Welche Gene regulieren die Flucht und die Futtersuche? · Agrar- und Ernährungswissenschaftliche...

Agrar- und ErnährungswissenschaftlicheFakultät

Welche Gene regulieren die Fluchtund die Futtersuche?

In vivo Studien am Modellorganismus Caenorhabditis elegans

Hochschultagung 2017

Dr. Dieter-Christian Gottschling

Institut für Humanernährung und Lebensmittelkunde

Molekulare Prävention

CAU Kiel

02.02.2017

dcgottschling 2017 2

Bedeutung spezifischer Verhaltensweisen

adaptive Bewegungsverhalten: Flucht, Abwehr und Nahrungssuche

Beispiel: Nahrungssuche

• Fische (Ward et al., 2012; Nakayama et al., 2012; Voellmy et al., 2014)

• Insekten (Wu et al., 2003; Wu et al.2005; Zhang et al., 2013)

• Nematoden (Sawin et al., 2000; Milward et al., 2011; Pirri und Alkema, 2012)

• Nager (Levy et al., 2016; Wernecke et al., 2016)

• Primaten (Chapman, 1989; Oftedal et al., 1991; Boyer et al., 2006)

ArterhaltungÜberlebensstrategien

nachhaltigkeitsblog.de

rudelstellungen-klargestellt.de


Adaptive Antworten von C. elegans auf Nahrungsverfügbarkeit

• u.a. auf neuronaler Ebene reguliert

• entsprechende Mechanismen weitgehend ungeklärtangepasst nach Ben Arous et al., 2009

angepasst nach Calhoun et al., 2014

global search

Bewegungsverhalten Bewegungsaktivität

Hy

per

ak

tivit

ät

randomisierte Bewegung

gerichtete Bewegung

Nah

run

gsv

erfü

gb

ark

eit


Forschungsziel:

Identifizierung von neuen evolutionär konservierten Faktoren/Signalwegen

in Caenorhabditis elegans, die Bewegungsphänotypen induzieren

in silico Screen

Zweiporendomänen-Kalium Kanäle (K2P)

als potentielle Kandidaten identifiziert

• neuronal exprimiert

• regulieren das Membran-Ruhepotential

• in vivo Funktionen weitgehend ungeklärt


Aufbau und Funktion von K2P-Kanälen

M1 M

3

C-Terminus

N -Terminus

P1 P2

Zellmembran

K+

K+Extrazellulär

Zytosolisch

K+

(-)

(+)

nach Renigunta et al., 2015, angepasst

Hyperpolarisation

Null-Mutation,

SF-Mutation

Überexpression

-65 mV-80 mV

0 mV

Ruhepotential

nach Bear et al., 2005, angepasst

Regulatoren:• Temperatur, mechanische Stimulation, osmotische Stimulation

• PH, O2, Fettsäuren, posttranslationale Modifikationen

• Anästhetika, pharmakologische Wirkstoffe

SF


Methodik Teil I:

Teil I: Identifizierung von K2P-Kandidaten

mit Bewegungsphänotypen (K I)

Teil II: Suche nach

K I-Regulatoren (K II)

3. Phänotypisierung:

• Kriechen

• Schwimmen

2. Allel-Prüfung:

• PCR

• Sequenzierung

Zellebene:

• Motor Neuronen

1. C. elegans

Mutanten:

• Null-Allele

• SF-Allele

E. coli OP50 Agar-Platten, 20°C M9 Puffer, 20°C

Kriechbewegung (S-Form) Schwimmbewegung (C-Form)

Analyseparameter:• Aktivität (Geschwindigkeit, Wellen-Parameter)

• Verhalten (Bewegungsrichtung, Bewegungsdauer)

• Expressionsmuster (Mikroskopie: Co-Lokalisation)

• „Rescue“-Potential (biolistische Transformation)

• Zellspezifische Effekte (selektive Überexpression)

N2

twk-

7(nf1

20)

twk-

7(gk

7600

44)

twk-

30(o

k130

4)

twk-

40(tm

6834

)

twk-

43(g

k590

127)

twk-

46(g

k568

572)

0.00

0.03

0.05

0.08

0.10

0.13

0.15

0.18

0.20

****

Sp

on

tan

eou

s

cra

wli

ng v

elo

cit

y [

mm

*s-1

]


Ergebnisse: Kandidaten-Screen (K I) von C. elegans Mutanten

motor-neuronal exprimierter K2P-Kanälen

• TWK-7(null) Mutanten zeigen ein hyperaktives spontanes Kriechverhalten (ad libitum, 20°C).

