FE

DE

RA

L IN

ST

ITU

TE

FO

R R

ISK

AS

SE

SS

ME

NT

Wirkungsbezogene Analytik –

Neue Konzepte für die Überwachung

und Lebensmittelsicherheit

Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen

Abteilung Lebensmittelsicherheit

Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin

Dr. Gabriele Böhmler

Lebensmittelinstitut Braunschweig

LAVES - Niedersachsen

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 2

Lebensmittel gelten gemäß Artikel 14 VO (EG) Nr. 178/2002

als nicht sicher, wenn davon auszugehen ist, dass sie:

a) gesundheitsschädlich sind

b) für den Verzehr durch den Menschen ungeeignet sind.

Ziel: Inverkehrbringen von sicheren Lebensmitteln

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 3

Überwachung von Lebensmitteln

Aktuelle Untersuchungsstrategie

Planproben

Landeseigene Kontrollpläne

Bundesweiter Kontrollplan

Monitoring-Programme

Koordiniertes Überwachungs- programm der EU

Analyse einzelner, zuvor

ausgewählter Substanzen

Auswahl von Matrix/Stoffkombinationen

z.B. Phthalate in fettreichen Lebensmitteln

Ochratoxin A in Trockenobst

Pharmakologisch-wirksame Stoffe in Aal

Analytik

Einzelstoffanalytik

- physikalisch-chemische Verfahren

- immunchemische Verfahren

Nationaler Rückstandskontrollplan (2010)

55883 Proben untersucht – 0,91 % pos.

z.B. Antibiotikarückstände – 0,1 % pos.

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 4

Ziel: In Verkehr bringen von sicheren Lebensmittel

Pflanzenschutzmittel

Mykotoxine

Bakterientoxine

Dioxine/dl PCBs

Pharmakologisch wirksame Stoffe

Allergene

Migrierende Stoffe

Schwermetalle

Acrylamid/Furane

PAKs

Substanz

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 5

Ansatz der wirkungsbezogenen Analytik

Reproduktions-toxizität

Zytotoxizität

Genotoxizität/Mutagenität

Rezeptorvermittelte Wirkung (estrogen, androgen, dioxinähnlich)

Tumorpromotion

Proben werden auf ihre gesundheitsrelevante Wirkung auf unterschiedliche Organismen (z.B. Zellen, Mikroorganismen) untersucht.

Wirkung Transcriptomics

Proteomics

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 6

Biologische Testsysteme in der Wirkungsbezogenen Analytik

Zellkultur

Rezeptorbasierte Assays

- Estrogenrezeptor

(Brustkrebszellen – E-Screen)

- Ah-Rezeptor

(Rattenhepatomzellen)

Zytotoxizität

- Zelltod

Mikroorganismen

Gentoxizität/Mutagenität

- AMES-Test

Enzyme

Enzymhemmungsassays

- Acetylcholinesterase

(Carbamate/Organophosphate) Extraktion

Analyse mit biologischen Wirkungstests

Fraktionierung

Identifizierung (instrumentelle Analytik)

Untersuchungsweg

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 7

Lebensmittelprobe

Extraktion

Auswahl des biologischen Testsystems

Zytotoxizität Genotoxizität/

Mutagenität

Reproduktionstoxizität/

Teratogenität

Rezeptorver-

mittelte Wirkung

Transkriptomics/

Proteomics

Tumor-

promotion

Work-Flow der Wirkungsbezogenen Analytik

Screening-Ansatz

Negative

Effekte

Positive

Effekte

Fraktionierung

Identifizierung der Substanz

durch klassisch analytische Methoden

Stopp der Analyse

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 8

Vorteile der Wirkungsbezogenen Analytik

Detektion gesundheitsschädlicher Wirkstoffe in komplexen Gemischen

aufgrund deren Wirkung (Mischeffekte werden erkannt)

Bestimmung von Summenparametern (Screening)

Nachweis von Substanzen, die über das originäre chemisch-analytische

Untersuchungsspektrum hinausgehen

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 9

Ah-receptor activation by B[a]P induce CYP1A1/1B1

nucleus

xenobiotic (f.e. PAH, dioxins)

Ah-receptor

ARNT

ARNT

enzyme

CYP1B1 mRNA

DNA

(DRE)

gene transcription enzyme

CYP1A1

AhR/ARNT/xeno-

biotic-complex

nuclear receptor: Aryl-hydrocarbone-receptor, AhR

(DRE = Dioxin response element, promoter)

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 10

Prinzip eines Reportergen-Assays

REPORTERGEN RE

Luciferin LUMINOMETER

Testsubstanz

Luciferase

z. B. AhR, ER, PPAR, ...

