5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 1
V5 – Analyse von Genomsequenzen
- Genom-Assemblierung
finde identische k-Tupel
- Genom-Alignment
Suche nach MUMs (maximal unique matches)
andere wichtige Bereiche, für die wir heute keine Zeit haben
- Gene identifizieren
Hidden Markov Modelle
- Transkriptionsfaktorbindestellen
Position Specific Scoring Matrices (PSSM)
- finde Repeat-Sequenzen
Suche nach bekannten Repeat-Motiven
Suche auf Suffix-Baum
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Softwarewerkzeuge 2
Whole Genome Shotgun Assemblierung
Es gibt 2 Strategien für die
Sequenzierung von Genomen:
clone-by-clone Methode
whole-genome shotgun Methode
(Celera, Gene Myers).
Die Shotgun Sequenzierung wurde
bereits 1977 von F. Sanger et al.
eingeführt und ist seither eine
Standardmethode für die
Sequenzierung von Genen.
Umstritten war jedoch, ob man sie
auch für komplette Genome
verwenden kann. ED Green, Nat Rev Genet 2, 573 (2001)
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Softwarewerkzeuge 3
Arachne Programm
von Serafin Batzoglou (MIT, Doktorarbeit 2000)
(i) konstruiere Graph G für Überlappungen zwischen Paaren von reads aus
Shotgun-Daten
(i) prozessiere G um Supercontigs von gemappten reads zu erhalten.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
Wichtige Variation der whole-genome shotgun Sequenzierung:
sequenziere reads jeweils von beiden Enden eines Klons.
Da die Inserts nach ihrer Größe ausgewählt werden, ist damit der ungefähre
Abstand zwischen dem Paar von reads bekannt.
Man nennt diese earmuff (Ohrenwärmer) Verbindungen.
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Softwarewerkzeuge 4
Arachne: erzeuge Überlappungsgraphen
Liste von reads R = (r1, ..., rN) , N ist die Anzahl der reads.
Jeder read ri besitzt eine Länge li < 1000.
Wenn beide reads von den Endpunkten desselben Klons stammen (earmuff link),
besitzt ri eine Verknüpfung zu einem anderen read rj in einer festen Distanz dij.
Erstes Ziel: erzeuge Graphen G der Überlappungen (Kanten) zwischen Paaren an
reads (Knoten) dies ergibt die Paare an reads in R, die aligniert werden müssen.
Da R sehr lang sein kann, sind N2 alignments nicht praktikabel.
erstelle Tabelle für das Vorkommen von k-Tupel (Strings der Länge k) in den reads,
zähle die Anzahl von k-Tupel Treffern für jedes Paar an reads.
Führe dann paarweise Alignments zwischen den Paaren an reads durch,
die mehr als cutoff gemeinsame k-mere besitzen.
Batzoglou PhD thesis (2002)
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Softwarewerkzeuge 5
Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-meren
Ermittle die Anzahl an k-Tupel Treffern in der Vorwärts- und Rückwärts-Richtung
zwischen jedem Paar von reads in R.
(1) Ermittle alle Triplets (r,t,v)
r = Nummer des reads in R
t = Index eines k-mers, das in r vorkommt
v = Richtung des Auftretens (vorwärts oder rückwärts)
(2) sortiere die Menge der Paare nach den k-mer Indices t
(3) verwende eine sortierte Liste um eine Tabelle T von Quadrubletts (ri, rj, f, v)
zu erstellen, wobei ri und ri die reads sind, die mindestens einen gemeinsamen
k-mer enthalten, v die Richtung angiebt, und f die Anzahl an gemeinsamen
k-mers zwischen ri und rj in Richtung v.
Batzoglou PhD thesis (2002)
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Softwarewerkzeuge 6
Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers
Batzoglou PhD thesis (2002)
Hier:k = 3
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Softwarewerkzeuge 7
Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers
Wenn ein k-Tupel „zu oft“ auftritt gehört er wahrscheinlich zu einer
Repeat-Sequenz.
