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Aus der Medizinischen Klinik

im Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer - Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Wolff-H. Schmiegel

Durchflusszytometrische Analysen des Liquor cerebrospinalis

von Patienten mit primären ZNS-Lymphomen: Retrospektive Beurteilung ihrer diagnostischen Aussagekraft im Vergleich zur

Liquorzytologie und Magnetresonanztomographie

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Christoph Heute

aus Herne 2013

Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: Prof. Dr. med. R. Schroers

Korreferent: Prof. Dr. med. A. Reinacher-Schick

Tag der mündlichen Prüfung: 30.01.2014

Abstract

Christoph Heute

Durchflusszytometrische Analysen des Liquor cerebrospinalis von Patienten mit primären ZNS-Lymphomen: Retrospektive Beurteilung ihrer diagnostischen Aussagekraft im Ver-gleich zur Liquorzytologie und Magnetresonanztomographie

Problem: Die Diagnostik einer meningealen Dissemination bei Patienten mit einem primärem ZNS-Lymphom (PCNSL) ist im klinischen Alltag aufgrund der geringen Sensitivität der zur Ver-fügung stehenden diagnostischen Werkzeuge eine Herausforderung. Ziel dieser Arbeit war es, den Stellenwert der Durchflusszytometrie gegenüber der Zytomorphologie und der Magnetresonanz-tomographie zu ermitteln. Ferner sollte der Einfluss von Kortikosteroiden auf den durchflusszyto-metrischen und zytomorphologischen Befund einer Meningeosis lymphomatosa analysiert werden.

Methode: Dieser Arbeit lag ein Kollektiv (n = 30) mit primärem ZNS-Lymphom (PCNSL) vom Typ der diffus großzelligen B-Zell-NHL (DLCBL) zugrunde. Bei 23 Patienten war Liquor cerebro-spinalis zum Zeitpunkt der Erstdiagnose, bei 7 Patienten bei Auftreten eines Rezidivs untersucht worden. Routinemäßig erfolgten laborchemische, durchflusszytometrische und zytomorpho-logische Untersuchungen des Liquor cerebrospinalis und jeder Patient unterlief einer Magnetreso-nanztomographie. Lymphomzellen wurden durchflusszytometrisch anhand einer aberranten Expression des Antigens CD45, einer übermäßigen Expression des Antigens CD10 und/oder einer Leichtkettenrestriktion identifiziert.

Ergebnisse: Zytomorphologisch wurde bei 4 Patienten (13,3%) und magnetresonanztomographisch bei 2 Patienten (6,7%) eine Meningeosis lymphomatosa nachgewiesen. Durchflusszytometrisch ließen sich bei 7 Patienten (23,3%) Lymphomzellen detektieren. Bei 87,5% der Patienten (7 von 8) mit durchflusszytometrischem, zytomorphologischem und/oder magnetresonanztomographischem Nachweis einer meningealen Dissemination wurde gegenüber 40,9% (9 von 22 Patienten) ohne Nachweis einer Meningeosis eine Liquorpleozytose dokumentiert. Bezüglich der Zellzahl im Liquor und dem Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa bestand ein signifikanter Zusammen-hang (p-Wert 0,015). Keine signifikante Assoziation bestand zwischen der Liquoreiweißkonzen-tration und dem Nachweis von Lymphomzellen im Liquor cerebrospinalis. In der Gruppe von Pati-enten ohne eine kortikosteroidale Medikation zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion gelang der Nachweis maligner Zellen in 7 von 16 Fällen (43,8%). Bei nur einem von 14 Patienten (7,1%) konnte in der Gruppe mit Kortikosteroiden eine Meningeosis lymphomatosa durchflusszyto-metrisch detektiert werden (p-Wert 0,024).

Diskussion: Wie bereits von verschiedenen Autoren für eine sekundäre meningeale Dissemination von aggressiven systemischen B-Zell-Lymphomen beschrieben, bewies die Durchflusszytometrie verglichen mit der konventionellen Zytomorphologie und der Magnetresonanztomographie für PCNSL eine verbesserte Sensitivität zum Nachweis von Lymphomzellen im Liquor cerebrospina-lis. Die Ergebnisse der laborchemischen Analysen der Liquorproben unterstützten die These, dass eine Pleozytose im Liquor mit dem Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa assoziiert ist und somit einen prädiktiven Parameter für eine meningeale Dissemination bei PCNSL darstellt. Zudem hatte eine kortikosteroidale Behandlung zum Zeitpunkt oder unmittelbar vor der Liquorasservation in der vorliegenden Arbeit einen negativen Einfluss auf die Nachweisbarkeit von Lymphomzellen im Liquorkompartiment bei PCNSL.

Meinen Eltern gewidmet

1

Inhaltsverzeichnis

1   Theoretische Grundlagen ................................................................................. 6  1.1   Non-Hodgkin-Lymphome ........................................................................................ 6  

1.2   Non-Hodgkin-Lymphome des ZNS .......................................................................... 7  

1.2.1   Epidemiologie .................................................................................................... 7  

1.2.2   Pathologie .......................................................................................................... 8  

1.2.3   Pathogenese und Molekularbiologie .................................................................. 9  

1.2.4   Klinische Präsentation ....................................................................................... 9  

1.2.5   Diagnostik ........................................................................................................ 10  

1.2.5.1   Neuroradiologische Präsentation .............................................................. 11  

1.2.5.2   Untersuchungen aus dem Liquor cerebrospinalis ..................................... 12  

1.2.6   Therapie ........................................................................................................... 16  

1.2.7   Prognosefaktoren ............................................................................................. 18  

2   Ziele der Arbeit .............................................................................................. 20  

3   Material und Methoden .................................................................................. 22  3.1   Patientenkollektiv ................................................................................................... 22  

3.2   Probengewinnung und Datensammlung ................................................................. 22  

3.3   Zytomorphologie und klinisch-chemische Untersuchung ...................................... 23  

3.4   Immunphänotypisierung und Durchflusszytometrie .............................................. 23  

3.4.1   Probenmaterial ................................................................................................. 23  

3.4.2   Grundlagen der Durchflusszytometrie ............................................................. 24  

3.4.3   Interpretation von durchflusszytometrischen Daten ........................................ 28  

3.4.4   Durchflusszytometrie: Durchführung und Färbeprotokolle ............................ 30  

3.4.5   Auswertung der durchflusszytometrischen Daten ........................................... 31  

3.5   Statistik ................................................................................................................... 31  

4   Ergebnisse ...................................................................................................... 33  4.1   Patienten .................................................................................................................. 33  

4.1.1   Diagnosesituation ............................................................................................. 33  

4.1.2   Histologie ......................................................................................................... 34  

4.1.3   Knochenmarkinfiltration .................................................................................. 34  

4.1.4   HIV und andere Infektionskrankheiten ............................................................ 34  

4.1.5   Therapie ........................................................................................................... 34  

4.2   Zytologische Untersuchung des Liquor cerebrospinalis ......................................... 35  

2

4.3   Durchflusszytometrie des Liquor cerebrospinalis .................................................. 35  

4.3.1   Durchflusszytometrische Kriterien zur Bewertung von Malignität ................. 36  

4.3.2   Analyse einzelner durchflusszytometrischer Parameter .................................. 38  

4.4   Vergleich der Ergebnisse von Durchflusszytometrie und Zytologie ...................... 39  

4.5   Laborchemische Untersuchung ............................................................................... 40  

4.5.1   Liquor cerebrospinalis ..................................................................................... 40  

4.5.1.1 Zellzahl im Liquor cerebrospinalis ........................................................... 40

4.5.1.2 Eiweißkonzentration im Liquor cerebrospinalis ....................................... 41

4.5.1.3 Albuminkonzentration im Liquor cerebrospinalis .................................... 42

4.5.1.4 Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis ..................................... 42

4.5.1.5 Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis ........................................ 42

4.5.2 Peripheres Venenblut ....................................................................................... 42

4.6   Radiologische Untersuchung .................................................................................. 43  

4.7   Einfluss von Kortikosteroiden auf den Befund einer Meningeosis ........................ 43  

4.8   Überleben in Abhängigkeit vom Befund einer Meningeosis lymphomatosa ......... 45  

5   Diskussion ...................................................................................................... 48  5.1   Zytomorphologischer Nachweis maligner Zellen im Liquor ................................. 48  

5.2   Durchflusszytometrischer Nachweis maligner Zellen im Liquor ........................... 49  

5.3   Zytomorphologischer und durchflusszytometrischer Nachweis eines

leptomeningealen Befalls von Patienten mit PCNSL im Vergleich ................................ 50  

5.3.1   Diskrepanz der Ergebnisse von Durchflusszytometrie und Zytomorphologie 51  

5.3.2   Relevanz von zytomorphologisch negativen und durchflusszytometrisch

positiven Ergebnissen .................................................................................................. 52  

5.3.3   Kritische Betrachtung der Untersuchungsverfahren ........................................ 52  

5.4   Konventionelle Laborparameter im Liquor cerebrospinalis ................................... 54  

5.4.1   Pleozytose ........................................................................................................ 54  

5.4.2   Liquorproteinkonzentration ............................................................................. 55  

5.4.3   Glukose- und Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis ........................ 55  

5.5   Magnetresonanztomographie .................................................................................. 56  

5.6   Einfluss von Kortikosteroiden auf den Lymphomzellennachweis im Liquor ........ 56  

5.7   Überleben der Patienten unter Berücksichtigung des leptomeningealen

Lymphomnachweises ....................................................................................................... 58  

6   Zusammenfassung ......................................................................................... 60  

7   Literaturverzeichnis ....................................................................................... 62  

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Verzeichnis der Abkürzungen

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrom

ART Anti-Retrovirale-Therapie

ASZT Autologe Stammzelltransplantation

bcl-6 B-Cell-Lymphoma-Protein 6

BSA Bovines Serumalbumin

cCT Cranielle Computertomographie

CD Cluster of Differentiation

CDR3 Complementarity Determining Region 3

CSF Cerebrospinal Fluid (Liquor cerebrospinalis)

cMRT Cranielle Magnetresonanztomographie

c-MYC Genprodukt des MYC-Gens

CT Computertomographie

DLBCL Diffuse Large B Cell Lymphoma

DNA Desoxyribonucleic Acid

DTPA Diethylene-triamine-pentaacetic-Acid

EBV Ebstein-Barr-Virus

ED Erstdiagnose

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FSC Forward Scatter

FL Fluoreszenz Gy Gray

Gd Gadolinium

Hb Hämoglobin

HBV Hepatitis-B-Virus

HCV Hepatitis-C-Virus

HD-MTX High-Dose-Methotrexate

HIV Human Immunodeficiency Virus

HTLV Humanes T-lymphotropes Virus

Ig Immunglobulin

kDa Kilodalton

Ki-67 Genprodukt des MKI67-Gens

LDH Laktat-Dehydrogenase

4

MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue

MHC Major Histocompability Complex

MMSE Mini-Mental State Examination

MRT Magnetresonanztomographie

MTX Methotrexat

MUM1 Genprodukt des MUM1-Gens

NHL Non-Hodgkin-Lymphom

NK Natural Killer

n.s. nicht signifikant

OS Overall Survival (Gesamtüberlebenszeit)

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCNSL Primary Central Nervous System Lymphoma

PCR Polymerase-Chain-Reaction

PE Phycoerythrin

PS Performance Status

Pim-1 Genprodukt des PIM1-Gens

RoH/TTF Genprodukt des RoH/TTF-Gens

SCNSL Secondary Central Nervous System Lymphoma

SSC Side Scatter

Tc Technetium

vgl. vergleiche

WHO World Health Organisation

ZNS Zentrales Nervensystem

z.Z. Zum Zeitpunkt

5

Verzeichnis der Abbildungen

Abbildung 3.1 Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers

Abbildung 3.2 Densityplot, SSC/CD45

Abbildung 3.3 Punktdiagramm, CD19/CD3

Abbildung 4.1 Nach Pappenheim gefärbte zytopathologische Präparate aus dem Liquor cerebrospinalis von PCNSL-Patienten

Abbildung 4.2 Densityplot, SSC/CD45, Patient 3

Abbildung 4.3 Punktdiagramm, CD10/CD19, Patient 2

Abbildung 4.4a Punktdiagramm, Kappa/CD19, Patient 23

Abbildung 4.4b Punktdiagramm, Lambda/CD19, Patient 23

Abbildung 4.5 Gesamtüberleben in Abhängigkeit von einer Meningeosis lymphomatosa (alle Patienten)

Abbildung 4.6 Gesamtüberleben in Abhängigkeit von einer Meningeosis lymphomatosa (Patienten ohne eine Steroidmedikation)

Verzeichnis der Tabellen

Tabelle 1.1 WHO-Klassifikation von Non-Hodgkin-Lymphomen

Tabelle 3.1 Übersicht der verwendeten Fluorochrome und Antikörper

Tabelle 3.2 Durchflusszytometrische Färbeprotokolle

Tabelle 4.1 Patientencharakteristika

Tabelle 4.2 Analyse der durchflusszytometrischen Ergebnisse

Tabelle 4.3 Vergleich von durchflusszytometrischen und zytologischen Ergebnissen

Tabelle 4.4 Liquorergebnisse für Zellzahl und Laborchemie

Tabelle 4.5 Korrelation einer Kortikosteroidmedikation mit dem Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa

6

1 Theoretische Grundlagen

1.1 Non-Hodgkin-Lymphome

Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) umfassen eine heterogene Gruppe bösartiger Tumore des

lymphatischen Systems, deren maligne Zellpopulationen sich von Zellen der Lymphopoese

ableiten (Dreyling et al., 2007). Nach der WHO-Klassifikation werden die NHL nach

zytomorphologischen, immunologischen und genetischen Merkmalen in die Kategorien

indolente, aggressive und sehr aggressive NHL eingeteilt (Tab. 1.1) (Pileri et al., 2011).

Die WHO-Klassifikation unterscheidet zunächst zwischen Lymphomen der B- und T-

Zellreihe und des Weiteren jeweils zwischen Lymphomen ausgehend von lymphatischen

Vorläuferzellen und reifzelligen Lymphomen (Jaffe et al., 2001).

Tabelle 1.1 WHO-Klassifikation von NHL (nach Jaffe et al., 2001)

B-Zell NHL T-Zell NHL

1. Indolente NHL

Chronische lymphozytische Leukämie / lymphozytisches Lymphom

Lymphoplasmozytisches Lymphom / Immunozytom / M. Waldenström

Haarzell-Leukämie

Splenisches Marginalzonenlymphom

Marginalzonen-Lymphom

Extranodales MALT-B-Zell Lymphom

Follikelzentrums-Lymphom / follikulär, Grad I

Follikelzentrums-Lymphom / follikulär, Grad II

1. Indolente NHL

Leukämie großer granulärer Lymphozyten, vom T- und NK-Zell-Typ

Mycosis fungoides / Sézary Syndrom

„Smoldering“ und chronische adulte T-Zell Leukämie / Lymphom (HTLV+)

2. Aggressive NHL

Prolymphozytenleukämie

Plasmozytom / Multiples Myelom

Mantelzell-Lymphom

Follikelzentrums-Lymphom / follikulär, Grad III

Diffuses großzelliges B-Zell Lymphom

Primäres mediastinales (thymisches) B-großzelliges Lymphom

Hochmalignes Aggressives B-Zell Lymphom, Burkitt-ähnlich

2. Aggressive NHL

Prolymphozytenleukämie

Peripheres T-Zell Lymphom

Angioimmunoblastisches Lymphom

Angiozentrisches Lymphom

Angioimmunoblastisches Lymphom

Intestinales T-Zell Lymphom

Anaplastisches großzelliges Lymphom (T- und Null Zell Typ)

7

3. Sehr aggressive NHL

Vorläuferzell B-lymphoblastisches Lymphom / Leukämie

Burkitt-Lymphom / akute B-Zell Leukämie

Plasmazell-Leukämie

3. Sehr Aggressive NHL

Vorläuferzell T-lymphoblastisches Lym-phom / Leukämie

Adultes T-Zell Lymphom / Leukämie

1.2 Non-Hodgkin-Lymphome des ZNS

Neben den Kriterien der WHO-Klassifikation ist im klinischen Alltag eine klinisch-

anatomische Einteilung nach dem Ort der primären Manifestation von Interesse. Primär im

zentralen Nervensystem (ZNS) können sich ZNS-Lymphome (PCNSL) manifestieren.

PCNSL zählen zu den extranodalen Non-Hodgkin-Lymphomen und sind durch eine primä-

re, ausschließliche Manifestation im ZNS, an den Meningen und/oder intraokulär definiert.

Sie müssen unterschieden werden von einem sekundären Lymphom des ZNS (SCNSL),

welches quasi "Metastasen" von nodalen Lymphomen darstellt (Paulus, 1999). Eine Mani-

festation außerhalb des ZNS spricht definitionsgemäß gegen ein PCNSL (Batchelor und

Loeffler, 2006; Pels und Schlegel, 2006).

1.2.1 Epidemiologie

PCNSL sind mit einem Anteil von 2-3% aller NHL (Rubenstein et al., 2008) und etwa

3-4% aller primären Hirntumoren bei immunkompetenten Patienten insgesamt selten

(Ferreri et al., 2003a; Ney und DeAngelis, 2010). Verschiedene Studien konnten zeigen,

dass die Inzidenz von PCNSL in den letzten Jahrzehnten zugenommen hat. Unklar bleibt

jedoch, ob die Inzidenzzunahme reell ist oder auf eine stetige Verbesserung diagnostischer

Verfahren wie Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) sowie

der Zunahme stereotaktischer Biopsien zurückzuführen ist (Olson et al., 2002; Kluin et al.,

2008).

Die meisten Patienten erkranken zwischen dem 45. und 70. Lebensjahr mit einem mittleren

Erkrankungsalter immunkompetenter PCNSL-Patienten zwischen dem 53. und 57. Lebens-

jahr. Männer sind annähernd zweimal häufiger betroffen als Frauen (Hochberg und Miller,

1988; Ling et al., 1994; Fine und Mayer, 1993; Reni et al., 1997).

Der einzige, bisher eindeutig etablierte Risikofaktor für PCNSL ist eine Immundefizienz.

Das relative Risiko, an einem PCNSL zu erkranken, steigt bei HIV-infizierten Personen

8

auf etwa das 1000fache, verglichen mit dem Risiko einer HIV-negativen Population

(Goplen et al., 1997; Beral et al., 1991; Coté et al., 1996).

1.2.2 Pathologie

PCNSL treten als solitäre oder, vor allem bei immunsupprimierten Patienten, als multiple

Tumoren auf. Sie lassen sich am häufigsten als ein tief im periventrikulären Parenchym

sitzender, solitärer Tumor nachweisen, welcher in 60-65% der Fälle supratentoriell loka-

lisiert ist (Herrlinger et al., 1999; Küker et al., 2005). Bei 20-40% der Patienten lassen sich

zum Zeitpunkt der Diagnose multiple Läsionen nachweisen, einen intraokulären Befall

findet man in 10-20% der Fälle (Rubenstein et al., 2008). Makroskopisch kann sich der

Tumor als ein braun, grau bis gelber, unregelmäßig begrenzter Tumor darstellen (Schlegel

et al., 2000; Commins, 2006). Ein primärer oder ausschließlicher Befall der Meningen ist

selten (Lachance et al., 1991). Die genaue Inzidenz der Meningeosis lymphomatosa ist

nicht bekannt, in 7-42% kann bei PCNSL-Patienten ein leptomeningealer Befall zytomor-

phologisch nachgewiesen werden (Batchelor et al., 2003; Ferreri et al., 2003; Jahnke et al.,

2005). Bei der Mehrzahl der PCNSL handelt es sich um B-Zell-Tumoren und in über 95%

der Fälle histopathologisch um Lymphome vom diffus-großzelligen B-Zell-Typ (DLBCL)

nach der WHO-Klassifikation (Deckert und Paulus, 2007). Der Häufigkeit nach folgen

immunoblastische B-NHL und kleinzellige Lymphome (Commins, 2006). Mit 2-8,5% aller

PCNSL sind T-Zell-Lymphome im ZNS selten (Shenkier et al., 2005; Hayabuchi et al.,

1999; Bataille et al., 2000; Ferreri et al., 2002b). Eine zunächst vermutete bessere Prognose

bei T-lineären PCNSL konnte nicht bestätigt werden (Shenkier et al., 2005).

