Zur Synthese und Analyse von Sterylglycosiden als nachwachsende Rohstoffe

Diplomarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades eines Magisters der Naturwissenschaften

vorgelegt von

Christopher LUDWIG

Am Institut für Chemie Arbeitsgruppe Nachwachsende Rohstoffe

Begutachter: Ao.Univ.-Prof. Mag.rer.nat. Dr.phil.Martin Mittelbach

Graz, 2015

Danksagung

Ich möchte mich bei all jenen bedanken, die mich im Zuge meines Studiums als auch meiner

Diplomarbeit unterstützt haben.

Ganz besonders möchte ich mich bei Prof. Dr. Martin Mittelbach für die Bereitstellung des Themas

sowie der fachlichen Betreuung bedanken.

Weiters möchte ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe NAWARO für die fachliche Unterstützung,

vielmehr aber noch für einen neu erhaltenen Freundeskreis bedanken. Ganz besonders danke ich an

dieser Stelle DI Philipp Marco Neu, Stephanie Flitsch, MSc. und Aline Silva Muniz, MSc.

Mein Dank gilt außerdem Dr. Tibor Czabany, Institut für Biotechnologie und Bioprozesstechnik TU

Graz, für die fachliche Unterstützung.

Christina Rother, BSc. möchte ich ganz besonders für ihre Geduld, die fachliche als auch für die

mentale Unterstützung, beziehungsweise einfach für alles danken.

Außerdem möchte ich mich noch bei meinen Eltern bedanken, die mir das Studium erst ermöglicht

haben.

Abschließend danke ich noch meiner Familie sowie meinen Freunden: Danke fürs Dasein.

Kurzfassung

Sterylglycoside (SGe) sind natürliche, in Pflanzen vorkommende Sterolderivate, die sowohl in freier,

als auch in acylierter Form (ASGe) vorliegen können. In acylierter Form sind diese, aufgrund der

unpolaren Fettsäurekomponente, in Pflanzenölen wie Sojaöl, Palmöl oder Rapsöl, aus denen unter

anderem Biodiesel hergestellt wird, gut löslich. In der Biodieselproduktion werden Pflanzenöle,

genauer gesagt Triacylglyceride, mit Methanol in Fettsäuremethylester (FAME) umgeestert. Bei

dieser Reaktion entstehen, neben dem gewünschten Produkt, auch Nebenprodukte. Unter anderem

werden aus ASGen nicht acylierte SGe gebildet, welche bei der Lagerung von Biodiesel ausfallen.

Diese Präzipitate können zur Verstopfung von Treibstofffiltern führen. Durch den hohen

Schmelzpunkt dieser Verbindungen haben sie außerdem einen negativen Einfluss auf das

Fließverhalten von Biodiesel bei kalten Temperaturen und können damit zu Motorversagen führen.

In Zuge dieser Arbeit werden SGe auf drei verschiedene Arten synthetisiert, bereits bekannte

Methoden modifiziert beziehungsweise in der Literatur noch nicht beschriebene Methoden

angewendet. Des Weiteren werden die Vor- und Nachteile der Methoden anhand ihrer Ausbeute,

Reinheit und der effektiven Arbeitszeit verglichen, sowie ein grober Vergleich der entstehenden

Kosten durch Chemikalien getätigt. Die synthetisierten SGe sollen als Modellverbindungen für neue

Analysemethoden dienen. Neben der Synthese werden außerdem verschiedene Analysemethoden

wie NMR-Spektroskopie, MS-TOF sowie Gaschromatographie angewendet und beschrieben und

deren Vor- und Nachteile herausgehoben. Außerdem wurden verschiedene Versuche getätigt,

acylierte Sterylglycoside enzymatisch, mittels einer Lipase, aus Sterylglycosiden herzustellen. Weiters

wurde Rapsbiodiesel gaschromatographisch vermessen und dessen Gehalt an verschiedenen

Sterylglycosiden bestimmt.

Abstract

Sterylglycosides (SGs) are natural derivates of sterols that occur in various plants either as free SGs or

as acylated compounds (ASGs). The acylated form is, due to the non-polar fatty acid component,

soluble in edible oils like soybean oil, palm oil or rapeseed oil, which are inter alia raw materials for

biodiesel production. In biodiesel production, plant oils, or to be more precise, triacylglycerols are in

a transesterification reaction with methanol transformed into fatty acid methyl esters (FAME). In this

reaction, besides the favored product, various by products occur. One of these by-products are SGs,

that are made of acylated SGs, which precipitate during storage of biodiesel. These precipitations can

lead to problems like clogging of filters. Due to the high melting point of these compounds, they also

have a negative influence on the fluidity of biodiesel, especially at low temperatures, which can lead

to engine failures. In this paper, SGs were synthesized in three different ways. Already known

methods were modified respectively in literature not yet described methods were used. Next to the

description of synthesis, also the advantages and disadvantages of the different methods, concerning

the yield, the purity of the products as well as the working hours investigated are discussed.

Moreover, the methods are compared regarding the costs of the raw materials which were used. The

synthesized SG should be used as model compounds for new methods of analysis. Furthermore,

different methods of analysis, like NMR-spectroscopy, MS-TOF as well as gas chromatography are

described and utilized. Also the pros and cons of the analysis-methods are pointed out. Moreover,

different experiments for enzymatic production of ASGs from SGs were carried out. Besides,

rapeseed-fatty acid methyl ester was analyzed by gas chromatography and the content of SGs was

determined.

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................................ 8

1 Einleitung ....................................................................................................................................... 10

2 Grundlagen und Theorie I: Sterylglycoside ................................................................................... 12

2.1 Sterole ................................................................................................................................... 12

2.1.1 Zoosterole ...................................................................................................................... 12

2.1.2 Phytosterole .................................................................................................................. 13

2.1.3 Mycosterole ................................................................................................................... 14

2.2 Sterylglycoside ....................................................................................................................... 15

2.2.1 Biosynthese von Sterylglycosiden ................................................................................. 15

2.2.2 Synthese von Sterylglycosiden ...................................................................................... 16

2.2.3 Vorkommen von Sterylglycosiden ................................................................................. 19

2.2.4 Die Biodieselproblematik .............................................................................................. 21

2.2.5 Entfernung von Sterylglycosiden aus Biodiesel ............................................................. 22

2.2.6 Analyse von Sterylglycosiden ........................................................................................ 24

3 Grundlagen und Theorie II: Analytische Methoden-Allgemein ..................................................... 28

3.1 Chromatographie .................................................................................................................. 28

3.1.1 Adsorptionschromatographie ....................................................................................... 30

3.1.2 Verteilungschromatographie ........................................................................................ 30

3.1.3 Größenausschlusschromatographie-GPC ...................................................................... 32

3.2 Massenspektrometrie ........................................................................................................... 33

3.2.1 Ionisierung ..................................................................................................................... 33

3.2.2 Analysatoren .................................................................................................................. 36

3.3 Kernspinresonanzspektroskopie-NMR .................................................................................. 38

4 Material und Methoden ................................................................................................................ 39

4.1 Lösungsmittel und Reagenzien .............................................................................................. 39

4.2 Geräte .................................................................................................................................... 41

4.2.1 Probenvorbereitung ...................................................................................................... 41

4.2.2 GC-MS ............................................................................................................................ 41

4.2.3 HPLC-TOF-MS................................................................................................................. 41

4.2.4 NMR-Spektroskopie ....................................................................................................... 41

4.2.5 GC-FID ............................................................................................................................ 41

4.3 Synthese von Cholesterylglycosiden ..................................................................................... 42

6

4.3.1 Synthese durch Koenigs-Knorr Methode ...................................................................... 42

4.3.2 Synthese durch Trichloracetimidat-Methode ............................................................... 44

4.3.3 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit Saccharose als Edukt..................... 47

4.4 Versuch der enzymatischen Herstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-

glucopyranosid .................................................................................................................................. 49

4.5 Probenvorbereitung für die qualitative und quantitative Analyse von Pflanzenölen und

Biodiesel auf Sterylglycoside ............................................................................................................. 50

4.6 Analytik .................................................................................................................................. 50

4.6.1 GC-MS ............................................................................................................................ 51

4.6.2 GC-FID ............................................................................................................................ 51

4.6.3 TOF-MS .......................................................................................................................... 51

4.6.4 NMR-Spektroskopie ....................................................................................................... 52

5 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................................ 52

5.1 Synthese durch Koenigs-Knorr Methode .............................................................................. 52

5.1.1 Synthese von β-D-Glucose-Pentaacetat [99] ................................................................ 53

5.1.2 Synthese von Acetobromoglucose ................................................................................ 53

5.1.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid durch Koenigs-

Knorr-Mechanismus ...................................................................................................................... 54

5.1.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid ............................................................. 55

5.2 Synthese durch Trichloracetimidat-Methode ....................................................................... 58

5.2.1 Synthese von 2,3,4,6-tetra-acetyl-D-glucose ................................................................ 58

5.2.2 Synthese von O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranosyl)-trichloracetimidat ............ 59

5.2.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid ......................... 61

5.2.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid ............................................................. 62

5.3 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit Saccharose als Edukt ............................ 65

5.3.1 Synthese von Octa-O-Benzylsaccharose ....................................................................... 66

5.3.2 Synthese von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose ................................................ 67

5.3.3 Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranosyl)trichloracetimidat ........... 70

5.3.4 Synthese von Cholesteryl-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid) ..................... 71

5.3.5 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid ............................................................. 72

5.4 Vergleich der verschiedenen SG-Synthesemethoden ........................................................... 75

5.5 Versuch der enzymatischen Herstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-

glucopyranosid .................................................................................................................................. 77

5.5.1 Versuch mit reinem Hexan als Lösungsmittel ............................................................... 78

5.5.2 Versuch mit Hexan nach vorherigem Lösen des Substrates in Chloroform .................. 81

7

5.5.3 Versuch mit THF/Pyridin 4:1 als Lösungsmittel ............................................................. 82

5.6 Qualitative und quantitative Analyse von Biodiesel auf den Gehalt von Sterylglycosiden .. 84

6 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................................... 86

8 Tabellenverzeichnis ....................................................................................................................... 98

9 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................................... 98

10 Anhang..................................................................................................................................... 101

8

Abkürzungsverzeichnis

ABG Acetobromoglucose

ac Wechselspannung

APCI Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck

ASG Acyliertes Sterylglycosid

CDP Cytidindiphosphat

CFPP Cold Filter Plugging Point

CP Cloud Point

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en

DC Dünnschichtchromatographie, Dünnschichtchromatogramm

dc Gleichspannung

DCM Dichlormethan

GTATH Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-trichloracetimidat

Enz. Enzym

EI Elektronenstoßionisation

ELSD Evaporative Light Scattering Detector, Lichtstreudetektor

ESI Elektrosprayionisation

FAME Fettsäuremethylester

FG Frischgewicht

FID Flammenionisationsdetektor

GC Gaschromatographie, Gaschromatograph

GLC Gas-Liquid-Chromatography

GPA Glucosepentaacetat

GPC Gelpermeationschromatographie

GTA Glucosetetraacetat

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HRMS High Resolution Mass Spectronomy

IS Interner Standard

LC Liquid-Chromatography

LLC Liquid-Liquid-Chromatography

m/z Masse zu Ladungs-Verhältnis

MALDI Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization

MHz Megahertz

9

MS Massenspektrometer, Massenspektrum

MSTFA N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamid

NMR Kernspinresonanz

n.d. nicht detektierbar

NP Normalphase

PI Photoionisation

ppm parts per million

Rf Retentionsfaktor

RP Reversed Phase

rpm revolutions per minute

RT Raumtemperatur

SG Sterylglycosid

SN1 Nucleophile Substitution erster Ordnung

SN2 Nucleophile Substitution zweiter Ordnung

SEC Size Exclusion Chromatography

SPE Solid Phase Extraction

TBG Tetrabenzylglucose

TDP Thiamindiphosphat

TG Triacylglycerid

THF Tetrahydrofuran

TMS Trimethylsilan

TMSOTf Trimethylsilyl trifluoromethansulfonat

TOF Time of Flight

UDP Uridindiphosphat

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography

UV Ultraviolett

VIS Visible

WLD Wärmeleitfähigkeitsdetektor

10

1 Einleitung

Bei Biodiesel handelt es sich um einen häufig eingesetzten erneuerbaren Kraftstoff, der eine direkte

Alternative zu fossilen Energiequellen darstellt. Dieser wird aus in Pflanzenölen enthaltenen

Triacylglyceriden durch eine Umesterungsreaktion mit Methanol hergestellt, wodurch die Fettsäuren

vom Glyceringrundgerüst abgespalten werden und es in weiterer Folge zur Herstellung von

Fettsäuremethylestern und Glycerin kommt. In Pflanzen sind unter anderem auch freie

Sterylglycoside (SGe) und acylierte Sterylglycoside (ASGe), welche mitunter zur Membranstabilität

beitragen, enthalten. ASGe sind mit einer Fettsäure verestert und befinden sich, nach der Herstellung

des Pflanzenöls aus der Pflanze, in gelöster Form auch in diesem wieder [1]. Bei der

Umesterungreaktion, im Zuge der Biodieselherstellung, kommt es zur Abspaltung des

Fettsäurerestes, woraus Sterylglycoside in freier Form resultieren [1]. Bei ASGen handelt es sich

aufgrund der Fettsäurekomponente um sehr unpolare Verbindungen, die sowohl im Pflanzenöl als

auch im Biodiesel löslich sind. Nach der Abspaltung der Fettsäurekomponente stellt das daraus

resultierende Sterylglycosid (SG), aufgrund der Absenz der unpolaren Fettsäurekomponente, eine

polarere Verbindung dar. Da in der Chemie der Grundsatz „Similia similibus solvuntur“ also „Gleiches

löst Gleiches“ gilt, bedeutet das, dass SGe in unpolaren Lösungsmitteln, wie dies Biodiesel im

weitesten Sinne darstellt, nicht löslich sind. Diese benötigen jedoch einige Zeit zur Präzipitation,

wodurch eine Abtrennung im Zuge des Herstellungsprozesses nicht möglich ist. Durch die Lagerung

vergeht indes Zeit, in der sich diese Feststoffe bilden, und beispielsweise Filter und Düsen verstopfen

können. Zum einen tritt dieses Problem schon bei der Lagerung in den Tanks an, zum anderen kann

dies auch beim Endverbraucher noch zu Leistungseinschränkungen bis hin zu Motorschäden führen,

wobei dies vermehrt bei kalten Temperaturen zu beobachten ist. Die Konzentration, bei denen SGe

Probleme verursachen beträgt unter 20 ppm [2], jedoch existieren zur Entfernung von SGen aus

Biodiesel keine Methoden, welche eine ausreichende Wirkung hinsichtlich der negativen

Eigenschaften auf die Filtrierbarkeit aufweisen (vgl. Kapitel 2.2.5). Neben dem direkten negativen

Einfluss der SGe auf die Fluidität, stehen diese außerdem im Verdacht, für das Ausfallen anderer

Stoffe verantwortlich zu sein, also als Impfkristalle zu wirken, wodurch es zu einer weiteren

Verschlechterung des Fließverhaltens kommt [3]. Deshalb ist es wichtig, dass zur Untersuchung von

Biodieselproben Analysen zur Verfügung stehen, welche eine möglichst niedrige Nachweisgrenze

aufweisen. Zur Entwicklung selbiger bedarf es unter anderem an Modellverbindungen, um die

Quantifizierung von Sterylglycosiden durch den Vergleich mit internen Standards durchführen zu

können.

11

Zur Entwicklung solcher sensitiven Methoden war es Ziel der Diplomarbeit, eine neue, effizientere

Methode zur Herstellung von Sterylglycosiden zu entwickeln. Im weiteren Sinne, waren folgende

Aufgabenstellungen zu bewerkstelligen:

Literaturteil:

Das Vorkommen und die Unterteilung von Sterolen sowie deren biochemische Bedeutung

Was sind Sterylglycoside, wo und in welcher Form kommen sie vor? Was ist die biologische

beziehungsweise biochemische Bedeutung von Sterylglycosiden?

Die Problematik von Sterylglycosiden in Biodiesel. Warum kommt es zu Problemen? Welche

Möglichkeiten gibt es, um Sterylglycoside aus Biodiesel zu entfernen?

Welche Synthese- und Analysemethoden für Sterylglycoside sind bekannt beziehungsweise

werden angewendet?

Praktischer Teil:

Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mittels verschiedener Methoden.

Modifizierung der Methoden beziehungsweise Entwicklung einer neuen Methode zur

Ausbeutesteigerung und zur Ersparung zeitintensiver säulenchromatographischer

Trennungen.

Charakterisierung der hergestellten Verbindungen durch diverse instrumentell-analytische

Verfahren.

Versuch der Herstellung von acylierten Sterylglycosiden durch enzymatische Veresterung.

Bewertung

Bewertung der untersuchten Methoden hinsichtlich ihrer Effizienz bezüglich der Ausbeute,

sowie der investierten Zeit als auch den verwendeten Chemikalien.

12

2 Grundlagen und Theorie I: Sterylglycoside

2.1 Sterole

Sterole sind wichtige, in der Natur vorkommende Verbindungen, die der Gruppe der Steroide

angehören. Die Grundstruktur der Sterole ist das Steran, an dem sich eine 3β-Hydroxygruppe

befindet. Bei der Grundstruktur sind drei Cyclohexanringe, meist trans-verknüpft, mit einem

Cyclopentanring verbunden [4]. Die Einteilung wird, je nach Herkunft, in Zoosterole (in Tieren),

Phytosterole (in Pflanzen) und Mycosterole (in Pilzen), vorgenommen [4].

Abbildung 1: Grundgerüst der Sterole

2.1.1 Zoosterole

Zoosterole nehmen eine zentrale Rolle im Stoffwechsel von Tieren ein, viele von ihnen besitzen

physiologische Aktivität. Das am weitesten verbreitete Sterol ist das Cholesterol, welches,

zurückzuführen auf die Anzahl von acht Stereozentren, eine Anzahl von 256 Stereoisomeren besitzt,

wobei nur die Hälfte davon in der Natur vorkommt [5]. Cholesterol kommt bei Menschen und Tieren

in großen Mengen, vor allem im Gehirn und in Rückenmark, vor. So befinden sich im Körper eines

erwachsenen Menschen beispielsweise 200-300 g Cholesterol. Dieses ist Verursacher zahlreicher

Krankheiten, wie beispielsweise Arteriosklerose, Herzerkrankungen sowie ein nicht unwesentlicher

Bestandteil von Gallensteinen. Cholesterol fungiert jedoch auch als Ausgangsstoff für die Synthese

von Steroidhormonen im Körper, als auch für die Produktion von Gallensäure. Weiters werden aus

Cholesterol, über den Zwischenschritt der Pregnenolon-Synthese, die Geschlechtshormone Östradiol

und Progesteron gebildet [6]. Die zwei Hauptaufgaben im Organismus sind zu einem die Stabilisation

von Zellmembranen, zum anderen die Resorption von Fettsäuren im Darm [4].

13

Abbildung 2: Strukturformel von Cholesterol

2.1.2 Phytosterole

Phytosterole kommen in praktisch allen höheren Pflanzen vor und tragen einen wesentlichen Beitrag

zur Stabilität pflanzlicher Zellmembranen bei. Vom Cholesterol unterscheiden sich pflanzliche Sterole

dahingehend, dass sie eine zusätzliche Methyl- oder Ethylgruppe besitzen [5]. Aufgrund der

unterschiedlichen Lage von Doppelbindungen und variablen Seitenketten kommt in Pflanzen eine

Vielzahl unterschiedlicher Phytosterole vor. Die Stereoisomere mitinbegriffen, wurden bereits mehr

als 250 verschiedene Verbindungen nachgewiesen [7]. Diese Vielfalt lässt sich durch die oft nur

geringen Unterschiede erklären. So besitzen beispielsweise Sitosterol und Stigmasterol beide eine

Ethylgruppe am C-24 Atom und unterscheiden sich lediglich durch die Doppelbindung am C-22 Atom.

Bei den am häufigsten in Pflanzen vorkommenden Sterolen handelt es sich um β-Sitosterol,

Campesterol und Stigmasterol, welche, hinsichtlich der Aufnahme an Phytosterolen, 65%, 30%

beziehungsweise 3% der menschlichen Ernährung ausmachen [8]. Stigmasterol stellt beispielsweise

12-25% des unverseifbaren Anteils des Sojaöls dar [9]. Auch Cholesterol kommt in Pflanzen vor, spielt

aber aufgrund der geringen Konzentration in der Ernährung eine vernachlässigbar kleine Rolle [10].

Neben freien Phytosterolen kommen diese in der Natur unter anderem auch noch in veresterter

Form, wie beispielsweise als Sterylglycoside und acylierte Sterylglycoside vor.

Abbildung 3: Strukturformeln von a) Sitosterol, b) Stigmasterol, c) Campesterol

14

Das Vorkommen von Phytosterolen lässt sich vor allem in fettreichen Pflanzenteilen wie Samen oder

Nüssen beobachten, wohingegen in frischem Obst und Gemüse in der Regel nur wenige Sterole

enthalten sind. (vgl. Tabelle 1) [11]. Im Organismus haben Phytosterole, sowie auch einige Derivate,

eine cholesterolsenkende Wirkung, weshalb sie auch bei der Therapie und Vorbeugung von

Hypercholesterolämie eingesetzt werden [12]. Diese Eigenschaft beruht darauf, dass Phytosterole,

durch die cholesterolähnliche Struktur, an dessen Stelle absorbiert werden, wodurch es zu einer

vermehrten Ausscheidung und somit zu keinem Anstieg in der Gallensäureexkretion kommt [13].

Tabelle 1: Phytosterolgehalte in ausgewählten Lebensmitteln [11]

Lebensmittel Phytosterolgehalt [mg/100 g]

Saaten und Nüsse 68-404 Sesamsaat 404 Sonnenblumenkerne 322 Mandeln 208 Pflanzliche Öle 129-1557 Maisöl 809-1557 Weizenkeimöl 967 Rapsöl 250-979 Sonnenblumenöl 374-725 Olivenöl 177 Getreideprodukte 4-344 Weizenkeime 344 Roggenmehl 86 Maismehl 53 Weizenbrot 50 Gemüse 4-50 Obst 1-44

2.1.3 Mycosterole

Mycosterole sind jene Sterole, die in Pilzen vorkommen. Grundsätzlich sind alle Pilze und Hefen in

der Lage, Sterole zu synthetisieren [14]. Das wichtigste der Mycosterole ist das Ergosterol, dessen

Funktion es unter anderem ist, den Zellmembranen von Pilzen Stabilität zu verleihen, so

beispielsweise im Hefepilz. Des Weiteren handelt es sich dabei um Provitamin D2, welches durch UV-

Strahlung in Vitamin D2 umgewandelt werden kann [15]. Ergosterol befindet sich auch in der

Zellwand von Schimmelpilzen. Nachdem die Synthese dieses Sterols sauerstoffabhängig ist, erklärt

dies auch, weswegen die meisten Schimmelpilze ein Wachstum unter aeroben Bedingungen

aufweisen [16].

15

Abbildung 4: Strukturformel von Ergosterol

2.2 Sterylglycoside

Sterylglycoside (SGe) sind chemisch gesehen, neben Saponinen, Estrogenglycosiden und

Herzglycosiden, eine Unterkategorie der Steroidglycoside [17]. Sterylglycoside kommen in der Natur

in einer Vielzahl von Pflanzen, aber auch in Pilzen, Bakterien, Algen und Tieren, beispielsweise in der

Epidermis von Schlangen vor [18]. Es handelt sich dabei um Sterole, die, meist β-D-glycosidisch, mit

einem Monosaccharid verbunden sind. Es kommen jedoch auch α-D-glycosidische Bindungen vor,

wie dies bei dem gram-negativen Bakterium Heliobacter pylori der Fall ist [19]. Als Zuckergrundgerüst

können verschiedene Einfachzucker wie Galactose, Mannose, Xylose oder Arabinose dienen, wobei

das Steryl-β-D-monoglucopyranosid das mit Abstand am häufigsten vorkommende Sterylglycosid

darstellt [20]. Sterylglycoside tragen, wie auch freie Sterole, zur Stabilisierung von Zellmembranen

bei, wobei eine Cholesterolkomponente eine bessere Wirkung aufweist, als dies bei Sitosterol oder

Stigmasterol der Fall ist [21]. Sitosteryl-Glycosid dient beispielsweise als Ausgangsstoff für die

Biosynthese von Cellulose, in dem es als Glucosedonator bei der Polymerisation von Glucanketten

fungiert [22]. Weiters ist bekannt, dass SGe eine positive Auswirkung auf die Membraneigenschaften,

ganz besonders auf jene der Proteininteraktionen, haben [23]. Außerdem wird vermutet, dass SGe

einen Einfluss auf die Umweltanpassung von Pflanzen hinsichtlich deren Hitze- und

Kälteempfindlichkeit haben [23]. Eine weitere Funktion, welche SGen im Organismus zukommt, ist

bei der Glycosylierung von Ceramidmolekülen, bei der sie als Glucosedonatoren wirken, indem sie als

Glucosecarrier zwischen UDP-Glucose und Ceramid fungieren [24]. Im Organismus haben SGe

außerdem einen positiven Einfluss auf das Immunsystem, da sie die Lymphozytenzahl erhöhen [25].

Außerdem besitzen SGe, durch die Inhibierung entzündungsfördernder Stoffe, eine

entzündungshemmende Wirkung [26].

2.2.1 Biosynthese von Sterylglycosiden

Die Biosynthese von Sterylglycosiden erfolgt durch eine enzymatische Reaktion, bei der die

Enzymklasse der Sterylglycosyltranferasen, die ihrerseits menbrangebundene Enzyme darstellen,

16

diese Reaktion katalysiert. Sterylglycosyltranferasen übertragen hierbei ein aktiviertes

Zuckernucleotid, meist in Form der UDP-Glucose auf eine Sterolkomponente. Genauer kommt es bei

dieser Reaktion zu einer Glycosylierung des Sterols an der 3β-Hydroxygruppe, woraus das 3β-D-

Glycosid resultiert [27].