Man sollte diese nicht für die Detektion von Überlappungen verwenden.
Implementierung
(1) finde k-Tupel (r,t,v) und sortieren sie in 64 Dateien entsprechen den ersten
drei Nukleotiden jedes k-mers.
(2) Für i=1,64
lade Datei in den Speicher, sortiere nach t, speichere sortierte Datei ab.
end
(3) lade 64 sortierte Dateien nacheinander in den Speicher,
fülle Tabelle T nacheinander auf.
In der Praxis ist k = 8 bis 24.Batzoglou PhD thesis (2002)
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Softwarewerkzeuge 8
Arachne: paarweise read-Alignments
Führe paarweise Alignments zwischen den Reads durch, die mehr als Cutoff
gemeinsame k-mers besitzen.
Sobald man zu häufige k-mers ausschließt (mehr als ein zweiter Cutoff), ist
sichergestellt, daß nur O(N) viele paarweise Sequenzalignments durchgeführt
werden müssen.
Nur eine kleine Anzahl an Basen-Austauschen und Indels ist in einer
überlappenden Region zweier alignierter reads erlaubt.
Output des Alignment-Algorithmus:
für die reads ri, rj gibt es Quadrubletts (b1, b2, e1, e2) für jede detektierte
Überlappungsregion mit den Anfangspositionen b1, b2 und Endpositionen e1,e2.
Falls eine signifikante Überlappungsregion vorliegt, wird (ri, rj, b1, b2, e1, e2) eine
Kante im Überlappungsgraphen G. Batzoglou PhD thesis (2002)
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Softwarewerkzeuge 9
Kombination teilweiser Alignments
3 teilweise Alignments der Länge
k=6 zwischen einem Paar von
reads werden zu einem einzigen
vollen Alignment der Länge k=19
kombiniert.
Die vertikalen Linien verbinden
übereinstimmenden Basen,
wogegen x Mismatche sind.
Dies ist eine oft auftretende
Situation, in der ein ausgedehnter
k-mer Treffer ein volles Alignment
von zwei reads ist.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
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Softwarewerkzeuge 10
Repeats erzeugen Mehrdeutigkeit
Ohne das Auftreten von Sequen-
zierungsfehlern und Repeats wäre es
einfach, alle entdeckbaren paarweise
Abstände von reads zu finden und
den Graph G zu konstruieren.
Da es Repeats jedoch sehr häufig
auftreten, bedeutet eine Verbindung
zwischen zwei reads in G nicht ohne
weiteres eine wahre Überlappung.
Eine „Repeat-Verbindung“ ist eine
Verbindung in G zwischen zwei
reads, die aus verschiedenen
Regionen des Genoms stammen und
in der repetitiven Sequenz überein-
stimmen. Batzoglou PhD thesis (2002)
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Softwarewerkzeuge 11
Sequence contigs
Batzoglou PhD thesis (2002)
unerläßlich für die Assemblierung ist die ausreichende Überdeckung (mehrfache
Sequenzierung = coverage) derselben Genomregionen
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Softwarewerkzeuge 12
Verbinden von Contigs
Batzoglou PhD thesis (2002)
Sequenz-Contigs werden gebildet
indem Paare von reads verbunden
werden, die eindeutig verbunden
werden können.
Tatsächlich ist die Situation viel
schwieriger als hier gezeigt, da
Repeats häufig nicht zu 100%
zwischen Kopien konserviert sind.
Durch die Löschung von k-mers hoher Frequenz wird einiges an Repetition im
Genom vor der Erzeugung von G effizient maskiert.
Zur Erkennung von repetitiven Verbindung dienen weitere heuristische Algorithmen,
die hier nicht diskutiert werden sollen.
