Zellbiologie - Philipps-Universität Marburg · Robert Hooke (1635‐1703) Engl. Physiker, Erfinder...
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Zellbiologie
Zellbiologie
Lehrbücher
Doppel-stunde
ThemaStichworte
11.04.11
Lichtmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Durchlichtmikroskopie, (Vergrößerung, Auflösung, Tiefenschärfe), Phasenkontrastmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Anwendungsbeispiele (Prof. Jacob)
14.04.11Elektronenmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Transmissions-EM, Raster-EM, Anwendungsbeispiele
02.05.11Biologische Membranen: Aufbau, Lipide, Cholesterin, Membranproteine, Fluidität, Membrananker, Detergentien
05.05.11 Membranverbindungen I: Tight junctions, Adhesion junctions, Cadherine, Desmosomen
09.05.11 Membranverbindungen II: Gap junctions, Connexine, Hemidesmosomen, Integrine
12.05.11
Zytoskelett Einführung/Mikrotubuli I: Einteilung der Zytoskelettsysteme; Morphologie der Zytoskelettsysteme; Mikrotubuliaufbau; Dynamische Instabilität in vitro; Dynamische Instabilität in vivo;
16.05.11Mikrotubuli II: intrazelluläre Mikrotubuliorganisation; Centrosom; Mikrotubuli-bindende Proteine; Mikrotubuli-assoziierter Transport; Kinozilien; Mitosespindel
19.05.11
Aktinzytoskelett: G-Aktin/F-Aktin; Polymerisation/Depolimerisation; Aktin-bindende Proteine; Mikrovilli; Aktin-assoziierte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen; Aktin-assoziierte zelluläre Bewegungen
23.05.11
Intermediärfilamente: Struktur der Intermediärfilamente; Polymerisation/Depolymerisation; Einteilung der Intermediärfilamente; Zelltypspezifische Verteilung und Funktion der Intermediärfilamente; Verbindung zwischen Intermediärfilamenten und Mikrotubuli
26.05.11
Extrazelluläre Matrix: Zell-Matrix Wechselwirkung; Basalmembran; Struktur, Synthese und Sekretion von Kollagen; Störungen im Kollagenstoffwechsel (Ehlers-Danlos Syndrom); Kollagentypen; Elastin und Störungen im Elastinstoffwechsel (Marfan Syndrom); Proteoglykane und Hyaluronsäure; Fibronectin
Nach Absprache Tutorium: Membranen
Nach Absprache Tutorium: Zytoskelett
Vorlesung/ Seminar Zellbiologie (SS 2011)2. SemesterOrt: Histologiesaal der Zellbiologie, Robert-Koch-Str. 6Zeit: Mo 10:15– 12:00 Uhr; Do 9:15 - 11.00 UhrVerantwortlich: Prof. Dr. Roland Lill, Prof. Dr. Ralf Jacob, PD Dr. Christopher Lillig
Institut für Zytobiologie, Robert-Koch-Str. 6 (Tel. 286-6482)
30.05.11 Endoplasmatisches Retikulum I: Morphologie der glatten und rauhen ER, Funktionen des glatten ER, Cytochrome P450. Ribosomen, Rauhes ER, Signalhypothese, Translocon (Prof. Lill)
06.06.11 Endoplasmatisches Retikulum II: Weitere Funktionen des rauhen ER, Proteinfaltung und Modifikationen im ER, Chaperone, Quality control, Disulfidverbrückung, N-Glykosylierung.
09.06.11Proteintransport durch Fission und Fusion von Membranvesikeln: vesikulärer Transport, Fusion und Fission von Membranvesikeln, anterograder/retrograder Proteintransport
16.06.11Golgi-Apparat I: Morphologie, Funktionen der Golgi Stapel, Modifikationen im Golgi-Apparat (z.B. O-Glykosylierung, Proteolyse, Sulfatierung)
20.06.11Golgi-Apparat II: Proteintransport im Golgi-Apparat, Sortierung im Trans-Golgi-Netzwerk; Sortierung lysosomaler Proteine
27.06.11Endosomales Kompartiment, Exocytose, Endozytose: regulierte und konstitutive Sekretion, frühes und spätes Endosom, Rezeptorgekoppelte Endozytose, Pinozytose.