Typischerweise zeigen PCNSL ein angiozentrisches Wachstumsmuster, mit Bildung soge-

nannter perivaskulärer Manschetten, besonders ausgeprägt im Randbereich des Tumors.

Oft findet sich ein relativ gut begrenzter Tumorrand. Typisch für PCNSL ist, dass einzelne

maligne Lymphomzellen auch in einiger Distanz zur Tumormasse gefunden werden,

welche das Parenchym infiltrieren (Commins, 2006). Nekrotische Areale innerhalb des

Tumors sind häufig (Kluin et al., 2008).

Histologisch sind PCNSL nicht von Absiedlungen systemischer NHL zu unterscheiden

(Jellinger und Paulus, 1995). Immunhistochemische Untersuchungen von Lymphomgewe-

be werden routinemäßig für CD45 (ein generelles Leukozytenantigen, das sowohl an B-,

als auch an T-Zellen bindet), CD20 (ein B-Zell-Marker) und CD3 (ein T-Zell-Marker)

angefertigt. Im Falle von PCNSL werden die großen, atypischen Lymphozyten durch

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Antikörper gegen CD19, CD20 und CD79 markiert, wohingegen der CD3-Antikörper klei-

ne, reaktive T-Lymphozyten im Präparat spezifisch anfärbt (Schlegel et al., 2000; Com-

mins, 2006). Die Tumorzellen können zudem CD10 exprimieren, wohingegen Plasma-

zellmarker wie CD38 und CD138 fehlen (Deckert, 2011).

1.2.3 Pathogenese und Molekularbiologie

Die Entstehung von PCNSL bei immunkompetenten Patienten ist bisher weitgehend

unbekannt. Da im gesamten ZNS kein originäres lymphatisches Gewebe vorliegt, bleibt

die Frage der histogenetischen Abstammung der neoplastischen Lymphozyten letztlich

bestehen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, PCNSL stammten von B-Zellen aus dem

systemischen lymphatischen Gewebe ab, welche auch unter physiologischen Umständen in

der Lage sind, in das ZNS zu migrieren (DeAngelis und Yahalom, 1997). Molekularbio-

logisch konnten für PCNSL neben einer höheren Mutationsfrequenz einer Reihe von aber-

ranten somatischen Hypermutationen verschiedener Protoonkogenen, wie Pim-1,

RhoH/TTF und c-MYC (Montesinos-Rongen et al., 2004), auch besondere Kombinationen

von B-Zell-Markern, wie zum Beispiel MUM-1 und Bcl-6 beschrieben werden, welche sie

möglicher-weise von extrazerebralen Lymphomen unterscheiden (Lin et al., 2006;

Camilleri-Broët et al., 2006; Rubenstein et al., 2006).

Bei immunsupprimierten Patienten scheint die Entstehung von PCNSL in mehr als 95%

mit dem Ebstein-Barr-Virus (EBV) assoziiert zu sein (Rubenstein et al., 2008; Paulus et

al., 1993; Larocca et al., 1998). Eine Assoziation von PCNSL mit EBV konnte bei

immunkompetenten Patienten nicht nachgewiesen werden. (Camilleri-Broët et al., 1997;

MacMahon et al., 1991; Geddes et al., 1992; Morgello, 1992; Hamilton-Dutoit et al., 1993;

Itoyama et al., 1994; Antinori et al., 1997).

1.2.4 Klinische Präsentation

Die vielen Möglichkeiten der klinischen Präsentation und die eingeschränkten, da haupt-

sächlich invasiven diagnostischen Maßnahmen, machen das PCNSL zu einer diagnosti-

schen Herausforderung (Chen und Abrey, 2006).

Entsprechend dem diffus-infiltrierenden Wachstumsmuster von PCNSL und der häufigen

periventrikulären Lokalisation, werden die klinischen Symptome in circa der Hälfte der

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Fälle von kognitiven Einschränkungen, psychomotorischer Verlangsamung, Persönlich-

keitsveränderung und Desorientiertheit bestimmt (Herrlinger et al., 1999; Braus et al.,

1992). Ähnlich häufig weisen Patienten Symptome eines erhöhten intrakraniellen Drucks,

wie Kopfschmerzen und Übelkeit, auf. Die häufigsten fokal-neurologischen Defizite sind

Hemiparesen in 40-50%, Ataxie und/oder andere zerebelläre Symptome (Herrlinger et al.,

1999; Fine und Mayer, 1993). Bei 5-31% der Patienten kommt es zu Hirnnervenausfällen,

die durch eine meningeale Aussaat von Tumorzellen erklärt werden (Herrlinger et al.,

1999). Ein Befall des Glaskörpers oder retinaler Strukturen durch das Lymphom findet

sich bei 10-20% der Erkrankten (DeAngelis, 2001; Ferreri et al., 2002a; Gavrilovic und

Abrey, 2005). Die Frequenz (symptomatischer) epileptischer Anfälle zum Zeitpunkt der

Diagnose wird mit 2-33% angegeben (Herrlinger et al., 1999) und liegt höher bei Patienten

mit AIDS (Fine und Mayer, 1993).

1.2.5 Diagnostik

Die Diagnostik eines ZNS-Lymphoms beinhaltet routinemäßig eine kranielle Magnet-

resonanztomographie (cMRT), eine augenärztliche Untersuchung sowie eine Computer-

tomographie (CT) von Thorax, Abdomen und Becken, eine Ultraschalluntersuchung der

Testes und eine Knochenmarkbiopsie zum Ausschluss einer extrazerebralen Lymphomma-

nifestation (Abrey et al., 2005). Darüber hinaus sollte bei Fehlen eines erhöhten Hirn-

drucks mit dem Ziel des zytologischen Nachweises maligner Zellen immer eine Lumbal-

punktion durchgeführt werden.

Zur histologischen Diagnosesicherung ist die stereotaktische Biopsie der Läsion geeignet

(Herrlinger et al., 1999; Fine und Mayer, 1993). Eine offene neurochirurgische Interventi-

on erbringt nach Bataille et al. keine besseren Ergebnisse als die stereotaktische Biopsie.

Stattdessen führt eine partielle Resektion des Tumors eher zu einer Prognoseverschlechte-

rung (Bataille et al., 2000). Im Falle eines okulären Befalls kann auch über eine Vitrek-

tomie eine histologische Diagnose erreicht werden (Abrey et al., 2005; Schlegel et al.,

2000). Ein HIV-Test ist in der Diagnostik des PCNSL unbedingt erforderlich, da diese

Infektion einen wichtigen Risikofaktor für die Erkrankung darstellt und therapeutische

Konsequenzen hat (Beral et al., 1991; Coté et al., 1996; Goplen et al., 1997). Für die The-

rapieplanung und die sichere Anwendung zytostatischer Medikamente wie Methotrexat,

Cytarabin oder alkylierender Substanzen sind in der vorbereitenden Diagnostik die Nieren-

und Leberfunktion von Bedeutung (Abrey et al., 2005).

11

Die Dokumentation kognitiver Funktionen ist sowohl für die Beurteilung des therapeuti-

schen Erfolgs, als auch als Monitoring für therapiebedingte neurokognitive Beeinträchti-

gung wichtig. Empfohlen wird hierzu als Mindestanforderung der Mini-Mental-Status

(Abrey et al., 2005).

Auf die Gabe von Steroiden sollte vor Diagnosesicherung wenn immer möglich verzichtet

werden. Dexamethason führt bei 15% der Patienten zu einem kompletten Verschwinden

und bei 25% der Patienten zu einer deutlichen Abnahme der Tumormasse. Bei der histo-

logischen Begutachtung von Gewebeproben, die im Anschluss an eine Steroidapplikation

entnommen wurden, findet sich häufig lediglich gliotisch verändertes Hirnparenchym, was

eine histologische Diagnosesicherung sehr erschweren und bisweilen unmöglich machen

kann (Weller, 1999). Das besondere Ansprechen auf Kortikosteroide kann jedoch auch als

diagnostischer Hinweis für das Vorliegen eines PCNSL dienen, da es für diesen Tumor

sehr charakteristisch, allerdings nicht pathognomonisch ist. Auch andere ZNS-Prozesse,

wie zum Beispiel Gliome, eine Multiple Sklerose oder Sarkoidose, können ein ähnliches

Ansprechen auf Kortikosteroide zeigen (Zaki et al., 2004; Schlegel et al., 2000; Abrey et

al., 2005).

1.2.5.1 Neuroradiologische Präsentation

Den neuroradiologischen Goldstandard sowohl für die Diagnose eines ZNS-Lymphoms,

als auch für Verlaufskontrollen stellt die native und kontrastmittelgestützte Magnetreso-

nanztomographie des Gehirns (cMRT) dar. Die cMRT hat auf Grund einer höheren Sensi-

tivität die kranielle Computertomographie (cCT) weitestgehend abgelöst (Schlegel et al.,

2000). Lediglich bei Kontraindikationen für eine cMRT sollte eine cCT erfolgen

(Baraniskin et al., 2011). In der cMRT imponiert in der T1-gewichteten Darstellung

zumeist eine homogene, zum Kontext iso- bis hypointense Raumforderung. Im T2-

gewichteten Bild kommt in mehr als 90% um die hyperintense Läsion ein ebenfalls hyper-

intens erscheinendes perifokales Ödem zur Darstellung (Küker et al., 2005; Bühring et al.,

2001). Nach intravenöser Gabe von Gadolinium nehmen die Läsionen typischerweise ho-

mogen Kontrastmittel auf (Küker et al, 2005). Insbesondere bei immunkompromittierten

Patienten können die multiplen Läsionen auch eine ringförmige Kontrastmittelaufnahme

zeigen. Die geringe Spezifität der cMRT erschwert die differentialdiagnostische Einord-

nung der Läsionen und macht eine sichere neuroradiologische Abgrenzung von anderen

12

Hirntumoren, wie Metastasen oder Glioblastomen, aber auch von entzündlichen oder in-

fektiösen Prozessen unmöglich (Ciricillo und Rosenblum, 1990; Bataille et al., 2000).

Ein Großteil der ZNS-Lymphome ist supratentoriell gelegen (80-90%). In 60% weisen sie

eine Lokalisation im periventrikulären Marklager des Frontal- und Parietallappens oder

auch in den tiefen Hirnstrukturen, wie dem Thalamus oder den Basalganglien auf (Küker et

al, 2005; Dina, 1991). In 28-75% der Fälle zeigen die Läsionen einen ependymalen Kon-

takt (Johnson et al., 1997; Jack et al., 1988), was genauso wie ein diffuses Kontrast-

mittelenhancement der Meningen auf einen Befall des Liquorkompartiments hindeuten

kann (Küker et al., 2005).

Szintigraphische Untersuchungen mit 111Indium-DTPA oder 99Tc-DTPA sind die Tech-

nik der Wahl zur Untersuchung von Liquorzirkulationsstörungen, welche bei 30-70% der

Patienten mit Meningeosis lymphomatosa nachgewiesen werden konnten (Chamberlain

und Corey-Bloom, 1991; Chamberlain und Kormanik, 1996; Chamberlain et al., 1999;

Glantz et al., 1995; Mason et al., 1998). Die Obstruktionen lagen gewöhnlich im Bereich

der Schädelbasis, des Spinalkanals oder über den Hemisphärenkonvexitäten. In einigen

klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass das Überleben von Patienten mit in der

Radionukleotid-Ventrikulographie gezeigtem Liquorzirkulationsdefizit, verglichen mit

dem von Patienten ohne Zirkulationsstörung, verkürzt war (Glantz et al., 1995; Chamber-

lain und Kormanik, 1996).

1.2.5.2 Untersuchungen aus dem Liquor cerebrospinalis

Grundsätzlich sollte bei Patienten mit der Erstdiagnose eines ZNS-Lymphoms, im Falle

eines Rezidivs oder bei Verdacht auf eine Meningeosis lymphomatosa eine Gewinnung

von Liquor cerebrospinalis erfolgen, insofern keine Kontraindikationen, wie ein erhöhter

intrakranieller Druck oder eine Liquorzirkulationsstörungen, bestehen. Ein Befall der

Meningen ist bei Patienten mit einem PCNSL nicht selten und konnte bei 80% der

PCNSL-Patienten im Rahmen einer histopathologischen Arbeit post-mortem nachgewiesen

werden (Onda et al., 1999).

Der zytomorphologische Nachweis von malignen Zellen im Liquor wird nach wie vor von

verschiedenen Autoren als Goldstandard zur Diagnose einer Meningeosis lymphomatosa

angesehen und soll auch in dieser Arbeit als Referenzmethode gelten (Abrey et al., 2005;

Korfel et al., 2012). Methodische Neuerungen wie die Immunphänotypisierung von Zellen

mittels Durchflusszytometrie, aber auch proteochemische und molekulargenetische Analy-

13

sen von Liquor haben die Diagnostik einer Meningeosis lymphomatosa im letzten Jahr-

zehnt hilfreich ergänzt (Baraniskin et al., 2011). Kiewe et al. definierten 2010 eine

Meningeosis lymphomatosa bei Vorliegen einer der folgenden Befunden: eindeutiger

zytomorphologischer Nachweis von Lymphomzellen im Liquor, immunzytologische oder

durchflusszytometrische Detektion einer monoklonalen B-Zellpopulation bzw. Nachweis

einer Leichtkettenrestriktion, das Vorhandensein eines dominanten Amplikons in der PCR

oder der Nachweis eines meningealen Befalls mittels cMRT (Kiewe et al., 2010).

Klinisch-chemische Analysen des Liquor cerebrospinalis

Grundlegende pathologische Veränderungen des Liquor cerebrospinalis umfassen eine

erhöhte Leukozytenzahl (> 4/mm3), einen erhöhten Proteingehalt (> 50 mg/dl) sowie eine

verminderte Konzentration an Glukose (< 60 mg/dl). Dabei handelt es sich zunächst um

Parameter, anhand derer zwar eine Meningeosis lymphomatosa vermutet, jedoch keines

Falls bewiesen werden kann. Bei Erstdiagnose eines PCNSL weisen ca. 35-75% der

Patienten erhöhte Zellzahlen im Liquor auf, die Eiweißkonzentration ist bei 54-85% der

Patienten erhöht und eine verminderte Glukosekonzentration wird bei 0-13% der Patienten

gemessen (Helle et al., 1984; Hayakawa et al., 1994; Herrlinger et al., 1998; Henry et al.,

1974; Bogdahn et al., 1986; Balmaceda et al., 1995).

Als Ursache einer Liquorpleozytose kommt neben einer neoplastischen beziehungsweise

monoklonalen Zellvermehrung, auch eine reaktive Proliferation vor allem von

T-Lymphozyten im Rahmen eines immunologischen Geschehens in Betracht, was mitunter

für die uneinheitlichen Ergebnisse bezüglich der Korrelation einer Pleozytose mit dem

Nachweis einer Meningeosis verantwortlich ist.

Ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Proteinkonzentration im Liquor und einer

Meningeosis wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Von einigen Autoren wird eine

erhöhte Proteinkonzentration als Indikator für eine Meningeosis angesehen (Balmaceda et

al., 1995; DeAngelis et al., 2002), wohingegen andere keinen Zusammenhang erkennen

konnten (Ferreri et al., 2003b; Fischer et al., 2006). Erhöhte Proteinkonzentrationen im

Liquor können zum einen für eine größere Tumormasse sprechen (Ferreri et al., 2003b),

zum anderen jedoch auch einen unterschiedlichen Schädigungsgrad der Blut-Hirn-

Schranke widerspiegeln oder im Zusammenhang mit einer zuvor stattgehabten Biopsie

stehen.

14

Zytomorphologie

Sowohl die Spezifität, als auch die Sensitivität der Zytomorphologie, basierend auf nach

Pappenheim gefärbten Präparaten, ist gering. In der Literatur wird mit 7-42% eine weite

Spanne zytomorphologisch ermittelter Inzidenzraten einer Meningeosis bei PCNSL-

Patienten angegeben (Batchelor et al., 2003; Ferreri et al., 2003b; Jahnke et al., 2005).

Darüber hinaus wurde von einer großen Zahl falsch-negativer wie auch falsch-positiver

Ergebnisse der Zytomorphologie in verschiedenen Arbeiten berichtet (Jahnke et al., 2005;

Glass et al., 1979).

Falsch-negative Ergebnisse können durch eine zu geringe Anzahl von Tumorzellen im

Liquor hervorgerufen werden. Dieses kann Folge zu geringer Probevolumina oder nicht

wiederholter Probeentnahmen sein, aber auch iatrogen durch den Einsatz von Kortiko-

steroiden vor der Liquorentnahme verursacht sein (Glantz et al., 1998a; Balmaceda et al.,

1995). Die Fehlinterpretation von reaktiven Lymphozyten als Blasten-typische Zellen stellt

eine Ursache falsch-positiver Untersuchungsergebnisse dar (Weller, 1999; Cartmill et al.,

2000; Haldorsen et al., 2005).

Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine weitgehend objektive Methode zur Differenzierung und

Quantifizierung von Zellpopulationen anhand ihres Phänotypus (Ward, 1999); die Methode

ist heutzutage unverzichtbar in der Diagnostik von Leukämien und Lymphomen. Für einen

Befall des Liquorkompartiments durch ein ZNS-Lymphom spricht der Nachweis von mo-

noklonalen Lymphozytenpopulationen im Liquor, welche anhand von Größe, Granularität

und Antigenexpression von reaktiven Lymphozyten unterschieden werden können (Schro-

ers et al., 2010b).

Gegenüber der Zytomorphologie erwies sich die Durchflusszytometrie in verschiedenen

Arbeiten als sensitivere Methode zum Nachweis maligner Zellen gegenüber der Zytomor-

phologie (Finn et al., 1998; French et al., 2000; Hedge et al., 2005; Bromberg et al., 2007).

Hedge et al. konnten zeigen, dass auch kleine Subpopulationen monoklonaler Zellen, wel-

che lediglich einen Anteil von 0,2% an der Gesamtzellzahl im Liquor cerebrospinalis aus-

machten, durchflusszytometrisch nachweisbar sind. Hingegen lassen sich zytomorpholo-

gisch maligne Zellen typischerweise in Fällen mit einer Liquorpleozytose und einem An-

teil maligner Zellen von mindestens 5% detektieren (Finn et al., 1998; French et al., 2000;

Tani et al., 2005; Stetler-Stevenson and Braylan, 2001).

15

Liquor-Protein-Diagnostik

Verschiedene Liquorproteine, wie unter anderen die lösliche Form von CD27 (sCD27),

Antithrombin und freie Immunglobulinleichtketten wurden als mögliche Marker für ein

ZNS-Lymphom beschrieben, zählen jedoch noch nicht zu den klinischen Routineverfahren

in der Diagnostik. sCD27 ist ein lymphozyten-spezifisches Protein aus der TNF-Rezeptor-

Familie und wird von T-Zellen und malignen B-Zellen exprimiert. Von Kersten et al. wur-

de für die Detektion eines meningealen Befalls bei Patienten mit einer akuten lymphati-

schen Leukämie oder einem NHL eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 82%

nachgewiesen (Kersten et al., 1996). Andere Autoren berichteten jedoch, dass auch im Fal-

le einer infektiösen oder entzündlichen ZNS-Erkrankung aktivierte B- und T-Zellen ver-

mehrt CD27 exprimieren, was Zweifel an der Spezifität dieses Markers aufkommen lässt

(Hintzen et al., 1991; Murase et al., 2000).