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Softwarewerkzeuge 13
Benutze Überlapp-Paarungen um die reads zu verbinden
Arachne sucht nach 2 Plasmiden mit
gleicher Insert-Länge, deren
Sequenzen an beiden Enden
überlappen paired pairs.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
(A) A paired pair of overlaps.
The top two reads are end sequences from
one insert, and the bottom two reads are
end sequences from another.
The two overlaps must not imply too
large a discrepancy between the insert
lengths.
(B) Initially, the top two pairs of reads
are merged. Then the third pair of
reads is merged in, based on having
an overlap with one of the top two left
reads, an overlap with one of the top
two right reads, and consistent insert
lengths. The bottom pair is similarly
merged.
Unten: eine Menge von paired pairs
werden zu contigs zusammengefasst
und eine Konsensussequenz erzeugt.
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Softwarewerkzeuge 14
Detection of repeat contigs
Contig R is linked to contigs A and
B to the right. The distances
estimated between R and A and
R and B are such A and B cannot
be positioned without substantial
overlap between them. If there is
no corresponding detected overlap
between A and B then R is
probably a repeat linking to two
unique regions to the right.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
Some of the identified contigs are repeat contigs in which nearly identical
sequence from distinct regions are collapsed together. Detection by
(a) repeat contigs usually have an unusually high depth of coverage.
(b) they will typically have conflicting links to other contigs.
After marking repeat contigs, the remaining
contigs should represent the correctly
assembled sequence.
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Softwarewerkzeuge 15
Contig assembly
If (a,b) and (a,c) overlap, then
(b,c) are expected to overlap.
Moreover, one can calculate that
shift(b,c)=shift(a,c)-shift(a,b).
A repeat boundary is detected
toward the right of read a, if there
is no overlap (b,c), nor any path
of reads x1, ..., xk such that (b,x1),
(x1,x2) ..., (xk,c) are all overlaps,
and shift(b,x1) + ... + shift(xk,c)
shift(a,c) – shift(a,b).
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
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Softwarewerkzeuge 16
Consistency of forward-reverse links
(A) The distance d(A,B) (length of
gap or negated length of
overlap) between two linked
contigs A and B can be
estimated using the forward-
reverse linked reads between
them.
(B) The distance d(B,C) between
two contigs B,C that are
linked to the same contig A
can be estimated from their
respective distances to the
linked contig.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
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Softwarewerkzeuge 17
Filling gaps in supercontigs
(A) Contigs A and B are connected by
a path p of contigs X1,..., Xk. The
distance dp(A,B) between A and B
(along the path p) is the length of
the sequence in the path that does
not overlap A and B.
(B) Contigs Y1 and Y2 share forward-
reverse links with the supercontig
S. These links position them in the
vicinity of the gap between A and
B. Therefore, Y1 and Y2 will be
used as possible stepping points in
the path closing the gap from A to
B. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
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Softwarewerkzeuge 18
Contig Coverage and Read Usage
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 19
Characterization of Contigs and Supercontigs
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 20
Base Pair Accuracy
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
base quality x*10 means that (on average) one sequencing error occursin 10-x bases.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 21
Misassemblies
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 22
Computational Performance
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 23
Contig Coverage and Read Usage
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 24
Comparison of different assemblers
Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001)
you should look out for:
- smallest number of contigs + misassembled contigs- highest possible coverage by contigs- lowest possible coverage by misassembled contigs
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 25
There is no error-free assembler to date
Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001)
Comparative analysis of EULER, PHRAP, CAP, and TIGR assemblers (NM sequencing project). Every box corresponds to a contig in NM assembly produced by these programs with colored boxes corresponding to assembly errors. Boxes in the IDEAL assembly correspond to islands in the read coverage. Boxes of the same color show misassembled contigs. Repeats with similarity higher than 95% are indicated by numbered boxes at the solid line showing the genome. To check the accuracy of the assembled contigs, we fit each assembled contig into the genomic sequence. Inability to fit a contig into the genomic sequence indicates that the contig is misassembled. For example, PHRAP misassembles 17 contigs in the NM sequencing project, each contig containing from two to four fragments from different parts of the genome.