30.06.11Lysosomen: Funktion, Hydrolasen, Biogenese von Lysosomen, Proteinimport in Lysosomen; lysosomale Erkrankungen
04.07.11Mitochondrien I Morphologie, Funktionen und Bestandteile der einzelnen Kompartimente, Überblick zur oxidativen Phosphorylierung, Biogenese (Proteinimport und -sortierung)
07.07.11
Mitochondrien II Genexpressionsapparat der Mitochondrien (mtDNA, Nukleoid, Transkription und Translation) , rho-zero Mitochondrien, Vererbung und Segregation, Fusion und Fission (Dynamik des mitochondrialen Retikulums), Endosymbiontentheorie, mitochondriale Erkrankungen (Myopathien etc.)
11.07.11Peroxisomen: Morphologie, Funktionen, Biogenese (Proteinimport, Peroxine), peroxisomale Erkrankungen (Zellweger-Syndrom, Adrenoleukodystrophie)(PD Dr. Lillig)
14.07.11 Ersatztermin
Nach Absprache Tutorium: Sekretorischer Transportweg
Nach Absprache Tutorium: Lysosomen, Peroxisomen, Mitochondrien
25.07.11 Abschlussklausur (9:00-11:00 Uhr)
Zellbiologie
• Lichtmikroskopie
• Elektronenmikroskopie
• Biologische Membranen
• Membranverbindungen
• Lichtmikroskopie
• Elektronenmikroskopie
• Biologische Membranen
• Membranverbindungen
Über 1,5 Millionen verschiedene Spezies sindbis heute von Biologen beschrieben worden !
• ~ 280.000 Pflanzen
• ~ 750.000 Insekten
• ~ 50.000 Vertebraten
• ~ 280.000 Pflanzen
• ~ 750.000 Insekten
• ~ 50.000 Vertebraten
Alle Lebewesen sind aus einer oder mehreren Zellen aufgebaut !
Zeitlicher Ablauf der Zellentwicklung
vor ca. Jahren:
4,7 Milliarden Entstehung der Erde3,9 Milliarden erste membranumschlossene Einzeller3,5 Milliarden Bakterien entstehen3 Milliarden Sauerstoffproduktion durch Blaualgen700 Mio. primitive Vielzeller (Schwämme) bilden sich450 Mio. erste Vertebraten tauchen auf200 Mio. Erscheinen der Säugetiere100.000 homo sapiens
vor ca. Jahren:
4,7 Milliarden Entstehung der Erde3,9 Milliarden erste membranumschlossene Einzeller3,5 Milliarden Bakterien entstehen3 Milliarden Sauerstoffproduktion durch Blaualgen700 Mio. primitive Vielzeller (Schwämme) bilden sich450 Mio. erste Vertebraten tauchen auf200 Mio. Erscheinen der Säugetiere100.000 homo sapiens
Die Zelle: Der kleinste Baustein aller Organismen
VergleichProkaryonten Eukaryonten
OrganismusEubakterien PilzeArchebakterien Pflanzen
Tiere
OrganisationsformEinzellig ein- oder
mehrzellig
Organellen, Cytoskelett, Zellteilungsapparatnicht vorhanden vorhanden,
kompliziert,spezialisiert
VergleichProkaryonten Eukaryonten
DNAklein, circulär, keine Introns groß, im Zellkern, viele Introns
RNA: Synthese und Reifungeinfach, im Cytoplasma kompliziert, im Zellkern
Protein: Synthese und Reifungeinfach, mit RNA- kompliziert, im Cytoplasma undSynthese gekoppelt rauhen Endoplasmat. Reticulum
Stoffwechselanaerob oder aerob meist aerobsehr anpassungsfähig
ZellkernZellkern
Golgi-ApparatGolgi-Apparat RibosomRibosom
MitochondriumMitochondriumLysosomLysosom
rERrER
PlasmamembranPlasmamembran
Zellkompartimente
Zelle als Produktionsstätte
Quelle: Leica Microsystems
Warum Mikroskopie?
