Phytohormone 1

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WWU-Münster

Prof. Jörg Kudla

Aufbau-Modul:

Zellbiologie, Physiologie und Genetik

Vorlesung:

Phytohormone: Wirkung und Signaltransduktion

Wochenziel:

Welche Aufgaben übernehmen Phytohormone in Pflanzen?

Was sind die molekularen Mechanismen der Phytohormonperzeption?

Definition Phytohormone

• Phytohormone sind Signalmoleküle

• Sie wirken in Pflanzen in verschwindend kleinen Mengen

• Synthese und Funktion von Phytohormonen kann in verschiedenen Zellen stattfinden (aber z.B. ABA kann in der Zelle wirken, in der es produziert wurde)

• Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzen keine hormonproduzierenden Drüsen, prinzipiell kann jede Zelle Hormone produzieren

• Phytohormone werden von spezifischen Rezeptoren oder Rezeptorfamilien erkannt

Phytohormone

fünf “klassische“Pflanzenhormone:

• Auxin

• Gibberellin (GA)

• Cytokinin

• Abscisinsäure (ABA)

• Ethylen

“neue“Pflanzenhormone:

• Brassinosteroid (BR)

• Jasmonat (JA)

• Salicylat (SA) ***

• Strigolacton (SL) ***

*** = unbekannte Rezeptoren

• Stickstoffmonoxid (NO) ***

• Polyamine ***

• Peptide

Die „klassischen“ Phytohormone

„fördern Wachstum“ „hemmen Wachstum“

Auxine Abscissinsäure (ABA)

Cytokinine Ethylen

Gibberelline

Auxin- Struktur und Synthese-

• Verschiedene Moleküle wirken als

Auxin (vor allem IES)

• Verschiedene Synthesewege (z.B.:

Tryptophan als Ausgangsmolekül)

• Syntheseorte: Apikalmeristem, junge

Blätter und die Wurzelspitze

• Die Regulation des Transports von

Auxin ist entscheidend für die

Funktion des Hormons (PIN-

Proteine)

Indol-3-Essigsäure (IES)

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Auxin- Physiologie und Mutanten -

• Pflanzenwachstum

Elongation der Zellen

(Phototropismus ,

Gravitropismus)

Zellteilung

Apikaldominanz

(Inhibition von

Seitenknospen)

• Fruchtentwicklung

• Keimung Col Ws tir1 afb2

Rezeptormutanten

tir1 afb1afb2 afb3

tir1 afb2afb3

Phototropismen werden durch Auxin vermittelt

• In der Spitze produziertes Signal (Auxin) wandert zur Elongationszone

• Schattige Seite wächst schneller (rot) durch verstärkte Zellstreckung und

führt somit zur Krümmung

Auxin wird zur Fruchtreife benötigt

• Achänen produzieren Auxin und ermöglichen die Entwicklung des

Blütenbodens (botanisch nicht die Frucht)

• Bei Entfernung der Achänen entwickelt sich der Blütenboden nicht normal

• Sprühen mit Auxin kann normales Wachstum wiederherstellen

geschwollener Blütenboden

Achäne(Frucht mit einem einzelnen Samen)

Auxin Biosynthese aus Tryptophan und IndolVerbindungen

• Indol-3-Essigsäure (IES) ist das am weitesten

verbreitete Auxin in Pflanzen

• Hauptstoffwechselweg aus Tryptophan

• Tryptophan-unabhängige IES Synthese kann zu

bestimmten Entwicklungszeitpunkten bedeutend

sein

Indol-3-Essigsäure

Tryptophan

Tryptophan

Indol Verbindungen

IES

Auxin Akkumulation in Sproß und Wurzel

• IES Biosynthese überwiegend in sich schnell teilenden, wachsenden Geweben

• Primäre Syntheseorte: Sprossapikalmeristem und junge Blätter

• Wurzelapikalmeristem wichtige Funktion für Entwicklung und Organogenese

(„Feinregulation“), allerdings bleibt die Wurzel abhängig vom primären Syntheseort