„Biologists "pay" for these errors at the
time-consuming finishing step“.
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Softwarewerkzeuge 26
What comes next? Finishing the genome
Usually, the assembly of shotgun data is finished with a number of contigs
with some remaining gaps.
Also, within each contig there are some regions of high error rate.
The goal of the finishing phase is then to get a single continuous contig
with low error rate.
„Finishers“ apply ad hoc rules to decide where additional data is necessary.
This experimental data may then be generated in experiments using
different chemistry or higher coverage.
Autofinish (phrap group) is a program to help humans with deciding
which new reads to get.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 27
Whole Genome Alignment (WGA)
Nachdem die genomische DNA-Sequenz eng verwandter Organismen verfügbar
wird, ist die erste Frage, wie das Alignment beider Genome aussieht.
Globale Genom-Alignments machen nur für eng verwandte Organismen Sinn.
Im anderen Fall muß man erst die genomischen Rearrangements betrachten.
Dann kann man die systenischen Regionen (Regionen, in denen Gen-
Reihenfolge des nächsten gemeinsamen Vorfahrens in beiden Spezies konserviert
blieb) betrachten und lokale Genom-Alignments dieser Regionen produzieren.
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Softwarewerkzeuge 28
Vergleich von Maus und Mensch auf Genomebene
Wichtigste Ergebnisse:
* das Mausgenom ist etwa 14% kürzer als das menschliche Genom.
Die unterschiedliche Länge liegt wohl an der höheren Deletionsrate in Maus.
* über 90% des Maus- und Menschen-Genoms kann in entsprechende
Regionen mit konservierter Syntenie eingeteilt werden
* auf dem Nukleotid-Level kann etwa 40% des menschlichen Genoms mit dem
Maus-Genom aligniert werden (diese am stärksten orthologen Sequenzen
blieben wohl in beiden Linien vom gemeinsamen Vorfahren erhalten).
Der Rest wurde wohl in einem oder beiden Genomen gelöscht.
* die neutrale Substitutionsrate beträgt etwa 0.5 Nucleotid-Substitutionen pro
Position seit der Divergenz der beiden Spezien. Etwa doppelt so viele
Austausche haben in Maus gegenüber Mensch stattgefunden.
aus dem Paper des Mouse Genome Sequencing Consortiums „Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome“,Nature 420, 520-562 (5.12.2002). Excellent paper! Well readable!
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 29
Vergleich von Maus und Mensch auf Genomebene
Key findings:
* der Anteil kurzer (50-100 bp) Segmente in den Säugetier-Genomen, der
reinigender Selektion unterliegt, ist etwa 5%, d.h. wesentlich höher als der Anteil
der Protein-kodierenden Regionen
Genome enthalten viele zusätzliche Eigenschaften wie UTRs (untranslated
regions), regulatorische Elemente, nicht-Protein-kodierende Gene, chromosomale
Strukturelemente, die unter Selektion für die biologische Funktion stehen.
* die Evolution von Säugetier-Genomen verläuft ungleichmäßig. Es gibt deutliche
Unterschiede an Divergenz je nach Genomposition.
* Sowohl Maus wie Mensch-Genom enthalten etwa 30.000 Gene, die für Proteine
kodieren. Der Anteil an Mausgenen mit einem eindeutigen Orthologen im
menschlichen Genom ist etwa 80%. Der Anteil der Mausgene ohne ein homologes
Gen im menschlichen Genom ist < 1%.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 30
The mouse genome. Nature 420, 520 - 562
Konservierung von Syntenie zwischen Mensch und Maus
Ein typisches 510-kb Segment des Maus-Chromosoms 12, das mit einem
600-kb Stück des menschlichen Chromosom 14 verwandt ist.
