Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum
Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone
und der Variabilität des agr-Genlocus
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Sven Hengesbach
aus Meschede
2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Manfred Köller
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2006
Abstract
Hengesbach
Sven
Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone und der
Variabilität des agr-Genlocus
Problem: Weltweit wird das Phänomen beobachtet, dass Epidemien mit Methicillin-
resistenten Staphylococcus aureus von nur wenigen Stämmen dieser Spezies verursacht
werden. Die Entdeckung der agrBDC-Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass
ein bestimmter agr-Interferenztyp mit der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-
Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden könnte. Dies sollte in der
vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden.
Methoden: Anhand der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster wurden die Isolate der
MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt
Bochum nach epidemiologischen Kriterien klassifiziert und mit anerkannten nationalen
und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Zur Analyse der
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen erfolgte zunächst die DNA-Präparation.
Anschließend wurde eine PCR durchgeführt mit nachfolgender Aufreinigung der PCR-
Produkte. Zur Restriktionsanalyse wurde das Enzym DraI verwendet.
Ergebnisse: Es wurden vier epidemische MRSA-Stämme in Bochum identifiziert, die
51,2% aller Infektionen verursachten. Das PFGE-Muster von zwei Isolaten aus Bochum
war identisch mit anerkannten Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und
Großbritannien. Auch der Hannoversche-, Süddeutsche- und Berliner Epidemiestamm
waren in der Stammsammlung enthalten. Im ersten Beobachtungszeitraum (13.02.1998-
31.12.2000) wiesen 70,9% der epidemischen MRSA-Stämme das agr-Interferenzmuster
II auf. Bei Betrachtung des gesamten Untersuchungszeitraumes (13.02.1998-
12.01.2004) nahm sein Anteil auf 53,3% ab, während die Interferenzgruppen I und Ia
wesentlich häufiger unter den epidemischen Stämmen zu finden waren.
Diskussion: Da bei den MRSA-Epidemiestämmen mit den meisten Isolaten drei agr-
Interferenzmuster, I, Ia und II, zu finden waren, scheint es keine Präferenz der
epidemischen MRSA für ein bestimmtes Interferenzmuster zu geben. Dies gilt auch für
die Restriktionsmuster der anerkannten deutschen Epidemiestämme.
Inhalt und Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Staphylococcus aureus 1 1.1.1 Kolonisation und Infektion 1 1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus 2 1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 3 1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen 5 1.2.2 Resistenzentwicklung 6 1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die Entwicklung neuer Antibiotika 8 1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) 10 1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen 13 1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene Expression 14 1.4 Der agr-Genlocus 17 1.4.1 Globale Regulatorsysteme virulenzassoziierter Gene 17 1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme 19 1.4.3 Aufbau und Funktion des agr-Genlocus 22 1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus 26 1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies 28 1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar 29 1.6 Fragestellung 30 2 Material und Methoden 32 2.1 Material 32 2.1.1 Chemikalien 32 2.1.2 Stämme 32 2.1.3 Kulturmedien und Puffer 36 2.1.4 Enzyme 36 2.1.5 Oligonukleotide 36 2.2 Methoden 37 2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster 37 2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen Eigenschaften
„epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“ 39 2.2.3 DNA-Präparation 39 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 40 2.2.5 Agarosegelelektrophorese 41 2.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte 41 2.2.7 Restriktionsanalyse 42
I
Inhalt und Verzeichnisse
3 Ergebnisse 43 3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung 44 3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres klinischen Auftretens 44 3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004 47 3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen 51 3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme 54 3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme 63 3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA 64 3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen 68 4 Diskussion 76 4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen 76 4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien 78 4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum 79 4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation 80 4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus 82 4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen 83 4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem agr-Interferenzmuster 86 4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo 87 5 Zusammenfassung 90 6 Literaturverzeichnis 93 7 Danksagung 107 8 Lebenslauf 108
II
Inhalt und Verzeichnisse
Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden 33 Tabelle 2 mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens 34 Tabelle 3 In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa 35 Tabelle 4 Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens 36 Tabelle 5 Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000) 47 Tabelle 6 Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004 49 Tabelle 7 Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende zu Abbildung 13) 57 Tabelle 8 Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen 71 Tabelle 9 Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen 72 Tabelle 10 Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004 74 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren 18 Abbildung 2 Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells 21 Abbildung 3 Transkription des polycistronischen agr-Locus 23 Abbildung 4 Modell des agr-Systems von S. aureus 25 Abbildung 5 Hypervariable Region des agr-Genlocus 27 Abbildung 6 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software 38 Abbildung 7 Optimization 38 Abbildung 8 Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus 42 Abbildung 9 Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster (Stand der Sammlung: 31.12.2000) 46 Abbildung 10 Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer MRSA-Stammsammlung 48 Abbildung 11 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software,
Übereinstimmung mit PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme 52
Abbildung 12 Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien 54 Abbildung 13 Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen 56 Abbildung 14 Verteilung der 360 Isolate der Klinik A auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 15 Verteilung der 294 Isolate der Klinik B auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 16 Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 17 Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 18 Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR 65 Abbildung 19 Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI 67 Abbildung 20 Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme 69 Abbildung 21 Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung 73
III
Inhalt und Verzeichnisse
Verzeichnis der Abkürzungen
ABC ATP binding cassette ADP Adenosindiphosphat agr accessory gene regulator AIP autoinducing peptide ATP Adenosintriphosphat bidest. Bidestilliert bp Basenpaare °C Grad Celsius CDC Centers for Disease Control and Prevention CF Clumping factor cm Zentimeter cMRSA community acquired MRSA CMRSA Canadian methicillin-resistant Staphylococcus aureus cna collagen adhesion gen CNISP Canadian Nosocomial Infection Surveillance Program DNA Desoxyribonukleinsäure ds doppelsträngig EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EMRSA epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus EPIC European Prevalence of Infection in Intensive Care et al. et alii FDA Food and Drug Administration FnBPA Fibronektin-Bindeprotein A FnBPB Fibronektin-Bindeprotein B IgG Immunglobulin G g Gramm x g Gravitationskonstante der Erde GISA Glykopeptid-intermediäre Staphylococcus aureus GPI-Karte gram-positiv identification card h Stunde HCl Salzsäure hla Alphatoxin-Gen HIV human immunodeficiency virus H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HPK Histidin-Proteinkinase IL-2 Interleukin-2 kb Kilobasen kD Kilodalton (Einheit für das Molekulargewicht) KNS Koagulase-negative Staphylokokken l Liter M Molar mecA Penicillin-Resistenzgen mg Milligramm min Minute ml Milliliter MLEE Multilocus Enzyme Electrophoresis MLST Multilocus Sequence Typing
IV
Inhalt und Verzeichnisse
mM Millimolar mRNA messenger-Ribonukleinsäure MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MSCRAMM microbial-surface components recognizing adhesive matrix molecules MSSA Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards ng Nanogramm nm Nanometer NNIS National Nosocomial Infections Surveillance NRW Nordrhein-Westfalen ORF open reading frame PBP Penicillin-Bindeprotein PBP2a Penicillin-Bindeprotein 2a PCR Polymerase-Kettenreaktion pmol Pikomol RAP RNA III activating protein RIP RNA III inhibiting peptide RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RR response regulator sar staphylococcal accessory regulator spa Gen für Protein A TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq Thermophilus aquaticus TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung TE Tris-EDTA TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha Tris Tris(hydroxymethylaminomethan) U Unit µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer UV Ultraviolett V Volumen VISA Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus VRSA Vancomycin-resistente Staphylococcus aureus V/cm Volt/Zentimeter (v/v) Volumen/Volumen VRE Vancomycin-resistente Enterokokken WHO Weltgesundheitsorganisation (w/v) Gewicht/Volumen
V
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Staphylococcus aureus
Die Gattung Staphylococcus enthält über 30 Spezies und Subspezies und ist den
grampositiven Kokken zuzuordnen. Staphylokokken bilden keine Sporen, haben eine
kugelige bis ovale Zellform und einen Durchmesser von etwa 1 µm. Sie vermehren sich
sowohl aerob als auch anaerob und ordnen sich in Haufen oder Trauben an (griechisch
staphyle, die Traube). Das Enzym Koagulase wird nur von Staphylococcus aureus
gebildet und ist somit ein wesentliches diagnostisches Kriterium der klinisch
wichtigsten, fakultativ bis obligat pathogenen Spezies. Die oft goldgelben
Pigmentierungen der Kolonien führten zu der Bezeichnung „aureus“ (lateinisch aureus,
golden).
Koagulasenegative Staphylokokken sind klassische fakultativ pathogene Opportunisten.
Die beiden Hauptvertreter dieser Gruppe sind Staphylococcus epidermidis und
Staphylococcus saprophyticus (Kloos und Schleifer, 1986).
1.1.1 Kolonisation und Infektion
Ungefähr 30-50% der gesunden Individuen sind Träger von Staphylococcus aureus, von
denen 10-20% dauerhaft kolonisiert sind. Sowohl Methicillin- (Oxacillin-) sensible
(MSSA) als auch Methicillin- (Oxacillin-) resistente Isolate (MRSA) können einen Wirt
dauerhaft kolonisieren. Die bevorzugten Körperregionen einer asymptomatischen
Kolonisierung sind Nasenvorhöfe und Rachen. Außerdem werden häufig Vagina und
Perineum befallen. Die nasale Kolonisierung hat sich als einer der größten
Risikofaktoren für die Entwicklung nosokomialer und auch ambulant erworbener
Infektionen erwiesen (von Eiff et al., 2001). Etwa 20% der Bevölkerung sind ständig
und circa 60% intermittierend im Bereich der vorderen Nasenhöhle mit S. aureus
kolonisiert. Ausgehend von der Nase kann sich der Erreger auf weitere Bereiche der
Haut- und Schleimhäute ausbreiten.
1
Einleitung
Die Bakterien können als transiente Flora für Wochen oder Monate asymptomatisch
intakte Mukosa kolonisieren. Sobald es jedoch zu einem Gewebedefekt kommt, wird
der Erreger inokuliert und kann Krankheitsbilder auf drei verschiedene Arten
verursachen:
1. Die Bakterien befinden sich am Infektionsort, beziehungsweise breiten sich
lokal begrenzt aus, und führen zu Abszessen, Karbunkeln, Zellulitis, Impetigo
bullosa und Wundinfektionen.
2. Eine Invasion der Blutbahn mit hämatogener Streuung kann der Grund sein für
Krankheitsbilder wie eine Endokarditis, Osteomyelitis, epidurale Abszesse bis
hin zum septischen Schock.
3. Staphylococcus aureus sezerniert Toxine und verursacht auf diesem Wege das
Toxic-Schock-Syndrom und das „staphylococcal-scalded-skin-syndrome“
(Dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter von Rittershain) (Archer, 1998).
Nach von Eiff et al. (2001) haben Personen, die mit S.-aureus-Stämmen kolonisiert
sind, ein erhöhtes Risiko, sich mit diesen zu infizieren. Die meisten Fälle nosokomialer
Infektionen entstehen durch den Kontakt mit staphylokokkenbesiedelten Händen des
Krankenhauspersonals, entweder von ihrem eigenen Reservoir oder durch den Kontakt
mit einem infizierten Patienten. Die wichtigste prophylaktische Maßnahme ist deshalb
die regelmäßige Händedesinfektion. Dies scheint zunächst einfach zu realisieren, doch
Studien zeigen, dass es den Ärzten hierbei deutlich an Compliance mangelt (Archer,
1998; Kipp et al., 2004; Lowy, 1998; Pittet et al., 2004; Vandenbergh et al., 1999).
1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus
Als nosokomial werden im Krankenhaus erworbene Infektionen bezeichnet, die im
Durchschnitt bei ungefähr 4,8% aller hospitalisierten Patienten gefunden werden. Sie
entstehen häufiger in Schwerpunktkrankenhäusern als in kleineren Institutionen,
innerhalb eines Krankenhauses häufiger bei Patienten der Intensivstationen als bei
denen der Normalabteilungen (Schentag et al., 1998). S. aureus ist einer der häufigsten
Gründe für endemische und epidemische nosokomiale Infektionen. Er ist der häufigste
Erreger nosokomialer Wundinfektionen und Pneumonien sowie die zweithäufigste
Ursache einer Sepsis.
2
Einleitung
Weitere Beispiele nosokomialer S.-aureus-Infektionen sind Omphalitiden, Impetigo,
infizierte Dekubital-Ulzerationen, Brandwunden und Weichteilabszesse (Boyce, 1997).
Schon 1880 und 1882 beschrieb Sir Alexander Ogston in einer Reihe klinischer
Beobachtungen und Laborstudien die bedeutende Rolle von Staphylococcus aureus in
der Entstehung von Wundinfektionen, Abszessen und einer Sepsis (Ogston, 1882).
S. aureus ist ebenfalls schon lange als ein Erreger ambulanter Infektionen bekannt.
Bereits in den 1950er Jahren beschrieben Nahmias und Eikhoff (1961) das Auftreten
der epidemischen S.-aureus-Stämme des Phagentyps 80/81 außerhalb von
Krankenhäusern. Ein besonders hohes Risiko, an einer ambulant erworbenen S.-aureus-
Infektion zu erkranken, haben Patienten mit Diabetes mellitus, chronischen
Hauterkrankungen, Dialyse-Patienten, Abhängige von intravenös applizierten Drogen
und HIV-Infizierte (Kauffman und Bradley, 1997). Häufige Manifestationen sind
umschriebene Abszesse, die auch in Form von Furunkeln oder Karbunkeln in
Erscheinung treten sowie Pneumonien und Tonsillarabszesse (Archer, 1998).
