Aplicaciones del Real Time PCR en Veterinaria
(reproducción, producción y enfermedades hereditarias en animalesdomésticos)
Dra.PhD. Silvia Llambí
Prof. Agre. Gr 4 DT .Area Genética
Facultad de Veterinaria
Un método eficiente para caracterizar el genoma “Real time PCR”-Curso Posgrado.PEDECIBA-Subarea Genética-2009.
La PCR a tiempo reál combina un termociclador, un espectrofotómetro y un equipo informático con software y monitor.
El termociclador efectúa la PCR en muestras que contienen fluorocromo.
La fluorescencia emitida será proporcional a la cantidad de DNA, cantidad que dobla de ciclo en ciclo.
Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por una fibra óptica. La emisión fluorescente inducida es enviada al espectrofotómetro que la analiza a diferentes longitudes de onda.
El monitor indica, después de cada ciclo, las fluorescencias leídas dentro de la longitud de onda escogida para la muestra
PCR en tiempo Real (PCR cuantitativa)
PCR en tiempo Real (PCR cuantitativa)
Principio detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento específico durante la amplificación
Técnicas de realización de la PCR en tiempo real
UtilizaciUtilizacióón de n de moleculasmoleculas intercalantesintercalantes
moléculas fluorescentes SYBR® Green
UtilizaciUtilizacióón de la hibridacin de la hibridacióón con sondas internasn con sondas internas
Sonda marcada fluorescente con estructura secundaria en horquilla(“sondas Beacons”)
Sondas u oligonucleótidos marcados (Transferencia de energía Fluorescente, FRET)
Sondas Taqman®. Diseñadas por Applied Biosystems
http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/featuresbd/taqman.html
Técnicas con fluorescenciaSYBR GreenSYBR GreenTaqManTaqMan
R- reporter (FAM, 6-carboxifluoresceina) y VIC)
Q-”quencher” (TAMRA , 6, carboxi-tetramil-rodamina)
Especificidad
TaqManTaqMan
Alta Alta especificidadespecificidad inherenteinherente a a laslasCualidadesCualidades de lade la TaqTaq -- ManMan
SYBR GreenSYBR Green
Baja Baja especificidadespecificidad
SYBR Green I
ColoranteColorante se se uneune a la a la curvaturacurvaturaMenorMenor del ADNdel ADN
No No sondasonda; ; mmááss econeconóómicomico quequeTaqManTaqMan..
No multiplex.No multiplex.
SONDAS BEACONS
los pasos principales serían :
1.- desnaturalización del ADN 2.-hibridación de los cebadores y de la sonda interna3.-extensión y acción exonucleasa (5’-3’) (la sonda presenta un grupo fosfato en 3’).4.- degradación de la sonda con liberación del extremo 5’ y emisión de fluorescencia.
Real Time PCRmejor estandarización, cuantificación, automatización miniaturización de las experiencias con una reducción de tiempo y costo en el diagnóstico y un aumento en el número de muestras a analizar.
TaqManTaqMan
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE ESTA TÉCNICA
Principales ventajas
Se necesitan cantidades muy pequeñas de ADN
No se tiene que realizar ningún tipo de soporte (geles de agarosa o acrilamida) para obtener el resultado con lo cual se minimizan riesgos en el laboratorio al tener que manipular sustancias cancerígenas y/o mutagénicas como el bromuro de etidio y la acrilamida.
Los ensayos son fáciles y rápidos (PCR en tiempo real donde simultáneamente se va obteniendo el resultado ciclo a ciclo en el ordenador).
Una vez que el tubo se cierra y empieza la reacción de PCR a funcionar no se necesita abrir más el tubo obteniendo el resultado en forma directa con lo cual evitamos los riesgos consecuentes de contaminación del laboratorio y/o de las muestras con productos post-amplificación. Esta era una de las grandes problemáticas de falsos-positivos por contaminación que podían obtenerse con la PCR convencional y que esta nueva tecnología ha superado.
