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Aus der medizinischen Klinik I mit Poliklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. E.G. Hahn
Bestimmung von Tumornekrosefaktor alpha, totalem und spezifischem IgE bei Nahrungsmittelallergikern und chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen am unteren Gastrointestinaltrakt mittels endoskopisch gesteuerter segmentaler Darmlavage
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von Andrea Nabe
geboren in Forchheim
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Gedruckt mit der Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität
Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. M. Raithel Korreferent: Prof. Dr. E. G. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2009
3
Gewidmet
meiner Mutter Maria Anna Nabe
4
Inhalt 1 Einleitung ........................................................................................................................... 6
1.1 Geschichte des Immunglobulin E .............................................................................. 6 1.2 Eigenschaften ............................................................................................................. 7 1.3 Sofortreaktion............................................................................................................. 8 1.4 Typ I-IV Reaktion ...................................................................................................... 9 1.5 Hauttest..................................................................................................................... 10 1.6 Rasttest ..................................................................................................................... 11 1.7 Stufendiagnostik der Nahrungsmittelallergie........................................................... 11 1.8 Ziel der Studie .......................................................................................................... 12
2 Durchführung der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage.......................... 13
2.1 Messung von totalem und spezifischem IgE............................................................ 13 2.1.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe ............................................................ 13 2.1.2 Vorbereitung vor Durchführung der Koloskopie ............................................. 19 2.1.3 Endoskopie ....................................................................................................... 20 2.1.4 Labor ................................................................................................................ 22
2.1.4.1 Vorbereitung für unterschiedliche Messtechniken der einzelnen Immunparameter und totalem und spezifischem IgE ....................................... 22
2.1.4.2 Dialyse.......................................................................................................... 23 2.1.4.3 Gefriertrocknung .......................................................................................... 23 2.1.4.4 Unicapmethode zur Bestimmung von totalem und spezifischem IgE ......... 24 2.1.4.5 Proteinmessung ............................................................................................ 27
2.2 Vergleich Trasylol versus Trasylol+Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) ........... 28 2.3 Durchführung der oralen Lavage ............................................................................. 30
2.3.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe ............................................................ 30 2.3.2 Vorbereitung zur Durchführung....................................................................... 30 2.3.3 Durchführung ................................................................................................... 31
2.4 Messung von TNF alpha in der Lavageflüssigkeit................................................... 32 2.4.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe ............................................................ 32 2.4.2 Durchführung des ELISAS .............................................................................. 35
3 Ergebnisse ........................................................................................................................ 37
3.1 Bestimmung von totalem und spezifischem IgE am unteren Gastrointestinaltrakt . 37 3.1.1 Intestinales Gesamt-IgE am unteren GIT bei gastrointestinal vermittelten
Allergien (I- IV°) .............................................................................................. 37 3.1.2 Gesamt-IgE am unteren GIT bei gastrointestinal vermittelter Allergie (GMA I-
IV°) ................................................................................................................... 39 3.1.3 Intestinales Gesamt-IgE im Rectum bei gastrointestinal vermittelter Allergie
(GMA I-IV°, IgE abhängiger Typ)................................................................... 41 3.1.4 Intestinales Gesamt IgE am unteren GIT bei chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen ........................................................................................... 42 3.1.5 Patienten – Subpopulationen bei gastrointestinal vermittelter Allergie (GMA I-
IV°) ................................................................................................................... 44 3.2 Bestimmung von TNF alpha am unteren Gastrointestinaltrakt................................ 45
3.2.1 Bestimmung von intestinalem TNF alpha mittels segmentaler endoskopischer Lavage............................................................................................................... 45
3.2.2 Diagnostischer Wert der endoskopischen Lavage bei nicht IgE vermittelter Allergie (I-IV°) ................................................................................................. 47
5
3.2.3 Gesamt IgE in Korrelation zum TNF alpha am unteren GIT bei GMA I-IV° (IgE abhängiger Typ I) ..................................................................................... 48
3.2.4 TNF alpha im terminalen Ileum bei gastrointestinal vermittelter Allergie I-IV° ................................................................................................... 49
3.3 Messung von spezifischem IgE am unteren Gastrointestinaltrakt ........................... 50 3.4 Korrelation zwischen totalem IgE und Serum-IgE .................................................. 53 3.5 Zusammenhang zwischen Histologie und Erkrankungsgruppe ............................... 54 3.6 Orale Lavage ............................................................................................................ 56
3.6.1 Analyse wichtiger Immunmediatoren und des Immunglobulin E aus der oralen Lavage gesunder Personen ............................................................................... 56
3.7 Vergleich des Proteingehaltes/ Immunmediatoren von Darmlavagen bei Behandlung mit Trasylol bzw. Trasylol und PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)....................... 58
4 Diskussion ........................................................................................................................ 61
4.1 Totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt........................................................... 62 4.2 TNF alpha am unteren Gastrointestinaltrakt ............................................................ 64 4.3 Spezifisches IgE am unteren GIT............................................................................. 67 4.4 Unterschiede der Proteinmessmethode .................................................................... 67 4.5 Korrelation zwischen totalem IgE und Serum-IgE .................................................. 68 4.6 Zusammenhang zwischen Histologie und Erkrankungsgruppe ............................... 69 4.7 Orale Lavage zum Messen wichtiger Immunmediatoren und IgE........................... 70
5 Zusammenfassung:........................................................................................................... 72
5.1 Hintergrund und Ziele .............................................................................................. 72 5.2 Methoden.................................................................................................................. 72 5.3 Ergebnisse ................................................................................................................ 73
6 Praktische Schlussfolgerungen......................................................................................... 74 7 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 75
6
1 Einleitung
Die Diagnostik von gastrointestinal vermittelten Allergien (GMA) ist für den
Gastroenterologen schwierig, da Serum-IgE, Prick- und Rasttest nicht zuverlässig
sind und die orale bzw. endoskopische Provokation sehr zeitintensiv und Patienten
belastend sind.
1.1 Geschichte des Immunglobulin E
Im Jahre 1921 führten Küstner und Prausnitz einen Versuch durch, der den Weg zum
Auffinden des Immunglobulin E bahnte. Küstner, der allergisch gegen Fisch war,
spritzte sein eigenes Serum in die Haut des Pollenallergikers Prausnitz. Prausnitz
reagierte auf eine Injektion mit Fischantigen in die sensibilisierte Hautstelle mit einer
sofortigen Rötung und Schwellung. Dieser Test zeigt die passive Übertragung einer
Sensibilisierung (Prausnitz-Küstner oder P-K Test) (1)(80)(32).
45 Jahre später identifizierte Ishizaka Denver, Colorado, USA, den von Küstner und
Prausnitz als Reagin bezeichneten Faktor und postulierte eine neue
Immunglobulinklasse. Aufgrund der eingeschränkten Messmethoden und der
geringen Serumkonzentration war es Ishizaka 1966 nicht möglich, das neue
Immunglobulin, genannt „yE“, genauer zu bestimmen (1)(80)(32).
1965 entdeckten auch Bennich und Johannson in Schweden eine neue
Immunglobulinklasse, genannt IgND, die dieselben physikochemischen
Eigenschaften wie das Reagin aufwies. Die Untersuchung eines Patienten mit
multiplen Myelomen (IgE Konzentration ca. 10mg/ml) ermöglichte es Johannson,
die Struktur des Antikörpers zu erfassen und wirkungsvolle Antiseren zu
produzieren.
1967 überprüften Johannson und Ishizaka ihre Erkenntnisse jeweils mit der isolierten
Antikörperlösung des anderen Labors mit einem biologischen Test für reagine
Aktivität. Die beiden Forschungsgruppen aus den USA und aus Schweden einigten
sich im Februar 1968 in Lausanne, Schweiz, aufgrund der Übereinstimmungen ihrer
7
Forschungsergebnisse bezüglich chemischer Struktur und physikochemischer
Eigenschaften auf die neue Immunglobulinklasse IgE (1)(80)(32)(30).
1.2 Eigenschaften
Das IgE-Molekül ist aus zwei schweren (ε Kette 72 000 Dalton) und zwei leichten
Ketten (entweder κ oder λ 25 000 Dalton) aufgebaut, wobei die schwere Kette aus
fünf Domänen (V, C 1, C 2, C 3, und C 4) besteht. Das Molekulargewicht beträgt
somit circa 188 000 Dalton. Der Kohlenhydratanteil liegt bei 12% und die
intravaskuläre Verteilung bei 50 % (1)(80)(32)(30). Im Gegensatz zu anderen
Immunglobulinen ist die mittlere Serumkonzentration des IgE mit 12-240 µg/l sehr
gering. Das IgE ist durch seine Hitzeinstabilität und seine Bindung an die
hochaffinen Rezeptoren (FcεRI) der Mastzellen, basophilen Granulozyten,
Langerhanszellen und Monozyten charakterisiert (19). IgE kann sich auch an die
niedrig affinen von Lymphozyten, Monozyten, dentritischen Zellen, Eosinophilen
und Plättchen exprimierten FcεRII Rezeptoren binden (22). Die Hitzelabilität hat zur
Folge, dass bei Veränderungen des Fc Teils keine Sensibilisierung der Mastzelle
erfolgt. Eine Antigenbindungsfähigkeit ist dennoch möglich, da sie auf dem Fab Teil
liegt. Auffallend ist auch die sehr kurze Serumhalbwertszeit von zwei Tagen (t1/2 2
d), während sie im Gewebe sehr lange andauern muss (t1/2 mehrere Wochen), da
Mastzellen in vivo nach passiver Sensibilisierung bis zu zwölf Wochen stimulierbar
bleiben (1)(80)(32)(30).
IgE scheint eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Parasiten zu spielen.
Menschen, die spezifische IgE Antikörper gegen Schistosoma-Parasiten besitzen,
sind resistent gegen diese Infektion. Interessant ist der inverse Zusammenhang von
IgE und IgG4 (80). Somit lässt sich die sehr hohe Infektionsrate bei Kindern im Alter
von zehn bis vierzehn Jahren erklären, da sie über die höchsten IgG4 Spiegel
verfügen (80). Ebenso existiert die Hypothese, dass IgE bei der Früherkennung von
Fremdmaterial („gate-keeper-function“) von Bedeutung ist und zu einer verbesserten
Antigenpräsentation beiträgt.
8
In den Industrieländern sind jedoch die IgE assoziierten allergischen Erkrankungen
wie Asthma, Urticaria, Rhinokonjunktivitis und Diarrhoe aufgrund der Häufigkeit
an Beschwerden sehr wichtig (1)(80).
1.3 Sofortreaktion
Einer Sofortreaktion geht im Allgemeinen eine lange und mehrfache Exposition
gegenüber einem Allergen voraus. Antigenpräsentierende Zellen z.B.
Langerhanszellen der Haut, dentritische Zellen und Makrophagen nehmen Antigene
auf und degradieren diese in immunogene Peptidfragmente, wie Abbildung 1 zeigt.
Die durch die Prozessierung entstandenen Peptidfragmente werden an der
Zelloberfläche anderen Zellen, hauptsächlich T-Lymphozyten, präsentiert. Beim
Allergiker werden besonders TH 2-Helferzellen aktiviert, die vermehrt Interleukin 4,
aber auch Interleukin 3, 5, 6 und 10 ausschütten (17)(12)(96). Diese Zytokine
bewirken, dass sich B-Lymphozyten vor allem zu IgE sezernierenden Plasmazellen
differenzieren (Isotypenswitch). Mastzellen binden das von den Plasmazellen
produzierte IgE durch deren hoch affine Fc-Rezeptoren. Auch basophile
Granulozyten, Langerhanszellen und Monozyten besitzen hoch affine Rezeptoren für
IgE-Moleküle (19). Durch die Sekretion von spezifischen Antikörpern kommt es zur
Sensibilisierung.
Erfolgt nach der Sensibilisierung ein Sekundärkontakt mit dem Allergen, reagiert das
Immunsystem schneller und aggressiver. Der erneute Allergenkontakt führt zu einer
Verknüpfung von mehreren IgE-Molekülen, die durch ein Antigen verbunden sein
können, mit der Mastzelle. Dieses Cross-Linking bewirkt eine Freisetzung von
Mediatoren und Zytokinen, die die typischen klinischen Symptome einer Typ I
Reaktion hervorrufen. Indem die Mastzelle versucht, eine bestimmte Anzahl von
freien Bindungsplätzen für IgE-Moleküle aufrecht zu halten, reagiert sie, abhängig
von den sich in der Blutbahn befindenden IgE-Antikörpern, als IgE
Rezeptorexpression (1)(30)
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Allergen
IgE-Antikörper
Hoch affin: Mastzelle/Basophiler/ Langerhans Zelle/ Monozyt
Niedrig affin: Eosinophiler/ Neutrophiler
Mediatoren
Entzündung
Symptome/Zeichen der Erkrankung
Abbildung 1
1.4 Typ I-IV Reaktion
Die Typ I Allergie, auch Soforttyp oder anaphylaktischer Typ genannt, kann
biphasisch ablaufen, so dass man eine Frühphase von einer zweiten, später
auftretenden Phase unterscheiden muss. Die Frühphase tritt innerhalb von Sekunden
bis maximal 20 Minuten nach Allergenkontakt auf. Unter Vermittlung zellständiger
IgE Antikörper kommt es zur Freisetzung von verschiedenen Mediatoren z.B.
Histamin, Leukotriene C4, D4, E4, Prostaglandin D2, E2, TNF, Tromboxan A2,
Kallikrein, ECF, NCF, PAF aus Basophilen und Mastzellen. Das klinische Bild kann
als allergisches Asthma, allergische Konjunktivitis, Angioödem usw. imponieren. Die
Spätphase tritt nach einer Latenzzeit von vier bis sechs Stunden nach Abklingen der
Sofortreaktion auf. Diese Phase ist durch Gewebsinfiltrationen, Mastzellen,
Eosinophile, Neutrophile, Fibrinablagerungen und Gewebszerstörungen
gekennzeichnet, die zu einem Wiederaufflammen der klinischen Symptome führt
(1)(80)(32)(96)(63).
Bei der Typ II Allergie vom zytotoxischen Reaktionstyp spielen IgG und auch IgM
eine große Rolle. Typische Erkrankungen sind die autoimmun hämolytische Anämie
und die Hashimoto-Thyreoiditis.
10
Die bei der Typ III Reaktion entstehenden Immunkomplexe aktivieren Komplement,
dringen in das Subendothel der kleinen Blutgefäße ein und lagern sich in
verschiedenen Organen ab. Dieser Immunmechanismus findet sich bei Vaskulitis,
Glomerulonephritis, systemischem Lupus erythematodes und der Serumkrankheit.
Während Typ II und Typ III bei Nahrungsmittelallergie weniger von Bedeutung
sind, scheint der Typ IV einer Allergie eine sehr wichtige Rolle zu spielen. Dieser
verzögerte Typ IV ist durch CD4 T-Zellen vom TH1-Typ gekennzeichnet. Er beginnt
etwa nach 24 Stunden und erreicht seinen Höhepunkt nach ungefähr 72 Stunden.
Der Typ IV einer Allergie gehört zu den nicht IgE vermittelten Allergien, die durch
eine erhöhte TNF -alpha Produktion auffallen (1)(80)(32)(96)(63).
1.5 Hauttest
Während die Diagnostik von nicht IgE vermittelten Allergien sehr schwierig ist, gibt
es für IgE vermittelte Allergien zahlreiche Möglichkeiten des Nachweises. Wichtig zu
erwähnen sind in diesem Zusammenhang die zur Erkennung von
Nahrungsmittelallergien oft durchgeführten Hauttests. Beim Pricktest handelt es sich
wohl um den am häufigsten in der Allergologie zum Auffinden von
Überempfindlichkeitsreaktionen vom Soforttyp durchgeführten Test. Die
charakteristische Immunantwort des intradermalen Pricktest ist die Quaddel und das
Erythem. Histamin verursacht durch eine Vasodilatation eine Extravasation von
Serum aus den Kapillaren und ist gleichzeitig für den Juckreiz verantwortlich,
während die Rötung durch einen Axonreflex provoziert wird. Je nach klinischen
Symptomen, Eigenanamnese und lokalen Besonderheiten wird eine Antigenauswahl
getroffen, wobei die Allergenextrakte mit einer Lanzette (0,1µl) intradermal
aufgetragen werden. Histamin (10mg/ml) wird als Positiv- und 0,9%ige
Kochsalzlösung als Negativkontrolle verwendet, um positive Reaktionen
hervorzuheben und falsch positive Ergebnisse aufzudecken, verursacht durch
Urticaria facticia. Der Pricktest wird nach fünfzehn bis zwanzig Minuten abgelesen,
wobei der Durchmesser der Quaddel und der Rötung im Vergleich zur Positiv- und
Negativkontrolle beurteilt wird. Bei negativer Reaktion auf die Negativkontrolle
wird ein Quaddeldurchmesser von 3 x 3mm als positive Reaktion gewertet. In
11
ähnlicher Weise wird der Reibe- und der Scratchtest durchgeführt. Beim
Intrakutantest wird eine 1000fach geringere Antigenkonzentration verwendet, die in
das obere Korium injiziert wird. Das Risiko einer systemischen Reaktion ist aufgrund
der erhöhten dermalen Antigenmenge höher als bei den anderen Hauttests. Um
Spätreaktionen vom Ekzemtyp zu erfassen, wird ein Test, ähnlich dem Epikutantest,
durchgeführt und nach 24 und 48 Stunden abgelesen (1)(80)(30).
1.6 Rasttest
Beim Radioallergosorbenttest (Rasttest) handelt es sich um eine in vitro Diagnostik,
bei der Allergene an einen Träger gekoppelt werden und das spezifische IgE indirekt
durch enzymatisch gebundene anti IgE-Antikörper gemessen wird. Im Rasttest
nachgewiesenes spezifisches IgE zeigt eine Sensibilisierung des Patienten auf. Die
Sensibilisierung muss jedoch nicht mit klinischen Symptomen einhergehen. Es gibt
fünf Rastklassen, wobei Rastklasse 0 keinen, Rastklasse 4 einen stark positiven
Nachweis, von spezifischen Antikörpern bedeutet. Der Rasttest ist weniger
störanfällig als die in vivo Verfahren und sollte bei Patienten, die zu
anaphylaktischen Reaktionen neigen oder an großflächigen Hautausschlägen leiden,
bevorzugt Anwendung finden.
Häufig wird sowohl in der Praxis als auch in der Klinik der Serum Gesamt IgE
Spiegel bestimmt, wobei der Normwert kleiner als 100 IE/ml festgelegt ist (1 IE
=2,4ng IgE Protein). Im Kindesalter steigen die IgE-Werte an, bis sie dann im Alter
von zwölf Jahren ihr Maximum erreichen. Das Gesamt IgE hängt von mehreren
Faktoren ab (Geschlecht, Alter, Alkohol-, Zigarettenkonsum) und ist auch bei
malignen und parasitären Erkrankungen erhöht, so dass es zwar über eine hohe
Sensitivität, aber eine geringe Spezifität verfügt (1)(80)(30).
1.7 Stufendiagnostik der Nahrungsmittelallergie
Nach Ernährungsanamnese (11), Pricktest, Gesamt IgE und spezifischem IgE im
Serum stellt die Bestimmung des Urin-Methylhistamin (UMH) im zwölf Stunden
Sammelurin den nächsten Schritt der Stufendiagnostik der Nahrungsmittelallergie
dar. Unter Vollkost, die bis 14.00 Uhr gegessen werden darf, finden sich im
12
Sammelurin von 18.00-6.00 Uhr bei circa 85-90% der Nahrungsmittelallergiker
erhöhte UMH-Spiegel. Diese fallen unter einer Kartoffel-Reis-Diät wieder ab
(103)(107)(29)(60). Weitere Diagnostikmöglichkeiten sind die Mukosaoxygenation,
die eine ex vivo Austestung von Darmbiopsien darstellt, bei der die
Mediatorfreisetzung (z.B. Histamin, TNF alpha, ECP...) gemessen wird (73)(70)
(56)(51)(68) und die einfach- oder doppeltblinde Provokation, die als Goldstandard
zählt, jedoch leider sehr zeit- und kostenintensiv ist (82). Vor der Durchführung der
Mucosaoxygenation und der doppelt-blinden Provokation steht die endoskopisch
gesteuerte segmentale Darmlavage zur Bestimmung von totalem und spezifischem
IgE und einiger Immunmediatoren (z.B. TNF alpha) (88)(62). Die endoskopisch
gesteuerte segmentale Darmlavage stellt somit einen wichtigen Schritt in der
Stufendiagnostik der Nahrungsmittelallergie dar (103)(66).
1.8 Ziel der Studie
Die Diagnostik von gastrointestinal vermittelten Allergien (GMA) ist für den
Gastroenterologen schwierig, da Serum-IgE, Prick- und Rasttest nicht zuverlässig
sind (29)(108)(60)(17) und die orale bzw. endoskopische Provokation sehr
zeitintensiv und Patienten belastend ist.