PromotorDR5::GFP bzw. PromotorDR5::GUS Fusion zeigt Syntheseorte

Sprossapikalmeristem und Blattprimordien

junge Blattbereiche

Wurzelapikalmeristem Seitenwurzel Initiation Seitenwurzel

Sproß Wurzel

Auxin reguliert das Streckenwachstum

• Transport von Sproßspitze abwärts

• stimuliert Streckungswachstum der

Sproßachse (durch Zellstreckung an

bestimmten Zonen)

• bei höheren Konzentrationen wirkt Auxin

hemmend (wie bei Überproduktion)

WT AuxinÜberproduzierer

IES

Transport

Warum hemmend bei Überproduktion?

Wie wird polarer Transport ermöglich?

Phytohormone 1

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Hormonwirkungen zeigen ein gewebespezifisches Optimum

Beispiel: Auxin-stimuliertes Streckungswachstum der Stängelsegmente

Bezogen auf die Kontrolle

(Wachstum in H2O, ohne exogene IES)

Wachstums-förderung

10–7 10–6

(µM)10–5 10–4 10–3

(mM)

Auxin (IES) -Konzentration

10–8 10–2 M

Rel

ativ

es W

ach

stu

m (

in m

m)

Maximum

Optimum(im

Spross)

Wachstums-Hemmung

Nachweis des polaren Auxintransportsdurch radioaktiv markierte IES

B

A

A

A

B

B

IES

IES

IES

Polarität des Transports ist unabhängig von der Schwerkraft und wird durch die Beschaffenheit des Pflanzengewebes bestimmt

Polare Anordnung von PIN Auxin Influx und Efflux Transportern

• AUX1 (Auxin resistant 1) 2H+/Auxin Symporter, vermittelt Influx

• PIN1 (PIN Formed 1) Auxin Transporter, vermittelt Efflux

• IES- Auxin Anion

• IESH protoniertes Auxin (unpolar)

Polare Anordnung von PIN Auxin Influx und Efflux Transportern

• Anionische IES- wird durch AUX1Symporter aufgenommen

• Nicht dissoziiertes IESH gelangt per Diffusion über die Plasmamembran in die Zelle

• In der Zelle liegt überwiegend die Anionische IES- Form vor („Ionenfalle“)

• Efflux der anionischen IES- wird durch PIN1vermittelt

• Polare Anordnung von Auxin Influx und Efflux Transportern ermöglicht den gerichteten Transport

Apikale Lokalisation von AUX1 und basale Lokalisation von PIN1

PIN1 (grün) AUX1 (rot)