Blaue Linien: reziprok eindeutige Treffer in beiden Genomen.
Rote Markierungen kennzeichnen die Länge der passenden Regionen.
Die Abstände zwischen diesen „Landmarks“ sind im Maus-Genom kleiner als
im Mensch, was mit der 14% kürzeren Gesamtlänge des Genoms
übereinstimmt.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 31
The mouse genome. Nature 420, 520 - 562
Entsprechung syntenischer Regionen
342 Segmente und 217 Blöcke >300 kb mit konservierter Syntenie im Mensch
sind im Maus-Genom markiert.
Jede Farbe entspricht einem bestimmten menschlichen Chromosom.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 32
Sensitivität
Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)
Im globalen Mensch:Maus Alignment sind mehr als eine Millionen Regionen
stärker als 70% konserviert (auf 100-bp Level)
– diese Regionen decken > 200 Million bp ab.
Nur 62% von ihnen werden von (lokalen) BLAT-Treffern abgedeckt.
Dies bedeutet, daß man 38% der konservierten Abschnitte nur durch das globale
Alignment finden kann!
Idee: lokales Alignment soll als Anker-Verfahren für anschliessendes globales
Alignment dienen. Dadurch hofft man, viele zusätzliche konservierte Regionen
ausserhalb der Anker-Regionen zu finden.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 33
hohe Sensitivität von globalen Alignments
Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)
Beispiel: das globale Alignment der mouse finished sequence
NT_002570 gegen die Region, die mit BLAT-Ankern gefunden
wurde, zeigt konservierte kodierende und nicht-kodierende
Elemente, die mit BLAT nicht gefunden wurden.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 34
Zusätzliche Informationen aus globalem WGA
• Unterschiede in Repeat-Merkmalen– Duplikationen (große Fragmente, chromosomal)
– Tandem-Repeats
• Große Insertionen und Deletionen
• Translokationen von einem Teil des Genoms zu einem anderen
• Single Nucleotide Polymorphism
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 35
Methods for WGA: iterative pairwise global alignment
These Methods follow a general strategy of iteratively merging two multiple
alignments of two disjoint subsets of sequences into a single multiple
alignment of the union of those subsets.
Construct a hash table on either the query string, or the database string (or
both) for all possible substrings of a pre-specified size (say l)
Find exactly matching substrings of length l using this hash table (seeds).
In the second phase, these seeds are extended in both directions, and
combined if possible, in order to find better alignments.
If the global pairwise alignment of two genomic DNA sequences S1 and S2
is computed by standard dynamic programming algorithms
(which requires O( | S1 |∙| S2 | time, where |S| is the length of sequence S)
such iterative methods cannot be used in practice to align DNA sequences
of entire genomes due to time and memory limitations.
examples are: FASTA, BLAST, MegaBLAST, BL2SEQ,
Wu-blast, flash,PipMaker (BLASTZ), and PatternHunter
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 36
Methods for WGA: anchor-based global multiple alignment
These methods try to identify substrings of the sequences under
consideration that they are likely parts of a global alignment.
(As mentioned, these substrings can be obtained from local alignments).
These substrings form „anchors“ in the sequences to be aligned.
These methods first align the anchors and subsequently close the gaps
(align the substrings between the anchors).
Anchor-based alignment methods are well suited for aligning very
long sequences.
MUMmer is a very successful implementation of this strategy for aligning
two genome sequences.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 37
Was ist MUMmer?
• A.L. Delcher et al. 1999, 2002 Nucleic Acids Res.
• http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/webmum/mumplot
• Nimm an, dass zwei Sequenzen eng verwandt sind (sehr ähnlich)
• MUMmer kann zwei bakterielle Genome in weniger als 1 Minute alignieren
• nutzt Suffix-Bäume um Maximal Unique Matches zu finden
• Definition eines Maximal Unique Matches (MUM):
– Eine Subsequenz, die in beiden Sequenzen genau einmal ohne Abweichungen vorkommt und in keine Richtung verlängert werden kann.