N2

twk-7(null)


N2

twk-

7(nf1

20)

twk-

7(gk

7600

44)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60*** ***

Sp

on

tan

eou

s B

BC

F [

Hz]

N2

twk-

7(nf1

20)

twk-

7(gk

7600

44)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50***

***

BB

SF

[H

z]

• TWK-7(null) induziert Hyperaktivität in einer koordinierten Art und Weise.

Ergebnisse: Bewegungsaktivität und -qualität von TWK-7(null) Mutanten

BBCF Body bending crawling frequency

BBSF Body bending swimming frequency


angepasst nach Donnelly et al., 2013 und Wormatlas.org

DB

VB VD

DD

VB

DB

AVB

PVC

D Kontraktion

Kontraktion

Entspannung

Entspannung

Muskulatur

V

Richtung der Wellenausbreitung

Richtung der Kriechbewegung

A

P

aktives exzitatorisches Signal

aktives inhibitorisches Signal

aktives Signal

inaktives Signal

DD

VD

Exkurs: Die sinusoidale Bewegung von C. elegans

Sensorisches Signal

(Nahrungsmangel)


Ergebnisse: Expressionsmuster von TWK-7 in C. elegans

V

KopfB

100 µm

A P

A anterior

P posterior

D dorsal

V ventral

D

Schwanz Neuronen

50 µm

Gelb: cholinerge Motor-Neuronen (exzitatorisch)

Rot: GABAerge Motor-Neuronen (inhibitorisch)

Kolokalisationsstudie (spezifische Genexpression):

• TWK-7 wird in allen cholinergen und GABAergen Motor-Neuronen exprimiert.


Ergebnisse: Zellspezifische Effekte durch selektive Überexpression

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

******

**

--

*********

Background:

twk-7(gk760044)

twk-7(nf120)

N2

Transgene: twk-7p::

TWK-7

unc-17p::

TWK-7

unc-17

(1kb)p::

TWK-7

unc-17

(1kb)p::

TWK-7

(G282C)

chol.

neurons

chol. MN

-

Sp

on

tan

eou

s B

BC

F [

Hz]

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

***

***

***

***

AMotor neurons:

Transgene:

D

- TWK-7 TWK-7(G282C)

B A B

-D

***

Background:

twk-7(null)

N2

Sp

on

tan

eou

s B

BC

F [

Hz]

• Die Expression von TWK-7 in cholinergen B-Typ Motor-Neuronen ist hinreichend

um die spontane Bewegungsaktivität zu modulieren.

chol.: cholinergic

MN: motor neurons


1. Vorwärtsgenetischer Screen (EMS-Mutagenese Screen)

3. Genotypisierung:

• WGS, Bioinformatik2. Phänotypisierung:

• Hyperaktivität

kin-2(cau-1) Allel(R92H)

Teil I: Identifizierung von K2P-Kandidaten

mit Bewegungsphänotypen (= TWK-7)

Teil II: Ermittlung von

TWK-7 Regulatoren

KIN-2KIN-1

cAMP

inaktive PKA

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

angepasst nach Wang et al., 2013

Methodik Teil II: potentielle Regulatoren von TWK-7

KIN-2KIN-1

cAMP

dauerhaft inaktive PKA

kin-2 Allel

dominant-negativ(G310D)

X


N2

twk-

7(nf1

20)

kin-2

(cau

1)

pde-

4(ce

268)

gsa-

1(ce

94)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

***

***

******

twk-7(null)

Gs(gf)

Sp

on

tan

eo

us

BB

CF

[H

z]

• GαS(gf)-Mutanten phänokopieren die hyperaktive Kriechbewegung von TWK-7(null).

gf : „gain-of-function“

Ergebnisse Teil II: Potentielle Regulatoren von TWK-7

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

TWK-7

Hyperaktivität!

geschlossener

Kanal

cAMPPDE-4

ACY-1

GSA-1

AMP

?


0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

Transgene: (-)unc-47p::

twk-7

unc-47p::

kin-2(G310D)

N2

twk-7(nf120)

kin-2(cau-1)

twk-7,kin-2

***

******

* *

**

******

******

***

**

Sp

on

tan

eo

us

BB

CF

[H

z]

• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch Hyperaktivität

während der spontanen Kriechbewegung.

