Histochemie 33, 333--339 (1973) �9 by Springer-Verlag 1973

Zur Methodik der elektronenmikroskopischen Darstellung der Succinat-Tetrazoliumsalzreduktase mit TC-NBT

Gerd Egger

Institut fiir His~ologie und Embryologie der Universit~t Graz (Vorstand: Prof. Dr. W. Burkl)

Eingegangen am 19. gull und 6. September 1972

On the Methods for the Elect ron Microscopic Demons t ra t ion of Succinate-Tetrazol ium Salt Reductase with TC-NBT

Summary. Five conventional preparation methods were investigated with respect to their suitability for the electron microscopic demonstration of succinate-tetrazolium salt reductase in heart muscle. Specific results combined with satisfactory ultrastructural tissue preservation were obtained by means of freezing followed by thawing as well as by rinsing the tissue blocks in buffer solution just before incubation in saccharose-containing media. Reaction products were localized in the inner membrane and in the intermembrane and inter- cristal space. Some reasons for false interpretations are discussed.

Zusammen/assung. Fiinf gebr/~uchliche Pr~iparationsmethoden wurden auf ihre Eignung ffir die elektronenmikroskopische Darstellung der Succinat-Tetrazoliumsalzreduktase mit TC- :NBT am Herzmuskel untersueht. Frieren und Tauen wie auch Waschen der BlScke in Puffer vor der Inkubation in Medien mit Sacharosezusatz lieferten bei guter Strukturerhaltung spe- zifisehe Resultate. Reaktionsprodukt trat in der Innenmembran, zwischen Au6en- und Innen- membran und intracristal auf. Auf einige Qnellen ffir Fehlinterpretationen wird n~her ein- gegangen.

Einleitung In einer vorangegangenen Studio (Egger, 1972) habe ich aufgrund der Resul-

tare eigener Unte r suchungen und den Angaben in der Li te ra tur zeigen kSnnen, dab den elektronenmikroskopischen Nachweismethoden der SDH mi t Tetra- zoliumsalzen zur Zeit noah zahlreiche M/~ngel anhaf ten, die n icht zuletzt wieder Ursaehe fiir die e inander widersprechenden Ergebnisse der verschiedenen Autoren sind.

Die vorliegende A r b o r ha t die Analyse von fiinf in der Enzymhis tochemie h/~ufig angewand ten Pr / ipara t ionsmethoden zum Thema und schliet~t in der Problemstel lung an die oben zitierte A r b o r an, auf die zur Vermeidung yon Wiederholungen verwiesen wird.

Material und Methoden Material und Zusammensetzung des Mediums s. Egger (1972). Das TC-NBT stammte

toils yon Dr. Harms, Leverkusen, teils yon Sigma, St. Louis. Folgende Methoden wurden angewandt: Die Bl6eke wurden A. sofort nach ihrer Herstellung 20 rain inkubiert; B. nach einmaligem Einfrieren und Auftauen, 20, 40, 60, 90 und 120 rain inkubiert; C. 20 min in Puffer bei 37 ~ C gewasehen und 20, 40 und 90 rain inkubiert; D. 20 min bei 4 ~ C in 6,25% 2-Hydroxyadipaldehyd vorfixiert, 2 • 5 min bei 4~ in Puffer gewaschen und 20 und 40 min inkubiert; E. 20 min bei 4 ~ C in 6,25% 2-Hydroxyadipaldehyd vorfixiert, 2 • 5 min bei 4~ in Puffer gewaschen und nach einmaligem Frieren und Tauen 20 min inkubiert.

334 G. Egger: Elcktronenmikroskopie der Suecinat-Tetrazoliumsalzreduktion

Die [nkubationstemperatur bctrug 37 ~ C, als Puffer dietite 0,1 M Na-Phosphatpuffer pH 7,35. Fflr die Versuche mit 20 rain Inkubationszeit wurde der Puffer ohne Saeharose verwendet, fiir alle iibrigen dem Puffer 0,22 M Sacharose zugesetzt.