Anhand der proteomisch bestimmten Quantifikation von Antithrombin im Liquor konnte

in einer von Roy et al. vorgestellten Arbeit mit einer Sensitivität von 75% und Spezifität

von 98% zwischen Patienten mit einem PCNSL und einer Kontrollgruppe ohne maligne

Erkrankung unterschieden werden (Roy et al., 2008). Abschließend ist jedoch nicht ge-

klärt, ob eine erhöhte Konzentration von Antithrombin im Liquor auf eine vermehrte Pro-

duktion in Lymphomzellen zurückzuführen ist oder lediglich mit einer unspezifischen

Schädigung der Bluthirnschranke einhergeht (Baraniskin et al., 2011).

Ob ein Missverhältnis zwischen den Konzentrationen von κ- und λ- Immunglobulin-

Leichtketten im Liquor als Indikator für ein B-Zell-Lymphom im ZNS dient, wurde von

den Arbeitsgruppen um Hildebrandt und Schroers untersucht (Hildebrandt et al., 2007;

Schroers et al., 2010a). In einer Patientenkohorte mit unterschiedlichen Lymphomerkran-

kungen konnten Hildebrandt et al. bei Patienten mit zytomorphologisch nachgewiesener

Meningeosis lymphomatosa signifikant häufiger eine Leichtkettenrestriktion beziehungs-

weise eine pathologische κ-λ-Ratio nachweisen, als bei Patienten ohne Nachweis einer

Meningeosis. Die Autoren errechneten eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von

67% (Hildebrandt et al., 2007). Schroers et al. konnten bei 11 (52%) von 21 Patienten mit

PCNSL und SCNSL unabhängig vom zytomorphologischen Nachweis einer Meningeosis

eine Leichtkettenrestriktion nachweisen, und damit häufiger als in einer Kontrollgruppe

aus Patienten mit verschiedenen nicht-neoplastischen neurologischen Erkrankungen

(Schroers et al., 2010a).

16

Molekulargenetik

Während der B-Zellentwicklung kommt es unter anderem zu einem komplexen Rearran-

gement und zur Hypermutation der für die schweren Ketten der Immunglobuline (IgH)

kodierenden Gene. Hieraus resultiert eine Kombination der variablen (V), diversity (D)

und joining (J) Gensegmente, welche die CDR (CDR= complementarity determining regi-

on) des IgH bilden und für jeden Lymphozyten spezifisch sind (van Dongen und Wolvers-

Tettero, 1991; Potter et al., 1993). Molekulargenetisch können diese mittels einer Poly-

merase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und elektrophoretisch dargestellt werden. Fin-

det sich nun eine gewisse Anzahl monoklonaler Lymphozyten in einer Liquorprobe, so

zeigen sich für verschiedene PCR-Produkte sogenannte monoklonale Peaks, welche aus

der „Baseline“, dem Hintergrundrauschen, hervorstechen.

In verschiedenen Arbeiten konnte belegt werden, dass eine PCR der IgH-CDR-III-Region

zur Detektion von monoklonalen B-Zell-Populationen im Liquor cerebrospinalis von Pati-

enten mit einem PCNSL oder einer sekundären Meningeosis lymphomatosa geeignet ist

(Galoin et al., 1997; Rhodes et al., 1996). Die Aussagekraft eines positiven Ergebnisses der

IgH-CDR-III-PCR ist aufgrund einer hohen Rate diskordanter Ergebnisse bei einem Ver-

gleich mit Befunden der Zytomorphologie in verschiedenen Studien jedoch weiterhin frag-

lich (Gleissner et al., 2002; Fischer et al., 2008; Kiewe et al., 2010). Probleme dieser Me-

thode, welche zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen können, sind 1)

die Schwierigkeit, DNA von guter Qualität zu isolieren, 2) das Auftreten falsch-

monoklonaler Ergebnisse aufgrund niedriger Zellzahlen in normalem oder reaktiv-

verändertem Liquor („Pseudomonoklonalität“) und 3) das Vorliegen nur geringer Mengen

isolierter DNA oder eine DNA-Schädigung (Gleissner et al., 2002). Darüber hinaus können

falsch negative Ergebnisse durch eine, verglichen mit nodalen diffus-großzelligen B-Zell-

Lymphomen, hohe Mutationsfrequenz der PCNSL resultieren, welche durch weitere

Punktmutationen die Primerhybridisierung verhindern können (Montesinos-Rongen et al.,

1999; Thompsett et al., 1999).

1.2.6 Therapie

PCNSL haben unbehandelt eine schlechte Prognose. Wie auch bei systemischen Formen

von NHL stehen zur Therapie von PCNSL Zytostatika und eine - in Ausnahmesituationen -

Radiotherapie zur Verfügung. Die chirurgische Intervention stellt keine adäquate Thera-

pieoption dar und ist allenfalls in der Behandlung von Komplikationen in sehr seltenen

17

Ausnahmefällen, wie zum Beispiel einer drohenden Einklemmung bei einem ausgeprägten

Masseneffekt durch das PCNSL, zu erwähnen (Gerstner und Batchelor, 2010).

Eine Ganzhirnbestrahlung galt, trotz des Mangels an Daten aus prospektiven Studien, für

Jahre als Therapie der Wahl zur Behandlung von PCNSL (DeAngelis, 2001). Aufgrund der

nicht zufriedenstellenden Ergebnisse der alleinigen Strahlentherapie wurde der Ganzhirn-

bestrahlung eine systemisch-applizierte Chemotherapie zur Verbesserung des Gesamtüber-

lebens hinzugefügt. Der Folsäureantagonist Methotrexat (MTX) etablierte sich als Zytosta-

tikum mit der besten Wirksamkeit im Rahmen der kombinierten Therapieregime (Ferreri et

al., 2003a). Da kombinierte Therapieregime mit einer erhöhten Neurotoxizität einhergin-

gen, wurden mit dem Ziel neurotoxische Effekte zu senken und die Überlebensraten zu

verbessern, Protokolle mit alleiniger Chemotherapie untersucht (Pels et al., 2003; Soussain

und Hoang-Xuan, 2009). MTX in variierender Dosierung und verschiedenartiger Applika-

tion stellt die wesentliche Basissubstanz in den zurzeit untersuchten polychemotherapeuti-

schen Regimen dar (Schäfer et al., 2012). Durch Kombination von MTX und Cytarabin

konnten zum Beispiel Ansprechraten mit kompletter Remission von 18% auf 46% angeho-

ben werden (Ferreri et al., 2009).

Mit der Integration von intrathekal/intraventrikulär appliziertem MTX in systemische

Chemotherapieregime wurde der Versuch unternommen, im Falle einer Meningeosis lym-

phomatosa zytotoxische Wirkspiegel im Liquorkompartiment über einen längeren Zeit-

raum aufrecht zu erhalten (Glantz et al., 1998b; Bleyer et al., 1978). Auch Rituximab, ein

monoklonaler Antikörper gegen das Lymphozytenoberflächenantigen CD20, zeigte sowohl

als Bestandteil einer systemischen Polychemotherapie (Fu et al., 2008, Birnbaum et al.,

2012), als auch für den intrathekalen Gebrauch bei Patienten mit nachgewiesenem menin-

gealem Befall eines B-Zell-NHL eine moderate Wirkung (Rubenstein et al., 2007). So

konnte eine Phase-II-Studie für die Kombination von Rituximab (500mg/m2) mit einer

MTX-basierten Chemotherapie ein Ansprechen mit kompletter Remission in 78% der Fälle

zeigen (Shah et al., 2007).

Des Weiteren besteht die Möglichkeit einer intensivierten Chemotherapie mit anschließen-

der autologer Stammzelltransplantation (ASZT) als first-line Therapie des PCNSL. Eine

Studie mit einer Hochdosischemotherapie und anschließender ASZT mit Verzicht auf eine

konsolidierende Ganzhirnbestrahlung erbrachte vielversprechende Ergebnisse (Illerhaus et

al., 2008).

18

1.2.7 Prognosefaktoren

Zur Risikostratifizierung von PCNSL-Patienten wurde von der „International Extranodal

Lymphoma Study Group (IELSG)“ im Jahr 2003 ein Scoring-System vorgeschlagen, wel-

ches die Patienten zur besseren Vorhersagbarkeit des Gesamtüberlebens einer von drei

Risikogruppen zuordnet. Fünf unabhängige patienten- und lymphomassoziierte Faktoren

konnten hier identifiziert werden: Alter, Allgemeinzustand (Performance Status), Serum-

LDH-Konzentration, Gesamtproteinkonzentration im Liquor und die Beteiligung tiefer

Hirnregionen, wie Thalamus oder Basalganglien (Ferreri et al., 2003b). Zuvor konnten in

verschiedenen Studien nur Alter und Performance Status als unabhängige prognostische

Faktoren beschrieben werden. Lebensalter unter 60 Jahren und ein guter Allgemeinzustand

stellten hier einen starken Überlebensvorteil dar (DeAngelis et al., 1992; Reni et al., 1997;

Blay et al., 1998; Corry et al., 1998).

Auch bei einer Untersuchung von 338 Patienten mit erstdiagnostiziertem PCNSL am Me-

morial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) konnten nur Alter und Performance Sta-

tus in der Multivarianzanalyse als unabhängige prognostische Faktoren identifiziert werden

(Abrey et al., 2006). Hieraus wurden drei Risikogruppen abgeleitet: Patienten < 50 Jahre,

Patienten ≥ 50 Jahre mit einem Karnofsky-Index von ≥ 70 und Patienten mit ≥ 50 Jahre mit

einem Karnofsky-Index von < 70.

Diese Prognosefaktoren sind mit basisdiagnostischen Maßnahmen oder während der klini-

schen Untersuchungen zu bestimmen und bedürfen keiner aufwändigen Diagnostik. Dane-

ben gilt der Suche nach biologischen Markern, welche eine Aussage zur Prognose von

PCNSL erlauben, weiterhin große wissenschaftliche Aufmerksamkeit. In diesem Zusam-

menhang zeigten Braaten et al., dass die Expression des Proto-Onkogens BCL-6 mit einer

verbesserten Prognose korreliert. Sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das

Gesamtüberleben waren bei Patienten mit einem PCNSL mit BCL-6 Expression länger

(Braaten et al., 2003).

Ferner geht ein radiologisch nachweisbares Ansprechen auf Kortikosteroide bei Erstdiag-

nose eines PCNSL mit einer besseren Prognose einher. In einer Arbeit von Mathew et al.

überlebten Patienten mit radiologisch nachgewiesenem Ansprechen auf eine kortikosteroi-

dale Medikation mit einem medianen Überleben von 117 Monaten länger gegenüber

5,5 Monaten von Patienten, welche nicht auf Kortikosteroide ansprachen (Mathew et al.,

2006).

19

Die prognostische Bedeutung einer Meningeosis lymphomatosa bei PCNSL ist zum

jetzigen Zeitpunkt letztlich nicht geklärt. Während Blay et al. ein schlechteres Gesamtüber-

leben für Patienten mit nachgewiesener Meningeosis lymphomatosa beschrieben (Blay et

al., 1998), beobachteten andere Autoren hier keinen signifikanten Unterschied (Balmaceda

et al., 1995; Ferreri et al., 2003b; Abrey et al., 2006; Korfel et al., 2012).

20

2 Ziele der Arbeit

Primäre ZNS-Lymphome (PCNSL) nehmen sowohl bei immunsupprimierten als auch bei

immunkompetenten Menschen an Häufigkeit zu. Diese Tumoren sind strahlen- und

chemosensibel. In den letzten Jahren hat sich die Prognose für Patienten mit PCNSL auf-

grund Neuerungen in der Therapie verbessert. Voraussetzung für die erfolgreiche Behand-

lung von PCNSL ist eine möglichst zeitnahe und exakte Diagnosestellung. Trotz deutlicher

Fortschritte der radiologischen Verfahren ist bis heute bei nahezu allen Patienten eine

histopathologische Begutachtung von Hirngewebe in der Diagnostik von ZNS-

Lymphomen erforderlich. Die hierzu notwendige neurochirurgische Biopsie von Hirnge-

webe kann für den Patienten belastend sein.

Bei einem Teil der Patienten liegt eine meningeale Lymphombeteiligung vor, die durch

routinemäßige zytomorphologische Untersuchung des Liquor cerebrospinalis diagnostiziert

werden kann. In Ergänzung zu diesen zytomorphologischen Untersuchungen werden routi-

nemäßig laborchemische Untersuchungen (Liquorzellzahl, Glukosegehalt, Gesamteiweiss-

gehalt, Immunglobuline, oligoklonale Banden, etc.) durchgeführt. Die Liquorzellen werden

außerdem immunphänotypisch mittels Durchflusszytometrie untersucht. Maligne Zellen

lassen sich zum Zeitpunkt der Erstdiagnose in ca. 20 bis 30% aller Patienten nachweisen.

Ihr Nachweis ist oft schwierig, besonders bei niedriger Zellzahl im Liquor oder reaktiver

Lymphozytose.

Verschiedene Arbeiten deuten daraufhin, dass die Sensitivität zum Nachweis maligner

Zellen im Liquor cerebrospinalis von Patienten mit aggressiven B-Zell-NHL und anderen

malignen hämatologischen Erkrankungen durch die Durchflusszytometrie gesteigert wer-

den kann.

Im Rahmen dieser Dissertation sollten die Ergebnisse der routinemäßigen zytologischen

und immunphänotypischen Analysen aus dem Liquor cerebrospinalis von Patienten mit

einem primären ZNS-Lymphom (PCNSL) hinsichtlich ihrer diagnostischen Aussagekraft

retrospektiv verglichen werden und darüber hinaus mit den Ergebnissen der laborchemi-

schen und radiologischen Untersuchungen korreliert werden.

Ferner sollte der Einfluss einer Medikation mit Glukokortidoiden zum Zeitpunkt der

Liquorentnahme auf den Nachweis von Lymphomzellen im Liquor untersucht werden. Es

21

ist bekannt, dass Kortikosteroide einen zytotoxischen Effekt auf PCNSL haben und die

histologische Diagnosesicherung erschweren, in einzelnen Fällen sogar unmöglich

machen. Zur Beurteilung, inwiefern der immunphänotypische und zytomorphologische

Nachweis maligner Zellen im Liquor cerebrospinalis beeinflusst wird, sollte diesbezüg-

lich eine Auswertung der Daten erfolgen.

22

3 Material und Methoden

3.1 Patientenkollektiv

Der Arbeit lag ein Kollektiv von 30 Patienten mit einem primären ZNS-Lymphom

(PCNSL) zu Grunde (vgl. Tab. 4.1). Die Patienten befanden sich zur Behandlung in der

Neurologischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses in Bochum-Langendreer. Die his-

tologische Diagnosesicherung und Staging-Untersuchungen erfolgten gemäß der WHO-

bzw. Revised European-American Lymphoma-Klassifikation (Harris et al., 1994; Gatter

und Warnke, 2001; Abrey et al., 2005). In allen Fällen erfolgte die histologische Diagnose-

sicherung nach Biopsie der Raumforderung im ZNS. Ohne Ausnahme lagen histopatholo-

gisch diffus großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL) vor. Alle Patienten wurden seronega-

tiv für das Humane-Immundefizienz-Virus (HIV-1) getestet. Die Untersuchung wurde mit

einem positiven Votum der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt.

3.2 Probengewinnung und Datensammlung

Im Zeitraum von 08/2008 bis 01/2010 wurden zeitgleich Liquor- und Serumproben von 30

Patienten mit einem PCNSL gewonnen. Die Probenentnahmen und die angeschlossenen

Untersuchungen erfolgten nach Aufklärung und mit dem Einverständnis der Patienten. Der

Liquor wurde nach neuroradiologischem Ausschluss eines großen intrakraniellen Tumors

und eines erhöhten intrakraniellen Drucks mittels diagnostischer Lumbalpunktion von ver-

schiedenen Assistenzärzten/-innen der Neurologischen Klinik des Knappschaftskranken-

hauses in Bochum-Langendreer entnommen und asserviert. Zeitgleich zur Liquorgewin-

nung wurde von allen Patienten peripheres Venenblut entnommen. Die klinisch-chemische

Routinediagnostik und die durchflusszytometrischen Analysen wurden im Labor des

Knappschaftskrankenhauses in Bochum-Langendreer durchgeführt. Ein Großteil der Pro-

ben wurde routinemäßig von den medizinisch-technischen Assistenten/-innen im Labor des

Universitätsklinikum Bochum-Langendreer gemessen. An den durchflusszytometrischen

Analysen der Patienten im Zeitraum 12/2008 bis 06/2009 hatte ich nach Einweisung durch

meinen Doktorvater Prof. Dr. med. R. Schroers im Rahmen meines praktischen Jahres zu-

nächst assistierend, im Verlauf maßgeblich Anteil (Patienten 7-17, 20, 27, 28; vgl.

Tab. 4.1). Die Zellzahlen im Liquor wurden im Liquorlabor des Universitätsklinikum

Bergmannsheil in Bochum bestimmt. Eine zytomorphologische Begutachtung der Liquor-

23

proben wurde im pathologischen Institut der Universitätsklinik Köln (Prof. Dr. med.

M. Deckert) vorgenommen.

Im Liquor cerebrospinalis wurden regelmäßig folgende Laborparameter bestimmt:

Zellzahl, Eiweiß, Glukose, Laktat, Albumin und Immunglobuline der Klassen IgG, IgM

und IgA.

Im peripheren Venenblut wurden die folgenden Laborparameter bestimmt:

Hämoglobinwert (Hb), Leukozyten-, Lymphozyten- und Thrombozytenzahl, Laktat-

dehydrogenase (LDH), Albumin, gesamtes Eiweiß, sowie ebenfalls die Immunglobuline

der Klassen IgG, IgM und IgA.

Folgende klinische Daten wurden von mir zusammengetragen und im Rahmen dieser

Arbeit berücksichtigt: Geburtsdatum, Geschlecht, Diagnose und Diagnosesituation (Erstdi-

agnose, Rezidiv), Zeitpunkt der Erstdiagnose, Histologie, Zeitpunkt der Probenentnahme,

bereits erhaltene Therapien sowie im Speziellen eine eventuelle Kortikosteroidmedikation

zum Zeitpunkt der Untersuchung. Als Ende des Beobachtungszeitraumes galt das Datum

der letzten Vorstellung bzw. der Todeszeitpunkt. Die Datenerhebung endete in 03/2010.

3.3 Zytomorphologie und klinisch-chemische Untersuchung

Für die zytomorphologische Untersuchung wurden die Zellen aus 2 ml unverdünntem

Liquor von den medizinisch-technischen Assistenten aus dem Labor des Universitätsklini-

kum Bochum-Langendreer durch Zentrifugation (200 x g für 10 min.) vorkonzentriert und

die Zellsuspension anschließend direkt auf einen Objektträger zentrifugiert, luftgetrocknet

und schließlich nach dem May-Grünwald-Giemsa-Protokoll (Pappenheim-Färbung)

gefärbt. Die Präparate wurden jeweils von zwei Neuropathologen unabhängig voneinander

beurteilt. Den Befundern waren die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analysen

nicht bekannt.