Ziel dieser Studie war, die mittels der endoskopisch gesteuerten segmentalen
Darmlavage gewonnenen totalen und spezifischen IgE-Werte und die TNF -alpha
Spiegel in bestimmte Krankheitsgruppen (gastrointestinal vermittelte Allergie
(GMA) I-IV°, CDna/a, UCna/a…) einzuteilen. Es sollte untersucht werden, ob
allergische Mechanismen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen eine Rolle
spielen. Allein erhöhte TNF alpha Konzentrationen sollten den Hinweis auf eine
nicht IgE vermittelte Allergie geben.
Die Orale Lavage wurde zum einen eingeführt, um wichtige Allergie- und
Immunmediatoren in der Mundhöhle zu bestimmen, zum anderen, um ein von der
Endoskopie unabhängiges Verfahren zu entwickeln, Nahrungsmittelallergien
aufzudecken. Es wurde an der Methodik gearbeitet und die Histologie und das
Serum IgE in Relation zu den in der Lavage gewonnenen Entzündungs- und
Immunparametern gestellt.
13
2 Durchführung der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage
2.1 Messung von totalem und spezifischem IgE
2.1.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe
Die endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage wurde bei 150 Patienten
vorgenommen, die an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen,
Nahrungsmittelallergien, Kollagenkolitis, Malabsorptionssyndromen,
Kolonadenome, Mastozytose oder chronischer Pankreatitis litten. Bei Morbus Crohn-
Patienten wurde ein CDAI>150 als aktive Erkrankung gewertet, bei Colitis ulcerosa-
Patienten ein CAI>4. Der Crohn´s Disease Activity Index nach Best (CDAI) ist ein
klinischer Symptomscore, um eine Aussage bezüglich des Aktivitätszustandes der
Entzündung zu treffen. In die Berechnung des CDAI gehen die Anzahl der Stühle,
Bauchschmerzen, Allgemeinbefinden, mit M. Crohn assoziierte Erkrankungen (z.B.
Arthritis, Iritis, Uveitis, Fissuren, Fisteln…), Antidiarrhoica, Resistenz im Abdomen,
Hämatokrit und das Körpergewicht mit ein. Bei der Colitis ulcerosa hat sich der
Colitis Activity Index (CAI) nach Truelove und Witts bewährt. Wichtig zur
Erfassung des CAI sind die Stuhlfrequenz pro Woche, Blut im oder auf dem Stuhl,
Bauchschmerzen, Allgemeinbefinden, Körpertemperatur, extraintestinale
Manifestationen wie Iritis, Erythema nodosum und Arthritis und das Labor: Hb und
BSG. Die Population der Nahrungsmittelallergiker wurde in drei Gruppen je nach
Sicherung der Diagnose aufgeschlüsselt. So erfolgte bei einem Teil der
Nahrungsmittelallergiker die Diagnose durch den Goldstandard der doppeltblinden,
placebokontrollierten Provokation, bei anderen Patienten war die Diagnose klinisch
durch eine antiallergische Therapie und eindeutige klinische Symptome gesichert,
während bei einem anderen Teil nur der Verdacht durch die Eigenanamnese des
Patienten/ einweisenden Arztes auf eine Nahrungsmittelallergie bestand. Erhöhte
Urinmethylhistaminspiegel unter Vollkost mit einem Abfall unter Kartoffel-Reis-Diät
waren ein guter Indikator für eine klinische Vermutungsdiagnose. Die klinische
Sicherung stützt sich zudem auf Pricktest, RAST (ELISA…), Mediatordiagnostik und
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auf Beobachtungen von Symptomen, die bei früheren Klinikaufenthalten gemacht
wurden.
In der Kontrollgruppe befinden sich Patienten, die zur Abklärung von Polypen,
Adenomen, Angiodysplasien, Suche einer Blutungsquelle und zum
Tumorausschluss in die Klinik gekommen waren. Da bei einem Patienten der
Eingang ins terminale Ileum aufgrund einer Verengung nicht möglich war, erhält
man für das terminale Ileum elf Lavagen, für die Darmabschnitte Coecum und
rektosigmoidaler Übergang 12. Die vier Patienten, bei denen die Diagnose der
gastrointestinal vermittelten Allergie durch eine doppeltblinde Provokation gesichert
ist, sind im Durchschnitt 52 Jahre alt, 3 weiblich, 1 männlich, mit einer Spannweite
von 41-63 Jahren. Im Vergleich zur Gruppe mit klinisch gesicherter Diagnose durch
eine antiallergische Therapie / klinisch objektivierbare Symptome und mit einer
Vermutungsdiagnose ist die Anzahl der Patienten mit doppeltblinder Provokation
sehr gering, da die Provokation sehr zeit- und kostenintensiv ist und auch für den
Patienten sehr belastend sein kann. Bei 45 Patienten mit klinisch gesicherter
Diagnose der gastrointestinal vermittelten Allergie wurde eine Lavage im terminalen
Ileum durchgeführt, während es im Coecum und am rektosigmoidalen Übergang
nur 44 Patienten waren. Auch hier unterscheidet sich die Anzahl in den
Darmabschnitten, da bei Blutung oder starker Verschmutzung die Lavage nicht
durchführbar war. Da die Patientenanzahl in dieser Gruppe so groß ist, lohnt es sich,
die gastrointestinal vermittelte Allergie in ihre vier Grade aufzuteilen (68), um zu
untersuchen, ob es einen Zusammenhang zwischen dem Grad der Allergie und der
Ausbeute an totalem und spezifischem IgE und der TNF alpha Produktion gibt. Grad
I heißt, dass die Symptome (z.B. Bauchschmerzen, Durchfälle, Obstipation,
Völlegefühl, Blähungen) auf den Magen/Darmtrakt beschränkt sind; bei II° kommt
eine extraintestinale Manifestation hinzu, während es bei III° mehrere
extraintestinale Manifestationen sind. Unter extraintestinalen Manifestationen
gehören Symptome wie Rhinitis, Konjunktivitis, Arthritis, Urticaria, Asthma und
Migräne. Bei einer gastrointestinal vermittelten Allergie IV° können mehrere
extraintestinale Manifestationen mit Kreislaufreaktion und/oder anaphylaktische
Symptome in der Anamnese eruiert werden. Aufgrund der Schwere der
15
Symptomatik findet sich nur eine 39 jährige Patientin mit einer IV° Allergie, während
es acht Patienten mit GMA I°, 19 Patienten mit GMA II° und 17 bzw. 16 Patienten je
nach Darmabschnitt mit GMA III° gibt. Bei 33 bzw. 34 Patienten mit
Verdachtsdiagnose GMA wurde eine Lavage durchgeführt. Unterteilt man auch hier
die GMA in ihre Grade, so erhält man mit I° 18, mit II° 9, mit III° 5 bzw. 6 und mit
IV° eine Patientin.
Patienten mit Morbus Crohn wurden in Abhängigkeit des CDAI in zwei Gruppen
eingeteilt. Ein akuter Schub lag bei einem CDAI von mehr als 150 vor. Anhand dieses
Kriteriums waren vier Patienten in Remission, während 3 bzw. 4 Patienten sich in
einem akuten Schub/akuten Phase der Erkrankung befanden. Bei der Colitis
ulcerosa gab es fünf Patienten mit einem CAI < 4, die klinisch gesund waren, und ein
bzw. zwei Patienten mit einem CAI > 4, die sich gerade im akuten
Entzündungsstadium befanden. Weiterhin wurde die endoskopisch gesteuerte
segmentale Darmlavage bei zwei Patienten mit eosinophiler Ösophagitis, 9 Patienten
mit Kollagenkolitis, 3 mit Mastozytose, 6 mit chronischer Pankreatitis, 11 bzw. 12 mit
Kolonadenomen, 6 mit Histaminintoleranz, 4 mit Sprue, einem Patienten mit
infektiöser Kolitis und zwei Patienten mit einer Salicylatintoleranz durchgeführt.
Eine tabellarische Übersicht über Geschlecht, Alter und die jeweilige
Krankheitsgruppe findet sich in Tabelle 2.1.
Personenan
zahl
Durchschnitts
alter
Geschlechterver
teilung
Spannweite
terminales Ileum Kontrollgruppe 11 54 9männlich/
2weiblich
38-69
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
Kontrollgruppe
12 55 10männlich/
2weiblich
38-71
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie I-
IV° Diagnose nach doppeltblinder
Provokation gestellt
4 52 1männlich/
3weiblich
41-63
16
terminales Ileum gastrointestinal
vermittelte Allergie I-IV° Diagnose
klinisch gesichert
45 46 17männlich/
28weiblich
23-73
Coecum/C gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV° Diagnose klinisch
gesichert
44 45 17männlich/
27weiblich
23-73
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie I°
Diagnose klinisch gesichert
8 48 3männlich/
5weiblich
34-61
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie
II° Diagnose klinisch gesichert
19 45 11männlich/
8weiblich
29-73
terminales Ileum gastrointestinal
vermittelte Allergie III° Diagnose
klinisch gesichert
17 47 3männlich/
14weiblich
23-69
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie
III° Diagnose klinisch gesichert
16 47 3männlich/
13weiblich
23-69
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie
IV° Diagnose klinisch gesichert
1 39 1weiblich
terminales Ileum/ Coecum Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV°
33 45 15männlich/
18weiblich
23-72
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV°
34 44 15männlich/
19weiblich
23-72
terminales Ileum/ Coecum/ Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV°
18 46 9männlich/
9weiblich
23-72
17
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie II°
9 41 4männlich/
5weiblich
26-61
terminales Ileum/ Coecum
gastrointestinal vermittelte Allergie
III° Diagnose klinisch gesichert
5 44 2männlich/
3weiblich
33-55
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie III°
6 42 2männlich/
4weiblich
29-55
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte
Allergie IV°
1 51 1weiblich
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Morbus
Crohn nicht aktiv (durch CDAI
festgelegt)
4 42 4weiblich 34-50
terminales Ileum/ Coecum Morbus
Crohn aktiv (durch CDAI festgelegt)
3 37 3männlich 26-47
rektosigmoidaler Übergang Morbus
Crohn aktiv (durch CDAI festgelegt)
4 41 3männlich/
1weiblich
26-51
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Colitis
ulcerosa nicht aktiv (durch CAI
festgelegt)
5 39 2männlich/
3weiblich
33-52
terminales Ileum Colitis ulcerosa
aktiv (durch CAI festgelegt)
2 42 2weiblich 32/52
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
Colitis ulcerosa aktiv (durch CAI
festgelegt)
1 32 1weiblich
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
eosinophile Ösophagitis
2 56 2männlich 56/56
18
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
mikroskopische/lymphozytäre Colitis
(Kollagencolitis)
9 58 5männlich/
4weiblich
44-74
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
Mastozytose
3 47 2männlich/
1weiblich
32-62
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
chronische Pankreatits
6 60 6männlich 51-72
terminales Ileum Kolonadenom 11 62 8männlich/
3weiblich
47-74
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
Kolonadenom
12 63 9männlich/
3weiblich
47-74
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
Histaminintoleranz
6 49 3männlich/
3weiblich
36-58
Sprue 4 47 3weiblich/
1männlich
38-61
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
infektiöse Colitis
1 34 1männlich
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
Salicylatintoleranz
2 57 2weiblich 52/62
Tabelle 2.1: Geschlecht, Alter und Einteilung in die jeweilige Krankheitsgruppe.
Für die Darmabschnitte terminales Ileum, Coecum und rektosigmoidaler Übergang
ergeben sich zum Teil unterschiedliche Patientenzahlen. Diese Beobachtung lässt sich
dadurch erklären, dass der Endoskopiker bei Verengung der Bauhin´schen Klappe
nicht bis ins terminale Ileum vordringen konnte oder nicht den Eingang ins
terminale Ileum gefunden hat (3%), nach Biopsieentnahme im terminalen Ileum mit
starker Blutung die Lavage im Coecum nicht mehr zur Ermittlung von totalem und
spezifischem IgE herangezogen werden konnte oder bei einem Patienten mit
Pouchoskopie nur das neoterminale Ileum zur Spülung zur Verfügung stand oder
19
wegen Verschmutzung die Verwertung der Lavage nicht möglich war (Coecum 4%,
rektosigmoidaler Übergang 2%).
Die Kontrollgruppe rekrutierte sich aus elf Personen, deren Indikation zur
Koloskopie eine Sigmadivertikulose, Blutungssuche, Adenomkontrolle und
Ausschluss eines kolorektalen Karzinoms war. Als Ausschlusskriterien galten ein
anamnestisch begründbarer Verdacht auf eine gastrointestinal vermittelte Allergie,
starke Blutung während der Koloskopie, histologisch/endoskopisch erwiesene
chronisch entzündliche Darmerkrankung und Karzinome des Verdauungstraktes.
Patientennummer Alter Geschlecht Indikation zur Koloskopie
1 69 m tubuläre Kolonadenome
2 63 m Z.n.Adenocarcinom des Rektum pT1N1G2 1988
3 38 m V.a. Sorbitmalabsorption
4 41 m Sigmadivertikulose
5 55 w Schleimhautpolypen, Divertikulose, Sorbitmalabsorption
6 59 m Ausschluss Kolonadenom/Neoplasie
7 58 m
Z.n. Bridenileus mit Hemikolektomie re 1993, Z.n. Billroth II
1971, Fruktosemalabsorption
8 43 w
Polypenknospe im Coecum, Ulcus duodeni mit erfolgreicher
Hp-Eradikation, Analgetika/Alkoholabusus
9 57 m Divertikulose
10 59 m tubuläre Kolonadenome
11 51 m Z.n. Angiodysplasien im Kolon, tubuläre Kolonadenome
12 71 m Rektumadenome
Tabelle 2.2: Alter, Geschlecht und Indikation zur Koloskopie in der Kontrollgruppe; Mittelwert 55a, Spannweite 38-61a
2.1.2 Vorbereitung vor Durchführung der Koloskopie
Bei jedem Patienten wurde eine genaue Medikamentenanamnese erhoben, da
Immunsuppressiva wie Kortison, Azathioprin, 5-Aminosalicylsäure-Präparate,
Antihistaminika, Antibiotika oder Mastzellstabilisatoren die in vivo bestehenden
Verhältnisse verändern. Wenn es für den Patienten vom Gesundheitszustand her
möglich war, wurden diese antientzündlichen Medikamente und Antiallergika eine
20
Woche vor der Koloskopie abgesetzt. Die Patienten wurden für die zur
Durchführung der Lavage notwendigen Schritte während der Koloskopie bezüglich
des Ablaufs, Nutzens und den damit verbundenen Risiken aufgeklärt. Als
Abführmittel wurden Klean-PrepR (Macrogol, Natriumsulfat), PrepacolR (Bisacodyl),
EndofalkR (Macrogol) und Endo-ParactolR (Simeticon) verwendet. Stationäre
Patienten begannen einen Tag vor der Koloskopie abends mit dem Abführen,
während ambulante Patienten erst am Untersuchungstag circa vier Stunden zuvor
die Abführlösung tranken. Auf einem standardisierten Bogen wurden Name,
Geburtsdatum, Medikamente, Untersucher, Nikotin/Alkoholanamnese und die
während der Koloskopie verabreichten Medikamente notiert. Zur
Schmerzbekämpfung und Sedierung wurde das Opioid Pethidin (Dolantin) 50-
100mg und die Benzodiazepine Diazepam (Valium) oder Midazolam (Dormicum)
2,5-10mg verwendet.
Vor der Koloskopie mussten im Labor noch einige Vorbereitungen für die
Durchführung der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage getroffen
werden. Für die Lavage werden im Koloskopieraum vier Perfusorspritzen, 250ml
0,9%ige physiologische Kochsalzlösung, drei sterile Zylindergläser, die je mit 2ml
Trasylol und 2ml diNatriumhydrogenphophatpuffer gefüllt sind, Parafilm, ein
Einmalplastiksammelbehälter mit Anschlusssystem, eine Kühlbox mit Kühlakkus,
ein Spülansatz für das Endoskop und eine Stoppuhr benötigt. Die Utensilien werden
auf dem Lavagewagen, der mit einem Einmaltuch abgedeckt ist, in den
Koloskopieraum transportiert (28).
2.1.3 Endoskopie
Im Koloskopieraum werden drei Perfusorspritzen mit je 50ml 0,9%iger
physiologischer Kochsalzlösung aufgezogen. Die vierte Perfusorspritze und die
übrigen 100ml Natriumchlorid dienen als Ersatz, falls die Lavageflüssigkeit verloren
geht, indem sie in tiefer gelegene Darmabschnitte abfließt oder aufgrund von starker
Verunreinigung durch Blut oder Stuhlreste wiederholt werden muss. Über den auf
der Perfusorspritze aufgesteckten Spülansatz wird die Flüssigkeit in den
Arbeitskanal des Endoskops gespritzt. Der Spülvorgang erfolgt an drei
21
unterschiedlichen Darmabschnitten: terminales Ileum, Coecum und
rektosigmoidaler Übergang. Diese Abschnitte weisen physiologisch Immungewebe
in hoher Konzentration auf, so dass die Möglichkeit, totales und spezifisches IgE
nachzuweisen, hier am größten ist. Die Lavage wurde jeweils vor Biopsieentnahme
oder anderen Manipulationen an der Darmschleimhaut durchgeführt, da Blut oder
Verunreinigungen die gemessenen Ergebnisse verfälschen oder einen Nachweis
gänzlich unmöglich machen könnten. Nach der Lavage und Biopsieentnahme im
terminalen Ileum folgt die Spülung im Coecum, wobei der Appendixansatz wegen
des dichten lymphatischen Gewebes bevorzugt gespült wird. Die Spülung des
rektosigmoidalen Überganges erfolgt bei ca. 15 Zentimetern von der Anokutanlinie
entfernt.
Mit Hilfe der Stoppuhr wurde die Einwirkzeit der Flüssigkeit auf eine Minute
beschränkt. Dieser Zeitraum war zum Herauslösen der Immunglobuline aus der
Darmschleimhaut notwendig. Danach wurde die Spülflüssigkeit über einen Schlauch
abgesaugt und in einem Einmalvakuumbehälter aufgefangen. Von dort wurde die
im terminalen Ileum gewonnene Lavage in das mit „A“ beschriftete, die Lavage aus
dem Coecum in das mit „B“ beschriftete und die Lavage des rektosigmoidalen
Überganges in das mit „C“ beschriftete Zylinderglas umgefüllt. Die Volumenangabe
an den Zylindergläsern erleichterte das Ablesen der Lavagemenge, die auf einem
standartisierten Untersuchungsbogen festgehalten wurde. Pro Darmabschnitt sollten
mindestens zehn, besser 20 ml abgesaugt werden, um die Verarbeitung im Labor zu
gewährleisten. In jedes Zylinderglas wurden die in einem Röhrchen vorpippetierten
zwei ml Trasylol (Aprotinin, 10 000 IE/ml) und 2ml diNatriumphosphatpuffer zur
Lavageflüssigkeit hinzugegeben. Trasylol hemmt Proteasen (Kallikrein, Trypsin,
Chymotrypsin, Plasmin und einige Plasminogenaktivatoren), um einen Abbau der
Immunglobuline zu verhindern. Der Puffer diNatiumphosphat wird benötigt, um
den pH-Wert auf sieben bis acht anzuheben. Bei pH Werten unter 6 besteht die
Gefahr, dass das Immunglobulin spontan zerfällt. Nach Spülung des
rektosigmoidalen Übergangs wurden die Zylindergläser mit Parafilm verschlossen
und die gewonnenen Lavagen A, B und C in einer Kühlbox auf dem Lavagewagen
22
ins Labor gebracht. Es war wichtig, dass die Lavage jedes einzelnen
Darmabschnittes gekühlt und getrennt verarbeitet wurde.
2.1.4 Labor
2.1.4.1 Vorbereitung für unterschiedliche Messtechn iken der einzelnen Immunparameter und totalem und spezifischem IgE
Im Labor wurde zur Lavageflüssigkeit der Proteaseinhibitor Trasylol hinzugegeben.
Die Menge an benötigtem Trasylol errechnete sich aus dem zuvor bestimmten
Lavagevolumen abzüglich 4ml (2ml Trasylol und 2ml 0.15mol
diNatriumphosphatpuffer), die schon im Endoskopieraum vorgelegt wurden. Jedes
Zylinderglas wurde wieder mit Parafilm verschlossen. Dies erleichterte das
Durchmischen der Lavageflüssigkeit. Mit einer pH-Elektrode wurde der pH-Wert
gemessen, um gegebenenfalls diNatriumphosphatpuffer hinzu zu geben, falls der
pH Wert unter 6,5 lag. Die Lavagefraktionen wurden in EDTA-Röhrchen abgefüllt.
EDTA ist ein weiterer Proteaseinhibitor, der wie Trasylol den Abbau von IgE
verhindern kann.