Die Weiterffihrung des Bl6eke erfolgte wie bei Egger (1972), nur zum Auswaschen der 2% 0s0~-L6sung wurde 0,9% NaC1-L6sung anstelle von Aqua dest. vcrwendet.

Kontrollen wurden durchgefiihrt unter Weglassen 1. des Substrates, 2. des Tetrazolimns mit Substratzusatz, 3. des Tetrazoliums und des Substrates.

Die Bl6eke reagierten hie gleichm/illig stark, sondern zeigten aueh naeh 1/ingeren lnku- bationszeiten an 0rientierungssehnitten Stellen mit kr/iftiger bis zu solchen ohne Enzym- reaktion. Orientierungsschnitte wurdcn daher stets von mehreren BlSeken eines Versuchs- ganges hergestellt und yon diesen die optimalen Stellen nach bestimmten gesiehtspunkten (s. Egger, 1972) ausgewghlt.

Ein Tell der elektronenniikroskoi)isehen Schnitte wurde nach R,eynolds kontrastiert. Naeh der lnkubation und dreimaligem Waschen wurden jedem einzelnen Versuehsgang

2 Bl6eke entnommen und daraus 10 bt dieke Gefrierschnitte zur liehtmikroskopisehen Kon- trolle hergestellt, die mffixier~ in Glyceringelatine eingeschlossen wurden. Ein Teil der Sehnitte at,s dem substratfreien Medium wurde 15 rain lang im Abstand von 20 cm mit einer UV- Lampe zur Darstelhmg substantiv gebnndenen Tetrazoliums bestrahlt (Egger, 1972).

Ergebnisse Bei Vcrwendung yon Puffer ohnc Sacharose waren auBer bei den Methoden D

und E Mitochondr ien zu schcn, die im Schni t tb i ld vcrl/~ngert erscheinende Cristae in der Ein- odes Mchrzahl aufwiesen. Der M c m b r a n a b s t a n d solcher Cristae be t rug oft das Doppe l te des Normalen und der in t racr i s ta le R a u m war s t a rker e lektronen- d ieh t als die umgebende Matr ix (Abb. 1). l ) iese Erscheinung blieb bei Aldehyd- vorf ixat ion sowie bei Sacharosezusatz aus.

Methods A. Schw/trzungon t r a t en in der Mi toehondr ienmat r ix , an des Innen- membran , an don Cristae und im l%aum zwischen Auf~en- und Innenn lembran wie bci Egger (1972) auf. An den Cristae konnten globulhre Schw/irzungeu yon 50- -80 A Durehmosser im A b s t a n d von 80- -100 .& festgestel l t werden (Abb. 4).

Die Betci l igung der einzelnen Mitochondr ien an der Reak t ion war sehr unter- sehicdlich (, ,Heterogenit/~t"). Kr 'Mtige Schw/irzungcn t r a ten hSufig an den Mombranen jener Cristae auf, die Verl/ingcrung mid Schwelhmg zeigen (Abb. 4). Die Kontro l len ohne Subs t r a t unterschiedon sich n icht yon den Versuchen mi t Subs t ra t .

L ichtmikroskopische Kont ro l l en : Fo rmazanab l age rung an den Mitochondrien. Befunde wie bei Egger (! 972).

Methods B. l%caktionsprodukt t r a t in dcr I n n e n m e m b r a n und an doren Aul~en- seite, wcniger hgufig in t raer is ta! auf (Abb. 2). Die Sehw/irzungen waren n ieh t gleichmii[]ig, sondern mul t ipe l en t lang der Membran ver te i l t ( , , spot ty reac t ion" , vgl. Ogawa uud Bar rne t t , 1964). An Stelleu, an denen ve rmehr t R e a k t i o n s p r o d u k t auf t ra t , bi ldetc es , ,Brfieken" zwischen den Membranen, deron A b s t a n d von- einandes ver r inger t war (Abb. 5). Solclle Kon t r~k t ionsa r t e f ak t e an Orten ves- mehr te r Fo rmazanab lage rungen wurden berei ts bei Sel igman st al. (1967) und Egger (1972) beschrieben. Es bes tand keine Heteroge~fit'~t, sondern p rak t i sch alle Mitochondsien zeigten in unterschiedl iehem Ausma{t Sehw~rzungon, die bei den l/~ngeren Inkuba t ionsze i t en zunabmcn. Die Matr ix blieb fsei.