… weil es mehr gibt als man mit dem Auge erfassen kann
Strahlengang des Auges
• Rose in weiter Entfernung• Linse entspannt
• Rose näher am Auge• Strahlen werden stärker gebrochen• Linse wird dicker• vergrößertes Abbild
Strahlengang des Auges
0.2 mm
Auflösungsvermögen des menschlichen Auges
Haare
BlätterInsekten
Tiere
0.2 mmmenschl. Auge
Haare Blätter
Insekten
Tiere
Auflösungsvermögen des menschlichen Auges
0.2 mm0.2 µm0.2 nm
Atome Organische Moleküle
Makromoleküle
Viren
….
0.1 nm
1 nm
10 nm
100µm
100 nm
1 µm
10 µm
Lichtmikroskopie
Atomkraftmikroskopie
Elektronenmikroskopie
Bakterien/ Organellen
Eukarytische Zellen
Haare
Blätter
Insekten
Tiere
Größenbereiche biologischer Präparate
menschl. Auge
Quelle: University of Vienna, cell imaging group
Brechung an einer bikonvexen Linse
Linsenconvex lenses
(collecting lenses)concave lenses
(divergent lenses)
biconcaveplano-convex
concave-convexcvbibiconvex
plano-concave
convex-concave
concave-convexcv
Fokuslänge
Brechung an einer bikonkaven Linse
Fokuslänge
Source: University of Vienna, cell imaging group
extw|Çz áàÉÇx
Erstes Jahrhundert: Lesesteine
objectimage
- ursprünglich aus Beryll (Silicat-Mineral)
Athanasius Kircher(1601‐1680)
Jesuiten‐Pater, Universalgelehrter
Robert Hooke(1635‐1703)
Engl. Physiker, Erfinder
Antoni van Leeuwenhoek(1632‐1723)
Engl. Physiker, Erfinder
Die ersten Jahre
Athanasius Kircher(1601‐1680)
Jesuiten‐Pater, Universalgelehrter
Robert Hooke(1635‐1703)
Engl. Physiker, Erfinder
Antoni van Leeuwenhoek(1632‐1723)
Engl. Physiker, Erfinder
Die ersten Jahre
Das Mikroskop
Vergrößerung
einer Lupe eines Mikroskops
Sehwinkel mit Lupe α1Sehwinkel in 25 cm Entfernung α0
γ = =
α1 G s0 s0α0 f G f
γ = = =γObj = =B t
G f1γ = γObj γOk = t s0
f1 f2
Auflösung
Objektiv: 100xOkular: 10xObjektiv: 100xOkular: 10x
Objektiv: 40xOkular: 25xObjektiv: 40xOkular: 25x
Numerische Appertur
2α
2α
2α
A = n sin α (ABBE)
Brechungsindex
Numerische Appertur
A = n sin α (ABBE)
Brechungsindex
Objektträger
Deckglas
Immersionsölα
Luft, n=1Öl, n=1,52Glas, n=1,52
Auflösung
Ernst Abbe 1873
Auflösung
dmin =A = n sin α (ABBE)
Brechungsindex
λAObj + AKond.
rotes blaues Licht
RA8 RA9 RA10
Folie 28
RA8 Wellenlänge des verwendeten Lichts: 400-750 nmmax. Empfindlichkeit des Auges: 555 nmRAD; 19.04.2004
RA9 Für den Kontrast ist es wichtig, dass A(Kondensor) < A(Objektiv) istOptimum: A (Kondensor) = 2/3 A (Objektiv)d= lambda/(2/3 A(Obj.) + A(Obj.)) = lambda/1,66 A(Obj.)Bei 555 nm:d= 555/1,66 1/A(Obj.) = 334 1/A(Obj.)RAD; 19.04.2004
RA10 Beispiele:A (Obj.) d(nm)
0,3 11130,65 5141,3 257Richtwert für Auflösungsgrenze: 200 nmRAD; 19.04.2004
Mikroskop-Strahlengang
Tubusmit Prisma
Feldblende
Lampenhaus
Kollektor
Okular
Objektivrevolver
Objektive
Kreuztisch
Kondensor
Spiegel
Aperturblende
Die Köhlersche Beleuchtung(Prof. August Köhler, 1893)1.
2.
3.
4.
5.