Die Lavage wurde bei 4° Celsius und 4000 Umdrehungen/min zehn Minuten
zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde je 1ml Überstand für die
Proteinbestimmung, Mediatorbestimmung und Zytokinmessung abgenommen und
in kleinen Röhrchen, die mit AP, AM, AZ, BP, BM, BZ und CP, CM, CZ beschriftet
waren, in einem –20° Celsius Kühlschrank aufbewahrt. AP bedeutet: Probe aus dem
terminalen Ileum, die zur Messung des Proteingehaltes herangezogen wird. AM ist
die Abkürzung für terminales Ileum zur Bestimmung der Mediatoren ECP und
Tryptase, während AZ zur Messung der TNF alpha Konzentration im terminalen
Ileum dient. Für alle drei Darmabschnitte ergeben sich insgesamt neun Proben. Es
wurden immer mehrere Patientenproben bis zu einer Messung aus Zeit- und
Kostengründen gesammelt.
Der Rest der Lavagefraktionen, ca. 20-25ml, wurde in entsprechend vorbereitete
Dialyseschläuche gefüllt, die mit einem Dialyseclip verschlossen wurden. Der
abzentrifugierte Bodensatz wurde verworfen. Die Dialyseschläuche wurden mit
einem Faden und weißem Klebeband am Rand einer Schüssel befestigt, so dass eine
23
Beschriftung möglich war. In der Plastikschüssel, die in einen Kühlschrank gestellt
wurde, befand sich destiliertes Wasser, gegen das die Lavagefraktionen A, B und C
unter ständigem Rühren eines Schwimmfisches bei 4°Celsius dialysiert wurde. Die
Dialysedauer betrug 24 Stunden. Pro Dialyse wurden nur die Proben eines Patienten
verwendet, um zu gewährleisten, dass alle Schläuche von Aqua destilata umgeben
waren und sich die Dialyseschläuche in einer bestimmten Relation zum Aqua
destilata verhielten, um eine Standardisierung zu erreichen.
2.1.4.2 Dialyse
Die Präparation der Dialyseschläuche (Dialysis Tubing, Sigma) erfolgte gemäß der
Gebrauchsanweisung [27]. Um das enthaltene Glycerin zu entfernen, wurden die
Schläuche drei bis vier Stunden unter fließendem Wasser gewaschen. Zum
Herausfiltern von Schwefelverbindungen wurde eine Minute lang bei einer
Temperatur von 80° Celsius eine 0.3%ige Natriumsulfidlösung hinzu gegeben. Die
Schläuche wurden anschließend für zwei Minuten mit Aqua destilata gewaschen
und mit 0,2%iger Schwefelsäure versetzt. Zum Schluss wurden die Schläuche wieder
mit Aqua destilata gewaschen, um sie von der Schwefelsäure zu befreien. Laut
Gebrauchsanweisung waren die Schläuche für eine Molekulargröße von 12 000
Dalton durchlässig. Dies hatte zur Folge, dass in der Lavage enthaltene Elektrolyte
und niedermolekulare Eiweiße aus der Lavage herausgefiltert wurden und sich im
die Lavage umgebenden Aqua destilata verteilten. Da das Immunglobulin E ein
Molekulargewicht von 170-190 000 Dalton aufweist, war es ihm als hochmolekulares
Protein nicht möglich, zu diffundieren, so dass es im Dialyseschlauch angereichert
wurde. Die Dialyse sollte die IgE Ausbeute erhöhen.
2.1.4.3 Gefriertrocknung
Nach der 24stündigen Dialyse wurden die Lavagefraktionen gefriertrocknet. Für die
Lyophilisation wurde der Inhalt der Dialyseschläuche in etwa zehn Zentimeter hohe
und zwei Zentimeter breite Röhrchen geschüttet, wobei jedes Röhrchen nur zu etwa
einem Drittel gefüllt werden durfte. Die Röhrchen wurden mit Alufolie verschlossen
und die Folie mit weißem Klebeband fixiert. In die Alufolie wurden mit einer
Pinzette einige Löcher gestochen. Vor der Lyophilisation mussten die Röhrchen
24
mindestens 30 Minuten bei –80° Celsius eingefroren werden, da im flüssigen
Zustand die Lavage durch das Vakuum aus den Röhrchen gezogen wurde. Die
tiefgefrorenen Röhrchen wurden in den Gefriertrockner gestellt und mit der
Trockenhaube verschlossen. Nach 48 stündiger Lyophilisation wurde die Maschine
abgestellt, der Ablaufschlauch herausgezogen und eine Schüssel untergestellt, um
das gebildete Kondenswasser aufzufangen, das bei der Lyophilisation entstanden
war. Das Lyophilisat wurde in Sample Diluent der Firma Pharmacia 10fach im
Vergleich zur gewonnenen Lavagemenge konzentriert aufgelöst. Die Menge, die an
Sample Diluent zugegeben wurde, errechnete sich aus dem Gesamtvolumen der
Lavage dividiert durch zehn. Das Auflösen der Lavage sollte unter einem Abzug
oder mit Mundschutz stattfinden, da die nun in Pulverform vorliegende Lavage
potentiell infektiöses Material beinhalten konnte.
2.1.4.4 Unicapmethode zur Bestimmung von totalem un d spezifischem IgE
Das Lyophilisat diente der Messung von Gesamt-IgE und spezifischem IgE. Da im
Labor in Erlangen für die Bestimmung des spezifischen IgE aus Kostengründen nur
ein Standard an Testallergenen zur Verfügung stand, wurde bei besonderen
Fragestellungen pro Darmabschnitt ein mit A, B und C markiertes Röhrchen mit
fertigem Lyophilisat zur Firma Pharmacia nach Freiburg per Post geschickt. Hier ist
eine Austestung von bis zu 550 verschiedenen Allergenen möglich.
Das totale und spezifische IgE wurden mit der Unicapmethode gemessen (100). Für
die Bestimmung der Antikörper mussten in einen mit dem Unicap-Gerät
verbundenen Computer Patientennummer, Anzahl der Proben und Anweisungen,
was gemessen werden sollte, eingegeben werden. Über diesen Computer erfolgte
auch der Ausdruck der Ergebnisse. Nach Eingabe der Aufforderungen wurde der
Unicap mit Patientenproben und Testlösungen bestückt. Jeder Arbeitsschritt konnte
am Display eines integrierten Minicomputers am Gerät abgelesen werden. Das
Probenkarusell drehte sich weiter, so dass es leicht war, die richtige Stelle für die
entsprechende Probe zu finden. Der Unicap pipettierte automatisch die
Patientenproben und übernahm die Fluoreszensmessung. Pro Lauf konnten drei
25
Patientenproben gemessen werden, da die Plätze für die Unicaps zur Messung des
spezifischen IgE limitiert waren. Nach jedem Lauf mit Patientenproben erfolgte ein
Desinfektionslauf zum Reinigen des Gerätes. Die Einheit von Gesamt- und
spezifischem IgE wurde vom Unicap in kU/l Lavage angegeben. Die
Nachweisgrenze lag bei diesem Gerät für Gesamt-IgE bei 2 kU/l und für spezifisches
IgE bei 0,35 kU/l, so dass sich unter Berücksichtigung der Zehnfachkonzentrierung
tatsächliche Konzentrationen von 0,2 kU/l für totales IgE und 0,035 kU/l für
spezifisches IgE für die anfänglich gewonnene Lavage ergeben.
Das Prinzip des Testverfahrens zur Messung von Gesamt-IgE ist ein
Radiofluoreszenzallergosorbenttest (RAST-Test). Potentiell vorhandene IgE-
Antikörper aus der Lavage konkurrieren mit einem zugegebenen IgE-Antikörper,
der mit einem Enzym verbunden ist, um die Bindungsstellen eines an das
Immunocap gebundenen Anti-IgE Antikörpers. Die gemessene Enzymreaktion ist
umgekehrt proportional zur IgE-Konzentration in der Lavage. Die Unicap Methode
ist in Abbildung 2 beschrieben.
Abbildung 2
Beim spezifischen IgE wurde das gleiche Testverfahren angewandt. In der Lavage
vorhandenes spezifisches IgE, gegen ein bestimmtes Allergen gerichtet, wurde an ein
am Immunocap haftendes Allergen gebunden. Durch enzymatisch markierte Anti-
IgE Antikörper kann die Menge an gebildeten Komplexen nachgewiesen werden
26
(siehe Abbildung 3)
Abbildung 3
Sowohl für Patienten als auch für Kontrollpersonen wurde ein Allergenstandard,
bestehend aus Reis, Kartoffel, Eiklar (Hühnereiweiß), Eigelb, alpha-Lactalbumin,
Kasein (hitzestabil), Weizenmehl, Roggenmehl, Sojabohne, Schweinefleisch,
Rindfleisch und Nussmischung (Erd, Hasel-, Para-, Kokosnuss, Mandel) verwendet.
Das Standardpanel von zwölf Allergenen wurde selbst ausgewählt. Zum einen
wurden Allergene in den Standard aufgenommen, die häufig zu allergischen
Symptomen führen, zum anderen wurde berücksichtigt, dass diese Nahrungsmittel
von vielen Leuten verzehrt werden. Bei selten gegessenen Nahrungsbestandteilen
kann das Allergen manchmal leichter vom Patienten herausgefiltert werden als bei
Grundnahrungsmitteln. Weizen- und Roggenmehl führen oft zu allergischen
Reaktionen, können vom Patienten aber selten als verantwortliches Allergen
identifiziert werden, da sie als Zutaten z.B. zum Backen von Brot, Brötchen und
Kuchen, als Soßenbinder usw. mit anderen Nahrungsmitteln gemischt verwendet
werden. Nach der Unicap-Messung werden die Patientenproben zur Archivierung
bei –20° Celsius eingefroren.
27
2.1.4.5 Proteinmessung
Um eine Standardisierung für die in der Lavage gemessenen Immun- und
Allergieparameter zu erreichen, wurden alle gemessenen Werte auf mg Protein
bezogen. Der Proteingehalt der Lavage wurde pro Lavagefraktion aus den vor der
Dialyse abpipettierten Überständen, die bei –20° Celsius im Gefrierschrank
aufbewahrt wurden und mit AP, BP und CP beschriftet waren, gemessen. P steht für
Proteinbestimmung, während A, B und C den jeweiligen Darmabschnitt angibt. Zur
Ermittlung der Menge an Protein wurde der Proteinassay nach Pierce herangezogen
(100). Der Testkit enthält 1000ml von BCA Reagenz A, bestehend aus
Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninic-Säure und Natriumtartrat in
0,1M Natriumhydroxid gelöst, 25ml BCA Reagenz B, bestehend aus 4% Kupfersulfat,
und 10 x 1ml Ampullen Albumin Standard, bestehend aus Rinderserumalbumin
(BSA) zu einer Konzentration von 2,0mg/ml in 0,9%iger Salzsäure und 0,05%
Natrium-Azide gelöst. Die Grundlage des Testverfahrens bildet die Biuretreaktion,
wobei in einem alkalischen Medium zweiwertiges Kupfer durch Protein zu einem
einwertigen Kupferproteinkomplex reduziert wird.
Zwei Moleküle der hinzugegebenen Bicinchoninic Säure (abgekürzt BCA) bilden mit
dem Kupferion einen Chelatkomplex, so dass eine aufgrund einer verstärkten
Lichtresorption höhere Extinktion erreicht wird. Dies hat zur Folge, dass auch
geringe Konzentrationen an Protein erfasst werden können.
Cu 2+ + 2 Bicinchoninic Säure (BCA) � BCA-Cu 1+ Komplex
Zur Vorbereitung des Assays musste eine Standardreihe aus Rinderalbumin angelegt
werden. Standard 1, 2 und 3 BCA erhielt direkt aus der Stocklösung, während die
Standards 4-8 jeweils Mischungen aus dem Standard einer Verdünnung niedriger
waren, nachdem die Proben zuvor in einem bestimmten Verhältnis verdünnt worden
waren. So ergaben sich BCA Endkonzentrationen von 2000µg/ml, 1500µg/ml,
750µg/ml, 125µg/ml und 25µg/ml. Das BCA Reagenz A musste mit dem BCA
Reagenz B im Verhältnis 50:1 gemischt werden. Die Menge der angemischten Lösung
richtete sich nach der Anzahl der Patientenproben, da pro Probe 2ml benötigt
wurden. Die Standardlösungen dürfen bei der Berechnung nicht vergessen werden.
28
Nach gutem Mischen der Standardproben und Patientenlösungen wurden jeweils
100µl entnommen und in ein Röhrchen pipettiert. Nachdem 2ml der aus BCA
Reagenz A und B zusammengemischten Lösung hinzugegeben waren, mussten die
Proben erneut gut durchmischt werden. Vor der eigentlichen Messung war ein 30
Minuten langes Wasserdampfbad bei 37° Celsius notwendig. Nach der Inkubation
sollten die Proben bei Raumtemperatur abkühlen. Die photometrische Messung
erfolgte bei 562nm, da bei dieser Wellenlänge die größte Absorption zu erwarten
war. Die photometrische Messung sollte innerhalb von zehn Minuten beendet
werden, da die BCA-Methode keine Endpunktbestimmung ist. Durch Inkubation,
Weiterarbeiten bei Raumtemperatur und Einhalten des zehn Minutenzeitfensters fiel
dieser Fehler nicht signifikant ins Gewicht. Die Standardkurve wurde ermittelt,
indem der Durchschnitt der Leerwert-korrigierten Absorption bei 562nm für jeden
einzelnen BSA Standard gegen seine Konzentration in µg/ml geplottet wurde. Mit
der Standardkurve ließ sich ein Faktor errechnen, mit dem alle Patientenproben
multipliziert wurden, so dass die tatsächliche in der Lavage vorhandene
Proteinkonzentration erhalten wurde.
Jeder in der Lavage ermittelte Wert eines Immun- oder Allergieparameters wurde
auf die Proteinkonzentration bezogen und in z.B. beim totalen IgE 2,5 U/mg Protein
angegeben, um eine Standardisierung und damit Vergleichbarkeit der Proben zu
erhalten.
2.2 Vergleich Trasylol versus Trasylol+Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)
Der Vergleich Trasylol versus Trasylol+PMSF wurde durchgeführt, um zu testen, mit
welchem Proteaseinhibitor eine größere Ausbeute an totalem und spezifischem IgE
und Proteingehalt zu erzielen war. Bei diesem Versuch wurde bei sechs Patienten
eine Doppelbestimmung gemacht, so dass man insgesamt 18 Lavageproben erhielt.
Die Patientengruppe setzt sich aus vier Frauen und zwei Männern im Alter von 34-
63 Jahren zusammen. Aus jeder Patientengruppe wurden Personen gefunden, so
dass es sich um eine sehr heterogene Patientengruppe handelt.
29
Patient Alter Geschlecht Erkrankung
1 34 weiblich Morbus Crohn nicht aktiv (durch CDAI festgelegt) /
gastrointestinal vermittelte Allergie I° Diagnose klinisch
gesichert
2 45 männlich gastrointestinal vermittelte Allergie II° Diagnose klinisch
gesichert
3 63 weiblich gastrointestinal vermittelte Allergie III° Diagnose nach
doppeltblinder Provokation gestellt
4 50 männlich DD:CD, UC, GMA
5 40 männlich eosinophile Ösophagitis
6 55 weiblich Kontrollgruppe
Tabelle 2.3: Alter, Geschlecht und jeweilige Erkrankung der Patienten; Durchschnittsalter 48a, Spannweite 34-63a;
Im Labor wurden 2ml PMSF gemischt mit 2ml diNatriumphosphatpuffer in ein
Röhrchen vorpippetiert. Pro Patient wurden drei dieser Röhrchen benötigt. In die
Endoskopie mussten drei weitere 50ml Perfusorspritzen, drei Zylindergläser,
Parafilm und 200ml 0,9%ige physiologische Kochsalzlösung mitgenommen werden.
Um die Kühlung der sechs Zylindergläser zu gewährleisten, wurde eine größere
Anzahl von Kühlelementen gebraucht. Je nachdem wie hoch die Recovery pro
Darmabschnitt vom Endoskopiker war, musste eine zweite Spülung erfolgen (40%).
Wenn pro Darmabschnitt zwei Lavagen notwendig waren, wurde die eine für die
Verarbeitung von Trasylol, die andere für Trasylol+PMSF verwendet. Falls eine
Spülung für die Messung von zwei Lavagen ausreichte, wurde das Recovery je zur
Hälfte auf zwei Zylindergläser aufgeteilt (60%). In das eine Zylinderglas wurde das
Röhrchen mit Trasylol+diNatriumphosphat geschüttet, während in das zweite Glas
PMSF+diNatriumphosphat hinzu gegeben wurde. Die Weiterverarbeitung im Labor
war für alle sechs gewonnenen Lavagen wie oben beschrieben.
30
2.3 Durchführung der oralen Lavage
2.3.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe
In die Studie der oralen Lavage wurden 61 Personen einbezogen, bei denen auch eine
endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage vorgenommen worden war. Je
nach Vorliegen eines oralen Allergiesyndrom in der Anamnese wurden 49 Patienten,
deren Indikation zur Koloskopie GMA, UC, CD und die oben genannten
Erkrankungen war, in zwei Gruppen eingeteilt (Patientengruppe mit oralem
Allergiesyndrom: 24 Personen, 15 weiblich, 9 männlich, Durchschnittsalter 41a,
Spannweite 16-63a, Patientengruppe ohne oralem Allergiesyndrom: 25 Personen, 11
weiblich, 14 männlich, Durchschnittsalter 45a, Spannweite 23-63a).
Die Kontrollgruppe umfasst zwölf Personen (5 Männer, 7 Frauen, Durchschnittsalter
28a, Spannweite 22-44 a).
Zusammensetzung
der Patienten mit
oraler Lavage an:
Patienten mit oralem
Allergiesyndrom
Zusammensetzung
der Patienten mit
oraler Lavage an:
Patienten ohne
oralem
Allergiesyndrom
Kontrollgruppe
Personenanzahl 24 25 12
Weiblich 15 11 7
Männlich 9 14 5
Durchschnittsalter 41 45 28
Spannweite 16-63 23-63 22-44
Tabelle 2.4: Zusammensetzung der Patienten mit oraler Lavage an: Patienten mit oralem Allergiesyndrom (OA), Patienten ohne oralem Allergiesyndrom (oOA), Kontrollgruppe (CG)
2.3.2 Vorbereitung zur Durchführung
Bei der Kontrollgruppe der oralen Lavage ist von besonderer Bedeutung, Personen
mit Pollenallergie wegen der Kreuzreaktion zu bestimmten Nahrungsmitteln (z.B.
Birkenpollen/Haselnuss – Apfel) und mit Entzündungen in der Mundhöhle (z.B.
Zahnfleischentzündung) wegen der veränderten Immunantwort auszuschließen.
Wie vor der intestinalen Lavage mussten auch vor der oralen Lavage sieben Tage
31
zuvor alle Immunsuppressiva und Antiallergika abgesetzt werden, um durch diese
Medikamente herbeigeführte veränderte Ergebnisse zu vermeiden. Das Aussetzen
der Einnahme von Antihistaminika und Mastzellstabilisatoren während der
Pollensaison war bei Tränen und Juckreiz der Augen, Niesattacken und
geschwollener Nasenschleimhaut manchmal schwer durchführbar (6%). Patienten
mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen konnten im akuten Schub nicht auf
die Einnahme von Immunsuppressiva verzichten, was auf dem Anamnesebogen
notiert wurde (2 Patienten). Vor der oralen Lavage wurde die Alkoholmenge, da
Alkohol Histamin freisetzen kann, und der Zigarettenkonsum, der für erhöhte IgE-
Spiegel (22) verantwortlich sein kann, erfragt. Die Aufklärung für die orale Lavage
musste einen Tag vor der Durchführung stattfinden, da am Morgen nach mindestens
achtstündiger Nahrungskarenz der Patient auch nichts getrunken, nicht geraucht
und keine Zähne geputzt haben durfte.
2.3.3 Durchführung
In einem mit “D“ für orale Lavage beschrifteten Becher befanden sich 50ml
physiologische Kochsalzlösung 0,9%. Der Patient nahm den Inhalt des Bechers für
eine Minute in den Mund und versuchte durch Gurgeln und Spülen die Lösung in
allen Bereichen der Mundhöhle zu verteilen. Nach einer Minute Einwirkzeit wurde
die Spüllösung in den Becher zurückgegeben und mit 2ml diNatriumphosphatpuffer
zum Anheben des pH-Wertes auf 7-8 und mit 2ml Trasylol (Aprotinin, 10 000 IE/ml)
versetzt. Diese 4ml wurden zuvor im Labor in einem Röhrchen abgefüllt und
konnten somit noch im Patientenzimmer hinzu gegeben werden. Die orale Lavage
wurde in einem mit Parafilm verschlossenen Becher und gekühlt ins Labor gebracht,
um dort wie die endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage zur Bestimmung
von Allergie- und Immunmediatoren weiterverarbeitet zu werden.
Die orale Lavage bietet die Möglichkeit, den kranialsten Teil des Magen-Darmtraktes
auf Entzündungs- und Immunmediatoren zu erkunden. Außerdem sollte in dieser
Studie der Überlegung nachgegangen werden, ob die orale Lavage sich als ein von
der Endoskopie unabhängiges Verfahren zur Ermittlung von Allergieparametern bei
Nahrungsmittelallergikern etablieren könnte.