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

TWK-7

Hyperaktivität!

geschlossener

Kanal

Epistase

Ergebnisse Teil II: Regulation von TWK-7

erster Hinweis

auf Epistase


***

0

20

40

60

80

100

Transgene: (-)unc-47p::

twk-7

unc-47p::

kin-2(G310D)

N2

twk-7(nf120)

kin-2(cau-1)

twk-7,kin-2

****

**

****

*

**

**

Sp

on

tan

eo

us

cra

wli

ng

str

aig

htn

ess

[%

]

1 mm

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

TWK-7

geradliniges, gerichtetes

Bewegungsverhalten!

geschlossener

Kanal

N2 twk-7(nf120)

twk-7(null) Hintergrund

unc-47p::kin-2(G310D)

twk-7(null) Hintergrund

kin-2(cau-1) Hintergrund

unc-47p::kin-2(G310D)

Epistase

• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch ein geradliniges, gerichtetes

Verhalten während der spontanen Kriechaktivität.


zweiter Hinweis

auf Epistase


0

20

40

60

80

100

Transgene: (-) unc-47p::twk-7 unc-47p::kin-2(G310D)

N2

twk-7(nf120)

kin-2(cau-1)

twk-7,kin-2

f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b

f : forwardr : restingb : backward

Crawling activity:

***

*** ***

*

*

*** ***

******

***

*

*** ***

**

***

***

Tem

po

ral

dis

trib

uti

on

of

spo

nta

neo

us

cra

wli

ng

[%

]

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

TWK-7

persistierende

Vorwärtsbewegung!

geschlossener

Kanal

N2

twk-7(nf120) 10 mm

Time span: 17h

ad libitum

Epistase

• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch eine persistierende

Vorwärtsbewegung während der spontanen Kriechaktivität.


dritter Hinweis

auf Epistase


0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8N2

twk-7(nf120)

kin-2(cau-1)

twk-7,kin-2

off foodon food

*** *** ***

** ** **

*

Net-

forw

ard

BB

CF

[H

z]

on food

on food

off food

off food

WT, 20°C

WT, 20°C

D.-Ch. Gottschling, 2016, unveröffentlicht

WT: Wildtyp

• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 agieren epistatisch während

der Nahrungssuche, ohne die Netto-Vorwärtsaktivität im

nahrungsfreien Raum weiter zu steigern.

Adaptives Verhalten im Kontext von Nahrungsverfügbarkeit


Zusammenfassung:

Implikation eines Modells für adaptives Verhalten in C. elegans

KIN-1KIN-2

cAMP

aktive PKA

TWK-7

multiple

Bewegungs-

Phänotypen

(adaptives Verhalten)

geschlossener

K2P Kanal

Nahrungsmangel

Effiziente

Erschließung neuer

NahrungsquellenEpistase

C. elegans

(sensorisches Signal)

+ weitere Faktoren/Signalwege

Ähnliche Verhaltensweisen: Insekten, Fische, Nager und Primaten.

Modell


Konklusion:

• TWK-7 ist hiermit der erste K2P-Kanal in C. elegans, für den

native in vivo -Funktionen charakterisiert wurden.

• Die Epistase zwischen PKA und TWK-7 generiert multiple

Phänotypen, die das Bewegungsverhalten spezifisch

beeinflussen.

• Die induzierten Phänotypen sind diejenigen, die während der

Nahrungssuche auch durch andere Organismen manifestiert

werden.


The Molecular Prevention Lab:

University of Kiel

Institute of Human Nutrition and Food Science

Dept. of Molecular Prevention

Heinrich - Hecht - Platz 10

24118 Kiel

Tel.: ++49-(0)431/880-5657

Fax: ++49-(0)431/880-5658

Lüersen, K., Gottschling, D. Döring, F. (2016)

Complex Locomotion Behavior Changes Are Induced in Caenorhabditis elegans by the Lack of the Regulatory Leak K+

Channel TWK-7. GSA GENETICS Journal

Gottschling, D., Döring, F., Lüersen, K. (2016)

The Gαs pathway and the two-pore domain K+ channel TWK-7 act epistatically in GABAergic motor neurons to affect the

locomotion behavior of Caenorhabditis elegans. GSA GENETICS Journal (under review)

Recently published:

The model organism

Caenorhabditis elegans Kai Lüersen Dieter Gottschling Frank Döring


Ich bedanke mich sehr für Ihre

Aufmerksamkeit!

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