Die Kontso l len ohne Subs t r a t zeigten gew6hnlich keine Reakt ion . Stellen- weise tratcn jedoch Schw~rzungen an den AuBenmembranen auf, und zwar meist

dort, we Mitoehondrien aneinanderstieBen. Diese Sehw~rzungen waren nieht

Abb. 1. Methode C, Kontrolle ohne Substrat , 20 min ohne Sacharose ink. ,,Verl~ngerte" Cristae (Pfeile), intracristaler Raum weiter und starker elektronendicht als bei normalen

Mitochondrien. 20000 • kontrast ier t

Abb. 2. Methode B, 60 min mit Sacharose ink. Reakt ionsprodukt vorwiegend zwischen AuBen- und Innenmembran , weniger reichlich intracristal. Beginnende Konfluenz der

Reaktionsherde bei dieser Inkubationszeit . 60000 • unkontras t ier t

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multipel, sondern erstreckten sich ohne Unterbreehung fiber einen Tell der Mito- chondrienzirkumferenz. Daneben waren maneherorts im Grundplasma wie aueh in Mitoehondrien starke bis massive Schw~rzungen in meist ringf6rmiger Anord- hug festzustellen, lbre Entstehung ist unklar, doch kSnnte es sich nach den licht- mikroskopischen Befunden um substantiv gebundenes Tetrazolium handeln.

Liehtmikroskopisehc Paralleluntersuchungen : Mit Substrat (m. S.) : Die Reaktion war bci gleicher Inkubationszeit und Topik deutlich st/~rker als bei Methodc A und der Reaktionsbereich gegen das Bloekinnere unscharf begrenzt. Eine starke Reaktion reiehte bis etwa 30 ~z Tiefe, weitere 20--30 ~z wiesen eine zunehmend blassere Blauf/irbung auf.

()hne Substrat (o.S.): Die Reaktiou war bei manchen B16cken vSllig negativ, bei anderen trat einc zarte Rosa- his Blauf/~rbung der Mitocbondricn auf. Nach 1/ingeren Inkubationszeiten nahm diese BlaufKrbung nieht oder kaum zu.

Ohne Substrat, mit UV bestrahlt (o.S.UV.): Eine blasse Blauf'~rbung der Mito- ehondrien ti'at auf, jedoeh auch das Plasma f~rbte sich geringffigig an. Die FKrbung nahln nach liingeren Inkubationszeiten zu. Mancherorts traten an der Blockober- fli~che dichte blauschwarze Granula vereinzelt oder in Gruppen auf, die den elcktronenmikroskopisch beobachteten ,,massiven Schw/~rzungen" entsprechen dfirften.

Methode C. Die Ergebnisse waren die gleichcn wie bei Methode B, doch blieben massive Sehw/irzungen aus.

Lichtmikroskopische ParMleluntersucbungen. m.S. : Starke Reaktion wie bei B, de,- Eindringbereieh umfaBte etwa 30--40 ~ und war scharf abgesetzt. - - o.S. : Ganz schwaehe Reaktion, die gegen das Blockinnere etwas zunahm. L/ingere Inkubationszeiten lieferten eine st/s Blauf~rbung. - - o.S.UV. : Die Farb- verteilung war gleich wie bei B, die Intensitht aber schw/ieher.

Methode D. Deutliche Schw/irzungen traten meist zwischen Aulten- und Innen- membran, selten intraeristal auf (Abb. 3). Eine I-[eterogonit/it war festzustellen. Der Erhaltungszustand der Mitoehondricn war nicht so gut wie bei unfixierten B15eken. So war der Abstand zwischen Aul]en- und Innenmembran sowie der eine Crista bildenden Membranen h/iufig unregelm/~i]ig und die Mitochondrien oft verformt. Die Osmierung fiel sehr ungleichm~13ig aus: In manchen B16cken war sie zufriedenstellend, in andereu /iul]erst kontrastarm. Dann wieder traten intensive SchwSrzungen und Vergr6berungen yon Membranen und Grundplasma- bezirken auf. Dadurch war es stellenweise unm6glich zu beurteilen, inwieweit Sehw/irzungen abgelagertem Formazan entsprachen (Abb. 3). Manehmal traten massive SehwSrzungen an den AuBenmembranen auf, die, wie die liehtmikro- skopischen Befunde schliegen /assen, auf substantiv gebundenes Tetrazolium zurfickzuffihren sein dfirften.