32
2.4 Messung von TNF alpha in der Lavageflüssigkeit
TNFα ist ein von Mastzellen, Eosinophilen, Monozyten, Makrophagen,
Endothelzellen und Lymphozyten produziertes Zytokin. Dieses 17kDa schwere,
nicht glykosylierte Protein hat einen zytotoxischen Effekt auf Tumor-und Virus-
infizierte Zellen (97). Neben der Aktivierung von Makrophagen, Neutrophilen,
Eosinophilen und Endothelzellen verfügt dieses Zytokin über einen prominenten
proinflammatorischen, immunmodulatorischen und einen geringen
antientzündlichen Einfluss (97). TNFα vermittelt auch metabolische Prozesse wie
Hyperlipidämie, Knochenresorption und einen Anstieg der Muskelglycogenolyse.
2.4.1 Patientenkollektiv und Kontrollgruppe
Dieses Zytokin wurde bei 129 Personen im terminalen Ileum, bei 125 im Coecum und
bei 131 am rektosigmoidalen Übergang in den Lavagen gemessen. Unterschiedliche
Personenanzahlen ergeben sich aus den bereits bei der Bestimmung des IgE
aufgeführten Gründen.
In der Kontrollgruppe befinden sich 11 Personen, in der mit doppeltblinder
Provokation 3, mit einer GMA mit klinisch gesicherter Diagnose 39 und 27-29
Patienten je nach Darmabschnitt mit Verdachtsdiagnose einer GMA. Bei 6 bzw. 7
Patienten mit M. Crohn (CD) und 5 bzw. 6 Patienten mit Colitis ulcerosa (CU) wurde
eine Lavage durchgeführt. Außerdem gibt es noch Patienten mit Kollagencolitis
(CC), Mastozytose (MZ), chronischer Pankreatitis (CP), Adenompatienten (CAd),
eosinophiler Ösopphagitis (eo.Ö.), Histaminintoleranz (HI.), Sprue und
Salicylatintoleranz (SI).
Ein Überblick über die Personenanzahl in der jeweiligen Krankheitsgruppe, das
Durchschnittsalter, die Geschlechterverteilung und die Altersspannweite findet sich
in Tabelle 2.5:
Personenan
zahl
Durchschnitts
alter
Geschlechter
verteilung
Spannweite
Kontrollgruppe 11 55 9männlich/
2weiblich
38-71
33
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang db GMA
I-IV°
3 52 3weiblich 41-63
terminales Ileum gastrointestinal
vermittelte Allergie I-IV° Diagnose
klinisch gesichert
39 45 16männlich/
23weiblich
23-69
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie I-
IV° Diagnose klinisch gesichert
39 46 17männlich/
22weiblich
23-73
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie I°
Diagnose klinisch gesichert
8 48 3männlich/
5weiblich
34-61
terminales Ileum gastrointestinal
vermittelte Allergie II° Diagnose
klinisch gesichert
17 44 10männlich/
7weiblich
28-65
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie II°
Diagnose klinisch gesichert
18 45 11männlich/
7weiblich
28-73
terminales Ileum gastrointestinal
vermittelte Allergie III° Diagnose
klinisch gesichert
14 46 3männlich/
11weiblich
23-69
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
gastrointestinal vermittelte Allergie III°
Diagnose klinisch gesichert
13 45 3männlich/
10weiblich
23-69
terminales Ileum/ Coecum Verdacht auf
gastrointestinal vermittelte Allergie I-
IV°
27 45 12männlich/
15weiblich
23.72
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
I-IV°
29 44 13männlich/
16weiblich
23-72
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
I°
16 44 8männlich/
8weiblich
23-72
34
terminales Ileum/ Coecum Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
II°
5 45 2männlich/
3weiblich
34-61
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
II°
7 44 3männlich/
4weiblich
34-61
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
III°
5 44 2männlich/
3weiblich
33-55
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Verdacht
auf gastrointestinal vermittelte Allergie
IV°
1 51 1weiblich
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Morbus
Crohn nicht aktiv (durch CDAI
festgelegt)
4 42 4weiblich 34-50
terminales Ileum/ Coecum Morbus
Crohn aktiv (durch CDAI festgelegt)
2 43 2männlich/
3weiblich
38-47
rektosigmoidaler Übergang Morbus
Crohn aktiv (durch CDAI festgelegt)
3 45 2männlich/
1weiblich
38-51
terminales Ileum Colitis ulcerosa nicht
aktiv (durch CAI festgelegt)
6 38 3männlich/
3weiblich
29-52
Coecum/ rektosigmoidaler Übergang
Colitis ulcerosa nicht aktiv (durch CAI
festgelegt)
5 39 2männlich/
3weiblich
33-52
terminales Ileum/ rektosigmoidaler
Übergang
mikroskopische/lymphozytäre Colitis
(Kollagencolitis)
7 58 3männlich/
4weiblich
44-74
Coecum mikroskopische/lymphozytäre
Colitis (Kollagencolitis)
6 59 2männlich/
4weiblich
44-74
35
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
Mastozytose
1 32 1weiblich
terminales Ileum/ rektosigmoidaler
Übergang chronische Pankreatits
4 60 4männlich 51-72
Coecum chronische Pankreatits 3 62 3männlich 51-72
terminales Ileum/ Coecum
Kolonadenom
11 61 8männlich/
3weiblich
47-74
rektosigmoidaler Übergang
Kolonadenom
11 62 8männlich/
3weiblich
47-74
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
eosinophile Ösophagitis
1 56 1männlich
terminales Ileum/ Coecum
Histaminintoleranz
5 51 2männlich/
3weiblich
40-58
rektosigmoidaler Übergang
Histaminintoleranz
6 49 3männlich/
3weiblich
40-58
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang Sprue
4 47 1männlich/
3weiblich
38-61
terminales Ileum/ Coecum/
rektosigmoidaler Übergang
Salicylatintoleranz
1 52 1weiblich
Tabelle 2.5: Zusammensetzung der Studienpopulation für TNFα
2.4.2 Durchführung des ELISAS
Der TNFα Gehalt wurde mittels ELISA der Firma Beckmann/Coulter gemessen(97).
Bei dieser Methode handelt es sich um einen Sandwich-Enzymimmunoassay. Die
Standardreihe besteht aus den Konzentrationen 1000pg/ml, 250pg/ml, 62,5pg/ml
und 15,6pg/ml. In die Mikrotiterplatte, die einen ersten monoklonalen anti TNFα
Antikörper enthält, wurden 100µl Konjugat und 100µl Standard, Kontrolle oder
Patientenprobe pipettiert. Es ist auch ein zweiter anti TNFα Antikörper verbunden
mit alkalischer Phosphatase anwesend. Nach einer Inkubation von 120 Minuten bei
einer Temperatur zwischen 18° und 25° Celsius und 350rpm Schütteln wurden die
Mikrotiterplatten in einem automatischen Verfahren gewaschen. Nachdem 200µl
36
chromogenetisches Substrat zugegeben worden waren, wurden die Proben für
weitere 30 Minuten im Dunkeln bei einer Temperatur von 18°-25° Celsius und
350rpm Schütteln inkubiert. Vor dem Messen der enzymatisch gebundenen Aktivität
wurden 50µl Stopplösung pipettiert. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge
von 405nm bestimmt. Die Farbintensität ist proportional zur TNFα Konzentration in
den Proben und Standards. Über eine angelegte Standardkurve können die
ermittelten TNFα Spiegel abgelesen werden.
Die Histologie wird wie folgt unterteilt: H0: normal, höchstens schütteres
entzündliches Infiltrat, weitgehend entzündungsfrei, H1: chronisch entzündliches
Infiltrat, gering/minimal/leicht gestörte Kryptenarchitektur, H2: mäßig
entzündliches Infiltrat, Krypten-/Mucosa-/Submucosa-Distorsion disproportioniert,
gestörte Kryptenarchitektur, H3: deutlich entzündliches Infiltrat, Nekrose,
Kryptenabszesse.
37
3 Ergebnisse
3.1 Bestimmung von totalem und spezifischem IgE am unteren Gastrointestinaltrakt
3.1.1 Intestinales Gesamt-IgE am unteren GIT bei ga strointestinal vermittelten Allergien (I- IV°)
CG GMA DB GMA V.a. GMA0
10
20
30
40
50
2/35 6% 3/12 25% 22/134 16% 11/100 11%
Ges
amt -
IgE
[U/m
g P
rote
in]
Intestinales Gesamt - IgE am unteren GITbei vermittelten Allergien
(GMA I - IV°)
Auf der x-Achse sind Patienten mit gastrointestinaler Allergie unterteilt in
doppeltblinde Provokation, klinisch gesichert und Verdachtsdiagnose der
Kontrollgruppe gegenübergestellt, während auf der y-Achse der Gesamt-IgE Spiegel
in U/mg Protein am unteren GIT aufgetragen ist.
In Tabelle 3.1 sind das Gesamt-IgE am unteren GIT als Median, Mittelwert, SD,
Prozentsatz und Anzahl in den unterschiedlichen Erkrankungsgruppen
widergegeben.
38
Median Mittelwert SD Prozentsatz Anzahl Signifikanz Variations-
koeffizient
Kontroll-
gruppe
0 0,1913 0,8254 6% 2/35 keine 431,47
Gastrointestinal
vermittelte
Allergie db
0 0,9592 2,134 25% 3/12 keine 222,48
Gastrointestinal
vermittelte
Allergie klin.
0 2,110 6,651 16% 22/134 keine 315,21
V.a.
Gastrointestinal
vermittelte
Allergie
0 0,4937 1,478 11% 11/100 keine 299,37
Tabelle 3.1: Gesamt IgE am unteren GIT
(Der Variationskoeffizient errechnet sich aus der Standardabweichung in Prozent vom Mittelwert)
In ca. 20% der Fälle mit einer gastrointestinal vermittelten Allergie (GMA) lässt sich
totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt nachweisen, während IgE in der
Kontrollgruppe (CG) nur in 6% zu finden ist. Auffällig ist die unterschiedliche
Ausbeute an Gesamt-IgE in den unterschiedlichen Erkrankungsgruppen.
Während bei zwei von den 35 Lavagen der Kontrollgruppe die Gesamt-IgE Spiegel
gering über der Nachweisgrenze von 2U/mg Protein mit 4,28U/mg Protein und
2,48U/mg Protein lagen, gibt es in der GMA-Gruppe mit klinisch gesicherter
Diagnose Patienten mit Werten, die größer als 20 U/mg Protein sind. Die höchsten
Werte haben zwei Patienten mit einer GMA II° mit 44 U/mg Protein im Coecum und
27,01 U/mg Protein im terminalen Ileum. Eine Signifikanz war nicht nachweisbar, da
sich die Population der GMA aus zwei unterschiedlichen Populationen
39
zusammensetzt. Zum einen aus Patienten mit einer IgE vermittlten Allergie zum
anderen aus Patienten mit einer nicht IgE mediierten Allergie. In der Literatur ist der
Prozentsatz an IgE vermittelten Allergien mit 60- 85% angegeben, während in dieser
Studie nur in ca. 20% am unteren GIT IgE nachweisbar ist.
3.1.2 Gesamt-IgE am unteren GIT bei gastrointestina l vermittelter Allergie (GMA I-IV°)
Gesamt - IgE am unteren GIT bei gastro-intestinal vermittelter Allergie (GMA I - IV°)
Term. Ileum Coekum Rectum0.0
2.5
5.0
7.5
10.0Kontrollpersonen
GMA I - IV°
Ges
amt -
IgE
[U/m
g P
rote
in]
1/11 6/45 0/12 11/44 1/12 19/45
P=0,75 p=2,4 p=7,4 p=1,2 p=7,9
Graphik 3.1
In der Graphik sind auf der X-Achse die unterschiedlichen Lavagespülorte
terminales Ileum, Coecum und rektosigmoidaler Übergang ca. 20 cm von der
Anokutanlinie entfernt aufgezeigt, während auf der y-Achse wieder das Gesamt-IgE
in U/mg Protein zu finden ist. Pro Darmabschnitt sind zwei Balken dargestellt: einer
für die Kontrollgruppe, der andere für die Patienten mit GMA klinisch gesichert.
Teilt man die Lavagen in die drei unterschiedlichen Darmabschnitte auf, erkennt
40
man vom terminalen Ileum über das Coecum bis zum Rektum ansteigende IgE
Konzentrationen in der Patientengruppe mit gastrointestinal vermittelter Allergie.
Darmabschnitt Kontrollgruppe GMA klin. Signifikanz
Mittelwert Terminales Ileum 0,2255 0,4464 keine
Coecum 0 1,880 keine
Rectosigmoidaler Übergang 0,3567 3,807 keine
Standardabweichung Terminales Ileum 0,7477 2,374 keine
Coecum 0 7,436 keine
Rectosigmoidaler Übergang 1,236 7,901 keine
Median Terminales Ileum 0 0 keine
Coecum 0 0 keine
Rectosigmoidaler Übergang 0 0 keine
Tabelle 3.2: Mittelwert, Standardabweichung und Median
Die hohe Standardabweichung verdeutlicht die unterschiedliche Zusammensetzung
der Populationen, da es eine große Anzahl von Patienten gibt, die keinen lokalen IgE
Nachweis haben, während bei anderen Patienten IgE auch in hoher Konzentration
gefunden werden kann.
41
3.1.3 Intestinales Gesamt-IgE im Rectum bei gastroi ntestinal vermittelter Allergie (GMA I-IV°, IgE abhängiger Typ)
CG GMA I° GMA II° GMA III° GMA IV°0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
°
Ges
amt -
IgE
[U/m
g P
rote
in]
Intestinales Gesamt - IgE im Rectum beigastrointestinal vermittelter Allergie
(GMA I - IV°, IgE-abhängiger Typ I)20.0
1/12 3/8 7/19 4/15 1/3
Graphik 3.2
Unterteilt man die große Gruppe der gastrointestinalen Allergie in ihre
Schweregrade, so sehen wir mit dem Grad der Allergie ansteigende IgE
Konzentrationen im Rektum, nicht aber im terminalen Ileum oder Coecum.
42
3.1.4 Intestinales Gesamt IgE am unteren GIT bei ch ronisch entzündlichen Darmerkrankungen
CG CD UC C & M C0
10
20
30
40
50
2/35 6% 6/22 27% 6/19 32% 5/27 19%
Ges
amt -
IgE
[U/m
g P
rote
in]
Intestinales Gesamt - IgE am unteren GITbei chron. entzündlichen Darmerkrankungen
Graphik 3.3
Bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen erhalten wir in ca.
30% totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt (GIT), so dass wir hier verstärkt
nach Nahrungsmittelallergien suchen sollten. Auch bei der Kollagenkolitis ist in 19%
totales IgE am unteren GIT nachweisbar.
Tabelle 3.3 zeigt je nach Erkrankungsgruppe Morbus Crohn (CD na/a), Colitis
ulcerosa (UC na/a), gastrointestinal vermittelte Allergie (GMA) doppeltblind (db),
klinisch gesichert oder mit Verdachtsdiagnose (V.a. GMA) die IgE positiv und
negativen Patienten auf.
IgE negativ in % IgE positiv in %
Kontrollgruppe 94 (33/35) 6 (2/35)
43
gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV° Diagnose nach
doppeltblinder Provokation
gestellt
75 (9/12) 25 (3/12)
gastrointestinal vermittelte
Allergie I-IV° Diagnose
klinisch gesichert
84 (112/134) 16 (22/134)
Verdacht auf gastrointestinal
vermittelte Allergie I-IV°
89 (89/100) 11 (11/100)
Morbus Crohn nicht
aktiv/aktiv (durch CDAI
festgelegt)
73 (16/22) 27 (6/22)
Colitis ulcerosa nicht
aktiv/aktiv (durch CAI
festgelegt)
79 (15/19) 21 (4/19)
Kollagenkolitis 81 (22/27) 19 (5/27)
Mastozytose 100 (9/9) 0 (0/9)
Histaminintoleranz 83 (15/18) 17 (3/18)
Tabelle 3.3: Totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt in Prozent
IgE negativ
Erwartete Anzahl
IgE positiv
Erwartete Anzahl
Chi-Quadrat
df Asymptotische Signifikanz
Kontrollgruppe 33 33,0 2 2,0 0,000 1 1,000 db GMA I-IV° 9 11,3 3 0,7 8,284 1 0,004 GMA I-IV° 112 126,3 22 7,7 28,494 1 0,000 V.a.GMA I-IV° 89 94,3 11 5,7 5,186 1 0,023 M.Crohn na/a 16 20,7 6 1,3 18,978 1 0,000 Colitis ulcerosa na/a
15 17,9 4 1,1 8,297 1 0,000
Kollagenkolitis 22 25,5 5 1,5 8,216 1 0,004 Mastozytose 9 8,5 0 0,5 0,545 1 0,460 Histaminintoleranz 15 17,0 3 1,0 4,008 1 0,045 Tabelle 3.4: Totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt getestet mittels Chi Quadrattest
Wie zu erwarten ist, erhalten wir eine sehr große Ausbeute an totalem IgE in der
Patientengruppe der gastrointestinal vermittelten Allergie, deren Diagnose durch
44
den Goldstandard der doppeltblinden Provokation gesichert ist. Insgesamt lässt sich
bei Patienten mit einer gastrointestinal vermittelten Allergie in ca. 20% der Fälle IgE
nachweisen.
Bei totalem IgE erhält man in der Gruppe der gastrointestinal vermittelten Allergie
niemals eine Signifikanz, da die Gruppe der gastrointestinal vermittelten Allergie
aus zwei Populationen besteht: zum einen aus der IgE vermittelten Allergie, zum
anderen aus der nicht IgE mediierten Allergie. (Getestet wurde mit Hilfe des nicht
parametrischen U-Test für unabhängige Stichproben: Mann-Whitney-Test, p<0.05
gilt als signifikant).
3.1.5 Patienten – Subpopulationen bei gastrointesti nal vermittelter Allergie (GMA I-IV°)
IgE - vermitteltelokale Allergie(Typ I)
Nicht - IgE ver-mittelte lokale Allergie(Typ II - IV)
CG G M A 0
10
20
30
40
50
2/35 6% 22/134 16%
Patienten - Subpopulationen bei gastro-intestinal vermittelten Allergien
(GMA I - IV°)Gesamt - IgE
[U/mg Protein]
Graphik 3.4
Erstaunlicherweise war nur in ca. 20% der gastrointestinal vermittelten Allergie
totales IgE nachweisbar. Insgesamt liegt keine Signifikanz vor.
45
Für die große Gruppe der nicht IgE vermittelten Allergien (Typ II-IV Allergie) wird
die TNF-alpha Konzentration in der endoskopisch gesteuerten segmentalen
Darmlavage gemessen.
3.2 Bestimmung von TNF alpha am unteren Gastrointes tinaltrakt
3.2.1 Bestimmung von intestinalem TNF alpha mittels segmentaler endoskopischer Lavage
Bestimmung von intestinalem TNFalpha mittelssegmentaler endoskopischer Lavage
terminalesIleum (A)
Recto-sigmoidalerÜbergang (C)
Gastrointestinal vermittelte AllergieKontrollgruppe
TN
Fal
pha
[pg/
mg
Pro
tein
](M
ittel
wer
t +
SD
)
00
25
50
75
100
125
150
Coekum(B)
Die Anzahl in allen drei Darmabschnitten beträgt in der Kontrollgruppe 11/50 und in der Gruppe mit gastrointestinal vermittelter Allergie Grad I-IV 39/50.
Graphik 3.5
Darmabschnitt Kontrollgruppe GMA klin. Signifikanz
Mittelwert Terminales Ileum 7,139 23,47 keine
Coecum 26,1 23,46 keine
Rectosigmoidaler
Übergang
37,30 78,99 keine
46
Standardabweichung Terminales Ileum 9,12 62,98 keine
Coecum 38,37 35,41 keine
Rectosigmoidaler
Übergang
62,10 184,6 keine
Median Terminales Ileum 3,78 9.88 keine
Coecum 9,12 21,81 keine
Rectosigmoidaler
Übergang
17,34 15,38 keine
Range Terminales Ileum 0-27.02 0.1-398.9 keine
Coecum 0,15-130,6 0-183,4 keine
Rectosigmoidaler
Übergang
0-215,8 0-847,6 keine
Tabelle 3.6: TNF alpha am unteren Gastrointestinaltrakt: Mittelwert, Standardabweichung, Median und Range
In der Patientengruppe mit einer gastrointestinalen Allergie finden sich immer
höhere Konzentrationen als in der Kontrollgruppe. Der Unterschied ist im
terminalen Ileum am höchsten, wobei die Streuung aber sehr groß ist. In allen drei
Darmabschnitten konnte keine Signifikanz erreicht werden.
47
3.2.2 Diagnostischer Wert der endoskopischen Lavage bei nicht IgE vermittelter Allergie (I-IV°)
A B C A B C 0
25
50
75
100200300400500
IgE
[U/m
g P
rote
in] b
zw.