1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)
S.-aureus-Stämme konnten anfänglich erfolgreich mit Penicillin behandelt werden, bis
schließlich ein Großteil resistent wurde. Man geht davon aus, dass mittlerweile 80-90%
der S.-aureus-Isolate Penicillin-resistent sind. Bis zu den 1980er Jahren konnten
Methicillin und andere halbsynthetische Penicilline erfolgreich gegen Penicillin-
resistente S. aureus eingesetzt werden. Doch schon im Jahre 1961 wurde über das
Auftreten sogenannter Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) berichtet und es kam
immer häufiger zu Infektionen mit MRSA, die in vielen Krankenhäusern endemisch
wurden. Dies führte Ende der 1970er Jahre wieder zu einem vermehrten Auftreten
grampositiver Keime, die nur mit neuen Wirkstoffen behandelt werden konnten (Grubb,
1991; Smith et al., 1999). In Deutschland sind inzwischen ungefähr 20% der
Staphylococcus-aureus-Stämme Methicillin-resistent. In den USA stieg, nach Angaben
der NNIS (National Nosocomial Infections Surveillance), die MRSA-Prävalenz von
2,4% im Jahre 1975 auf 29% im Jahr 1991 und beträgt mittlerweile circa 40% (Kipp et
al., 2004; Voss et al., 1994).
3
Einleitung
Bezüglich der MRSA-Prävalenz gibt es beträchtliche Unterschiede zwischen
europäischen Ländern, innerhalb Deutschlands zwischen verschiedenen
Krankenhäusern und selbst innerhalb verschiedener Abteilungen eines Krankenhauses.
In den USA, Japan und den südeuropäischen Ländern kann man von einer hohen
MRSA-Prävalenz ausgehen (zwischen 30 und 80%). In den Niederlanden und
Skandinavien liegt die MRSA-Rate unter 1%, vermutlich auf Grund eines restriktiveren
Antibiotika-Einsatzes in Klinik und Praxis und konsequenter Implementierung eines
gezielten MRSA-Screening-Programms mit Isolation von Patienten schon bei einem
vermuteten MRSA-Befall. Erst bei negativen Abstrichen wird der Patient auf die
Station verlegt („Search and Destroy-Politik“). Das Bewusstsein, MRSA-Infektionen
unter allen Umständen zu vermeiden, ist in diesen Ländern wesentlich stärker
ausgeprägt als zum Beispiel in Deutschland (Daschner et al., 2004; Heuck, 2003; Heuck
et al., 1995; Ibelings und Bruining, 1998; Kipp et al., 2004; Sader et al., 1993; Trindade
et al., 2003; Vincent et al., 1995; Weinstein, 2001; Witte et al., 1997, 2004).
Es galt lange Zeit als umstritten, dass Infektionen mit MRSA einen signifikant
schwereren klinischen Verlauf nehmen als solche mit Methicillin-sensiblen
Staphylococcus aureus (MSSA) (Boyce, 1997; Soriano et al., 2000). Inzwischen sind
jedoch mehrere Kohortenstudien erschienen, die eine höhere Mortalität, einen längeren
Krankenhausaufenthalt und höhere Kosten bei Patienten mit MRSA-Infektionen
nachgewiesen haben, denn durch infektions- und therapiebedingte Komplikationen
steigt die Krankenhausverweildauer und die Genesung der Patienten wird deutlich
hinausgezögert (Kopp et al., 2004; Rubin et al., 1999; Weinstein, 2001). Betrachtet man
die mit nosokomialen Wundinfektionen und Septikämien verbundenen Kosten, liegt das
jährliche Einsparpotenzial für ein Krankenhaus der Maximalversorgung sicherlich im
sechsstelligen Bereich (Engemann et al., 2003; Herr et al., 2003). In einigen Kliniken
der USA werden 10-15% des gesamten Arzneimittelbudgets für Vancomycin verwendet
(Fridkin et al., 2001). In Deutschland wird die Verbreitung und erhöhte
Resistenzsituation von MRSA auf Dauer ebenfalls zu einem immer größer werdenden
krankenhaushygienischen und –ökonomischen Problem werden. Die Prävalenz von zur
Zeit 20,7% MRSA-Stämmen in Deutschland, eine mögliche Ausbreitung von cMRSA
(community acquired MRSA), die Zunahme von VISA-Stämmen (Vancomycin-
intermediär-resistenter Staphylococcus aureus) oder VRSA (Vancomycin-resistenter
Staphylococcus aureus) kann bei knappen Ressourcen im Gesundheitswesen zu einer
4
Einleitung
medizinisch und wirtschaftlich nur noch schwer beherrschbaren Situation führen (Kipp
et al., 2004). Somit scheint die Implementierung eines Screening-Programms für MRSA
lohnenswert. Wernitz et al. (2005) analysierten die Kosten eines MRSA-Screening-
Programms über 19 Monate in mehreren Krankenhäusern Deutschlands basierend auf
dem DRG- („diagnosis related groups“-) Abrechnungssystem. Sie zeigten auf, dass mit
einer Reduktion nosokomialer MRSA-Infektionen durch ein konsequentes Screening
Einspareffekte erzielt werden konnten.
1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen
MRSA wurden lange als ein krankenhausspezifisches Problem angesehen. Diese
Ansicht musste korrigiert werden, als MRSA-Infektionen auch im ambulanten Bereich
nachgewiesen werden konnten (Salyers und Whitt, 2002). Abgesehen von
Drogenabhängigen gab es kaum einen Anhaltspunkt für die Ausbreitung von MRSA in
der Öffentlichkeit, obwohl sie in den Krankenhäusern der USA schon in den 1960er
Jahren auftraten. Erst in den frühen 1990er Jahren häuften sich die Berichte von
Patienten außerhalb der typischen Hoch-Risikogruppen, die mit MRSA infiziert waren
und bei denen der Keim schon vor Einlieferung ins Krankenhaus vorhanden war
(Kauffman und Bradley, 1997; Rosenberg, 1995). Seit einigen Jahren werden vermehrt
MRSA-Stämme von Patienten ohne direkten Kontakt zu stationären medizinischen
Einrichtungen beschrieben. Diese sogenannten „community acquired MRSA“ (cMRSA)
wurden zuerst bei Ureinwohnern Nordamerikas (indianische Bevölkerung im Gebiet
Albuquerque) und Australiens gefunden. Auf Grund der unzureichenden Datenlage ist
die Bedeutung dieser Stämme noch unklar. Sie scheinen in Deutschland bisher nur eine
marginale Rolle zu spielen (Kipp et al., 2004). Die in Deutschland bisher aufgetretenen
Isolate zeigen ein einheitliches SmaI-Makrorestriktionsmuster, den MLST- (Multilocus
Sequence Typing) Typ 80 und spa- (kodiert das Protein A) Typ 44, womit sie sich
deutlich von den in Deutschland verbreiteten nosokomialen Epidemiestämmen
unterscheiden (Robert Koch-Institut, 2004). In der zweiten Hälfte des Jahres 2002 trat
in Deutschland ein neuer cMRSA-Stamm bei Patienten ohne vorhergehenden
Krankenhausaufenthalt auf. Dieser Stamm scheint weit verbreitet zu sein, denn er wurde
schon in Frankreich, Schottland, Finnland und Norwegen isoliert (Witte et al., 2004).
5
Einleitung
Alten- und Pflegeheime werden als Reservoir für MRSA angesehen, insbesondere die
großen Heime, die mit Krankenhäusern der Maximalversorgung zusammenarbeiten.
Man geht derzeit davon aus, dass MRSA-Träger in Pflegeeinrichtungen ihre Besiedlung
eher bei früheren Krankenhausaufenthalten als im Pflegeheim selbst erworben haben.
Es scheint sich um eine komplexe epidemiologische Wechselwirkung zwischen
Akutversorgung und Pflege zu handeln (Bradley, 1997; Robert-Koch-Institut, 2003).
Bei nasaler Kolonisierung mit MRSA ist der Patient, je nach eigener Disposition,
grundsätzlich selbst infektionsgefährdet. Für Hämodialysepatienten zum Beispiel
besteht durch die nasale MRSA-Besiedlung eine große Infektionsgefahr (Heuck und
Nassauer, 1999). Das Risiko für eine ständige Besiedlung mit MRSA ist von einem zum
anderen Patienten sehr unterschiedlich. Risikofaktoren hierfür sind eine Kolonisierung
mit MRSA an mehreren Körperstellen und eine vor kurzem erhaltene
Antibiotikatherapie mit Fluorchinolonen. Außerdem scheint sowohl die fehlende
Mupirocin- (lokales Antibiotikum zur MRSA-Eradikation) Behandlung als auch die
Mupirocin-Resistenz der besiedelnden MRSA eine persistierende Kolonisierung zu
fördern (Harbarth et al., 2000).
1.2.2 Resistenzentwicklung
Von MRSA wurde erstmals 1961 in Großbritannien berichtet. Es gab in den 1960er
Jahren allerdings nur vereinzelte Ausbrüche. Bedingt durch die Einführung der
Isoxazolylpenicilline (Penicillinase-feste Penicilline) Anfang der 1960er Jahre und die
Entwicklung der Substanzklasse der Cephalosporine, wurde das Resistenzproblem bei
S. aureus zu einem untergeordneten Thema für den klinischen Alltag. Nach dieser
stummen Periode Mitte der 1970er Jahre häuften sich zu Beginn der 1980er Jahre die
Berichte über ein Wiederaufflammen von MRSA-Infektionen. Diese Phase scheint mit
der Entwicklung von Resistenzen gegenüber Gentamicin und anderen Aminoglykosiden
zusammenzuhängen.
Es besteht jedoch weiterhin Ungewissheit über die Gründe für die Zunahme von
MRSA-Infektionen; wahrscheinlich sind der häufige Einsatz von Antibiotika und eine
inadäquate Infektionskontrolle die entscheidenden Einflussfaktoren.
6
Einleitung
Durch den hohen Selektionsdruck entwickelten sich neue Stämme, die erfolgreicher im
Krankenhaus überlebten als die ursprünglichen MRSA (Grubb, 1991; Kipp et al., 2004).
Im mitteleuropäischen Raum blieb die Resistenzsituation bei S. aureus bis Mitte der
1980er Jahre im Wesentlichen unverändert und war zum Teil sogar rückläufig. 1990
und insbesondere 1995 folgte dann eine deutliche Zunahme der Methicillin-Resistenz,
die sich 1995 bei 12,9% der S.-aureus-Isolate fand (Kresken et al., 2000). Zu Beginn
der 1980er Jahre traten in den USA zunehmend MRSA-Klone auf, die parallel
Resistenzen gegen Aminoglykoside, Lincosamide, Makrolide, Tetracycline,
Fluorochinolone, Sulfonamide und weitere Substanzklassen aufwiesen, was die
Behandlungsmöglichkeiten schon zu diesem Zeitpunkt deutlich einschränkte. Die
Prävalenz von MRSA-Stämmen in Deutschland liegt mittlerweile bei 20,7%. Es hat
demnach in kurzer Zeit ein bedenklicher Anstieg Methicillin-resistenter S. aureus von
1,7% (1990) über 15,2% (1998) auf 20,7% (2001) stattgefunden (Kipp et al., 2004).
Die Paul-Ehrlich-Gesellschaft für Chemotherapie e.V. führt regelmäßig
Untersuchungen zur Resistenzsituation durch, wobei in jeder Erhebungsperiode dieser
sogenannten EPIC-Studie (European Prevalence of Infection in Intensive Care) die
gleiche Testmethodik angewandt wird. In der EPIC-Studie von 1995, bei der unter
Beteiligung von 17 Ländern Infektionen auf Intensivstationen vorwiegend großer und
universitärer Einrichtungen erfasst worden waren, fand man zu 30,1% S. aureus, von
denen sich 60% als MRSA herausstellten. Lediglich Enterobacteriacen waren mit
34,4% etwas häufiger Ursache von Infektionen. Der größte Risikofaktor für einen
Patienten an einer MRSA-Infektion zu erkranken, war die Dauer des Aufenthaltes auf
der Intensivstation. Diese Ergebnisse verdeutlichen die derzeitige Dominanz von
Staphylokokken. Beim europaweiten Vergleich der Ausbreitung von MRSA ist in
Deutschland und England ein besonders starker Anstieg von jährlich 6% zu beobachten.
Früher ging man davon aus, dass die globale Ausbreitung von MRSA auf einen
einzigen Klon zurückgeht. Nachfolgende Studien ließen jedoch vermuten, dass sich das
mecA-Gen für die Methicillin-Resistenz horizontal in eine Vielzahl von S.-aureus-
Stämmen ausgebreitet hat (Boyce, 1997). Die Resistenz gegenüber Methicillin entsteht
durch ein zusätzliches Penicillin-Bindeprotein, PBP2a, mit einer sehr geringen Affinität
zu β-Laktam-Antibiotika. Die genaue strukturelle Basis für diese erniedrigte Affinität
ist noch nicht geklärt.
7
Einleitung
S.-aureus-Stämme produzieren zwar auch β-Laktamasen, aber die mecA-Resistenz
scheint die meisten Probleme zu verursachen, da das PBP2a eine Resistenz gegen
sämtliche β–Laktam-Antibiotika vermittelt, wohingegen β-Laktamasen nur gegen ein
begrenztes Spektrum von β–Laktam-Antibiotika wirken (Chambers, 1997; Salyers und
Whitt, 2002).
Die Multiresistenz und die Fähigkeit zur Ausbreitung in Krankenhäusern verleihen den
MRSA ihre große klinische Bedeutung. Sie sind resistent gegen eine Vielzahl
Antibiotika wie Penicilline, Aminoglykoside, Tetrazykline, Makrolide und
Lincosamide, Chloramphenicol sowie gegen Schwermetall-Ionen und teilweise
quaternäre Ammoniumverbindungen (Witte, 1991).
Vancomycin, ein Glykopeptid, ist oft das letzte verfügbare Antibiotikum für eine
Therapie gegen MRSA. Aus einem Gutachten der CDC (Centers for Disease Control
and Prevention) ging hervor, dass die Anzahl der MRSA, die nur noch sensibel auf
Vancomycin reagierten, von 22,8% im Jahr 1987 auf 56,2% im Jahr 1997 angestiegen
ist (Archer, 1998; CDC NNIS System, 1999).