Liehtmikroskopisehe Paralleluntersuchungen. m.S. : Positive Reaktion, etwa der yon A entspreehend. Die Eindringtiefe ist geringer als bei uufixierten B16cken (etwa 20 p.) und die Grenze gegen das nichtdurehdrungene Gewebe scharf. - - o.S. : Negative l~eaktion. - - o.S.UV. : Es trat eine starke Blauf/irbung der Mito- ehondrien und daneben auch im Plasma auf. Die Farbintensit~t erreichte fast die St/irkc der im Medium m.S. inkubierten Bl6cke.

Methode E zeigte elektronenmikroskopisch keine Untersehiede zu D.

Elektronenmikroskopie der Succinat-Tetrazoliumsalzreduktion 337

Abb. 3. Methode D, 20 min ohne Sacharose ink. Die Schw~rzungen bei 1 und 2 sind ver- mutlich spezifisch, bei 3 vermutlich substantiv gebundenes Tetrazolium. 50000 • un-

konstrastiert

Abb. 4. Methode A, 20 min ohne Sacharose ink. Ausschnitt aus einer ,,verl~ngerten" und geschwollenen Crista. Globul~re Schw~rzungen in den Membranen. 40000 X, auf 400000 X

nachvergrSllert, unkontrastiert

Lichtmikroskopische Par~l le luntersuchungen. m.S. : Die Reakt ion war schw~- cher, die Eindringt iefe gr6Ber als bei D (50---60 ~), und gogen das Blockinnere unschaff begrenzt. - - o.S., o.S.UV. : entsprachen der Methode D.

Tetrazolium/reie Kontrollen A - - E zeigten die beschriebenen Schw~rzungen nicht . Die Schwellungen und Verl~tngerungen einzelner Cristae nach I n k u b a t i o n in sacharosefreiem Puffer t r a t en - - mi t Ausnahme nach Aldehydvorf ixat ion - -

338 (~. Egger:

Abb. 5. Methode B, 60 min mit Sacharose ink. Ausschnitt aus eincr Crista. Reaktionsprodukt in der Membran bei 1, Briickenbildung bei 2. Aul3erhalb der Reaktionszonen trit t das trila- mell/ire Bild der Mcmbranen in Erseheinung. 40000 • auf 400000 • nachvcrgriiBcrt, un-

kontrastiert

auch hier auf. Ein Unterseh ied zwisehen I n k u b a t i o n c n mi t und solche ohne Sub- s t r a t war n ieht festzustel len. Sel ten waren vereinzel t oder in Gruppen l iegende Mitoehondr ien zu beobaeht, en, deren Mat r ix homogene Sehw/~rzungen aufwies. Ungleiehm/i[3ige Osmierungsergebnisse tra.ten naeh Aldehydvor f ixa t ion auf.

Diskussion

Prgpa ra t i onsme thode A l iefert unspezifisehe Resu l t a te und ist deshalb un- geeignet. I m Gegensatz dazu zeigten Para l le lversuche mib den Te t razo l iumtypen N B T und TNBT unte r gleichen Bedingungen nur geringffigige unspezifisehe Formazanb i ldung . (~ber die Bedeutung der globulgren Schwgrzungen, die aueh bei den Methoden B und C gefunden wurden, kann vorei 'st n ichts ausgesagt werden. Ahnl iche Gebilde s te l l ten Ogawa und Bar rne t t (i 965) fest.