Abbildung 5: Biosynthese von Stigmasteryl-β-D-glucopyranosid

Diese Sterylglycosyltransferasen besitzen hinsichtlich des Glycosyldonors eine hohe

Substratspezifität. So findet beispielsweise bei der Anwesenheit von UDP-Galaktose als auch bei

UDP-Mannose keine Umsetzung statt. Die Substratspezifität der Sterolkomponente betreffend ist

jedoch weniger ausgeprägt. Die in Abbildung 5 ersichtliche Reaktion kann unter anderem auch mit

Sitosterol, Cholesterol und Ergosterol erfolgen [28]. Glycosyltransferasen lassen sich, anhand der

stereochemischen Ausrichtung ihrer Produkte, in inverting- und in retaining-Glycosyltransferasen

einteilen [29]. Da der UDP-Teil stets α-ständig an die Glucopyranose gebunden ist, spricht man bei

der Biosynthese eines α-SGs von retaining-Glycosyltransferasen, also dem Aufrechterhalten der

anomeren Konfiguration (z.B.: UDP-α-Glucose α-SG). Häufiger kommen hingegen die inverting-

Glycosyltransferasen vor, bei denen es zu einer Umkehrung der axialen Ausrichtung des Zuckers

kommt (z.B.: UDP-α-Glucoseβ-SG). Hierbei kommt es in Folge einer nucleophilen Substitution

zweiter Ordnung, bei der der Akzeptor durch eine Brønsted-Base deprotoniert wird, zu einem

nucleophilen Angriff am anomeren C-Atom, wodurch es zu einer Umkehr der anomeren Ausrichtung

kommt [29] [30].

In tierischen Zellen wurde das Vorhandensein der β-Glycosyltransferasen noch nicht beobachtet,

jedoch wurde herausgefunden, dass hierbei nicht UDP-Glucose, sondern Glycosylceramid, bei einer

durch β-Glucosidase katalysierten Reaktion, als Glycosyldonor fungiert [31].

2.2.2 Synthese von Sterylglycosiden

Zur Synthese komplizierter Glycoside, wie beispielsweise jener von SGen, haben sich zwei Methoden

bewährt. Zum einen die Koenigs-Knorr-Methode, zum anderen die Trichloracetimidat-Methode. Auf

diese beiden Varianten wird hier nur kurz eingegangen, da diese im weiteren Verlauf der Arbeit noch

17

genauer beleuchtet, beziehungsweise die Synthesen mittels dieser Methoden durchgeführt wird.

Diese sind in Kapitel 4.3 beziehungsweise Kapitel 5 beschrieben.

Bei der Koenigs-Knorr-Methode wird über das peracetylierte Glucopyranosid das entsprechende, am

C-1 halogenierte, acetylierte Glucopyranosid durch Umsetzung mit Bromwasserstoffsäure

hergestellt. Dieses wird in weiterer Folge in Gegenwart von Silbercarbonat und dem entsprechenden

Sterol zum peracetylierten SG umgesetzt. Eine Abspaltung der Acetylgruppen erfolgt mittels

Zemplén-Verseifung.

Abbildung 6: Mechanismus der Zemplén-Verseifung

Die Synthese durch die Trichloracetimidat-Methode erfolgt ebenfalls über das peracetylierte

Glucopyranosid. Dieses wird in Gegenwart einer Säure in das Alkoholanion umgewandelt. Genauer

gesagt wird die anomere Schutzgruppe durch ein Nitril ersetzt. In weiterer Folge wird in Gegenwart

einer Lewis-Säure und dem entsprechenden Sterol das SG gebildet [5]. Die Abspaltung erfolgt

wiederum durch Zemplén-Verseifung. Hierbei kommt es, durch den basischen pH-Wert, zuerst zu

einer Deprotonierung des Methanols, so dass Methanolat vorliegt. In weiterer Folge greift dieses an

den Carbonyl-Kohlenstoffatomen der Acetyl-Schutzgruppen an wodurch es zur Bildung von

Essigsäuremethylestern als auch des entschutzten Cholesterylglycosids kommt.

Andere Methoden beschreiben die Verwendung diverser Modifikationen der Koenigs-Knorr- als auch

der Trichloracetimidat-Methode, bei denen für die Synthese von SGen Benzoylschutzgruppen [32],

oder für das α-Anomer auch Benzylschutzgruppen verwendet werden [33]. Als Edukt fungiert jeweils

Glucose [34]. Den Vorteil, den Benzoylschutzgruppen gegenüber Benzylschutzgruppen aufweisen, ist

die leichtere Abspaltung durch Zemplén-Verseifung im Vergleich mit zeit- und kostenintensiveren

Hydrierungen.

Eine weitere Methode, welche in der Literatur von Murui et al. (1993) [35] beschrieben wird, ist die

Umsetzung von Cholesterol mit Glucosepentaacetat in Gegenwart von Zinnchlorid. Bei diesem

Verfahren handelt es sich um eine Modifikation der Helferich-Synthese [5]. Dieses Verfahren basiert

auf einer durch Zinnchlorid, als Lewis-Säure fungierend, katalysierten SN1 Reaktion bei der vom

anomeren C-Atom eine Acetoxygruppe abgespalten, und anschließend das Sterol angelagert wird.

Dichlormethan wird als Lösungsmittel verwendet. Nach vollständiger Umsetzung, nach

sechsstündigem Rühren, und anschließender Zugabe von gesättigter Natriumchlorid-Lösung wird die

Entstehung eines Niederschlages beschrieben, der in weiterer Folge abgesaugt wird. Die organische

Phase wird daraufhin mit Wasser nachgewaschen und anschließend am Rotavapor eingeengt.

Anschließend wird zur Schutzgruppenabspaltung Natriummethoxid zugegeben, also wiederum durch

18

Zemplén-Verseifung, durchmischt, das Produkt in Ethanol gelöst und sechs Stunden bei 70°C

gelagert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels und der Zugabe von Wasser wird ein Waschschritt

mit Aceton, n-Hexan sowie heißem Aceton durchgeführt, um das Cholesterylglycosid zu erhalten. Die

Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie. Neben dem gewünschten Produkt entstehen

jedoch außerdem noch Glucopyranosylchlorid sowie das α-Anomer. Ausbeuten werden zu dieser

Methode von Murui et al. (1993) [35] jedoch nicht beschrieben. Aufgrund der entstehenden

Nebenprodukte als auch der nicht gegebenen anomeren Kontrolle ist jedoch mit einer nicht

zufriedenstellenden Ausbeute zu rechnen. Weitere Synthesen von SGen nach diesem Mechanismus

finden sich in der Literatur nicht.

Abbildung 7: Mechanismus der Helferich-Synthese

Eine Methodik, auf die im Zuge dieser Arbeit praktisch nicht genauer eingegangen wird, ist die

Herstellung von SGen durch enzymatische Prozesse. Zu einem besteht die Möglichkeit, SGe mittels

Sterol 3-β-Glycosyltransferasen herzustellen. Dieses Verfahren wird analog zur Biosynthese von SGen

praktiziert, in dem ein aktivierter Nucleosid-Diphosphat-Zucker als Glycosyldonor dient. In der Regel

wird dafür UDP-Glucose verwendet, da diese höhere Ausbeuten als beispielsweise CDP- oder TDP-

Glucose liefert [36]. Das SG wird in weiterer Folge durch die Umsetzung mit einem freien Sterol in

Gegenwart des Enzyms dargestellt. Potocka et al. (2008) [36] beschrieben hier ein Verfahren, bei

dem sie dies mit dem entsprechendem Enzym, welches zuvor aus Melanzani isoliert wurde,

experimentell durchführten. Zur Herstellung von größeren Mengen an SGen eignet sich diese

Methode, aufgrund der hohen Kosten für UDP-Glucose jedoch nicht. So erfolgt die Darstellung auf

diese Weise, wie beispielsweise bei Potocka et al. [36], im Nanomol-Bereich. Neben der Anwendung

von Transferasen, wird in der Literatur auch der Einsatz von Glycosylasen beschrieben. Da

Glycosylasen, eine Untergruppe der Hydrolasen, in Verbindung mit Wasser für gewöhnlich

glycosidische Bindungen hydrolysieren, handelt es sich hierbei eher um eine ungewöhnliche

Methode [37]. Wird die Reaktion jedoch in organischen Lösungsmitteln ausgeführt, können diese

19

Enzyme auch eine Kondensationsreaktion, in diesem Fall auch als umgekehrte Hydrolyse (reversed

hydrolysis) bezeichnet, in der die Zucker- und die Sterolkomponente verbunden werden, katalysieren

[38]. Durch die Wahl von α- beziehungsweise β-Glycosylasen besteht hier der Vorteil der anomeren

Kontrolle. Als Substrate für die Reaktion dienen Glucose sowie das entsprechende Sterol, somit muss

also kein aktivierter Zucker vorliegen [39]. Dadurch, dass diese Methode noch wenig erforscht ist,

besteht jedoch noch die Problematik, ein geeignetes Lösungsmittel zu finden, in dem die Wasserhülle

des Enzyms im organischen Lösungsmittel erhalten bleibt, ohne dabei zusätzlich Wasser im

Lösungsmittel vorliegen zu haben, und die Reaktion somit optimal von statten gehen kann [39].

Neben der Synthese von SGen, ist die Darstellung auch durch die Isolierung aus höheren Pflanzen

möglich [40]. In der Literatur finden sich hier beispielsweise Sojabohnen [41], Erbsen, Avocado,

Blumenkohl oder Spinat als verwendete Pflanzen [42]. Weiters kann die Isolierung aus Pflanzenölen

erfolgen, wobei sich zur Trennung und Aufreinigung verschiedene Techniken existieren. Für die

Extraktion können beispielsweise Waschschritte mit organischen Lösungsmittelgemischen wie

Chloroform/Methanol 2:1 [43] oder Soxhletverfahren mit Aceton als Lösungsmittel verwendet

werden [44], wobei hier jeweils eine vorherige Homogenisierung der Pflanzen notwendig ist. Zur

Deaktivierung der enthaltenen Glycosidasen wird des Weiteren heißes Ethanol zugegeben [43]. Zur

weiteren Aufarbeitung können verschiedene chromatographische Methoden angewendet werden.

Bei den wichtigsten handelt es sich hierbei um gewöhnliche säulenchromatographische Methoden

wie Normalphasen- (NP), Umkehrphasen (RP)- sowie Silberionenchromatograpie. Weiters finden

auch präparative dünnschichtchromatographische Methoden wie NP-DC und RP-DC Verwendung. Bei

den am häufigsten eingesetzten chromatographischen Methoden handelt es sich um diverse HPLC-

Verfahren, welche gegenüber der gewöhnlichen Säulenchromatographie die Vorteile einer

geringeren Dauer, sowie eines verminderten Verbrauchs an Laufmittel aufweisen.

2.2.3 Vorkommen von Sterylglycosiden

Da SGe in einer Vielzahl von Pflanzen vorkommen, liegt es auf der Hand, dass diese auch über die

Ernährung zugeführt werden. Besonders zu erwähnen sind an dieser Stelle Sojabohnen, deren

Lecithin SGe in einer Konzentration von 3-4% beinhaltet [45]. Bezogen auf das Trockengewicht von

Pflanzen sind Blumenkohl, Zucchini, Brokkoli, Melanzani und Gurken die Lebensmittel, die mit einem

SG-Gehalt von 490, 462, 241, 234 beziehungsweise 217 µg/g Trockenmasse die höchsten

Konzentrationen enthalten [45]. Neben freien SGen kommen diese auch in Form von verschiedenen

Derivaten vor. Diese können polyhydroxyliert, sulfatiert sowie acyliert vorliegen [43]. Die Acylierung,

gewöhnlicherweise am 6´O-Atom des Zuckers, stellt die häufigste Derivatisierung der SGe dar. Meist

handelt es sich dabei um eine Veresterung mit Palmitinsäure. In geringeren Mengen kommen jedoch

auch Veresterungen mit Ölsäure, Stearinsäure, Linolsäure und Linolensäure vor [46]. In Abbildung 9

20

ist eine Auswahl von Lebensmitteln und deren Gehalt an SGen, acylierten SGen (ASGen) sowie der

Gesamtgehalt an SGen+ASGen angeführt. Die Daten basieren auf einer Analyse von Nyström et al.

(2012) [45]. Analysen von Kiribuchi et al. (1966) [44] über den Sterolgehalt von Sojabohnen zeigten,

dass 41% des Gesamtsterolgehaltes in Form von Sterylglycosiden vorliegen, 50% als acylierte

Sterylglycoside und kaum Sterol-ester beziehungsweise nur wenig freie Sterole. Durch den Gehalt an

SGen kann des Weiteren auf den Gehalt an freien Sterolen geschlossen werden. Das Vorkommen von

SGen ist jedoch nicht auf Pflanzen beschränkt. Diese Verbindungen konnten, mit den jeweils

charakteristischen Sterolresten, auch in Tieren, beispielsweise in Vögeln [47], sowie in diversen

Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae [48] und Candida albicans [49] nachgewiesen werden.

Abbildung 8: Strukturformel eines acylierten Sterylglycosids (ASG)

Abbildung 9: Gehalt von SGen, ASGen sowie der Gesamtgehalt von ASGen + SGen in verschiedenen Lebensmitteln bezogen auf das Frischgewicht (FG) (Modifiziert von [45])

Das Auftreten von acylierten Sterylglycosiden wurde das erste Mal von Lepage (1964) [43] in

Kartoffeln beschrieben. Diese werden in Pflanzen enzymatisch aus SGen hergestellt, wobei dies

0 50 100 150 200

Weißer SesamKakao

SonnenblumenkerneWeiße Bohnen

SojabohnenCashew Nüsse

WalnüsseKürbiskerne

KartoffelnGurke

MelonenSpinat

Tomaten

[µg/g FG]

ASG+SG

ASG

SG

21

durch die Enzymklasse der Sterylglycosid-Acyltransferasen katalysiert wird [17]. Durch diese Enzyme

wird der Zucker am 6´O-Atom mit einer Fettsäure verestert, wobei Phosphoglyceride, Mono- und

Diacylglyceride sowie Monogalactosyldiacylglyceride häufige Donatoren der Fettsäurekomponente

darstellen [50]. Ein weiterer Biosyntheseweg für ASGe wurde von Frasch et al. (1976) [51] nach der

Untersuchung von Sterolen mittels radioaktiver Markierung des Cholesterols in den Setzlingen von

Nicotiana Tabaccum L. vorgeschlagen. Hierbei soll das Sterol mit einem bereits acylierten

Glycosylrest über ein unbekanntes Zwischenprodukt zum ASG reagieren.

2.2.4 Die Biodieselproblematik

Der Gehalt von SGen und ASGen in Pflanzenölen beträgt, abhängig von der Art der Pflanze, bis zu

einigen hundert Milligramm pro Kilogramm Öl, wobei der ASG-Gehalt in der Regel jenen der freien

SGe übersteigt (vgl. Tabelle 2) [2].

Tabelle 2: Analyse von SG und ASG in Pflanzenölen und Biodieselproben nach Lacoste et al. [2].

Probe SG Gehalt [mg/kg] ASG Gehalt [mg/kg]

Soja-FAME 10 n.d. Raps-FAME 12 n.d. Jatropha-FAME 18 n.d. Rapsöl n.d. n.d. Jatrophaöl 24 95 Palmöl 11 219 Sojaöl 13 21

n.d.: nicht detektierbar

Biodiesel (Fettsäuremethylester) wird im Zuge einer Umesterungsreaktion von Triacylglyceriden mit

Methanol hergestellt. Bei dieser Reaktion kommt es, als Nebenreaktion, zur Abspaltung des

Fettsäurerestes vom 6´O-Atom des acylierten Sterylglycosides, wodurch es zur Bildung freier SGe

kommt (siehe Abbildung 10).

Abbildung 10: Bildung von SGen aus ASGen durch Umesterung bei der Biodieselproduktion

22

ASGe sind in Pflanzenölen aufgrund des unpolaren Fettsäurerestes löslich, SGe hingegen besitzen nur

eine polare Zuckerkomponente ohne den angehängten Fettsäurerest und sind deshalb in der

unpolaren Biodieselmatrix nicht löslich, weshalb sie langsam ausfallen und in weiterer Folge als

Feststoff vorliegen. Dieses Verhalten der SGe wird durch kalte Temperaturen begünstigt [1]. Die

Temperatur, bei der Inhaltsstoffe im Biodiesel sichtbare Kristalle bilden, wird als cloud point (CP)

bezeichnet. Die Sichtbarkeit der Kristalle ist mit einem Durchmesser von > 0,5 µm definiert [52].

Diese Unlöslichkeit führt nun weiterführend dazu, dass diese Präzipitationen sowohl bei der Lagerung

des Biodiesels in Tanks, als auch bei der Verwendung in Motoren zu Verstopfung von Filtern und

Düsen führen können, was zur Folge unter anderem das Versagen von Motoren haben kann.

Außerdem liegen Vermutungen vor, dass die ausgefallenen SGe die Kristallisation und

Komplexbildung weiterer Verbindungen, wie beispielsweise jener von gesättigten Monoglyceriden,

begünstigen [3]. Labortechnisch wird die Auswirkung der SGe hinsichtlich der Verstopfung von Filtern

durch die Messung der Temperaturgrenze der Filtrierbarkeit1, auch als cold filter plugging point

(CFPP) bezeichnet, ermittelt. Der CFPP beschreibt die niedrigste Temperatur, bei der 20 mL Treibstoff

durch einen Filter mit einer Maschenweite von 45 µm bei einem Unterdruck von 0,019 Atmosphären

in 60 Sekunden noch problemlos durchgepumpt werden können [53].

2.2.5 Entfernung von Sterylglycosiden aus Biodiesel

2.2.5.1 Filtration und mechanische Methoden

Um den Problemen, welche SGe in Biodiesel hervorrufen, entgegenzuwirken, wurden in den

vergangenen Jahren zahlreiche Methoden entwickelt, um diese aus dem Treibstoff zu entfernen.

Viele dieser Methoden beschäftigen sich damit, die ausgefallenen Bestandteile abzufiltrieren. Lee et

al. (2006) [54] haben beispielsweise eine Methode entwickelt, bei welcher der Biotreibstoff über

Aktivkohle filtriert wird, um störende Bestandteile zu entfernen. Ein modifiziertes Verfahren wurde

von Danzer et al. (2007) [55] vorgestellt, bei dem direkt nach der Umesterungsreaktion zur

Herstellung von FAME auf 38°C gekühlt wurde, um unlösliche Stoffe wie SGe auszufällen. Durch

Zugabe von Aktivkohle und anschließender Filtration konnten ausgefallene SGe entfernt werden.

Sohling et al. (2011) [56] haben als Adsorbens ein Gemisch aus Smektit-Kieselgel (SiO2 > 60 Gew.%)

verwendet, dessen spezifische Oberfläche 120 m²/g beträgt. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass

das Adsorbens natürlich vorkommt und somit relativ kostengünstig bereitgestellt werden kann. Der

Nachteil ist jedoch, dass sich diese Methode lediglich für die Nachreinigung von Biodiesel eignet.

Durch dieses Verfahren konnte der Anteil freier SGe unter 20 ppm reduziert werden. Die

1 Bezeichnung laut DIN EN 116:1998-01

23

beschriebenen Methoden stellen jedoch das Problem dar, dass sie nur schwer in größerem Maßstab

durchführbar sind. Außerdem handelt es sich hierbei um kostenintensive Verfahren, bei denen ein

zusätzlicher Aufreinigungsschritt zur Entfernung des Adsorbens notwendig ist. Nicht zu

vernachlässigen ist des Weiteren, dass bei Filtrationsmethoden die Präzipitation von SGen

abgewartet werden muss, wodurch der Biodiesel vor der schlussendlichen Aufreinigung einem

Lagerungsprozess unterzogen werden muss, was sich sowohl als zeit- sowie auch als kostenintensiv

erweist. Weiters geht bei den Filtrationsprozessen jeweils ein Teil des Produktes verloren. Tang et al.

(2010) [57] haben verschiedene Strategien, nämlich Kaltfiltration, die Filtration bei Raumtemperatur,

die Zugabe von Adsorbens, Zentrifugieren sowie die Vakuumdestillation zur Entfernung von freien

SGen aus Biodiesel verglichen. Die Vakuumdestillation zeigte sich als die effektivste Methode, bei der

neben den freien SGen auch lösliche SGe bis auf einen Gehalt von 20 ppm abgetrennt werden

konnten. Die anderen untersuchten Methoden hatten keinen Einfluss auf gelöste SGe, es wurde

lediglich die Menge an bereits ausgefallenen SGen reduziert. Neben dem hohen technischen

Aufwand, den die Vakuumdestillation mit sich bringt, sowie den hohen Kosten, findet des Weiteren

eine drastische Qualitätsminderung des Biodiesels durch Reduktion der Oxidationsstabilität statt,

weshalb auch diese Methode, abgesehen von den hohen Kosten, keine optimale Lösung darstellt.

Diese Abnahme beruht auf der Entfernung der im Biodiesel natürlich enthaltenen Antioxidantien wie

Tocopherolen und Carotinoiden. Kass et al. (2011) [58] patentierten ein Verfahren, bei welchem

Biodiesel, bei dem bereits Präzipitate vorlagen, Ultraschall mit einer Energie zwischen 2000 und 7000

Joule ausgesetzt wurde. Außerdem wird beschrieben, dass einer Bildung von SG-Agglomeraten,

beispielsweise mit Monoglyceriden, die durch eine unvollständige Umesterungsreaktion im Biodiesel

enthalten sind, durch die vorherige Behandlung mit Ultraschall vorgebeugt werden kann. Um eine

übermäßige Erhitzung bei diesem Verfahren zu verhindern, geschieht die Ultraschallbehandlung in

Intervallen mit einer Dauer von je etwa 40 Sekunden. Durch dieses Verfahren kommt es zu einer

irreversiblen Dissoziation der Präzipitationen, so dass sich auch nach dem Abkühlen keine

Niederschläge mehr bilden können. Durch diese Behandlung kann die anschließende

Filtrationsdauer, verglichen mit jener ohne Ultraschallbehandlung, um 19% verkürzt werden.

2.2.5.2 Enzymatische Entfernung von SG

Neben der Möglichkeit der Filtration finden sich in der Literatur auch Methoden, in denen die

unlöslichen SGe in lösliche ASGe umgewandelt werden. Brask et al. (2012) [59]. beschreiben eine

Methode, in der die SGe in einer Umesterungsreaktion durch Lipasen, beispielsweise Novozyme 435,

in ASGe umgewandelt werden. Die Effizienz dieser Methode ist jedoch dahingehend begrenzt, dass

eine bestmögliche Umsetzung nur dann funktioniert, wenn sich das Substrat in Lösung befindet. Da

diese Enzyme nur eine begrenzte Thermostabilität aufweisen und eine optimale

24

Reaktionstemperatur von 40-60°C haben, ist eine vollständige Lösung des Produktes in unpolaren,

organischen Lösungsmitteln, wie Biodiesel eines darstellt, jedoch nicht möglich. Eine Erhöhung der

Reaktionstemperatur würde zu einer Minimierung der Aktivität beziehungsweise zu einer

Denaturierung des Proteins führen. Da sich in Biodiesel bei einer Temperatur von 50°C SGe jedoch

nur in einer Menge von 50 ppm lösen, und in Rohbiodiesel in der Regel 10-480 ppm [60] vorliegen, ist

deren Entfernung jedoch nur begrenzt möglich. Eine weitere Möglichkeit, die von Menzella et al.

(2013) [61] beschrieben wurde, ist der Einsatz von neu designten thermostabilen Sterylglycosidasen,

welche SGe durch Hydrolyse der glycosidischen Bindung in Glucose sowie in das Sterol spalten. Durch

die Thermostabilität der Enzyme kann die Reaktionstemperatur bei dieser Methode erhöht werden,

wodurch sich ein größerer Anteil der enthaltenen SGe in Lösung befindet und so enzymatisch

umgewandelt werden kann. Zu beachten ist jedoch, dass es sich bei enzymatischen Prozessen in der

Regel um relativ teure Methoden handelt, wodurch es hier noch an Forschung für die optimalen

Reaktionsbedingungen, um den Einsatz der Enzymmenge auf ein Minimum zu begrenzen, bedarf. Es

werden jedoch Experimente hinsichtlich des Recyclings von Enzymen durchgeführt, in dem diese

nach der Reaktion abfiltriert und anschließend durch Aufreinigungsschritte und Trocknungsprozesse

wieder aktiviert werden [62] [63].

2.2.5.3 Präprozedurale Prozesse

Bei den bisherig beschriebenen Methoden handelt es sich jeweils um Prozesse, die nach der

eigentlichen Biodieselherstellung durchgeführt werden. Weiters besteht jedoch die Möglichkeit, SGe

als auch ASGe, aus denen bei der Umesterung zu Biodiesel SGe hergestellt werden können (vgl.

Abbildung 10), bereits aus dem Rohöl zu entfernen. Murui et al. (1997) [64] haben beispielsweise ein

Verfahren entwickelt, mit denen 90% der freien SGe sowie 50% der ASGe durch die Zugabe von

Bleicherde zu Palmöl und anschließender Filtration entfernt werden konnten.