1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die
Entwicklung neuer Antibiotika
Besondere Aufmerksamkeit verdient gegenwärtig eine Subpopulation von MRSA-
Stämmen, Vancomycin-intermediäre S. aureus (VISA), mit verminderter
Empfindlichkeit gegen Glykopeptid-Antibiotika (Robert Koch-Institut, 1998; Witte und
Klare, 1999). Der erste bekannte Fall trat 1996 bei einem vier Monate alten Jungen in
Japan auf, der als postoperative Komplikation nach einem herzchirurgischen Eingriff
eine MRSA-Infektion entwickelte, die nicht therapiert werden konnte. Zwei Wochen
nach der Operation bekam der Säugling Fieber und ein purulentes Sekret trat aus der
Inzisionswunde am Sternum. Der Patient wurde ohne eine Besserung der Symptomatik
29 Tage mit Vancomycin behandelt. Nach den NCCLS-Kriterien (National Committee
for Clinical Laboratory Standards) war der isolierte MRSA-Keim (Mu 50) weder
empfindlich noch resistent. Deshalb wurde er als S. aureus mit intermediärer Resistenz
gegen Vancomycin beschrieben.
8
Einleitung
Dass MRSA zunehmend Vancomycin-resistent werden, wurde schon vermutet, denn
der Transfer des vanA-Plasmids von hochgradig Vancomycin-resistenten Enterokokken
(VRE) auf S. aureus konnte bereits demonstriert werden. Der Stamm Mu 50 trägt aber
weder ein vanA- noch ein vanB-Gen, sodass die Resistenz hier über einen anderen Weg
vermittelt wird. Es gibt Hinweise auf eine verstärkte Zellwandsynthese, denn
elektronenmikroskopisch erschien die Wand zwei Mal so dick wie bei Kontrollstämmen
(Hiramatsu et al., 1997, 2002). Anschließend wurde von fünf ähnlichen Stämmen
berichtet, die in den USA, Frankreich und Korea auftraten. Wie im vorher geschilderten
Fall versagte die Vancomycin-Therapie bei den infizierten Patienten. Es ist leicht
vorstellbar, dass die Ausbreitung solcher Stämme die Morbidität und Mortalität
nosokomialer Infektionen signifikant erhöhen wird. In Thailand wurden MRSA-
Stämme entdeckt, die heterogen resistent (oder heteroresistent) gegen Vancomycin
waren. Sie mutieren mit einer Frequenz von eins zu einer Million oder mehr Fällen und
reagieren nur noch eingeschränkt empfindlich auf Vancomycin (Trakulsomboon et al.,
2001). Die Verbreitung vollständig Vancomycin-resistenter S. aureus (VRSA), von
denen bisher nur zwei Stämme bekannt sind, wurde erstmals 2002 in den USA
beschrieben. Aus in-vitro-Versuchen in New York und Japan geht hervor, dass 9,3%
von den getesteten nosokomialen MRSA-Stämmen Vancomycin-resistente
Subpopulationen besitzen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Vancomycin-intermediäre S.
aureus jederzeit unter selektivem Druck vollständig resistent werden könnten (Kipp et
al., 2004; Waldvogel, 1999).
Es wird intensiv an der Entwicklung neuer Antibiotika gearbeitet und seit wenigen
Jahren sind zwei von ihnen im Einsatz: eine Kombination zweier Streptogramine
(Synercid) und ein neuer Proteinsynthese-Inhibitor, Linezolid, aus der vollsynthetischen
Gruppe der Oxazolidinone. Streptogramine sind schon seit Jahren als Proteinsynthese-
Inhibitoren bekannt, welche die Translokation der Ribosomen verhindern. Das
Linezolid hingegen repräsentiert eine völlig neue Klasse von Antibiotika, die erstmalig
ein sehr frühes Stadium der Proteinsynthese blockieren. Die Substanz verhindert durch
Bindung an die 50S-Untereinheit der Ribosomen die Ausbildung eines 70S-
Ribosomenkomplexes, sodass kein Initiationskomplex entstehen kann. Als Erstes
marktfähiges Oxazolidinon wurde Linezolid im April 2000 in den USA von der FDA
(Food and Drug Administration) zugelassen (Hamel und Ford, 2001; Salyers und Whitt,
2002; Wilcox 2003).
9
Einleitung
1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)
Der Transfer MRSA-kolonisierter Patienten, der Hauptquelle von MRSA in
Krankenhäusern, führte zu einer Übertragung zwischen Krankenhäusern innerhalb von
Städten und Ländern, aber auch über Länder und sogar Kontinente hinweg (Boyce,
1997; Roman et al., 1997). Auffällig ist, dass nur bestimmte MRSA-Stämme diese
epidemischen Charakteristika aufweisen und sich in kurzer Zeit über große Distanzen
ausbreiten. So entstehen weltweit Epidemien, die von wenigen MRSA-Stämmen
verursacht werden.
Hierfür einige Beispiele:
In Lissabon fiel ein MRSA-Klon auf, der besonders häufig bei Infektionen isoliert
wurde. Dieser Klon wurde ebenso in Krankenhäusern von Barcelona und Madrid als
dominant beschrieben und war für mehrere Ausbrüche verantwortlich (Sanchez et al.,
1995). Eine weitere Epidemie in Barcelona verursachte ein bestimmter MRSA-Klon,
der sich äußerst effektiv über die Stationen im Krankenhaus verbreitete und bei
Patienten sowie beim Personal und auf Oberflächen der Umgebung gefunden wurde
(Dominguez et al., 1994).
In Brasilien wurden ähnliche Phänomene beobachtet. In fünf verschiedenen Regionen
Brasiliens ließen sich 77% der klinischen MRSA-Stämme auf einen Klon, den
„Brazilian Endemic Clone A“, zurückführen (Sader et al., 1993). Weiterhin ist in
Brasilien die Ausbreitung eines epidemischen MRSA-Klones gut dokumentiert. Eine
beachtliche Anzahl von Krankenhausinfektionen wurde von diesem multiresistenten
MRSA-Klon verursacht, der als „brasilianischer epidemischer Klon“ bezeichnet wurde.
Es konnte gezeigt werden, dass dieser Stamm kontinentale Schranken überwunden und
sich bis nach Portugal ausgebreitet hat (da Silva Coimbra et al., 2000).
Auch in britischen Krankenhäusern sind solche Fälle beschrieben:
Trotz Maßnahmen zur Kontrolle der Übertragung von Keimen, die bezüglich anderer
Erreger Erfolg zeigten, breiteten sich einige MRSA-Stämme (EMRSA) ungewöhnlich
schnell in englischen Kliniken aus. In den frühen 1980er Jahren war ein einziger
MRSA-Stamm die Ursache vieler Epidemien in Krankenhäusern von England und
Wales, sodass er fortan als Epidemiestamm (EMRSA, epidemic MRSA) galt.
10
Einleitung
Der Stamm EMRSA-1 breitete sich in der Region North Thames und EMRSA-3 in der
Region Southeast Thames in England aus.
Der Stamm EMRSA-16 erlangte besondere Berühmtheit als Auslöser vieler Epidemien.
In drei Krankenhäusern in East Northamptonshire kolonisierte und infizierte er über
einen Zeitraum von fast zwei Jahren 400 Patienten, wobei auch eine Kolonisation von
Angehörigen dieser Patienten und des Krankenhauspersonals nachgewiesen werden
konnte. Sieben Patienten starben als direkte Folge der Infektion. 1993 gab es in
Großbritannien 15 verschiedene EMRSA-Stämme, die allesamt multiresistent waren
und gehäuft bei Intensiv-Patienten auftraten (Boyce et al., 1997; Cox et al., 1995). Auch
in Deutschland hat die Zahl der MRSA deutlich zugenommen. Das Genom von
EMRSA-16 liegt mittlerweile vollständig vor und die bisher gemachten Analysen
zeigen, dass der Erreger äußerst anpassungsfähig ist und sich über die letzten 50 Jahre
ständig weiterentwickelt hat. Etwa 6% der 2675 Gene unterscheiden sich vom MSSA-
Genom (Holden et al., 2004).
Von Januar 1996 bis Dezember 1997 wurde eine zunehmende Zahl von Patienten mit
einem einzigen MRSA-Klon in der westlichen Schweiz kolonisiert beziehungsweise
infiziert. Dieser Klon war für einige Ausbrüche in verschiedenen Krankenhäusern
verantwortlich und wurde bei mindestens 136 Patienten und 20 Angestellten in 21
Krankenhäusern oder Pflegeheimen gefunden. Der Stamm war nicht zu unterscheiden
von dem belgischen Epidemiestamm 2, zu dem 1995 15% aller MRSA-Isolate gehörten,
und war verwandt mit einem MRSA-Klon, der 1996 für eine große Epidemie in Ontario
(Kanada) verantwortlich war (Blanc et al., 1999; Cox et al., 1995; Voss et al., 1994).
Papakyriacou et al. (2000) beschrieben zwei epidemische MRSA-Stämme als Auslöser
für die Hälfte aller MRSA-Infektionen in Kanada. Sie untersuchten von 1995 bis 1999
2780 MRSA aus kanadischen Kliniken und fanden sechs klonale Typen, die 87% aller
Infektionen ausgelöst hatten. Sie wurden als CMRSA (canadian MRSA) -1 bis -6
bezeichnet. Der häufigste Klon, CMRSA-1, repräsentierte 49% und CMRSA-3 8% aller
nosokomialen MRSA-Isolate in Kanada. CMRSA-3 ist dokumentiert als ein Stamm, der
ursprünglich mit einem Patienten aus Punjab (Indien) nach Kanada gelangte und sich
dort rasant ausgebreitet hatte.
11
Einleitung
Booth et al. (2001) charakterisierten 405 S.-aureus-Isolate aus verschiedenen Gebieten
der USA. Von diesen waren lediglich fünf Stämme für mehr als 65% aller Infektionen
verantwortlich.
Wesentliche Ursache für einen Anstieg der MRSA-Häufigkeit im deutschsprachigen
Raum dürfte die weiter fortschreitende überregionale Ausbreitung von MRSA-
Epidemiestämmen sein. In Deutschland und einigen seiner Nachbarstaaten sind seit
mehreren Jahren sechs klonale Gruppen überregional verbreiteter MRSA-Stämme
bekannt, die nach der geographischen Region ihres erstmaligen Nachweises benannt
wurden, wie zum Beispiel der „süddeutsche“ Epidemiestamm. Diese Epidemiestämme
sind inzwischen im gesamten Bundesgebiet verbreitet. Der Erwerb des mecA-Gens (für
die Methicillin-Resistenz) und die Mutation zur Chinolon-Resistenz könnten zumindest
für den „Berliner“-Epidemiestamm hinreichende Voraussetzungen gewesen sein, sich
im Hospitalmilieu auszubreiten (Braulke et al., 1999). In diesem Fall scheint eine
zusätzliche Resistenz die Ausbreitung erhöht zu haben. Im Gegensatz dazu wird seit
1996 eine Dynamik der Verbreitung von MRSA-Epidemiestämmen registriert, bei der
die „älteren“ Epidemiestämme mit „breitem“ Resistenzphänotyp zurückgehen und die
erst seit Mitte der 90er Jahre auftretenden klonalen Gruppen, mit einer vergleichsweise
nur geringen Mehrfachresistenz, zunehmen. Demnach breiten sich Epidemiestämme
aus, denen Resistenzgene fehlen, die in anderen, weniger vorherrschenden MRSA
enthalten sind. Deshalb ist die Resistenzsituation sicherlich keine hinreichende
Erklärung für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen (Braulke et al., 1999;
Robert Koch-Institut, 2003; Voss et al., 1994).
Dies sind nur wenige Beispiele für die weltweite Beobachtung, dass einige MRSA-
Stämme von großer epidemiologischer Bedeutung sind, sich schnell ausbreiten und zu
einem großen Problem werden, wohingegen andere MRSA-Stämme nur sporadisch in
einem begrenzten Bereich auftreten und von untergeordneter klinischer Relevanz sind
(Grubb, 1991). Das gleiche Phänomen trat in den 1950er und 1960er Jahren bei einigen
Phagentypen (80/81) von S. aureus auf, die fähig waren, schwere Infektionen bei
Patienten und Personal zu verursachen und sich sehr schnell in und zwischen den
Krankenhäusern ausbreiteten (Boyce, 1997).
12
Einleitung
Der Mechanismus, der MRSA und auch S. aureus allgemein dazu befähigt, sich
auszubreiten und epidemisch zu werden, ist noch nicht bekannt und die Ursache der
schnellen Verbreitung und Pathogenität einiger Klone muss noch gefunden werden
(Grubb, 1991; Lowy, 1998).
1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen
Um die klonale Ausbreitung von MRSA-Stämmen in Krankenhäusern zu erfassen,
stehen mehrere Verfahren zur Verfügung. In dieser Studie wurde zur Charakterisierung
der MRSA-Isolate die von Schwartz und Cantor (1984) entwickelte
Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) verwendet (siehe Material und Methoden 2.2.1). Sie
beruht auf der Verdauung bakterieller DNA mit Restriktionsendonukleasen, die
bestimmte Abschnitte des Chromosoms erkennen und große DNA-Fragmente (10-800
kb) generieren. Als geeignetste Restriktionsendonuklease hat sich SmaI herausgestellt.
Bei der PFGE wird die Orientierung des elektrischen Feldes periodisch geändert
(pulsed), was die DNA-Fragmente effektiv im Bereich der Megabasenpaare trennen
kann. Die Ergebnisse sind hoch reproduzierbar. Die Nachteile der PFGE sind: ein
langes Zeitintervall bis zu endgültigen Resultaten, hohe Kosten, eine relativ geringe
Anzahl an Banden und die schwierige Interpretation der Ergebnisse, besonders bei
PFGE-Muster-Vergleichen verschiedener Labore (Enright et al., 2002).
Eine weitere angemessene Technik für die molekulare infektionsepidemiologische
Forschung ist die MLST (Multilocus Sequence Typing). Sie wurde von Maiden et al.