Bei den Methoden B - - D konntc die unspezifisehe Reduk t ion des I nd ika to r s dureh vcrschiedene Behandlungen der B16cke v e t der I n k u b a t i o n vermieden werden: 1. Dutch Fr ie ren und Tauen. 2. Dureh Waschcn in Puffer. Das Wasehen gesehah mi t der Absieht , die sog. endogenen Subs t ra te zu entfernen. Die Tem- pe ra tu r von 37~ wurde deshalb gewiihlt, um Subs t ra t r e s t e enzymat i sch zu verbrauchen. Da ParMlelversuehe bei 4 c C jedoeh die gleiehen Resu l ta te er- brachten, is t die Annahme offensichtl ich nicht ha l tbar . 3. Din'oh kurzdauernde F ixa t ion .

Die Vorstel lung, dal3 endogene Subs t ra te die unspezifische Redukt, ion bei Methode A bewirken (Seligman et al., 1967), die yon mir in meiner ersten Studie i ibernommen wurde (Egger, 1972), scheint du tch diese Result,ate widerlegt ; denn obwohl beim Fr ie ren und Tauen bei B endogene Subs t ra te n icht ent fernt wurden und daher wie bei Methode A hg t t en wirksam werden mfissen, t r a t kaum un- spezifisehe Fo rmazanb i ldung auf. Es is t eher wahrseheinl ich, dab die bei diesen Methoden erzielte Spezif i tgt du tch Des in tegra t ion des zellulgren Feingeffiges hervorgerufen wird, wodurch zwar der Zitrat ,zyklus und seine Subs t ra t l ie ferung unterbroehen werden, hingegen einzelne widerstandsffihige Bruehst i icke, wie de,' S D H - K o m p l e x , funkt ionsfghig bleiben.

Elektronenmikroskopie der Succinat-Tetrazoliumsalzreduktion 339

Eine Vorfixierung mit Hydroxyad ipa ldehyd ist nach M6glichkeit zu ver- meiden, da sie zu einer schlechten 0smierbarkei t und erhShten Substantivit / i t des Gewebes fiihrt. Sie ist au6erdem zur Darstellung der SDH im Herzmuskel entbehrlich, da weder eine Verlagerung des Enzyms, noeh eine mangelhafte St rukturerhal tung (vide Hayos und Kerpel-Fronius, 1970) zu befiirchten sind.

Die Methoden B und C liefern spezifisehe I~esultate bei guter Strukturerhal- tung und sind daher D und E vorzuziehen. Frieren und Tauen erh6ht die Ein- dringrate, in geringem Ma6 aber auch die Substantivit/~t von TC-NBT. Eine meehanische Seh/idigung der Zellstruktur durch Eiskristallbildung konnte in den untorsuehten AuflSsungsbereichen (Originalvergr56erungen bis zu 40000 x ) nicht festgestellt werden, desgleichen keine Anzeichen f/ir eine Vorlagerung des Enzyms, das an die Innenmembran gebunden ist (Ernster und Kuylenstierna, 1970). I m Gegensatz zu A reagierten bei B und C alle Mitochondrien. Letztere Methoden iiben offenbar eine St imulat ion auf die Enzymt/~tigkeit aus, was mSglicherweise auf den Wegfall hemmender regulatorischer Einfliisse (vide Egger und Rappor t , 1963; Ernster und Kuylenstierna, 1970) zuriickzufiihren ist.

Literatur Egger, G. : Zur Problematik der elektronenmikroskopischen Darstellung der Suecinodehydro-

genase mit dem osmiophilen Tetrazoliumsalz TC-NBT. Histoehemie 80, 60--72 (1972). Egger, E., l~apport, S. : Die Aktivierung und Freisetzung yon Mitochondrienenzymen und

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Seligman, A.M., Ueno, H., Morizono, Y., Wasserkrug, H.L., Katzoff, L., Hanker, J. S.: Electron microscopic demonstration of dehydrogenase activity with a new osmiophilic ditetrazolium salt (TC-NBT). J. Histochem. Cytochem. 15, 1--13 (1967).

Dr. Gerd Egger Institut fiir Histologie und Embryologie der Universitiit Graz A-8010 Graz Universit~tsplatz 4 0sterreich