La experiencias son altamente reproducibles y automatizadas cuando se optimizan las temperaturas de hibridización y las concentraciones de ADN.
Principales desventajas
Se necesita datos de la secuencia de ADN o de ADNcopiapara la construcción de los cebadores y de la sonda.Para esto se recurre a los bancos de secuencias de ácidos nucleicos como el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) o al European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, http://www.ebi.ac.uk/embl/).
Real Time PCR System 7300 Applied BiosystemsLaboratorio de Citogenética y Genética MolecularFacultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza
APLICACIONES EN VETERINARIA
Genotipado por discriminación alélica (detección de mutaciones puntuales, estudio de polimorfismos de un solo nucleótido o SNP).
1.- Se diseñan 2 sondas (específica alelo salvaje y específica alelo mutante).
2.- se marcan con dos fluorocromos distintos.
3.- evaluación de la hibridización
VENTAJAS FRENTE A TÉCNICA CONVENCIONAL
No necesitamos evaluar la amplificación primaria en gel de agarosa.
No necesitamos analizar el RFLP utilizando enzimas de restricción y evaluación del tamaño de los fragmentos en gel de agarosa.
DISCRIMINACIÓN ALÉLICA EN ENFERMEDADES HEREDITARIAS
EN ANIMALES DOMÉSTICOS POR MUTACIÓN PUNTUAL
IdentificaciIdentificacióón mediante marcadores n mediante marcadores moleculares de ADN de la moleculares de ADN de la Enfermedad Renal Enfermedad Renal PoliquPoliquíísticastica AutosAutosóómicamica DominanteDominante en gatos en gatos
domdoméésticos (sticos (FelisFelis catuscatus) del Uruguay) del Uruguay
Dra. Mónica MartínezOrientadora: Dra. Silvia Llambí
Proyecto de maestría aprobado en Facultad de Veterinaria-UdelaR
INTRODUCCION Y ANTECEDENTES
Enfermedades renales quísticas:
Forman parte de un Síndrome caracterizado por la formación de quistes con localización renal y extrarrenal (hígado, bazo, páncreas)
Pueden o no tener base hereditaria
Enfermedades renales quísticas hereditarias afectan varias especies (eg. humano, felino, perro, ratón)
Ejemplos:
Enfermedad sp gen
• Enf.renal poliquística autosómica recesiva humano PKHD1
• Enf.renal poliquística autosómica dominante humano PKD1(ADPKD) PKD2
PKD3?
felino PKD1
ADPKD….. humanos y felinos
• Alteración genética mas importante
• Mecanismo de herencia y presentación clínica similar
• Causa: mutaciones en gen PKD1
Ambas sp:
Comparten mas de 30 enfermedades hereditarias homólogas
FELINO modelo ideal para estudio PKD humano
Características de la enfermedad en felinos:
• Adultos ( 3 -10 años; media de 7)
• Quistes renales varían en tamaño y número
• Ocasionalmente quistes en hígado, páncreas, bazo
• Desarrollo gradual de falla renal y muerte
• Razas mas afectadas:
Prevalencia: 37-49% (USA y UK)
Exótico Himalayo Persa
Mediante técnicas moleculares basadas en la PCR se identificó la mutación responsable de la enfermedad en el felino (2004):C A
Gen involucrado PKD1
Evolución estudio por Técnicas moleculares:
• MS ligados al gen (PCR)
• Mutación puntual (PCR-RFLP; Real Time PCR)
Felino Humano
• 53 kb , 46 exones
•Cromosoma E3 felino(homólogo a HSA 7,13 y 16)
Características Gen PKD1
Mecanismo de producción de los quistes
• Policistina 1: diferenciación células epiteliales (función normal)
• Mutación gen PKD1: Proteína alterada, Diferenciación celular incompleta
• Inadecuada cantidad de proteínas transportadoras de electrolitos
• Aumento secreción de solutos con acumulación de fluídos (quistes)
Aspecto macroscópico riñón poliquístico
Riñón poliquístico de 30 cm diámetro.