(1998) entwickelt und ging aus der MLEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis), einer
phänotypischen Technik zur Typisierung von Proteinen, hervor. Da jedoch zwei
verschiedene Basensequenzen dasselbe Protein exprimieren können oder zwei Proteine
mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität bei der MLEE als eine Bande detektiert
werden, hat sich diese Methode durch die Entwicklung der MLST entscheidend
verbessert. Hierbei werden, statt der Genexpression, die Gene selbst durch Nukleotid-
Sequenzierung analysiert. Unterschiede in den Sequenzen bedeuten verschiedene Allele
des Gens.
13
Einleitung
Es wird jeweils eine bestimmte Anzahl an Genloci verwendet, wobei es sich meist um
das innere Fragment von Housekeeping-Genen handelt. Bei S. aureus wurden sieben
Loci ausgewählt. Bisher sind für jeden ungefähr 30 Allele beschrieben. Die MLST-
Technik wurde von Enright et al. (2000) mit der PFGE validiert. Sie beobachteten, dass
Stämme, die mit der MLST gruppiert wurden, auch ähnliche PFGE-Profile aufwiesen.
Ein großer Vorteil der MLST ist, dass der Stamm durch sein Allel-Profil definiert ist
und deshalb aus lediglich sieben Zahlen besteht. Diese Information lässt sich sehr leicht
mit elektronischen Medien über das Internet in die ganze Welt verbreiten. Somit werden
globale epidemiologische Daten vereinheitlicht und standardisiert. Diese Datenbank ist
unter folgender Internetadresse zugänglich „http://www.mlst.net“.
Nachteile der MLST sind die hohen Kosten und die aufwendige Ausstattung. Dessen
ungeachtet ist sie eine neue Technik, die auf Grund ihrer Standardisierbarkeit und
Reproduzierbarkeit zunehmend an Bedeutung gewinnen wird. Bis dato gilt jedoch die
PFGE als der Goldstandard (Enright et al., 2002; Kreiswirth et al., 1993; Maiden et al.,
1998; Trindade et al., 2003).
1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene
Expression
Infektionen mit S. aureus können jedes Organsystem betreffen und ohne eine
entsprechende Therapie nimmt die Letalität mit der Disseminierung des Erregers im
Wirtsorganismus zu. Durch die Sekretion von Toxinen ist es möglich, dass der Erreger,
auch ohne selbst Anschluss an die Blutbahn zu bekommen, bestimmte Syndrome
auslöst. Beispiele hierfür sind das Toxic-Schock-Syndrom und das „staphylococcal-
scalded-skin-syndrome“.
Die Fähigkeit, ein sehr breites Spektrum an Krankheiten zu verursachen und in vielen
verschiedenen Gewebetypen des Wirtes zu überleben, lässt sich auf die vielfältigen
Virulenzfaktoren zurückführen (Archer, 1998; Surette et al., 1999; Xiong et al., 2004),
wobei der Ausdruck Virulenzfaktor in diesem Zusammenhang sehr weit gefasst ist und
für jede Substanz gilt, die entweder vom Zytoplasma zur Zelloberfläche oder in die
Umgebung abgegeben wird und wenigstens hypothetisch am Krankheitsgeschehen
beteiligt ist (Projan und Novick, 1997).
14
Einleitung
Die Kombination von mehr als 40 verschiedenen extrazellulären Toxinen, Enzymen und
Zelloberflächen-Proteinen verleiht Staphylococcus aureus seine Pathogenität (Arvidson
und Tegmark, 2001).
Es lässt sich eine grobe Einteilung der Virulenzfaktoren vornehmen in:
1. Zellwandgebundene Oberflächenproteine:
Hierzu gehört zum Beispiel der „Clumping Factor“, ein zellwandständiges Protein
mit der Funktion eines Fibrinogenrezeptors, das die Bindung von Staphylokokken
im verletzten Gewebe, auf Kathetern und Implantaten ermöglicht. Protein A, ein
weiteres Oberflächenprotein, bindet an den Fc-Teil von IgG-Antikörpern, was die
Opsonierung und damit die Phagozytose verhindert.
2. Extrazelluläre Enzyme:
Die Koagulase ist das Hauptmerkmal für die Speziesbestimmung von S. aureus und
löst die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin aus, was zu der charakteristischen
Fibrinkapsel bei Abszessen führt. Ihr wird eine entscheidende Funktion bei der
Abgrenzung des Infektionsortes gegenüber der Umgebung zugeschrieben.
Die Staphylokinase, ein anderes extrazelluläres Enzym, erfüllt die entgegengesetzte
Funktion und löst das gebildete Fibrin wieder auf, wenn eine bestimmte Zelldichte
erreicht wird, die Nährstoffe knapp werden und eine Ausbreitung des Erregers
vorteilhaft für sein Überleben ist.
3. Toxine:
Hierzu zählen unter anderem die Enterotoxine, exfoliative Toxine, das Toxic-
Schock-Syndrom-Toxin und die Hämolysine. Es sind bisher vier
membranschädigende Hämolysine beziehungsweise Toxine, α-, β-, γ- und δ-
Hämolysin, bekannt. Da sie zytotoxisch sind, liegt ihre Funktion in der Invasion des
befallenen Gewebes. Einer der meist erforschten Virulenzfaktoren von
Staphylokokken ist das α-Hämolysin (α-Toxin). Durch die Entstehung von Poren in
Zellmembranen bewirkt α-Hämolysin eine Lyse von Erythrozyten. Ebenso werden
Phagozyten zerstört und die Phagozytose behindert. β-Hämolysin arbeitet wie eine
Sphingomyelinase und zerstört Membranen, die Sphingomyelin enthalten, wie die
von Erythrozyten (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Hahn et al., 2001; Lina et al.,
1997; Lowy, 1998; Projan und Novick, 1997; Wann et al., 2000; Xiong et al., 2004).
15
Einleitung
Es ist allgemein anerkannt, dass die Pathogenität eines S.-aureus-Stammes von der
Ausstattung mit Virulenzfaktoren abhängig ist. Diese Sicht wird unterstützt durch die
Entdeckung regulatorischer Mechanismen, die Oberflächenproteine, sezernierte
Proteine und Toxine steuern, denn neben der Fähigkeit zur Produktion von
Virulenzfaktoren nimmt die Regulation ihrer Expression während verschiedener Stadien
der Infektion eine Schlüsselrolle ein. So entsteht ein zeitlich konzertiertes Programm
der Expression dieser Faktoren, wodurch der Ablauf einer Infektion koordiniert wird.
Faktoren für die Adhäsion, Verteidigung und Invasion in das Gewebe, werden den
äußeren Bedingungen optimal angepasst, um das Überleben des Bakteriums zu sichern
(Projan und Novick, 1997).
Betrachtet man Ort, Funktion und Expression im zeitlichen Verlauf, lassen sich die
Virulenzfaktoren grob einteilen in Adhäsine und gewebezerstörende Enzyme
beziehungsweise Toxine (siehe oben). Die Adhäsine sind meist zellwandgebundene
Oberflächenproteine und werden mit der Phase der Kolonisierung des Wirtes assoziiert,
der exponentiellen Wachstumsphase.
Die gewebeabbauenden Enzyme und Toxine werden in der Mehrzahl der Fälle in die
Umgebung sezerniert und befinden sich extrazellulär. Sie werden mit Persistenz und
Invasion in Verbindung gebracht, was zeitlich der postexponentiellen Phase zuzuordnen
ist. Die Produktion der Virulenzfaktoren ist also gebunden an eine bestimmte
Wachstumsphase und abgestimmt auf die Umgebung (Novick et al., 1993; Projan und
Novick, 1997).
Globale Regulatorsysteme koordinieren die Expression der Virulenzfaktoren. Einer
dieser Regulatoren, agr, kontrolliert die Produktion von Virulenzfaktoren durch ein
regulatorisches RNA-Molekül (Arvidson und Tegmark, 2001) und soll im Folgenden
näher betrachtet werden.
16
Einleitung
1.4 Der agr-Genlocus
1.4.1 Globale Regulatorsyteme virulenzassoziierter Gene
Bakterien befinden sich in einem kontinuierlichen Prozess der Anpassung an sich
verändernde Umweltbedingungen. Signale vom Zytoplasma und aus der Umgebung
beeinflussen die zellulären Aktivitäten und vermitteln eine entsprechende Antwort
(Stock et al., 1989). Vermehren sich Bakterien exponentiell, ist ihr Metabolismus
schnell und effizient. In diesem Stadium werden bestimmte Regulatorsysteme so
koordiniert, dass eine konstante Wachstumsrate gewährleistet ist. Wird eine Kultur älter
und wächst langsamer oder stoppt ihr Wachstum auf Grund verschlechterter
Umweltbedingungen, werden andere als die vorherigen Regulatorsysteme aktiviert, um
dem zellulären Metabolismus ein Überleben auf lange Zeit zu sichern. Diese
Umstellung wird in der sogenannten postexponentiellen Phase eingeleitet. Ein
besonderes Merkmal dieser Phase ist die schnelle Synthese von nicht-essentiellen
Proteinen, von denen die meisten sezerniert werden. Bei grampositiven Bakterien, und
somit auch bei Staphylococcus aureus, handelt es sich vor allem um Enzyme, die
Biopolymere abbauen und so das Überleben, die Vermehrung und Ausbreitung im
infizierten Gewebe erleichtern (Balaban und Novick, 1995). Diese Exoproteine
erschließen für den bakteriellen Metabolismus neue Nahrungsquellen und würden
während der exponentiellen Wachstumsphase keinen Vorteil bringen, da ein
hinreichendes Nahrungsangebot besteht (Kornblum et al., 1991). Unter den optimalen
Wachstumsbedingungen der exponentiellen Phase werden vornehmlich
Oberflächenproteine, zum Beispiel Protein A, Koagulase und das Fibrinogen-
Bindeprotein synthetisiert, die eher für die Adhäsion eine wichtige Rolle spielen
(Arvidson, 1983). Das einzelne Bakterium muss somit den Zustand seiner Umwelt
wahrnehmen können und auf Änderungen der Umgebungsvariablen reagieren können,
um sein Überleben und das der eigenen Population zu sichern.
17
Einleitung
Abbildung 1: Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren Die zwei Komponenten dieses Systems sind das Protein mit der sensorischen Funktion, typischerweise in
der zytoplasmatischen Membran lokalisiert, und das Regulatorprotein. Das Sensor-Protein enthält eine
extrazelluläre Domäne für die Erfassung des Signals und eine intrazelluläre mit einer Histidin-Kinase.
Auf einen Stimulus hin, den die sensorische Komponente erfasst, wird die Histidin-Kinase direkt aktiviert
und es erfolgt eine Autophosphorylierung. Der Phosphatrest wird auf ein Regulatorprotein übertragen,
woraufhin es für die weitere Signalweiterleitung aktiviert wird und zur Transkription von Zielgenen führt.
Die Erkennung von Umweltsignalen und deren Übertragung in die Zelle erfolgt häufig
über sogenannte Zwei-Komponenten-Systeme von globalen Regulatoren, die den
wichtigsten Weg bakterieller Kommunikation untereinander und mit der Außenwelt
darstellen (siehe Abbildung 1). Ein Sensorprotein empfängt Signale aus der Umwelt.
Durch Phosphorylierung wird bei Erfassung des spezifischen Signals ein
Regulatorprotein aktiviert, woraufhin weitere Reaktionen in der Zelle ausgelöst werden
über welche die Transkription von Zielgenen gesteuert wird (Lyon et al., 2000, 2002;
Morschhäuser, 2000). Die Expression der meisten Virulenzfaktoren wird von
wenigstens einem gut charakterisierten globalen Regulator gesteuert (Ji et al., 1995).
18
Einleitung
Das agr-System ist solch ein Regulator von Staphylococcus aureus, bei dem das
spezifische Umweltsignal, was letztendlich die Expression der Zielgene veranlasst, die
Bakteriendichte ist. Hierbei sezernieren die Bakterien ein Peptid, das die interbakterielle
Kommunikation ermöglicht (Balaban et al., 2000).
1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme
Die Expression bestimmter bakterieller Eigenschaften ist nur dann sinnvoll, wenn eine
hohe Zelldichte vorhanden ist. Erreicht das spezifische Signal, in diesem Fall die
Bakteriendichte, einen Schwellenwert, dann werden -charakteristisch für ein globales
Regulatorsystem- eine Reihe unverbundener Gene aktiviert. Damit jedes einzelne
Bakterium die Dichte der Bakterienpopulation für eine koordinierte Genexpression
wahrnehmen kann, müssen die Bakterienzellen miteinander kommunizieren.
Quorum-sensing-Systeme vermitteln diese Kommunikation zwischen Bakterien durch
Signalmoleküle, sogenannte Pheromone oder Autoinducer mit einem geringen
Molekulargewicht, die in die Umgebung abgegeben werden. Durch Erfassung dieser
Signalmoleküle können die Bakterien die Zelldichte ihrer Population wahrnehmen und
die Expression von Virulenzgenen koordinieren (Morschhäuser, 2000; Winzer und
Williams, 2001). Der aus dem römischen Recht stammende Begriff „Quorum“
bezeichnet jene Teilnehmerzahl einer Versammlung, die mindestens erreicht sein muss,
um einen Beschluss zu fassen. Auf Bakterien übertragen meint Quorum die Anzahl der
Signalmoleküle, die zur Aktivierung der Genexpression von den Bakterien sezerniert
werden muss.
Diese Strategie setzt voraus, dass jede einzelne Bakterienzelle in der Lage ist, andere
Zellen der gleichen Spezies zu erkennen, deren Anzahl zu bestimmen und im Einklang
mit diesen bestimmte Genen zu exprimieren. Auf diesem Weg können die Bakterien ihr
Verhalten so aufeinander abstimmen, dass dem Wirt die Zeit fehlt, eine effektive
Verteidigung aufzubauen (Winzer und Williams, 2001). Sind die Exoproteine vieler
Bakterien zur gleichen Zeit an einem Fokus lokalisiert, haben sie einen viel größeren
Effekt, als wenn sie von nur wenigen Individuen zu verschiedenen Zeitpunkten
produziert werden.