3.4 Immunphänotypisierung und Durchflusszytometrie

3.4.1 Probenmaterial

Für die durchflusszytometrischen Analysen wurden 5 ± 0,5 ml unverdünnter Liquor

cerebrospinalis verwendet, welcher wie oben beschrieben asserviert wurde.

24

3.4.2 Grundlagen der Durchflusszytometrie

Durchflusszytometer können durch Kombination zweier Messverfahren (Messung der

Lichtstreuung und der Fluoreszenz) Zellen sowohl hinsichtlich morphologischer Kriterien

(Größe, Membranstruktur, intrazelluläre Strukturen) analysieren, als auch die Beladung mit

fluorochrommarkierten Antikörpern quantitativ erfassen.

Bei dem Messvorgang werden die in Suspension vorliegenden Zellen mit Überdruck durch

eine Kapillare gepresst und einzeln an einem Laser vorbeigeleitet. Die Lichtstreuung von

Elektronenvervielfältigern, sogenannten Photomultipliern, wird als Vorwärtsstreuung

(engl. "forward scatter" = FSC) bezeichnet, welche durch die Zellgröße beeinflusst wird.

Im rechten Winkel dazu wird die sogenannte Seitwärtsstreuung (engl. "side scatter" =

SSC) mit einer Abhängigkeit von der intrazellulären Granularität und der Membranbe-

schaffenheit durch die Detektoren des Gerätes erfasst. Mit Hilfe dieser beiden Messpara-

meter sind unterschiedliche Zellpopulationen in einem zweidimensionalen SSC/FSC-

Punktediagramm identifizierbar (z.B. Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten).

Abbildung 3.1 Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers (modifiziert nach Brown und Wittwer, 2000)

25

Ein Partikel oder eine Zelle wandert in einer Suspension durch einen Laserstrahl. Dabei

wird für jede einzelne Zelle gemessen, wie viel Licht von dieser absorbiert wird (sog.

Forward Scatter, zeigt die relative Größe) und wie viel Licht reflektiert wird (sog. Side

Scatter, zeigt die relative optische Dichte). Wurde die Zelle oder der Partikel zuvor mit

fluoreszierenden Antikörpern markiert, so wird ebenfalls im 90°-Winkel detektiert, welche

Fluoreszenzen emittiert werden. Die Detektion ist abhängig von den Detektoren, dem

Fluoreszenzfarbstoff und der Wellenlänge des Anregungslichtes. Filter und Spiegel bre-

chen und reflektieren das Licht so, dass es auf die richtigen Detektoren trifft.

Ebenfalls im 90°-Winkel zur Flussrichtung wird die Fluoreszenz (FL) detektiert, welche

sich aus der Markierung zellulärer Antigene mit fluoreszierenden Farbstoffen

(Fluorochrome) ergibt. Diese Farbstoffe besitzen die Eigenschaft, Licht einer bestimmten

Wellenlänge zu absorbieren und mit weniger Energie (bei größerer Wellenlänge) wieder

abzugeben (emittieren). Bei der Anregung (Exzitation) werden ihre Elektronen auf eine

höhere Schale (Energieniveau) angehoben und geben beim Zurückfallen die Energie unter

Wärmeverlust als Licht wieder ab (Emission).

Bei der Fluoreszenzmessung wird monochromatisches Licht zur Anregung der

Fluorochrome verwendet. Die Markierung der gewünschten zellulären Antigene kann ent-

weder durch direkt an einen Farbstoff gebundene, spezifische Antikörper erfolgen oder

durch eine indirekte Markierung des Antigens. Zur indirekten Markierung wird ein Anti-

Immunglobulin als Zweitreagenz einsetzt (z.B. Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-FITC),

welches seinerseits den nicht farbstoffgebundenen ersten Antikörper bindet und somit

sichtbar macht. Durch die Bindung von monoklonalen Antikörpern ist die Identifizierung

von leukozytären Subpopulationen anhand vorhandener Oberflächenmoleküle möglich. Ist

eine Färbung zytoplasmatischer Antigene erwünscht, so werden die Zellmembranen

zunächst chemisch permeabilisiert.

Die in dieser Arbeit verwendeten Fluorochrome wurden von den Herstellern Beckman

Coulter (BC; Krefeld), Becton Dickinson (BD; Heidelberg) und DakoCytomation (Dako;

Glostrup, Dänemark) bezogen und sind in Tabelle 3.1 aufgelistet.

Mit einer durchflusszytometrischen Analyse können innerhalb kurzer Zeit sehr viele Zellen

charakterisiert werden. Die zu analysierenden Zellen liegen in der Regel nicht als reine

Populationen vor. Vorhandene Zelltrümmer und restliche Thrombozyten sowie Erythro-

zyten können durch das Setzen eines Schwellenwertes im FSC von der Untersuchung aus-

geschlossen werden. Dieser Schwellenwert erlaubt den Ausschluss von Partikeln abhängig

26

von deren Größe. Durch das Setzen eines elektronischen „Gates“, welches Zellen ohne ein

bestimmtes Merkmal ausschließt, ist es möglich, Populationen mit bestimmten Eigen-

schaften bezüglich FSC, SSC und Fluoreszenz von den übrigen Zellen getrennt darzustel-

len und die ausgewählte Subpopulation auf weitere Parameter hin zu untersuchen.

Da es bei Farbstoffen wie z.B. FITC und PE zu einer spektralen Überlappung des emittier-

ten Lichtes kommt, muss eine Kompensation vorgenommen werden. Diese ermöglicht eine

zweifelsfreie Zuordnung in einer zweidimensionalen x-y-Darstellung (Quadranten-

statistik). Die unerwünschte Einstrahlung eines Fluorochroms in den „benachbarten“ Fluo-

reszenzkanal wird durch die Subtraktion der Signalstärke im überlappenden Emissions-

bereich von jedem einzelnen Signalimpuls korrigiert.

Wählt man eine Kombination zweier Farbstoffe, so dass die Emissionswellenlänge des

ersten der Absorptionswellenlänge des zweiten entspricht, kommt es bei ausreichender

Nähe beider Moleküle zum Energietransfer. Hierbei kommt es idealerweise dazu, dass die

Fluoreszenz des ersten vollständig in die Anregung des zweiten Moleküls umgesetzt wird.

Die praktische Anwendung dieses Phänomens liegt in der simultanen Mehrfarbfluoreszenz

bei Anregung mit einer Wellenlänge.

Tabelle 3.1 Übersicht der verwendeten Fluorochrome und Antikörper

Antigen Fluorochrome Antikörper (AK) Hersteller (Katalog-Nr.)

IgG FITC / PE / ECD 679.1Mc7 BC (A07732)

IgG PC5 679.1Mc7 BC (A07798)

CD3 FITC UCHT1 BC (A07726)

CD4 FITC 13B8.2 BC (A07726)

CD5 PC5 BL1a BC (A70203)

CD8 FITC B9.11 BC (A07726)

CD10 PE ALB1 BC (A07761)

CD10 FITC W8E7 BD (347503)

CD14 PC5 RMO52 BC (IM2707U)

CD19 PC5 / ECD J3-119 BC (A07771/0)

CD20 FITC B9E9 BC (A07772)

CD45 PC7 J33 BC (IM3548)

CD56 PE N901 BC (A07788)

κ/λ FITC / PE TB28-2 / 1-155-2 BD (349516)

κ PE polyklonaler Hasen-AK F(ab’)2 Dako (R0436)

λ PE polyklonaler Hasen-AK F(ab’)2 Dako (R0437)

27

Es folgt eine kurze Charakterisierung der markierten Antigene:

CD3 ist Teil eines größeren Komplexes, zu dem auch der T-Zell-Rezeptor gehört. Es wird

von reifen T-Zellen und einer Subpopulation von Thymozyten exprimiert (van Agthoven et

al., 1981). Die T-Zell-Aktivierung kann ausgelöst werden, indem einem T-Zell-Rezeptor

durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompability complex = MHC)

ein Fremdantigen präsentiert wird. In Kombination mit CD4 und CD8 eignet es sich zur

weiteren Differenzierung von Lymphozyten.

CD4 besitzt ein Molekulargewicht von 55 kDa und stellt ein T-Zell-Antigen dar. Es wird

von T-Helferzellen und von der Mehrheit der Thymozyten (meist mit Coexpression von

CD8) sowie in geringerer Dichte von Monozyten exprimiert (Miceli und Parnes, 1991).

CD5 ist ein transmembranes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 67 kDa und

wird von reifen T-Zellen und von der Mehrheit der Thymozyten exprimiert. (Horejsi und

Angelisova, 1987; Disanto et al., 1987). Zusätzlich lässt sich CD5 auf einer Subpopulation

von B-Lymphozyten finden. Hingegen weisen Granulozyten, Monozyten und Thrombo-

zyten kein CD5 auf ihrer Zelloberfläche auf (Reiter, 1989). CD5 ist ein Ligand für das

B-Zelloberflächenantigen CD72 (van de Velde et al., 1991).

CD8 ist ein T-Zell-Antigen, das von T-Suppressorzellen und Natural-Killer-(NK-)Zellen

exprimiert wird. Sein Molekulargewicht beträgt 32 kDa (Terry et al., 1990).

CD10 ist eine Endopeptidase mit einem molekular Gewicht von 100 kDa und findet sich

auf einer Vielzahl normaler und neoplastischer Zelltypen, wie Fibroblasten, Granulozyten,

Nierenepithelien, aber auch auf Lymphom-, Melanom- und Gliomzellen (Letarte et al.,

1988; Bilalovic et al., 2004). CD10 wurde auf Lymphozyten bei einer akuten B-Zell-

Leukämie entdeckt und wird daher auch als „common acute lymphoblastic leukemia anti-

gen“ (CALLA) bezeichnet (Le Bien und McCormack, 1989).

CD14 ist ein Oberflächenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 53 bis 55 kDa

und findet sich in hoher Expression auf Monozyten und Makrophagen und weniger dicht

auf neutrophilen Granulozyten (Todd et al., 1981; Todd et al., 1982). Außerdem kann es

auf pleuralen Phagozyten, dendritischen Zellen, Langhanszellen oder Histiozyten nach-

gewiesen werden. Hingegen exprimieren B-Zellen, T-Zellen, NK-Zellen, Erythrozyten und

Thrombozyten kein CD14 (Peters et al., 1991; Ziegler-Heitbrock und Ulevitch, 1993).

CD19 ist ein B-Zell-Marker mit einem Molekulargewicht von 95 kDa. Unter anderem wird

es zur Unterscheidung von Lymphomen der B- und T-Zell-Reihe herangezogen. CD19

28

kommt eine wichtige Rolle in der B-Zell-Aktivierung zu (Doody et al., 1996).

CD20 ist ein Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 33 bis 37 kDa (Ted-

der und Engel, 1994). Eine starke Expression erfährt es auf Zellen der B-Zelllinie. Es wird

früh in der B-Zelldifferenzierung exprimiert, jedoch ist es auf physiologischen Plasmazel-

len nicht (mehr) zu finden. Schwach exprimiert kann es auf T-Zellsubpopulationen gefun-

den werden, wohingegen CD20 nicht von anderen leukozytären Subtypen (NK-Zellen,

Monozyten und Granulozyten) exprimiert wird (Uckun, 1990; Zhou und Tedder, 1995).

CD45 kann in verschiedener Dichte Expression auf lymphoiden und myeloiden Zellen

nachgewiesen werden und als Pan-Leukozytenmarker bezeichnet werden. Die Expression

korreliert mit verschiedenen Differenzierungsstadien. Das Molekulargewicht beträgt in

Abhängigkeit von der Isoform 180 bis 220 kDa (Serra-Pages et al., 1995).

CD56 wird von NK-Zellen, neben einer Subpopulation von (CD3-positiven) T-Zellen

exprimiert (Griffin et al., 1983; Lanier et al., 1986; Hercend et al., 1985).

κ- und λ-Leichtketten werden von B-Lymphozyten als Bestandteil der Immunglobuline auf

der Zelloberfläche exprimiert. Eine Ausnahme stellen die B-Progenitorzellen, Prä-B-Zellen

und reifen Plasmazellen dar. Jede B-Zelle ist lediglich dazu in der Lage, eine Sorte Leicht-

ketten zu bilden, κ- oder λ-Leichtketten. Circa zwei Drittel der B-Zellen exprimieren κ-

und circa ein Drittel λ-Leichtketten (Johnson und Olofsson, 1993).

3.4.3 Interpretation von durchflusszytometrischen Daten

Die Ergebnisse einer durchflusszytometrischen Analyse können graphisch als Punkt-

diagramm (Dotplot) dargestellt werden. Hierbei handelt es sich um eine zweidimensionale

Darstellung in der die gemessenen Parameter als Punkte gegeneinander aufgetragen

werden (z.B. FSC/SSC, FL1/FL2; FSC/FL3). Dazu werden in der Regel alle gemessenen

Zellen in einem Punktdiagramm FSC gegen SSC dargestellt und ein elektronisches Gate

um die mononukleären Zellen gelegt. Um zum Beispiel im weiteren Verlauf nur lympho-

zytäre Zellen zu untersuchen, werden zunächst die Zellparameter „positiv für CD45“, eine

Thyrosinphosphatase, welche auf allen Leukozyten exprimiert wird, und SSC gegeneinan-

der aufgetragen. Im Anschluss daran wird ein Gate um die Zellen mit lymphozytären

Eigenschaften, hier wenig Side Scatter und relative Expression von CD45, gelegt (vgl.

Abb. 3.2). Eine statistische Auswertung ist mit Hilfe eines Quadrantenkreuzes möglich,

welches die Grafik in 4 Quadranten einteilt und die Verteilung der Zellen prozentual auf-

29

schlüsselt: links unten doppelt negative, rechts oben doppelt positive sowie rechts unten

und links oben für die jeweiligen Parameter einfach-positiver Zellen (vgl. Abb. 3.3). Um

zu wissen, ob ein Oberflächenmolekül auf einer Zelle vorhanden ist oder nicht, wird der

Quadrant an einer Isotypkontrolle ausgerichtet. Dabei wird der Quadrant so positioniert,

dass alle Zellen der Isotypkontrolle negativ sind.

Abbildung 3.2 Densityplot, SSC/CD45. Densityplot, Parameter SSC und CD45 gegeneinander aufgetragen. Rote Flächen entsprechen einer hohen Dichte von Er-eignissen. Im unteren rechten Quadranten wurde ein Gate um den Teil der Zellen gelegt, welche zum einen positiv für CD45 waren und zum anderen nur wenig „Side Scatter“ (SSC) aufwiesen.

Abbildung 3.3 Punktdiagramm CD3/CD19. Links/oben: CD3-positive Zel-len (rot, 34,8%, entsprechen T-Zellen). Links/unten: CD3- und CD19-negative Zellen (0,5%). Rechts/unten: CD19-positive Zellen (blau, 64,6%, entsprechen B-Zellen). Rechts/oben: doppelt-positive Zellen (0,1%; resultieren aus nicht ganz exakt gesetztem Quadranten).

30

3.4.4 Durchflusszytometrie: Durchführung und Färbeprotokolle

Es wurden jeweils 5 ± 0,5 ml Liquorproben innerhalb von 1-2 Stunden nach der Proben-

entnahme zentrifugiert (200 x g, Raumtemperatur, 10 min.). Die Zellen wurden im

Anschluss in 400 µl Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) ergänzt mit 1% bovinen

Serumalbumin (BSA) resuspendiert und wurden dann in jeweils 50 µl-Röhrchen pipettiert

und mit den verschiedenen Antikörperkombinationen bei Raumtemperatur für 30 Minuten

inkubiert. Einzelheiten zu den verwendeten Fluorochromen und Antikörpern sind Tabelle

3.1 zu entnehmen. Die verschiedenen Färbungen erfolgten in den in Tabelle 3.2 dargestell-

ten Antikörperkombinationen.

Tabelle 3.2 Durchflusszytometrische Färbeprotokolle

Röhrchen FITC PE ECD PC5 PC7

1 IgG IgG IgG IgG CD45

2 CD8 CD4 CD3 CD19 CD45

3 CD10 CD56 CD14 CD19 CD45

4 κ λ CD19 CD10 CD45

5 CD20 κ - CD19 CD45

6 CD20 λ - CD19 CD45

7 CD20 CD22 CD19 CD5 CD45

Für den Fall von sehr hohen Zellzahlen im Liquor wurden die Proben auf ein Maximum

von 10.000 Leukozyten/mm3 limitiert, um eine ausreichende Antikörpersättigung der An-

tigene auf den Zellen zu gewährleisten. Nachdem erneutem Waschen der Zellen in PBS

wurden die Zellen in 500 µl PBS/BSA resuspendiert. Innerhalb der darauffolgenden zwei

Stunden wurden die durchflusszytometrischen Untersuchungen mit einem FC500-

Cytometer (Beckman Coulter) und der CXP Analyse Software (Version 2.2) durchgeführt.

Die Software erlaubt das beliebige Setzen von Gates und die farbige Darstellung von Zell-

subpopulationen, um auch in den Kontrollen exakt die gleichen Populationen zu analysie-

ren.

31

3.4.5 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten

Für die Analyse der durchflusszytometrischen Ergebnisse wurde zunächst anhand der

SSC/CD45-Darstellung ein Gate um die Population lymphozytärer Zellen gesetzt

(vgl. Abb. 3.2). Unter dieser Voraussetzung konnten die CD45-positiven B-Lymphozyten,

welche in diesem Kollektiv als potentielle Tumorzellen betrachtet werden müssen, ent-

sprechend ihres Phänotyps und Anfärbeverhaltens, getrennt von T-Lymphozyten (CD3-

positiv) und NK-Zellen (CD56-positiv) dargestellt und quantifiziert werden.

Um nun die Zellen der verschiedenen lymphozytären Subpopulationen weiter zu phäno-

typisieren, wurden die Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen ver-

schiedene B-Zell-Antigene (CD19, CD20, CD10 und κ/λ-Leichtketten von Immunglobuli-

nen) und Kontrollantigene (CD14, CD56, CD3, CD4, CD5, CD8) angefärbt (vgl. Tab. 3.1).

Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie wurden ohne Kenntnis der zytomorphologischen

Befunde zunächst eigenständig von mir interpretiert und mit „kein Nachweis maligner Zel-

len“ oder „positiver Nachweis maligner Zellen“ beschrieben. Anschließend erfolgte die

Diskussion der Ergebnisse und die Korrektur einzelner Einschätzungen zusammen mit

meinem Doktorvater Prof. Dr. med. R. Schroers. Kriterien, nach denen Zellpopulationen

als maligne eingestuft wurden, sind in Kapitel 4 (Ergebnisse) beschrieben.

3.5 Statistik

Die Aufbereitung der Daten und die statistischen Berechnungen wurden von mir mit Hilfe

der Programme EXCEL 2004 für Mac (Version 11.0) und SPSS (PAWS Statistics 18, Ver-

sion 18.0.0) durchgeführt.

Gruppenvergleiche für die Verteilung von klinischen und biologischen Daten erfolgten

unter Anwendung des Mann-Whitney-U-Tests. Zur Bestimmung der Konkordanz zwi-

schen den zytologischen und den durchflusszytometrischen Befunden wurde der Kappa-

Koeffizient verwendet. Dieser wurde von Jacob Cohen als Maß zur Bewertung der Über-

einstimmungsgüte bei Vorliegen von kategoriellen Merkmalen vorgeschlagen (Cohen,

1960).

Zur Korrelation des Nachweises maligner Zellen im Liquor und einer Kortikosteroidmedi-

kation zum Zeitpunkt der Probenentnahme nutzte ich den Chi-Quadrat-Test nach Pearson

(Plackett, 1983). Mit diesem Test wird die Unabhängigkeit zweier kategorieller Merkmale

geprüft.