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 11

-1 0 1 2 3 4 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

TCDD

B[k]F

x-f

old

in

du

ctio

n

Concentration in pM (log)

ungeräuchert 0,47

1,26

1,35

0,80

geräuchert, Rand 19,84 0,577

12,89

15,30

geräuchert, Mitte 8,85 0,251

10,52

CALUX-TEQ

(µg/kg

Frischfleisch)

B[a]P Gehalt

(µg/kg

Frischfleisch)

< Nachweis-

grenze

Konzentration von B[k]F in pM (log)

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6

x-f

ach

e I

nd

ukti

on

0

1

2

3

4

5

6

7

Quantifizierungs-grenze

EC50

min --> 0,8356 max --> 6,1809 logEC50 --> 3,0456 EC50 --> 1111 R2 --> 0,9981

R2 = 0,9192

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20 25

CALUX-TEQ

B[a

]P-G

eh

alt

(G

C/M

S)

Detektion von PAK in Fleisch mittels Reportergen-Assay (AhR) X

-fa

ch

e In

du

kti

on

Konzentration in pM (log)

Konzentration von B[k]F in pM (log)

X-f

ac

he In

du

kti

on

Kuhn et al., Journal of Food Protection 2008

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 12

0

2

4

6

8

10

12

14

ungeräuchert

n = 5

3 Std kalt

n = 6

6 Std kalt

n = 5

1 Std heiß

n = 7

3 Std heiß

n = 3

Sum

me d

er

16 E

FS

A-P

AK

(µ

g/k

g)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

ungeräuchert

n = 5 3 Std kalt

n = 6 6 Std kalt

n = 5 1 Std heiß

n = 7 3 Std heiß

n = 3

TC

DD

IE

Q (

ng/k

g)

Detektion von PAK in geräuchertem Schweinebauch

Kuhn et al.,

Journal of Food

Protection, 2009

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 13

-14 -12 -10 -8 -6 -4

0

2

4

6

8

10

12

14

E2 Genistein Daidzein

concentration (log M)

x - fo

ld

ind

ucti

on

0

100

200

300

400

500

0 100 200 300 400 500 600

Gen

iste

in a

nd D

aidze

in

conte

nt

in

feed

(m

g/k

g)

estrogenic activity (EEQ µ g/kg feed )

alpha HEK

r 2 = 0.9488

p<0.05

beta HEK

r 2 = 0.9427

p<0.05

Aktivierung des Östrogenrezeptors (ER) X

-fach

e In

du

kti

on

Konzentration (log M)

Gen

iste

in-

un

d D

aid

zein

-Geh

alt

in F

utt

er

[mg

/kg

]

östrogene Aktivität [EEQ µg/kg Futter]

Winter et al., J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 2008

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 14

Zusammenfassung und Ausblick

Lebensmittel müssen sicher sein (EU-Verordnung (EG) Nr. 178/2002)

• erfordert Lebensmittelmonitoring mit hohem Niveau an Sicherheit.

• effiziente und moderne biotechnologische Techniken können dazu beitragen

• Detektion bekannter und unbekannter Substanzgruppen mit potentiell

toxikologischer Wirkung durch Wirkungsbezogene Analytik möglich

• Validierungsstudien sind notwendig

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 15

Extraktionsmethoden (Rohextrakte; gereinigte Extrakte) Matrixeffekte auf das Textsystem

- Maskierung der Effekte → Fraktionierung

- Zytotoxizität Sensitivität

Offene Fragen

Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 16

Zusammenfassung und Ausblick

Kommunikation bei der Anwendung und Entwicklung neuer biologischer

Teststrategien ist sinnvoll und erforderlich

Internationaler Workshop

Wirkungsbezogene Analytik

am 18.10.2012 in Berlin am BfR

EU Projekt BIOCOP (Prof. Elliot, Queens Univ.)

EU Projekt Conffidence (Dr. S. Weigel, RIKILT)

u.a.

FE

DE

RA

L IN

ST

ITU

TE

FO

R R

ISK

AS

SE

SS

ME

NT

Vielen Dank für Ihre

Aufmerksamkeit

Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen

Abteilung Lebensmittelsicherheit

Bundesinstitut für Risikobewertung

Thielallee 88-92 D-14195 Berlin

Tel. 0 30 - 84 12 - 0 Fax 0 30 - 84 12 - 47 41

Alfonso.Lampen@bfr.bund.de www.bfr.bund.de

Danksagung: Dr. Anke Ehlers,

Dr. Stefanie Hessel,

Dr. Torsten Buhrke