19
Einleitung
Wundinfektionen durch Staphylococcus aureus sind oft durch große, mit Pus gefüllte
Läsionen gekennzeichnet, die Ausdruck eines konzertierten Zusammenwirkens vieler
Bakterien sind (Salyers und Whitt, 2002).
Für die koordinierte Genexpression verschiedener Bakterienzellen bedarf es eines
effektiven Signalmechanismus in Form des schon erwähnten Zwei-Komponenten-
Systems. Die Signaltransduktion beruht hierbei auf einem Phosphotransfer, somit ist das
entscheidende Mittel zur Informationsübertragung die Phosphorylierung. Die erste
Komponente, das Sensorprotein, ist eine Histidin-Proteinkinase (HPK), die bei vielen
dieser Systeme in der Zytoplasmamembran lokalisiert ist. Ihre N-terminale
Bindungsdomäne empfängt das Signal und überträgt es auf den C-Terminus (siehe
Abbildung 2). Es wird eine Phosphokinase aktiviert, die das Sensorprotein an einem
Histidin-Rest unter Verbauch von ATP (Adenosintriphosphat) phosphoryliert. ATP
wird zu ADP und stellt somit den Phosphatrest zur Verfügung, durch den die
Signalkaskade ermöglicht wird. Nach dieser Autophosphorylierung wird die
Phosphatgruppe vom Histidin des transmembranen Sensorproteins auf die Carboxyl-
Seitenkette eines Aspartat-Restes am N-Terminus der zweiten Komponente, dem
Regulatorprotein (response regulator), übertragen. Der C-Terminus des Sensorproteins
und der N-Terminus des Regulators, zwischen denen es zur Übertragung des
Phosphatrestes kommt, sind hoch konserviert. Durch Phosphorylierung des
Regulatorproteins wird seine C-terminale Domäne zu einem Aktivator, bindet in der
regulatorischen Region von Zielgenen und aktiviert oder reprimiert deren Transkription
(Kleerebezem et al., 1997; Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).
Im Fall des agr-Systems senden Bakterienzellen bestimmte Pheromone aus, die es
ihnen indirekt ermöglichen, die Zelldichte zu ermitteln. Bei Erreichen einer
Schwellenkonzentration von Pheromonen, die das entsprechende Signal für den Sensor
sind, kommt es zur Aktivierung der Signalkaskade, die, wie oben beschrieben, mittels
eines Phosphotransfers abläuft (Koenig et al., 2004; Qiu et al., 2005). Das Signal führt
beim agr-System einerseits dazu, dass bevorzugt Strukturgene für sezernierte
Virulenzfaktoren transkribiert werden, wie Hämolysine und Toxine, wohingegen
diejenigen für Oberflächenproteine nur noch abgeschwächt transkribiert werden;
andererseits werden über eine Feed-forward-Stimulierung die Proteine des
Signaltransduktionsweges selbst, einschließlich des Pheromons, vermehrt transkribiert.
20
Einleitung
Dies geschieht über einen anderen Promotor als die Transkription der Zielgene (siehe
Abbildung 2).
Abbildung 2: Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells Das Sensorprotein (sensor) empfängt das spezifische Signal und wird daraufhin an seinem Histidin-Rest
unter Verbrauch von ATP phosphoryliert. Das Phosphatmolekül wird auf das Regulatorprotein (response
regulator) übertragen. Nachfolgend aktiviert oder reprimiert der Regulator die Transkription von
Zielgenen. Zusätzlich werden die Proteine der Signaltransduktion über einen zweiten Promotor vermehrt
transkribiert. Hierzu gehört auch das Pheromon, beziehungsweise der Autoinducer, ein posttranslational
modifiziertes Protein, das aus einem größeren Peptid gebildet und über einen ABC- (ATP-binding
cassette-) Transporter sezerniert wird. Das Pheromon ist das Signal für das Sensorprotein und aktiviert
bei Bindung an diesen Sensor die Signalkaskade, sodass sich dieses System selbst verstärkt (aus
Kleerebezem et al., 1997).
Das Zwei-Komponenten-System hat als Signalweg in vielen Bakterien eine große
Bedeutung. Es steuert je nach Bakterium Vorgänge wie Chemotaxis, Osmoregulation,
Sporulation, Symbiosen und vieles mehr. Das agr-System von Staphylococcus aureus
kontrolliert die Expression von Virulenzfaktoren.
21
Einleitung
1.4.3. Aufbau und Funktion des agr-Genlocus
Die Expression des globalen Regulatorsystems agr von Staphylococcus aureus weist
eine starke Abhängigkeit vom Eintritt der Bakterien in die post-exponentielle
Wachstumsphase und der Aktivierung des Quorum-sensing-Systems über einen Zwei-
Komponenten-Signaltransduktionsweg auf (Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).
Sobald die Zellen das Ende der exponentiellen Wachstumsphase erreicht haben, wird
die Anzahl der Oberflächenproteine reduziert. Stattdessen werden gewebezerstörende
Proteine und Toxine vermehrt synthetisiert (Novick et al., 1995). Eine Zunahme der
Bakteriendichte führt demnach ab einem bestimmten Schwellenwert zur Up-Regulation
von sezernierten Virulenzfaktoren und der reziproken Down-Regulation von
Oberflächenproteinen. Startet man einen neuen Wachstumszyklus, indem man eine
Dilution der Bakterien mit einem neuen Medium durchführt, schalten die Bakterien
wieder um auf die vermehrte Synthese der Oberflächenproteine der exponentiellen
Phase (Peng et al., 1988).
Entdeckt wurde agr von Recsei et al. (1986) bei der Herstellung einer Mutante. Die
Insertion des Transposons Tn551 für die Erythromycin-Resistenz in das
Staphylococcus-aureus-Genom hatte einen weitreichenden Effekt auf die Expression
einiger extrazellulärer Proteine (siehe Abbildung 3). α-, β- und δ-Hämolysin, TSST-1
(Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-1) und die Staphylokinase wurden ungefähr um das
50fache reduziert, während Protein A um das circa 20fache anstieg. Das Transposon
musste somit ein Kontrollelement inaktiviert haben, das die Expression dieser Gene
steuert. Es wurde als agr (accessory gene regulator) bezeichnet (Recsei et al., 1986).
Der agr-Locus ist polycistronisch. Die transkribierte mRNA kodiert also für mehr als
ein Protein, wobei für jedes Protein ein eigenes Start- und Stoppsignal auf der mRNA
existiert (Stryer, 1988).
Der Genlocus agr besteht aus zwei divergierenden Operons, die von benachbarten,
jedoch nicht überschneidenden Promotoren, P2 und P3, transkribiert werden. Die
Sequenz des P2-Operons besteht aus vier offenen Leserahmen (ORFs, open reading
frames), agrA, -B, -C und -D (siehe Abbildung 3). Man geht davon aus, dass zwei
davon, agrA und agrC, die Proteine eines klassischen Zwei-Komponenten-
Signaltransduktionsweges kodieren.
22
Einleitung
Das Sensorprotein, die Histidin-spezifische Proteinkinase (HPK), wird vermutlich durch
den AgrC–Teil repräsentiert; agrA kodiert ein Protein, das dem Regulator (RR, response
regulator) und somit auch Aktivator der Zielgen-Transkription entsprechen könnte
(siehe Abbildung 4). Diese Annahme ist sehr verbreitet, allerdings bis zum jetzigen
Zeitpunkt noch nicht bewiesen.
Die Transkription von P2 beginnt an der Position 1750 der Nukleotidsequenz des agr-
Genlocus und es entsteht ein 3,5 kb (Kilobasen) langes Transkript, die RNA II (siehe
Abbildung 3). Die Transkription von P2 ist nur mit den Produkten des P2-Operons
möglich, sodass es sich hier um einen autokatalytischen Prozess handelt, der geeignet
ist, eine schnelle Produktion von Exoproteinen bei Stagnation des Bakterienwachstums
zu induzieren (Kornblum et al., 1991; Novick et al., 1993, 1995; Stock et al., 1989).
Abbildung 3: Transkription des polycistronischen agr-Locus Die Darstellung zeigt die Orte der drei Promotoren P1, P2, P3 und das ungefähre Ausmaß ihrer
Transkripte. Die RNA III, das Transkript des P3-Operons, wird in die gegensätzliche Richtung zu P1 und
P2 abgelesen. Außer der RNA III wird durch die ersten 160 Nukleotide des P3-Operons ein Toxin, das δ-
Hämolysin, kodiert. Entdeckt wurde agr bei der Herstellung einer Mutante durch Insertion des
Transposons Tn551 in agrA (aus Kornblum et al., 1991).
Das aus 0,5 kb bestehende Transkript des P3-Operons, die RNA III, beginnt an der
Position 1566 und wird in entgegengesetzter Richtung zum P2-Operon abgelesen. Die
ersten 160 Nukleotide enthalten oft die Sequenz für ein agr-reguliertes Protein, das δ-
Hämolysin (siehe Abbildung 3). Die RNA III ist aber das wesentliche Transkript, da sie
eine regulatorische RNA und daher selbst der eigentliche Effektor der agr-Antwort ist.
Sie kontrolliert in der postexponentiellen Wachstumsphase die Expression von
23
Einleitung
wenigstens 15 nicht miteinander verbundenen Exoprotein-Genen. Novick et al. (1993)
zeigten mit einem Klonierungsexperiment, dass allein die RNA III die gesamte
regulatorische Funktion des agr-Locus ersetzen kann und damit der agr-spezifische
Effektor für die Genregulation der Exoproteine in Staphylococcus aureus ist. Primär
beeinflusst die RNA III die Ebene der Zielgen-Transkription, jedoch hat sie in einigen
Fällen auch Einfluss auf die Translation. Auf welche Weise die RNA III die Zielgen-
Expression kontrolliert, ist bisher nicht bekannt (Kornblum et al., 1991; Novick et al.,
1993, 1995). Ein dritter Promotor, P1, befindet sich nahe des 5’-Endes von agrA und
zeigt nur wenig Aktivität. Er hat in etwa die gleiche Aktivität in agr+-Stämmen wie in
agr-defekten Stämmen. Zudem lässt sich kein Aktivitätsunterschied zwischen der
exponentiellen und postexponentiellen Wachstumsphase beobachten, sodass er von der
agr-Funktion unabhängig zu sein scheint. Seine Bedeutung innerhalb des agr-Systems
ist noch unbekannt. Er scheint -neben dem wesentlich stärkeren Promotor P2- die
Transkription des agrA-Gens zu regeln (Peng et al., 1988).
AgrA scheint die Rolle des Regulators und AgrC die des Sensorproteins in diesem
Zwei-Komponenten-System zu übernehmen (siehe Abbildung 4). Ji et al. (1995, 1997)
entschlüsselten die Funktion der Proteine AgrB und AgrD. Sie isolierten ein Oktapeptid
mit der Funktion des Quorum-sensing-Signalmoleküls, das sowohl die Transkription an
dem Promotor P2, als auch die am divergierenden Promotor P3 aktiviert. In der
postexponentiellen Wachstumsphase von Staphylococcus aureus akkumuliert es in der
Umgebung. Man geht davon aus, dass dieses Peptid (AIP, autoinducing peptide) aus
einem Fragment des agrD-Genproduktes gebildet wird, das von AgrB aus dem agrD-
Propeptid prozessiert und anschließend sezerniert wird. Das integrale Membranprotein
AgrB übernimmt demnach die Aufgabe eines modifizierenden Enzyms (Ji et al., 1995,
1997; van Leeuwen et al., 2000). Der genaue Mechanismus vom Vorläufer-Protein zum
funktionsfähigen Pheromon sowie die Interaktion von AgrB mit AgrD, ist bislang
unbekannt. Zhang et al. (2004) fanden heraus, dass das Propeptid AgrD für das agr-
Quorum-sensing-Signal (AIP) von S. aureus ein Membranprotein ist, dessen N-
terminale Region in die zytoplasmatische Membran integriert ist. Diese
Membranintegration ist notwendig, damit ein reifes AIP entstehen kann. Es wird
postuliert, dass dieses so entstandene Signalpeptid mit dem Transmembranrezeptor-
Protein eines klassischen Zwei-Komponenten-Regulatorsystems, AgrC, interagiert,
durch die Übertragung einer Phosphatgruppe den Regulator AgrA aktiviert und in
24
Einleitung
Verbindung mit einem zweiten Transkriptionsfaktor, SarA, die Transkription des P2-
und P3-Promotors triggert (Ji et al., 1995). Das AIP wird kontinuierlich sezerniert, zur
RNA III-Aktivierung kommt es -im Sinne des Quorum-sensing-Systems- jedoch erst,
wenn eine bestimmte Schwellendosis des AIP erreicht ist (Balaban und Novick, 1995).
Das Akronym AIP für „autoinducing peptide“ bezieht sich auf die funktionsfähigen
AgrD-Peptide, die schon von AgrB modifiziert wurden (Lyon et al., 2000).
Abbildung 4: Modell des agr-Systems von S. aureus Das P2-Operon kodiert neben AgrD, dem Vorläufer-Protein des autoinduzierenden Peptides (AIP), noch
drei weitere Proteine, nämlich AgrA, AgrB und AgrC. AgrB ist ein notwendiges Protein für die
Prozessierung von AgrD zum funktionsfähigen AIP. Dieses bindet dann an die extrazelluläre Domäne der
AgrC-Histidin-Proteinkinase, die daraufhin in der zytoplasmatischen Domäne eine Autophosphorylierung
erfährt. Der Phosphatrest wird vermutlich auf AgrA übertragen, das in seiner phosphorylierten Form
zusammen mit dem Protein SarA des globalen Regulators sar, die Promotoren P2 und P3 aktiviert. So
entsteht ein autoinduzierender Kreislauf, der über eine erhöhte RNA III-Transkription die Expression von
Oberflächenproteinen vermindert und die Anzahl der sezernierten Proteine erhöht (modifiziert nach
Novick, 1999).