2.2.6 Analyse von Sterylglycosiden

2.2.6.1 Gaschromatographische Methoden

Aufgrund der geringen Flüchtigkeit von SGen und ASGen eignen sich gaschromatographische

Methoden nicht für deren Analyse, ohne die Verbindungen einer vorherigen Derivatisierung zu

unterziehen. Diese geschieht in der Regel durch eine Silylierung mittels MSTFA, welche zur

Stabilisation der thermolabilen Moleküle beiträgt, sowie die Auflösung verbessert [45]. Bei den GC-

Methoden wird grundsätzlich zwischen zwei Arten unterschieden. Zum einen gibt es die Möglichkeit

einer „indirekten GC“ andererseits jene der „direkten GC“. Bei der indirekten Methode, wird der

Sterolester durch alkalische Hydrolyse in den Sterolteil, in den Zuckerteil sowie die eventuell

angehängte Fettsäure gespalten. Die Fettsäure kann nun als das korrespondierende Salz, welches

25

durch die Verseifung entsteht, isoliert werden, anschließend beispielsweise durch Methylierung

derivatisiert, und so gaschromatographisch mittels FID-Detektion vermessen werden [65]. Bei der

Analyse der Sterole handelt es sich um die offizielle Methode für Sterolanalysen (ISO 12228). Die SGe

werden nach der alkalischen Hydrolyse durch Festphasenextraktion (SPE) oder

Dünnschichtchromatographie aufgereinigt, silyliert und anschließend am Gaschromatographen

analysiert [66]. Als Referenzwert dient in der Regel Cholesterol, welches eine ähnliche Retentionszeit

wie andere Sterole aufweist, wodurch somit deren relative Retentionszeit im Vergleich zum

Cholesterol ermittelt werden kann. Weiters birgt Cholesterol als interner Standard den Vorteil, dass

es in Pflanzen kaum vorkommt und somit der Peak ausschließlich auf das hinzugegebene Cholesterol

zurückgeführt werden kann [67]. Außerdem ist es kommerziell in großen Mengen verfügbar und

stellt das kostengünstigste Sterol dar. Für die direkte Methode hingegen ist keine vorhergehende

Hydrolyse notwendig. Hierbei wird das SG silyliert und anschließend direkt vermessen, wodurch

dieses Verfahren sowohl eine Zeit- als auch eine Kostenersparnis, verglichen mit der indirekten

Methode, birgt [68].

Durch die Ionisierung bei der Messung mittels GC-MS kommt es zum einen zur Spaltung der

glycosidischen Bindung, wodurch zum einen der Sterolteil als Ladungsträger analysiert werden kann.

Die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Sterolen ist somit, durch die Kopplung mit einem

Massenspektrometer, leicht möglich. Zum anderen kommt es zur Abspaltung der Silylgruppen der

Zuckerkomponente. Diese bilden charakteristische, ladungstragende Trimethylsilylester und -ether

welche im Massenspektrum ersichtlich sind, und auf die Anwesenheit des Zuckers schließen lassen

[69]. Verglichen mit anderen verwendeten instrumentellen Methoden, wie TOF-

Massenspektroskopie oder NMR-Spektroskopie, ergibt sich bei gaschromatographischen Messungen

die längste Analysendauer. Außerdem ist, bedingt durch die Derivatisierung, eine Vorlaufdauer von

etwa einer Stunde bei der Messung einzuberechnen, wodurch die Dauer der Gesamtanalyse etwa

zwei Stunden beträgt. Den Vorteil, den diese Methode jedoch birgt, ist die exakte Berechnung der

Reinheit durch Integration der Peakflächen bei Verwendung eines Flammenionisationsdetektors

(FID). Weiters ist eine Unterscheidung von Anomeren aufgrund der unterschiedlichen

Retentionszeiten möglich. Ein Vorteil von gaschromatographischen Messungen ist die

Quantifizierung sowie die Differenzierung zwischen den einzelnen, strukturell sehr ähnlichen,

Sterolkomponenten. Positiv ist außerdem, dass aufgrund der hohen Sensitivität der Methode, nur

wenig Probe verwendet werden muss. Ist das Ziel der GC-Analyse lediglich die Quantifizierung von

SGen, so hat sich zur Detektion die Verwendung eines FID-Detektors bewährt, welcher den Vorteil

einer hohen Robustheit und Empfindlichkeit mit sich bringt. Bei Verwendung derselben Säule ist

außerdem eine GC-Messung mit MS-Kopplung zur Identifikation der Struktur und in weiterer Folge

eine Quantifizierung durch FID-Kopplung möglich. Lacoste et al. (2009) [2] haben mit einer GC-FID-

26

Methode, nach der vorhergegangenen Aufreinigung der Probe mittels Säulenchromatographie, eine

Nachweisgrenze von 4 ppm erreicht, die Quantifizierung gelang bis zu einer Konzentration von 10

ppm [2].

2.2.6.2 NMR-Spektroskopie

Die NMR-Spektroskopie stellt eine zuverlässige Methode zur qualitativen Analyse von SGen dar. Zu

einem handelt es sich, bei der Messung an sich, um eine schnelle Methode. So dauert die Erstellung

eines 1H-NMR-Spektrums etwa zwei Minuten, jene eines 13C-NMR-Spektrums zirka 30 Minuten. Zum

anderen sind durch molekülspezifische Shifts sichere Analyseaussagen möglich. Weiters ist, im

Gegensatz zur Gaschromatographie, keine Derivatisierung nötig. Negativ anzumerken ist jedoch,

dass, verglichen mit TOF-MS und GC-MS, mit einer Menge von ungefähr 20 mg viel Probe für die

Analyse nötig ist. Dadurch, dass für die Analyse deuterierte Lösungsmittel verwendet werden

müssen, ergibt sich außerdem noch ein nicht unwesentlicher Kostenfaktor. Eine Unterscheidung von

Anomeren ist bei der SG-Synthese, aufgrund der ähnlichen Signale, nur schwer möglich. Außerdem

ist die Auswertung der Ergebnisse, ohne vorliegende NMR-Referenzspektren, sehr zeitaufwändig.

Hinsichtlich der Reinheit ist anzumerken, dass sich diese lediglich durch das Überprüfen von

eventuell auftretenden Nebensignalen abschätzen lässt. Eine Berechnung der Reinheit ist somit nicht

möglich.

2.2.6.3 TOF-MS

Die Analyse mittels Flugzeitmassenspektrometer stellt mit einer Messdauer von etwa einer Minute

die schnellste der beschriebenen Methoden dar. Die Probe muss sich lediglich in einem geeigneten

Lösungsmittel, welches eine Mischbarkeit mit Acetonitril aufweist, lösen, was einen großen Vorteil

im Vergleich zur Gaschromatographie darstellt. Weiters ist keine Derivatisierung notwendig. Für die

Analyse ist, aufgrund der geringen Nachweisgrenze im Femto- bis Attogrammbereich nur eine

äußerst geringe Menge an Probe notwendig [70]. Durch den hochauflösenden Charakter des TOF-

Massenspektrometers lässt sich außerdem die Summenformel der Verbindung generieren, wodurch

eine sichere Identifizierung gegeben ist. Außerdem lässt sich eine Berechnung der Abweichung der

erhaltenen Masse von der theoretischen Masse in ppm vornehmen, wobei Abweichungen unter 5

ppm akzeptabel sind. Durch die milde Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI (Atmospheric

Pressure Chemical Ionization)) oder auch durch Elektrospray-Ionisation (ESI) findet des Weiteren

keine Fragmentierung in den Zucker- und den Sterolteil statt, wodurch das gesamte Molekül

analysiert werden kann. Der Nachteil, den die Methode darstellt ist jedoch, dass keine

Unterscheidung zwischen Anomeren vorgenommen werden kann. Weiters lässt sich, aufgrund von

27

eventueller selektiver Ionisationsfähigkeit verschiedener Moleküle, keine Berechnung der Reinheit

vornehmen.

2.2.6.4 HPLC

Der Einsatz von HPLC-Methoden kann sowohl für die Trennung von Sterylglycosiden, als auch für die

Quantifizierung erfolgen. Grundsätzlich finden sowohl Normalphasen- (NP) als auch Umkehrphasen-

(Reversed Phase (RP))-HPLC Verwendung. Mittels RP-HPLC ist jedoch, aufgrund der strukturellen

Ähnlichkeit, eine Unterscheidung verschiedener SGe nur schwer möglich, es kann somit nur der

Gesamt-SG-Gehalt bestimmt werden [71]. Eine gute Auftrennung zwischen Sterolen und SGen ist

jedoch möglich [72]. Mittels NP-HPLC hingegen können auch ähnliche SGe voneinander getrennt und

analysiert werden [67]. Ein Vorteil ist, dass für HPLC-Methoden in der Regel keine Derivatisierung

notwendig ist, was die Dauer der Probenvorbereitung minimiert. Die Messdauer ist kürzer als jene

der Gaschromatographie und beträgt etwa 20 Minuten und kann bei Verwendung von UHPLC-

Methoden auf wenige Minuten verkürzt werden. Weiters handelt es sich um eine nicht destruktive

Methode, weshalb Sterylglycoside nach der Messung im aufgetrennten Zustand isoliert werden

können.

In der Praxis werden verschiedene Detektortypen für die SG-Analyse verwendet. Eine HPLC-Methode

zur Trennung und Quantifizierung von SGen und ASGen wurde von Sugawara et al. (1999) [71]

beschrieben, wobei zur Detektion ein Lichtstreudetektor (ELSD, Evaporative Light Scattering

Detector) angewendet wurde. Mit dieser Methode wurde für SGe eine Nachweisgrenze von 0,2 µg

erreicht, für ASGe 0,5 µg.

Murui et al. (1993) [35] beschreiben zur Messung von SGen und ASGen eine Methode mit einer

Nachweisgrenze von 0,5-50 ng die auf der Derivatisierung mittels 1-Anthroylnitril beruht. Bei dieser

Methode werden Sterylglycoside zu Beginn mittels Säulenchromatographie aus der Probe isoliert,

durch dünnschichtchromatographische Trennung in SGe und ASGe separiert und anschließend bei

100°C für 20 Minuten, in Gegenwart von Quinuclidin (1-Azabicyclo[2.2.2]octan) als Katalysator, mit 1-

Anthroylnitril derivatisiert. Diese UV-sensitiven Derivate können in weiterer Folge durch HPLC mittels

UV-Detektor analysiert werden. Die UV-Absorption von Sterolen ist hierbei bei 200-210 nm zu

beobachten beziehungsweise bei 282 nm bei konjugierten Dienen wie Stigmasterol oder Ergosterol

[73]. Moreau et al. (2008) [74] beschreiben eine Methode, in der sich durch HPLC mit APCI-MS

Sterole in Biodiesel nachweisen und mit anschließender RP-HPLC mit Elektronenspray-MS eine

Unterscheidung zwischen Sitosterylglycosid und Campesterylglycosid vornehmen konnten. Mit NP-

HPLC und isokratischer Elution und anschließender Detektion mittels ELSD beziehungsweise UV-

Detektor wurde anschließend die Quantifizierung vorgenommen.

28

2.2.6.5 Dünnschichtchromatographie

SGe können durch dünnschichtchromatographische (DC-) Methoden durch Auftragung der Probe

gegen einen Standard analysiert werden. Die Detektion kann durch destruktive Weise, wie durch die

Verkohlung mittels Schwefelsäure, als auch durch nicht destruktive Weise, zum Beispiel durch die

Detektion mittels Ioddampf oder UV-Licht erfolgen. Verwendung finden auch Sprühreagenzien wie

Fluorescein und Rhodamin 6G [75]. Somit kann die Methode der nicht destruktiven Detektion neben

der qualitativen Analyse auch für die Quantifizierung herangezogen werden. Diese erfolgt durch das

Abschaben der SG-Bande von der DC-Platte und anschließender Trennung des Kieselgels durch

Waschschritte in organischen Lösungsmittelgemischen (z.B. Chloroform/Methanol 4:1) mit

anschließender Filtration sowie Zentrifugation [67]. Die Vorteile, die DC-Methoden bieten, sind zum

einen eine schnelle qualitative Analyse sowie die simultane Auftrennung mehrerer Proben. Weiters

handelt es sich um eine kostengünstige Methode, da die verwendeten Gerätschaften in der Regel

billiger sind als GC-, HPLC-Systeme etc. sind. Durch die anschließende Aufreinigung bei der

Quantifizierung sind DC-Methoden jedoch zeit- und arbeitsaufwändig. Weiters kommt es hierbei zu

Produktverlusten wodurch die Genauigkeit der Analyse abnimmt. Durch die geringere Anzahl an

theoretischen Böden, verglichen mit HPLC-Systeme, ist mitunter keine absolute Trennung recht

ähnlicher Substanzen, wie dies bei den verschiedenen Sterylglycosiden der Fall ist, gegeben.

Außerdem können nur Mengen im Milligramm-Bereich quantifiziert werden, wodurch diese

Methode eher für qualitative Bestimmungen brauchbar ist.

3 Grundlagen und Theorie II: Analytische Methoden-Allgemein

In Kapitel drei werden die analytischen Methoden, welche im Zuge der Diplomarbeit verwendet

wurden, vorgestellt und deren theoretischer Hintergrund genauer beschrieben. Auf nicht

verwendete Methoden wird nicht genauer eingegangen.

3.1 Chromatographie

Das Prinzip der Chromatographie beruht auf der Trennung von Komponenten mit verschiedenen

chemischen oder physikalischen Eigenschaften zwischen zwei nicht mischbaren Phasen.

Grundsätzlich wird zwischen einer stationären und einer mobilen Phase unterschieden. Die

stationäre Phase ist in der Regel an eine Säule gebunden, die mobile Phase läuft durch sie in eine

definierte Richtung hindurch. Die Trennung beruht auf der Wechselwirkung der Analyten mit der

stationären Phase, wodurch diese zu unterschiedlichen Zeiten eluieren. Zur Analyse wird die zu

29

analysierende Probe in der flüssigen, gasförmigen oder superkritischen mobilen Phase gelöst und auf

die Säule aufgetragen.

In Abbildung 11 ist eine schematische Darstellung der chromatographischen Auftrennung ersichtlich.

Das Schema zeigt eine höhere Wechselwirkung des Moleküls A mit der stationären Phase, wodurch A

sich mit einer langsameren Geschwindigkeit als B bewegt und somit länger in der Säule verbleibt. Bei

automatisierten Systemen kann sich am Probenauslass noch ein Detektor befinden.

Abbildung 11: Schematische Darstellung der Säulenchromatographie [76]

Eine Unterscheidung der unterschiedlichen Chromatographiearten kann durch die verschiedenen

Arten der Interaktion zwischen der stationären Phase und dem Analyten vorgenommen werden. In

der Regel unterteilt man in Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Größenausschluss- und

Affinitätschromatographie. Außerdem kann eine Unterteilung aufgrund des Aggregatzustandes der

stationären Phase in Gaschromatographie (GC) und Flüssigkeitschromatographie (LC, Liquid

Chromatography) getätigt werden. Bei der Flüssigkeitschromatographie hat sich mittlerweile die

Methodik der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) als schnelle und automatisierte

Methode durchgesetzt. Am Ende der chromatographischen Auftrennung finden in der Regel

verschiedene Detektorarten Verwendung. Die Detektion kann beispielsweise anhand chemischer

Derivatisierung erfolgen. Bei instrumentellen Methoden finden unter anderem Flammenionisations-,

Lichtstreu-, UV-VIS, Brechungsindex und Wärmeleitfähigkeitsdetektoren Verwendung. Auf die in

dieser Arbeit angewendeten Methoden wird im Zuge dieses Kapitels noch genauer eingegangen.

30

3.1.1 Adsorptionschromatographie

Bei der Adsorptionschromatographie wird als stationäre Phase ein Adsorbens eingesetzt. Die

Auftrennung beruht auf der wiederholten Adsorption und Desorption des Analyten an der

stationären Phase. Als stationäre Phase kann beispielsweise Silikagel dienen. Van-der-Waals-Kräfte

sowie Wasserstoffbrückenbindungen sind für unterschiedliche Retentionszeiten verantwortlich. So

verbleiben, bei Silikagel als stationäre Phase, polare Substanzen länger in der Säule, unpolare

Substanzen eluieren früher. Somit können durch diese Methode polare von unpolaren Substanzen

getrennt werden. Je nach Größe der Säule beziehungsweise nach der Methode, können

Probenmengen im Bereich weniger Milligramm, beispielsweise bei Festphasenextraktion (SPE, Solid-

Phase-Extraction) bis zu einigen Gramm aufgetrennt werden. Durch die verschiedenen

Retentionszeiten der Analyten können somit die Proben, beispielsweise durch den Vergleich mit der

Retentionszeit interner Standards, charakterisiert werden. Des Weiteren kann noch zwischen

Normalphasen (NP)- und Umkehrphasenchromatographie (RP, Reversed-Phase) unterschieden

werden. Bei NP-Chromatographie werden polare stationäre Phasen, wie Silikagel, und unpolare

Laufmittel eingesetzt, bei RP-Chromatographie fungieren beispielsweise langkettige

Kohlenwasserstoffe als unpolare, stationäre Phasen [77].

3.1.2 Verteilungschromatographie

Die Auftrennung bei der Verteilungschromatographie ist auf die unterschiedliche Löslichkeit der

Analyten in einer der beiden Phasen zurückzuführen. Bei besserer Wechselwirkung mit der

stationären Phase bleibt der Analyt also länger in der Säule. Ist hingegen eine schlechte

Wechselwirkung mit der stationären Phase und dafür eine bessere mit der mobilen Phase gegeben,

so verlässt der Analyt schneller die Säule und wird somit von anderen Stoffen getrennt. Bei der

stationären Phase handelt es sich um eine Flüssigkeit, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist.

Ist die mobile Phase flüssig, so handelt es sich um LLC (Liquid Liquid Chromatography), liegt sie

hingegen gasförmig vor, so spricht man von GLC (Gas Liquid Chromatography) oder einfach

Gaschromatographie (GC).

Auf GC-Methoden wird in diesem Kapitel noch genauer eingegangen, LLC-Methoden hingegen

werden nicht weiter behandelt.

3.1.2.1 Gaschromatographie

Die Gaschromatographie stellt einen Sonderfall dar, da es sich hierbei sowohl um eine Verteilungs-

als auch um eine Adsorptionschromatographie handelt. Die Auftrennung erfolgt hierbei anhand der

unterschiedlichen Siedepunkte der Analyten. Diese werden verdampft und anschließend nach der

31

Wechselwirkung mit der stationären Phase getrennt. Als mobile Phasen dienen Inertgase wie

Stickstoff oder Helium, aber auch Wasserstoffgas findet Verwendung. Die Säulen, in der analytischen

Chemie in der Regel Kapillarsäulen, sind als stationäre Phase meist mit Polysiloxanharzen

ausgekleidet. In der präparativen Chemie werden hingegen meist gepackte Säulen, welche unter

anderem einen größeren Durchmesser und geringere Längen als Kapillarsäulen aufweisen,

verwendet. Der Innendurchmesser von Kapillarsäulen beträgt zwischen 0,1 und 0,75 mm, Längen

zwischen 10 und 100 m finden Verwendung. Die Säule befindet sich im Säulenofen in dem der Analyt

auf Temperaturen bis 400°C aufgeheizt wird [78]. Für die Probenauftragung können verschiedene

Injektorsysteme verwendet werden, wobei die beiden am häufigsten verwendeten Injektoren

Split/Splitless für thermostabile, beziehungsweise für thermolabile Verbindungen Cool on Column-

Injektoren darstellen [79].

Abbildung 12: Schema eines Gaschromatographen. (Übernommen von [80])

Detektoren, die in der Gaschromatographie verwendet werden, können in zwei Unterkategorien

eingeteilt werden. Zum einen handelt es sich um konzentrationsabhängige Detektoren, die die

Anzahl der Teilchen, welches sich in einem definierten Volumen des Trägergases befindet, detektiert.

So zum Beispiel Wärmeleitfähigkeitsdetektoren (WLD). Andererseits existieren

massenstromabhängige Detektoren, welche die Anzahl der Teilchen, die in einer gewissen Zeit zum

Detektor gelangen, messen [81]. Ein Beispiel dafür stellt der Flammenionisationsdetektor (FID) dar.

Durch die Anwendung in der vorliegenden Diplomarbeit, wird auf diesen im Zuge dieses Kapitels

noch genauer eingegangen. Weiters können GC-Systeme mit Massenspektrometern gekoppelt

werden (vgl. Kapitel 4.2 bzw. 4.7).

Die Detektion mittels FID basiert auf der Ionisierung des Analyten in einer Flamme, wodurch

messbarer Strom entsteht. Der Einsatzbereich ist vor allem die Quantifizierung von oxidierbaren

Kohlenstoffen, also Verbindungen die C-C und C-H Bindungen enthalten. Bei diesen Substanzen

zeichnet sich der FID durch seine hohe Sensitivität aus, der lineare Bereich beträgt 107 [82] . Nicht

verbrennbare Substanzen können nicht detektiert werden. Auch für die Detektion von funktionellen

32

Gruppen ist diese Methode wenig geeignet. Weitere Nachteile sind, dass es sich hierbei um eine

destruktive sowie nicht selektive Methode handelt. Die Probe wird durch ein Trägergas in eine, durch

die Verbrennung von Wasserstoffgas erzeugte Flamme, die sich in einem elektrischen Feld befindet,

eingebracht. Durch die Verbrennung der kohlenstoffhältigen Verbindungen kommt es zur Pyrolyse

und somit zur Bildung von Radikalen. Diesen wird in weiterer Folge Luft zugeführt, wodurch es durch

die Reaktion mit Sauerstoff zur Oxidation und somit zur Bildung von positiv geladenen Ionen sowie

zur Bildung von Elektronen kommt.

Abbildung 13: Pyrolyse und Ionisation im FID

Über der Flamme befindet sich eine positiv geladene Sammelelektrode, welche gleichzeitig die

Anode des Systems darstellt. Die Flammenspitze sowie die Düse, aus der Wasserstoffgas strömt,

fungieren als Kathode. Die erzeugten Elektronen werden an der Anode gesammelt und der daraus

resultierende Stromfluss gemessen.

Abbildung 14: Schematische Darstellung eines Flammenionisationsdetektors (Modifiziert von [83])

3.1.3 Größenausschlusschromatographie-GPC

Bei der Größenausschlusschromatographie (SEC, engl.: Size Exclusion Chromatography) oder auch

Gelpermeationschromatographie (GPC) handelt es sich um eine Unterkategorie der

Flüssigchromatographie, in der Moleküle anhand ihrer Größe, genauer durch das hydrodynamische

Volumen aufgetrennt werden. In der Säule befindet sich hierbei als stationäre Phase ein poröses Gel.

Kleine Moleküle verbleiben länger in der Säule, da sie in die porösen Partikel eindringen können und

sich darin nur mehr durch Diffusion bewegen können, große Moleküle hingegen strömen an den

Partikeln vorbei und haben demzufolge eine kürzere Retentionszeit. Die Bestimmung der

Molekülmasse wird anschließend durch den Vergleich mit Kalibriersubstanzen vorgenommen. Die

Detektion kann beispielsweise über die Ermittlung des Brechungsindexes erfolgen.

33

3.2 Massenspektrometrie

Die Methodik der Massenspektrometrie (MS) beruht auf der Analyse von Atomen und Molekülen

aufgrund ihrer Masse. Die Proben werden verdampft und ionisiert, woraufhin geladene Moleküle

entstehen. Die entstandenen Ionen werden anschließend hinsichtlich deren Masse zu

Ladungsverhältnis (m/z) analysiert.

3.2.1 Ionisierung

Die Ionisierung kann auf verschiedene Weisen erfolgen und hängt von der chemischen und

physikalischen Beschaffenheit der Proben ab. Häufig kommen unter anderem Elektronenstoß-

Ionisation (EI), Photo-Ionisation (PI), Elektrospray-Ionisation (ESI), Chemische-Ionisation (CI) sowie

Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) vor. Hierbei kann noch zwischen harten (EI)

und weichen (ESI, MALDI) Ionisierungen unterteilt werden, wobei bei der weichen Ionisierung nur

wenige Fragment-Ionen entstehen [84]. Als Möglichkeit der weichen Ionisierung hat sich des

Weiteren die chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) etabliert, welche bei weniger

polaren Substanzen eine bessere Effektivität als zum Beispiel ESI aufweist [85]. Eine

Zusammenfassung der Ionisationsmöglichkeiten für die Massenspektrometrie sowie eine

Unterteilung anhand der Eigenschaften der zu ionisierenden Proben sind in Abbildung 15 dargestellt

[86].

Abbildung 15: Ionisationsmöglichkeiten für die Massenspektroskopie [86]

34

3.2.1.1 Elektronenstoßionisation

Bei dieser Methode handelt es sich um das Standardverfahren bei gaschromatographischen

Massenanalysen, wobei es bei dieser Methode zu einer weitgehenden Fragmentbildung kommt.

Durch das Erhitzen eines kathodischen Filaments, meist aus Wolfram oder Rhenium, werden durch

thermoionische Emission Elektronen erzeugt. Diese Elektronen werden zu einem Strahl gebündelt

und durch das Zuführen von Energie, etwa 70 eV, durch eine Anode beschleunigt. Die Probe wird

senkrecht zum Elektronenstrahl aufgetragen, wodurch Elektronen und Probenmoleküle miteinander

in Wechselwirkung treten. Auf diese Weise kann es zur Ionisation der Moleküle kommen, wobei

durch elektrostatische Abstoßung Elektronen aus der Elektronenhülle der Moleküle geschlagen

werden und es so zur Bildung von radikalischen Molekülkationen kommt. Diese werden daraufhin

durch ein schwaches elektrisches Feld zum Analysator transportiert [84].

Abbildung 16: Bildung von radikalischen Molekülkationen

Durch überschüssige Energie kann es weiters zum Zerfall der Molekülionen kommen. Die Fragmente

sind für jedes Molekül charakteristisch und sind, sofern sie eine Ladung tragen, im Massenspektrum

ersichtlich.

3.2.1.2 Elektrospray-Ionisation

Bei der Elektrospray-Ionisation handelt es sich um eine Ionisation bei Atmosphärendruck, welche bei

LC-MS Verfahren Anwendung findet. Durch diese milde Ionisierung zählt die ESI zu den weichen

Ionisationsmethoden und wird deshalb, aufgrund der geringen Fragmentierung, oft für die Analyse

von Biomolekülen eingesetzt. Zu Beginn dieser Ionisationstechnik wird die Probe bei

Atmosphärendruck durch eine Metallkapillare gepumpt, an deren Spitze eine Spannung angelegt ist.