• Grundidee: ein MUM ausreichender Länge wird sicher Teil eines globalen Alignments sein.
A maximal unique matching subsequence (MUM) of 39 nt (shown in uppercase) shared by
Genome A and Genome B. Any extension of the MUM will result in a mismatch.
By definition, an MUM does not occur anywhere else in either genome. Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 38
MUMmer: wichtige Schritte
• Erkenne MUMs (Länge wird vom Benutzer festgelegt)
ACTGATTACGTGAACTGGATCCAACTCTAGGTGAAGTGATCCA
ACTGATTACGTGAACTGGATCCAACTCTAGGTGAAGTGATCCA
ACTGATTACGTGAACTGGATCCA
ACTC--TAGGTGAAGTG-ATCCA
1 10
1 10
20
20
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 39
Definition von MUMmers
• Für zwei Strings S1 und S2 und einen Parameter l
• Der Substring u ist eine MUM Sequenz wenn gilt: |u| > l u kommt genau einmal in S1 und genau einmal in S2 (Eindeutigkeit) Für jeden Buchstaben a kommt weder ua noch au sowohl in
S1 als auch in S2 vor (Maximalität)
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 40
Wie findet man MUMs?
• Naiver Ansatz
– Vergleiche alle Teilsequenzen von A mit allen Teilsequenzen von B.
Dies dauert O(nn)
• verwende Suffix-Bäume als Datenstruktur
– ein naiver Ansatz, einen Suffix-Baum zu konstruieren hat
eine quadratische Komplexität in der Rechenzeit und dem Speicherplatz
– durch klevere Benutzung von Pointern gibt es lineare Algorithmen in
Rechenzeit und Speicherplatz wie den Algorithmus von McCreight
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 41
Suffix-Bäume
CACATAG$
Suffix-Bäume sind seit über 20
Jahren wohl etabliert.
Einige ihrer Eigenschaften: • ein “Suffix” beginnt an jeder
Position I der Sequenz und reicht
bis zu ihrem Ende. • Eine Sequenz der Länge N hat N
Suffices.• Es gibt N Blätter.• Jeder interne Knoten hat mindest
zwei Kinder.• 2 Kanten aus dem selben Knoten
können nicht mit dem selben
Buchstaben beginnen.• Am Ende wird $ angefügt
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 42
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG$
CA
T
CA
G$
1
A
Suffixes:
1. CACATAG$
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 43
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
A
12
A
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 44
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
T
G
$
AA
123
A
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 45
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$4. ATAG$
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
T
G
$
AA
T G $A
123
4
A
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 46
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$4. ATAG$5. TAG$
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
123
4
5
A
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 47
Konstruktion eines Suffix-Baums
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
G
$
123
4
5
6A
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$4. ATAG$5. TAG$6. AG$
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 48
Konstruktion eines Suffix-Baums
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
G
$
G $
123
4
5
6
7
A
CACATAG$
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$4. ATAG$5. TAG$6. AG$7. G$
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 49
Konstruktion eines Suffix-Baums
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
G
$
G $$
123
4
5
6
78CACATAG$
A
Suffixes:
1. CACATAG$2. ACATAG$3. CATAG$4. ATAG$5. TAG$6. AG$7. G$8. $
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 50
Speicherplatz sparen
[3, 6][3, 6]
[5, 4]
[5, 4]
[5, 4]
[7, 2]
[7, 2][8, 1]CACATAG$
[1, 2]
[2, 1]Suffix-Bäume können sehr
groß werden, da ihre
Größe mit der des
Genoms vergleichbar
ist. Es ist daher wichtig,
Speicherplatz
effizient zu
nützen.