Die Arabidopsis pin1 Mutante zeigt gravierende Entwicklungsphänotypen

- (in der Regel) Keine Blütenbildung

- Sprossachse Stäbchen (pin) ähnlich verlängert

- Oft reduziert Keimblattzahl

- Reduzierte Anzahl an Blättern

- Form der Blätter oft gestört

- Keine Trichome auf den Blättern

- Keine Anthocyane im Spross

- Gelbe Samen

- Veränderte Struktur der Samenhülle

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Apoplast

Zytosol

ATP

Auxin induzierte Zellstreckung: Säurewachstumshypothese

Cellulosemikrofibrille

Expansin

Glykan spaltendes Enzym

Quervernetzte Glykane

H+-ATPase

Auxin

Apoplast

Zytosol

ATP

A. Auxin erhöht die Aktivität von

Protonenpumpen

B. Ansäuerung des Apoplasten

C. Ansäuerung aktiviert Expansine, die

quervernetzende Glykane von den

Mikrofibrillen ablösen

D. Enzymatische Spaltung der

Quervernetzenden Glykane

Auflockerung der Zellwand

Erhöhte Dehnbarkeit der Zellwand führt durch den Turgor zur Zellstreckung

Die Orientierung der Cellulosemikro-fibrillen legt die Dehnungsrichtung fest

Auxin induzierte Zellstreckung: Säurewachstumshypothese

Auxin

Auxintransport und ApikaldominanzAuxin wirkt antagonistisch zu Cytokinin

• Apikaldominanz: Unterdrückung von Seitensprossen

• Durch Dekapitieren (Enthaupten) wird Apikaldominanz aufgehoben

Auxin

Cytokinin Cytokinin

Cytokinin wird aus der Wurzelspitze

nach oben transportiert und stimuliert

die Seitensprossbildung

Auxin wird aus der Sproßspitze nach

unten transportiert und unterdrückt die

Bildung von Seitensprossen

Cytokinin

Auxin

Dekapitiert Dekapitiert + auxinhaltige Gelatinekapsel Apikalmeristem intakt

Cytokinin-Struktur und Synthese-

• Zeatin (trans- und cis-) bilden die

häufigsten Formen

• Syntheseweg: Adenin als

Ausgangsmolekül

• Syntheseorte: Wurzeln sich

entwickelnde Embryonen, junge

Blätter, Fürchte, WurzelhalsgallenZeatin

Cytokinin-Physiologie und Mutanten-

• Zellteilung

• Löst Sprosswachstum aus

• Inhibiert Wurzelwachstum, leitet

aber Zelldifferenzierung ein

• Verzögert Seneszenz

Col Ws versch. Rezeptormutanten

Cytokinin Biosynthese aus ATP / ADP

• Transfer Isopentenylgruppe an ATP/ADP durch : Isopentenyl Transferase (IPT)

• Weitere enzymatische Reaktionen führen zum aktiven Cytokinin (= freie Base)

• Cytokinine sind Adenin Derivate mit Isopentenyl basierter Seitenkette

• DMAPP wird sowohl in Zytosol als auch in Plastiden gebildet

• Das plastidäre DMAPP wird hauptsächlich zur Cytkininsynthese genutzt

Adenin

Adenin

Seitenkette

(Dimethylallyldiphosphat)

Zwischenprodukt Cytokinin

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Cytokinin Akkumulation in Wurzel, Spross und Embryo

AtIPT::GUS

AtIPT::GUSARR5::GUS

Wurzel Embryo

AtIPT::GUS

SprossLeitgewebe

junge Blätter

Wurzel und Wurzelapikalmeristem

Seitenwurzel

Cytokinin hat verschiedene Wirkungen in unterschiedlichen Geweben

Cytokinin Überproduktion ähnelt dem Phänotyp nach exogenen Cytokinin-Gaben

• Überexpression der IPT (Isopentenyl

Transferase) führt zu erhöhtem Cytokininlevel

• Katalysiert ersten Schritt der

Cytokininbiosynthese

35S::IPT (transgener Tabak)

• Apikaldominanz reduziert(„buschiges“ Wachstum durch Ausbildung von Seitensprossen)

• Seneszenz verzögert(alte Blätter werden kaum gelb)

Cytokinine fördern das Sprosswachstum durch erhöhte Zellteilung im Sprossapikalmeristem

• Cytokinin Oxidase (CKX) degradiert

Cytokinine irreversibel

• Bei Überexpression von CKX ist

weniger Cytokinin vorhanden

• Verminderte Cytokininkonzentration

führt zu geringerem Wachstum des

Sprosses

CKX-OE = CKX Überexpressionslinie

WT

CKX-OE

WT CKX-OE

Cytokinine hemmen das Wurzelwachstum durch verminderte Zellteilung im Wurzelapikalmeristem

• Deutlich mehr Wurzeln in der

CKX-OE Linie

• Zellkernfärbung (DAPI):

• deutlich erhöhte Zellanzahl

• verlängertes Wurzelmeristem

• Zellen vergrößert

WT CKX-OE

RM = root apical meristem

Cytokinin und kontrollierte Seneszenz-Verzögerung durch induzierbare Promotoren

Cu-Prom::GUS

Cu-Prom::IPT

• Cu-Prom: Cu2+ induzierbarer Promotor

• GUS Expression hat keinen Einfluß auf

Cytokininkonzentration (Kontrolle)