Durch den Spannungsunterschied zur Gegenelektrode, etwa 3-6 kV, kommt es zur Ausbildung eines

starken elektrischen Feldes [84]. Aufgrund der elektrischen Spannung bewegen sich die Ionen in der

Analytlösung in Richtung der Gegenelektrode, wodurch sich ein Überschuss an gleichartig geladenen

Ionen bildet, welche sich gegenseitig abstoßen. Beim Austritt aus der feinen Spitze der Kapillare

bilden diese einen sogenannten Taylor-Cone. Das heißt, dass sich diese unter der Bildung feiner

Tröpfchen explosionsartig in Richtung der Gegenelektrode bewegen [87]. Der zweite Schritt der

Ionisation, die Vernebelung (engl. Nebulisation) wird durch ein inertes Trägergas, in der Regel

erhitzter Stickstoff, unterstützt. Der Durchmesser der Tröpfchen nimmt immer weiter ab, bis das

„Rayleigh limit“ erreicht ist und es kommt zur Abstoßung der Ionen aufgrund der Ladungsgleichheit

(„Coulomb-Explosion“), wodurch wiederum kleinere Tröpfchen entstehen. Aus den Tröpfchen

werden nun die Ionen in die Gasphase emittiert. Durch die Spannungsdifferenz zwischen der

35

Kapillare und der Gegenelektrode werde die Ionen nun, durch eine Öffnung in der Gegenelektrode in

das MS transportiert [88].

Abbildung 17: Elektrospray-Ionisation (Modifiziert von [87])

3.2.1.3 Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck, APCI

Bei der chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck handelt es sich um eine besonders

analytenschonende Modifizierung der chemischen Ionisation. Sie wird, wie auch ESI unter

Atmosphärendruck durchgeführt, jedoch handelt es sich bei APCI um eine etwas härtere Methode,

wodurch es zu vermehrter Fragmentbildung kommt [89]. Diese Methodik findet beispielsweise bei

thermisch stabilen und verdampfbaren Analyten, welche durch ESI schlecht ionisierbar sind, da sie

zum Beispiel wenige funktionelle Gruppen besitzen, Anwendung. Der gelöste Analyt wird auf eine

Kapillare aufgetragen und durch einen Stickstoffstrom zerstäubt, wodurch ein Spray entsteht der in

weiterer Folge zum Verdampfen des im Überschuss vorliegenden Lösungsmittels in einen erhitzten

Quarzkanal (Vaporizer) gelangt. Durch Anlegen einer Hochspannung an die Corona-Nadel entsteht

ein Elektronenstrahl, durch welchen Primärionen aus der gasförmigen Lösungsmittelphase erzeugt

werden. Durch Kollision mit den im Dampf befindlichen Analytmolekülen beziehungsweise durch den

Energieunterschied zu den Lösungsmittelionen werden die Analytenmoleküle in weiterer Folge

ionisiert. [84] Beim Lösungsmittel handelt es sich oft um einen Ammoniumformiat-Puffer. Die

Ionisierung kann im Positiv- oder im Negativ-Modus erfolgen, wodurch es zur Bildung von positiven

beziehungsweise negativen Ionen kommt. Im Positiv-Modus kommt die Ionisation entweder durch

Protonentransfer zwischen dem Pufferion, bei Ammoniumformiat demzufolge Ammonium, und dem

Analyten oder durch Adduktbildung zustande. Im Negativ-Modus kommt es entweder zur Abspaltung

eines Protons oder wiederum zur Adduktbildung, bei Ammoniumformiat also der Anlagerung des

Formiat-Ions [84]. Bei den gebildeten Ionen handelt es sich jeweils um Primärionen. Die Ionen

werden daraufhin durch einen dünnen Einlass fokussiert und zum MS transportiert.

36

Abbildung 18: Schematische Darstellung der Chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck. (Modifiziert von [90])

3.2.2 Analysatoren

Die Analyse von Molekülen beruht auf der Trennung von Ionen anhand verschiedener physikalischer

Prinzipien, wobei das Masse zu Ladungsverhältnisses (m/z) entscheidend ist. Analysatoren können

grundsätzlich in zwei Arten eingeteilt werden. Zum einen in simultan messende Analysatoren, bei

denen alle Ionen gleichzeitig gemessen werden (zum Beispiel Flugzeitanalysatoren (TOF)) sowie

gepulste Analysatoren, bei denen Ionen nacheinander gemessen werden (zum Beispiel

Quadrupolanalysatoren). Weiters kann eine Unterscheidung aufgrund der physikalischen Prinzipien

erfolgen. Hierbei wird anhand der Analyse der unterschiedlichen Flugzeiten der im feldfreien Raum

(z.B. TOF), der Selektion anhand der Ionenmassen in elektrischen Wechselfeldern (z.B. Quadrupol)

und der Ablenkung der Ionen in elektrischen oder magnetischen Feldern (Sektorfeldanalysatoren)

unterschieden [84] [91].

3.2.2.1 Flugzeitanalysatoren-TOF

Das Prinzip von Flugzeitanalysatoren beruht auf der Trennung der Ionen aufgrund ihrer Masse, wobei

alle Ionen simultan analysiert werden können. Ionen werden, von der Ionenquelle kommend, in

einem elektrischen Feld gepulst beschleunigt, bevor die Ionen mit äquivalenter kinetischer Energie in

einen feldfreien Bereich mit der definierten Länge d eintreten. Durch die Korrelation der Masse mit

der kinetischen Energie durch die Formel Ekin=0,5*(m*v2) lässt sich somit berechnen, dass Ionen mit

höheren Massen eine längere Verweildauer in der feldfreien Zone aufweisen. In der Regel

unterscheidet man zwischen linearen TOFs, bei denen die Ionen eine lineare Flugbahn durch das

Flugrohr haben, und Reflektron-TOFs. Reflektrons, auch Ionenspiegel, kehren am Ende des

Flugrohres die Richtung der Ionen um, wodurch der Einfluss der kinetischen Energieverteilung auf die

37

Flugzeit minimiert wird, was in einer Erhöhung der Auflösung, im Vergleich zu linearen TOFs

resultiert [84].

Abbildung 19: Schematische Darstellung eines Reflektron-TOFs (Modifiziert von [92])

3.2.2.2 Quadrupol

Quadrupolanalysatoren werden häufig in Verbindung mit GC-EI-MS eingesetzt, wobei der Quadrupol

das Herzstück des Massenspektrometers darstellt [93]. Der Quadrupol besteht aus vier parallel

angeordneten Stabelektroden, welche durch Keramikklemmen zusammengehalten werden. Es liegen

sich jeweils zwei gleich geladene Stabelektroden gegenüber (vgl. Abbildung 20). Zur Trennung wird

ein elektrisches Feld, durch Anlegen einer Gleichspannung (dc) und einer oszillierenden

hochfrequenten Wechselspannung (ac), erzeugt [93]. Die von der Ionisationsquelle erzeugten Ionen

werden vor der Analyse beschleunigt, und können dann in den Quadrupol eintreten. Negativ

geladene Ionen treten danach mit den positiv geladenen Stabelektroden in Wechselwirkung und

positive Ionen mit den negativ geladenen. Diese Wechselwirkung variiert je nach Stärke des

angelegten elektrischen Feldes. Durch Veränderung des elektrischen Feldes werden Ionen anhand

der verschiedenen Massen nacheinander auf stabile, sinusförmige Flugbahnen gebracht und können

so den Quadrupol passieren [84].

Abbildung 20: Schema eines Quadrupol-Analysators (Modifiziert von [94])

38

3.3 Kernspinresonanzspektroskopie-NMR

Die NMR-Spektroskopie ist eine Untergruppe der Spektroskopie. Spektroskopische Methoden

basieren im Allgemeinen darauf, dass verschiedene Strahlungsarten nach definierten Eigenschaften,

wie zum Beispiel Wellenlänge, Energie oder Masse zerlegt werden. Bei der NMR-Spektroskopie

werden die Atomkerne anhand ihres Eigendrehimpulses (Kernspin) untersucht. Durch diesen

Eigendrehimpuls erzeugen die Atomkerne ein Magnetfeld, welches willkürlich ausgerichtet ist. Durch

das Anlegen eines Magnetfeldes, durch die Einbringung von resonanten elektromagnetischen

Wellen, kommt es zu einer Ausrichtung der Spins, entweder mit dem angelegten Magnetfeld, oder in

die entgegengesetzte Richtung [95]. Es kommt also zum Übergang von einem relaxierten

Energieniveau in ein angeregtes (Resonanz). Atome gleicher Art haben in der Regel die gleiche

Resonanz. Sind diese an verschiedene andere Atome gebunden, ändert sich diese geringfügig, da die

Elektronendichte um den Kern verschoben ist, wodurch unterschiedliche Bindungspartner stärkere

oder schwächere Abschirmungen des angelegten Magnetfeldes vom Atomkern hervorrufen. Durch

diesen Rückschluss auf die Elektronendichte eignet sich die NMR-Spektroskopie zur

Strukturaufklärung von Molekülen.

Abbildung 21: Schematische Darstellung eines Kernspinspektrometers (Modifiziert von [96])

Die Probe wird hierbei, um eine Beeinflussung des Spektrums durch das Lösungsmittel, durch darin

enthaltene Wasserstoffatome, zu vermeiden, in deuteriertem Lösungsmittel gelöst und auf das

veränderbare Magnetfeld aufgebracht. Dieses ist von einer Induktionsspule umgeben, welches

senkrecht zum bestehenden Magnetfeld ein elektromagnetisches Wechselfeld erzeugt [97]. Das

veränderbare Magnetfeld wird nun so lange verstärkt, bis es zu einer Resonanz kommt, wodurch die

Atomkerne Energie aus dem Wechselfeld aufnehmen und es somit zu einer messbaren Veränderung

der Stromstärke kommt. Die Auswertung erfolgt anhand der Berechnung der Verschiebung zu einem

Standard (Shift), bei 1H- sowie 13C-Messungen wird hierzu häufig Tetramethylsilan (TMS) eingesetzt

[95].

39

4 Material und Methoden

4.1 Lösungsmittel und Reagenzien

1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (98%), Sigma-Aldrich

Aceton (chem. Rein), Brenntag

Acetonitril (HPLC- grade ≥ 99,9%), Fisher-Scientific

Benzylbromid (98%), Fluka

Biodiesel, ADM-Hamburg

Bromwasserstoff (33% in AcOH), Merck

Calciumchlorid (wasserfrei geschmolzen granuliert, reinst), Fisher

Chloroform (99%), Merck

Cholesterol (from sheep wool, ≥ 92.5%), Sigma-Aldrich

Cyclohexen (99%), Riedel-de-Haen

DC Kieselgel 60 F254, Merck

Dichlormethan (HPLC-grade), Acros

Diethylether (rektifiziert), Prolab

Dimethylformamid (99%), Fluka

Dioxan (99,5%), Acros

Essigsäureanhydrid (98%), Riedel-de-Haen

Ethanol (96%), VWR

Ethanol (abs.), Merk

Kaliumhydroxid (p.A.), Fisher

Kieselgel60 (0,015-0,040 mm), Merck

Lipase acrylic resin from Candida antarctica (Novozyme 435), Sigma Aldrich

Magnesiumsulfat (97% wasserfrei pur.), Acros

Methanol (techn. > 98%), VWR

Methanol (HPLC-grade ≥ 99,5%), VWR

Molekularsieb 3Å, Merck

Molekularsieb 4Å, Merck

MSTFA (N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamid) (97%), Acros

Natrium (In Paraffinöl), Merck

Natriumacetat (wasserfrei, 99%), Riedel-de-Haen

Natriumchlorid (techn.), Brenntag

Natriumhydrid (dry, 95%), Sigma-Aldrich

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Natriumhydrogencarbonat(≥ 99%), Riedel-de-Haen

Natriumhydroxid (97%), Acros

Natriumsulfat (≥ 99%, wasserfrei), Carl Roth

n-Hexan (HPLC- grade ≥ 97%), VWR

n-Hexan (techn. 95%), Carl Roth

Palladiumhydroxid/C (Pearlman´s Catalyst), Sigma Aldrich

Palmitinsäure(puriss. p.a), Riedel-de-Haen

Petrolether (40-65°C bp.), Acros

Phosphorpentoxid (≥ 98,5%), Riedel-de-Haen

Piperidin (99%), Sigma-Aldrich

Pyridin (≥ 99%), Acros

Rapsöl, Spar

Saccharose (Staubzucker), Dr. Oetker

Salzsäure (37%), IfC

Silbercarbonat (99%), Sigma-Aldrich

Sojaöl, Kunela Feinkost

Tetrahydrofuran (HPLC-grade ≥ 99,5%), VWR

Trichloracetonitril (98%), Sigma-Aldrich

Triethylamin (99%), Riedel-de-Haen

Trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (TMSOTf) (99%), Sigma-Aldrich

α-D-Glucose (wasserfrei), Sigma-Aldrich

β-D-Glucosepentaacetat (98%), Sigma-Aldrich

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4.2 Geräte

4.2.1 Probenvorbereitung

Rotavapor Heidolph VV2000 mit Wasserbad Heidolph WB 2000 und Membranvakumpumpe ABM MZ

2C, Schwabach, Deutschland

Autovortex SA6, Stuart Scientific, Staffordshire, United Kingdom

Laborschüttler IKA KS 130 basic, Staufen, Deutschland

4.2.2 GC-MS

Agilent Technologies 7693 Autosampler

Agilent Technologies 7890A GC-System

Agilent Technologies 5975C inert XL MSD with Triple-Axis-Detector

Software: MSD-Chemstation E.02.00.493

Säule: DB5-HT (400°C max, 30 m, 0,25 mm, 0,10 µm)

4.2.3 HPLC-TOF-MS

TOF-MS: Agilent 6230 TOF LC/MS G6230B

Agilent 1260 Infinity Series

HiP Degasser G4225A

Bin Pump G1312B

ALS Autosampler G1329B

TCC Columnthermostat G1316A

DAD Detector G4212B

Software: MassHunter Workstation Rev.B.05.01 SP2

4.2.4 NMR-Spektroskopie

Spektrometer: Bruker Avance III

Probenkopf: Broadband Observe

4.2.5 GC-FID

HP 7683 Series Injector

HP 6890 Series GC System

Software: GC ChemStation Rev.B. 03.01.

Säule: DB5-HT (400°C max, 15 m, 0,32 mm, 0,10 µm)

42

4.3 Synthese von Cholesterylglycosiden

In diesem Kapitel wird die Synthese von Cholesterylglycosiden durch drei unterschiedliche Methoden

beschrieben. Bei diesen handelt es sich um die Koenigs-Knorr-Methode, die Trichloracetimidat-

Methode und eine weitere Trichloracetimidatmethode, bei der Saccharose als Edukt dient.

4.3.1 Synthese durch Koenigs-Knorr Methode

4.3.1.1 Synthese von β-D-Glucose-Pentaacetat [98]

Bei der Synthese von Glucosepentaacetat wurde Glucose (25,00 g; 138,8 mmol) und Natriumacetat

(20,00 g; 243,8 mmol) in einen 250 mL Rundkolben eingewogen, in Essigsäureanhydrid (125 mL; 1,13

mol) gelöst und der Rundkolben anschließend mit einem Rückflusskühler inklusive eines CaCl2-

Trockenrohrs verbunden. Die Lösung wurde 90 min lang unter Rückfluss und unter Rühren erhitzt

und anschließend wurde die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt. Das entstandene

Produktgemisch wurde anschließend langsam auf 1250 mL Eiswasser gegossen, woraufhin sich

farblose Kristalle bildeten, die mit der Vakuumpumpe abgesaugt wurden. Anschließend wurde aus

Methanol umkristallisiert. Dazu wurden die Kristalle in wenig heißem Methanol gelöst und heiß

filtriert. Nach wenigen Stunden bildeten sich bei Raumtemperatur farblose Kristalle, die wieder

abgesaugt wurden. Das Produkt der Reaktion wurde bei 45°C über Nacht im Trockenschrank

getrocknet. Die Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie und

Schmelzpunktbestimmung.

Rf-Wert: (Laufmittel Toluol/Aceton 3:1) 0,57

Ausbeute: 32,75 g (83,90 mmol), (60% d. Th., 97% d. Lit.)

4.3.1.2 Synthese von Acetobromoglucose

Glucosepentaacetat (15,00 g; 38,4 mmol) und 33%-ige Bromwasserstofflösung in Eisessig (34 mL;

192,7 mmol HBr) aus dem Kühlschrank wurden in einen 250 mL Rundkolben durch Rühren und durch

kräftiges Umschütteln unter Eiswasserkühlung in eine homogene Mischung überführt. Der

Rundkolben wurde mit einem CaCl2-Trockenrohr versetzt und die Reaktion anschließend zwei

Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bis sich eine klare Flüssigkeit ergab. Das Gemisch wurde

daraufhin unter Rühren mit einem Glasstab in ein Becherglas mit 700 mL Eiswasser gegossen. Es

bildete sich ein farbloser Niederschlag, der mit dem Glasstab gründlich unter Eiswasser zerrieben

wurde. Dieser wurde mit der Vakuumpumpe abgesaugt und mit Wasser nachgewaschen. Die

farblosen Kristalle wurden in Diethylether gelöst und das ausgeschiedene Wasser mit einem

Schütteltrichter entfernt. Die Lösung wurde in einen 500 mL Rundkolben mit CaCl2-Trockenrohr

überführt und über Nacht über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde anschließend filtriert

43

und der Ether unter Vakuum am Rotavapor abgezogen, woraufhin sich eine viskose Flüssigkeit

bildete. Zu dieser wurde Diethylether zugegeben, bis sich die Flüssigkeit gerade wieder löste.

Daraufhin wurde solange Petrolether zugetropft, woraufhin sich Schlieren bildeten, die beim

Umschütteln wieder verschwanden. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis sich die Schlieren

beim Umschütteln nicht mehr lösten. Die so erhaltene Lösung wurde zum Auskristallisieren über

Nacht in den Kühlschrank gestellt, woraufhin sich farblose Kristalle bildeten die mit Hilfe der

Vakuumpumpe abgesaugt wurden. Das Produkt wurde mit einem eiskalten Gemisch aus

Petrolether/Diethylether im Verhältnis 1:1 nachgewaschen. Die Trocknung erfolgte im evakuierten

Exsikkator über Natriumsulfat im Kühlschrank. Die Analyse erfolgte mittels

Dünnschichtchromatographie und Schmelzpunktbestimmung.

Rf-Werte: (Laufmittel Petrolether/Ethylacetat 4:5): ABG: 0,70; GPA: 0,53

Ausbeute: 12,95 g (31,49 mmol), (82% d. Th., 90% d. Lit.)

4.3.1.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid durch

Koenigs-Knorr-Mechanismus

Acetobromoglucose (4,00 g; 9,7 mmol), Cholesterol (4,71 g; 12,18 mmol) und Silbercarbonat (3,02 g;

11,0 mmol) wurden in einen 250 mL Rundkolben eingewogen und etwa 17 g Molekularsieb 3Å

zugegeben. Dem Gemisch wurden 72 mL Diethylether zugegeben und es wurde über Nacht unter

Luft- und Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Hierzu wurde dem Rundkolben ein mit Stickstoff gefüllter

Ballon aufgesetzt. Die Reaktion wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt, und nachdem das

gesamte Edukt verbraucht war, wurde das entstandene Silberbromid sowie das Molekularsieb

abfiltriert und mit Diethylether nachgewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter

Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit Wasser gewaschen, in einen 500 mL Rundkolben mit

CaCl2-Trockenrohr überführt und über Natriumsulfat über Nacht getrocknet. Anschließend wurde das

Natriumsulfat abfiltriert und das Lösungsmittel am Rotavapor unter Vakuum abgezogen. Es verblieb

ein Produktgemisch (7,23 g) aus farblosen Kristallen, welches aus Cholesterol, Cholesterylacetat

sowie dem acetylierten Cholesterylglycosid und dem Orthoester bestand.

2 g des Produktgemisches wurden auf eine Chromatographiesäule (Ø 2 cm), welche 40 cm hoch mit

Kieselgel 60 (40-63 µm) befüllt wurde, aufgetragen und getrennt. Als Laufmittel diente

Petrolether/Aceton 4:1. Die letzten erhaltenen Fraktionen entsprachen jenen, die das acetylierten

Produkt enthielten. Diese wurden anschließend vereint und das Laufmittel am Rotavapor unter

Vakuum abgezogen. Es verblieb ein farbloser Feststoff, der über Nacht im evakuierten Exsikkator

über Natriumsulfat getrocknet wurde. Die Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie,

44

durch Derivatisierung mit Schwefelsäure und anschließendem Erwärmen, sowie durch

Schmelzpunktbestimmung.

Rf-Werte: Glycosid: 0,14, Orthoester: 0,24; Cholesterol: 0,33; Cholesterylacetat: 0,75

Ausbeute: 0,70 g (0,97 mmol), (36% d. Th., 88% d. Lit.)

Schmelzpunkt:156-157°C (Literatur: 156-158°C).

4.3.1.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Das acetylierte Cholesterylglycosid (0,70 g; 0,97 mmol) wurde in einen 100 mL Rundkolben, der mit

einem CaCl2-Trockenrohr versetzt wurde, eingewogen und in 36 mL THF/MeOH 1:1 gelöst. Es wurde

1 mL MeO--Lösung (10 mg Natrium in 1 mL Methanol gelöst) zugegeben und der Reaktionsansatz

gerührt, bis die DC-Kontrolle (Laufmittel Petrolether/Aceton 1:1) das Verschwinden des acetylierte

Edukts zeigte. Außerdem wurde die vollständige Deacetylierung durch die Analyse mittels MS-TOF

überprüft. Die Reaktion wurde anschließend durch Zutropfen von HCl bis zu einem pH-Wert von 7

beendet und auf 50 mL Eiswasser gegossen woraufhin sich ein farbloser Niederschlag bildete. Dieser

wurde mit Hilfe der Vakuumpumpe abgesaugt und mit Wasser gründlich nachgewaschen. Die

Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie, MS-TOF und

Schmelzpunktbestimmung.

Rf-Wert: (Laufmittel Petrolether/Aceton 1:1): 0,14

Ausbeute: 0,43 g (0,78 mmol), (80% d. Th., 87% d. Lit.)

Schmelzpunkt: 276-278°C (Literatur: 276-278°C)

4.3.2 Synthese durch Trichloracetimidat-Methode

4.3.2.1 Synthese von 2,3,4,6-tetra-acetyl-D-glucose

Glucosepentaacetat (10,00 g; 25,6 mmol) wurde in einen 250 mL Rundkolben, welcher mit einem

CaCl2-Trockenrohr versetzt wurde, eingewogen und in 130 mL wasserfreiem THF gelöst. Unter

Feuchtigkeitsausschluss wurden 5 mL Piperidin zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur

gerührt. Die Reaktion wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt (Laufmittel Hexan/Ethylacetat

1:1). Nach vier Stunden zeigte sich bereits ein signifikanter Umsatz von Glucosepentaacetat zu

Glucosetetraacetat. Es wurden weitere 2 mL Piperidin zugegeben und die Lösung über Nacht in den

Kühlschrank gegeben. Nach dem vollständigen Verschwinden des Edukts und der Präsenz von zwei

tieferliegenden Spots am Chromatogramm, welche das α- und das β- Anomer des

Glucosetetraacetats darstellen, wurde die Lösung mit Ethylacetat verdünnt, 10%-ige HCl zugegeben.

Die wässrige Phase wurde mit dem Schütteltrichter abgetrennt und noch zweimal ausgeschüttelt. Die

organischen Phasen wurden vereint und mit gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser nachgewaschen.

45

Anschließend wurde die Lösung in einen 250 mL Rundkolben überführt und über Natriumsulfat

getrocknet. Nach dem das Lösungsmittel am Rotavapor unter Vakuum abgezogen wurde, verblieb

eine farblose Flüssigkeit. Die Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie.

Rf-Werte (Laufmittel Hexan: Ethylacetat 1/1): GPA: 0,48; Anomere GTA: 0,30 und 0,24

Ausbeute: 7,84g (2,53mmol) (88% d.Th. bzw. 103% d. Lit.)

4.3.2.2 Synthese von O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranosyl)-trichloracetimidat

Die beiden Anomere von 2,3,4,6-Tetra-acetyl-D-glucose (6,27 g; 18,01 mmol) wurden in 67 mL

Dichlormethan gelöst und die Lösung im Eiswasserbad auf 0°C gekühlt. Dem Gemisch wurde

anschließend eine katalytische Menge DBU (140 µL; 0,94 mmol) sowie Trichloracetonitril (20 mL; 199

mmol) hinzu pipettiert, das Eiswasserbad entfernt und die Reaktion bei Raumtemperatur gerührt.

Die dünnschichtchromatographische Verfolgung der Reaktion zeigte nach einiger Zeit, neben den

Edukten, zwei höherliegende Spots, welche das α- und das β-Anomer des Trichloracetimidat-

Produktes darstellten (Laufmittel Hexan/Ethylacetat 1:1). Nach vier Stunden war kein weiterer

Umsatz von Edukt zu Produkt mehr zu beobachten, jedoch zeigte sich, dass die Intensität des α-Spots

immer mehr zunahm, während der β-Spot beinahe zur Gänze verschwand. Die Reaktion wurde

daraufhin abgebrochen. Zur Entfernung des verbliebenen Eduktes wurde aus Hexan/Ethylacetat 1:1

umkristallisiert, woraufhin nur noch die beiden Anomere des Produktes, nachweisbar waren. Das

Lösungsmittel wurde am Rotavapor unter Vakuum abgezogen. Es verblieben farblose Kristalle,

welche über Nacht im Exsikkator über Natriumsulfat getrocknet wurden. Die Analyse erfolgte mittels

Dünnschichtchromatographie sowie durch NMR-Spektroskopie.

Rf-Werte: (Laufmittel Hexan/Ethylacetat 1:1): α- und β-Anomer: 0,50 und 0,62.

Ausbeute: 7,97 g (16,23 mmol) (90% d.Th. bzw. 102 % d.Lit.)

4.3.2.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid

Trichloracetimidat (8,41 g; 17,13 mmol) und Cholesterol (4,40 g; 11,38 mmol) wurden in

wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Weiters wurde Molekularsieb 4Å zugegeben und das Gemisch

bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Anschließend wurde

eine 0,02 M Lösung von TMSOTf in DCM (215 µL TMSOTf in 59 mL DCM) tropfenweise zugegeben

und die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach zehn Minuten war das gesamte

Edukt verbraucht. Am Chromatogramm waren, neben diversen Verunreinigungen, das Produkt sowie

das Cholesterylacetat ersichtlich. Die Reaktion wurde durch Zutropfen von Triethylamin bis zum

Eintreten einer Gelbfärbung beendet. Anschließend wurde das Lösungsmittel am Rotavapor

46

abgezogen, woraufhin ein zähes, braunes Gemisch erhalten wurde, welches aus dem acetylierten

Cholesterylglycosid, dem Cholesterylacetat sowie diversen Verunreinigungen bestand. Die Analyse

erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie und MS-TOF. Eine Berechnung der Ausbeute wurde für

diesen Schritt nicht als sinnvoll erachtet, da sich zahlreiche Verunreinigungen im Produkt befanden.