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 51
Suchen in einem Suffix-Baum
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
G
$
G $$
123
4
5
6
78
A
Search Pattern:CATA
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 52
Suchen in einem Suffix-Baum
CA
T
CA
G$
A
T
CA
G$
TT
A
G
$G
$
AA
T G $A
G
$
G $$
123
4
5
6
78
A
Search Pattern:ATCG
5. Vorlesung WS 2005/06
Softwarewerkzeuge 53
MUMmer 1.0: Wie findet man MUMs?
• Konstruiere einen Suffix-Baum aus allen Suffices von Genom A
• Füge jedes Suffix von Genom B in diesen Suffix-Baum ein
• Kennzeichne jedes Blatt mit dem Genom, das es enthält
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Sortieren der MUMs
• MUMs werden nach ihren Positionen in Genom A sortiert
1 2 3 4 5 6 7
1 3 2 4 6 7 5
Genome A:
Genome B:
1 2 4 6 7
1 2 46 7
Genome A:
Genome B:
Jeder MUM ist nur mit seiner Nummer gekennzeichnet, ohne Berücksichtigung seiner Länge.
Das obere Alignment zeigt alle MUMs.
Die Verschiebung von MUM 5 in Genom B zeigt eine Transposition an.
Die Verschiebung von MUM 3 könnte ein Zufallstreffer oder Teil einer inexakten Repeat-Sequenz sein.
Unteres Alignment: suche in beiden Genomen die längste gemeinsam ansteigende Folge an
Subsequenzen
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Es gibt 4 Arten an Gaps in MUM-Alignments
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
Diese Beispiele
stammen aus dem
Alignment der beiden
M.tuberculosis
Genome.
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Schliessen der Gaps• SNP
– einfache Fälle: Gap aus einer Base zwischen benachbarten MUMs
– wenn neben Repeat-Sequenzen: behandle als Tandem-Repeat
• Variable / Polymorphe Region
– Kleine Region: Alignment mit dynamischer Programmierung
– Große Region: rekursive Anwendung von MUMmer mit reduzierter Länge des minimalen Cut-offs
• Insertionen / Deletionen
– Transposition: out of alignment order
– Einfache Insertion: nicht ins Alignment aufnehmen
• Repeats
– Tandem-Repeats werden durch überlagern von MUMs entdeckt
– Andere Repeats (i.e. Duplikation) werden als Gaps behandeln
Schließe Gaps durch lokale Alignments für die Abschnitte zwischen
den alignierten MUMs (z.B. mit Smith-Waterman).
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Beispiel: Alignment zweier Mikroorganismen
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
Das Genom von M.genitalium ist nur etwa 2/3 so
lang wie das von M.pneumoniae.
Obere Abbildung: FASTA-Alignment von
M.genitalium und M.pneumoniae.
Mitte: Alignment mit 25mers
Unten: Alignment mit MUMs. 5 Translokationen.
Ein Punkt bedeutet jeweils einen Treffer zwischen
den Genomen.
FASTA-Plot: ähnliche Gene
25-mer-Plot: 25-Basen-Sequenz, die in beiden
Sequenzen genau einmal vorkommt.
MUM-Plot: MUM-Treffer.
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Example: alignment human:mouse
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
Alignment of even more distant
species: human and mouse.
Here: alignment of a 222 930 bp
subsequence of human
chromosome 12p13, accession
no. U47924, to a 227 538 bp
subsequence of mouse
chromosome 6, accession no.
AC002397. Each point in the plot
corresponds to an MUM of
[ge]15 bp.
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Zusammenfassung
• Die Anwendung der Suffix-Bäume war ein Durchbruch für die
Alignierung ganzer Genome
• MUMmer 2 besitzt zusätzliche Verbesserung für die Rechenzeit und
den Speicherplatz
– die Verwendung von Suffix-Arrays anstatt von Suffix-Bäumen gibt
eine verbesserte Datenstruktur ( Stefan Kurtz, Hamburg)
– es wird nun möglich, mehr als zwei Genome zu alignieren
(implementiert in MGA)
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