TN
F [p
g/m
g P
rote
in]
Diagnostischer Wert der endoskopischenLavage bei nicht-IgE vermittelter GMA I - IV°
I g E T N F
A term. IleumB CoekumC Rekt.-sigmoidaler
Übergang
Graphik 3.6
Schaut man sich nun die unterschiedlichen IgE und TNF -alpha Konzentrationen in
der Gruppe der nicht IgE mediierten Allergien an, so haben Patienten mit sehr hoher
TNF -alpha Produktion häufig niedrige IgE Konzentrationen.
48
3.2.3 Gesamt IgE in Korrelation zum TNF -alpha am u nteren GIT bei GMA I-IV° (IgE abhängiger Typ I)
0 10 20 30 40
0
250
500
750
1000Gesamt-IgE in Korrelation zu TNF alpha
am unteren GIT bei GMA I - IV°(IgE-abhängiger Typ I)
Gesamt-IgE[U/mg Protein]
TN
Fal
pha
[pg/
mg
Pro
tein
]
Graphik 3.7
Trägt man die Patienten mit einer IgE vermittelten Typ I Allergie auf, weisen 2
Patienten mit sehr hohen IgE Werten sehr geringe TNF alpha Konzentrationen auf
49
3.2.4 TNF alpha im terminalen Ileum bei gastrointes tinal vermittelter Allergie I-IV°
CG GMA I° GMA II° GMA III°GMA IV°0
5
10
15
20
25
30
35
TN
Fal
pha
[pg/
mg
Pro
tein
]
TNF alpha im terminalen Ileum bei gastrointestinal vermittelter Allergie40
Graphik 3.8 IgE und nicht IgE abhängiger Typ
Auch bei TNF –alpha finden wir im terminalen Ileum mit dem Grad der Allergie
ansteigende TNF Spiegel. Leider ist kein Patient mit einer Grad IV Allergie in diesem
Patientenkollektiv. Bei Patienten mit GMA I° (n=8) wurde ein TNF alpha- Gehalt von
5,2+/- 4,3 pg/mg, mit GMA II° (n=16) von 14,7+/-14,9 pg/mg und mit GMA III°
(n=13) von 17,32+/-11,8 pg/mg [Kontrollgruppe (n=10) 7,8+/-9,3 pg/mg] gemessen,
während der nicht aktive Crohn Werte von 30,0+/-31,9 pg/mg und die nicht aktive
Colitis ulcerosa von 14,0+/-7,8 pg/mg zeigten. Auffallend ist die mit dem Grad der
GMA ansteigende Produktion an TNF alpha, die ab einer GMA II° zur
Diagnosefindung beitragen könnte.
Deutlich erhöhte TNF alpha-Spiegel fand man im aktiven Schub bei chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen (CDa 125,5+/-173,3 pg/mg, UCa 55,7+/-13,8
pg/mg), was die starke Entzündung widerspiegelt. Bei der Colitis ulcerosa ist p<0.05
und damit signifikant, aber aufgrund der sehr kleinen Fallzahl noch nicht
50
aussagekräftig. Das generell bei M. Crohn erhöhte TNF alpha könnte erklären,
weshalb Infliximab erfolgreich in der Therapie des M. Crohn eingesetzt wird.
Patientengruppe Mittelwert SD Signifikanz
Kontrollgruppe 7,8 9,3 pg/mg keine
gastrointestinal vermittelte Allergie
I° Diagnose klinisch gesichert
5,2 4,3 pg/mg keine
gastrointestinal vermittelte Allergie
II° Diagnose klinisch gesichert
14,7 14,9 pg/mg keine
gastrointestinal vermittelte Allergie
III° Diagnose klinisch gesichert
17,32 11,8 pg/mg keine
Morbus Crohn nicht aktiv (durch
CDAI festgelegt)
7,8 9,3 pg/mg keine
Morbus Crohn aktiv (durch CDAI
festgelegt)
125,57 173,3 pg/mg keine
Colitis ulcerosa nicht aktiv (durch
CAI festgelegt)
14,0 7,8 pg/mg keine
Colitis ulcerosa aktiv (durch CAI
festgelegt)
30,0 31,9 pg/mg P<0.05
Tabelle 3.7: TNF alpha-Gehalt in den unterschiedlichen Erkrankungsgruppen am gesamten unteren Gastrointestinaltrakt
3.3 Messung von spezifischem IgE am unteren Gastrointestinaltrakt
Bei sechs Personen von 151 Personen (entspricht 4%) konnte spezifisches IgE im
terminalen Ileum gefunden werden. Die Patientengruppe ist sehr heterogen: ein
Patient mit einem aktiven Morbus Crohn, ein Patient mit einer Kollagenkolitis, zwei
Patienten mit einer gastrointestinal vermittelten Allergie II° und zwei Patienten mit
einer nicht aktiven Colitis ulcerosa.
Im Coecum war bei fünf Personen von 151 Personen (entspricht 3,3%) spezifisches
IgE nachweisbar. Unter ihnen ein Patient mit einer Kollagenkolitis, ein Patient mit
der Verdachtsdiagnose GMA II°, ein Patient mit einer GMA II°, ein Patient mit einem
51
aktiven Morbus Crohn und ein Patient, der sowohl eine nicht aktive Colitis ulcerosa
als auch die Verdachtsdiagnose GMA III° zu haben scheint.
Am rektosigmoidalen Übergang war bei elf Personen von 154 Personen (entspricht
11%) IgE auffindbar. Auch finden sich sehr unterschiedliche Erkrankungsbilder wie
Patienten mit einer gastrointestinal vermittelten Allergie II°/III°/IV°, aktivem
Morbus Crohn, Kollagencolitis und der Verdachtsdiagnose einer Gastrointestinal
vermittelten Allergie.
52
Graphik 3.9 zeigt die häufigsten Allergene in % bezogen auf alle drei Darmabschnitte
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Weize
nmeh
l
Rindfl
eisch
Sojabo
hnen
Roggen
mehlReis
Karto
ffel
Lacta
lbum
in
Schwein
eflei
sch
Kasein
Eiklar
Eigelb
Nussmisc
hung
Graphik 3.9
In der Tabelle 3.8 finden sich die gemessenen Allergene in % in die unterschiedlichen
drei Darmabschnitte aufgeteilt wieder
Terminales
Ileum
Coecum Rektosigmoidaler
Übergang
Unterer GIT
gesamt
Schweinefleisch 33% (2/6) 0% (0/5) 45% (5/11) 32% (7/22)
Rindfleisch 50% (3/6) 20% (1/5) 55% (6/11) 45% (10/27)
Kartoffel 40% ((2/5) 20% (1/5) 36% (4/11) 33% (7/21)
Reis 33% (2/6) 20% (1/5) 45% (5/11) 36% (8/22)
Sojabohne 33% (2/6) 20% (1/5) 64% (7/11) 45% (10/22)
Weizenmehl 67% (4/7) 40% (2/5) 64% (7/11) 59% (13/22)
Roggenmehl 50% (3/6) 20% (1/5) 55% (6/11) 45% (10/22)
Nussmischung 20% (1/5) 0% (0/5) 40% (4/10) 25% (5/20)
Lactalbumin 40% (2/5) 20% ((1/5) 36% (4/11) 33% (7/21)
Kasein 20% (1/5) 40% (2/5) 27% (3/11) 29% (6/21)
Eiklar 20% (1/5) 40% (2/5) 22% (2/9) 26% (5/19)
Eigelb 20% (1/5) 20% (1/5) 33% (3/9) 26% (5/19)
Tabelle 3.8: Allergene in Prozent in unterschiedlichen Darmabschnitten
53
Mittelwert Median
Schweinefleisch 2,58 4,92
Rindfleisch 0,963 1,5
Kartoffel 2,265 4,74
Reis 1,38 1,9
Sojabohne 1,715 3,94
Weizenmehl 1,32 2,56
Roggenmehl 1,048 1,43
Nussmischung 5mal pos
Lactalbumin 0,96 2,05
Kasein 0,94 1,36
Eiklar 0,85 0,97
Eigelb 0,88 1,18
Tabelle 3.9 spezifisches IgE als Mittelwert und Median
Im terminalen Ileum findet sich in dieser bezüglich spezifischem IgE positiven
Gruppe in 36% spezifisches IgE, im Coecum in 22% und am rektosigmoidalen
Übergang in 44%.
Bei keinem der Kontrollpatienten wurde spezifisches IgE gefunden.
3.4 Korrelation zwischen totalem IgE und Serum-IgE
Korrelation zwischen totalem IgE und Serum-IgE bei Patienten mit M. Crohn (CD
na/a), Colitis ulcerosa (UC na/a) und Gastrointestinal vermittelter Allergie klinisch
oder durch doppeltblinde Provokation gesichert (GMAdb/klin.)
Morbus Crohn na/a
n=5
Colitis ulcerosa na/a
n=4
Gastrointestinal
vermittelte Allergie
klin./db n=21
r2 0,2778 0,1940 0,1879
p 0,2625 0,4366 0,0618
Signifikanz Nicht signifikant Nicht signifikant Nicht signifikant
Tabelle 3.10: Korrelation zwischen totalem IgE am unteren GI-Trakt und Serum-IgE
Wie aus Tabelle 3.10 zu erkennen ist, besteht kein Zusammenhang zwischen
intestinalem IgE und Serum-IgE in den Erkrankungsgruppen. Somit liefert das
54
Serum-IgE keinen direkten Hinweis auf die direkt am Effektororgan gemessenen IgE
Konzentrationen.
3.5 Zusammenhang zwischen Histologie und Erkrankung sgruppe
Bei allen Lavagepatienten wurden routinemäßig Stufenbiopsien entnommen und
vom Pathologen untersucht. Graphik 3.10 gibt den Zusammenhang zwischen
Histologie (eingeteilt nach H0-H3) und den Erkrankungsgruppen Morbus Crohn
(CD na/a), Colitis ulcerosa (UC na/a), Kollagenkolitis und gastrointestinal
vermittelter Allergie klinisch oder durch doppeltblinde, placebokontrollierte
Provokation wieder.
0
20
40
60
80
100
120
H0 H1 H2 H3 H0 H1 H2 H3 H0 H1 H2 H3 H0 H1 H2 H3
CG UC CD GMA
Anz
ahl
Graphik 3.10
In der Gruppe der GMA db/klin mit lokalem Nachweis von totalem IgE finden sich
2/19 Patienten (10,5%) mit Histologie H1, während 17/19 Patienten eine Histologie
von H0 aufweisen (89,5%). H2 oder H3 konnte nicht in der GMA-Gruppe eruiert
werden.
Die Tabelle 3.11 zeigt die Histologie in Bezug zur IgE Konzentration.
55
GMA db/klin H0 H1
Anzahl 17/19 (89,5%) 2/19 (10,5%)
IgE Range 2,5-44 U/mg Protein 10.44-10,53U/mg Protein
IgE Median 7,6 U/mg Protein 10,49 U/mg Protein
IgE Mittelwert 12,56 U/mg Protein 10,49/mg Protein
Tabelle 3.11: Histologie in Bezug zur IgE Konzentration
Aus der Graphik 3.10 wird deutlich, dass die Histologie mit der H0-H3 Einteilung
nicht zur Diagnosefindung der GMA beiträgt. Außerdem kann mit der Histologie
kein Vorhersagewert für die Ausbeute an totalem IgE in der Lavage getroffen
werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass in der Gruppe der GMA nur zwei
Patienten mit einer H1 Histologie und positivem IgE Nachweis sind.
Berücksichtigt man noch in der Histologie die Anzahl der Eosinophilen, so erhält
man folgende Tabelle 3.12
männlich weiblich Durchschnittsalter Histologie
Morbus Crohn
nicht aktiv/aktiv
(durch CDAI
festgelegt)
8 12 40a 8*HoEo
4*H1Eo
8*H2Eo
Colitis ulcerosa
nicht aktiv/aktiv
(durch CAI
festgelegt)
6 13 39a 8*HoEo
6*H1Eo
3*H2Eo
1*H2Eo
1*HoE3
Kollagenkolitis 12 12 58 14*HoEo
3*H1Eo
4*H1E1
3*H1E2
GMA klin/db 46 80 44 101*HoEo
12*H1Eo
2*H2Eo, 1*H2E2
8*HoE1, 1*H2Eo
Tabelle 3.12: Histologie der unterschiedlichen Erkrankungsgruppen
56
In der Tabelle 3.12 bestätigt sich ebenfalls, dass die Histologie keine
Nahrungsmittelallergie aufdecken kann. In 81% der Lavagen bei Patienten mit
Nahrungsmittelallergie war die Histologie völlig unauffällig, so dass es einer
Abklärung z.B. der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage bedarf.
3.6 Orale Lavage
3.6.1 Analyse wichtiger Immunmediatoren und des Imm unglobulin E aus der oralen Lavage gesunder Personen
Die Graphik 3.11 zeigt Immunmediatoren, totales und spezifisches IgE in der
gesunden Kontrollgruppe auf. Für die orale Lavage mussten Normwerte erhoben
werden, da das Verfahren erst neu eingeführt wurde. Als Normwert wurde die
zweifache Standardabweichung des Wertes der Kontrollgruppe angenommen.
Graphik 3.11
In der Tabelle 3.13 sind die absoluten Werte der Kontrollgruppe pro mg Protein aufgeführt.
Protein ECP Tryptase TNF tIgE Spez. IgE
Mittelwert 0.46 3,9 3.2 9.97 0 0
Median 0.46 4,5 3.3 9.8 0 0
57
SD 0.02 2.5 0.6 3.7 0 0
Tabelle 3.13: Immunmediatoren der Kontrollgruppe pro mg Protein
Bei keinem Probanden aus der Kontrollgruppe wurde ein totales oder spezifisches
IgE gefunden. Im Gegensatz dazu kam es bei drei Patienten mit einer gastrointestinal
vermittelten Allergie in Kombination mit einem oralen Allergiesyndrom zum
Nachweis von totalem IgE. Die Unterschiede bezüglich ECP, Tryptase und TNF
alpha waren nicht signifikant.
Graphik 3.12 zeigt die Immunmediatoren, totales und spezifisches IgE bei Patienten
mit gastrointestinal vermittelter Allergie, die zusätzlich unter einem oralen
Allergiesyndrom leiden, auf.
Graphik 3.12
Vergleicht man die Werte der Kontrollgruppe mit den Ergebnissen der Patienten mit
GMA und oralem Allergiesyndrom, filtert man bei ECP einen Patienten und beim
TNF alpha Gehalt wieder einen Patienten heraus, dessen Wert über der zweifachen
Standardabweichung liegt. Während bei der Kontrollgruppe lokal IgE in der
Mundhöhle nicht nachweisbar war, konnte bei drei Patienten IgE in der Mundhöhle
gefunden werden. Die orale Lavage sollte eingeführt werden, um ein von der
Endoskopie unabhängiges Verfahren zu entwickeln, Nahrungsmittelallergien
58
aufzuzeigen. Spezifisches IgE konnte nicht nachgewiesen werden. Da nur bei
Patienten mit oralem Allergiesyndrom IgE nachweisbar war, sollte dieses Verfahren
nur bei Patienten mit oralem Allergiesyndrom eingesetzt werden. Da Patienten mit
oralem Allergiesyndrom meist wissen, auf was sie allergisch reagieren, und an erster
Stelle der Therapie immer die Allergenkarenz steht, wurde klar, dass die
endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage nicht durch dieses Verfahren
ersetzt werden kann.
3.7 Vergleich des Proteingehaltes/ Immunmediatoren von Darmlavagen bei Behandlung mit Trasylol bzw. Trasyl ol und PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)
Bei sechs Patienten und somit 18 unterschiedlichen Lavagen wurden der
Proteingehalt, Eosinophiles cationischen Protein (ECP), Tryptase, TNF alpha und
totales und spezifisches IgE bezüglich des Unterschiedes in der Proteinausbeute
untersucht.
TNF alpha ist manchmal bei Trasylol alleine, manchmal aber auch bei Trasylol in
Kombination mit PMSF höher. Wobei aber festzustellen ist, dass die TNF alpha
Konzentration bei Trasylol und PMSF, falls es größer als bei Trasylol alleine ist,
deutlich höher ist ( Vergleiche Summe der Mittelwerte bei Trasylol alleine liegt bei
17,2 bei Trasylol in Kombination mit PMSF bei 26,5). Im terminalen Ileum liegt das
Verhältnis bei 50%, im Coecum ist der TNF alpha Gehalt bei Trasylol alleine in 80%
höher als bei Trasylol mit PMSF, am rektosigmoidalen Übergang ist der TNF alpha
Gehalt bei Trasylol mit PMSF in 80% höher als bei Trasylol alleine und in der oralen
Lavage ist der TNF alpha Gehalt in 100% höher in Kombination der
Proteaseinhibitoren als bei Trasylol alleine.
TNF Term.
Ileum 1
Termina
les
Ileum 2
Coecum
1
Coecum
2
Rekto
Sigmo
idaler
Über
gang 1
Rekto
Sigmo
idaler
Über
gang 2
Orale
Lavage
1
Orale
Lavage
2
Mittel
wert
10,62 12,9 4,9 5,3 48,05 78,7 4,7 8,9
59
SD 12,57 16,1 3,6 4,3 39,9 61,4 1,7 3,6
Median 6,26 8,4 3,13 4,06 46,0 67,3 4,7 9,2
Tabelle 3.14: TNF alpha-Ausbeute bei Verarbeitung mit Trasylol (entspricht 1) bzw. mit Trasylol + PMSF (entspricht 2)
Über totales IgE lässt sich keine eindeutige Aussage treffen, da 2 von 18 Lavagen
(11%) mit Trasylol und 3 von 18 (17%) mit Trasylol und PMSF positiv waren.
Spezifisches IgE war in beiden Ansätzen nicht nachweisbar.
Im Proteingehalt ist kein eindeutiger Trend feststellbar. Falls Trasylol einen höheren
Proteingehalt hat, ist dieser meist deutlich höher als bei Trasylol und PMSF.
Umgekehrt nur geringfügig erhöht.
Protein Term.
Ileum 1
Term.
Ileum 2
Coecum
1
Coecum
2
Rektos.
Überg.
1
Rektosi.
Überg.
2
Orale
Lavage
1
Orale
Lavage
2
Mittelwert 0.6 0.56 0.52 0.54 0.6 0.5 0.5 0.45
SD 0.2 0.15 0.1 0.15 0.07 0.07 0.05 0.15
Median 0.55 0.55 0.52 0.5 0.63 0.47 0.52 0.49
Tabelle 3.15: Proteinmessung bei Verarbeitung mit Trasylol 1 bzw. mit Trasylol + PMSF 2
Der Mittelwert von Trasylol bei allen sechs Patienten in den drei Darmabschnitten und der oralen Lavage liegt bei 0,56, der Mittelwert bei Trasylol + PMSF bei 0,51.
Bei der Bestimmung von Tryptase und ECP ist kein hervorzuhebender Unterschied
erkennbar.
Tryptase Term.
Ileum 1
Term.
Ileum 2
Coecum
1
Coecum
2
Rektos.
Überg.
1
Rektos.
Überg.
2
Orale
Lavage
1
Orale
Lavage
2
Mittelwert 1,6 2,03 2,04 7,7 2,08 2,6 3,5 3,9
SD 0,77 0,71 0,64 13,96 0,44 0,56 0,37 1,8
Median 1,5 2,06 2,03 2,06 2,2 2,6 2,98 3,2
ECP A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2
Mittelwert 49,6 35,9 44,5 67,2 60,07 87,5 5,8 7,9
SD 111,1 77,7 104,1 155,6 120,7 182,6 7,652 10,11
60
Median 4,08 4,9 2,08 2,2 8,3 6,9 2,7 2,9
Tabelle 3.16: Tryptase und ECP bei Verarbeitung mit Trasylol 1 bzw. mit Trasylol + PMSF2
Da die neue Aufbereitung keinen eindeutigen Vorteil erbracht hat, wurde die Lavage
weiterhin mit Trasylol alleine aufbereitet.