• Isopentenyl Transferase (IPT) Expression führt zu

erhöhter Cytokinakkumulation

• Induktion von IPT bei älteren Pflanzen führt zu

einer deutlichen Verzögerung der Seneszenz

Cu-Prom Cu-PromGen X Gen X

Cu

Gibberellin (GA)-Struktur und Synthese-

Gibberellin GA1

• Tetracyclische Diterpene(C20)

• Biosynthese über den Isoprenoid-Weg

• Syntheseorte: Keimende Embryos,

junge Keimlinge, Spross, Apizes und

sich entwickelnde Samen

• Komplexe Synthese in mehreren

Kompartimenten

GA1-promoter:GUS; zeigt Syntheseorte

Phytohormone 1

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Gibberellin (GA)-Physiologie und Mutanten-

• Löst Samenkeimung aus

• Blühinduktion

• Pollenentwicklung und -

schlauchwachstum

• Elongation der Internodien

(Zelllängenwachstum und -

teilung)

• Löst Fruchtwachstum aus

Wt gdi1(Rezeptormutante)

Schritt 1 (Plastid)

• GGPP (Geranylgeranyldiphosphat)

aus Terpenoidsynthese wird

zyklisiert

Schritt 2 (ER)

• Synthese von GA12 über mehrere

Zwischenstufen im ER

Schritt 1 und 2 der GA Biosynthese

sind in allen Pflanzen im wesentlichen

identisch

Gibberellin Biosynthese verläuft in drei Schritten

Gibberellin Biosynthese verläuft in drei Schritten

Schritt 3 (Zytosol)

• Synthese bioaktiver Gibbereline

ausgehend von GA12

• Präferenz des Syntheseweges ist

artspezifisch

• Stoffwechselweg für GA4 am

weitesten verbreitet

Gibberellin nehmen Einfluß auf Wachstum und Entwicklung

• Der Einfluss von GA auf ausgewachsene Mais-Pflanzen ist gering.

• Aber bei einer Zwergmutante korrigieren exogene GA-Gaben das Längenwachstum.

Mut- GA

Mut+ GA

WT- GA

WT+ GA

Gibberelinsäure erhöht Ausbeute bei Fürchten

- GA + GA• „Weintrauben“ sind botanisch

Weinbeeren

• Ohne GA-Behandlung wird die Fruchtentwicklung früher abgebrochen (gerade in kernlosen Weinbeeren, da GA in den Kernen gebildet wird)

• GA behandelte Beeren nehmen deutlich an Größe zu

• Zudem lockert sich die Dichte mit denen die Beeren an der Rispe auftreten durch Verlängerung des Beerenstiel

• Lockere Anordnung senkt das Risiko von Pilzbefall

• Verminderte Sensitivität gegenüber GA verhindert exzessives GA induziertes Wachstum bei Überflutung (Ressourcenschonend)

vor Überflutung Überflutung (16 Tage) Regeneration (7 Tage)

WT Sub1A-OE

A B C

WT Sub1A-OE WT Sub1A-OE

Submergence tolerant 1A (Sub1)

• WT versucht der Überflutung durch starkes GA vermitteltes Wachstum zu zu entkommen

• Starker Energie und Ressourcenverbrauch führt zum Absterben

WT

Reduzierte GA Sensitivität ist bei Überflutungvon Vorteil

Phytohormone 1

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Reduzierte GA Sensitivität ist bei Überflutungvon Vorteil

A. Reispflanzen gleichen Alters werden für 16 Tage unter Wasser inkubiert

B. Nach 16 Tagen Überflutung ist der WT deutlich weniger vital im Vergleich zur Sub1A-OE Überexpressions-Linie

C. Während der Regenerationszeit stirbt der WT vollständig ab, im Gegensatz dazu erholt sich die Sub1A-OE Linie

vor Überflutung Überflutung (16 Tage) Regeneration (7 Tage)

WT Sub1A-OE

A B C

WT Sub1A-OE WT Sub1A-OE

Submergence tolerant 1A (Sub1)

Gibberelline nehmen Einfluß auf Wachstum und Entwicklung

• Im Kurztag bildet Kohl nur Rosetten.

• GA-Applikation induziert „Schießen“ und Blütenbildung.