Außerdem wurden keine Aufreinigungsschritte getätigt, sondern mit dem erhaltenen Gemisch

unverändert weitergearbeitet.

Rf-Werte(Laufmittel Hexan/Ethylacetat 70:30): Produkt: 0,50; Cholesterylacetat: 0,81

Ausbeute: 12,48 g

4.3.2.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Das acetylierte Cholesterylglucopyranosid enthaltende Produktgemisch (5 g) wurde in einen 500 mL

Rundkolben eingewogen und in einem Gemisch aus THF/MeOH 1:1 durch Rühren mit dem

Rührknochen unter Luftausschluss gelöst. Nachdem sich das Produkt vollständig gelöst hatte, wurden

7 mL MeO--Lösung, welche durch Lösen von Natrium in Methanol (68 mg Na in 7 mL MeOH)

hergestellt wurde, zugegeben und das Gemisch über Nacht gerührt. Die

dünnschichtchromatographische Kontrolle zeigte die Absenz des acetylierten Ausgangsmaterials und

einen tieferliegenden Spot, welcher das deacetylierte Cholesteryl-β-D-glucopyranosid darstellte

(Laufmittel Hexan/Ethylacetat 70:30). Die Beendigung der Reaktion erfolgte durch Zutropfen von

konzentrierter Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 7. Anschließend wurde das Lösungsmittel am

Rotavapor unter Vakuum abgezogen und der braune, zähe Rückstand zur Aufreinigung mit

Hexan/Methanol 1:1 bis zur Lösung versetzt. Das Gemisch wurde im Eiswasserbad auf 0°C gekühlt

und mehrere Stunden am Magnetrührer gerührt, bis sich farblose Kristalle abschieden. Diese wurden

mit der Vakuumpumpe abgesaugt und mit Hexan mehrere Male gründlich nachgewaschen, bis auf

der DC-Platte nur noch das gewünschte Produkt erkennbar war. Es verblieb ein farbloser Feststoff,

welcher über Nacht im Exsikkator über Natriumsulfat getrocknet wurde. Die Analyse erfolgte mittels

Dünnschichtchromatographie, MS-TOF, Gaschromatographie, NMR-Spektroskopie sowie durch

Schmelzpunktbestimmung.

Rf: (Laufmittel: Petrolether/Aceton 1:1): 0,14

Ausbeute: 1,20 g (2,19 mmol) (38% d.Th. bzw. 138 % d.Lit.)

Schmelzpunkt: 268-270°C (Literatur: 276-278°C)

47

4.3.3 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit Saccharose als Edukt

4.3.3.1 Synthese von Octa-O-Benzylsaccharose

Saccharose, in Form von Staubzucker (10,00 g; 29,22 mmol) und Natriumhydrid (10,00 g; 41,67

mmol) wurden unter Feuchtigkeitsausschluss in einen 500 mL Rundkolben eingewogen, gut

durchmischt, in 300 mL Dimethylformamid gelöst und im Eisbad auf 0°C gekühlt. Anschließend wurde

Benzylbromid (34 mL; 286,25 mmol) hinzugegeben, der Rundkolben mit einem CaCl2-Trockenrohr

versetzt und der Reaktionsansatz drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Zur Beendigung

der Reaktion wurden 30 mL Methanol zugegeben und das Lösungsmittel am Rotavapor unter

Vakuum bei 90°C Badtemperatur abgezogen. Das verbliebene Rohprodukt wurde in Dichlormethan

und Wasser gelöst und die organische Phase noch zweimal im Schütteltrichter mit Wasser

nachgewaschen. Die Lösung wurde über Nacht über Magnesiumsulfat getrocknet, anschließend

filtriert und der entstandene Dibenzylether und andere flüchtige Verunreinigungen am Rotavapor bei

90°C unter Vakuum abgezogen. Das Produkt war ein zähes, hellbraunes Öl.

Ausbeute: 23,50 g (22,12 mmol) (76% d. Th. bzw. 80% d. Lit.)

4.3.3.2 Synthese von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose

Octa-O-Benzylsaccharose (23,5 g; 22,12 mmol) wurden in einen 500 mL Rundkolben eingewogen, in

240 mL Aceton gelöst und mit 12 mL konzentrierter HCl versetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten bei

55°C unter Rückfluss erhitzt. Der erhaltene Ansatz wurde am Rotavapor unter Vakuum einrotiert, in

Dichlormethan wieder gelöst und im Schütteltrichter dreimal mit Wasser gewaschen. Zur Entfernung

des verbliebenen Wassers wurde über Nacht über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das

Lösungsmittel am Rotavapor abgezogen. Der verbliebene Rückstand wurde in wenig heißem

Ethylacetat gelöst und zur Fällung des benzylierten Glucosederivates mit Hexan versetzt. Die Lösung

wurde anschließend über Nacht bei -25°C gelagert, die entstandenen farblosen Kristalle mit der

Vakuumpumpe abgesaugt, in wenig heißem Methanol gelöst, filtriert und anschließend wieder

bei -25°C gelagert. Die ausgefallenen Kristalle wurden wiederum abgesaugt und im Exsikkator über

Natriumsulfat getrocknet. Die Analyse erfolgte durch Dünnschichtchromatographie,

Schmelzpunktbestimmung sowie mittels NMR-Spektroskopie.

Rf-Wert (Laufmittelgemisch Hexan/Ethylacetat 20:80): 0,85

Ausbeute: 6,12 g (11,33 mmol) (51% d.Th. bzw. 73% d. Lit.)

48

4.3.3.3 Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranosyl)trichloracetimidat

Tetrabenzylglucose (1,20 g; 2,22 mmol) wurde in 10 mL absolutem Dichlormethan gelöst und unter

Feuchtigkeitsausschluss und intensivem Rühren bei Raumtemperatur 1 mL Trichloracetonitril und

5 mg Natriumhydrid zugegeben. Die Reaktion wurde mit aufgesetztem CaCl2 –Trockenrohr 15

Minuten gerührt, bis die dünnschichtchromatographische Kontrolle das Verschwinden des Eduktes

und das Entstehen zweier neuer Spots, welche das α- und das β-Anomer darstellten, zeigte. Zur

Beendigung der Anomerisierung wurden noch 70 mg Natriumhydrid zugegeben und das

Reaktionsgemisch nach 2,5 Stunden zur Entfernung des überschüssigen Natriumhydrids über eine

mit Kieselgel 60 bedeckte Glasfritte abfiltriert. Das Filtrat wurde am Rotavapor einrotiert, in

Petrolether/Diethylether 3:2 gelöst und wieder über Kieselgel filtriert. Der Filterkuchen wurde

gründlich nachgewaschen. Nach dem Abrotieren des Lösungsmittelgemisches verblieb eine ölige

Flüssigkeit, welche zum Auskristallisieren im Kühlschrank gelagert wurden. Das Ergebnis waren

farblose Kristalle. Die Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie sowie MS-TOF.

Rf-Werte: (Laufmittel Petrolether/Diethylether 1:1): α-Anomer: 0,71, β-Anomer: 0,50

Ausbeute: 1,29 g (1,88 mmol) (85% d. Th. bzw. 89% d. Lit.)

4.3.3.4 Synthese von Cholesteryl-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid)

Tetrabenzyl-β-D-glucopyranosyl-trichloracetimidat (1,29 g; 1,89 mmol) und Cholesterol (0,61 g; 1,58

mmol) wurden in abs. Dichlormethan gelöst, 7,5 g Molekularsieb 4Å zugegeben und das Gemisch 15

Minuten lang unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Anschließend wurde eine 0,02 M TMSOTf-

Lösung (12 µL TMSOTf in 2 mL Dichlormethan) zugegeben. Die Reaktion wurde

dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach dem Verschwinden des Eduktes wurde die

Reaktion durch Zugabe von 0,75 mL Triethylamin beendet. Nach dem Abfiltrieren des Molekularsiebs

und dem Abziehen des Lösungsmittels am Rotavapor verblieben 1,90 g eines hellbraunen Öles.

Dieses wurde mit einem Gemisch aus Methanol/Dioxan 10:1 versetzt und auf der Magnetrührplatte

gerührt. Nach einiger Zeit fiel ein farbloser Feststoff aus. Dieser wurde mit der Vakuumpumpe

abgesaugt und anschließend über Natriumsulfat im Exsikkator getrocknet. Die Analyse erfolgte

mittels Dünnschichtchromatographie sowie MS-TOF.

Rf-Wert: (Laufmittel: Hexan/Ethylacetat 70:30): 0,79

Die Ausbeute betrug 0,89 g (0,98 mmol), (52% d. Th.)

49

4.3.3.5 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Die benzylierte Cholesterylglucopyranose (0,30 g; 0,33 mmol) wurde in einen Zweihalskolben

eingewogen und mit einem Gemisch aus 15 mL Ethanol/Cyclohexen 2:1 versetzt. Der Rundkolben

wurde mit einem Rückflusskühler mit Trockenrohr, sowie einem Verbindungsstück für Thermometer

verbunden. Durch das Verbindungsstück wurde mit Hilfe einer Glaspipette etwa 20 Minuten lang

Stickstoff durch die Lösung geleitet, bevor diese mit einer katalytischen Menge Pd(OH)2 (20% auf

Kohlenstoff) versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoffeinleitung unter ständigem

Rühren mit einem Rührknochen unter Rückfluss erhitzt und von Zeit zu Zeit wurde wieder ein

Gemisch aus Ethanol/Cyclohexen zugegeben, um den Lösungsmittelverlust durch Verdampfung

auszugleichen. Die Reaktion wurde solange fortgesetzt, bis die dünnschichtchromatographische

Kontrolle die Abspaltung der Benzylgruppen zeigte. Das Produkt war ein farbloser Feststoff. Die

Analyse erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie, TOF-MS sowie Gaschromatographie.

Rf-Wert: (Laufmittel: Petrolether/Aceton 1:1): 0,14

Ausbeute betrug 0,18 g (0,33 mmol) (99% d. Th.).

4.4 Versuch der enzymatischen Herstellung von Cholesteryl(6´-O-

palmitoyl)-β-D-glucopyranosid

Cholesteryl-β-D-glucopyranosid (100,0 mg; 182 µmol) und Palmitinsäure (1,00 g; 3,899 mmol)

wurden in 69 mL Hexan gelöst und Molekularsieb (3Å, 5,15 g) hinzugegeben. Anschließend wurde die

Lipase Novozyme 435 (0,86 g) hinzugegeben und die Mischung bei 45°C im Trockenschrank am

Laborschüttler bei 320 rpm umgesetzt. Nach 48 Stunden wurde die Reaktion abgebrochen, die

Mischung in einen 500 mL Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotavapor abgezogen.

Anschließend wurde das Lösungsmittel abdekantiert, das Gemisch aus Enzym, Molekularsieb und

den verbliebenen Kristallen mit Dichlormethan/Methanol versetzt, und gaschromatographisch als

auch mittels TOF-MS analysiert. Die abdekantierte Lösung wurde mit 1%-iger NaOH solange mit Hilfe

eines Schütteltrichters ausgeschüttelt, bis sich kein Natriumpalmitat mehr bildete und ebenfalls

analysiert.

Ein weiterer Versuch mit n-Hexan als Lösungsmittel wurde durchgeführt, wobei dieses zuvor mit

Molekularsieb getrocknet wurde. Cholesteryl-β-D-glucopyranosid (50 µmol, 27,4 mg) wurde in einer

kleinen Menge an Chloroform gelöst. Palmitinsäure (1 mmol, 260 mg) wurde in n-Hexan gelöst, das

gelöste Cholesterylglycosid sowie Molekularsieb (3Å, 3 g) zugegeben und auf 45°C temperiert.

Anschließend wurde die Lipase Novozyme 435 (260 mg) zugegeben und sofort durch Umschwenken

in Bewegung gebracht. Die Reaktion wurde 24 Stunden bei 45°C und 240 rpm am Laborschüttler

50

durchgeführt. Anschließend wurden das Enzym sowie das Molekularsieb über Glaswolle abfiltriert,

mit Chloroform/Methanol 2:1 nachgewaschen und dann das Lösungsmittel abrotiert. Zum Rückstand

wurden 100 mL Chloroform gegeben und dieser wurde so lange mit 1%-iger NaOH ausgeschüttelt, bis

sich kein Natriumpalmitat mehr bildete. Die organische Phase wurde einrotiert und

gaschromatographisch und mit TOF-MS vermessen.

Weiters wurde die Synthese in einem Lösungsmittelgemisch von THF/Pyridin 4:1 ausgeführt. THF

wurde zuvor destilliert und über Natriumdraht gelagert. Das fertige Lösungsmittelgemisch wurde

noch über Molekularsieb getrocknet. Cholesteryl-β-D-glucopyranosid (50 µmol, 27,4 mg) und

Palmitinsäure (300 µmol, 78 mg) wurden in THF/Pyridin gelöst und Molekularsieb (3Å, 1 g)

zugegeben. Anschließend wurde auf 45°C temperiert, die Lipase Novozyme 435 (25 mg) zugegeben

und sofort durch Umschwenken in Bewegung gebracht. Die Reaktion wurde 48 Stunden bei 45°C und

240 rpm am Laborschüttler durchgeführt. Anschließend wurden das Enzym sowie das Molekularsieb

über Glaswolle abfiltriert, mit Chloroform/Methanol 2:1 nachgewaschen und dann das Lösungsmittel

abrotiert. Das erhaltene Gemisch wurde im Anschluss gaschromatographisch und mittels TOF-MS

analysiert.

4.5 Probenvorbereitung für die qualitative und quantitative Analyse von

Pflanzenölen und Biodiesel auf Sterylglycoside

Die Analyse der Biodieselprobe erfolgte in Anlehnung auf die Vorschrift von Pieber et al. (2010) [99].

Raps- und Sojaöl sowie Rapsbiodiesel wurden anhand der in Tabelle 3 angeführten Parameter für die

Messung am GC-MS vorbereitet. Zur eingewogenen Probe wurden 200 µL MSTFA zugegeben. Zur

Biodieselprobe wurde außerdem noch ein Cholesterolstandard (IS)mit einer Konzentration von

10,22 mg/kg hinzugefügt. Anschließend wurden die Proben 60 Minuten bei 60°C gelagert, mit Pyridin

aufgefüllt und anschließend gaschromatographisch analysiert.

Die Biodieselprobe wurde vor der Messung außerdem noch 1:50 verdünnt.

Tabelle 3: Probenvorbereitung für die Analyse am GC-MS

Probenmenge [mg] MSTFA [µL] Pyridin [g] IS [µl]

Rapsöl 46,4 200 1,20 - Sojaöl 38,9 200 1,14 -

Rapsbiodiesel 80,1 200 1,00 50

4.6 Analytik

In diesem Kapitel werden die im Zuge der Arbeit verwendeten Analysemethoden hinsichtlich der

Probenvorbereitung en als auch der Messparameter beschrieben.

51

4.6.1 GC-MS

Die zu messenden Proben wurden vor der Analyse am GC-MS mit MSTFA silyliert. Hierzu wurde ein

etwa 1 mg der Probe in ein GC-Vial gegeben, in 150 µL Pyridin gelöst, 200 µL MSTFA zugegeben und

verschlossen. Daraufhin wurde die Lösung am Vortex durchmischt und anschließend bei 60°C im

Trockenschrank gelagert. Nach 60 Minuten wurde das Vial mit Pyridin aufgefüllt und vermessen. In

Tabelle 4 sind die Parameter für die Messungen angeführt. Bei den Messungen mittels SIM-Methode

wurden die Fragmente 147 m/z, 204 m/z und 217 m/z zur Charakterisierung der Zuckerkomponente

verwendet.

Tabelle 4: GC-MS Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid

Säule DB-5HT

Starttemperatur 100°C Hold time 2 min Gradient 10°C/min

Endtemperatur 370°C Hold time 15 min Trägergas He Flussrate 1 mL/min

4.6.2 GC-FID

Die Probenanalyse am GC-FID erfolgte analog zur Analyse nach Lacoste et al. (2009) [2].

Die Probenvorbereitung für die Messung erfolgte analog zur Probenvorbereitung für die GC-

Massenspektroskopie. In Tabelle 5 sind die Parameter für die Messung angeführt.

Tabelle 5: GC-FID Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid

Säule DB-5HT

Starttemperatur 100°C Gradient 10°C/min

Endtemperatur 370°C Hold time 18 min Trägergas H2

Flussrate 1,2 mL/min

4.6.3 TOF-MS

Ein kleiner Teil der zu messenden Probe wurde in ein GC-Vial gegeben und in Acetonitril gelöst. In

Acetonitril nicht lösliche Proben wurden zuvor in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, ein Tropfen

davon entnommen und in Acetonitril gelöst. Anschließend wurde die Probe mittels Vortex

durchmischt und am TOF-MS vermessen.

52

Tabelle 6: TOF-MS Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid

APCI Positiv/ Negative* mode

Gas Temp. (N2) 325°C

Vaporizer 350°C

Drying Gas 8 L/min

Nebulizer 40 psig

Fragmentor 175 V

Skimmer 65 V

OCT 1 RF Vpp 750 V

Vcap 3500 V

Corona* 4 µA/25* µA

Capallary 0.078 µA

Corona 176 V

Chamber 5.33 µA

Injection 0.5-2 µL

Solvent 30% H2O, 70%( 90% ACN 10%H2O (0,1% Amminoumformiat))isocratic

Flow 0,3 mL/min

Column Temp. 30°C

4.6.4 NMR-Spektroskopie

Die zu messenden Proben (20 mg) wurden in ein NMR-Röhrchen eingewogen und mit deuteriertem

Lösungsmittel, Chloroform beziehungsweise Pyridin, aufgefüllt und bis zur vollständigen Lösung des

Produktes stehengelassen. Anschließend wurde die Probe am NMR-Spektrometer vermessen.

Tabelle 7: NMR-Parameter für durchgeführte Messungen

1H-NMR 13C-NMR DEPT

Prozessierung % Auswertung Topspin® 2.1

Lösungsmittel CDCl3 bzw. C5D5

5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Synthese durch Koenigs-Knorr Methode

Die Darstellung mittels Koenigs-Knorr Methode wurde in Anlehnung an die von Pieber et al. (2010)

[99] beschriebene Synthesevorschrift durchgeführt, wobei bei dieser als Edukt Glucosepentaacetat

verwendet wurde. In der hier durchgeführten Synthese wurde dieses hingegen zuvor aus Glucose

hergestellt. Des Weiteren wurde zur Herstellung von Acetobromoglucose eine alternative Methode

gewählt.

53

5.1.1 Synthese von β-D-Glucose-Pentaacetat [98]

Die Synthese von Glucosepentaacetat beruht auf der Veresterung von alkoholischen Gruppen durch

ein Carbonsäureanhydrid. Die alkoholischen Gruppen sind in diesem Fall von der Glucose, das

Carbonsäureanhydrid wird durch Essigsäureanhydrid dargestellt. Durch die Wahl von Natriumacetat

als Katalysator beziehungsweise durch die kinetische Kontrolle der Reaktion wird ausschließlich das

β-Anomer gebildet.

Abbildung 22: Darstellung von β-D-Glucose-Pentaacetat mit Natriumacetat als Katalysator

Die erhaltene Ausbeute betrug 60% der Theorie beziehungsweise 97% der Literatur. Das Produkt

stellt einen farblosen Feststoff dar. Der Schmelzbereich der Substanz betrug 130-132°C, welcher sich

exakt mit den Literaturangaben deckt [98]. Bei dünnschichtchromatographischer Analyse zeigt das

Produkt, bei einem Laufmittelgemisch aus Toluol/Aceton 3:1, einen Rf-Wert von 0,57.

Rf-Wert: (Laufmittel Toluol/Aceton 3:1) 0,57

Schmelzpunkt: 130-132°C

Ausbeute: 32,75 g (83,90 mmol), (60% d. Th., 97% d. Lit.)

5.1.2 Synthese von Acetobromoglucose

Die Synthese von Acetobromoglucose nach Ravindranathan-Kartha et al. (1990) [100] beruht auf

dem Mechanismus einer nucleophilen Substitution am gesättigten Kohlenstoffatom. Die anomere

Acetylgruppe wird durch den anorganischen Säurerest der Bromwasserstoffsäure ersetzt.

Abbildung 23: Umsetzung von Glucosepentaacetat mit Bromwasserstoffsäure zur Herstellung von Acetobromoglucose

54

Die erhaltene Ausbeute betrug 82% der Theorie. Das Produkt war ein farbloser Feststoff mit einem

Schmelzpunkt von 88°C, was sich mit den gefundenen Literaturschmelzpunkten deckt. Bei

dünnschichtchromatographischer Analyse zeigt das Produkt, bei einem Laufmittelgemisch aus

Petrolether/Ethylacetat 4:5, einen Rf-Wert von 0,53.

Rf-Werte: (Laufmittel Petrolether/Ethylacetat 4:5): ABG: 0,70; GPA: 0,53

Ausbeute: 12,95 g (31,49 mmol), (82% d. Th., 90% d. Lit.)

5.1.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid durch

Koenigs-Knorr-Mechanismus

Bei dieser Reaktion handelt es sich um eine Substitutionsreaktion eines Glycosylhalogenids durch

einen Alkohol. In diesem Fall werden diese beiden Komponenten durch Acetobromoglucose und

Cholesterol dargestellt.

Abbildung 24: Darstellung des tetraacetylierten Glucopyranosids mittels Koenigs-Knorr Methode

Die Synthese wurde nach der Methodik von Kunz et al. [101] durchgeführt. Die Problematik dieser

Methode liegt unter anderem in der Orthoesterbildung, welche eine Aufreinigung durch

anschließende Säulenchromatographie unerlässlich macht. Neben dem zeitlichen Aufwand, den die

Säulung beansprucht, ist auch ein Produktverlust durch den Verbleib des Produktes in der Säule zu

verzeichnen. Außerdem führt die Bildung von Cholesterylacetat zu weiteren Produktverlusten und

55

erschwert, durch die Präsenz mehrerer Nebenprodukte, die säulenchromatographische Aufreinigung.

Neben dem im experimentellen Teil beschriebenen Laufmittelgemisch Petrolether/Aceton 4:1 wurde

auch ein Versuch mit einem 12:1 Verhältnis, wie dies in der Vorschrift von Pieber et al. (2010) [99]

beschrieben wurde, durchgeführt. Dieser war jedoch, aufgrund der geringen Löslichkeit des

Gemisches, nicht erfolgreich. Diese Faktoren führen in Summe zu geringen Ausbeuten bei hohem

zeitlichen Aufwand. Ein weiterer Faktor der bei dieser Methode zu berücksichtigen ist, ist die Menge

an Silbercarbonat, welche in etwa in äquimolarem Verhältnis zu Acetobromoglucose und Cholesterol

eingesetzt werden muss, und deshalb einen nicht zu vernachlässigenden Kostenfaktor darstellt. Die

geringe Löslichkeit des Produktes erschwert außerdem die säulenchromatographische Trennung. Für

die Herstellung größerer Mengen ist diese Methode somit nicht geeignet.

Vor der säulenchromatographischen Trennung wurde ein Produktgemisch aus dem acetylierten

Cholesterylglycosid, dem Orthoester, Cholesterolacetat sowie freiem Cholesterol in Form eines

farblosen Feststoffes erhalten. Nach der Trennung mittels Säule verblieb ein farbloser Feststoff. Die

erhaltene Ausbeute betrug 0,70 g. Dies entspricht 36% der Theorie beziehungsweise 88% der

Literatur. Der Schmelzpunkt betrug 156-157°C (Literatur: 156-158°C). Bei

dünnschichtchromatographischer Analyse zeigt das Produkt, bei einem Laufmittelgemisch aus

Laufmittel Petrolether/Aceton 4:1, einen Rf-Wert von 0,14.

Rf-Werte: (Laufmittel Petrolether/Aceton 4:1): Acetyliertes Cholesterylglycosid: 0,14; Orthoester:

0,24; Cholesterol: 0,33; Cholesterylacetat: 0,75

Ausbeute: 0,70 g (0,97 mmol), (36% d. Th., 88% d. Lit.)

5.1.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Die Darstellung des Cholesterylglucopyranosids basiert auf der Abspaltung der Acetylgruppen nach

Zemplén [102]. Konkret handelt es sich um eine basenkatalysierte Verseifung, bei der die

Acetylgruppen des Glucopyranosids durch Hydroxylgruppen substituiert werden.

Abbildung 25: Darstellung von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Zemplén-Verseifung

56

Die Deacetylierung verlief unproblematisch und nach drei Stunden zeigte sowohl die

dünnschichtchromatographische Kontrolle als auch das TOF-Massenspektrum die vollständige

Abspaltung aller Acetylgruppen. Bei einem Laufmittelgemisch von Petrolether/Aceton 1:1 zeigte das

Produkt einen Rf-Wert von 0,14. Die erhaltene Ausbeute betrug 80% der Theorie. Die Analyse des

Produktes erfolgte des Weiteren durch TOF-MS als auch durch Gaschromatographie. Anhand der

Peakfläche des Gaschromatogramms wurde eine Reinheit von 99,5% errechnet. Bei den minimal

sichtbaren Peaks bei 11 bzw. 13 Minuten handelt es sich um silylierte Pyranosen, die durch die

Silylierung mit MSTFA entstanden sind. Der Hauptpeak bei etwa 27 Minuten stellt das Produkt dar.

Im TOF-Massenspektrum ist nur eine kleines, nicht identifiziertes Signal mit einer Masse von 405

g/mol zu sehen, bei dem es sich möglicherweise auch um eine Verunreinigung im Lösungsmittel

handeln könnte. Die Analyse mittels MS-TOF wurde mittels Elektrosprayionisation durchgeführt.