32

Die Gesamtüberlebenszeit wurde definiert als die Zeitspanne von der Erstdiagnose eines

PCNSL bis zum Tod des Patienten infolge des PCNSL oder einer mit dem PCNSL assozi-

ierten Komplikation. Tod an PCNSL beziehungsweise einer Komplikation der Erkrankung

war somit der Endpunkt der Beobachtung. Patienten, deren Tod durch eine andere Ursache

eintrat sowie diejenigen, die am Ende des Beobachtungszeitraumes (03/2010) noch lebten,

gingen als zensierte Ereignisse in die Statistik ein.

Anhand der Kaplan-Meier-Analyse konnte für jede dieser Gruppen die Wahrscheinlichkeit

des Überlebens abhängig von der Diagnose einer Meningeosis ermittelt werden (Kaplan,

1958). Die Unterschiede in der Überlebenswahrscheinlichkeit der einzelnen Gruppen

wurden jeweils mit Hilfe des Log-rank-Tests (auch Mantel-Cox-Test genannt) auf ihre

Signifikanz hin überprüft (Mantel, 1966). Diese Verfahren erlauben es, sogenannte unvoll-

ständige Überlebensdaten zu verwenden. Unter unvollständigen Überlebensdaten versteht

man solche, bei denen die Patienten bei Abschluss der Datensammlung noch lebten und

deren Erkrankung nicht fortschritt.

33

4 Ergebnisse

4.1 Patienten

Tabelle 4.1 Patientencharakteristika

Patient Diagnose Diagnose- situation Histologie

Steroid-medi-kation

Zellzahl (Liquor) cMRT

Zytologie (Liquor)

Durch- flusszyto-metrie (Liquor)

z.Z. der Untersu-chung

Drittel Zellen Meningeosis?

Maligne Zellen?

Maligne Zellen?

1 PCNSL ED DLBCL nein 6 nein nein nein 2 PCNSL ED DLBCL nein 96 nein ja ja 3 PCNSL ED DLBCL nein 136 nein ja ja 4 PCNSL ED DLBCL nein 1 nein nein nein 5 PCNSL ED DLBCL nein 204 nein nein nein 6 PCNSL ED DLBCL nein 136 fraglich fraglich ja 7 PCNSL ED DLBCL nein 5 fraglich nein nein 8 PCNSL ED DLBCL ja 44 nein nein nein 9 PCNSL ED DLBCL ja 40 fraglich fraglich nein 10 PCNSL ED DLBCL ja 6 nein nein nein 11 PCNSL ED DLBCL ja 240 nein nein ja 12 PCNSL ED DLBCL ja 4 fraglich nein nein 13 PCNSL ED DLBCL ja 77 fraglich fraglich nein 14 PCNSL ED DLBCL nein 24 nein nein nein 15 PCNSL ED DLBCL ja 14 fraglich fraglich nein 16 PCNSL ED DLBCL ja 1 fraglich nein nein 17 PCNSL ED DLBCL ja 5 nein nein nein 18 PCNSL ED DLBCL nein 13 nein ja nein 19 PCNSL ED DLBCL ja 30 nein fraglich nein 20 PCNSL ED DLBCL ja 23 nein nein nein 21 PCNSL ED DLBCL ja 7 nein nein nein 22 PCNSL ED DLBCL ja 13 nein nein nein 23 PCNSL ED DLBCL nein 1 nein nein ja 24 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 8 nein nein nein 25 PCNSL Rezidiv DLBCL ja 0 fraglich nein nein 26 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 6 nein fraglich nein 27 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 256 ja nein ja 28 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 11 nein nein nein 29 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 89 ja ja ja 30 PCNSL Rezidiv DLBCL nein 0 nein nein nein

4.1.1 Diagnosesituation

Bei 23 (76,7%) der 30 untersuchten Patienten wurde ein PCNSL erstdiagnostiziert;

7 (23,3%) Patienten litten an einem PCNSL-Rezidiv.

Der Altersdurchschnitt der Patientenkohorte war 61,8 Jahre. Das Verhältnis von Männern

zu Frauen lag bei 1,3 : 1 (17 Männer; 13 Frauen), was Angaben in der Literatur entspricht

34

(Hochberg und Miller, 1988; Ling et al., 1994; Fine und Mayer, 1993b; Reni et al., 1997).

Der mittlere Nachbeobachtungszeitraum nach Erstdiagnose des PCNSL (Follow-Up-Zeit)

betrug 16,6 Monate (Median: 10 Monate).

4.1.2 Histologie

Alle PCNSL waren biopsiert worden und wurden als diffuse großzellige Non-Hodgkin-

Lymphome der B-Zellreihe (DLBCL) gemäß der WHO-Klassifikation eingestuft.

4.1.3 Knochenmarkinfiltration

Bei allen Patienten wurde eine Knochenmarkbiospie vorgenommen. Bei keinem der 30

Patienten gab es eindeutige zytologische und/oder histopathologische Hinweise für das

Vorliegen einer Knochenmarkinfiltration durch ein Lymphom.

4.1.4 HIV und andere Infektionskrankheiten

Im gesamten Kollektiv erwiesen sich alle Patienten als seronegativ für das Humane

Immundefizienz-Virus (HIV). Auch unter den auf eine Hepatitis-B (HBV) und Hepatitis-C

(HCV) getesten Patienten (94,6%) fand sich kein Nachweis eines dieser Viren.

4.1.5 Therapie

Die Gruppe der Patienten mit erstdiagnostiziertem PCNSL wurden mit Ausnahme eines

Patienten nach einem einheitlichen Therapieprotokoll behandelt. Dieses bestand aus insge-

samt 6 Zyklen und beinhaltete die intravenöse Gabe von MTX, Vincristin, Ifosfamid,

Cyclophosphamid, Ara-C und Vindesin sowie Dexamethason per os. Zum Zeitpunkt der

Durchflusszytometrie hatte keiner der Patienten eine tumorspezifische Therapie erhalten.

Patienten mit der Diagnose eines PCNSL-Rezidivs erhielten im Vorfeld 6 Zyklen einer auf

MTX-basierten Chemotherapie als Erstlinientherapie. Ein Patient (3) konnte auf Grund

einer Niereninsuffizienz keine methotrexathaltige Chemotherapie erhalten und wurde

primär bestrahlt.

35

4.2 Zytologische Untersuchung des Liquor cerebrospinalis

Die zytologische Untersuchung der Liquorproben aller 30 Patienten wurde in einer

Referenzbegutachtung im pathologischen Institut in Köln unter der Leitung von Frau Prof.

Dr. med. M. Deckert durchgeführt.

In 4 Fällen (13,3%) wurden maligne Zellen identifiziert, wobei blastäre lymphatische

Zellen im Liquor zur Darstellung kamen (Abb. 4.1). In 6 weiteren Fällen (20%) wurden,

neben einer Pleozytose, blasten-verdächtige Zellen gesehen. Diese wurden als möglicher

Anhalt für eine Meningeosis lymphomatosa interpretiert, für den sicheren Nachweis eines

Befalls des Liquorkompartiments waren diese Befunde jedoch nicht ausreichend.

Abbildung 4.1 Nach Pappenheim gefärbte zytopathologische Präparate aus dem Liquor cerebrospinalis (A) eines Patienten mit Nachweis eines PCNSL vom DLBCL-Typ. Darstellung blastärer Tumorzellen mit basophilem Zytoplasma (Pfeilspitze), typisch für eine Meningeosis lymphomatosa. Mitose einer Tumorzelle (Pfeil). (B) Liquor cerebro-spinalis eines PCNSL-Patienten mit einer Liquorpleozytose: aktivierte Lymphozyten und zwei aktivierte Monozyten (Pfeil), kein Nachweis von Tumorzellen [M. Deckert, Köln].

4.3 Durchflusszytometrie des Liquor cerebrospinalis

Bei 7 der 30 Patienten (23,3%) wurden durchflusszytometrisch pathologische B-

Lymphozyten im Liquor nachgewiesen.

36

4.3.1 Durchflusszytometrische Kriterien zur Bewertung von Malignität

Es folgt eine Beschreibung von Zellparametern, anhand welcher die Detektion patho-

logischer B-Zellen in der durchflusszytometrischen Analyse möglich war; bei einem Teil

der Patienten konnten verschiedene dieser Parameter gleichzeitig nachgewiesen werden.

Durch das Zusammentreffen verschiedener Atypien in einer Lymphozytenpopulation

wurde die Diagnose einer Meningeosis lymphomatosa im Liquor umso wahrscheinlicher.

Bei 3 (42,9%) der 7 Patienten mit durchflusszytometrischem Nachweis von malignen Zel-

len im Liquor ließen sich pathologische B-Zellen aufgrund einer abweichenden Dichte der

Granularität der Zellen und einer aberranten CD45 Expression (SSC/CD45) von den übri-

gen B-Lymphozyten abgrenzen. Diese homogene Gruppe aberranter Lymphozyten wurde

als Kriterium einer pathologischen B-Zellpopulation im Liquor gewertet (Abb. 4.2).

Abbildung 4.2 Densityplot, SSC/CD45. Am rechten Bildrand sind zwei Lymphozytenpopulationen mit unterschiedlichem Anfärbeverhalten mit dem CD45-Antikörper PC7 und verschiedener Dichte (SSC) zu erkennen. Am linken Bildrand sind die CD45-negativen, nicht-lymphozytären Zellen verschiedener Dichtegrade aufgetragen.

Bei 5 der 7 Patienten (71,4%) lag eine übermäßige Expression von CD10 auf reifzelligen

B-Lymphozyten (CD10/CD19) vor. CD10 ist eine Atriopeptidase, welche auch als

„Common acute lymphocytic leukemia antigen“ (CALLA) bezeichnet wird. Die Expressi-

on des Antigens CD10 wird bei lymphozytären Malignomen beobachtet (Abb. 4.3).

37

Abbildung 4.3 Punktdiagramm, CD10/CD19. Im Quadranten rechts oben befinden sich CD19-positive Zellen (rot), welche CD10 koexprimieren. Diese entsprechen einem Anteil von 1,4% aller Zellen im Lymphozytengate bei insgesamt 8,8% B-Lymphozyten.

Abbildung 4.4 Punktdiagramm, (A) Kappa/CD19, (B) Lambda/CD19. In Abbildung (A) ist zu erkennen, dass nahezu alle CD19-positiven Zellen κ-Leichtketten exprimieren (blau). Im Gegensatz dazu sind kaum CD19-positive Zellen vorhanden, wel-che λ-Leichtketten auf ihrer Zellmembran binden (B).

Physiologischerweise werden in einer B-Zell-Population κ- und λ-Leichtketten in an-

nähernd gleichem Verhältnis exprimiert. In monoklonalen B-Zell-Populationen wird aus-

schließlich eine Sorte Leichtketten - κ oder λ - auf den Membranen von B-Zellen gebun-

den. Der Nachweis einer Leichtkettenrestriktion konnte bei 3 der 7 durchflusszytometrisch

detektierten Patienten (42,9%) erbracht werden (Abb. 4.4). In allen Fällen lag eine Restrik-

38

tion der κ-Leichtketten mit einer Spannweite des κ-λ-Verhältnis von minimal 0,8 zu 0 und

maximal 60,3 zu 0,8 vor. Bei Patient 15 fiel ein κ-λ-Verhältnis von 20 : 0 auf, jedoch war

die Anzahl der Ereignisse so gering, dass die Interpretation dieses Befundes als sicher

positiv nicht möglich war.

Die verschiedenen Befunde traten bei einigen Patienten zum Teil isoliert auf, aber auch

jede mögliche Kombination zweier Befunde wurde beobachtet: SSC/CD45-Aberration bei

den Patienten 2, 3, 6; CD10/19-Koexpression Patienten 2, 11, 27 und 29; Leichtketten-

restriktion bei den Patienten 3, 23, und 29.

4.3.2 Analyse einzelner durchflusszytometrischer Parameter

Bei genauerer Betrachtung der Lymphozytenzahlen wurde deutlich, dass im Mittelwert

sowohl die absolute Lymphozytenzahl (7751 versus 810 Zellen) als auch der Lympho-

zytenanteil an allen Zellen in der Liquorprobe (25,5% versus 17,7% Lymphozyten) bei

Patienten mit durchflusszytometrischem Nachweis pathologischer B-Zellen im Liquor im

Mittelwert höher waren als bei Patienten ohne durchflusszytometrischen Anhalt für einen

Lymphombefall des Liquorkompartiments. Nach dem Mann-Whitney-U-Test war dieser

Unterschied mit einem p-Wert von <0,001 signifikant. Für Lymphozyten in Relation zu

der gesamten Zellzahl konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen mit

und ohne Nachweis einer Meningeosis gezeigt werden (vgl. Tab. 4.2).

Tabelle 4.2 Analyse der durchflusszytometrischen Ergebnisse

Alle

Patienten 1 Durchflusszytometrie

positiv 1 Durchflusszytometrie

negativ 1 p-Wert* Lymphozyten im Lymphozytengate

Zellzahl absolut

2429,8 (2-14950)

7751 (1534-14950)

810 (2-3638) < 0,001

Lymphozytenanteil an allen Ereignissen % 19,5 (0-73) 25,5 (6-71) 17,7 (0-73) n.s. 0,335 Lymphozyten CD3+ %2 88,8 (34,8-100) 68,2 (34,8-97,2) 95,0 (87,4-100) 0,008 CD3+/CD4+ %2 59,7 (21,8-72,4) 46,3 (21,8-72,4) 63,7 (39,5-100) n.s. 0,096 CD3+/CD8+ %2 29,3 (0-62,4) 27,6 (10,3-62,4) 29,9 (0-55,9) n.s. 0,532 CD19+ %2 7 (0-72,0) 23,5 (1,1-72,0) 2,0 (0-12,5) 0,005 CD56+ %2 3,4 (0-14,8) 1,7 (0,3-3,2) 3,9 (0-14,8) 0,033 CD19+/CD10+ %2 0,2 (0-1,4) 0,6 (0-1,4) 0,1 (0-0.9) 0,022

1 Daten sind Mittelwerte; Spannweite in Klammern angegeben 2 Anteil an allen Lymphozyten * nach dem Mann-Whitney-U-Test berechnet

39

Des Weiteren war ersichtlich, dass der Anteil von CD19-positiven Zellen (B-

Lymphozyten) bei Patienten mit Nachweis einer Meningeosis (23,5%) den in der Patien-

tengruppe ohne Nachweis maligner Zellen (2,0%) signifikant überstieg (p-Wert 0,005;

Mann-Whitney-U-Test). Dem entsprechend war der Anteil von CD3-positiven Zellen (T-

Lymphozyten) in der auf maligne Zellen positiv getesteten Gruppe mit 68,2% signifikant

geringer als in der Gruppe ohne einen Befall des Liquorkompartiments mit 95,0% (p-Wert

0,008; Mann-Whitney-U-Test). Ähnlich verhielt es sich mit dem Anteil an CD56-positiven

NK-Zellen, welcher 1,7% in der Gruppe mit respektive 3,9% in der Gruppe ohne Nachweis

einer Meningeosis ausmachte (p-Wert 0,033; Mann-Whitney-U-Test). Für die Ko-

expression von CD10 und CD19 wurde für die Patientengruppe mit Nachweis maligner

Zellen im Liquor ein Mittelwert von 0,6% errechnet. In der Patientengruppe ohne diesen

Nachweis betrug der Mittelwert 0,1% (p-Wert 0,022; Mann-Whitney-U-Test;

vgl. Tab. 4.2).

4.4 Vergleich der Ergebnisse von Durchflusszytometrie und Zytologie

Bei einem Vergleich von Zytomorphologie und Durchflusszytometrie fiel zunächst eine

hohe Konkordanz der Ergebnisse auf. Von den 4 (13,3%) Patienten, welche in der Zyto-

morphologie als Betroffene einer Meningeosis erkannt wurden, konnten in der Durch-

flusszytometrie 3 bestätigt werden. Durchflusszytometrisch konnten 4 weitere Patienten

mit malignen B-Zellpopulationen im Liquor detektiert werden. Insgesamt waren somit 7

(23,3%) Patienten dieser Population in der Durchflusszytometrie positiv hinsichtlich eines

Lymphombefalls des Liquorraums befundet worden. Nur in einem Fall (Patient 18) konnte

die zytomorphologische Diagnose maligner Zellen im Liquor in der Durchflusszytometrie

nicht bestätigt werden.

Bei 6 Patienten (20%) wurde zytomorphologisch der Verdacht auf maligne Zellen ge-

äußert, jedoch konnte letztendlich nicht sicher zwischen reaktiven und malignen Lympho-

zyten unterschieden werden. Lediglich einer dieser 6 Patienten mit zytologischem Ver-

dacht auf eine Meningeosis, mit der Anmerkung „sehr zellreiches Sediment, einzelne

blasten-verdächtige Zellen“ fiel in der Durchflusszytometrie mit einer auffälligen Ereignis-

verteilung im Punktdiagramm SSC/CD45 auf, anhand dessen sich der zytomorphologische

Verdacht durchflusszytometrisch erhärten ließ. Im Falle der übrigen 5 Patienten, bei denen

in der Zytologie das Vorliegen pathologischer Zellen fraglich blieb, kamen in der Durch-

flusszytometrie keine pathologischen Auffälligkeiten zur Darstellung (vgl. Tab. 4.3).

40

Tabelle 4.3 Vergleich von durchflusszytometrischen und zytologischen Ergebnissen

Zytologie

Durchflusszytometrie positiv fraglich negativ Summe

Positiv n (%) 3 (10,0) 1 (3,3) 3 (10,0) 7 (23,3)

Negativ n (%) 1 (3,3) 5 (16,7) 17 (56,6) 23 (76,7)

Summe 4 (13,3) 6 (20,0) 20 (66,7)

Cohens Kappa-Koeffizient (Cohen, 1960), das meist verwendete statistische Maß zur Be-

stimmung der Übereinstimmungsgüte von Ergebnissen zweier unabhängiger Untersucher

(sog. interrater agreement), ohne dass das wahre Ergebnis bekannt ist, betrug für die Über-

einstimmung der durchflusszytometrischen und zytomorphologischen Ergebnisse 0,453.

Dieser Wert für Kappa liegt nach Altman im Bereich mittlerer Übereinstimmungsstärke

(0,41-0,60) (Altman, 1991).

4.5 Laborchemische Untersuchung

4.5.1 Liquor cerebrospinalis

Standardgemäß wurden zur Korrelation mit zytologisch und/oder durchflusszytometrisch

im Liquor nachgewiesenen malignen Zellen folgende zusätzliche Laborparameter im Li-

quor bestimmt: Zellzahl, Eiweiß, Glukose, Laktat und Albumin.

4.5.1.1 Zellzahl im Liquor cerebrospinalis

Eine erhöhte Zellzahl (>12/3 Zellen) im Liquor konnte bei 87,5% der Patienten (7 von 8)

mit durchflusszytometrischem und/oder zytologischem Nachweis einer Meningeosis lym-

phomatosa gezählt werden und in 40,9% der Patienten (9 von 22) ohne einen entsprechen-

den Nachweis. Im Mittel lag in der Gruppe mit Meningeosis eine Zellzahl von

120,9 /3 Zellen (Spannweite: 1-256) vor, wohingegen bei Patienten ohne Meningeosis der

Mittelwert deutlich niedriger bei 24,1 /3 Zellen (Spannweite: 0-204) lag. Es bestand eine

statistisch signifikante Assoziation von Zellzahl und Vorliegen einer Meningeosis lym-

phomatosa (p = 0,015; Mann-Whitney-U-Test; vgl. Tab. 4.4). Bei Patient 23 fand sich trotz

der durchflusszytometrischen Diagnose einer Meningeosis eine normale Zellzahl (1 /3 Zel-

41

le) im Liquor. Es lässt sich festhalten, dass die Patienten mit Nachweis einer Meningeosis

gegenüber den Patienten ohne einen solchen im Mittel signifikant höhere Zellzahlen im

Liquor cerebrospinalis aufwiesen.