• Spinat bildet nur im Langtag Sprosse.

• GA-Applikation kann auch im KurztagSprossbildung induzieren.

KT- GA

LT- GAKT

+ GAKT

- GA

KT+ GA

KT = Kurztag

LT = Langtag

Abscisinsäure (ABA)-Struktur und Synthese-

Abscisinsäure(ABA)

• Sesquiterpen (15 C Atome,

Terpenoid)

• Syntheseweg: Carotinoide als

Ausgangsmoleküle; findet in

Plastiden und Zytoplasma statt

• Hat kurz- und langfristigen

Einfluss auf

Pflanzenentwicklung und

Stressadaption

Abscisinsäure (ABA)-Physiologie und Mutanten-

• Stressantwort

Trocken-, Salz- und

osmotischer Stress

Schließzellregulation

Pathogenabwehr

Entwicklungsprozesse

• Samen- und Knospenruhe

(Antagonist von GA)

• vegetatives Wachstum

• Seneszenz (vermehrte

Ethylenbildung)

CHLOROPLAST

ZYTOSOL

Abscisinsäure (ABA) wird aus Carotinoiden synthetisiert

Chloroplast:aus Carotinoiden wird Zeaxanthin gebildetdurch Epoxidationsreaktionenund Isomerisierung werden9-cis Neoxanthin oder 9-cis Violaxanthin gebildetDurch oxidative Spaltung wird Xanthoxin abgetrennt

ZytosolÜber verschiedene Reaktionen wird Xanthoxinin ABA umgewandelt

ABA insensitiv 1 (abi1-1)

ABA hemmt die Entwicklung von Keimlingen

WT abi1-1

• ABA im Medium hemmt die Entwicklung von WT-Keimlingen

• Keimlinge der abi1-1 Mutante entwickeln sich auch bei Anwesenheit von ABA ungehemmt weiter

Phytohormone 1

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Arabidopsis abi1-1 Mutanten zeigen gestörte Stomataregulation:Infrarot-Thermographie von Arabidopsis Keimlingen zeigen die erhöhteVerdunstungsrate der Blätter der abi1-1 Mutanten, die zu einer lokalenTemperatursenkung führt (rechts)

Abscisinsäure (ABA) Mutanten haben häufig deregulierte Stomata

Abscisinsäure wird durch Wassermangel induziert

Dynamik der ABA AntwortArabidopsis Keimlinge, deren Wurzeln einem osmotischen (Wasser-) Stress ausgesetzt werden, zeigen innerhalb von wenigen Stunden ABA-Reaktionen in den Keimblättern. pAtHB6::Luc = ABA-abhängiger Promotor treibt Luciferase Gen

Der Reiz „Wassermangel“, der in der Wurzel wahrgenommen wird, löst Signalwege aus, die zu spezifischen Reaktionen in anderen Organen führen!

Ethylen- Struktur und Synthese-

• Kohlenwasserstoff, brennbares Gas

• Syntheseweg: Methionin als

Ausgangsmoleküle

• ACC (Aminocyclopropancarboxylsäure), der

direkte Vorläuferstoff von Ethylen bildet die in

Pflanzen transportierbare Form

• Ethylenproduktion wird durch verschiedene

Faktoren ausgelöst:

Andere Phytohormone

Umweltbedingungen

Entwicklungsstadien

Ethylen

Ethylen-Physiologie und Mutanten-

• “Triple response” in dikotylen

Keimlingen

• Beteiligt am Wachstum von

Keimlingen

• Zellausdehnung und Struktur der

Zellwand

• Bildung von Wurzelhaaren

• Induziert Fruchtreife

Screen: Etiolierte Keimlinge 3 Tage in Dunkelheit mit Ethylen angezogen

Rezeptormutante

Ethylen löst Dreifachantwort in etiolierten Keimlingen aus

• Stark verlängertes Hypokotyl• Apikaler Haken

• Inhibition von Wurzel und Hypokotyl Elongation• Schwellung des Hypokotyl• Verstärkung des apikalen Haken („Kringel“)