Zusammenfassend gelten folgende Prinzipien für den Aufbau und die Funktion des agr-
Locus: Das P2-Operon kodiert in Form eines Oktapeptids seinen eigenen Aktivator
(AIP), der als Ligand an den Signalrezeptor bindet, welcher ebenfalls durch dasselbe
Operon kodiert wird. Die Hauptfunktion des Signal-Transduktionspfades ist die
Aktivierung seines eigenen Promotors P2 und die des divergierenden P3-Promotors.
25
Einleitung
Der Netto-Effekt dieser dualen Aktivierung ist eine schnelle RNA III-Expression auf
einem sehr hohen Level. Vermutlich ist die RNA III nicht besonders aktiv, sodass eine
hohe Konzentration benötigt wird. Das dichte-sensitive Merkmal dieses Systems
offenbart sich in der graduellen Akkumulation des Aktivators während der
Wachstumsphase und der plötzlichen Aktivierung bei Erreichen der Schwellendosis (Ji
et al., 1995).
1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus
Das AgrD-Peptid eines S.-aureus-Stammes aktiviert seinen eigenen agr-Locus und
inhibiert die agr-Expression anderer Stämme. Man nimmt an, dass dieser inhibitorische
Effekt auf andere Stämme vorteilhaft für die eigene Population und das Bakterium
selbst bezüglich Kolonisierungs- oder Infektionsort ist. Mayville et al. (1999) zeigten,
dass es diese Sequenzvariationen für agr tatsächlich gibt und zwar nicht nur für den
Autoinducer (AgrD), sondern auch für sein modifizierendes Protein (AgrB) und den
Rezeptor (AgrC). Dass diese drei Gene, agrD, agrB und agrC, von der
Sequenzvariation betroffen sind, stützt die Vorstellung, dass sie im Sinne eines Zwei-
Komponenten-Signaltransduktionsmechanismus zusammenwirken. Diese hypervariable
Region, agrBDC, besteht nicht aus den vollständigen drei Genen, sondern aus den C-
terminalen zwei Dritteln von agrB, dem kompletten agrD-Gen und der N-terminalen
Hälfte von agrC (siehe Abbildung 5) (Jarraud et al., 2000).
26
Einleitung
Abbildung 5: Hypervariable Region des agr-Genlocus Im oberen Teil des Schemas ist ein Shuttle-Vektor zu sehen, pRN7062, der zwei Segmente des agr-Locus
enthält, agrA und agrC sowie die P2- und P3-Region. Die C-terminalen zwei Drittel von agrB, das agrD-
Gen und die N-terminale Hälfte von agrC bilden die hypervariable Region des agr-Locus, welche die
Spezifität des Autoinducers und Rezeptors dieses Zwei-Komponenten-Systems ausmacht. Diese Gene für
das dichte-sensitive und sich selbst verstärkende Zwei-Komponenten-System liegen auf dem P2-Operon.
Der Effektor der Zielgen-Transkription, die RNA III, ist auf dem P3-Operon lokalisiert. Bei Bindung des
Autoinducers an den Rezeptor werden P2 und P3 aktiviert (aus Jarraud et al., 2000).
Auf der Basis dieser Autoinducer-Rezeptor-Spezifität, nämlich der
Aminosäurensequenz des AIP und des korrespondierenden Rezeptors, kann S. aureus in
vier verschiedene agr-Interferenzgruppen (I-IV) eingeteilt werden (siehe Material und
Methoden, Abbildung 8). Es gibt eine Besonderheit der Interferenzgruppe I des agr-
Genlocus, denn sie besitzt noch eine Subgruppe, Ia. Dies ist eine Variante, die sich von
I nur darin unterscheidet, dass ein Fragment aus 174 Basenpaaren fehlt und durch ein
anderes aus 270 bp ersetzt wurde (Papakyriacou et al., 2000). Innerhalb einer Gruppe
findet eine Kreuzaktivierung der agr-Antwort durch das autoinduzierende Peptid statt,
wohingegen die agr-Expression von anderen agr-Interferenzgruppen unterdrückt wird.
Dies bestätigte ein Vergleich der agrBDC-Sequenzen von S.-aureus-Stämmen, denn sie
waren innerhalb einer Gruppe identisch, verglichen mit den agrBDC-Sequenzen anderer
Gruppen wiesen sie aber deutliche Unterschiede auf (Ji et al., 1997). Lyon et al. (2000)
entdeckten, dass sowohl die Aktivierung innerhalb einer Gruppe als auch die
Inhibierung zwischen den Gruppen über den gruppenspezifischen AgrC-Rezeptor
vermittelt werden.
27
Einleitung
Jarraud et al. (2002) fanden die agr-Interferenzgruppe III gehäuft bei menstruellen
TSST- (Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-) Stämmen, wohingegen die Gruppen I und II
nicht bei bestimmten klinischen Symptomen gehäuft auftraten.
Sie entdeckten außerdem die vierte der bisher bekannten Interferenzgruppen, bei der das
AIP (autoinducing peptide) erwartungsgemäß deutliche Veränderungen zu dem der
Gruppen II und III aufwies. Verglichen mit dem Autoinducer der Interferenzgruppe I
zeigte sich jedoch bis auf den Austausch einer Aminosäure, Aspartat gegen Tyrosin,
kein Unterschied. Der agr-Locus der Gruppe IV ist demnach nahe verwandt mit dem
der Gruppe I. Diese Annahme stimmt mit der Beobachtung überein, dass die RNA III-
Synthese in Stämmen der agr-Gruppe I durch die Zugabe des Überstandes von S.
aureus der agr-Interferenzgruppe IV nicht gehemmt sondern stimuliert wird. Diese
Aktivierung erreichte ungefähr 30% der agr-Aktivierung, die bei Zusatz des
Überstandes der gleichen Interferenzgruppe (I) aufgetreten ist. Eine weitere
Besonderheit der agr-Interferenzgruppe IV ist ihre Korrelation zu S.-aureus-Stämmen,
die ein exfoliatives Toxin produzieren. Diese Korrelation ist aber nicht besonders eng,
da auch Stämme der Gruppen I und II exfoliative Toxine produzieren (Jarraud et al.,
2000).
1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies
Bei Staphylococcus epidermidis, der klinisch wichtigsten Koagulase-negativen Spezies,
konnte ebenfalls ein agr-System identifiziert werden, das bei der Wachstumsphasen-
abhängigen Regulation der Virulenzfaktoren eine zentrale Rolle spielt. Die Homologie
zwischen dem agr-Locus von S. aureus und S. epidermidis beträgt 68% (Kies et al.,
2003; Otto et al., 1998; van Wamel et al., 1995). Unter Staphylokokken wurde agr stark
konserviert. Studien der AIPs von Staphylococcus epidermidis haben im Allgemeinen
das bestätigt, was von ihnen bereits bei S. aureus bekannt ist (Kornblum et al., 1991;
Lyon et al., 2000; Otto, 2001; Otto et al., 1998, 1999). Dufour et al. (2002) fanden
durch Hybridisierung in mindestens 14 anderen Staphylokokken-Spezies oder
Subspezies Sequenzen, die mit dem agr-Regulon verwandt sind. Dieser
Regulationsmechanismus scheint somit unter Staphylokokken weit verbreitet zu sein.
28
Einleitung
1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar
Neben agr beeinflussen noch andere Regulatorsysteme die RNA III-Transkription. Der
sar- (staphylococcal accessory regulator-) Locus ist zum Beispiel ein weiterer
entscheidender Regulator. Er besteht aus drei überlappenden Transkripten, sarA, sarB
und sarC, die einer vom Wachstumszyklus abhängigen Regulation unterliegen, wobei
sarA und sarB in der frühen logarithmischen Wachstumsphase und sarC in der späten
stationären Phase die höchsten Konzentrationen zeigen. Sie werden von drei getrennten
Promotoren (P1, P2, P3) transkribiert; das Terminationssignal am 3’-Ende von allen
drei Transkripten ist jedoch identisch (Bayer et al., 1996). Das sarA-Transkript ist ein
regulatorisches Molekül, das die Expression der RNA II am Promotor P2 des agr-
Operon triggert und dadurch indirekt Einfluss auf die RNA III-Produktion nimmt
(Heinrichs et al., 1996).
Es wird angenommen, dass die beiden globalen Regulatoren agr und sar auf folgende
Weise interagieren:
Im Gegensatz zu agr aktiviert der sar-Locus sowohl die Synthese extrazellulärer als
auch Zellwand-assoziierter Proteine. SarA bindet zwischen der P2- und P3-
Promotorregion, der sogenannten Interpromotorregion. Die Bindungsstelle liegt
allerdings näher an P2, was die höhere Affinität zu diesem erklärt. Außerdem wirkt sich
eine sar-Mutation mehr auf die Transkription von RNA II als von RNA III aus (Chien
und Cheung, 1998). Es spricht vieles für die Annahme, dass sar den agr-Genlocus in
der Synthese von Exoproteinen kontrolliert.
Diese vereinfachte Darstellung wird dem komplexen Geflecht von Wechselwirkungen
zwischen agr und sar nicht gerecht. An dieser Stelle würde eine profundere Betrachtung
jedoch zu weit führen, zumal agr und sar nicht die einzigen Regulatorsysteme sind, die
Einfluss auf die Virulenzfaktorproduktion nehmen. Die Regulation der Synthese von
extrazellulären und Zellwand-assoziierten Proteinen von Staphylococcus aureus ist ein
äußerst komplexer und sorgfältig koordinierter Prozess, der von vielen Faktoren
beeinflusst wird. In diesem Netz von Interaktionen sind noch viele Wege unbekannt und
die jetzt schon bestehende Komplexität macht eine überschaubare Ansicht unmöglich
(Cheung und Projan, 1994; Cheung und Ying, 1994; Gertz et al., 2000; Heinrichs et al.,
1996; Smeltzer et al., 1993).
29
Einleitung
1.6 Fragestellung
Es gibt seit langem in vielen Ländern die Beobachtung, dass sich einige MRSA-Stämme
besonders erfolgreich, zum Teil weltweit ausbreiten und zu einem enormen
epidemiologischen Problem werden. Andere Stämme hingegen treten nur sporadisch in
Erscheinung und sind von untergeordneter klinischer Relevanz. Somit entstehen
weltweit Epidemien, die von wenigen MRSA-Stämmen verursacht werden. Dieser
epidemiologische Unterschied führt zu der Frage, was den epidemischen MRSA-
beziehungsweise S.-aureus-Stämmen die enorme Fähigkeit zur Ausbreitung verleiht.
Welche Faktoren sind daran beteiligt, dass ein Stamm epidemisch wird, sich schnell
über große Entfernungen ausbreitet und zu einem erheblichen klinischen Problem wird?
Dieses Phänomen ist bisher nur wenig erforscht.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Pathogenität eines S.-aureus-Stammes von seiner
Ausstattung mit Virulenzfaktoren abhängt. Neben der Fähigkeit zur Produktion von
Virulenzfaktoren ist auch die Regulation ihrer Expression in den verschiedenen
Infektionsstadien für die Pathogenität von entscheidender Bedeutung.
Papakyriacou et al. (2000) entdeckten zwei epidemische Stämme von S. aureus, die für
die Hälfte aller Infektionen in Kanada verantwortlich waren und einen einheitlichen
Phänotyp aufwiesen. Die Sekretion von Exoproteinen war bei ihnen begrenzt zu
Gunsten einer erhöhten Bindungsfähigkeit an Wirtszellproteine. Dieser spezielle
Phänotyp könnte der Grund sein für die starke Prävalenz dieser Stämme unter
klinischen Isolaten.
Durch seine regulatorische Funktion auf die Expression von Virulenzfaktoren und der
Variabilität seines zentralen Segmentes, agrBDC, könnte der agr-Genlocus einen
entscheidenden Einfluss auf die Epidemiologie von MRSA ausüben. Deshalb erscheint
es sinnvoll, hier nach einer Erklärung zu suchen. Die Entdeckung der agrBDC-
Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass möglicherweise ein bestimmter agr-
Interferenz-Typ mit Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden kann. Dies
sollte in der vorliegenden Arbeit genauer betrachtet werden.
30
Einleitung
Als Erstes galt es in dieser Studie herauszufinden, ob es in den untersuchten Kliniken
epidemische MRSA-Stämme gibt. Dazu wurden die MRSA-Isolate der
Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach
epidemiologischen Kriterien klassifiziert. Weiterhin sollten die in Bochum
vorherrschenden Stämme mit anerkannten nationalen und internationalen
Epidemiestämmen verglichen werden.
Nachfolgend sollte nach Auffälligkeiten in der Verteilung der MRSA-Stämme auf die
Kliniken gesucht werden, damit mögliche Zusammenhänge von MRSA-Klonen mit den
Kliniken hergestellt werden können. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht jedoch die
Suche nach einer Korrelation zwischen den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen
und den epidemiologischen Eigenschaften der MRSA-Stämme, denn der agr-Locus gilt
als eine mögliche Erklärung für das unterschiedliche epidemiologische Verhalten der
MRSA-Stämme. Die Erforschung der Regulatorsysteme und der bakteriellen
Kommunikation könnten für zukünftige therapeutische Entwicklungen von Bedeutung
sein.
31
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien waren von höchstem Reinheitsgrad und wurden, falls
nicht anders angegeben, von den Firmen Merck Eurolab (Darmstadt) und
Sigma/Aldrich (München) bezogen.
2.1.2 Stämme
Die für diese Arbeit ausgewählten MRSA- (Methicillin-resistente Staphylococcus
aureus-) Stämme waren klinische Isolate aus dem Institut für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum, zugesandt aus einer Gemeinschaftspraxis und 19
Kliniken Nordrhein-Westfalens, insbesondere aus Bochum und Städten der näheren
Umgebung (siehe Tabelle 1). Der Einfachheit halber werden im Folgenden 20 Kliniken
als Einsender beschrieben. Aus Gründen des Datenschutzes wurden die Kliniken selbst
nicht genannt, sondern durch Buchstaben gekennzeichnet. Insgesamt wurden in der Zeit
vom 13.02.1998 bis zum 31.12.2000 417 MRSA-Stämme in die Studie aufgenommen.