Tabelle 4.4 Liquorergebnisse für Zellzahl und Laborchemie

Referenzwerte Meningeosis* Keine Meningeosis*

p-Wert**

Zellzahl1 0-12 /3 Zellen 120,9 (1-256) 24,0 (0-204) 0,015

Eiweiß1 20-50 mg/dl 82,4 (22,3-136,2) 77,2 (17,5-207,9) n.s. 0,670

Albumin1 100-350 mg/l 565,1 (110,4-988,6) 436,9 (90,7-988,3) n.s. 0,303

Glukose1 30-80 mg/dl 48,4 (5,0-76,0) 74,9 (46,0-168,0) n.s. 0,126

Laktat1 10-20 mg/dl 24,5 (12,3-43,8) 20,8 (12,0-33,0) n.s. 0,381 1 Daten sind Mittelwerte; die Spannweite ist in Klammern angegeben * basierend auf dem durchflusszytometrischen und/oder zytologischen Nachweis ** nach dem Mann-Whitney-U-Test berechnet

4.5.1.2 Eiweißkonzentration im Liquor cerebrospinalis

Bei 62,1% (18 von 29) der Patienten ließ sich eine erhöhte Eiweißkonzentration im Liquor

messen (Referenzwert: 20-50 mg/dl). Bei einem Patienten (6) ließ sich retrospektiv die

Eiweißkonzentration im Liquor zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht ermitteln. In der

Gruppe der Patienten mit im Liquor nachgewiesenen malignen Zellen wurde in 71,4%

(5 von 7) der Fälle eine Erhöhung der Gesamteiweißkonzentration verzeichnet (Mittelwert:

82,4 mg/dl, Spannweite: 22,3-136,2 mg/dl), wohingegen die Patienten ohne Nachweis

einer Meningeosis lediglich in 59,1% (13 von 22) eine den Referenzwert übersteigende

Konzentration des Gesamteiweißes im Liquor zeigten (Mittelwert: 77,2 mg/dl,

Spannweite: 17,5- 207,9 mg/dl). Mit einem p-Wert von 0,670 ist dieser Unterschied als

nicht signifikant zu werten (vgl. Tab. 4.4).

4.5.1.3 Albuminkonzentration im Liquor cerebrospinalis

Ähnlich der Eiweißkonzentration, zeigten 69,2% der 26 Patienten, bei welchen die

Albuminkonzentration im Liquor retrospektiv ermittelt werden konnte, eine pathologisch

erhöhte Konzentration (Mittelwert: 471,4 mg/l, Spannweite: 90,7-988,6 mg/l; Referenz-

wert: 100-350 mg/l). Bei einem Vergleich der Patientengruppen mit und ohne Nachweis

maligner Zellen im Liquor zeigte sich, dass in der Population mit nachgewiesener

42

Meningeosis ein größerer Anteil der Patienten eine Erhöhung der Albuminkonzentration

aufwiesen (85,7% gegenüber 65%) und zudem der Mittelwert der Albuminkonzentration in

dieser Gruppe deutlich höher ausfiel (565,1 mg/l, Spannweite: 110,4-988,6 mg/l gegenüber

436,9 mg/l, Spannweite: 90,7-988,3 mg/l; vgl. Tab. 4.4).

4.5.1.4 Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis

Die Glukosekonzentration im Liquor (Referenzwert: 30-80 mg/dl) zeigte, dass die Liquor-

proben der Kohorte mit Nachweis von malignen Zellen im Durchschnitt tendenziell eine

niedrigere Konzentration an Glukose aufwiesen als diejenigen ohne Nachweis maligner

Zellen (48,4 mg/dl, Spannweite: 5-76 mg/dl beziehungsweise 74,9 mg/dl, Spannweite:

46-168 mg/dl), wobei die Unterschiede statistisch nicht signifikant waren (p = 0,126;

Mann-Whitney-U-Test; vgl. Tab. 4.4). Auffallend war, dass in der Population mit Menin-

geosis in 2 (25%) Fällen (Patient 3 und 6) unter den Referenzwert erniedrigte Glukose-

konzentrationen gemessen wurden. Hingegen konnte in der Gruppe ohne Meningeosis in

keinem Fall eine erniedrigte Konzentration von Glukose im Liquor nachgewiesen werden.

4.5.1.5 Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis

Gegenläufig zu den erniedrigten Glukosekonzentrationen fand sich bei Patienten mit einem

Lymphombefall des Liquorraums mit 75% (6 von 8) in der Tendenz eine erhöhte Laktat-

konzentration (Mittelwert von 24,5 mg/dl, Spannweite:12,3-43,8 mg/dl; Referenzwert:

10-20 mg/dl) verglichen mit der Gruppe ohne Meningeosis, in welcher 50% (11 von 22)

der Patienten eine erhöhte Laktatkonzentration aufwiesen (Mittelwert von 20,8 mg/dl,

Spannweite: 12,0-33,0 mg/dl; vgl. Tab. 4.4). In den 2 Fällen (Patient 3 und 6) mit einer

erniedrigten Glukosekonzentration im Liquor zeigte sich eine erhöhte Laktatkonzentration.

4.5.2 Peripheres Venenblut

Eine Korrelation der im peripheren Venenblut bestimmten Parameter mit den Ergebnissen

von Durchflusszytometrie, Zytomorphologie und MRT ergab keine wegweisende Er-

kenntnis. Ein Zusammenhang zwischen dem Vorliegen einer Meningeosis und pathologi-

schen Veränderungen im peripheren Blut konnte nicht beobachtet werden.

43

4.6 Radiologische Untersuchung

Bei allen Patienten war im Rahmen des Stagings der Lymphomerkrankung eine kranielle

Magnetresonanztomographie (cMRT) mit und ohne Gadolinium durchgeführt worden. Es

fand hierbei auch eine Beurteilung der Meningen statt, wobei eine Verdickung und/oder

Kontrastanreicherung als Lymphombefall gewertet wurde.

Insgesamt wurde in lediglich 2 Fällen (6,7%) eine Meningeosis anhand der magnet-

resonanztomographischen Befunde diagnostiziert. Bei beiden Patienten (Patient 27 und 29)

bestand ein direkter Kontakt des Tumors zum Liquorsystem. Bei 8 weiteren Patienten

(26,7%) lag der Verdacht auf eine Meningeosis vor, beziehungsweise konnte eine Menin-

geosis nicht sicher ausgeschlossen werden. In der Durchflusszytometrie konnten beide

(100%) magnetresonanztomographisch als Meningeosis gewerteten Befunde bestätigt

werden. Zytomorphologisch kamen lediglich in einem der beiden Fälle (50%) maligne

Zellen zur Darstellung.

Von den 8 Patienten, bei welchen radiologisch der Verdacht auf Meningeosis gestellt

wurde, fand man lediglich in einem Fall (12,5%) durchflusszytometrisch maligne Zellen

im Liquor. Bei 4 der 8 Patienten (50%) wurden die Befunde zytologisch als verdächtig

eingestuft (vgl. Tab. 4.1).

4.7 Einfluss von Kortikosteroiden auf den Befund einer Meningeosis

Des Weiteren wurde der Einfluss einer zum Zeitpunkt der Liquorpunktion verabreichten

Kortikosteroidtherapie auf den Nachweis maligner Zellen im Liquor untersucht. Hierzu

wurde der Nachweis einer Meningeosis mit der Applikation beziehungsweise der Nicht-

Applikation von Kortikosteroiden korreliert. Zum einen erfolgte die Korrelation

methodenunabhängig, zum anderen methodenabhängig für die Ergebnisse der Zyto-

morphologie, der Durchflusszytometrie und der MRT getrennt voneinander (vgl. Tab. 4.5).

Unter den Patienten, welche keine Steroidmedikation zum Zeitpunkt der Untersuchung

erhielten (n=16), konnten bei 7 Patienten (43,8%) durchflusszytometrisch und/oder zyto-

morphologisch maligne Zellen im Liquor nachgewiesen werden. Bei den Patienten mit

einer kortikosteroidalen Medikation hingegen (n=14) fanden sich lediglich in einem Fall

(7,1%) maligne Zellen (Patient 11). Unter den Patienten mit Nachweis einer Meningeosis

wurden lediglich bei 12,5% Steroide appliziert. 59,1% der Patienten ohne Meningeosis

wurden zum Zeitpunkt der Untersuchung mit Kortikosteroiden therapiert.

44

Tabelle 4.5 Korrelation einer Kortikosteroidmedikation mit dem Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa

Patienten ohne

Steroidmedikation (n=16) Patienten mit

Steroidmedikation (n=14)

Parameter Meningeosis Keine Meningeosis p-Wert* Meningeosis Keine Meningeosis

Alle (n=30) 7 (43,8%) 9 (56,3%) 0,024 1 (7,1%) 13 (92,9%) Durchflusszytometrie 6 (37,5%) 10 (62,5%) 0,050 1 (7,1%) 13 (92,9%) Zytologie 4 (25%) 12 (75%) 0,044 0 (0%) 14 (100%) MRT 2 (12,5%) 14 (87,5%) 0,171 0 (0%) 14 (100%)

*berechnet nach Chi-Quadrat-Test nach Pearson

Betrachtet man den Einfluss einer Steroidmedikation auf die Ergebnisse der Zytomorpho-

logie und der Durchflusszytometrie getrennt, so fällt zunächst auf, dass häufiger der

Nachweis maligner Zellen jeweils in der Gruppe ohne Steroide gelang.

Während durchflusszytometrisch in der Patientengruppe ohne kortikosteroidale Medikati-

on bei 37,5% maligne Zellen nachgewiesen wurden, gelang dies in der Gruppe mit

Kortikosteroiden in lediglich 7,1% der Fälle. Zytomorphologisch und magnetresonanz-

tomographisch konnte eine Meningeosis lymphomatosa ausschließlich in der Gruppe von

Patienten ohne Kortikosteroidmedikation zum Zeitpunkt der Untersuchung diagnostiziert

werden. In der Gruppe von Patienten ohne Steroide wurden zytomorphologisch in 25%

maligne Zellen identifiziert und magnetresonanztomographisch in 12,5% ein pathologi-

sches Kontrastmittelenhancement der Meningen beschrieben.

Nach dem Chi-Quadrat-Test nach Pearson bestand ein signifikanter Unterschied zwischen

dem Nachweis maligner Zellen in den Gruppen von Patienten mit und ohne Steroid-

medikation zum Zeitpunkt der Untersuchung mit einem Ergebnis für chi = 5,117 und

einem entsprechenden p-Wert für zweiseitige asymptotische Signifikanzen von p = 0,024.

Für die Zytomorphologie konnte ein signifikanter Unterschied in der Nachweisbarkeit

maligner Zellen im Liquor in Anhängigkeit einer Kortikosteroidmedikation festgestellt

werden (p = 0,044). Für die Durchflusszytometrie wurde das Signifikanzniveau grenz-

wertig nicht erreicht (p = 0,05). Ebenso bestand für die Magnetresonanztomographie kein

statistisch signifikanter Unterschied (p = 0,171), was auf die geringe Zahl an positiven

Nachweisen zurückzuführen ist (vgl. Tab. 4.5).

45

Des Weiteren wurden die durchflusszytometrischen Analysen hinsichtlich eines eventuel-

len Einflusses der Kortikosteroide auf einzelne Lymphozytensubpopulationen analysiert.

Es fielen in der Gruppe von Patienten mit einer Kortikosteroidmedikation im Mittelwert

eine niedrigere absolute Lymphozytenzahl (1850,6 beziehungsweise 2936,6 Zellen) sowie

ein höherer Anteil an CD3-positiven (94,6% beziehungsweise 83,7%) und CD56-positiven

Zellen (4,3% beziehungsweise 2,5%) verglichen mit der Patientengruppe ohne eine solche

Medikation auf. Darüber hinaus fand sich ein geringerer Anteil von CD19-positiven Zellen

(2,7%) in der Gruppe mit Steroidmedikation als bei Patienten, welchen zum Zeitpunkt der

Untersuchung keine Kortikosteroide verabreicht wurden (10,8%). Diese Unterschiede

erwiesen sich nach dem Mann-Whitney-U-Test als nicht signifikant.

4.8 Überleben in Abhängigkeit vom Befund einer Meningeosis lympho-matosa

Zum Zeitpunkt der Datenauswertung (03/2010) lebten noch 18 (60%) der 30 Patienten.

Das mittlere Gesamtüberleben betrug insgesamt 17,1 Monate. Angaben zum medianen

Gesamtüberleben konnten nicht gemacht werden, da zum Zeitpunkt der Datenauswertung

noch mehr als 50% der Patienten lebten. Die mediane Follow-Up-Zeit für die gesamte Ko-

horte war mit 10 Monaten (Mittelwert: 17,1 Monate, Range: 0-119 Monate) verhältnis-

mäßig kurz.

Bei einer Analyse der Überlebensdaten der 30 untersuchten Patienten mit PCNSL ließ sich

festhalten, dass die Patienten mit meningealem Befall durch das PCNSL (n = 8) mit

10,0 Monaten tendenziell kürzere mittlere Gesamtüberlebenszeiten aufwiesen als die-

jenigen, welche an einem PCNSL ohne sicheren Nachweis einer Meningeosis litten

(n = 22; mittleres Gesamtüberleben: 19,7 Monate). In Abbildung 4.5 sind die entsprechen-

den Verläufe der Kaplan-Meier-Überlebenskurven dargestellt.

46

Abbildung 4.5 Gesamtüberleben in Abhängigkeit von einer Meningeosis lymphomatosa (alle Patienten)

Aus dem Verlauf der grünen (Meningeosis) und der blauen (keine Meningeosis) Kurve ist

ersichtlich, dass tendenziell ein Überlebensvorteil bei den Patienten ohne Meningeosis

(blaue Kurve) im untersuchten Kollektiv vorlag. Kein Patient mit einem PCNSL und einer

Meningeosis (grüne Kurve) konnte länger als 21 Monate nachverfolgt werden. Dieses

Ergebnis war mit einem Wert für Chi-Quadrat (nach Pearson) von 0,987 und einem p-Wert

von 0,320 nach dem Log-rank-Test statistisch nicht signifikant.

Nach Ausschluss der Patienten, welche zum Zeitpunkt der Untersuchung Kortikosteroide

erhielten, lag das mittlere Überleben bei Patienten mit nachgewiesener Meningeosis (n = 7)

bei 9,9 Monaten; bei denjenigen ohne Befund einer Meningeosis (n = 9) bei 39,2 Monaten.

Aus dem Verlauf der Kaplan-Meier-Überlebenskurven in Abbildung 4.6 kommt der in

Abbildung 4.5 bestehende Unterschied zwischen den Gruppen mit und ohne kortiko-

steroidaler Medikation deutlicher zum Ausdruck und ist mit einem Wert von 6,902 für Chi-

Quadrat (nach Pearson) und einem p-Wert von 0,009 nach dem Log-rank-Test statistisch

signifikant.

47

Abbildung 4.6 Gesamtüberleben in Abhängigkeit von einer Meningeosis lymphomatosa (Patienten ohne Steroidmedikation)

48

5 Diskussion

5.1 Zytomorphologischer Nachweis maligner Zellen im Liquor

Die Zytomorphologie wird nach wie vor von vielen Autoren als Goldstandard zur Detek-

tion maligner Zellen im Liquor cerebrospinalis angesehen und als Referenzmethode in

vielen klinischen Untersuchungen genutzt (Korfel et al., 2012). Seit geraumer Zeit ist

bekannt, dass die konventionelle Zytomorphologie zu einer großen Zahl falsch-positiver

und falsch-negativer Ergebnisse führt. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass bei

Patienten mit autoptisch oder radiologisch nachgewiesenem meningealem Befall durch

einen soliden Tumor oder eine hämatologische Neoplasie in bis zu 41% der Fälle der

zytomorphologische Nachweis maligner Zellen im Liquor nicht gelang (Freilich et al.,

1995; Glass et al., 1979).

Mit konventionellen Färbemethoden ist die definitive Diagnose einer Meningeosis

lymphomatosa häufig nur schwer zu stellen, da eine Vielzahl verschiedener infektiöser und

nicht-infektiöser Befunde zytomorphologisch zum Teil nur schwierig bis unmöglich von-

einander zu differenzieren sind (Goodson und Strauss, 1979; Li et al., 1986). Neben der

Schwierigkeit, reaktive von malignen Lymphozyten zu unterscheiden, kann eine mono-

klonale Lymphozytenpopulation zytomorphologisch zuweilen auch völlig unauffällig

erscheinen und somit nicht von normalen Lymphozyten unterschieden werden (Li et al.,

1986).

Die zytomorphologische Untersuchung ist in hohem Maße von der Erfahrung des Unter-

suchers abhängig, wobei Glantz et al. postulieren, dass falsch-positive Untersuchungs-

ergebnisse in der Hand eines erfahrenen Untersuchers selten seien. Falsch-negative

Ergebnisse sind weder selten, noch allein auf einen inkompetenten Untersucher zurückzu-

führen (Glantz et al., 1998a). Eine Großzahl technischer und logistischer Gegebenheiten

haben Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit, mit welcher maligne Zellen zytomorphologisch

nachgewiesen werden können. Einfluss auf die zytomorphologische Detektion maligner

Zellen haben das zur Verfügung stehende Liquorvolumen, der Ort der Liquorentnahme,

eine sachgemäße Handhabung der gewonnen Proben und die Frequenz der Liquor-

entnahmen (Glantz et al., 1998a). Die Tatsache, dass sowohl falsch-positive als auch

falsch-negative Untersuchungs-ergebnisse auftreten, zeigt die Notwendigkeit komplemen-

tärer Untersuchungsverfahren.

49

5.2 Durchflusszytometrischer Nachweis maligner Zellen im Liquor

Die Durchflusszytometrie ist eine objektive quantitative Methode zum Nachweis maligner

Zellenpopulationen anhand eines klonalen, von den übrigen Lymphozyten abweichenden

Phänotypus (Ward, 1999).

In verschiedenen Arbeiten ist gezeigt worden, dass der zytomorphologische Nachweis

maligner Zellen typischerweise in Fällen mit einer Liquorpleozytose gelingt, während die

Durchflusszytometrie auch in normozellulären Proben Monoklonalität in einem hohen

Prozentsatz der Fälle darstellen kann. Auf diese Weise können theoretisch aberrante

Lymphozytenpopulationen, welche weniger als 0,01% aller in einer Liquorprobe ent-

haltenen Lymphozyten ausmachen, erfasst werden und ein sonst okkulter Befall der

Meningen aufgedeckt werden. Für den zytologischen Nachweis hingegen sind in der Regel

mindestens 5% maligne Zellen nötig (Hegde et al., 2005).