61
4 Diskussion
Mit der in dieser Arbeit weiterentwickelten und standardisierten Methode der
endoskopisch gesteuerten, segmentalen Darmlavage ist es gelungen, in während der
Koloskopie gewonnener Spülflüssigkeit Immunmediatoren zum Aufzeigen von
Nahrungsmittelallergien nachzuweisen. Neben dem Nachweis von totalem und
spezifischem IgE wurde erstmals TNF alpha in der Spülflüssigkeit bestimmt. Es
sollte geprüft werden, ob TNF alpha bei Nahrungsmittelallergikern vermehrt
gefunden werden kann. Des Weiteren wurden auch die Spülflüssigkeiten von
Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen untersucht. Bei Patienten
mit Morbus Crohn wird der monoklonale Antikörper gegen TNF alpha bereits
erfolgreich mit erheblichen Nebenwirkungen in der Therapie eingesetzt. Während
anti TNF alpha in der Therapie bei Morbus Crohn klinische, endoskopische und
histologische Effekte erzielen kann (5), scheint es bei Patienten mit Colitis ulcerosa
nicht nützlich zu sein (23)(58). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob auch
Patienten mit Nahrungsmittelallergie erhöhte TNF alpha Konzentrationen aufweisen
(36)(24)(50), was eventuell für einen Spättyp einer Nahrungsmittelallergie sprechen
würde, und ob es einen Unterschied bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis
ulcerosa gibt (49)(99)(91)(23)(5). Der Nachweis von spezifischem IgE sollte den
Patienten aufzeigen, bei welchen Nahrungsmitteln sie eine Allergenkarenz einhalten
sollten. Es wurden die häufigsten Nahrungsmittelallergene wie z.B. Milch und Nüsse
getestet (26)Error! Reference source not found.(109). Dies sollte vor allem den
Patienten helfen, bei denen im Pricktest, Epikutantest und RAST-Test keine
Allergene herausgefiltert werden konnten, so dass diese Patienten trotz immenser
Beschwerden nicht wussten, was sie meiden sollten (2)(10)(17)(57). Desweiteren
sollte untersucht werden, ob es einen Zusammenhang zwischen Histologie und
Nahrungsmittelallergie gibt. Insbesondere ob bei Nahrungsmittelallergikern mehr
Eosinophile nachweisbar sind bzw. ob gleichzeitig eine Entzündungsreaktion in der
Darmschleimhaut abläuft. Es stellte sich die Frage, ob Serum IgE bei Patienten mit
Nahrungsmittelallergie signifikant höhere Werte aufzeigte als bei Patienten ohne
Allergie. In der endoskopisch durchgeführten segmentalen Darmlavage konnte kein
62
Zusammenhang gefunden werden. Betut und Klomannskog stellten ebenfalls fest,
dass IgE-Konzentrationen im Stuhl und Lavageflüssigkeit keine Korrelation zu
Serum IgE aufwiesen (8)(45).
Mit der oralen Lavage sollte ein von der Endoskopie unabhängiges Verfahren
gefunden werden, um Nahrungsmittelallergien nachzuweisen, und somit dem
Patienten eine Koloskopie zu ersparen. Interessanterweise waren in der oralen
Lavage Immunmediatoren nachweisbar. Es konnten auch IgE Konzentrationen
nachgewiesen werden. Dies war jedoch nur bei Patienten mit oralem
Allergiesyndrom nachweisbar. Bei Patienten mit oralem Allergiesyndrom geht man
meist von einer IgE abhängigen Reaktion von Soforttyp aus (84)(38)(85). Da diese
Patienten eine sofortige Reaktion auf ihr Allergen haben - sei es wie z.B. ein
Pelzigkeitsgefühl im Mund oder Juckreiz – sind die Allergene bekannt und können
somit bewusst gemieden werden. Diese Untersuchung zeigte somit, dass auf die
Durchführung der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage nicht
verzichtet werden kann.
4.1 Totales IgE am unteren Gastrointestinaltrakt
In der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage war nur in 20% der Fälle
totales IgE lokal am unteren Gastrointestinaltrakt nachweisbar. Dieses Ergebnis sollte
nicht den Anspruch erheben, dass es sich bei Nahrungsmittelallergien nur in 20% der
Fälle um IgE abhängige Typ I Allergien handeln würde. Es weist jedoch deutlich
daraufhin, dass es bei einer Nahrungsmittelallergie eine lokale gastrointestinale
Allergie mit lokaler IgE Bildung gibt, so wie es auch den schon lange bekannten
Nachweis von IgE im Blut und auf der Haut gibt. Desweiteren handelt es sich um ein
vorselektioniertes Patientengut, da die IgE abhängigen Allergien häufig beim
niedergelassenen Kollegen z.B. Dermatologen, HNO Arzt, Kinderarzt, Allergologen
usw. herausgefiltert wurden. Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen, die darauf
hinweisen, dass es eine lokale IgE Bildung in den einzelnen Darmsegmenten gibt
(45)(50)(71). Finn beschreibt, dass die Allergie sich lokal in der Mucosa- und
Submucosa des Gastrointestinaltraktes abspielt (29). Die häufigsten Allergieorte
befinden sich an der Haut, im Respirationstrakt und im Gastrointestinaltrakt
63
(19)(22)(26)(86). Der Gastrointestinaltrakt zeigt mit einer Oberfläche von 300-400m²
viel lymphatisches Gewebe mit einer eigenständigen IgE Produktion (70)(26)(45).
Bereits Gray und Selbeck sprachen vor ca. 65 Jahren von der Mediatorfreisetzung aus
humanen Biopsien (35)(92). 1942 erfolgte eine erste diagnostisch endoskopische
Austestung der Darmschleimhaut (59). Genau für die Patienten, die nur lokal am GIT
eine IgE Produktion aufweisen, erscheint die endoskopisch gesteuerte segmentale
Darmlavage als ein sehr nützliches Verfahren, um diese lokale IgE Produktion
nachzuweisen. Insgesamt haben sich bei dieser speziellen Patientengruppe Serum-
IgE, RAST- und Hauttests als nicht sehr zuverlässig erwiesen (13)(85)(9)(105)(3)(86).
Huggins beschreibt einen negativen Hauttest trotz lokaler IgE-Produktion (39).
Teitelbaum weist daraufhin, dass bei atopischer Dermatitis und Asthma
immunologische Faktoren am Magendarmtrakt nachweisbar sind (98). Es mussten
vor allen Dingen für Patienten mit lokaler IgE Produktion Tests entwickelt werden,
die innerhalb der Routinediagnostik einsetzbar und reproduzierbar sind und die
immunpathologische Störungen direkt am befallenen Organ nachweisen
(3)(4)(78)(92). Die endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage ist eines dieser
Testverfahren, mit dem lokale IgE Bildner herausgefiltert werden können. Es ist
jedoch daraufhinzuweisen, dass bei Diagnosestellung der Nahrungsmittelallergie
eine Biopsieentnahme erfolgen muss, um wichtige Differentialdiagnosen, die
Ursache für die gastrointestinalen Symptome sein können, aber auch mit einer
Nahrungsmittelallergie einhergehen können (105)(26) (50)(60), auszuschließen. Mit
dem Nachweis von totalem IgE am unteren Gastrointestinaltrakt war den Patienten
schon häufig allein dadurch geholfen, dass man nun mit einem messbaren Parameter
den Hinweis auf eine Nahrungsmittelallergie objektiviert hatte. Viele von diesen
Patienten waren zuvor als psychosomatisch erkrankte Patienten oder
Reizdarmsyndrom abgetan worden. Bei ca. 20% der Patienten mit GMA wurde lokal
IgE nachgewiesen. Diese GMA Patienten setzten sich aus Patienten mit Verdacht auf
eine Nahrungsmittelallergie, klinisch gesicherter Diagnose und dem Goldstandard
der doppeltblinden Placebo kontrollierten Provokation zusammen. Es lässt sich hier
zeigen, dass mit zunehmender Sicherung der Diagnose der Nahrungsmittelallergie
die Wahrscheinlichkeit des lokalen IgE Nachweises im Darm steigt. Bei zwei
64
Kontrollpatienten war IgE lokal im Darm messbar. Die Werte lagen jedoch nur
geringfügig oberhalb der Nachweisgrenze, während sich bei Patienten mit
Nahrungsmittelallergie deutlich erhöhte Werte zeigten. In früheren Untersuchungen
wurde betont, dass sich die höchste Ausbeute an totalem IgE im terminalen Ileum
und Coecum befinden würde, da sich hier konzentriert das meiste lymphatische
Gewebe in der Appendix und den Peyerschen Plaques finden würde (26)(7). In
dieser Studie zeigten sich am häufigsten am rektosigmoidalen Übergang erhöhte IgE
Spiegel (GMA klin. gesichert/db 19/45; 42%). Im so genannten Colap Test werden
Allergien lokal im Gastrointestinaltrakt vom Soforttyp aufgezeigt (17)(11)(18)(15).
Kochsalz wurde in diesem Test als Negativkontrolle, Histamin als Positivkontrolle
verwendet. Es konnten mit diesem Testverfahren maximal vier Allergene pro
Darmabschnitt getestet werden. Am häufigsten wurde der COLAP Test im Coecum
durchgeführt. Das Auftragen der Allergene wurde 20 min lang beobachtet. Der Test
galt als positiv, wenn z.B. eine deutliche Schwellung eintrat. Bei diesem Test muss
neben der geringen Allergenauswahl und nur dem Nachweis von Sofortreaktionen
darauf hingewiesen werden, dass dieses Verfahren zum Teil sehr belastend bis zum
allergischen Schock für den Patienten sein konnte; wenngleich nachweisbar war,
dass mit diesem Test allergische Reaktionen vom Soforttyp bei Patienten, die sonst
keine auffälligen Testergebnisse, sei es Serum-IgE, Rast- und Hauttest, hatten,
aufgedeckt werden konnten. In der Auswertung der endoskopisch gesteuerten
segmentalen Darmlavage zeigten sich mit dem Ausbreitungsgrad der Allergie
ansteigende IgE Konzentrationen.
4.2 TNF alpha am unteren Gastrointestinaltrakt
Erstmals wurden in der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage TNF
alpha Konzentrationen bestimmt. Es sollte ein Immunmediator gefunden werden,
der den Nachweis von nicht IgE mediierten Allergien liefert. Die Ergebnisse dieses
Testverfahrens sollten mittels eines kommerziellen Tests bestimmbar und
reproduzierbar sein. Hierfür wurde der Test der Firma Beckmann/Coulter
ausgewählt. In den Proben der Darmlavage konnten TNF alpha Konzentrationen
nachgewiesen werden. Die höchsten Konzentrationen wurden im terminalen Ileum
65
gefunden. Hier ist jedoch darauf hinzuweisen, dass es sich in diesem Darmabschnitt
um die höchste Streubreite handelt. In zahlreichen Studien wurde nachgewiesen,
dass TNF alpha die Darmpermeabilität erhöht (24)(36)(55)(11). Diese erhöhte
Darmpermeabilität könnte zu einer intestinalen Dysfunktion führen, d.h. dass
Allergene und Stoffe aufgenommen werden, die normalerweise nicht die
Darmschleimhaut passieren könnten. Der Körper muss sich somit mit diesen
Nahrungsmitteln auseinandersetzen, die in erhöhter Konzentration als Allergen
wirksam werden können und erst auf diese Weise zu allergischen Symptomen
führen können. Erhöhte TNF alpha Konzentrationen finden sich v.a. bei allergischen
Reaktionen vom Spättyp. Bei Majamaa wurde TNF alpha bei Kindern mit atopischer
Dermatitis in höheren Konzentrationen im Stuhl nachgewiesen als bei Gesunden. So
ist er der Meinung, dass sich bei Kindern mit atopischem Ekzem im Darm vermehrt
generelle immunologische Störfaktoren abspielen. Seiner Ansicht nach können durch
TNF alpha, ECP und alpha 1 anti Trypsin im Stuhl verschiedene Typen einer Allergie
aufgezeigt werden. Er betont, dass TNF alpha v.a. bei Spättypreaktionen erhöht
nachweisbar ist (50). Bei Ruben Dario Motrich wurde ebenfalls darauf hingewiesen,
dass TNF alpha v.a. bei Spätreaktionen der Allergie erhöht gefunden werden konnte
(55). Bei der intestinalen segmentalen Darmlavage gingen auch erhöhte TNF alpha
Konzentrationen mit sehr niedrigen IgE Konzentrationen einher. Dies ist ebenfalls
ein Indikator dafür, dass es sich bei sehr hohen TNF alpha Werten um Reaktionen
vom Spättyp handeln könnte. In diesem Artikel wird diskutiert, ob erhöhte TNF
alpha Spiegel v.a. mit gastrointestinalen Symptomen korreliert sind und somit evtl.
Symptome wie z.B. Bauchschmerzen und Durchfall vorhersagen können (55)(82). In
einer Arbeitsgruppe aus Frankreich wurde TNF alpha im Stuhl als Indikator für
verschiedene Reaktionstypen einer Nahrungsmittelallergie gesehen (42). In den
Proben der segmentalen intestinalen Darmlavage waren mit dem Ausbreitungsgrad
der Allergie ansteigende TNF alpha Konzentrationen nachweisbar.
Bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen waren deutlich
höhere Werte nachweisbar. Am höchsten waren die Konzentrationen von TNF alpha
im akuten Schub eines Morbus Crohn. Diese sehr hohen Konzentrationen im akuten
Schub eines Morbus Crohn könnten erklären, weshalb die Therapie mit Infliximab so
66
erfolgreich ist und hier ein sehr guter Behandlungsansatz liegt. Der bereits
bestehende Antikörper müsste noch weiter moduliert werden, um ein Medikament
mit weniger Nebenwirkungen zu erhalten (49)(77)(99)(91)(27)(25). In einer
belgischen Arbeitsgruppe wurde Infliximab als erstes Biologikum mit klinischen,
endoskopischen und histologischen Effekten bezeichnet. Es wurde jedoch auch hier
darauf hingewiesen, dass bessere Biologika mit weniger Nebenwirkungen noch
folgen müssten (5). 2004 wurde in Barcelona erarbeitet, dass Infliximab bei Morbus
Crohn sehr nützlich sei, nicht jedoch bei Colitis ulcerosa (23). Dies könnte die in
dieser Studie wesentlich höheren Werte bei einem akuten Schub eines Morbus Crohn
erklären, so dass bei dieser Erkrankung mit deutlich höherem Nachweis von TNF
alpha der Antikörper gegen TNF alpha wesentlich nützlicher ist. In einer anderen
Studie wurde ein unterschiedlicher Mechanismus bei Morbus Crohn und Colitis
ulcerosa diskutiert. Hier sollte ein Th 1 Muster mit erhöhter TNF alpha Produktion
für die Erkrankung des Morbus Crohn verantwortlich sein, während in dieser Studie
bei der Colitis ulcerosa vermehrt ein Th 2 Muster diskutiert wurde. Im Review von
Wilhelm SM von 2008 wurde der Einfluss von Infliximab in einer Patientengruppe
mit therapieresistenter Glucocorticoidtherapie untersucht. In dieser Studie wurde
Infliximab als alternative Therapieoption deklariert (106). Während bei M. Crohn
Patienten die Datenlage klar dafür spricht, dass die Therapie von Infliximab
erfolgreich in der Behandlung eingesetzt werden kann, wird in einer Studie darauf
hingewiesen, dass Infliximab bei Patienten mit Colitis ulcerosa, die therapierefraktär
auf Glucocorticoide und Immunsupressiva reagieren, eingesetzt werden kann. Der
Einsatz von Infliximab bei Patienten mit Colitis ulcerosa bedarf noch einer größeren
Studienlage (48). Die in der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage
gefundenen erhöhten Nachweiskonzentrationen von TNF alpha waren ein
interessanter Anlass, um in der nächsten Stufe der Diagnostik der
Nahrungsmittelallergie, der Mucosaoxygenation, eine vermehrte Produktion von
TNF alpha auf bestimmte Allergene bei Darmbiopsien auszutesten. Mit dem
Verfahren der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage war zwar ein
Verfahren für den Nachweis von TNF alpha gefunden. Für den Patienten von
entscheidender Bedeutung ist jedoch der direkte Nachweis eines Allergens, da erst
67
durch Allergenkarenz eine Nahrungsmittelallergie erfolgreich behandelt werden
kann. Da jedoch die endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage ein wesentlich
günstigeres Verfahren darstellt, ist sie sehr gut zum Herausfiltern von Patienten mit
einer Allergie vom Spättyp geeignet, deren Allergene im nächsten Schritt der
Diagnostik der Mucosaoxygenation herausgefunden werden können (66)(64)(73)(68).
4.3 Spezifisches IgE am unteren GIT
Am unteren Gastrointestinaltrakt konnte spezifisches IgE nachgewiesen werden. In
dieser Studie zeigte sich doch der Nachweis heterogen auf alle Patientengruppen
verteilt. Das heißt, dass nicht nur bei Patienten mit Nahrungsmittelallergie
spezifisches IgE nachweisbar war, sondern auch bei Patienten mit einer chronisch
entzündlichen Darmerkrankung oder Kollagencolitis. In der Kontrollgruppe war
niemals spezifisches IgE nachweisbar. Die Erkenntnis der heterogenen Verteilung
des spezifischen IgE auf diese unterschiedlichen Erkrankungsgruppen lässt die
Schlussfolgerung zu, dass auch vermehrt bei diesen Erkrankungsgruppen nach einer
allergischen Genese gesucht werden muss bzw. ob diese Erkrankung nicht durch
eine allergische Komponente getriggert wird. In der Literatur wurde von einem
Patienten mit Kollagencolitis berichtet, dessen Erkrankung durch eine
Nahrungsmittelallergie unterhalten wird (104). Es gibt auch Überlegungen, die auf
eine allergische Genese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen hinweisen
(40)(6)(111).
4.4 Unterschiede der Proteinmessmethode
Durch den Vergleich Trasylol mit Trasylol plus PMSF sollte untersucht werden, ob
der Nachweis von Antikörpern mit Hilfe von PMSF größer ist als mit Trasylol
alleine. Erste Hinweise für diese Untersuchungsmethode lieferte der Artikel von
Hohmann (38), in dem der Nachweis von Antikörpern mittels Bestimmung mit
PMSF deutlich höher war als mit dem üblichen Proteaseinhibitor Trasylol (87). Am
geringsten war in dieser Versuchsreihe der Effekt von PMSF auf IgM, da dieser
Antiköper auf den Zusatz von intestinaler Flüssigkeit resistent zu sein schien. Es gab
jedoch auch Versuche, in denen nur der Nachweis von spezifischen Antikörpern mit
68
Hilfe von PMSF möglich war (38). In dieser Auswertung war kein signifikanter
Unterschied in den Methoden der Proteinbestimmung erkennbar. Über
unspezifisches intestinales IgE lässt sich keine Aussage treffen, da es nur in 2/18
(Trasylol) bez. 3/18 (Trasylol plus PMSF) nachweisbar war. Spezifisches IgE ließ sich
mit keiner der beiden Methoden nachweisen. In der Bestimmung von TNF -alpha
war ein Unterschied erkennbar. Es lässt sich keine eindeutige Linie finden, mit
welcher Methode der Nachweis von TNF alpha öfter in einer höheren Konzentration
gelang. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei höherer Konzentration von Trasylol
plus PMSF die Konzentration deutlich höher war als nur mit Trasylol alleine. Bei der
Auswertung von ECP und Tryptase war kein Trend feststellbar. Da sich insgesamt
kein signifikanter Unterschied zeigte, wurde die Auswertung mit Hilfe von Trasylol
alleine als Proteaseinhibitor fortgeführt. Bei Ausdehnung der Versuchsreihe wäre
eventuell ein signifikanter Unterschied feststellbar gewesen. Desweiteren wäre es
interessant zu wissen gewesen, ob es von besonderer Bedeutlung ist, ob man die
erste oder zweite Probe am Spülort des Darmabschnittes weiterverarbeitet hat. Für
die Weiterverarbeitung dieser beiden Methoden war nicht immer eine Spülmenge
von 50ml ausreichend, so dass ein zweites Mal Spülflüssigkeit in den Absaugkanal
des Endoskops gegeben werden musste. Bei Fortführung der Versuchsreihe mit
Trasylol lässt sich eine bessere Vergleichbarkeit der Untersuchungsergebnisse als bei
Umstellung auf Trasylol plus PMSF erreichen. Die Versuchsreiche von Hohmann
(38) wurde mit anti IgM, IgA und IgG durchgeführt. Von Fahrney und Gold wurde
1963 PMSF als Proteaseinfhibitor von pankreatischem Trypsin und Chymotrypsin
deklariert (87). In dem Artikel von Hohmann wurde darauf hingewiesen, dass der
Effekt von PMSF auf bestimmte Antiköper nicht automatisch auf alle Antikörper, die
mit intestinaler Flüssigkeit in Kontakt kommen, ausgedehnt werden kann. Für
weitere Studien wäre der direkte Vergleich von Trasylol versus PMSF alleine
interessant, da sich bei einer derartigen Untersuchung evtl. ein signifikanter
Unterschied in der Ausbeute zeigen würde.
69
4.5 Korrelation zwischen totalem IgE und Serum-IgE
In dieser Studie bestand keine Korrelation zwischen Serum IgE und totalem IgE am
unteren Gastrointestinaltrakt in den drei untersuchten Patientengruppen Colitis
ulcerosa, Morbus Crohn und Gastrointestinal vermittelte Allergie. Es gibt jedoch
Untersuchungen, dass Serum IgE bei chronisch entzündlichen Darmerkankungen
deutlich höher ist als in gesunden Kontrollgruppen (95). In diesem Artikel werden
für den Morbus Crohn deutlich höhere Konzentrationen an Serum IgE als für
Patienten mit Colitis ulcerosa aufgezeigt. Bei Patienten mit einer gastrointestinal
vermittelten Allergie gehört die Bestimmung von Serum IgE zur Standarddiagnostik.