Detail

- Ethylen (etioliertes Wachstum) + Ethylen (Dreifachantwort)

Ethylensynthese aus Methionin

Methionin wird unter Verbrauch von ATP zu S-Adenosyl-Methionin umgewandelt

Die ACC-Synthase spaltet dies in 5‘-Methylthioadenosin und ACC

5‘-Methylthioadenosin fließt in den Yang-Kreislauf zurück

ACC wird von der ACC Oxidase zu Ethylen verstoffwechselt

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Ethylen ist notwendig für Fruchtreife

Früchte von Wildtyp-Tomaten und ACC-Synthase RNAi Linien Tomaten wurden70 Tage lang (einzeln!) bei Raumtemperatur gelagert

WT-Kontrollfrüchte begannen nach 8-10 Tagen zu verrottenFrüchte der RNAi Linien zeigen starke Verzögerungen im Reifeprozess!

Regulation des BlattabwurfsDurch Auxin und Ethylen

Drei Phasen des Blattabwurfs:

1. Erhaltungsphase: Bevor die ersten Abwurfsignale wahrgenommen werden,

unterdrückt ein vom Blatt ausgehender Auxingradient die Ethylensensitivtät der

Trennungszone

2. Induktionsphase des Blattabwurfs: Reduktion oder Umkehr des Auxingradienten

löst Ethylensensitivität der Trennungszone aus

3. Abwurfphase: In der Trennungszone reagieren die sensitiven Zellen auf endogene

geringe Ethylenkonzentrationen und sekretieren Zellwand-auflösende Enzyme

Brassinosteroid (BR)

bri1 WT

• Erstmals wurde das BR Brassinolid

1979 in B. napus Pollen nachgewiesen

• BR löst Zellproliferation und –

Längenwachstum aus

Brassinolid

Rezeptormutante

Brassinosteroid (BR) „Bioassay“ zeigt Wirkungen biologisch aktiver BRs

• Zweites Internodium aus Bohnen in BR Lösung inkubieren

• Effekt auf Internodium abhängig von Konzentration:

niedrige BR Konzentration: Elongation und Wachstum

hohe BR Konzentration: Verdickung, Biegung, Spaltung

ansteigende BR Konzentration

Kontrolle(keine BR)

Brassinosteroide wirken in verschiedenen Entwicklungsprozessen

Rote Pfeile: ausgelöst durch BRBlaue Pfeile: inhibiert durch BRhigh: Effekt hoher BR Konzentrationenlow: Effekt geringer BR Konzentrationen

Salicylsäure

• Wird hauptsächlich aus Phenylallanin

synthetisiert

• Beteiligt bei Pflanzenwachstum und -

entwicklung

• Chloroplastenstruktur und

Photosynthese

• Vermittelt Abwehrreaktionen

Wichtig für systemic acquired

resistance (SAR)

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Salicylsäure vermittelt systemische Resistenz

Salicylic acid (SA), Methyl Salicylate (MeSA)

Jasmonat (JA) and Methyljasmonat (MeJA)

Jasmonsäure (JA) Methyljasmonat (MeJA)

Strigolactone

• Erstmals in Wurzeln identifiziert

Löst Samenkeimung parasitärer Pflanzen

aus (Striga spp. Strigolactone)

• Werden aus Carotinoiden gebildet

• Inhibieren Sprossverzweigung

• Lösen die Verzweigungen der Hyphen von

Mycorrhiza Pilzen aus

ccd8: Carotenoid cleavege dioxygenase 8(katalysiert einen essenziellen Syntheseschritt)

Zusammenfassung Wirkung von Phytohormonen

Die Perzeption eines Phytohormons erfolgt durch gewebespezifische

und entwicklungsabhängige Expression von Hormon-Rezeptoren

• Zeigen multiple Signalwirkungen (selten einzelne)

• Optimale Wirkung bei bestimmter Konzentration

• Wirkung eines Hormons ist häufig gewebespezifisch

• Zentrale Koordination von Wachstum und Entwicklung

• Beeinflussen sich untereinander, Übergänge sind oft fließend