Bei einer nachfolgend durchgeführten Aktualisierung der Untersuchung stieg die
Anzahl der MRSA-Stämme um 744 auf 1161. Einige MRSA der Stammsammlung
blieben dabei unberücksichtigt, da sich deren einsendende Kliniken weit außerhalb des
Einzugsbereiches dieser Studie befinden oder nicht mehr sicher identifiziert werden
konnten.
Das Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum identifizierte im
Grampräparat alle Stämme als grampositive Kokken; der Nachweis von Katalase mit
H2O2 und der des Fibrinogenrezeptors mit dem Clumping-factor-Test (CF) waren
positiv. Bei nicht eindeutig zu differenzierenden Stämmen wurde zusätzlich das
VITEK-System (bioMerieux, Nürtingen) mit der GPI-Karte (gram-positiv identification
card) Nr. V 1305 eingesetzt.
32
Material und Methoden
Die als Kontrollstämme verwendeten S. aureus ATCC 38591 (Oxacillin-resistent) und
ATCC 25923 (Oxacillin-sensibel) sind Referenzstämme der „American Type Culture
Collection“.
Tabelle 1: Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden
KLINIK ANZAHL DER ISOLATE
A 360
B 294
C 110
D 81
E 37
F 34
G 34
H 33
I 26
J 26
K 22
L 13
M 18
N 18
O 14
P 12
Q 11
R 9
S 6
T 3
33
Material und Methoden
Die Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster der für diese Arbeit verwendeten
Stämme wurden mit denen folgender anerkannter epidemischer MRSA und MSSA
verglichen:
CMRSA-1A, -1B, -1D = -1E, -2A, -3A, -3B, -4 sind MRSA-Stämme des
Department of Microbiology, Sunnybrook and Women's College Health Science
Centre, Toronto, Ontario, Canada (Papakyriacou et al., 2000).
Diese MRSA wurden aus der Sammlung des Canadian Nosocomial Infection
Surveillance Program (CNISP) ausgewählt.
SA 441 (MRSA), 442 (MSSA), 456 (MRSA), 493 (MSSA), 506 (MRSA), 518
(MSSA), 553 (MSSA), 554 (MSSA) sind Stämme des Department of
Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center
(Booth et al., 2001). Da aus der genannten Publikation nicht eindeutig
hervorging, in welchem Fall es sich um MRSA handelt und in welchem um
MSSA, wurden die Stämme mit einer mecA-PCR (siehe Tabelle 2) näher
klassifiziert.
Diese PCR wurde wie in Abschnitt 2.2.4 beschrieben durchgeführt. Bei 96 °C wurde die
DNA 30 Sekunden denaturiert, die Primerbindung erfolgte in 30 Sekunden bei 50 °C
und die Elongation wurde für 40 Sekunden bei 72 °C durchgeführt. Der primär
abgelaufene Denaturierungsschritt dauerte 7 Minuten bei 95 °C und der terminale
Elongationsschritt 7 Minuten bei 72 °C. Es wurden insgesamt 30 Amplifikationszyklen
durchlaufen.
Tabelle 2: mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens
PRIMER SEQUENZ SEQUENZ-LÄNGE
mecA forward 5' -GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA- 3' 25
mecA reverse 5' -CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA- 3' 25
34
Material und Methoden
Um das Ergebnis der mecA-PCR zu überprüfen, folgte noch ein Oxacillin-Screening-
Test zum Nachweis der Oxacillin-Resistenz:
Dazu wurden 10 µl einer Bakteriensuspension der Dichte McFarland 0,5 auf Oxacillin-
Screeningplatten getropft und diese dann bei 30 °C bis zu zwei Tagen bebrütet
(NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standard, 1997).
Zur Kontrolle wurden die S.-aureus-Stämme ATCC 38591 (mecA-positiv) und ATCC
25923 (mecA-negativ) mitgetestet. Sowohl die mecA-PCR als auch der Oxacillin-
Screening-Test führten zu dem gleichen Ergebnis (siehe oben).
Des Weiteren wurden die PFGE-Muster mit denen europäischer MRSA
verglichen. Dazu gehörten sechs bekannte deutsche Epidemiestämme des
Nationalen Referenzzentrums für Staphylokokken am Robert Koch-Institut
(Bereich Wernigerode), ein österreichischer und ein englischer Epidemiestamm
(siehe Tabelle 3).
Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa
(nach Enright et al., 2002; Robert Koch-Institut, 2002)
Klonale Gruppe, Bezeichnung in D Internat.Kennziffer MLST-TYP Internationale Verteilung
„Süddeutscher“-Epidemiestamm ST 28 1-4-1-4-12-24-29 D,SL
„Berliner“-Epidemiestamm ST 45 10-14-8-6-10-3-2 B,Fin,D,S,Nl
„Barnimer“-Epidemiestamm = EMRSA 15 ST 22 7-6-1-5-8-8-6 D,Ir,UK,S
„Rhein-Hessen“-Epidemiestamm ST 5 1-4-1-4-12-1-10 F,Por,D,UK,US
„Hannoverscher“-Epidemiestamm ST 254 3-32-1-1-4-4-3 D,UK
„Norddeutscher“-Epidemiestamm ST 247 3-3-1-12-4-4-16 B,Fin,F,D,Por,Sp,Sl,S,UK,US
„Wiener“-Epidemiestamm ST 239 3-3-1-1-4-4-3 Fin,D,Gr,Ir,Nl,Pol,Sl,S,UK,US
EMRSA 16 ST 36 2-2-2-2-2-3-2 Fin,UK
B = Belgien, D = Deutschland, F = Frankreich, Fin = Finnland, Gr = Griechenland, Ir = Irland, Nl = Niederlande,
Pol = Polen, Por = Portugal, S = Schweden, Sl = Slowenien, UK = Großbritannien, US = USA
35
Material und Methoden
2.1.3 Kulturmedien und Puffer
Die S.-aureus-Stämme wurden auf Blutagarplatten (Columbia Agar-Basis mit Zusatz
von 4% defibriniertem Schafsblut, beides Oxoid) und in LB-Medium (Life
Technologies, Karlsruhe) angezüchtet.
TAE-Puffer x 1: 40mM Tris-acetat (pH=8,0), 1mM EDTA
TBE-Puffer x 0,5: 45mM Tris-borat (pH=8,0), 1mM EDTA
Lysepuffer: 20mM Tris-HCl (pH=8,0), 2mM EDTA,
1,2% Triton x 100, sterilfiltriert
2.1.4 Enzyme
Die in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsenzyme wurden bezogen von:
1. DraI mit dem React 1-Puffer x 10 von Life Technologies und
2. Taq-Polymerase mit dem PCR-Puffer x 10 von Amersham Pharmacia.
2.1.5 Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden bei MWG Biotech (Ebersberg) mit der
Reinheitsstufe HPSF synthetisiert.
Tabelle 4: Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens
PRIMER SEQUENZ SEQUENZ-LÄNGE POSITION
agr forward 5' -ACC AGT TTG CCA CGT ATC- 3' 18 1801-1818
agr reverse 5' -TAA ACC ACG ACC TTC ACC- 3' 18 3685-3668
Die ausgewählten Primer-Sequenzen beginnen 25 Nukleotide vor dem 5’-Ende der
agrB-kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide nach dem 3’-Ende der agrC-kodierenden
Sequenz und enthalten somit die hypervariable Region.
Die Auswahl der Primer erfolgte nach den Angaben von Papakyriacou et al. (2000).
36
Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien
anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster
Die in dieser Arbeit verwendeten Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus
(MRSA) wurden anhand der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) nach der Methode von
Goering und Winters (1992) typisiert. Das Restriktionsenzym Sma I hat sich für diese
Methode der Makrorestriktion von Staphylococcus aureus als besonders nützlich
erwiesen und wurde dementsprechend eingesetzt. Die Anzahl der entstehenden
Restriktionsfragmente beläuft sich auf 12 bis 20 mit einer Fragmentgröße von 10 bis
700 Kilobasen (Tenover et al., 1995).
Mit der Software Molecular-Analyst der Firma Bio-Rad wurden die PFGE-Muster auf
ihren Verwandtschaftsgrad hin überprüft (siehe Abbildung 6). Hierzu konnte eine
Cluster-Analyse der PFGE-Muster mit verschiedenen Algorithmen durchgeführt
werden: Der Pearson’sche Korrelationskoeffizient ist von definierten Banden
unabhängig und reflektiert den linearen Zusammenhang zweier quantitativer Merkmale.
Des Weiteren standen vier verschiedene, von definierten Banden abhängige
Koeffizienten zur Auswahl. Einer dieser bandenbasierten Koeffizienten, der
Algorithmus Jeffrey’s x coefficient, wurde für die Cluster-Analyse zur Berechnung der
Verwandschaft von Bandenmustern verwendet. Zusätzlich wurde der Cluster-
Algorithmus Ward verwendet (siehe Abbildung 6).
Es erfolgte eine anschließende Kontrolle und gegebenenfalls Korrektur der durch die
Algorithmen errechneten Verwandtschaftsgrade nach den Konsensus-Leitlinien zur
Interpretation von PFGE-Mustern chromosomaler DNA (Tenover et al., 1995).
Diesen Kriterien zufolge wurden Isolate mit gleichen oder nah verwandten PFGE-
Mustern in einer PFGE-Gruppe zusammengefasst.
37
Material und Methoden
Abbildung 6: Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software
Das Dendrogramm veranschaulicht den Verwandtschaftsgrad der Bandenmuster,
errechnet mit Jeffrey’s x coefficient.
Durch Aktivierung der Option „global optimization“ wurde ein durchschnittliches
Bandenmuster errechnet und die Banden innerhalb vorgegebener Grenzen soweit
verschoben, bis sie die höchste Korrelation mit diesem Durchschnittsmuster aufwiesen.
Damit wurden kleinste Linienunterschiede der zu vergleichenden Bandenlinien
herausgefiltert (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Optimization
Zwei identische Bandenmuster werden in der linken Abbildung nicht exakt nebeneinander dargestellt und
somit nicht als gleich erkannt. Durch die Optimierung werden die Bandenlinien einander angeglichen und
als gleich identifiziert (aus Instruction Manual, Molecular Analyst Fingerprinting Software).
38
Material und Methoden
2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen
Eigenschaften „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“
Isolate mit identischen oder nahezu identischen Pulsfeldgelelektrophorese-Mustern
wurden in einer PFGE-Gruppe zusammengefasst. Auf diese Weise entstanden Gruppen
mit sehr vielen Isolaten, solche, die wenige oder nur zwei Isolate enthielten, und solche,
die in dieser Stammsammlung einzigartig waren. Somit lässt sich eine Klassifizierung
vornehmen in häufig, selten oder nur ein Mal vorkommende Stämme. Die in dieser
Arbeit gewählte Nomenklatur für die epidemiologische Zuordnung der PFGE-Gruppen
ist „epidemisch“ und „unklar“. Für die nur ein Mal in der Sammlung aufgetretenen
Stämme fand die Bezeichnung „sporadisch“ Verwendung. Als „endemisch“ lassen sich
diese Stämme nicht ohne Zweifel benennen, da nicht sicher auszuschließen ist, dass sie
noch außerhalb von Bochum und der näheren Umgebung vorkommen. Da es für
infektionsepidemiologische Untersuchungen in der Literatur keine eindeutige Definition
der Begriffe „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“ gibt, wurde für die 1161
Bochumer Stämme eine Operationalisierung vorgenommen. Eine PFGE-Gruppe, die 20
oder mehr Isolate aus mindestens zwei verschiedenen Krankenhäusern enthielt, galt als
epidemisch. Gruppen mit mindestens zwei und weniger als 20 Isolaten konnten zum
gegebenen Zeitpunkt nicht als epidemisch oder sporadisch klassifiziert werden und
erhielten deshalb die Bezeichnung unklar. Durch weitere Untersuchungen zu einem
späteren Zeitpunkt lassen sich möglicherweise noch einige dieser Gruppen als
epidemisch einstufen. Bei nur ein Mal aufgetretenen PFGE-Mustern, ohne nähere
Verwandtschaft zu anderen, galten die Stämme als sporadisch.
2.2.3 DNA-Präparation
Genomische DNA von S. aureus wurde mit dem DNeasy Kit der Firma Qiagen (Hilden)
hergestellt; dabei wurde wie folgt vorgegangen:
Jeweils eine Kolonie eines auf Blutagar angezüchteten MRSA wurde in 5 ml LB-
Boullion gegeben und über Nacht bei 37 °C und 130 Rotationen pro Minute in einem
Schüttelinkubator (Innova 4330, New Brunswick Scientific) inkubiert.
39
Material und Methoden
Von dieser Bakteriensuspension wurden 2 ml in ein Eppendorfgefäß pipettiert und eine
Minute bei 16060 x g in einer Mikroliterzentrifuge (Heraeus Biofuge Pico, Kendro
Laboratory Products) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in
170 µl Lysepuffer resuspendiert. Außerdem wurden 20 µl Lysozym (10 mg/ml) und 10
µl Lysostaphin (1 mg/ml) hinzugegeben. Der Ansatz wurde für 30 Minuten bei 37 °C
inkubiert.
Nachfolgend wurden 25 µl der im Kit enthaltenen Proteinase K, 20 µl RNAse (20
mg/ml), 210 µl Ethanol (99,8%) und die vorgeschriebenen Puffer an entsprechender
Stelle hinzugefügt. Die Lösung wurde direkt auf eine spezielle Filtersäule gegeben,
unter welcher sich ein 2-ml-Gefäß befand, und eine Minute bei 6000 x g zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und es folgten zwei Waschschritte, bei denen jeweils
ein Puffer hinzugefügt und mit den oben genannten Filtersäulen eine Minute bei 6000 x
g zentrifugiert wurde. Nach jedem Waschschritt wurde der Überstand verworfen.
Daraufhin folgte ein zweiminütiger Zentrifugationsschritt bei 16060 x g ohne Zugabe
eines Puffers, der Überstand wurde anschließend wiederum verworfen. Nachfolgend
wurden 200 µl einer Pufferlösung zugegeben, die Lösung dann eine Minute bei 6000 x
g zentrifugiert und von dem verdünnten Eluat (1:10) eine PCR angefertigt.