Häufig erwies sich die Durchflusszytometrie als sensitiveres Verfahren zum Nachweis

einer Meningeosis lymphomatosa als die Zytomorphologie (Finn et al., 1998; French et al.,

2000; Bromberg et al., 2007). Hedge et al. konnten zum Beispiel zeigen, dass im Falle von

Patienten mit Erstdiagnose eines aggressiven B-Zell-Lymphoms und erhöhtem Risiko

einer ZNS-Beteiligung in der Durchflusszytometrie in 11 von 51 Fällen (22%) mono-

klonale Lymphozytenpopulationen nachgewiesen werden konnten, hingegen gelang der

zytomorphologische Nachweis maligner Zellen nur bei einem dieser Patienten (Hegde et

al., 2005). Auch Bromberg et al. wiesen eine höhere Sensitivität der Durchflusszytometrie

im Vergleich zur Zytomorphologie an einer Serie von 266 Patienten mit malignen hämato-

logischen Erkrankungen nach. Hier ließ sich durchflusszytometrisch bereits in 73% aller

Patienten mit Nachweis einer Meningeosis im Verlauf, in der erstuntersuchten Liquor-

proben ein Befall des Liquorkompartiments belegen. Zytomorphologisch wurden lediglich

bei 32% in der Erstuntersuchung maligne Zellen im Liquor detektiert (Bromberg et al.,

2007). Eine Arbeit von Quijano et al. unterstreicht ebenfalls die eben beschriebenen

Ergebnisse. In ihrer Arbeit an 123 Patienten mit aggressiven B-Zell-Lymphomen und er-

höhtem Risiko einer ZNS-Beteiligung gelang lediglich bei 6% der Patienten zytomorpho-

logisch der Nachweis maligner Zellen im Liquor, hingegen durchflusszytometrisch bei

22% (Quijano et al., 2009).

50

5.3 Zytomorphologischer und durchflusszytometrischer Nachweis eines leptomeningealen Befalls von Patienten mit PCNSL im Vergleich

Im Vergleich zu Studien, welche sich mit dem zytopathologischen Nachweis einer Menin-

geosis lymphomatosa befassen, gibt es nur wenige Arbeiten zum durchflusszytometrischen

Nachweis maligner Zellen im Liquor cerebrospinalis. Bezüglich Lymphomerkrankungen

handelt es sich dabei vornehmlich, wie oben beschrieben, um den sekundären Befall der

Meningen durch aggressive systemische B-Zell-Lymphome (Quijano et al., 2009; Hegde et

al., 2005). Die vorliegende Arbeit umfasst die erste systematische Untersuchung von

Liquor cerebrospinalis immunkompetenter Patienten mit PCNSL mittels Durchflusszyto-

metrie.

Analog zu den oben zitierten Arbeiten zum sekundären Befall der Meningen durch aggres-

sive B-Zell-Lymphome (Hegde et al., 2005; Bromberg et al., 2007; Quijano et al., 2009),

erwies sich in der vorliegenden Arbeit auch für PCNSL die Durchflusszytometrie als ein

sensitiveres Verfahren zum Nachweis maligner Zellen im Liquor verglichen mit der Zyto-

morphologie. In der Literatur wird die zytomorphologisch ermittelte Prävalenz einer

Meningeosis lymphomatosa bei PCNSL mit 16-26% angegeben (Balmaceda et al., 1995;

Fischer et al., 2008); in dem dieser Arbeit zugrunde liegenden Kollektiv fand sich ein zyto-

morphologischer Nachweis maligner Zellen bei 13% der Patienten (4 von 30 Patienten).

Durchflusszytometrisch konnte hingegen bei 23% der Patienten (7 von 30 Patienten) ein

Befall des Liquors durch das PCNSL nachgewiesen werden. Lymphomzellpopulationen

wurden in der Durchflusszytometrie anhand einer aberranten CD45-Expression, einer

übermäßigen Expression von CD10 und/oder einer Leichtkettenrestriktion identifiziert. In

der vorliegenden Arbeit konnte in 57% der Fälle (17 von 30 Patienten) übereinstimmend in

Durchflusszytometrie und Zytopathologie eine Meningeosis ausgeschlossen werden. In

drei Fällen (10 %) gelang der Nachweis maligner Zellen sowohl zytomorphologisch als

auch durchflusszytometrisch. Zu widersprüchlichen Untersuchungsergebnissen kam es in

13% der Fälle (Patienten 11, 18, 23 und 27), wobei 3 der 7 (43 %) durchflusszytometrisch

detektierten Patienten zytomorphologisch keinen Anhalt für Malignität zeigten. Im Falle

eines Patienten (Patient 6) mit ausschließlich durchflusszytometrischem Nachweis einer

Lymphomzellpopulation fanden sich zytomorphologisch nur fraglich maligne Zellen im

Liquor. Im Liquor von Patient 18 konnten lediglich zytomorphologisch maligne Zellen

identifiziert werden, während sich durchflusszytometrisch und magnetresonanztomo-

graphisch kein Anhalt für das Vorliegen einer Beteiligung des Liquorkompartiments ergab.

51

Im Gegensatz zu den Ergebnissen unserer Arbeit konnten Kiewe et al. keine höhere Sensi-

tivität der Durchflusszytometrie für den Nachweis einer meningealen Dissemination bei

PCNSL gegenüber der Zytomorphologie nachweisen (Kiewe et al., 2010). Bei nur einem

von 32 Patienten (3%) konnte durchflusszytometrisch ein Befall des Liquorkompartiments

erfasst werden und lediglich einer von 4 (25%) zytomorphologisch als Meningeosis

lymphomatosa eingestuften Liquorbefunden letztlich durchflusszytometrisch bestätigt

werden. Mögliche Gründe für die diskrepanten Untersuchungsergebnisse sind am ehesten

in technischen Unterschieden der zugrunde liegenden durchflusszytometrischen Unter-

suchungsprotokolle zu sehen, so wurde unter anderem in der Arbeit von Kiewe et al. nicht

die Koexpression von CD10 untersucht.

5.3.1 Diskrepanz der Ergebnisse von Durchflusszytometrie und Zytomorphologie

Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der Untersuchungsergebnisse von Durch-

flusszytometrie und Zytomorphologie ist in der Schwierigkeit zu sehen, zytomorpholo-

gisch reaktive von neoplastischen Lymphozyten zu unterscheiden, wie bereits von ver-

schiedenen Autoren berichtet (Li et al., 1986, Hegde et al., 2005, Schinstine et al., 2006).

Darüberhinaus scheint die Quantität von Tumorzellen in den Liquorproben Einfluss auf

das Untersuchungsergebnis zu haben, wobei methodisch bedingt in der Durchflusszyto-

metrie ein geringerer Anteil von neoplastischen Zellen an der Gesamtzellzahl zum Nach-

weis ausreicht, verglichen mit der Zytomorphologie (Hegde et al., 2005; French et al.,

2000; Stetler-Stevenson und Braylan, 2001; Tani et al., 1995; Finn et al., 1998). Für die

Anfertigung zytologischer Präparate standen 2 ml Liquor von jedem Patienten zur Verfü-

gung, wohingegen 5 ml Liquor für die durchflusszytometrische Analyse eingesetzt wurden.

Dieses ging möglicherweise mit einer größeren Anzahl maligner Zellen einher und könnte

somit die Nachweiswahrscheinlichkeit maligner Zellen in der Durchflusszytometrie erhöht

haben.

Im Patientenkollektiv der vorliegenden Arbeit, mit ausschließlich diffus-großzelligen B-

Zell-NHL (DLBCL), variierte der Anteil CD19-positiver Lymphozyten im Liquor von

Patienten mit Nachweis maligner Zellen in der Durchflusszytometrie von 1,1 bis 72%. Der

Patient (27) mit dem potenziell geringsten Anteil neoplastischer Zellen im Liquor (1,1%)

wurde trotz einer ausgeprägten Liquorpleozytose (256 /3 Zellen) lediglich durchflusszyto-

metrisch detektiert und erschien zytomorphologisch unauffällig. Dieses Ergebnis erhärtet

die von Hedge et al. postulierte These, dass für die durchflusszytometrische Diagnose einer

52

Meningeosis weniger maligne Zellen im Liquor erforderlich sind als für einen entspre-

chenden zytologischen Nachweis (Hegde et al., 2005).

Auffallend in der vorliegenden Arbeit war der hohe Anteil an Patienten, bei denen zyto-

morphologisch die Lymphozyten im Liquor nur fraglich als maligne beschrieben wurden.

Von den 6 Patienten mit fraglichem Nachweis maligner Zellen in der Zytomorphologie

konnten pathologische Lymphozyten durchflusszytometrisch lediglich bei einem Patienten

(Patient 6) detektiert werden.

5.3.2 Relevanz von zytomorphologisch negativen und durchflusszytometrisch posi-

tiven Ergebnissen

Quijano et al. berichteten über neurologische Symptome, häufig mit Beteiligung der Hirn-

nerven, in über 50% der jeweils durchflusszytometrisch positiven bzw. zytomorphologisch

negativen Patienten (Quijano et al., 2009). In dem von Hegde et al. untersuchten Kollektiv

erlitten 5 von 11 (45,5%) durchflusszytometrisch positiven und zytomorphologisch negati-

ven Patienten im Verlauf ein ZNS-Rezidiv. Dies traf im Gegensatz dazu lediglich auf

3 von 40 (7,5%) Patienten mit sowohl negativem durchflusszytometrischem, als auch

negativem zytomorphologischem Ergebnis zu (Hegde et al., 2005).

Eine Aussage über die klinische Relevanz von durchflusszytometrisch positiven und

gleichzeitig zytomorphologisch negativen Befunden, basierend auf den Daten der vorlie-

genden Arbeit, war in Anbetracht der kurzen Follow-Up-Zeit nicht möglich. Zudem lag in

der untersuchten Patientengruppe der weitere Erkrankungsverlauf zum Auswertungszeit-

punkt nicht bei allen Patienten vor. Zu berücksichtigen war darüber hinaus, dass in den

Arbeiten von Quijano et al. und Hegde et al. über Patienten mit einem sekundären

Lymphombefall des ZNS berichtet wurde, ohne Angaben über eine eventuelle zyto-

statische Therapie. Die Vergleichbarkeit der Arbeiten ist insofern eingeschränkt, als dass

gängige Therapieregime für systemische NHL häufig nicht ZNS-gängig sind, bei PCNSL

das ZNS hingegen grundsätzlich Ziel der Therapie ist.

5.3.3 Kritische Betrachtung der Untersuchungsverfahren

Glantz et al. (Glantz et al., 1998a) zufolge können falsch-negative Ergebnisse in der Zyto-

morphologie durch verschiedene Verfahrensweisen minimiert werden. Nach Auffassung

53

der Autoren sollte 1) ein ausreichendes Liquorvolumen (> 10,5 ml) entnommen werden,

2) dieses unmittelbar weiterverarbeitet werden, 3) nach Möglichkeit an einem Ort mit

sicherem meningealem Befall punktiert werden und 4) sollte die Punktion im Falle eines

negativen zytologischen Ergebnisses wiederholt werden.

Überprüft man anhand dieser Empfehlungen das von uns zur Probengewinnung und deren

Verarbeitung erfolgte Procedere, so lässt sich feststellen, dass lediglich 2 ml Liquor für die

zytomorphologische Untersuchung zur Verfügung standen, diese allerdings zeitnah durch

Zentrifugation (200 x g für 10 min.) vorkonzentriert wurden und die Zellsuspension

anschließend direkt auf einen Objektträger übertragen und gefärbt werden konnte.

Bezüglich der Lokalisation der Liquorpunktion konnten Murray et al. nachweisen, dass

sowohl die Liquorkonzentrationen von Protein und Glukose, wie auch die Zahl der malig-

nen Zellen in Abhängigkeit der Entnahmestelle in Bezug auf die Neuroachse variieren,

selbst wenn der Liquorfluss an keiner Stelle durch eine Obstruktion behindert wird

(Murray et al., 1983). Diese Ergebnisse spiegeln den multifokalen Befall der Meningen

wider und scheinen ursächlich für einen negativen Untersuchungsbefund, wenn die

Probenentnahme weit entfernt vom fokalen Befall der Meningen erfolgte. In einer Serie

von 60 Patienten ohne Nachweis einer Liquorabflussstörung mit zytomorphologischem

Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa in lumbal entnommenen Liquorproben zeigten

simultan ventrikulär entnommene Liquorproben in mehr als 30% der Fälle diskordante

Ergebnisse. Es wurde zudem berichtet, dass bei Patienten mit spinalen Symptomen des

meningealen Befalls ein positiver zytologischer Befund bei Durchführung einer Lumbal-

punktion wahrscheinlicher war als in ventrikulär entnommenen Proben und umgekehrt

(Chamberlain et al., 2001).

Im Patientenkollektiv dieser Arbeit wurde der Liquor routinemäßig ohne besondere

Berücksichtigung einer möglicherweise in der Magnetresonanztomographie beschriebenen

Lokalisation des meningealen Befalls oder fokaler neurologischer Defizite des Patienten

lumbal gewonnen. Die Proben für die Durchflusszytometrie und Zytomorphologie wurden

zwar an gleicher Stelle während der gleichen Punktion entnommen, jedoch nacheinander in

zwei unterschiedliche Probenröhrchen gefüllt. Somit ist denkbar, dass jede Probe einen

unterschiedlich hohen Anteil neoplastischer Zellen beinhalten könnte. In zukünftigen

prospektiven Studien sollte daher Liquor, welcher nacheinander für unterschiedliche

Untersuchungsverfahren in verschiedene Proberöhrchen entnommen wird, durchmischt

werden und gleiche Probenvolumina für die verschiedenen Methoden zur Verfügung ge-

54

stellt werden, um mögliche Konzentrationsunterschiede maligner Zellen in den Proben

weitgehend auszugleichen.

In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich bei bis zu 45% der Patienten mit

positiver Liquorzytologie bei einer ersten zytologischen Untersuchung keine malignen

Zellen fanden (Glass et al., 1979). Die Nachweisrate konnte mit einer zweiten liquorzyto-

logischen Untersuchung auf bis zu 92% gesteigert werden, was zunächst von Wasserstrom

et al. gezeigt und später anhand verschiedener Studien untermauert werden konnte

(Wasserstrom et al., 1982; Kaplan et al., 1990; Balm und Hammack, 1996). Aufgrund der

Tatsache, dass in dem von uns untersuchten Kollektiv von jedem Patienten nur eine

Liquorprobe asserviert wurde, ist es möglich, dass die wahre Prävalenz einer Meningeosis

bei PCNSL die von uns ermittelten Zahlen noch übertrifft.

5.4 Konventionelle Laborparameter im Liquor cerebrospinalis

5.4.1 Pleozytose

In zahlreichen Studien konnte ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten eine Pleozytose

im Liquor und einer Meningeosis lymphomatosa gezeigt werden (Fischer et al., 2006;

Quijano et al., 2009). Fischer et al. beschrieben eine signifikante Korrelation von Zellzahl

im Liquor und dem zytomorphologischen, PCR- oder magnetresonanztomographischen

Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa. In ihrer Arbeit konnte eine Meningeosis

lymphomatosa bei 23% der Patienten mit erhöhter Zellzahl im Liquor (> 5 Zellen/µl) im

Gegensatz zu 5% der Patienten mit normwertiger Zellzahl (≤ 5 Zellen/µl) diagnostiziert

werden (Fischer et al., 2008). Ebenso bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

die These, dass eine Pleozytose im Liquor eng mit dem Nachweis einer Meningeosis korre-

liert und somit einen prädiktiven Parameter für eine meningeale Dissemination eines

(ZNS-) Lymphoms darstellt. In 87,5% (7 von 8) der Patienten mit nachgewiesener

Meningeosis lymphomatosa wurde eine Pleozytose im Liquor festgestellt und lediglich in

40,9% (9 von 22) der Patienten ohne Meningeosis. Dieses Ergebnis erwies sich mit

Mittelwerten von 120,9 /3 Zellen (Spannweite: 1-256) beziehungsweise von 24,1 /3 Zellen

(Spannweite: 0-204) als statistisch signifikant (p = 0,015, Mann-Whitney-U-Test; vgl. Tab.

4.4). Entsprechend errechnete sich für das dieser Untersuchung zugrunde liegende Kol-

lektiv ein positiv prädiktiver Wert von 87,5% für das Vorliegen einer Meningeosis im Falle

einer Liquorpleozytose und ein negativ prädiktiver Wert von 92,9%. Von den 14 Patienten

55

ohne eine Pleozytose im Liquor konnte lediglich bei einem (Patient 23) eine Meningeosis

detektiert werden. Obgleich ein signifikanter Unterschied bestand, konnte eine fehlende

Pleozytose im Liquor nicht als sicheres Ausschlusskriterium einer meningealen Dissemina-

tion gewertet werden. Kaplan et al. zeigten, dass in 29% bei den von ihnen untersuchten

Patienten mit lymphomatöser oder leukämischer Meningeosis keine erhöhte Liquorzellzahl

gemessen wurde (Kaplan et al., 1990). Zu postulieren ist, dass mit der Einführung von

Nachweisverfahren mit einer verbesserten Sensitivität für den Nachweis von Lymphom-

zellen im Liquor, der Anteil von Patienten mit einer Meningeosis lymphomatosa und

normwertiger Liquorzellzahl womöglich in Zukunft steigt. Im Umkehrschluss kann eine

Pleozytose in der Gesamtschau von klinischen, neuroradiologischen und laborchemischen

Befunden einen zusätzlichen Hinweis für das Vorliegen einer Meningeosis geben, wobei

ihr Stellenwert jedoch keinenfalls überschätzt werden darf.

5.4.2 Liquorproteinkonzentration

Erhöhte Konzentrationen von Protein im Liquor wurden von einigen Autoren als ein

weiterer Indikator für eine Meningeosis beschrieben (Balmaceda et al., 1995; DeAngelis et

al., 2002). In anderen Studien konnte dieser Zusammenhang nicht nachvollzogen werden

(Ferreri et al., 2003b; Fischer et al., 2008). In dem Kollektiv dieser Arbeit fanden sich nahe

beieinander liegende Mittelwerte in den Gruppen derer mit und ohne Meningeosis

(82,4 mg/dl und 77,2 mg/dl; p = 0,670, Mann-Whitney-U-Test). Eine erhöhte Protein-

konzentration im Liquor (>50 mg/dl) wurde in dem von uns untersuchten Patienten-

kollektiv in 62,1% (18 von 29 Patienten) gemessen. Es ist zu vermuten, dass eine erhöhte

Proteinkonzentration im Liquor die Schwere des Tumorleidens und/oder verschiedene

Grade einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke widerspiegelt (Ferreri et al., 2003b).

5.4.3 Glukose- und Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis

Unterschiede in den Konzentrationen von Glukose und Laktat im Liquor zwischen den

Gruppen mit und ohne meningeale Dissemination erwiesen sich als statistisch nicht

signifikant. Der Befund von verhältnismäßig niedrigen Glukose- und hohen Laktat-

konzentrationen in der Gruppe von Patienten mit einer Meningeosis spricht für einen

gesteigerten Glukoseumsatz im tumorzellhaltigen Liquor.

56

5.5 Magnetresonanztomographie

Die MRT vermag nach Angaben in der Literatur in 23-71% der Patienten mit dem

liquorzytologischen Nachweis maligner Zellen pathologische, jedoch nicht spezifische

Befunde abzubilden (Krol et al., 1988; Chamberlain et al., 1990; Davis et al., 1987;

Sze et al., 1989; Yousem et al., 1990). In den meisten Fällen weist ein meningeales

Kontrastmittelenhancement auf einen Befall der Meningen hin (Freilich et al., 1995). In

den von uns erhobenen Daten zeigte die MRT im Vergleich zur Zytomorphologie und

Durchflusszytometrie mit Abstand die geringste Sensitivität aller drei Untersuchungs-

modalitäten. Bei lediglich 2 (25%) der insgesamt 8 Patienten mit durchflusszytometri-

schem und/oder zytomorphologischem Nachweis einer Meningeosis lymphomatosa, zeigte

sich in der MRT ein Kontrastmittelenhancement der Meningen beziehungsweise ein

direkter Kontakt des Tumors zum Liquorsystem. Bei 8 weiteren Patienten (26,7%) konnte

eine Meningeosis nicht sicher ausgeschlossen werden, jedoch imponierte der Großteil

dieser Patienten unauffällig in Durchflusszytometrie und Zytomorphologie (vgl. Tab. 4.1).