Leuchtfeldblende schließen
Über den Kondensorscharf einstellen
zentrieren
Blende öffnenscharf einstellen
zentrieren
Blende öffnenPräparat ausleuchten
schlecht ausgeleuchtetesPräparat
RA4
Folie 30
RA4 Punkteabstand im Präparat: 5 µM10 x Objektiv: Zwischenbild 50 µMaber: d(Auge) ~300 µM > NachvergrößerungRAD; 19.04.2004
Färbetechniken
Quergestreifter Skelettmuskelquer
längs
Azan-Färbung
HE-Färbung
Eisenhämatoxilin-Färbung
Mikroskopiertechniken
Kontrastverfahren
1. Dunkelfeld
2. Phasenkontrast
3. Differenzinterferenzkontrast
Fluoreszenzmikroskopie
4. Fluoreszenz
5. Laser-Scanning
to see, or not to see …
that is the question
Dunkelfeld-Mikroskopie
• Das Präparat wird nicht direkt angestrahlt
• Vom Präparat ausgehendes Streulicht wird gemessen
Refraktion (Brechung)Richtungsänderung einer Welle durch veränderte Geschwindigkeit in verschiedenen Medien
Die Brechung erfolgt zum Lot,wenn ein Lichtstrahl in einMedium mit größerer Brechzahleintritt (zum Beispiel aus Luft inWasser oder Glas)
Eine Spaltbreite kleiner als dieWellenlänge ergibt eine vom Spaltausgehende Kreiswelle, derenIntensität auch in Richtungen, diesich stark von der ursprünglichenAusbreitungsrichtung abweichen,noch groß ist.
Diffraktion (Beugung)Ablenkung an einem Hindernis (Spalt, Gitter, Linsenrand usw)
Wellenwanne
Phasenkontrast(1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike)
• Kontraststeigerung durch Veränderung in der Mikroskopoptik
• Kondensor und Objektiv sind mit verschiedenen Ringblenden versehen
• Wechselwirkung (Interferenz) des direkten Mikroskopierlichts mit dem am Präparat gebeugten Licht
• Ergebnis: Objekte mit hohem Brechungsindex (z.B. Zellen) werden dunkler abgebildet als Objekte
mit geringem Brechungsindex (z.B. Wasser)
Phasenkontrast(1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike)
Differential Interferenz Kontrast (DIC)
• Linear polarisiertes Licht wird in einem Winkel von
45° auf ein Wollaston-Prisma geleitet
• Aufspaltung in zwei senkrecht zueinander
schwingende Wellenzüge gleicher Amplitude
• Vereinigung mit einem zweiten Wollaston-Prisma
• Interferenz am Analysator gemessen
Differential Interferenz Kontrast (DIC)
Phasenkontrast DIC
Differential Interferenz Kontrast (DIC)
• Der Name „Fluoreszenz“ stammt von dem Fluoreszierenden Mineral „Fluorit“ (CaF2)
• 1824 entdeckt der Mineraloge Friedrich Mohs Fluoreszenz unter UV-Licht
• Der Ausdruck „Fluoreszenz“ wurde in einer Veröffentlichung von G.G. Stokes erstmals 1852 erwähnt
Fluoritkristalle unter UV-Licht
Fluoreszenz
• Energien der Elektronenübergänge, die bei
Absorption und Emission von Photonen
auftreten
• Delokalisierte Elektronen in bindenden -
Orbitalen werden bei Absorption eines
Anregungsphotons auf ein höheres *-
Orbital katapultiert (angeregter Zustand S1
o. S2)
• Beim Übergang in den Grundzustand wird
die freiwerdende Energie als
Fluoreszenzphoton emittiert
Fluoreszenz
Fluoreszenzierende Moleküle
Absorptions- und Emissionsspektrum
Anregungs- und Emissionsfilter
Fluoreszenzmikroskop
Fluoreszenzmikroskop
Konfokales Fluoreszenzmikroskop
Konventionelles Fluoreszenzmikroskop konfokales Fluoreszenzmikroskop
Konfokales Fluoreszenzmikroskop
konventionelles
konfokales
Fluoreszenzmikroskop
Medulla Muskel Getreidekorn
Laser-Scanning Mikroskop
SI-YFP Actin-CFP
Aktin-abhängiger Transport der Saccharase
Scale bars: 10 µm
Gal3-YFPGT-CFP
Transient interference between galectin-3 containing vesicles and the trans Golgi