Kumar beschreibt erhöhte Serum IgE Konzentrationen bei Patienten mit Asthma mit
zusätzlicher Nahrungsmittelallergie (46). Auch für Patienten mit Kuhmilchallergie
finden sich erhöhte Serum IgE Spiegel (37). In der Dissertationsarbeit von Kurteva
Vesselina wurde im Speichel auf eine Korrelation von erhöhten IgE Konzentrationen
mit Serum IgE hingewiesen (47). Es zeigten sich in dieser Arbeit jedoch auch hohe
Speichelkonzentrationen mit niedrigem Serum IgE vergesellschaftet, so dass in dieser
Dissertationsarbeit eine lokale IgE Bildung in der Mundschleimhaut propagiert wird.
Somit bildet sich eine Parallele zu dieser Dissertationsarbeit, da auch hier lokale IgE
Bildung propagiert wird, die nicht notwendigerweise mit einer systemischen Serum
IgE Erhöhung einhergehen muss. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich in dieser
Studie um ein vorselektioniertes Patientengut handelt, bei dem IgE vermittelte
Nahrungsmittelallergien zuvor mit Hilfe von Hausärzten, HNO Ärzten,
Dermatologen, Allergologen usw. herausgefiltert wurden, da eine IgE Erhöhung im
Serum als erster Hinweis für eine Nahrungsmittelallergie aufgefallen war. Hieraus
lässt sich die Wichtigkeit der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage
ableiten, da Patienten mit ausschließlicher lokaler IgE Bildung bzw. Bildung weiterer
lokaler Immunmediatoren sonst nicht entdeckt werden würden.
4.6 Zusammenhang zwischen Histologie und Erkrankung sgruppe
Bei jedem Patienten dieser Studie wurde während der Koloskopie eine Stufenbiopsie
entnommen, um Differentialdiagnosen, die sich histologisch eindeutig abgrenzen
lassen, auszuschließen. Histologisch sehr gut zu sichernde Diagnosen sind die
70
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Kollagenkolitis. Im akuten Schub
zeigen Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen spezifische
Verteilungsmuster der Entzündung mit spezifischen Kennzeichen. Mit dem Grad der
Entzündung steigt auch der in der Histologie bestimmte Entzündungsgrad, was
auch in dieser Studie gut zu erkennen war. Es gibt eine Arbeit von Sandborn (94), die
den direkten Zusammenhang zwischen CRP, klinischer, endoskopischer und
histologischer Aktivität erklärt. In dieser Arbeit wird darauf hingewiesen, dass diese
Parameter nicht mit den radiographischen Aktivitäten korrelieren. In einem Artikel
von Geboes K (31) wird die unterschiedliche Histologie der oben aufgeführten
Erkrankungen beschrieben. In seltenen Fällen wurde eine Doppeldiagnose gestellt.
Meist handelte es sich erst um eine mikroskopische, gewöhnlich kollagene Colitis,
die sich in eine Colitis ulcerosa umwandelte. Von M. Weidenhiller ist erwähnt, dass
es Patienten mit mikroskopischer Colitis gibt, deren Erkrankung durch eine
Nahrungsmittelallergie getriggert ist (104). In der Endoskopie zeigte sich bei den
Patienten mit Nahrungsmittelallergie in 17 von 19 fällen eine H0 Probe. Nur bei zwei
Patienten mit positivem IgE Nachweis war eine H1 Probe nachweisbar. Somit wird
deutlich, dass die Histologie keine Entscheidungshilfe in der Erkennung einer
Nahrungsmittelallergie im Gegensatz zu chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen und mikroskopischer Colitis darstellt. Um so wichtiger erscheint
im Umkehrschluss das Verfahren der endoskopisch gesteuerten segmentalen
Darmlavage.
4.6.1 Orale Lavage zum Messen wichtiger Immunmediat oren und IgE
Mit der oralen Lavage sollte ein von der Endoskopie unabhängiges Verfahren zur
Bestimmung von Immunmediatoren und Immunglobulin E bei Patienten mit
Nahrungsmittelallergie entwickelt werden. Die Koloskopie ist ein für den Patienten
oft unangenehmes und invasives Verfahren, das Personal bindet und je nach
Untersucher und notwendiger Interventionen während der Spiegelung (z.B.
Polypenabtragung) mind. 20 min jedoch auch deutlich länger Zeit in Anspruch
nehmen kann. Im Gegensatz zur Endoskopie benötigt die orale Lavage zum
Sammeln der Probe ca. 5 min und ist unabhängig von anderen Berufsgruppen, was
71
die Durchführung wesentlich erleichtert. In der gesunden Kontrollgruppe wurde bei
keiner Person totales oder spezifisches IgE gefunden, während der Nachweis von
totalem IgE bei drei Patienten mit gastrointestinal vermittelter Allergie in
Verbindung mit einem oralen Allergiesyndrom gelang. Es ist darauf hinzuweisen,
dass eine gastrointestinal vermittelte Allergie alleine nicht zum Nachweis von
totalem IgE führte. In der Arbeit von Vernejouy war IgE bei Patienten mit Allergie
öfter im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe, jedoch nicht mit signifikant
höheren IgE Konzentrationen nachweisbar (102). Eine Korrelation zum Serum IgE
ergab sich nicht. 1990 wurde von Negretti F und Casetta P vorgeschlagen, den
Nachweis von IgE im Speichel bei Patienten mit Kontaktdermatitis und allergischem
Asthma oder allergischer Rhinitis zur Diagnostik zu benützen (56). Auch der
Arbeitsgruppe von Sanchis gelang der Nachweis von totalem IgE im Sputum
(56)(51). Es wurde sogar in dieser Arbeit ein Zusammenhang zur Serum IgE
Konzentration festgestellt. Da keine Korrelation zwischem totalem IgE und Albumin
im Sputum bestand, wurde über eine lokale Produktion von IgE im Sputum
nachgedacht. Auch in der Mundhöhle war der Nachweis lokaler IgE Bildung
möglich. Spezifisches IgE konnte jedoch mit der im Material und Methoden Kapitel
beschriebenen Methode nicht gefunden werden. In der Dissertationsarbeit von
Kurteva Vasselina war einmal der Nachweis von spezifischem IgE gegen
Erdnussallergen möglich (47). Diese Arbeitsgruppe fordert für die Bestimmung von
spezifischem IgE eine zusätzliche Stimulation. Da nur bei Patienten mit oralem
Allergiesyndrom der Nachweis von totalem IgE gelang, sollte oben aufgeführte
Methode nur bei Patienten mit oralem Allergiesyndrom eingesetzt werden. Da
Patienten mit oralem Allergiesyndrom meist wissen, auf was sie allergisch reagieren,
ist diese Nachweismethode oraler IgE Bildung in der Mundhöhle zwar interessant.
Die Methode bringt jedoch dem Patienten keinen weiteren Vorteil, da in der
Behandlung einer Nahrungsmittelallergie an erster Stelle stets eine Allergenkarenz
steht. Bezüglich ECP und TNF alpha gab es zwei Patienten, die Werte oberhalb der
zweifachen Standardabweichung hatten. Hier sollte es zu einer Fortsetzung der
Untersuchung kommen, um eine genauere Aussage treffen zu können. Ziel dieser
Untersuchung war bezüglich ECP, Tryptase und TNF alpha die Ermittlung von
72
Normalwerten. Bei der Bestimmung von Tryptase war kein Patient über der
zweifachen Standardabweichung. Weitere Untersuchungen werden zeigen, ob die
Ermittlung dieser Immunmediatoren im Vergleich zu den Normwerten der
Kontrollgruppe, nicht IgE vermittelte Alllergien detektieren kann. Die Auswertung
der Immunmediatoren und IgE Werte der oralen Lavage zeigte, dass die
endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage ein unverzichtbares Verfahren in
der Ermittlung einer Nahrungsmittelallergie ist, da diese Methode Allergien direkt
am betroffenen Organ, der Darmschleimhaut, erfassen kann.
5 Zusammenfassung:
5.1 Hintergrund und Ziele
Bei Nahrungsmittelallergien müssen zum einen die Typ I Allergie, die IgE vermittelt
ist, von der nicht IgE mediierten Allergie unterschieden werden. Während für IgE
vermittelte Allergien zahlreiche Diagnostikmöglichkeiten zur Verfügung stehen, die
auch in der Arztpraxis durchgeführt werden können, wie z.B. Prick/Epikutantest
sowie Serum-IgE, sind nicht IgE vermittelte Allergien sehr schwer aufzudecken. Das
bei der endoskopisch gesteuerten segmentalen Darmlavage gemessene IgE und TNF
alpha sollte bei der Ermittlung von IgE und nicht IgE mediierten Allergien helfen.
Mit der oralen Lavage sollte ein von der Endoskopie unabhängiges Verfahren zum
Aufdecken von Nahrungsmitteln gefunden werden.
5.2 Methoden
Die Patientenpopulation der endoskopisch durchgeführten segmentalen Darmlavage
bestand aus Patienten mit GMA I-IV° (GMA db 4 Pat./12 Lavagen, 1m/3w,
Altersverteilung 41-63 Jahre; GMA klin. gesichert 45 Pat./134 Lavagen, 17m/28w,
23-73 Jahre; V.a. GMA 34 Pat./100 Lavagen, 18m/16w, 23-72 Jahre), aus Patienten
mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (8 M. Crohn, 22 Lavagen, 3m/5w,
32-52 Jahre; 7 Colitis ulcerosa, 19 Lavagen, 2m/5w, 32-52 Jahre; 9 kollagene und
mikroskopische Colitis, 27 Lavagen, 5m/4w, 44-74 Jahre) und der Kontrollgruppe (12
Personen, 10m/2w, 38-71 Jahre). Die Orale lavage wurde bei 12 Kontrollpersonen
und 11 Patienten mit oralem Allergiesyndrom durchgeführt. Während der
73
Koloskopie wurde jeweils eine endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage im
terminalen Ileum, Coecum und am rektosigmoidalen Übergang mit 50ml NaCl 0,9%
durchgeführt. Die nach einer Minute Einwirkzeit abgesaugte Flüssigkeit wurde
sofort mit Proteaseinhibitoren (Trasylol, EDTA) versetzt und gekühlt. TNF alpha
(pg/mg Protein, Mittelwert +/- SD) wurde mittels Elisa (Beckmann/Coulter)
gemessen, während die intestinale IgE Bestimmung (U/mg Protein, Mittelwert +/-
SD) (Unicap-System, Pharmacia) erst nach Dialyse und 10 fach Konzentrierung der
Flüssigkeit erfolgte. Bei der oralen Lavage wurde die Mundhöhle gespült.
5.3 Ergebnisse
Bei Personen mit gesicherter GMA und bei CED fanden sich häufiger intestinale IgE
Antikörper und höhere TNF Konzentrationen als bei der Kontrollgruppe. Die
quantitativen IgE Spiegel betrugen bei Personen mit gesicherter GMA I° am unteren
GIT n=10 0,5+/-0.3 U/mg, für die GMA II° n=18 2,9+/1.1 U/mg und für Personen
mit GMA III° n=11 2,5+/-1.8 U/mg. Bei Patienten mit GMA I° konnte ein TNF alpha
Gehalt von 5,2+/-4,3 pg/mg nachgewiesen werden, bei Personen mit GMA II°
12,7+/- 12.9 pg/mg und mit GMA III° von 19.4+/-12.9 pg/mg, während die
Personen in der Kontrollgruppe mit Werten von 7,8+/-9,3 pg/mg einhergingen.
Personen mit nicht aktiver Colitis ulcerosa bzw. nicht aktivem M. Crohn zeigten
deutlich höhere TNF alpha Werte (14.0+/- 7,8 pg/mg und 30,0+/-31.9 pg/mg).
Signifikant höhere Werte fanden sich im aktivem Schub von M. Crohn 125,5+/- 173,3
pg/mg und der Colitis ulcerosa 55,7+/-13,8 pg/mg. Während bei Kontrollpersonen
in 6% der Fälle IgE lokal am unteren GIT nachweisbar war, konnte bei
inaktivem/aktivem M. Crohn in 25% bzw. 43%, bei inaktiver/aktiver Colitis ulcerosa
in 20% und 25% IgE gefunden werden. Bei der oralen Lavage waren bei der
gesunden Kontrollgruppe niemals totales oder spezifisches IgE nachweisbar,
während bei Patienten mit einer gastrointestinal vermittelten Allergie in
Kombination mit einem oralen Allergiesyndrom bei drei Patienten totales IgE
nachweisbar war. Die Unterschiede bezüglich ECP, Tryptase und TNF alpha waren
nicht signifikant. Es wurde jedoch jeweils ein Patient mit einer über der zweifachen
Standardabweichung liegenden ECP und TNF alpha Konzentration gefunden.
74
6 Praktische Schlussfolgerungen
Die endoskopisch gesteuerte segmentale Darmlavage ist ein als ein direkt am
betroffenen Organ ansetzendes Verfahren sowohl zum Nachweis von IgE als auch
nicht IgE mediierten Allergien geeignet. Mit diesem Verfahren können trotz
fehlender kutaner und serologischer Sensibilisierungen signifikante intestinale
Immunphänomene nachgewiesen werden. Die deutlich erhöhten TNF alpha
Konzentrationen bei M. Crohn könnten ein Hinweis sein, weshalb anti-TNF alpha
Pharmazeutika so erfolgreich in der Therapie des M. Crohn eingesetzt werden
können. Mit dem Ausbreitungsgrad der Nahrungsmittelallergie konnten auch
ansteigende TNF Konzentrationen gefunden werden. Es stellt sich die Frage,
inwieweit bei Personen mit nicht aktiver CED auch allergische Mechanismen zur
persistierenden TNF Produktion beitragen können. Aufgrund dieses
Untersuchungsergebnisses sollte bei CED verstärkt nach Nahrungsmittelallergien
gesucht werden. Die physiologischerweise in der Mundhöhle vorhandenen Allergie-
und Immunmediatoren können quantitativ mittels der oralen Lavage nachgewiesen
werden. Bei Gesunden können Normwerte mit relativ engem Schwankungsbereich
angegeben werden. Bezüglich ECP, TNF alpha und totalem IgE können bei Personen
mit oralem Allergiesyndrom erste pathologische Befunde erhalten werden.
75
7 Literaturverzeichnis
(1) Allergic Diseases Resource Centre: IgE in Clinical Allergy and Allergy
Diagnosis
(2) Andre F., Andre C., Colin L., Cavagna S.: IgE in stools as a indicator of food
sensitization. Allergy 1995;50:328-333.
(3) Baenkler HW., Jorde W., Hörauf A, Raithel M., Schata W.: Antigeninduzierte
Histaminfreisetzung aus Kolonbiopsie-Partikeln bei darmmanifester Allergie
(Abstract). Allergologie 78, 2/12 (1989)
(4) Baenkler HW., Lux G.: Antigen-induced histamine-release from duodenal
biopsy in gastrointestinal food allergy. Ann of Allergy 62, 449-452 (1989)
(5) Baert F., Vermeire S., Noman M., Van Assche G., D´Haens G., Rutgeerts P.:
Management of ulcerative colitis and Crohn´s disease. Acta Clin Belg. 2004
Sept-Oct;59(5): 304-14
(6) Ballegaard M., Bjergstrom A., Bronndum S., Hylander E., Jensen L.: Self
reported food intolerance in chronic inflammatory bowel disease. Scand J
Gastroenterol 1997;32: 569-571.
(7) Bellanti JA.: Prevention of food allergies. Ann Allergy 53 (1984) 683-688
(8) Belut D., Moneret-Vautrin DA., Nicolas JP., Grilliat JP.: IgE levels in intestinal
juice. Dig Dis Sci 1980;25: 323-332
(9) Bengtsson U., Nilsson-Balknäs U., Hanson LA., Ahlstedt S.: Double blind,
placebo controlled food reactions do not correlate to IgE allergy in the
diagnosis of staple food related gastrointestinal symptoms. Gut 1996;39: 130-
135.
(10) Bengtsson U., Rognum T.P., Brantzaeg P. et al.: IgE-positive duodenal mast
cells in patients with food-related diarrhea. Int Arch Allergy Appl Immunol
1991; 95: 86-91
76
(11) Bischoff S.C., Manns M.P.: Wissenschaftliche Basis der
Nahrungsmittelallergie. Med Kin 1996, 91: 389-395
(12) Bischoff S.C.: Mucosal Allergy: role of mast cells and eosinophil granulocytes
in the gut. In: Bailliere’s Clin Gastroenterol 1996, 10: 443-459
(13) Bischoff SC., Grabowsky J., Manns MP.: Quantification of inflammatory
mediators in stool samples of patients with inflammatory bowel disorders and
controls. Dig Dis Sci 1997;42: 394-403.
(14) Bischoff SC., Herrmann A., Manns MP.: Prevalence of adverse reactions to
food in patients with gastrointestinal disease. Allergy 1996;51: 811-818
(15) Bischoff SC., Mayer J., Meier PN., Zeck-Kapp G., Manns MP.: Clinical
significance of the colonoscopic allergen provocation test. Int Arch Allergy
Immunol 113, 348-351 (1997)
(16) Bischoff SC., Mayer J., Wedemeyer J., Meier PN., Zeck-Kapp G., Wedi B.,
Kapp A., Cetin Y., Gebel M., Manns MP.:Colonoscopic allergen provocation
(COLAP): A new diagnostic approach for gastrointestinal food allergy. Gut
40, 745-753 (1997)
(17) Bischoff SC., Mayer JH., Manns MP.: Allergy and the Gut. Int Arch Immunol
2000;121: 270-283
(18) Bischoff SC.: Colonoscopic allergen provocation (COLAP) – technique and
results. Allergy Clinical Immunol 9, 101-109 (1997).
(19) Bock SA., Sampson HA., Atkins FM., Zeiger RS., Lehrer S., Sachs M., Bush
RK., Metcalfe DD.: Double-blind, placebo-controlled food challenge
(DBPCFC) as an office procedure: A manual. J Allergy Clin. Immunol. 82, 986-
997 (1988)
(20) Brown W.R., Borthistle B.K., Chen ST.: Immunglobulin E (IgE) and IgE-
containing cells in human gastrointestinal fluids and tissues. Clin exp.
Immunol 20 (1975) 227-237
77
(21) Brown W.R., Lee E.H.: Studies on IgE in human intestinal fluids. Int Archs
Allergy Appl Immunol 50 (1976) 87-94
(22) Bruijnzeel-Kommen C., Ortolani C., Aas K., Bindslev-Jensen C., Bjorksten B.,
Moneret-Vautrin D.: Adverse reactions to food. Allergy 50, 623-635 (1995)
(23) Casellas i Jorda F.: TNF-alpha inhibitors in inflammatory bowel disease. Med
Clin (Barc). 2004 Nov 6;123(16): 627-34
(24) Chung HL., Hwang JB., Park JJ., Kim SG.: Expression of transforming growth
factor beta1, transforming growth factor type I and II receptors, and TNF-
alpha in the mucosa of the small intestine in infants with food protein-
induced enterocolitis syndrome. J Allergy Clin Immunol. 2002 Jan; 109(1): 150-
4
(25) Christ A.D. et. al. Immunologische Grundlagen der Entzündungsreaktion im
Darm am Beispiel der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen,
Allergologie Jahrgang 24, 111/2001, S.515-524
(26) Crowe SE., Perdue MH.: Gastrointestinal food hypersensitivity: Basic
mechanisms of pathophysiology. Gastroenterology 103, 1075-1095 (1992)
(27) Daniel H. Present, M.D., Paul Rutgeerts, M.D.et al.Infliximab for the treatment
of fistulas in patients with crohn´s disease, N England J Med 1999; 340:1398-
405
(28) Donhauser N., Weidenhiller M., Nabe A., Kressel J., Maiss J. Mühldorfer St.,
Hahn E.G., Raithel M., Praktische Durchführung der endoskopisch
gesteuerten segmentalen Darmlavage am Gastrointestinaltrakt, Endopraxis 3,
August 2003, 19.Ausgabe
(29) Finn R., H. Newman Cohen:“Food Allergy: Fact or Fiction?” The Lancet 25,
426-429 (1978)
(30) Ganten D., Ruckpaul K: Immunsystem und Infektiologie, Springer Verlag,
1.Auflage 1999
78
(31) Geboes K: Lymphocytic, collagenous and other microscopic colitides:
Pathology and the relationship with idiopathic inflammatory bowel diseases,
Gastroenterol ClinBiol. 2008 Jun 5. (Epub ahead of print)
(32) Gemsa D., Kalden J.R., Resch K: Immunologie, Georg Thieme Verlag,
4.Auflage 1997
(33) Grabbe J., Haas N., Czarnetzki B.M. (1994a) Die Mastzelle.Hautarzt 45:55-64
(34) Grabbe J., Hamann K., Kolde G., Hakimi J., Czarnetzki B.M. (1993)
Demonstration of the high affinity IgE receptor on human Langerhans cells in
normal and diseased skin. Br J Dermatol 129:120-123
(35) Gray I., Harten M., Walzer M.: Studies in mucous membrane
hypersensitivness; allergic reactions in passively sensitized mucous
membranes of ileum and colon in humans. Ann Int Med 13, 2050 (1940)
(36) Heyman M., Desjeux JF.: Cytokine-induced alteration of the epithelial barrier
to food antigens in disease. Ann N Y Acad Sci. 2000;915: 304-11
(37) Hidvegi E, Cserhati E, Kereki E, Savilahti E, Arato A. : Serum immunglobulin
E, IgA and IgG antibodies to different cow´milk prtoteins in children with
cow´s milk allergy: association with prognosis and clinical manifestation,
Pediatr Allergy Immunol., 2002 Augus;13(4):255-61.