Dieses Ergebnis untermauert die Annahme, dass disseminierte Läsionen an den Meningen

kernspintomographisch nur sehr schwierig und mit geringer Sensitivität zu diagnostizieren

sind (Freilich et al., 1995).

5.6 Einfluss von Kortikosteroiden auf den Lymphomzellennachweis im Liquor

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Kortikosteroiden auf die durch-

flusszytometrische und zytomorphologische Nachweisbarkeit von Lymphomzellen im

Liquor zu untersuchen. Kortikosteroide besitzen, neben ihren antiödematösen Eigen-

schaften, einen zytotoxischen Effekt auf Lymphomzellen. Schon bei der Applikation über

einen kurzen Zeitraum bewirken sie, unter anderem durch die Induktion einer Apoptose

(Geppert et al., 1990), einen Zerfall des Tumorgewebes (Evans-Storms und Cidlowski,

1995; Iwata, 1995; Wyllie, 1980). Dieser Effekt erschwert die histopathologische

Befundung von bioptisch gewonnenem Material erheblich. In Proben, welche nach der

Applikation von Kortikosteroiden entnommen wurden, findet sich häufig lediglich glio-

tisch verändertes Hirnparenchym. Die verbleibenden Lymphozyten erscheinen klein, nicht-

neoplastisch und entsprechen häufig CD3-positiven T-Lymphozyten (Commins, 2006).

Um den Einfluss von Kortikosteroiden auf den durchflusszytometrischen und zytomorpho-

57

logischen Nachweis maligner Zellen im Liquor darzustellen, erfolgte eine Analyse der

Ergebnisse getrennt nach Patienten, welchen zum Zeitpunkt der Probengewinnung

und/oder in den 28 Tagen zuvor Kortikosteroide verabreicht wurden, und denen ohne eine

solche Medikation. Zu berücksichtigen ist, dass sowohl die Dosis der Kortikoid-

medikation, als auch der Applikationszeitraum nicht einheitlich waren. Die kleinste verab-

reichte Tagesdosis betrug 2,5 mg Prednisolon (Decortin H®), die höchste 24 mg Dexa-

methason (Fortecortin®).

Zwischen der Diagnose einer Meningeosis und der Applikation beziehungsweise der

Nicht-Applikation von Kortikosteroiden bestand eine statistisch signifikante Beziehung,

berechnet nach dem Chi-Quadrat-Test nach Pearson (κ = 5,117; p = 0,024). Unter den

Patienten ohne kortikosteroidale Medikation zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion gelang

der Nachweis maligner Zellen in 7 von 16 Fällen (43,8%). Bei nur einem von 14 Patienten

(7,1%) konnte in der Gruppe mit Kortikosteroiden eine Meningeosis durchflusszyto-

metrisch detektiert werden. Dieser Patient (11) nahm zum Zeitpunkt der Liquorpunktion

Dexamethason (3 x 8 mg täglich) ein. Zytomorphologisch und magnetresonanztomo-

graphisch gelang der Nachweis einer Meningeosis ausschließlich in der Gruppe ohne eine

kortikosteroidale Medikation.

In einer Arbeit von Korfel et al. war von 396 Patienten bekannt, ob diese Kortikosteroide

erhalten hatten. Der Nachweis einer Meningeosis erfolgte zytomorphologisch, molekular-

genetisch durch eine PCR des Rearrangements des IgH Gens in der CDR-III-Region oder

magnetresonanztomographisch. Ein Zusammenhang zwischen einer kortikosteroidalen

Medikation und der Nachweisbarkeit einer Meningeosis lymphomatosa ließ sich nicht dar-

stellen. In der Gruppe mit bekannter kortikosteroidaler Medikation gelang der Nachweis in

8,8%, gegenüber 12,7% in der kortikosteroidnaiven Patientengruppe (Korfel et al., 2012).

Auch wenn unsere Ergebnisse Grund zur Annahme geben, dass neben der histologischen

Nachweisbarkeit von PCNSL auch die durchflusszytometrische und zytomorphologische

Diagnose einer Meningeosis lymphomatosa durch den Einsatz von Kortikosteroiden

erschwert wird (vgl. Tab. 4.5), so ließ sich dieses in anderen Arbeiten nicht bestätigen. In

zukünftigen Untersuchungen von Patienten mit einem ZNS-Lymphom sollte die Verwen-

dung von Kortikosteroiden daher dokumentiert und analysiert werden.

Des Weiteren wurden die Ergebnisse der Durchflusszytometrie hinsichtlich eines Effekts

der kortikosteroidalen Medikation auf verschiedene Lymphozytenpopulationen untersucht,

welcher eine Erklärung dafür bieten könnte, dass in der Gruppe der Patienten mit einer

58

Kortikosteroidmedikation der Nachweis maligner Zellen sowohl durchflusszytometrisch,

als auch zytologisch deutlich seltener gelang. Durchflusszytometrisch fanden sich vor

allem bezüglich der Lymphozytenzahl, absolut und relativ, aber auch in der Verteilung von

CD3-positiven und CD19-positiven Zellen, diskrete Unterschiede zwischen den Patienten

mit beziehungsweise ohne eine Kortikosteroidmedikation. Statistisch erwiesen sich diese

Unterschiede jedoch als nicht signifikant.

5.7 Überleben der Patienten unter Berücksichtigung des leptomeningea-len Lymphomnachweises

In einer retrospektiven monozentrischen Studie mit 92 PCNSL-Patienten ermittelte Über-

lebensdaten zeigten ein medianes Überleben von Patienten mit einer Meningeosis von 45,5

Monaten verglichen mit Patienten ohne Nachweis eines leptomeningealen Lymphom-

befalls von 42,5 Monaten (p = 0,340; Log-rank-Test). Der Nachweis einer Meningeosis

erfolgte hier zytomorphologisch, mittels Immunphänotypisierung und/oder durch eine PCR

des Rearrangements des IgH Gens in der CDR III Region. Bei alleiniger Betrachtung der

Patienten mit zytomorphologischem Nachweis eines Lymphombefalls des Liquor-

kompartiments hatten die Patienten mit positivem Befund eine mediane Überlebensrate

von 18,5 Monaten und diejenigen mit negativer oder verdächtiger Zytomorphologie von

45 Monaten (p = 0,017; Log-rank-Test) (Kiewe et al., 2010).

In einer Arbeit von Korfel et al. mit Einschluss von 415 PCNSL-Patienten wurde keine

signifikante Korrelation zwischen dem Vorliegen einer Meningeosis und dem Gesamtüber-

leben beobachtet. Hier erfolgte der Nachweis einer Meningeosis zytomorphologisch, mit-

tels IgH-CDR3 PCR und/oder magnetresonanztomographisch. Die Therapieregime in den

beiden Gruppen hatten sich nicht maßgeblich unterschieden. Das mediane Überleben lag

bei 21,5 Monaten von Patienten mit Meningeosis und bei 24,9 Monaten in der Gruppe

ohne Nachweis einer solchen (p = 0.98; Log-rank-Test) (Korfel et al., 2012).

Das mediane Überleben der Patienten der vorliegenden Arbeit war zum Zeitpunkt der

Datenanalyse noch nicht erreicht, da noch mehr als 50% der Patienten lebten. Ein-

schränkend muss festgehalten werden, dass die Liquoruntersuchungen nicht grundsätzlich

zum Zeitpunkt der Erstdiagnose des PCNSL und/oder einer Meningeosis lymphomatosa

erfolgte. Daraus resultiert ein eventuelles Unterschätzen des Gesamtüberlebens und der

Follow-Up-Zeit. Anhand der Kaplan-Meier-Überlebenskurve konnte jedoch die Über-

59

lebensfunktion im Rahmen einer Ereigniszeitanalyse abgeschätzt werden.

Nach der Kaplan-Meier-Kurve (vgl. Abb. 4.5) zeigten diejenigen Patienten, welche an

einem PCNSL ohne Meningeosis litten (n = 22; mittleres Gesamtüberleben 19,7 Monate)

im Trend ein besseres Überleben, als diejenigen mit Nachweis maligner Zellen im Liquor

(n = 8; mittleres Gesamtüberleben 10,0 Monate). Betrachtet man den Verlauf der Kaplan-

Meier-Überlebenskurven, so erkennt man einen steileren Kurvenabfall in der Patienten-

gruppe mit Meningeosis, was einer erhöhten Sterberate in den ersten Monaten nach

Diagnosestellung entspricht. Statistisch erwies sich dieses Ergebnis jedoch als nicht

signifikant (p = 0,320; Log-rank-Test).

Wenn man von einem Einfluss der Kortikosteroide auf die Nachweisbarkeit von malignen

Zellen in bioptisch gewonnenem Tumorgewebe oder im Liquor ausgeht, so erscheint es

plausibel, nur die Daten kortikosteroidnaiver Patienten bei der Überlebensanalyse zu

berücksichtigen (vgl. Abb. 4.6). Unter dieser Voraussetzung fand sich ein statistisch signi-

fikanter Unterschied (p = 0,009; Log-rank-Test) zwischen den beiden Patientengruppen

mit (n = 7) und ohne (n = 9) Nachweis einer Meningeosis. Das mittlere Überleben von

Patienten mit PCNSL ohne Meningeosis war mit 39,2 Monaten signifikant länger als das

der Patienten mit im Liquor durchflusszytometrisch und/oder zytomorphologisch nach-

gewiesen malignen Zellen (mittleres Gesamtüberleben 9,9 Monate). Aufgrund der im

Verhältnis kleinen Patientenzahl und des kurzen Zeitraumes der Verlaufsbeobachtung

(mediane Follow-up-Zeit 10 Monate) ist der Aussagewert der Überlebenszeitanalyse als

eingeschränkt zu bewerten.

60

Zusammenfassung

Eine meningeale Dissemination bzw. Beteiligung des Liquor cerebrospinalis bei Patienten

mit primärem ZNS-Lymphom (PCNSL) spielt im Rahmen der Diagnosestellung und

vermutlich für die Prognose eine Rolle und bedarf einer frühzeitigen und zuverlässigen

Diagnostik. Aufgrund der eingeschränkten Sensitivität der konventionellen zytomorpholo-

gischen Untersuchung des Liquor cerebrospinalis gilt alternativen Nachweisverfahren ein

großes wissenschaftliches Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Stellenwert der

Durchflusszytometrie im Vergleich zur konventionellen Zytomorphologie und Magnet-

resonanztomographie in Bezug auf den Nachweis einer meningealen Dissemination bei

PCNSL-Patienten untersucht. Ferner sollte der Einfluss von Kortikosteroiden auf die

durchflusszytometrische und zytomorphologische Nachweisbarkeit von Lymphomzellen

im Liquor cerebrospinalis analysiert werden.

In dem dieser Arbeit zugrunde liegenden Kollektiv (n = 30) mit PCNSL vom Typ der

diffusen großzelligen B-Zell-NHL (DLBCL) konnten zytomorphologisch bei 4 Patienten

(13,3%) und magnetresonanztomographisch bei 2 Patienten (6,7%) eine Meningeosis

lymphomatosa diagnostiziert werden. Durchflusszytometrisch ließen sich bei 7 Patienten

(23,3%) Lymphomzellen im Liquor detektieren. Die Lymphomzellen wurden durch-

flusszytometrisch anhand einer aberranten Expression des Antigens CD45, einer über-

mäßigen Expression des Antigens CD10 und/oder einer Leichtkettenrestriktion identifi-

ziert. Wie bereits von verschiedenen Autoren für eine sekundäre meningeale Dis-

semination von aggressiven systemischen B-Zell-Lymphomen beschrieben, bewies die

Durchflusszytometrie verglichen mit der konventionellen Zytomorphologie und der

Magnetresonanztomographie für PCNSL eine verbesserte Sensitivität beim Nachweis von

Lymphomzellen im Liquor cerebrospinalis. Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der

Untersuchungsergebnisse von Durchflusszytometrie und Zytomorphologie ist in der

Schwierigkeit zu sehen, reaktive von neoplastischen Lymphozyten zytomorphologisch zu

unterscheiden. Darüber hinaus scheint die Quantität von Tumorzellen in den Liquorproben

Einfluss auf das Untersuchungsergebnis zu haben, wobei methodisch bedingt in der Durch-

flusszytometrie ein geringerer Anteil von neoplastischen Zellen an der Gesamtzellzahl zum

Nachweis ausreicht, verglichen mit der Zytomorphologie.

Bezüglich der laborchemischen Analysen der Liquorproben unterstützten die Ergebnisse

dieser Untersuchung die These, dass eine Pleozytose im Liquor mit dem Nachweis einer

61

Meningeosis assoziiert ist und somit einen prädiktiven Parameter für eine meningeale Dis-

semination bei PCNSL darstellt. So konnte in der Gruppe mit einer Pleozytose im Liquor

signifikant häufiger eine meningeale Dissemination nachgewiesen werden (p-Wert 0,015;

Mann-Whitney-U-Test). Hingegen fanden wir keine statistisch signifikante Beziehung

zwischen einer erhöhten Liquorprotein-Konzentration und einer Meningeosis lympho-

matosa (p-Wert 0,670; Mann-Whitney-U-Test).

Kortikosteroide haben neben ihrem antiödematösen einen direkten zytotoxischen Effekt

auf PCNSL-Zellen. Die Vermutung, dass die Nachweisbarkeit einer Beteiligung des

Liquorkompartiments bei PCNSL von einer vorherigen kortikosteroidalen Behandlung

negativ beeinflusst wird, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestätigt.

Die Analyse der Überlebensdaten in Hinblick auf das Vorliegen einer Meningeosis

erbrachte keinen signifikanten Unterschied zwischen Patienten mit und ohne Nachweis

einer Meningeosis lymphomatosa (p-Wert 0,320; Log-rank-Test). Unter der Annahme,

dass Kortikosteroide den Nachweis maligner Zellen im Liquor methodenunabhängig

negativ beeinflussen, zeigte sich nach Ausschluss der Patienten mit einer kortiko-

steroidalen Therapie zum Zeitpunkt der Untersuchung ein signifikant längeres Überleben

von PCNSL-Patienten ohne Anhalt für eine leptomeningeale Beteiligung (p-Wert 0,009;

Log-rang-Test).

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit eine Prognosever-

schlechterung durch das Vorliegen einer meningealen Dissemination eines PCNSL nicht

eindeutig belegt werden konnte. Zur Detektion einer Meningeosis lymphomatosa bewies

die Durchflusszytometrie in dieser und in verschieden anderen Untersuchungen eine

höhere Sensitivität in der Diagnostik einer meningealen Dissemination als die Zyto-

morphologie und die Magnetresonanztomographie. Der negative Einfluss von Kortiko-

steroiden, verabreicht zum Zeitpunkt der Liquorasservation, auf die Nachweisbarkeit

maligner Zellen im Liquor ließ sich zwar in dieser Arbeit belegen, er bleibt jedoch in

Zusammenschau mit anderen Untersuchungen weiterhin zu diskutieren.

62

6 Literaturverzeichnis Abrey, L.E., Batchelor, T.T., Ferreri, A.J.M., Gospodarowicz, M., Pulczynski, E.J., Zucca, E., Smith, J.R., Korfel, A., Soussain, C. and DeAngelis, L.M. (2005). Report of an interna-tional workshop to standardize baseline evaluation and response criteria for primary CNS lymphoma. J. Clin. Oncol. 23, 5034-5043

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Danksagung

Ich danke ganz herzlich meinem zuverlässigen Unterstützer und Doktorvater Prof. Dr. med. R. Schroers aus der Medizinischen Klinik der Universitätsklinik Bochum-Langendreer für seine konstruktive und ausdauernde Unterstützung, der mir stets mit fach-lichem und persönlichem Rat zur Seite stand, maßgeblich für das Gelingen dieser Arbeit mitverantwortlich ist und durch den sich mir zahlreiche neue Erkenntnisse eröffnet haben.

Lebenslauf Name: Christoph Heute Geburtstag: 08.05.1983 in Herne Nationalität: deutsch Familienstand: ledig, keine Kinder Konfession: evangelisch Beruf Seit August 2011 Anstellung als Assistenzarzt im Institut für diagnostische und inter-

ventionelle Radiologie und Nuklearmedizin des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil Bochum unter Leitung von Prof. Dr. V. Nicolas

Juli 2010-Juli 2011 Anstellung als Assistenzarzt in der Medizinischen Klinik I des

St. Josef Hospital Bochum unter der Leitung von Prof. Dr. W. Schmidt

Studium Herbst 2009 ärztliche Prüfung 2008 - 2009 Praktisches Jahr 2007 - 2008 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum

im Rahmen des Modelstudiengang Medizin (MSM) 2006 - 2007 Studium der Humanmedizin an der Université de Lausanne, Schweiz (ERASMUS / 4. Studienjahr) 2003 - 2006 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum im Rahmen des Modelstudiengang Medizin (MSM) Praktisches Jahr Innere Medizin Knappschaftskrankenhaus, Bochum-Langendreer Chirurgie Centre National Hospitalier Universitaire (CNHU), Cotonou, Bénin Neurologie Knappschaftskrankenhaus, Bochum-Langendreer Famulaturen Gynäkologie St. Anna-Hospital, Herne (März 2008 für einen Monat) Onkologie Marienhospital, Herne (September 2006 für einen Monat) Pädiatrie Fachärztliche Praxis in Herne (März 2006 für zwei Wochen) Allgemeinmedizin Fachärztliche Praxis in Herne (März 2004, September 2005,

Februar 2008 für jeweils zwei Wochen)

Promotion Seit Januar 2010 Durchflusszytometrischer Nachweis einer Meningeosis lympho-

matosa im Liquor von Patienten mit primärem ZNS-Lymphom: Retrospektive Beurteilung ihrer diagnostischen Aussagekraft im Vergleich zu den Befunden der Liquorzytologie und Magnetreso-nanztomographie.

Klinik für Innere Medizin am Knappschaftskrankenhaus, Bochum-Langendreer Betreuung durch Prof. Dr. R. Schroers Zivildienst 2002 - 2003 Robert-Brauner-Schule, Herne Arbeit mit geistig behinderten Kindern Schulische Ausbildung 1993 - 2002 Haranni-Gymnasium, Herne, Abschluss: Abitur 1989 - 1993 Grundschule an der Schillerstraße, Herne Weitere Aktivitäten Verschiedene Sonographiekurse, sowohl Teilnahme, wie auch Durchführung/Leitung im Rahmen von „Von Studierenden für Studierende“ an der Ruhr-Universität Bochum (zuletzt März 2009) ANAP, Bénin, Nichtstaatliche Organisation (NGO), Mitwirken bei einer Kampagne zur Untersuchung und Behandlung von Augenerkrankungen (Campagne de depistage visuel et traitment des maux d’yeux, August 2008) Organisation des „Forum für Reform- und Modellstudiengänge der Medizin (FRMM)“ in Bochum (Oktober 2005) La Gerbe, Ecquevilly, Frankreich, Arbeit für eine christliche humanitäre Organisation (September 2002) Private Kenntnisse und Interessen Sprachen: Englisch und Französisch fließend sowie Grundkenntnisse in Spanisch in Wort und Schrift Reisen und Kennenlernen fremder Kulturen Gitarre (seit 1991), Klavier (seit 2000) Sport (Volleyball, Badminton, Skifahren, Wassersport)


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