Diese lieferte jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Eine anschließende Analyse im negative-

mode mittels APCI-Ionisierung war hingegen erfolgreich. Die Masse 593 g/mol (HRMS (APCI): m/z

berechnet für C34H57O8 [M+HCOO]-: 593,405892, gefunden: 593,407408, Δm=-2,55 ppm) kommt

durch das Vorhandensein des Formiat-Adduktes zustande. Das Gaschromatogramm sowie das TOF-

MS sind in den Abbildungen unten dargestellt.

Ausbeute: 0,43 g (0,78 mmol), (80% d. Th., 87% d. Lit.)

Schmelzpunkt: 276-278°C (Literatur: 276-278°C)

Abbildung 26: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mittels Koenigs-Knorr-Methode

Die Signale bei m/z 147, 204 und 217, die im GC-Massenspektrum ersichtlich sind, sind in den

Massenspektren aller synthetisierten Cholesterylglycoside enthalten und sind auf die Silylierung der

57

Proben zurückzuführen. Genauer kommen diese durch die Fragmentierung von Trimethylsilylester-

und –ethergruppen beziehungsweise durch Trimethylsilyl-Transferprozesse und Umlagerungen

zwischen den Ethern und Estern zustande [103]. Das Ion m/z 204 wird von Grunwald et al. [104] als

Charakteristikum für Pyranoseformen von Hexosen beschrieben. Weiters sind auch die beiden

anderen Werte in der Literatur häufig zu finden. Ein weiterer charakteristischer Wert, der in der

Literatur häufig zu finden ist, ist m/z 73, welcher auch hier vorkommt.

Abbildung 27: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit den Signalen der Silyl-Fragmente sowie dem Cholesterol-Signal

Das Signal bei m/z 369 ist jenes, des vom Glucopyranosylrest abgespaltenen Cholesterols. Die

Massen, welche durch die Fragmentierung bei der Ionisierung zustande kommen [103] [105], sind in

Abbildung 29 mit den Angaben der jeweiligen Strukturformeln angeführt. Links außen ist das

Silylierungsmittel MSTFA, welches das ursprüngliche Ausgangsprodukt für die entstandenen

Trimethylsilyl-Fragmente darstellt.

Abbildung 28: TOF-Massensprektum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

58

Abbildung 29: Entstehende Fragmente bei der Ionisierung im GC-MS

5.2 Synthese durch Trichloracetimidat-Methode

5.2.1 Synthese von 2,3,4,6-tetra-acetyl-D-glucose

Bei dieser Reaktion handelt es sich um einen basenkatalysierten Additions-

Eliminierungsmechanismus. Formal handelt es sich um eine Substitutionsreaktion, bei der die

Acetylgruppen abgespalten werden.

Abbildung 30: Basenkatalysierte Darstellung von Tetraacetylglucose aus Glucosepentaacetat

Bei dieser Reaktion war darauf zu achten, dass sie unter absolut wasserfreien Bedingungen ablief,

weswegen das Lösungsmittel zuvor über KOH unter Rückfluss gekocht, anschließend destilliert und

über Natriumdraht gelagert wurde. Die Ausbeute der Reaktion lieferte bei der Darstellung analog zur

internen Vorschrift [106] keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Erst nach signifikanter Erhöhung der

Piperidinmenge konnte ein vollständiger Umsatz der Reaktion beobachtet werden. Das Produkt war

nach dem Eindampfen eine farblose, ölige Flüssigkeit. Die erhaltene Ausbeute betrug 88% der

59

Theorie. Die dünnschichtchromatographische Analyse zeigte die beiden Anomere bei einem

Laufmittelgemisch Hexan/Ethylacetat 1:1 mit Rf-Werten von 0,30 bzw. 0,24.

Rf-Werte (Laufmittel Hexan: Ethylacetat 1:1): GPA: 0,48; Anomere GTA: 0,30 und 0,24

Ausbeute: 7,84g (2,53mmol) (88% d.Th. bzw. 103% d. Lit.)

5.2.2 Synthese von O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranosyl)-trichloracetimidat

Die Darstellung Glucopyranosyl-Trichloracetimidates beruht auf dem Prinzip der nucleophilen

Addition eines Alkoholatanions an ein Nitril.

Abbildung 31: Basenkatalysierte Darstellung von O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranosyl)-trichloracetimidat aus Tetraacetylglucose

Bei dieser Reaktion war wieder darauf zu achten, dass sie unter möglichst wasserfreien Bedingungen

ablief, weswegen Dichlormethan zuvor über P2O5 unter Rückfluss gekocht, und über Molekularsieb

gelagert wurde. Nach vier Stunden konnte durch die dünnschichtchromatographische Kontrolle kein

weiterer Umsatz von Edukt zu Produkt mehr festgestellt werden, weshalb die Reaktion abgebrochen

wurde. Im Gegensatz zu der, in der internen Vorschrift vorgeschlagenen säulenchromatographischen

Auftrennung, wurde eine Umkristallisation mit Hexan/Ethylacetat vorgezogen, wodurch das Edukt

beziehungsweise Verunreinigungen zur Gänze entfernt werden konnten. Das Anomerengemisch,

welches hauptsächlich aus dem Anomer mit dem Rf-Wert 0,62 bestand, war nach dem Abrotieren

ein farbloser Feststoff mit teilweise etwas bräunlicher Färbung. Dies lässt sich dadurch erklären, dass

hauptsächlich das α-Anomer, welches in Reinform einen farblosen Feststoff [106] darstellt, im

erhaltenen Produkt vorhanden war. Das β-Anomer hingegen ist in Reinform ein braunes Öl [106]. Der

Überschuss an α-Trichloracetimidat beruht darauf, dass durch die schnelle Addition zuerst das β-

Anomer gebildet wird, dieses jedoch in der langsameren basenkatalysierten Reaktion beinahe

Vollständig zum α-Anomer anomerisiert [107]. Die erhaltene Ausbeute betrug 90% der Theorie. Die

dünnschichtchromatographische Analyse zeigte die beiden Anomere bei einem Laufmittelgemisch

Hexan/Ethylacetat 1:1 bei 0,50 und 0,62. Weiters bestätigte die NMR-spektroskopische Analyse den

Erfolg der Methode, wodurch die Säulung vermieden werden kann.

60

Rf-Werte: (Laufmittel Hexan: Ethylacetat 1:1): α- und β-Anomer: 0,50 und 0,62.

Ausbeute: 7,97 g (16,23 mmol) (90% d.Th. bzw. 102 % d.Lit.)

NMR: Die Analyse mittels 13C NMR zeigte das Vorhandensein von Shifts bei 61,5 ppm (CH2Ac), 69.8

ppm (C2-O-C), 67,8 ppm(C3-O-C), 70,1 ppm(C4-O-C), 72.6ppm (C2-O-C), 170,2 ppm, 170,9 ppm,

169,4 ppm (Carbonylgruppen), 160,9 ppm (C=NH), 90,6 ppm (-CCl3), 20,6 ppm (-CH3).

Abbildung 32: 13

C NMR (CDCl3) (75 MHz)Spektrum von GTATH (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-trichloracetimidat

Die Analyse durch 1H NMR zeigte minimale Verunreinigungen, die auf die Produktformierung

zurückzuführen sind. 8,73 ppm (C=NH), 5,29 ppm (H1 von O-CH-O), 5,23 ppm (-CH-OAC), 4,36 ppm

(H2), 4,20 ppm und 3,93 ppm (-CH2-OAc), 2,1 ppm (-CH3).

61

Abbildung 33: 1H NMR (CDCl3) (300MHz) Spektrum von GTATH (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-

trichloracetimidat

5.2.3 Synthese von Cholesteryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid

Diese Reaktion beruht auf einer säurekatalysierten SN2 Reaktion am anomeren Zentrum des

Glucopyranosids, bei der die Schutzgruppe durch Cholesterol substituiert wird.

Abbildung 34: TMSOTf-katalysierte Umsetzung zu Cholesteryl-Tetraacetylglucopyranosid

Für diese Umsetzung wurde das Lösungsmittel frisch destilliert sowie Molekularsieb als

„Wasserfänger“ eingesetzt, um die Reaktion absolut wasserfrei durchzuführen. Nach der ersten

Zugabe von TMSOTf konnte noch keine vollständige Umsetzung des Ausgangsproduktes beobachtet

werden, weswegen nach 10 Minuten noch einige Tropfen TMSOTf-Lösung zugegeben wurden. Neben

62

dem gewünschten Produkt bildeten sich noch Cholesterylacetat sowie einige nicht identifizierte

Nebenprodukte. Nach Beendigung der Reaktion wurde ein zähes braunes Gemisch erhalten, die

Ausbeute betrug 12,58 g. Die dünnschichtchromatographische Analyse zeigte bei einem

Laufmittelgemisch von Hexan/Ethylacetat 70:30 das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,5, das

Cholesterylacetat bei 0,81 sowie diverse Verunreinigungen. Weiters war nach der Messung am TOF-

MS das Produkt im Massenspektrum zu sehen. Eine Berechnung der Ausbeute wurde für diesen

Schritt nicht als sinnvoll erachtet, da sich zahlreiche Verunreinigungen im Produkt befanden.

Außerdem wurden keine Aufreinigungsschritte getätigt, sondern mit dem erhaltenen Gemisch

unverändert weitergearbeitet.

Rf-Werte( Laufmittel Hexan/Ethylacetat 70:30): Produkt: 0,5; Cholesterylacetat: 0,81

5.2.4 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Bei dieser Darstellung wurde, wie auch schon bei der Synthese desselben Produktes im Zuge der

Koenigs-Knorr Methode, wieder die Zemplén-Reaktion angewendet. Die Acetylgruppen wurden

basenkatalysiert durch Hydroxylgruppen ersetzt.

Abbildung 35: Darstellung von Cholesterylglucopyranosid durch Zemplén-Verseifung

Die Reaktion zeigte bei dünnschichtchromatographischer Kontrolle nach etwa drei Stunden bereits

das gewünschte Produkt. Die Messung mittels TOF-MS zeigte jedoch, dass nach drei Stunden, wie

dies in der internen Vorschrift [106] beschrieben wird, in dem Reaktionsgemisch noch ein nicht

unwesentlicher Teil mit einer verbleibenden Acetylgruppe befand. Da dieses Zwischenprodukt

offenbar einen recht ähnlichen Rf-Wert wie das Produkt aufweist, war eine

dünnschichtchromatographische Unterscheidung nicht möglich. Zur Entfernung der letzten

Acetylgruppe wurde noch einige Stunden gerührt, wobei sich jedoch keine Veränderung mehr zeigte.

Erst nach Zugabe von weiterer MeO--Lösung und dem Rühren über Nacht konnte die Abspaltung der

verbleibenden Acetylgruppe beobachtet werden. Da die Methode bei der Darstellung mittels

Koenigs-Knorr Methode gut funktioniert hat, (vgl. Kapitel 4.3.1) ist die längere Reaktionsdauer auf

63

das unreine Ausgangsprodukt zurückzuführen. Außerdem wurde weniger Lösungsmittel als auch

weniger Natriummethanolat eingesetzt, als dies für dieselbe Menge an reinem Edukt der Fall

gewesen wäre, da ansonsten im Liter Maßstab gearbeitet hätte werden müssen. Durch die weitere

Zugabe von MeO--Lösung und durch das längere Rühren konnte jedoch schlussendlich die Abspaltung

aller Acetylgruppen erreicht werden. Bei der Aufreinigung wurde, nicht wie in der internen Vorschrift

empfohlen, eine säulenchromatographische Trennung durchgeführt, sondern das Produkt mit Hexan

und Methanol versetzt, auf Eis gestellt und mehrere Stunden gerührt, woraufhin sich das Produkt an

der Phasengrenze als farbloser Feststoff absetzte und so abgesaugt werden konnte. Eine

Schwierigkeit trat bei der Isolierung des gesamten Produktes auf, da sich in der Methanolphase das

Produkt teilweise löste und auch durch mehrmaliges Wiederholen des Rührens auf Eis nicht zur

Gänze isoliert werden konnte, was auch den Verlust an Ausbeute zum Teil erklärt. Durch

Nachwaschen mit Hexan, sowie durch Erhitzen in Hexan, gleichzeitigem Rühren und anschließendem

Absaugen konnten die durch Dünnschichtchromatographie nachweisbaren Verunreinigungen

komplett entfernt werden. Die Charakterisierung des Produktes erfolgte mittels TOF-MS, NMR-

Spektroskopie, GC, DC sowie durch Ermittlung des Schmelzpunktes. Am Dünnschichtchromatogramm

zeigte das Produkt bei einem Laufmittelgemisch Petrolether/Aceton 1:1 einen Rf-Wert von 0,14. Die

Ausbeute betrug 1,20 g, was bezogen auf die eingewogene Trichloracetimidat-Menge einer Ausbeute

von 38 % der Theorie bzw. 138% d. Literatur entspricht. Der Schmelzbereich betrug 276-278°C und

deckt sich mit dem Literaturwert.

Im Gaschromatogramm sind neben den Hauptpeak bei 27 Minuten wieder zwei kleinere Peaks bei

Minute 10 bzw. 11 zu erkennen. Bei diesen handelt es sich, wie schon bei der Synthese mittels

Koenigs-Knorr-Methode, um silylierte Glucopyranosen, die durch Silylierung mittels MSTFA

entstanden sind. Der Hauptpeak bei etwa 27 Minuten stellt das Produkt dar. Des Weiteren ist vor

den Hauptpeak ein kleinerer Peak erkennbar, der jedoch beinahe dieselbe Retentionszeit sowie exakt

dasselbe GC-Massenspektrum wie Cholesteryl-β-D-glucopyranosid aufweist, weshalb davon

auszugehen ist, dass hier zum Teil das α-Anomer entstanden ist. Dies ist auf eine nicht vollständige

Anomerisierung des β-Anomers zum α-Anomer, welches für die Synthese des β-

Cholesterylglucopyranosids von Nöten ist, bei der Herstellung des Trichloracetimidates

zurückzuführen. Dies stellt auch den Nachteil der Trichloracetimidatmethode dar, da eine 100%-ige

Stereoselektivität nicht erreicht werden kann. Bei der Berechnung der Peakfläche ergibt sich ein

Cholesterylglucopyranosidanteil von 98%, wobei zu 85% das β-Anomer, und zu 13% das α-Anomer

vorliegt. Die Verunreinigung durch silylierten Glucopyranosen beträgt etwa 2%. Das GC-

Massenspektrum zeigt, wie auch jenes der Darstellung durch Koenigs-Knorr Methode Signale bei m/z

73, 147, 204, 217 sowie 369. Die Erklärungen der Signale sind in Kapitel 5.1.4 nachzulesen, das

Massenspektrum befindet sich im Anhang. Die Analyse mittels TOF-MS wurde im negative-Mode

64

mittels APCI-Ionisierung durchgeführt. Die Masse 593 g/mol (HRMS (APCI): m/z berechnet für

C34H57O8 [M+HCOO]-: 593,405892, gefunden: 593,406398, Δm=-0,85 ppm) kommt durch das

Vorhandensein des Formiat-Adduktes zustande. Ansonsten sind nur geringfügige Verunreinigungen

erkennbar. Bei der Analyse mittels 13C-NMR konnten alle Signale eindeutig zugeordnet werden, es

sind keine weiteren Signale erkennbar. Das TOF-MS, das NMR-Spektrum sowie das

Gaschromatogramm sind in den Abbildungen unten ersichtlich. Die Strukturformel mit den im NMR-

Spektrum erhaltenen Shifts befindet sich im Anhang.

Rf-Wert (Laufmittel Petrolether/Aceton 1:1): 0,14

Ausbeute: 1,20 g (2,19 mmol) (38% d.Th. bzw. 138 % d.Lit.)

Abbildung 36: TOF-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Abbildung 37: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mittels Trichloracetimidat-Methode

65

NMR: Die Analyse mittels 13C NMR zeigte das Vorhandensein von Shifts bei 140,8 ppm (C-5 Chol),

121,8 ppm (C-6 Chol), 109,9 ppm (C-1 Glc), 81,9 ppm (C-2 Chol), 81,5 ppm (C-5 Glc), 76,8 ppm (C-3

Glc), 74,1 ppm (C-2 Glc), 71,5 ppm (C-4 Glc), 62,2 ppm (C-6 Glc), 56,5 ppm (C-14 Chol), 56,2 ppm (C-

17 Chol), 50,8 ppm (C-9 Chol), 42,7 ppm (C-13 Chol), 39,9 ppm (C-4 Chol), 39,9 ppm (C-24 Chol), 39,8

ppm (C-12 Chol), 37,7 ppm (C-10 Chol), 37,5 ppm (C-1 Chol), 36,1 ppm (C-22 Chol), 35,8 ppm (C-20

Chol), 32,0 ppm (C-7-Chol), 31,8 ppm (C-8 Chol), 29,8 ppm (C-2-Chol), 29,7 ppm (C-25 Chol), 26,3

ppm (C-15 Chol), 25,9 ppm (C-16 Chol), 24,6 ppm (C-23 Chol), 23,2 ppm (C-26 Chol), 23,2 ppm (C-27

Chol), 21,1 ppm (C-11 Chol), 19,4 ppm (C-21 Chol), 19,3 ppm (C-19 Chol), 12,0 ppm (C-18 Chol)

Abbildung 38: DEPT und 13

C NMR (Pyridin) (75 MHz) Spektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

5.3 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit Saccharose als

Edukt

Die Synthese von Sterylglycosiden mit Saccharose als Ausgangsstoff wurde in der Literatur noch nicht

beschrieben. Des Weiteren finden sich für die Anwendung von Benzylschutzgruppen lediglich für die

Synthese von α-Cholesterylglycosid Literatureinträge, für das β-Anomer hingegen konnten für diese

Synthesemethode keine Literatureinträge gefunden werden. Weiters dienten bei bisherig

beschrieben Methoden jeweils Glucose sowie Derivate davon als Edukt für die SG-Synthese. Die

Herstellung des von tetrabenzylierten Trichloracetimidates wurde von der Methode von Schmidt et

al. (1983) [108] adaptiert.

66

5.3.1 Synthese von Octa-O-Benzylsaccharose

Bei der Einführung der Schutzgruppen an das Saccharose-Molekül wurde die Methodik der

Williamson-Ethersynthese [109] gewählt. Bei dieser Methode handelt es sich um einen zweistufigen

Prozess, bei dem durch Natriumhydrid zuerst die alkoholischen Gruppen der Saccharose in

Alkoholate umgewandelt wurden. Anschließend wurden diese mit Benzylbromid umgesetzt und so

im Zuge einer SN2 Reaktion mit Benzylgruppen verethert.

Abbildung 39: Darstellung von Octa-O-Benzylsaccharose durch Williamson-Ethersynthese

Der Vorteil dieses Verfahrens nach Kessler et al. [110] mit Saccharose als Edukt liegt unter anderem

darin, dass Saccharose, in diesem Fall in Form von Staubzucker, einen recht kostengünstigen und

nachwachwachsenden Ausgangsstoff darstellt. Weitaus bedeutender als der Kostenfaktor ist jedoch,

dass die anomere Hydroxylgruppe nicht zusätzlich geschützt werden muss, da diese Aufgabe durch

den angehängten Fructofuranosylrest erfüllt wird. Die Benzylierung wurde zuerst unter Luft- und

Feuchtigkeitsausschluss mit einem aufgesetzten Stickstoff-Ballon durchgeführt, wobei die

gewünschte Reaktion jedoch nicht ablief und sich das gewünschte Produkt nicht bildete. Bei einem

zweiten Versuch hingegen wurde die Umsetzung nur mit einem aufgesetzten CaCl2-Trockenrohr

durchgeführt, bei der die Reaktion mit der unten angeführten Ausbeute ablief. Ein weiteres Problem

wurde bei der Reaktivität des Natriumhydrids festgestellt. Ein Syntheseversuch erfolgte mit NaH,

welches schon länger gelagert wurde, wobei jedoch keine Umsetzung beobachtet werden konnte.

Die Reaktivität des Natriumhydrids wurde daraufhin dadurch getestet, dass eine minimale Menge an

NaH mit Wasser in Kontakt gebracht wurde, wobei es im Normalfall zu einer stark exothermen

Reaktion kommt. Bei diesem Versuch war dies nicht der Fall, weshalb das Misslingen eindeutig auf

das NaH zurückzuführen war. Das Abziehen des Lösungsmittels unter Vakuum bei 90°C

Badtemperatur beruht auf der Tatsache, dass bei der Benzylierungsreaktion Dibenzylether als

Nebenprodukt entsteht, welcher laut Literatur [111] einen Siedepunkt von 158-160°C aufweist.

Dieser konnte durch das entstandene Vakuum (90 mbar) auf 80°C erniedrigt, und so zur Gänze

abdestilliert werden. Nach der Aufarbeitung verblieben 23,50 g einer hellbraunen, öligen Flüssigkeit,

was einer Ausbeute von 76 % entspricht. Die Abweichung von der Literaturausbeute lässt sich durch

67

Verluste bei der Aufreinigung erklären, wobei der größte Teil vermutlich bei der Filtration über

Aktivkohle verloren ging

Die dünnschichtchromatographische Kontrolle zeigte keinerlei Verunreinigungen und lieferte bei

einem Laufmittelgemisch Benzol/Diethylether 6:1 einen Rf-Wert von 0,83.

Ausbeute: 23,50 g (22,12 mmol) (76% d. Th. bzw. 80% d. Lit.)

5.3.2 Synthese von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose

Die Darstellung der tetrabenzylierten Glucose beruht auf der säurekatalysierten hydrolytischen

Spaltung der Octa-O-benzylsaccharose.

Abbildung 40: Hydrolytische Spaltung von Octabenzylsaccharose in das Glucose- und das Fructosederivat

Die Entschützung der anomeren OH-Gruppe des Glucosederivat wurde nach dem Verfahren von

Kessler et al. [110] durchgeführt und verlief recht unproblematisch. Bei der Fällung des Produkts war

darauf zu achten, dass Hexan in großem Überschuss zuzugeben wurde. Bei der Zugabe von zu wenig

Hexan konnte nur die Fällung eines kleinen Teils der benzylierte Glucose beobachtet werden. Der

Vorgang der Fällung und des Auskristallisierens wurde deshalb mehrere Male durchgeführt, um eine

Maximierung der Ausbeute zu erhalten. Das Fructosederivat verblieb, aufgrund des weniger polaren

Charakters, in Lösung, wodurch das gewünschte Produkt ohne das störende Nebenprodukt

abgesaugt werden konnte. Dünnschichtchromatographisch konnte das Fructosederivat in der

Mutterlauge nachgewiesen werden. Die Charakterisierung des Produktes erfolgte mittels NMR, MS-

TOF, DC sowie durch Ermittlung des Schmelzpunktes. Am Dünnschichtchromatogramm zeigte das

Produkt bei einem Laufmittelgemisch Hexan/Ethylacetat 20:80 einen Rf-Wert von 0,85. Die Ausbeute

betrug 6,12g, was einer Ausbeute von 51% entspricht. Die, verglichen mit dem Literaturwert

geringere Ausbeute lässt sich unter anderem darauf zurückführen, dass nicht das gesamte Produkt

zur Auskristallisation gebracht werden konnte, und so zum Teil in der Mutterlauge verblieb. Weiters

traten Probleme beim Absaugen der Kristalle auf. Das heißt, dass bei jeder Filtration ein Teil der recht

feinen Kristalle durch das Filterpapier gezogen wurde, und so nicht das gesamte Produkt isoliert

68

werden konnte. Der Schmelzbereich betrug 153-155°C und deckt sich mit dem Literaturwert (153-

156°C). Das NMR-Spektrum sowie das TOF-Spektrum sind in den Abbildungen unten dargestellt. Die

TOF-MS-Messung erfolgte im positive-mode mittels APCI-Ionisierung. Die Masse des beschriebenen

Produktes ist im Massenspektrum mit 558 g/mol (HRMS (APCI): m/z berechnet für C34H40O6N

[M+NH4]+: 558,285014, gefunden: 558,284309, Δm = 1,34 ppm)) mit Ammonium-Addukt ersichtlich.

Des Weiteren sind nur geringfügige, nicht identifizierte Verunreinigungen im TOF-MS ersichtlich,

welche zum Teil auch vom Lösungsmittel stammen könnten. Im 1H-NMR-Spektrum sind nur

minimale, nicht identifizierte Signale erkennbar.

Rf-Wert (Laufmittelgemisch Hexan/Ethylacetat 20:80): 0,85

Ausbeute: 6,12 g (11,33 mmol) (51% d.Th. bzw. 73% d. Lit.)

Abbildung 41: TOF-Massenspektrum von Tetrabenzylglucose

NMR: Die 13C NMR-Analyse von TBG zeigte Shifts bei 68,5 ppm (C6-O-CH2), 73,3 ppm (CH2Ph), 81,8

ppm (C5-CH2 -O-), 91,4 ppm (C3-O-CH2), 96,9 ppm (C1-OH), 138,7-127,7 ppm (Phenylgruppen),

Die Analyse von TBG durch 1H NMR zeigt nur minimale Verunreinigungen, welche auf die

Produktformation zurückzuführen sind: 7,36-7,47 ppm (H Aromaten), 5,25 ppm (H-1 β-Anomer), 4,95

ppm (H5), 4,88ppm (CH2Ph), 4,78 ppm (CH2Ph), 4,60 ppm (CH2Ph), 4,53 ppm (CH2Ph), 3,99 (-CH-CH2-

O-), 3,72ppm (H2 β-Anomer), 3,64 ppm (H4 β-Anomer), 3,67 ppm (H3-β Anomer), 3,01 (CH-OH),

69

Abbildung 42: 13

C NMR (CDCl3 ) (75 MHz) Spektrum von 2,3,4,6-Tetra-O-Benzyl-D-glucopyranose

Abbildung 43: 1H NMR (CDCl3) (300 MHz) Spektrum von 2,3,4,6-Tetra-O-Benzyl-D-glucopyranose

70

5.3.3 Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranosyl)trichloracetimidat

Die Synthese des benzylierten Glucopyranosyl-Trichloracetimidates basiert auf der nucleophilen

Addition eines Alkoholanions an ein elektronenarmes Nitril.

Abbildung 44: Basenkatalysierte Darstellung von Tetrabenzyl-Glucopyranosyltrichloracetimidat aus Tetrabenzylglucose

Die Darstellung der Trichloracetimidates erfolgte nach einem Verfahren, welches von Schmidt et al.