(38) Hohmann A., J.La Brooy, G.P.Davidson and D.J.C. Shearman Measurement of
Specific Antibodies in Human Intestinal Aspirate: Effect of the Protease
Inhibitor Phenylmethylsulphonyl Fluoride. Journal of Immunological
Methods, 64 (1983) 199-204
(39) Huggins KG., Brostoff J.: Local production of specific IgE antibodies in
allergic-rhinitis patients with negative skin tests. Lancet 1975;ii: 148-150
(40) Jones VA., Dickinson RJ., Workman E., Wilson AJ., Freeman AH., Hunter JO.:
Crohn´s disease: Maintenance of remission by diet. Lancet 1985;ii: 177-180
(41) Jyonouchi H., Geng L., Ruby A., Zimmerman-Bier B.: Dysregulated innate
immune responses in young children with autism spectrum disorders: their
79
relationship to gastrointestinal symptoms and dietary intervention.
Neuropsychobiology.2005;51(2): 77-85
(42) Kapel N., Matarazzo P., Haouchine D., Abiola N., Guerin S., Magne D., Gobert
JG., Dupont C.: Faecal tumor necrosis factor alpha, eosinophil cationic protein
andIgE levels in infants with cow´s milk allergy and gastrointestinal
manifestations. Clin Chem Lab Med. 1999 Jan;37(1): 29-32
(43) Klein P.: Diagnostik der gastrointestinal vermittelten Allergie mittels
endoskopischer Lavage. Inaugural-Dissertation, Universität Erlangen-
Nürnberg (2000) 1-120
(44) Kolmannskog S., Haneberg B., Marhaug G., Bolle R.: Immunglobulin E in
extracts of faeces from children. Int Arch Allergy Appl Immunol 74 (1984)50-
54
(45) Kolmannskog S., Haneberg B.: Immunglobulin E in faeces from children with
allergy. Evidence of local production of IgE in the gut. Int Arch Allergy
Immunology 76, 133-137 (1985)
(46) Kumar R, Singh BP, Sridhara S. Arora N.. Gaur SN :Relevance of serum IgE
estimation in allergic bronchial asthma with spezial reference to food allergy,,
Asian Pac J Allergy Immunol. 2006 Dec, 2,4(4):191-9.
(47) Kurteva, Vesselina :Detection of IgE antibodies in saliva as evidence of a local
mucosal immune response, österreichische Dissertationsdatenbank
(48) Lawson MM, Thomas AG, Akobeng AK, Tumor necrosis factor alpha
blocking agents for induction of remission in ulcerative colitis, Cochrane
Database Syst Rev. 2006 Jul 19;3:CD005112.
(49) Ljung T., Karlen P., Schmidt D., Hellström P.M., Lapidus A., Janczewska I.,
Sjöqvist U. and Löfberg R.: Infliximab in inflammatory bowel disease: clinical
outcome in a population based cohort from Stockholm County. Gut
2004;53:849-853
(50) Majamaa H. Miettinen A., Laine S., Isolauri E.: Intestinal inflammation in
children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumour
80
necrosis factor-alpha as non invasive indicators of foof allergy. Clilical
Experimental All 26, 181-187 (1996)
(51) Margarit F, Belda J, Juarez C, Martinez C, Ramos A, Torrejon M, Granel C,
Casan P, Sanchis J : Total IgE in the sputum and serum of patients with
asthma Allergol Immunopathol (Madf) 2005 Jan-Febr.;33(1):48-53
(52) Marsh D.G., Bias W.B., Ishizaka K. (1974) Genetic control of basal serum
immunoglobulin E level and its effect on specific reaginic sensitivity. Proc
Natl Acad Sci USA71: 3588-3592
(53) Maurer D., Fiebiger E, Reiniger B., Wolff-Winiski B., Jouvin M.H., Kilgus O.,
Kinet J.P., Stingl G. (1994) Expression of functional high affinity IgE receptor
(Fcε-RI) on monocytes of atopic individuals. J Exp Med 179:745-750
(54) Maurer D., Stingl G. (1995) Immunglobulin E-binding structures on antigen-
presenting cells in skin and blood. J Invest Dermatol 104:707-710
(55) Motrich RD., Gottero C., Rezzonico C., Riera CM., Rivero V.: Cow´s milk
stimulated lymphocyte proliferation and TNFalpha secretion in
hypersensitivity to cow´s milk protein. Clin Immunol. 2003 Nov; 109(2):203-11
(56) Negretti F und Casetta P: Remarcable increases of salivary IgE levels in
allergic syndromes, Allergy Appl. Immunol. 1990;92(1):101-3
(57) Paganelli R., Sgambato F., Carbonari M., Buono G., Bonomo R., Pontesilli O.:
Cow´s milk hypersensitivity in an elderly woman: Clinical and
immunological findings. Ann Allergy 56 (1986) 480-483
(58) Pena AS., Crusius JB.: Food allergy, celiac disease and chronic inflammatory
bowel disease in man. Vet Q. 1998; 20 Suppl 3: S49-52
(59) Pollard HM., Stuart GJ.: Experimentally reproduction of gastric allergy in
humans beings with controlled observations on the mucosa. J Allergy 13, 467-
473 (1990)
81
(60) Raithel M. Allergische Enteropathie. In Hahn EG, Riemann JF (eds): Klinische
Gastroenterologie. Stuttgart, New York, Georg Thieme Verlag, 1996, 3.
Auflage 960-965
(61) Raithel M. Weidenhiller M., Abel R., Nabe A., Hahn E.G. Schlecht vertragen
oder doch allergisch. MMW-Fortschr. Med. 144(20002), 30-33
(62) Raithel M., Hochberger J., Schneider H.Th., Hahn E.G.: Neue diagnostische
und bioptische Verfahren bei der Endoskopie des unteren
Gastrointestinaltraktes. EndoPraxis 2000/4; 16:6-14
(63) Raithel M., Ell C.: Diagnostik chronisch entzündlicher Darmerkrankungen:
Was ist sinnvoll? Überblick und Empfehlung zur rationellen Diagnostik.
Coloproctology 1996
(64) Raithel M., Hahn E.G., Baenkler H.W.: Klinik und Diagnostik von
Nahrungsmittelallergien (Gastrointestinal vermittelte Allergien Grad I-IV).
Englisch: Gastrointestinal allergies. Dtsch Ärzteblatt 2002; 99: A 780-786 [Heft
12]
(65) Raithel M., Hahn E.G., Baenkler H.W.: Klinik und Diagnostik von
Nahrungsmittelallergien, gastrointestinal vermittelte Allergie Grad I bis IV.
Deutsches Ärzteblatt/Jg.99/Heft 12/22.März 2002
(66) Raithel M., Hahn E.G.: Funktionsdiagnostiche Tests zur Objektivierung von
Gastrointestinal vermittelten Allergieformen. Allergologie 1998; 21/2: 51-64
(67) Raithel M., Hahn E.G.: Funktionsdiagnostische Tests zur Objektivierung von
gastrointestinal vermittelten Allergieformen. Allergologie 21/2 (1998) 51-64
(68) Raithel M., Matek M., Baenkler H.W., Jorde W., Hahn E.G.: Mucosal histamine
content and histamine secretion in Crohn`s disease, ulcerative colitis and
allergic eneropahty. Int Arch Allergy Immunol 1995; 108: 127-133
(69) Raithel M., Matek M., Baenkler HW., Jorde W., Hahn E.G.: Mucosal histamine
content and histamine secretion in Crohn´s disease, ulcerative colitis and
allergic enteropathy. Int Arch Allergy Immunol 1995;108: 127-133.(allergie bei
CED?)
82
(70) Raithel M., Pacurar A., Winterkamp S., Dalbay S., Ell C., Hahn E.G.: Analysis
and Characteristics of Mast Cell Tryptase and Eosinophilic Cationic Protein
from Human Gut Mucosa in Gastrointestinal Allergy. Basel, Karger, 1996; 32:
143-156
(71) Raithel M., Schwab D., Ell C., Hahn E.G.: Identification of Food Specific IgE-
Antibodies in Patients with Chronic Diarrhea by Intestinal Lavage.
Gastroenterology 108/4, A315 (1995).
(72) Raithel M., Schwab D., Winterkamp S., Weidenhiller M., Nabe A., Donhauser
N., Mühldorfer S., Hahn E.G.: Endoscopically guided segmental gut lavage: A
new practical method for allergy, inflammation and immune diagnostics of
the gastrointestinal tract. Gut 2002;51(Suppl III): A 237
(73) Raithel M., Weidenhiller M., Abel R., Tuchbreiter H., Backhaus B., Donhauser
N., Baenkler H.W., Hahn E.G.: Diagnostic use of mucosa oxygenation and
histamine release experiments in patients with gastrointestinally mediated
allergy (GMA). Infl Res 2002 (submitted)
(74) Raithel M., Weidenhiller M., Schwab D., Hahn E.G.: Allergische Magen-Darm-
Erkrankungen (Gastrointestinal vermittelte Allergie I-IV°): vom Konzept zur
Realität. Zeitschrift für Umweltmedizin; 8. Jg. Heft 6/2000
(75) Raithel M., Weidenhiller M., Winterkamp S., Schwab D., Donhauser N., Nabe
A., Mühldorfer S., Hahn E.G.: Die endoskopisch gesteuerte segmentale
Lavage am Gastrointestinaltrakt: Ein neues praktikables Verfahren für die
Allergie-, Immun- und Entzündungsdiagnostik am Magen-Darmtrakt. Z
Gastroenterol 2002; 40:755
(76) Rancé F., Juchet A., Brémont F., Duteau G.: Correlations between skin prick
tests using commercial extracts and fresh foods, specific IgE and food
challenges. Allergy 1997, 52: 1031-1035
(77) Regueiro M., Valentine J., Plevy S., Fleisher M.R., Lichtenstein G.R.: Infliximab
for treatment of pyoderma gangrenosum associated with inflammatory bowel
disease. Am J Gastroenterol 2003 Aug;98(8): 1821-6
83
(78) Reimann HJ., Lewin J.: Gastric mucosal reactions in patients with food allergy.
Am J Gastroenterol 11, 1212-1219 (1988).
(79) Reimann HJ., Ring J., Ultsch B.: Intragastral provocation under endoscopic
control (IPEC) in food allergy: Mast cell and histamine changes in gastric
mucosa. Clin Allergy 15, 195 (1985)
(80) Roitt I., Brostoff J., Male D: Immunology, Mosby 2001
(81) Ruben Dario Motrich, Caudio Gottero, Carlos Rezzonico Jr., Carlos Rezzonico,
Clelia Maria Riera and Virginia Rivero: Cow´s milk stimulated lymphocyte
proliferation and TNF alpha secretion in hypersensitivity to cow´s milk
protein. Clin Immunol 2003 Nov;109(2): 203-211
(82) Sampson H.A., Ho DG: Clinical Aspects of allergic disease. Relationship
between food specific IgE concentrations and the risk of positive food
challenges in children and adolescents. Allergy Clin Immun 1997, 100: 444-451
(83) Sampson H.A.: Food allergy. J Am Med Ass 1997, 218: 1888-1893
(84) Sampson HA.: Food allergy. Part 1: Immunopathogenesis and clinical
disorders. J Allergy Clin Immunol 1999; 103: 717-728
(85) Sampson HA.: Food allergy. Part 2; Diagnosis and management. J Allergy
Clin Immunol 1999;103: 981-989
(86) Sampson HA.: Immunologically mediated food allergy: the importance of
food challenge procedures. Annals of Allergy 60, 262-269 (1988)
(87) Samson, R.R., D.B.L.McClelland and D.J.C.Shearman, 1973, Gut 14,
(88) Schwab D., Raithel M., Klein P., Winterkamp S., Weidenhiller M., Radespiel-
Troeger M., Hochberger J., Hahn E.G.: Immunglobulin E and
eosinophiliccationic protein in segmental lavage fluid of the small and large
bowel identifies patients with food allergy. AM J Gastroenterol 2001; 96: 508-
514
(89) Schwab D., Raithel M., Klein P., Winterkamp S., Weidenhiller M., Radespiel-
Troeger M., Hochberger J., Hahn E.G.: Immunglobulin E and eosinophilic
84
cationic protein in segmental lavage fluid of the small and large bowel
identifies patients with food allergy. Am J Gastroenterol 2001; 96: 508-514
(90) Schwab D., Raithel M., Weidenhiller M., Winterkamp S., Hochberger J., Hahn
E.G.: Identification of food allergens in gastrointestinal allergy (GA): Accuracy
of serum-Rast and endoscopic-guided lavage. Gastroenterology 114 (1998)
A415
(91) Seiderer J., Goke B., Ochsenkuhn T.: Safety aspects of infliximab in
inflammatory bowel disease patients. A retrospective cohort study in 100
patients of a German University Hospital. Digestion 2004;70(1): 3-9.Epub 2004
Aug 3.
(92) Selbekk BH., Aas K., Myren J.: in vitro sensitization and mast cell
degranulation in human jejunal mucosa. Scand J Gastroenterol 13, 87 (1978).
(93) Shearman DJC., Parkin DM., McClelland DBL.: The demonstration and
function of antibodies in the gastrointestinal tract. Gut 13, 483-499 (1972)
(94) Solem CA, Loftus EV Jr, Tremaine WJ, Harmsen WS, Zinsmeister AR,
Sandborn WJ : Correlation of C-reactive protein with clinical, endoscopic,
histologic and radiographic activity in inflammatory bowel disease, Inflamm.
Bowel Dis. 2005 Aug;11(8):107-12), die den direkten Zusammenhang zwischen
CRP
(95) Song CH, Vadheim CM, Snape WJ, Heiner DC: Antibodies in patients with
inflammatory bowel disease and the apparent influence of medications, Clin
lab Immunol. 1995; 46(4): 143-54
(96) Stadler B.M.: Allergie. In Gemsa D., Kalden R.K., Resch K.(eds): Immunologie,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1997, 4. Auflage: 235-250
(97) TNF Elisa Firma Beckmann coulter
(98) Teitelbaum JE., Furuta GT.: Immune mechanisms of food allergy. Curr Opin
Gastroenterol 14 (1998) 498-503
85
(99) Travassos W.J., Cheifetz A.S.: Infliximab: Use in Inflammatory Bowel
Disease.Curr Treat Options Gastroenterol 2005 Jun,8(3): 187-196
(100) Unicup Gebrauchsanweisung für Bestimmung von totalem und spezifischem
IgE
(101) Vatn M.H., Grimstad I.A., Thorsen L. et al.: Adverse reaction to food:
Assessment by double-blind placebo-controlled food challenge and clinical,
psychosomatic and immunologic analysis. Digastion 1995; 56: 421-428
(102) Vernejouy JM, Tunon der Lara JM, Kanueva P, Vuillemin L, Taytard A, Int,
Arch, Allergy Immunl. 1994 May; 104 (1):101-3
(103) Weidenhiller M., Konturek P., Nabe A., Wilken V., Hahn E.G., Raithel M.:
Sinnvolle Diagnostik bei Nahrungsmittelallergikern. Internist Prax 2004;44:17-
30
(104) Weidenhiller M., Müller S., Schwab D., Hahn E.G., Raithel M., Winterkamp S.:
Microscopic (collagenous and lymphocytic) colitis triggered by food allergy.
Gut 2005;54: 312-313 (siehe 141)
(105) Wershil BK:, Walker WA.: The mucosal barrier, IgE-mediated gastrointestinal
events, and eosinophilic gastroenteritis. Gastroenterol Clin North Am 21, 387-
404 (1992)
(106) Wilhelm SM, McKenney KA, Rivait KN, Kale-Pradhan PB, A review of
infliximab use in ulcerative colitis, Clin Ther, 2008;30(2):223-30
(107) Winterkamp S., Weidenhiller M., Otte P., Stolper J., Schwab D., Hahn E.G.,
Raithel M.: Urinary excretion of N-Methylhistamine as a marker of disease
activity in inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 2002
(108) Wüthrich B.: Nahrungsmittelallergie. Internist 27, 362-371 (1986)
(109) Wüthrich B.: Zur Nahrungsmittelallergie (Food allergy). Allergologie 16
(1993) 280-287
(110) Zuberbier T., Czarnetzki B.M. (1993) Nahrungsmittelunverträglichkeiten.
Hautarzt 44:57-62
86
(111) Zwetschenbaum JF., Burakoff R.: Food allergy and the irritable bowel
syndrome. Am J Gastroenterol 1988;83: 901-904(zuammenhang CED GMA?)
87
Abkürzungsverzeichnis
a aktiv
BCA Bicinchoninic Säure
CAI Aktivitätsindex bei Colitis ulcerosa
CC Kollagencolitis
CD Morbus Crohn
CDAI Aktivitätsindex bei Morbus Crohn
CED chronisch entzündliche Darmerkrankung
CG Kontrollgruppe
db doppeltblind
ECP Eosinophiles cationisches Protein
GIT Gastrointestinaltrakt
GMA Gastrointestinal vermittelte Allergie
MC Mikroskopische Colitis
na nicht aktiv
PMSF Phenylmethansulfonylflorid
RAST Radiofluoreszenzallergosorbenttest
SD Standardabweichung
TNF Tumornekrosefaktor
UC Colitis ulcerosa
UMH Urin-Methylhistamin
88
Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
89
Anhang
90
Danksagung
Ich möchte mich bei Herrn Prof. Dr. Hahn für die Überlassung
des interessanten Themas meiner Promotion bedanken.
Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Raithel für die
Unterstützung in der Einführung der Endoskopie, der
Laborarbeit, der Auswertung der Statistik, Bearbeitung des
Themas, Einführung in Erstellung von Postern und
Veröffentlichungen und die Teilnahme an zahlreichen
Kongressen. Darüber hinaus möchte ich mich bei Herrn Jürgen
Kressel für die Hilfe und Mitarbeit im Labor bedanken. Herrn
Mach danke ich für die Beantwortung der schwierigen Fragen
zu meiner Statistik. Desweiteren möchte ich mich bei meiner
Familie, insbesondere bei meiner Mutter, und bei meinen
Freunden für die menschliche Unterstützung bis zum
vollständigen Abschließen meiner Promotion bedanken.
91
Tabellarischer Lebenslauf
Persönliche Daten
• Name Nabe
• Vorname Andrea
• Geburtsdatum 09.11.1978
• Geburtsort Forchheim
• Staatsangehörigkeit Deutsch
• Konfession katholisch
• Familienstand verheiratet
• Ehemann Alexander Müssigbrodt
• Eltern Maria Anna Nabe, geb. Gehra
Hans Joachim Nabe
• Geschwister Susanne Schlund, geb. Nabe
Schulausbildung
• 1989-1998 Herder- Gymnasium Forchheim
• 1985-1989 Grundschule Eggolsheim
Studium
Beginn 1998 mit Studium der Humanmedizin an der Friedrich- Alexander-Universität
Erlangen- Nürnberg
92
Examina
• 06/2005 Drittes Staatsexamen ( Note 1, insgesamt Note 1,99)
• 04/2004 Zweites Staatsexamen
• 04/2002 Erstes Staatsexamen
• 09/2000 Physikum
Praktisches Jahr
• 11/2004-03/2005 Chirurgische Klinik, Universität Erlangen-Nürnberg
• 08/2004-11/2004 Klinik für Anästhesie, Universität Erlangen-Nürnberg
• 04/2004 -08/2004 Medizinische Klinik I, Innere Medizin, Universität Erlangen-
Nürnberg
Dissertation
Seit Juli 2005 : Labor für funktionelle Gewebediagnostik, Medizinische Klinik I mit
Poliklinik, Universität Erlangen-Nürnberg, Doktorvater: Herr Prof. Dr. Raithel
Facharztausbildung für Innere Medizin
Seit 15.07.2005 in der Klinik Fränkischen Schweiz in Ebermannstadt
93
Wahrheitsgemäße Erklärung
Ich erkläre hiermit wahrheitsgemäß, dass ich
1) die eingereichte Arbeit selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt
habe,
2) außer den im Schrifttumsverzeichnis angegebenen Hilfsmitteln kein weiteren
benutzt und alle Stellen, die aus dem Schrifttum ganz oder annähernd
entnommen sind, also solche kenntlich gemacht und einzeln nach ihrer
Herkunft unter der Bezeichnung der Literaturstelle nachgewiesen habe.
Eggolsheim, den 26.05.2009
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