Análisis RFLP
• Enzima de restricción Mly I
• Evaluación: geles agarosa 2% teñidos con BrEt, visualizados bajo luz UV
• Control positivo
Fragmentos (pb)
•Portadores 559, 316 y 243(Aa)
•Sanos 559(aa)
En definitiva.En definitiva.…….aplicar el.aplicar el C O N S E J O G E N E T I C O
Concepto análisis del riesgo de defectos genéticos en una población así como la presentación de opciones disponibles para evitar o reducir los riesgos posibles.
Profesional
•Contar con información genética relacionada a la enfermedad hereditaria.
•Distinguir características de base genética de las de base ambiental
•Tomar medidas tendientes a eliminar el problema o disminuir su frecuencia.
•Considerar limitaciones a estas medidas.
Sonda (alelo salvaje) FAM
Sonda (AD-PKD) HEX
Resultados: RT-PCR en 90 min
PCR-RFLP en 5 hrs
Hembra canina raza cimarróncon problemas reproductivos
ESTUDIO DE INTERSEXOS EN ANIMALES DOMÉSTICOS
ZT27 / DBU : 1962
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999TABAPUA LOS ROBLES
Sí4145
ZT 31 / DBU : PR:ZT31
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999CALAGUALA LOS ROBLES
No1811
ZT 30 / DBU : PR:ZT30
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999KAI LOS ROBLES
No1810
ZT 29 / DBU : PR:ZT29
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999CARANDAY LOS ROBLES
No1809
ZT 28 / DBU : PR:ZT28
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999AGUAI LOS ROBLES
No1808
ZT 27 / DBU : PR:ZT27
TANA LOS ROBLES
56ZAPICAN LOS ROBLES
43410/06/1999TAPUA LOS ROBLES
Si1807
TattooIDmadres.RegNameDamIDpadres.Reg
NameSireIDDOBOriginal.RegNameSexMaleDogID
Consulta Original
78, XY/ 77, XOCitogenética
X
Y
CA macho hembra CA CA Macho hembra macho
Sangre sang sang M Neg Chelex Chelex chelex chelex sangre
sangre Pelo pelo pelo
SRY CANINO
Laboratorio Técnicas Nucleares –Facultad de Veterinaria
Cuantificación
Real-Time PCR
No. Colour Name Genotype Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 1 CI44 74,2 86,3 90,8 92,5
3 CI4 77,8 81,8 86,8 91,7
4 CA´intersexo 86,0
5 CAintersexo 86,0
6 CI36macho 73,5 81,5 85,5 91,5
7 CI2macho 78,5 86,0 90,7
8 CAchelexintersex 81,5 85,5
10,Gain Green
The Run Signature is valid.Run Signature
Rotor-Gene 1.7.75Run On Software Version
Notes
Operator
03/06/2009 19:13:36Run Finish
03/06/2009 17:32:47Run Start
SRY_Three Step with Melt 2009-06-03 (1)
Run Name
Estos datos experimentales se realizaron con la colaboración de la Lic. Paula Nicolini
Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005
Aplicaciones para la caracterización de especies
Detección de SNPs
(información de genes de otras especies aviares)
Diseño de cebadores y PCR en muestras de perdiz (roja y chukar)
Secuenciación de los fragmentos. 1) RFLP (si el SNP forma parte de sitiode reconocimiento de una E.R)
2) RT-PCR (si SNP no forma parte de sitioDe reconocimiento de una E:R).
GENOTIPADO POR RT-PCR
Diseño de cebadores convencionales con las secuencias consenso de PerdizDiseño de sonda (específica para el SNP que diferencia a perdiz roja de chukar)
SONDA Taqman reporter “FAM” (Perdíz roja) y “VIC” (P. chukar).
Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005
Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005
Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005
Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005
Perdices silvestres: 10 híbridas de un total de 201 analizadas (4.98%)
Perdices de granja: 1482 híbridas de un total de 7241 analizadas (20.47%)
Resultados obtenidos aplicando técnicas moleculares para identificaciónde híbridos Vs perdiz roja.
Muchas Gracias por su tiempo
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