(1983) [108] beschrieben wurde. Zur Synthese des nachfolgenden β-Glycosids musste zuerst das α-

Anomer des Trichloracetimidates hergestellt werden, um einen nucleophilen Angriff des Cholesterols

am anomeren Zentrum der geschützten Glucopyranose zu ermöglichen. Dies wurde durch die

Trichloracetimidatmethode bewerkstelligt. Die dünnschichtchromatographische Kontrolle zeigte kurz

nach dem Start der Umsetzung des Eduktes mit NaH und Trichloracetonitril bereits zwei neue Spots,

welche das α- und das β-Anomer darstellten, wobei der Spot für das β-Anomer bei weitem stärker

ausgeprägt vorlag. Durch Zugabe von weiterem NaH wurde die basenkatalysierte Anomerisierung

von β-Imidat zu α-Imidat erreicht. Nach längerem Stehenlassen konnte beobachtet werden, dass die

Intensität des β-Anomeren-Spots immer mehr abnahm und der des α-Anomers, durch die

Stabilisation des anomeren Effekts, zunahm. (vgl. Kapitel 5.2.2). Bei der Filtration über Kieselgel zur

Entfernung von überschüssigem NaH musste darauf geachtet werden, nicht zu viel Kieselgel zu

verwenden, um einen übermäßigen Produktverlust vorzubeugen. Deswegen wurde hier auch die

Methode gewählt, die Filtration mittels Saugflasche und unter Vakuum in einem modifizierten Dry-

Flash-Verfahren durchzuführen. Außerdem wurde gründlich mit Lösungsmittel nachgespült. Nach der

weiteren Aufreinigung wurde ein farbloses Öl erhalten welches laut Vorschrift nach wenigen Stunden

durchkristallisieren sollte. Die Kristallisation wurde jedoch erst nach dem Stehenlassen für mehrere

Tage beobachtet. Das Produkt zeigte sich daraufhin als farblose, kristalline Substanz. Die Ausbeute

betrug 1,29 g bzw. 85% der Theorie. Produktverluste sind durch Filtrationsprozesse zu erklären, bei

dem sich ein Teil des Produkts nicht mehr aus der Kieselgel-Matrix löste. Die

dünnschichtchromatographische Analyse zeigte bei einem Laufmittelgemisch von Petrolether/Ether

1:1 das α -Anomer mit einem Rf-Wert von 0,71, das β-Anomer mit einem minimalen Spot mit einem

Rf-Wert von 0,5. Weiters wurde ein Schmelzbereich von 75-76°C ermittelt, welcher nur gering vom

Literaturwert (77°C) abweicht.

71

Ausbeute: 1,29 g (1,88 mmol) (85% d. Th. bzw. 89% d. Lit.)

5.3.4 Synthese von Cholesteryl-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid)

Bei dieser Reaktion wird die Schutzgruppe am anomeren Zentrum des Glycopyranosids in einer

säurekatalysierten SN2 Reaktion durch Cholesterol substituiert.

Abbildung 45: Darstellung des benzylierten Cholesterylglycosids durch nucleophile Substitution

Bei dieser Umsetzung war auf absolute Wasserfreiheit zu achten, weshalb Dichlormethan zuvor

destilliert wurde, außerdem wurde Molekularsieb eingesetzt. Bereits 15 Minuten nach der TMSOTf

Zugabe war der Umsatz der Ausgangssubstanz zum gewünschten Produkt vollendet, welches nach

Beendigung der Reaktion und dem Abrotieren als braunes Öl vorlag. Die Auskristallisierung im

Kühlschrank brachte auch nach mehreren Tagen nicht den gewünschten Erfolg. Erst nach der Zugabe

eines Gemisches aus Methanol/Dioxan 10:1 und anschließendem Rühren konnte das Ausfallen eines

farblosen Feststoffes beobachtet werden. Nach den weiteren Aufreinigungsschritten verblieben 0,89

g eines farblosen Feststoffes, was 52% der Theorie entspricht. Das Produkt wurde mittels

Dünnschichtchromatographie als auch TOF-MS analysiert. Bei einem Laufmittelgemisch von

Hexan/Ethylacetat 70:30 ergab sich Rf-Wert von 0,79. Weiters war ein minimaler Spot bei 0,70 zu

erkennen, welcher mittels TOF-MS nicht detektiert werden konnte und vermutlich das α-Anomer

darstellte. Das TOF-Massenspektrum ist in Abbildung 46 ersichtlich. Da bei der

dünnschichtchromatographischen Kontrolle kein Cholesterol detektiert werden konnte, ist der

markierte Cholesterol-Peak, der im Spektrum dargestellt ist, auf die Fragmentierung bei der

Ionisation zurückzuführen. Die TOF-MS-Messung erfolgte im positive-Mode mittels APCI-Ionisierung.

Die Masse des beschriebenen Produktes ist im Massenspektrum mit 926 g/mol (HRMS (APCI): m/z

berechnet für C61H84O6N [M+NH4]+: 926,629316, gefunden: 926,629023, Δm = -0,32 ppm)) mit

Ammonium-Addukt ersichtlich. Da die Reaktion mit dieser Methodik für die Herstellung des

tetrabenzylierten β-Cholesterylglycosids in der Literatur noch nicht beschrieben wurde, liegen auch

keine Referenzwerte hinsichtlich der Ausbeute vor.

72

Die Ausbeute betrug 0,89 g (0,98 mmol), (52% d. Th.)

Abbildung 46: TOF-Massenspektrum des tetrabenzylierten Cholesterylglycosids

5.3.5 Synthese von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid

Die Darstellung des Cholesterylglucopyranosids beruht auf der hydrogenolytischen Abspaltung der

Benzylgruppen, wobei Cyclohexen als Wasserstoffdonor, und Palladiumhydroxid auf Aktivkohle als

Katalysator dienen [112].

Abbildung 47: Benzylgruppenabspaltung durch katalytische Hydrierung

Bei der Abspaltung der Benzylgruppen ergab sich das Problem, dass bei einer Hydrierung mittels

Pd/C und Wasserstoff nicht nur die Benzylgruppen, sondern auch die Doppelbindung am C5-Atom

hydriert worden wäre. Somit wäre als Produkt Cholestanol-β-D-glucopyranosid entstanden. Deshalb

wurde die relativ milde Hydrierungsmethode mit Palladiumhydroxid als Katalysator und Cyclohexen

als Wasserstoffdonor angewendet. Die Abspaltung wurde von Duivenvoorden (2011) [33] lediglich

für das α-Anomer des Cholesterylglycosids beschrieben, für das β-Anomer wurde in der Literatur

keine Beschreibung gefunden. Nachdem die Vorschrift zur Benzylgruppenabspaltung von jener der

für das α-Anomer des benzylierten Cholesterylglycosids adaptiert wurde, kam es zu der Problematik,

dass sich das Edukt, im Gegensatz zum α-Anomer, welches ein farbloses Öl darstellt, im

Lösungsmittel nicht beziehungsweise nur schlecht löste. Die dünnschichtchromatographische

Verfolgung der Reaktion zeigte nach fünfstündigem Kochen unter Rückfluss bei etwa 80°C

73

Badtemperatur keine Veränderungen, woraufhin das Volumen des Lösungsmittels verdoppelt, die

Reaktionstemperatur auf 150°C gesteigert sowie die Menge an Katalysator erhöht wurde. Die

Verfolgung der Reaktion mittels TOF-MS ließ sich die Reaktion besser verfolgen als durch

Dünnschichtchromatographie. Am Dünnschichtchromatogramm waren nach vier Stunden insgesamt

acht Spots erkennbar, wobei immer zwei davon, ein stärkerer und ein schwächerer, ein Duplett

bildeten (vgl. Abbildung 48).Bei den Dupletts handelte es sich jeweils um das Cholesterylglycosid mit

einer verschiedenen Anzahl an Benzylgruppen, wobei die beiden oberen Spots mit Rf-Werten von

0,72 bzw. 0,70 das Edukt darstellten, und die darunterliegenden Spots jeweils nach Abspaltung einer

gewissen Anzahl an Benzylgruppen. Durch die Analyse mittels TOF-MS, welche für die vorhandenen

Spots jeweils nur eine Masse generierte, wurden die schwächeren, unteren Spots als die jeweiligen

α-Anomere der teilbenzylierten Cholesterylglucopyranosen identifiziert. Die erste Messung mittels

TOF-MS erfolgte 12 Stunden nach Reaktionsbeginn. Im Massenspektrum war die teilweise

Abspaltung der Benzylgruppen erkennbar. Nach weiteren 48 Stunden war das

vollständig benzylierte Edukt beinahe verschwunden, woraufhin noch eine

Spatelspitze des Katalysators zugegeben wurde. Nach vier Tagen war die Reaktion

beendet. Die anschließende dünnschichtchromatographische Kontrolle als auch

das TOF-Massenspektrum zeigten keinerlei Nebenprodukte. Am DC zeigte das

Produkt bei einem Laufmittelgemisch Petrolether/Aceton 1:1 einen Rf-Wert von

0,14, die Verfolgung mittels TOF-MS ist in Abbildung 50 ersichtlich. Die Analyse

mittels MS-TOF wurde im negative-Mode mittels APCI-Ionisierung durchgeführt.

Die Masse 593 g/mol (HRMS (APCI): m/z berechnet für C34H57O8 [M+HCOO]-:

593,405892, gefunden: 593,405705, Δm = 0,32 ppm) kommt durch das

Vorhandensein des Formiat-Adduktes zustande. Weiters ist, nach der Abspaltung

der Benzylgruppen, fast ausschließlich das Signal des Cholesterylglycosids sichtbar. Die minimalen

Signale sind möglicherweise auf Verunreinigungen des Lösungsmittels zurückzuführen. Weiters

wurde eine Analyse mittels Gaschromatographie durchgeführt, das Chromatogramm ist in Abbildung

49 ersichtlich. Der Hauptpeak, bei dem es sich um das Produkt handelt, befindet sich bei etwa 27

Minuten. Wie im Chromatogramm ersichtlich, ist dem Hauptpeak noch ein zweiter Peak vorgelagert,

bei dem es sich, aufgrund des äquivalenten Massenspektrums, vermutlich um das α-Anomer handelt.

Das GC-Massenspektrum zeigt, wie auch jenes der Darstellung durch Koenigs-Knorr Methode Signale

bei m/z 73, 147, 204, 217 sowie 369. Die Erklärungen der Signale sind in Kapitel 5.1.4 nachzulesen,

das Massenspektrum befindet sich im Anhang. Die Entstehung des α-Anomers ist auf die nicht

vollständige Anomerisierung von β- zu α-Anomer im Zuge der Darstellung des Trichloracetimidates

zurückzuführen, da eine 100%-ige stereochemische Kontrolle bei dessen Bildung nicht gegeben ist.

Die Reinheit wurde durch Integration des Peakflächen berechnet und ergab, dass zu ≥ 99,5

Abbildung 48: DC-Benzylgrupppen-

abspaltung

74

Cholesterylglucopyranosid vorlag, wobei etwa zu 70% das β-Anomer und zu 30% das α-Anomer

entstand. Die Ausbeute betrug 0,18 g (0,33 mmol) (99% d. Th.).

Abbildung 49: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mit Saccharose als Edukt

Abbildung 50: Verfolgung der Debenzylierung mittels TOF-MS, nach 12, 40 und 52 Stunden

75

5.4 Vergleich der verschiedenen SG-Synthesemethoden

Experimentell wurde mit der Trichloracetimidat-Methode, bei welcher Glucose-Pentaacetat als Edukt

diente, mit 30,1% der Theorie die höchste Ausbeute an Cholesterylglycosid erzielt. Des Weiteren ist

hier anzumerken, dass die Literaturausbeute durch diverse Modifikationen um 43% gesteigert

werden konnte. Bei der Synthese mit Saccharose als Edukt konnte lediglich eine Ausbeute von 17%

der Theorie erzielt werden, womit die geringste Ausbeute an SGen erzielt wurde. Jedoch ist auch

anzumerken, dass bei den in der Literatur bereits beschriebenen Synthesen die Literaturausbeuten

aufgrund der beschriebenen Verluste nicht erreicht werden konnten, wodurch eine

Ausbeutensteigerung möglich wäre. Hinsichtlich der Reinheit der SGe ist die Methode mit

Saccharose als Edukt jene, die den beiden anderen zu bevorzugen ist, da der SG-Anteil beinahe 100%

beträgt. Zielt die Synthesemethode auf eine größtmögliche Anomerenreinheit ab, so sind

Synthesemethoden mit Trichloracetimidat als Zwischenprodukt nicht die erste Wahl. Für diese

Methoden wird in der Literatur beispielsweise eine Stereoselektivität von 4:1 zugunsten des α-

Anomers beschrieben [5]. Bei der Koenigs-Knorr Methode hingegen entsteht lediglich das β-Anomer.

Jedoch ist anzumerken, dass für die Herstellung von Standards für die Messung mittels TOF-

Massenspektrometer oder mittels Gaschromatographen die Anomerenreinheit nicht von Nöten ist,

wodurch dies kein Ausschlusskriterium für die Trichloracetimidat-Methode als auch für die Methode

mit Saccharose als Edukt, darstellt.

Das synthetisierte β-Anomer des Produktes ist des Weiteren auch kommerziell mit einer Reinheit von

≥ 97% erhältlich, wobei sich die Kosten dafür auf 167,00 Euro/10 mg belaufen [113].

Abbildung 51: Zusammenfassung der Ergebnisse der verschiedenen Synthesemethoden

0 20 40 60 80 100

Anteil β-Anomer

Anteil α-Anomer

Anteil SG

Ausbeute Literatur

Ausbeute

[%]

Saccharose als Edukt

Trichloracetimidat-Methode

Koenigs-Knorr-Methode

76

Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse

Koenigs-Knorr-Methode

Trichloracetimidat-Methode

Saccharose als Edukt

Ausbeute [%] 23,6 30,1 17,0 Ausbeute Literatur [%] 29,8 20,6 32,9 Anteil SG [%] 99,5 98,0 >99,5 Anteil α-Anomer [%] n.d. 13,0 30,0 Anteil β-Anomer [%] 99,5 85,0 70,0

n.d: nicht detektierbar

Die Schritte der Umsetzung der am anomeren C-Atom geschützten Glucosederivate mit Cholesterol

stellen bei allen drei Methoden, wie auch in den internen Vorschriften beschrieben [106] [114], die

verlustreichsten dar. Hierbei ist jedoch anzumerken, dass die Methode mit Saccharose als Edukt

verglichen mit den beiden anderen Methoden, in denen in diesem Schritt 38% beziehungsweise 36%

Ausbeute erreicht werden konnten, mit 52% mit Abstand die höchste Ausbeute aufweist. Da in den

beiden anderen Methoden Acetylschutzgruppen verwendet wurden, ist dies möglicherweise auf eine

Beeinflussung durch die hier verwendeten Benzylschutzgruppen zurückzuführen.

Hinsichtlich der aktiven Zeit, welche zur Synthese des jeweiligen Produktes im Labor verbracht

werden muss, ist die Koenigs-Knorr-Methode aufgrund der zeitintensiven Säulung jedoch die

arbeitsaufwändigste. Durch die schlechte Löslichkeit von Cholesterylglycosid in organischen

Lösungsmitteln ist die Säulung außerdem schwer durchzuführen, wodurch sich diese Methode für die

Herstellung größerer Mengen an SGen nicht eignet. Weiters ist bei säulenchromatographischen

Trennungen anzumerken, dass eine relativ große Menge an Lösungsmittel eingesetzt werden muss.

Ein nicht zu vernachlässigender Faktor ist außerdem, dass bei der Synthese mittels der Koenigs-Knorr

Methode die Verwendung von Silbercarbonat unabdinglich ist. Da dieses in äquimolaren Mengen

eingesetzt werden muss, stellt Silbercarbonat, verglichen mit den Chemikalien der anderen

Methoden, die teuerste Chemikalie dar. Zu den verwendeten Chemikalien ist außerdem anzumerken,

dass bei allen drei Methoden die Verwendung von halogenierten Reagenzien stattfindet. Die

Toxizität betreffend ist Benzylbromid das unbedenklichste der drei halogenierten Verbindungen.

Bromwasserstoff als auch Trichloracetonitril sind beide giftig beim Einatmen, jedoch führen die

beiden bromierten Verbindungen zu einer massiven Reizung der Augen als auch der Atemwege,

wodurch diese äußerst unangenehm in der Handhabung sind. Somit stellt die

Trichloracetimidatmethode, bei der keine bromierte Verbindung eingesetzt wird, die angenehmste

Möglichkeit zur Synthese dar.

77

5.5 Versuch der enzymatischen Herstellung von Cholesteryl(6´-O-

palmitoyl)-β-D-glucopyranosid

Diese Reaktion basiert auf der enzymatischen Veresterung einer primären Alkoholgruppe mit der

Lipase Novozyme 435, wobei das Enzym hierbei regioselektiv am 6´-O-Atom des Glucoserestes

angreift.

Abbildung 52: Darstellung von durch Veresterung von Cholesterylglycosid mittels Novozyme 435

Zunächst wird bei dieser Reaktion, nach Michaelis-Menten, zwischen Fettsäure und Enzym ein

Enzym-Substrat-Komplex gebildet, wobei Wasser frei wird, welches durch die Zugabe von

Molekularsieb aus der Reaktion entfernt wird, um Hydrolysereaktionen zu vermeiden. Durch den

nucleophilen Angriff des Alkohols, in diesem Fall also der 6-OH-Gruppe des Cholesterylglycosids, auf

den Enzym-Substratkomplex, sollte es zur Bildung des acylierten SGs sowie der Bildung des Enzyms in

seiner nativen Form kommen.

Abbildung 53: Enzymkinetik nach Michaelis-Menten. E=Enzym, S= Substrat, P=Produkt.

78

Abbildung 54: Reaktionsmechanismus der Veresterung von Sterylglycosiden mit Palmitinsäure. Enz = Enzym Novozyme 435

Den Vorteil, den diese Methode mit sich bringt, ist, dass es durch die Regioselektivität, zu keiner

Veresterung der anderen freien Hydroxylgruppen kommt, wodurch keine Einführung von

Schutzgruppen notwendig ist. Die Problematik hingegen ist, dass sich das das Substrat nicht,

beziehungsweise nur begrenzt (vgl. Löslichkeit in Biodiesel (50 ppm bei 50°C)) in unpolaren,

organischen Lösungsmitteln, die für das Enzym empfohlen werden, löst [60]. Lipasen sind zwar

gleichermaßen in wässrigen Medien aktiv, jedoch kommt es in diesem Fall bevorzugt zu

Hydrolysereaktionen, was in diesem Fall einer Spaltung eines acylierten Sterylglycosids in das freie

Sterylglycosid sowie der Fettsäure entsprechen würde. Das Enzym benötigt zwar eine kleine Menge

Wasser, welches jedoch durch die Immobilisierung auf Acrylharz mit einem Wassergehalt von 1-2%

ohnehin gegeben ist. Jedoch ist bei der Reaktion an sich darauf zu achten, dass das Enzym nicht zu

lange, in direktem Kontakt mit dem Molekularsieb, ohne dass das Reaktionssystem in Bewegung ist,

kommt, da ansonsten das benötigte Wasser aus dem Enzym entzogen werden kann, was in einer

Minderung des Umsatzes beziehungsweise in einer Zerstörung des Enzyms resultieren würde [62]. Im

Gegensatz zum Substrat löst sich das acylierte SG im organischen Lösungsmittel. Durch den Umsatz

kann zwar somit erreicht werden, dass sich immer wieder ein Teil des Substrates im Lösungsmittel

löst, jedoch in so geringem Maße, dass nach wie vor der Großteil als ungelöster Feststoff vorliegt. So

gelangt jeweils nur ein kleiner Teil des Cholesterylglycosids in das aktive Zentrum des Enzyms

wodurch sich auch der geringe Umsatz erklären lässt.

5.5.1 Versuch mit reinem Hexan als Lösungsmittel

In der Literatur wurde dieser Versuch von Paczkowski et al. (2007) [63] im Maßstab für 1 µmol

beschrieben, jedoch handelt es sich dabei um das einzige Literaturzitat, welches die enzymatische

Veresterung durch eine freie Fettsäure beschreibt. Eine Umsetzung mit Fettsäureestern, zum Beispiel

mit Palmitinsäurevinylester [115] ist hingegen des Öfteren zu finden. Das Experiment wurde in

Anlehnung an die interne Vorschrift durchgeführt [114].

Bei der Umsetzung in Hexan ist es zu einem Versagen des Laborschüttlers während der Nacht

gekommen. Es wurde daraufhin die Schütteldauer noch verlängert, jedoch kann es möglicherweise

dennoch zu einer Anlagerung des Enzyms an das Edukt beziehungsweise zu einer Dehydratisierung

79

des Enzyms durch das Molekularsieb gekommen sein, wodurch dieses inaktiviert wird

beziehungsweise schlechtere Ausbeuten liefert.

Die Kristalle, die sich noch im Lösungsmittel befanden, wurden mit einer Pinzette aus dem

Lösungsmittel isoliert und dünnschichtchromatographisch als auch gaschromatographisch im SIM-

Mode untersucht. Es handelte sich dabei beinahe ausschließlich um das unveränderte Edukt. Das

Gaschromatogramm als auch das GC-Massenspektrum davon befinden sich im Anhang. Der

verbleibende Reaktionslösung wurde in Chloroform/Methanol 2:1 gelöst und gaschromatographisch

untersucht. Das Chromatogramm ist in der Abbildung unten ersichtlich. Beim Chromatogramm ist ein

Hauptpeak bei etwa 27 Minuten ersichtlich, wobei es sich um das unveränderte Edukt handelt. Bei

etwa 32 Minuten ist ein kleinerer Peak ersichtlich. Es ist davon auszugehen, dass es sich dabei um

Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid handelt. Das Verhältnis zwischen Edukt und dem

entstandenen Produkt ist jedoch dahingehend als verfälscht zu betrachten, dass ein Teil des Eduktes,

durch die Entfernung der nicht umgesetzten Kristalle, bei dieser Analyse nicht berücksichtigt wurde.

Somit würde dies zu einer Vergrößerung des Peaks bei Minute 27 führen. Aufgrund der geringen

Ausbeute und mangels des Vorhandenseins einer präparativen HPLC-Säule wurden keine weiteren

Aufreinigungsschritte getätigt.

Im Vergleich mit einem Referenz-Gaschromatogramm derselben acylierten Substanz, welche mittels

Steglich-Veresterung hergestellt wurde und bei dem äquivalente GC-MS Parameter verwendet

wurden, zeigt das Produkt im erstellten Chromatogramm zwar eine um fünf Minuten kürzere

Retentionszeit, jedoch wurde bei der Messung im SIM-Mode ein vergleichbares Massenspektrum

erhalten. Der Peak bei Minute 11 stellt silylierte Palmitinsäure dar. Das Massenspektrum mit dem

Referenzmassenspektrum als auch das Gaschromatogramm sind in den Abbildungen unten

ersichtlich. Das Referenz-Gaschromatogramm, mit dem bei Minute 37 ersichtlichen Peak, befindet

sich im Anhang. Im GC-Massenspektrum sind wiederum die m/z-Verhältnisse 73, 147, 204, 217 sowie

369 erkennbar. Die Erklärung hierfür ist in Kapitel 5.1.4 nachzulesen.

Abbildung 55: GC-Massenspektrum von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid (links) sowie Referenzspektrum (rechts) [114]

80

Abbildung 56: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel

Des Weiteren wurde eine Analyse mittels TOF-MS durchgeführt, welche eine erfolgreiche

Veresterung des SGs mit der Palmitinsäure bestätigt. Das TOF-Massenspektrum befindet sich in der

Abbildung 57 unten. Bei der Masse 593 g/mol (HRMS (APCI): m/z berechnet für C34H57O8 [M+HCOO]-:

593,405892, gefunden: 593,405430, Δm = 0,78 ppm) handelt es sich um das unveränderte Edukt. Die

Masse 831 g/mol (C50H87O9 [M+HCOO]-: 831,635558, gefunden: 831,635114, Δm = 0,53 ppm) stellt

das acylierte Sterylglycosid dar. Die beschriebenen Massen kommen jeweils durch das

Vorhandensein des Formiat-Adduktes zustande. Die Massen 659 g/mol beziehungsweise 897 g/mol,

die im Spektrum ersichtlich sind, weichen jeweils um 66 g/mol vom Formiat-Addukt des SGs

beziehungsweise des ASGs ab. Über die exakte Massenbestimmung des TOF-MS konnte bei diesen

beiden Shifts ein Addukt mit der Summenformel C2H4O3Cl (Formiat-Addukt nicht zwingend)

identifiziert werden, wobei eine genauere Aufklärung nicht möglich war. Die Analyse mittels TOF-MS

wurde im negative-Mode mittels APCI-Ionisierung durchgeführt.

81

Abbildung 57: TOF-Massenspektrum aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel

Nachdem die enzymatische Veresterung in der internen Vorschrift nicht erfolgreich durchgeführt

werden konnte, ist die Entstehung des gewünschten Produktes möglicherweise auf die Reduzierung

der Menge an Palmitinsäure, welches in dieser im 70-fachen Überschuss verwendet wurde,

zurückzuführen. Weiters wurde auf absolute Wasserfreiheit geachtet. Weitere Faktoren, welche

möglicherweise eine positive Auswirkung auf die Reaktion hatten, waren die Verwendung von n-

Hexan an der Stelle von n-Oktan, sowie die Erhöhung der Reaktionstemperatur von 40°C auf 45°C.

5.5.2 Versuch mit Hexan nach vorherigem Lösen des Substrates in Chloroform

Um das Substrat in Lösung zu bringen, um es in weiterer Folge für das aktive Zentrum des Enzyms

zugänglich zu machen, wurde dieses im Vorhinein in Chloroform gelöst [116]. Weiters wurde die

Menge an Enzym im Vergleich zur internen Vorschrift reduziert, da das Enzym eine extrem hohe

Aktivität von >5000 U/g aufweist. Nichtsdestoweniger wurde das Enzym dennoch in großem

Überschuss eingesetzt. Nach der Aufreinigung wurde eine gaschromatographische Analyse

durchgeführt, welche zeigte, dass nur mehr eine kleine Menge des Cholesterylglycosids vorlag. Dies

lässt darauf schließen, dass durch die Zugabe von Chloroform und der damit verbundenen Löslichkeit

des Eduktes, ein höherer Umsatz im Vergleich zu reinem Hexan erreicht werden konnte. Weiters

entstand eine Reihe von Nebenprodukten, die weder durch die Analyse am GC-MS noch durch

Analyse am TOF-MS identifiziert werden konnten. Der Peak bei Minute 10 stellt, Methylpalmitat dar,

welches möglicherweise bei der Filtration und dem anschließenden Nachwaschen mit

Chloroform/Methanol 2:1 sowie dem darauffolgenden Abrotieren entstanden ist. Das gewünschte

Produkt wurde jedoch nicht gebildet. Auffällig hingegen ist beim Hauptpeak des entstandenen

Produktgemisches ein ausgeprägtes Signal mit m/z 399, welches jedoch nicht identifiziert werden

konnte.

82

Abbildung 58: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in Hexan + 1 mL Chloroform als Lösungsmittel

5.5.3 Versuch mit THF/Pyridin 4:1 als Lösungsmittel

Im Gegensatz zum vorherigen Versuch, in dem nur das Substrat in Chloroform gelöst wurde, und die

Reaktion in einem zur Gänze unpolaren Lösungsmittel durchgeführt wurde, fungierte hier das

Lösungsmittel gleichzeitig als Reaktionsmedium. Die Menge an Enzym wurde, wiederum aufgrund

der hohen Aktivität, reduziert, jedoch betrug die Reaktionszeit 48 Stunden. Nach dem Abfiltrieren

des Molekularsiebs und des Enzyms wurde die resultierende Lösung ohne weitere

Aufreinigungsschritte gaschromatographisch im Scan-Mode zur Erstellung von Massenspektren der

unbekannten Substanzen analysiert. Das Gaschromatogramm zeigt, neben den durch die fehlende

Aufreinigung enthaltenen Fettsäureester-Peaks sowie Peaks durch eine Verunreinigung des

Lösungsmittels am Anfang des Chromatogramms, in etwa dieselben Peaks wie der Versuch mit

Hexan und Chloroform. Auch hier ist wieder anzumerken, dass durch das Lösen des Substrates

dessen Menge deutlich abgenommen hat. Das Cholesterylglycosid ist jedoch nicht ganz so stark

verbraucht worden wie im oben angeführten Versuch mit Zusatz an Chloroform, jedoch ist zu

verdeutlichen, dass die Lösung des Substrates zu einem vollständigeren Umsatz führt. Die Vielzahl

von enthaltenen Fettsäureestern, so kommt auch hier unter anderem wieder

Palmitinsäuremethylester vor, lässt sich vermutlich wiederum auf das Abfiltrieren mit

anschließendem Nachwaschen mit Chloroform/Methanol 2:1 und dem anschließenden Abrotieren

erklären. Weiters ist jedoch auch beispielsweise Palmitinsäure-2-hydroxyethylester enthalten,

welcher durch den Waschschritt nicht entstehen kann und so möglicherweise durch einen

unbekannten Zwischenschritt durch das Enzym verestert wurde. Das gewünschte Produkt ist jedoch

auch hier nicht entstanden. Im Massenspektrum ist auch hier wieder der nicht identifizierte

Hauptpeak mit m/z 399 erkennbar.

83

Abbildung 59: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in THF/Pyridin 4:1 als Lösungsmittel

In der Literatur finden sich des Weiteren Methoden bei denen anstelle der freien Fettsäure diverse

Fettsäureester zur Veresterung von SGen verwendet werden. Unter anderem wird von Davis et al.

(2012) [117], die Verwendung von Fettsäure-Vinylester beschrieben. Dies hat den Vorteil, dass sich

bei der Umesterungreaktion mit dem Enzym Acetaldehyd bildet, welches in weiterer Folge mit dem

in der Reaktion frei werdenden Wasser zu Aldehydhydrat weiterreagiert, wodurch dieses aus der

Reaktion entfernt werden kann. Somit benötigen diese Reaktionen kein Molekularsieb das abfiltriert

werden muss, weshalb hier in der Regel höhere Ausbeuten erzielt werden. Bornscheuer et al. (2000)

[118] beschrieben des Weiteren eine Methode, bei der Fettsäuremethylester eingesetzt wird. Im

Gegensatz zur angewendeten Methode, bei der es sich um eine Veresterung handelt, handelt es sich

hierbei jeweils um Umesterungsreaktionen, für die sich für das verwendete Enzym, neben

Hydrolyseraktionen [119], in der Literatur die meisten Einträge finden [120] [121] [122].

Zusammenfassend lässt sich bei diesem Versuch sagen, dass, im Gegensatz wie in der internen

Vorschrift [114] beschrieben, durch diverse Modifikationen, eine enzymatische Veresterung des

Sterylglycosids mit Palmitinsäure möglich ist, wobei die Verwendung eines unpolaren Lösungsmittels

notwendig ist. Bei vorheriger Lösung des Produktes kommt es zwar in Summe zu einer höheren

Umsetzung des Eduktes, jedoch ist hierbei eine Steuerung der Reaktion nicht möglich, so dass

zahlreiche Nebenprodukte entstehen. Hierbei ist außerdem anzumerken, dass, sobald sich das

Substrat in Lösung befindet, der Einfluss unterschiedlicher Lösungsmittel offenbar kaum mehr

gegeben ist, da in der Reaktion mit vorherigem Lösen in Chloroform als auch bei der Reaktion in

THF/Pyridin 4:1 in etwa dieselben Produkte entstehen. In Hexan entstand nur ein nennenswertes

Produkt wobei es sich um das ASG handelte, jedoch ist der Umsatz relativ gering.

84

5.6 Qualitative und quantitative Analyse von Biodiesel auf den Gehalt

von Sterylglycosiden

Raps-Biodiesel (ADM, Hamburg) wurde zur Entfernung von Methylestern vakuumdestilliert und

anschließend mittels GC-MS im Scan- als auch im SIM-Mode vermessen. Zudem wurde auch

versucht, Raps- als auch Sojaöl, auf die gleiche Weise zu untersuchen. Bei den Rohmaterialen war

dieser Versuch nicht erfolgreich, da die SGe dieselbe Retentionszeit wie die enthaltenen Triglyceride,

welche im Chromatogramm einen großen Peak von 25-38 Minuten darstellen, aufwiesen, und so

keine zuordenbaren Signale erkennbar waren. Somit wurde nach der Messung von Rapsöl für Sojaöl

kein weiterer Versuch durchgeführt. Das zugehörige Chromatogramm befindet sich im Anhang. Bei

der Biodieselprobe hingegen waren im Gaschromatogramm, neben Monoglyceriden, freien Sterolen

sowie sonstigen Inhaltsstoffen auch zwei kleinere Peaks bei Retentionszeiten von 26,7 bzw. 27,1

Minuten zu erkennen. Das Gaschromatogramm für Rapsbiodiesel ist unten dargestellt.

Abbildung 60: SIM-Gaschromatogramm von Rapsbiodiesel. Im markierten Bereich sind Sterylglycoside ersichtlich.

Bei dem Peak etwa 26 Minuten handelt es sich um den internen Cholesterylglycosid-Standard. Das

rechte Gaschromatogramm stellt eine Vergrößerung von Minute 25 bis Minute 28 dar, wobei hier

Sterylglycoside erkennbar sind. Bei dem SG 1-Peak bei 26,7 Minuten handelt es sich um Campesterol,

welches im GC-Massenspektrum mit einem m/z-Verhältnis von 383 erkennbar ist. Bei dem

ersichtlichen SG 2-Peak bei 27,1 Minuten handelt es sich um Sitosterol. Dieses ist im

Massenspektrum mit einem m/z-Verhältnis von 397 erkennbar. Stigmasterol konnte nicht detektiert

werden, da dieses eine ähnliche Retentionszeit wie der zugegebene Cholesterol-Standard aufweist

(vgl. Pieber et al (2010) [99]) und somit verdeckt wird. Deshalb wurde in weiterer Folge auch eine

Messung ohne den IS durchgeführt, in Abbildung 60 als blauer Graph ersichtlich, wobei jedoch auch

kein Stigmasterol detektiert werden konnte, womit dieses unter der Nachweisgrenze der Methode

liegt. Die GC-Massenspektren für die Sterylglycoside in Rapsbiodiesel sind unten abgebildet.

85

Abbildung 61: Fragmente der in den Biodieselproben enthaltenen Sterylglycoside: Campesterol. Stigmasterol und Sitosterol.

Abbildung 62: Massenspektren der detektierten Sterylglycoside. Links mit m/z 397,4 Sitosteryl-, rechts mit m/z 383,3 Campesterylglycosid

Cholesterylglycosid war, aufgrund des sehr geringen Vorkommens in Pflanzen, nicht zu detektieren,

wodurch sich dieses als interner Standard verwendet werden kann. Die Ermittlung der enthaltenen

Mengen an SGen wurde anhand der Integration der Peakflächen und anschließender Berechnung

durchgeführt.

Tabelle 9: Ergebnisse der gaschromatographischen Analyse

Retentions- zeit

Peak- fläche

Start- zeit

End- zeit

IS 26,309 127493024 26,09 26,673

SG1 26,766 1232055 26,727 26,853

SG2 27,126 4047397 27,082 27,294

86

Formel 1: Formel zur Berechnung des Sterylglycosid-Gehalts

Tabelle 10: SG-Gehalt in Raps-Biodiesel

Campesterylglycosid

[ppb]

Sitosterylglycosid-

Glycosid [ppb]

Gesamtgehalt

[ppb]

Rapsöl-Biodiesel 0,062 0,202 0,268

Laut Literatur ist im Rapsöl mit 800 mg/kg in der Regel ein höherer Gehalt an freien SGen enthalten,

der Gehalt an ASGen liegt in Rapsöl bei etwa 200 mg/kg [123]. Für den Gesamtgehalt an

Sterylglycosiden in Rapsbiodiesel .finden sich in der Literatur Werte um 10 mg/kg, der gemessene

Wert bei Lacoste et al. [2] beträgt beispielsweise 12 mg/kg. Die große Abweichung von diesen

Werten kann jedoch nicht erklärt werden.

6 Zusammenfassung und Ausblick

Wie in der Einleitung beschrieben, war das Ziel der Arbeit, die Synthese von Sterylglycosiden unter

dem Aspekt der Steigerung der Ausbeute durchzuführen. Zu diesem Zweck wurden zwei bekannte

Methoden, die Synthese mittels Koenigs-Knorr-Mechanismus sowie die Trichloracetimidat-Methode

modifiziert, und eine neue Methode, nämlich die Herstellung aus Saccharose, entwickelt.

Bei der Synthese nach Koenigs-Knorr konnte keine Steigerung der Ausbeute erzielt werden, wobei es

bei dieser Methode vielmehr das Ziel war, eine Vergleichssubstanz für die beiden anderen Methoden

herzustellen. Von der Anomerenreinheit, die jedoch für die Erstellung interner Standards nicht das

primäre Auswahlkriterium darstellt, liefert diese Methode das beste Ergebnis. Die Reinheit des

Produktes belief sich auf 99,5%.

Bei der Trichloracetimidatmethode konnte, aufgrund einiger Modifizierungen der internen

Synthesevorschrift [106] sowie der Umgehung von säulenchromatographischen Auftrennungen, eine

Steigerung auf 146% des Literaturwertes verzeichnet werden. Weiters wurde mit dieser Methode, im

Vergleich zu den beiden anderen, die höchste Ausbeute erzielt. Hinsichtlich der Anomerenreinheit

CIS Konzentration des IS in mg/kg

ASG Peakfläche der SGe

AIS Peakfläche IS

SG Konzentration der SGe in mg/kg

mFAME Gewicht von Biodiesel in mg

mIS Gewicht des IS in mg

87

entstanden bei der Synthese 13% des α-Anomers und 85% des β-Anomers. Die Gesamtreinheit des

erhaltenen Produktes betrug 98%.

Die Synthese von Sterylglycosiden mit Saccharose als Ausgangssubstanz wurde in der Literatur noch

nicht beschrieben, somit handelt es sich hierbei um eine neue Methode. Im Vergleich mit den beiden

anderen Methoden wurde hier die niedrigste Ausbeute erhalten, was jedoch teilweise auf

vermeidbare Produktverluste zurückzuführen ist. Theoretische Berechnungen der Ausbeute durch

den Vergleich mit diversen, in der Literatur beschriebenen, Zwischenschritten, zeigen jedoch, dass

mit dieser Methode die höchste Ausbeute erzielt werden könnte. Weiters wurde bei dem Schritt der

Substitution der Schutzgruppe durch Cholesterol, der beiden anderen Methoden den

verlustreichsten Zwischenschritt darstellte, hier mit einer vergleichsweise hohen Ausbeute vollzogen.

Bei der Synthese entstand zu 30% das α-Anomer und zu 70% das β-Anomer. Bei der Gesamtreinheit

wurde mit dieser Methode mit > 99,5% der beste Wert erzielt.

Somit ist zu sagen, dass dieses Ziel der Arbeit erfolgreich abgeschlossen werden konnte, da durch die

Modifikation eine Ausbeutensteigerung vorliegt. Weiters wurde durch die Methode mit Saccharose

als Edukt eine vielversprechende Grundlage für eine weitere Ausbeutensteigerung gelegt.

Die enzymatische Veresterung von Sterylglycosiden konnte, durch diverse Modifikationen der

internen Vorschrift [114], im Gegensatz zu dieser, zumindest dahingehend erfolgreich durchgeführt

werden, dass das gewünschte Produkt analytisch nachgewiesen werden konnte. Weiters wurde

gezeigt, dass durch vorherige Lösung des SGs andere Produkte entstehen, als dies beim ungelösten

Edukt der Fall ist, wobei das eingesetzte Lösungsmittel, nach der erfolgten Lösung, keinen Einfluss

auf die Reaktion hat. Außerdem ist aus den Versuchen ersichtlich, dass eine Umsetzung auch bei

einer drastischen Reduzierung der eingesetzten Enzymmenge als auch der Menge an Palmitinsäure

stattfindet, was zu einer Kostenreduktion für eventuelle weitere Versuche führen könnte. Eine

Reduktion von SGen konnte in allen drei Versuchen beobachtet werden, auch wenn in zwei davon

nicht das gewünschte Produkt entstand, wodurch solche Methoden möglicherweise auch zur

Reduktion von SGen in Biodiesel verwendet werden könnten.

Für zukünftige Experimente wäre es möglicherweise interessant, jeweils die Schritte der Umsetzung

der Glucopyranosyl-Trichloracetimidate beziehungsweise der Acetobromoglucose mit Cholesterol zu

modifizieren, da hierbei bei allen drei Methoden der höchste Ausbeutenverlust verzeichnet wird.

Außerdem wäre eine Modifizierung der Methode mit Saccharose als Edukt dahingehend einen

Versuch wert, die Benzylschutzgruppen durch Benzoylschutzgruppen zu ersetzen, da diese, in

weiterer Folge, leicht durch Zemplén-Verseifung abgespalten werden könnten. Bei den

Anomerisierungen bei Trichloracetimidat-Methoden könnte außerdem noch hinsichtlich der Dauer

88

der Anomerisierung experimentiert werden. Empfehlenswert wäre hierbei vielleicht diese über

Nacht durchzuführen, um eine möglichst vollständige Anomerisierung zum α-Trichloracetimidat zu

erreichen. Zur enzymatischen Synthese von acylierten Sterylglycosiden könnten noch Versuche mit

Fettsäureestern durchgeführt werden, bei denen diese anstelle der freien Fettsäuren eingesetzt

werden. Eine weitere Möglichkeit, die versucht werden könnte, ist die vorherige Veresterung am O-6

Atom [124] und eine anschließende Umsetzung mit Cholesterol. Summa summarum könnten weitere

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[124] Pöhnlein M., Ulrich J., Kirschhöfer F., Nusser M., Muhle-Goll C., Kannengiesser B., Brenner-

Weiß G., Luy B., Liese A., Syldatk C., Hausmann R., „Lipase-Catalyzed Synthesis of Glucose-6-O-

hexanoate in Deep Eutectic Solvents,“ Eur. J. Lipid Sci. Technol., Bd. 117, pp. 161-166, 2015.

[125] Yahya A.R.M., William A.A., Moo-Young M., „Ester Synthesis in Lipase-Catalyzed Reactions,“

Enzyme and Microbial Technology, Bd. 23, Nr. 7-8, pp. 438-450, 1998.

98

8 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Phytosterolgehalte in ausgewählten Lebensmitteln [10] ..................................................... 14

Tabelle 2: Analyse von SG und ASG in Pflanzenölen und Biodieselproben nach Lacoste et al. [1]. ..... 21

Tabelle 3: Probenvorbereitung für die Analyse am GC-MS .................................................................. 50

Tabelle 4: GC-MS Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid ............................................... 51

Tabelle 5: GC-FID Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid ............................................... 51

Tabelle 6: TOF-MS Parameter für die Messung von Cholesterylglycosid ............................................. 52

Tabelle 7: NMR-Parameter für durchgeführte Messungen .................................................................. 52

Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse ....................................................................................... 76

Tabelle 9: Ergebnisse der gaschromatographischen Analyse ............................................................... 85

Tabelle 10: SG-Gehalt in Raps-Biodiesel ............................................................................................... 86

9 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Grundgerüst der Sterole .................................................................................................. 12

Abbildung 2: Strukturformel von Cholesterol ....................................................................................... 13

Abbildung 3: Strukturformeln von a) Sitosterol, b) Stigmasterol, c) Campesterol ............................... 13

Abbildung 4: Strukturformel von Ergosterol ......................................................................................... 15

Abbildung 5: Biosynthese von Stigmasterol-β-D-glucopyranosid ......................................................... 16

Abbildung 6: Mechanismus der Zemplén-Verseifung ........................................................................... 17

Abbildung 7: Mechanismus der Helferich-Synthese ............................................................................. 18

Abbildung 8: Strukturformel eines acylierten Sterylglycosids (ASG) .................................................... 20

Abbildung 9: Gehalt von SGen, ASGen sowie der Gesamtgehalt von ASGen + SGen in verschiedenen

Lebensmitteln bezogen auf das Frischgewicht (FG) (Modifiziert von [44]) .......................................... 20

Abbildung 10: Bildung von SGen aus ASGen durch Umesterung bei der Biodieselproduktion ............ 21

Abbildung 11: Schematische Darstellung der Säulenchromatographie [76] ........................................ 29

Abbildung 12: Schema eines Gaschromatographen. (Übernommen von [80]) .................................... 31

Abbildung 13: Pyrolyse und Ionisation im FID ....................................................................................... 32

Abbildung 14: Schematische Darstellung eines Flammenionisationsdetektors (Modifiziert von [83]) 32

Abbildung 15: Ionisationsmöglichkeiten für die Massenspektroskopie [86] ........................................ 33

Abbildung 16: Bildung von radikalischen Molekülkationen .................................................................. 34

Abbildung 17: Elektrospray-Ionisation (Modifiziert von [87]) ............................................................... 35

Abbildung 18: Schematische Darstellung der Chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck.

(Modifiziert von [90]) ............................................................................................................................ 36

99

Abbildung 19: Schematische Darstellung eines Reflektron-TOFs (Modifiziert von [92]) ...................... 37

Abbildung 20: Schema eines Quadrupol-Analysators (Modifiziert von [94])........................................ 37

Abbildung 21: Schematische Darstellung eines Kernspinspektrometers (Modifiziert von [96]) .......... 38

Abbildung 22: Darstellung von β-D-Glucose-Pentaacetat mit Natriumacetat als Katalysator ............. 53

Abbildung 23: Umsetung von Glucosepentaacetat mit Bromwasserstoffsäure zur Herstellung von

Acetobromoglucose .............................................................................................................................. 53

Abbildung 24: Darstellung des tetraacetylierten Glucopyranosids mittels Koenigs-Knorr Methode ... 54

Abbildung 25: Darstellung von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Zemplén-Verseifung .............. 55

Abbildung 26: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mittels

Koenigs-Knorr-Methode ........................................................................................................................ 56

Abbildung 27: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid mit den Signalen der Silyl-

Fragmente sowie dem Cholesterol-Signal ............................................................................................. 57

Abbildung 28: TOF-Massensprektum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid ......................................... 57

Abbildung 29: Entstehende Fragmente bei der Ionisierung im GC-MS ................................................ 58

Abbildung 30: Basenkatalysierte Darstellung von Tetraacetylglucose aus Glucosepentaacetat ......... 58

Abbildung 31: Basenkatalysierte Darstellung von O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranosyl)-

trichloracetimidat aus Tetraacetylglucose ............................................................................................ 59

Abbildung 32: 13C NMR (CDCl3) (75 MHz)Spektrum von GTATH (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-

glucopyranosyl)-trichloracetimidat ....................................................................................................... 60

Abbildung 33: 1H NMR (CDCl3) (300MHz) Spektrum von GTATH (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-

glucopyranosyl)-trichloracetimidat ....................................................................................................... 61

Abbildung 34: TMSOTf-katalysierte Umsetzung zu Cholesteryl-Tetraacetylglucopyranosid................ 61

Abbildung 35: Darstellung von Cholesterylglucopyranosid durch Zemplén-Verseifung ...................... 62

Abbildung 36: TOF-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid ......................................... 64

Abbildung 37: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mittels

Trichloracetimidat-Methode ................................................................................................................. 64

Abbildung 38: DEPT und 13C NMR (Pyridin) (75 MHz) Spektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid 65

Abbildung 39: Darstellung von Octa-O-Benzylsaccharose durch Williamson-Ethersynthese .............. 66

Abbildung 40: Hydrolytische Spaltung von Octabenzylsaccharose in das Glucose- und das

Fructosederivat ..................................................................................................................................... 67

Abbildung 41: TOF-Massenspektrum von Tetrabenzylglucose ............................................................. 68

Abbildung 42: 13C NMR (CDCl3 ) (75 MHz) Spektrum von 2,3,4,6-Tetra-O-Benzyl-D-glucopyranose ... 69

Abbildung 43: 1H NMR (CDCl3) (300 MHz) Spektrum von 2,3,4,6-Tetra-O-Benzyl-D-glucopyranose ... 69

Abbildung 44: Basenkatalysierte Darstellung von Tetrabenzyl-Glucopyranosyltrichloracetimidat aus

Tetrabenzylglucose ................................................................................................................................ 70

100

Abbildung 45: Darstellung des benzylierten Cholesterylglycosids durch nucleophile Substitution ..... 71

Abbildung 46: TOF-Massenspektrum des tetrabenzylierten Cholesterylglycosids ............................... 72

Abbildung 47: Benzylgruppenabspaltung durch katalytische Hydrierung ............................................ 72

Abbildung 48: DC-Benzylgrupppen-abspaltung .................................................................................... 73

Abbildung 49: Gaschromatogramm von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid durch Darstellung mit

Saccharose als Edukt ............................................................................................................................. 74

Abbildung 50: Verfolgung der Debenzylierung mittels TOF-MS, nach 12, 40 und 52 Stunden ........... 74

Abbildung 51: Zusammenfassung der Ergebnisse der verschiedenen Synthesemethoden ................. 75

Abbildung 52: Darstellung von durch Veresterung von Cholesterylglycosid mittels Novozyme 435 ... 77

Abbildung 53: Enzymkinetik nach Michaelis-Menten. E=Enzym, S= Substrat, P=Produkt. .................. 77

Abbildung 54: Reaktionsmechanismus der Veresterung von Sterylglycosiden mit Palmitinsäure. Enz =

Enzym Novozyme 435 ........................................................................................................................... 78

Abbildung 55: GC-Massenspektrum von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid (links) sowie

Referenzspektrum (rechts) [114] .......................................................................................................... 79

Abbildung 56: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von

Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel .......................... 80

Abbildung 57: TOF-Massenspektrum aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von

Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel .......................... 81

Abbildung 58: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von

Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in Hexan + 1 mL Chloroform als Lösungsmittel ....... 82

Abbildung 59: Gaschromatogramm aus dem Versuch der enzymatischen Darstellung von

Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in THF/Pyridin 4:1 als Lösungsmittel ....................... 83

Abbildung 60: SIM-Gaschromatogramm von Rapsbiodiesel. Im markierten Bereich sind

Sterylglycoside ersichtlich. .................................................................................................................... 84

Abbildung 61: Fragmente der in den Biodieselproben enthaltenen Sterylglycoside: Campesterol.

Stigmasterol und Sitosterol. .................................................................................................................. 85

Abbildung 62: Massenspektren der detektierten Sterylglycoside. Links mit m/z 397,4 Sitosteryl-,

rechts mit m/z 383,3 Campesterylglycosid ........................................................................................... 85

Abbildung 63: Gaschromatogramm der Kristalle aus der Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-

β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel ..................................................................... 101

Abbildung 64: Massenspektrum der Kristalle aus der Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-

glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel ............................................................................ 101

Abbildung 65: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid Trichloracetimidatmethode

............................................................................................................................................................. 102

Abbildung 66: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid Saccharose als Edukt ...... 102

101

Abbildung 67: Gaschromatogramm von Rapsöl .................................................................................. 103

Abbildung 68: Cholesterylglycosid durch Synthese mittels Trichloracetimidatmethode mit 13C NMR-

Shifts .................................................................................................................................................... 103

Abbildung 69: Referenzgaschromatogramm von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid

durch Steglich-Veresterung [114] ....................................................................................................... 104

10 Anhang

Abbildung 63: Gaschromatogramm der Kristalle aus der Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel

Abbildung 64: Massenspektrum der Kristalle aus der Darstellung von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid in reinem Hexan als Lösungsmittel

102

Abbildung 65: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid Trichloracetimidatmethode

Abbildung 66: GC-Massenspektrum von Cholesteryl-β-D-glucopyranosid Saccharose als Edukt

103

Abbildung 67: Gaschromatogramm von Rapsöl

Abbildung 68: Cholesterylglycosid durch Synthese mittels Trichloracetimidatmethode mit 13

C NMR-Shifts

104

Abbildung 69: Referenzgaschromatogramm von Cholesteryl(6´-O-palmitoyl)-β-D-glucopyranosid durch Steglich-Veresterung [114]