2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR wurde in einem „Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler“ durchgeführt. In einer
Standardreaktion wurden 100 pmol von jedem Primer, 20 pmol von jedem
Desoxynukleotid und 2,5 U Taq-Polymerase eingesetzt. Als Ziel-DNA wurden von der
genomischen DNA circa 30 ng pro Reaktion zugefügt. Es wurde ein Ansatz hergestellt,
der insgesamt 100 µl je Probe für die PCR betrug.
Die DNA wurde für 30 Sekunden bei 94 °C denaturiert, die Primerbindung erfolgte in
30 Sekunden bei einer Annealing-Temperatur von 55 °C, die Kettenverlängerung
(Elongation) wurde für 1 Minute bei 72 °C durchgeführt. Die PCR begann mit einem
Denaturierungsschritt (5 Minuten bei 94 °C) und endete mit einem Elongationsschritt (7
Minuten bei 72 °C), dazwischen lagen 30 Amplifikationszyklen.
40
Material und Methoden
2.2.5 Agarosegelelektrophorese
In einem 10 µl-Ansatz wurden 5 µl des jeweiligen PCR-Produktes (200-250 ng DNA)
mit 5 µl verdünntem (1:5) Stopp-Mix (50% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau) versetzt
und durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel (Spezialagarose für die
Elektrophorese von Nukleinsäuren > 500 bp, Biozym agarose) in TAE-Puffer
aufgetrennt (8 Volt/ cm). Jedes Gel enthielt außer den Proben noch einen
Molekulargewicht-Längenstandard und eine Negativ-Probe. Das Molekulargewicht
konnte anhand dieses Standards, der 1 kb-ladder (Life Technologies), beurteilt werden
und betrug bei erfolgreicher Durchführung 1884 kb. Das Gel wurde ungefähr 15
Minuten in Ethidiumbromidlösung gefärbt, mit H2O von Ethidiumbromidresten befreit
und im UV-Licht fotografiert. Dazu diente die Polaroid-Kamera DS 34, ausgestattet mit
einem UV-Filter und eingestellt auf die Blendenzahl 8 bei der Belichtungszeit 4 (1/4
Sekunde).
2.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte
Zur Aufreinigung der durch das Agarosegel nachgewiesenen Amplifikate wurde das
„QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen) verwendet und entsprechend des Protokolls
verfahren: 500 µl des PB-Puffers wurden mit den 100 µl PCR-Produkt vermischt, über
eine QIAquick-Filter-Säule gegeben und eine Minute bei 16060 x g zentrifugiert. Die
folgenden Zentrifugationsschritte dauerten ebenfalls eine Minute und es wurde auch
hier auf 16060 x g beschleunigt. Der Überstand wurde verworfen, 0,75 ml des PE-
Puffers hinzugefügt und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt wurde anschließend ohne
Zugabe eines Puffers wiederholt. Zuletzt wurden 50 µl EB-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH
8,5) auf die QIAquick-Filter-Säule gegeben und nach anschließender Zentrifugation
konnten 50 µl aufgereinigte DNA in ein Eppendorfgefäß eluiert werden.
Mit einem erneuten Kontrollgel (siehe 2.2.5) wurde diesmal die gereinigte DNA
nachgewiesen (1884 kb).
41
Material und Methoden
2.2.7 Restriktionsanalyse
Ein 10 µl Ansatz mit 8,5 µl gereinigter DNA (24-29 ng), 0,5 µl des Restriktionsenzyms
DraI (1,250 U; 10 U/µl) und 1 µl Enzympuffer wurde für 16-18 Stunden bei 37 °C
inkubiert. DraI schneidet einen Abschnitt heraus, der 25 Nukleotide vom 5’-Ende der
agrB kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide vom 3’-Ende der agrC kodierenden
Sequenz entfernt ist und somit die hypervariable Region enthält (Papakyriacou et al.,
2000).
Anschließend wurde ein Tropfen unverdünnter Stopp-Mix (50% Glycerin, 0,25%
Bromphenolblau) zugegeben und die Restriktionsfragmente durch Elektrophorese in
einem 2%igen mit Ethidiumbromid versetzten Agarosegel (small dna low melt,
Spezialagarose für die Elektrophorese von Nukleinsäuren < 1 kbp, Biozym agarose) in
TBE-Puffer nachgewiesen (6 Volt/cm). Der Molekulargewicht-Längenstandard
„molecular weight standard VIII“ (Roche) wurde zur Bestimmung der Fragmentgröße
eingesetzt. Nachdem das Gel mit der Polaroid-Kamera wie in Abschnitt 2.2.5
beschrieben fotografiert worden war, erfolgte zusätzlich ein Scan-Vorgang. Das Gel
wurde dabei mit dem „Fluor-STM Multi-Imager“ (Bio-Rad) und der zugehörigen
Software „Multi-Analyst“ (Bio-Rad) im UV-Licht mit dem Filter „520 nm Long Pass
Ethidiumbromide“ gescannt.
Die eingestellte Belichtungszeit variierte je nach Gel zwischen 30 Sekunden und 2
Minuten. Es wurde, abhängig vom jeweiligen Gel, entweder mit der Option „High
Resolution“ oder „High Sensitivity“ gescannt, die Scan-Breite betrug 80 mm oder 160
mm.
Die hier beschriebene Erfassung der
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP)
der hypervariablen Region des agr-Locus führte zu den
in der Literatur beschriebenen vier verschiedenen
Bandenmustern (Jarraud et al., 2000; Papakyriacou et
al., 2000).
Abbildung 8: Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus
Zu erkennen sind fünf verschiedene RFLP-Muster, wobei Ia als Subgruppe von I gilt, da sich diese beiden
nur geringfügig in ihren Bandenmustern unterscheiden.
42
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, der Frage nachzugehen, warum bestimmte
MRSA (Methicillin-resistente Staphylococcus aureus) epidemisch sind, sich über große
Entfernungen und manche sich sogar weltweit innerhalb kurzer Zeit ausbreiten können,
wohingegen andere MRSA-Stämme anscheinend nicht über diese Fähigkeit verfügen
und nur selten oder ein Mal in einem geographisch begrenzten Bereich auftreten. Um
der Antwort näher zu kommen, wurde eine von vielen möglichen Erklärungen dieses
Phänomens, die Variabilität des agr-Genlocus, genauer untersucht.
Das Vorgehen lässt sich in vier Punkten zusammenfassen:
1. Es wurde ermittelt, welche MRSA, eingesandt aus 20 Kliniken Nordrhein-
Westfalens mit Konzentration auf die Stadt Bochum und Umgebung, häufig und
welche bisher selten oder nur ein Mal im Untersuchungsmaterial von Patienten
dieser Krankenhäuser auftraten. Um epidemische von sporadischen Stämmen
abzugrenzen, wurden von allen Isolaten Pulsfeldgelelektrophorese-
Untersuchungen durchgeführt. Diejenigen, deren Pulsfeldgel-Muster sehr
ähnlich oder identisch waren (Tenover et al., 1995), wurden in Gruppen
zusammengefasst, sodass die Häufigkeit, mit der ein Stamm klinisch auftrat, der
Anzahl der Isolate in einer Gruppe entsprach. Pulsfeldgelelektrophorese-
(PFGE-) Gruppen einer bestimmten Größe (≥ 20 Isolate) wurden als
„epidemisch“ definiert. Diejenigen, die mindestens zwei und weniger als 20
Isolate aufwiesen, erhielten die Bezeichnung „unklar“. Isolate, deren Muster in
der Stammsammlung einzigartig waren, wurden als „sporadisch“ eingeordnet
(siehe Material und Methoden 2.2.2).
2. Anschließend wurde die Stammsammlung des Instituts für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum mit bereits bekannten nationalen und
internationalen Epidemiestämmen verglichen, wobei auch hier die
Bandenmuster der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) zur Bestimmung des
Verwandtschaftsgrades herangezogen wurden.
43
Ergebnisse
3. Für jede PFGE-Gruppe wurde ermittelt, von wie vielen und von welchen
Kliniken die MRSA-Isolate eingesandt wurden. Nachfolgend wurde für die vier
Kliniken, von denen mehr als 100 Isolate eingeschickt wurden, die Verteilung
ihrer MRSA-Isolate auf die PFGE-Gruppen dargestellt.
4. Den Schwerpunkt der Arbeit bildet die Suche nach einem Zusammenhang
zwischen den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen und den
epidemiologischen Eigenschaften der MRSA-Stämme (epidemisch, unklar,
sporadisch). Dazu war es erforderlich, die agr-Interferenzmuster sämtlicher
sporadischer Isolate zu erfassen. Von den auf Grund ähnlicher PFGE-Muster in
Gruppen (epidemisch oder unklar) zusammengefassten Isolaten wurden nur
Stichproben aus jeder Gruppe zur Restriktionsanalyse herangezogen, da davon
auszugehen ist, dass die nahe verwandten Isolate innerhalb einer PFGE-Gruppe
auch zur gleichen agr-Interferenzgruppe gehören. Zudem stellt die
Pulsfeldgelelektrophorese im Vergleich zur Analyse der Restriktionsfragment-
längen-Polymorphismen der hypervariablen Region des agr-Genlocus die
wesentlich diskriminativere Methode dar.
3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit
Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung
3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für
Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres
klinischen Auftretens
Es wurden 417 MRSA-Isolate in die Studie eingeschlossen, die von Februar 1998 bis
Dezember 2000 in die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie
aufgenommen wurden. Das älteste Isolat stammt vom 13.02.1998 und trägt die
Dauerkultur-Nummer 1. Das Untersuchungsmaterial stammt aus 20 Krankenhäusern in
Nordrhein-Westfalen, hauptsächlich aus Bochum und Umgebung.
Da die Einsender zumeist Universitätskliniken oder akademische Lehrkrankenhäuser
sind, kann von einem breiten Spektrum an Grunderkrankungen ausgegangen werden.
44
Ergebnisse
Um herauszufinden, ob es auch in Bochum und im näheren Umfeld epidemische
MRSA-Stämme gibt, die häufig und in verschiedenen Krankenhäusern auftreten,
mussten die Isolate der Stammsammlung nach bestimmten Kriterien geordnet werden:
Anhand der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Bandenmuster der 417 MRSA-Isolate
wurde durch Anwendung entsprechender Software der Verwandtschaftsgrad der Isolate
errechnet. Danach bedurfte es einer manuellen Kontrolle und Korrektur des
rechnergestützten Ergebnisses mit Hilfe der Konsensus-Leitlinien zur Interpretation von
PFGE-Mustern (Tenover et al., 1995). Gleiche oder sehr ähnliche Bandenmuster
wurden zu einer PFGE-Gruppe zusammengefasst (siehe Material und Methoden 2.2.1
und 2.2.2). Auf diesem Weg ergab sich eine Einteilung der 417 Isolate in 22
verschiedene PFGE-Gruppen. Die Bandenmuster von 37 Isolaten entsprachen keinem
der anderen Stämme, was vermuten lässt, dass diese Isolate für sich stehen und
innerhalb der Stammsammlung keinen oder einen nur sehr geringen
Verwandtschaftsgrad zu anderen Isolaten aufweisen, sodass sie als „sporadisch“
klassifiziert wurden (siehe Abbildung 9).
45
Ergebnisse
21
13
39
34
52
39
68
12
42
34
1211
43
3 3 3 4
11
6 53 2 2 2 2 2
37
20
10
20
30
40
50
60
Isolate pro
Gruppe
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
PFGE - Gruppen
= unklar = sporadisch= epidemisch
Abbildung 9: Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster
(Stand der Stammsammlung: 31.12.2000)
Die insgesamt sieben rot markierten Säulen stehen für die PFGE-Gruppen, in denen sich mindestens 20
Isolate befinden und die deshalb als epidemisch klassifiziert wurden. Die 22 blauen Säulen symbolisieren
die unklaren PFGE-Gruppen, in denen sich mindestens zwei und höchstens 19 Isolate befinden, deren
epidemiologisches Verhalten somit zum Zeitpunkt der Datenerhebung nicht ausreichend erfassbar war.
Die Bandenmuster von 37 Isolaten konnten keiner Gruppe zugeordnet werden und gelten als sporadisch.
Einige PFGE-Gruppen sind ohne Isolate dargestellt, da sie erst in einem späteren Untersuchungszeitraum
entstanden sind (01.01.2001–12.01.2004) und deshalb hier nur eine Platzhalterfunktion einnehmen. Diese
Gruppen sind in der aktualisierten Fassung des Diagramms (siehe Abbildung 10) von Bedeutung.
Nach den oben genannten Kriterien ergaben sich sieben epidemische Gruppen mit 20
oder mehr Isolaten, von denen die meisten der PFGE-Gruppe 6 (52 MRSA) angehörten.
Insgesamt wurde der Großteil des Kollektivs mit 262 Isolaten (62,8%) den
epidemischen Gruppen zugeordnet. Bei 22 PFGE-Gruppen mit insgesamt 118 Isolaten
(28,3%) war zum damaligen Zeitpunkt keine Klassifikation in epidemisch oder
sporadisch möglich, ihre Zuordnung blieb somit unklar. 37 Isolate (8,9%) wiesen mit
anderen PFGE-Mustern keine Übereinstimmung auf und waren demnach sporadisch
(siehe Tabelle 5). Sie wurden für die Abbildungen als Gruppe 34 zusammengefasst.
46
Ergebnisse
Tabelle 5: Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000)
Im Folgenden sind die Kriterien zur Operationalisierung der Begriffe „epidemisch“, „unklar“ und
„sporadisch“ aufgeführt (siehe Material und Methoden 2.2.2), wobei „N“ für die Anzahl der Isolate steht.
Des Weiteren wird aus der Tabelle ersichtlich, wie viele Isolate den jeweiligen Eigenschaften absolut und
in Prozent bis zum 31.12.2000 zugeordnet werden konnten.
EPIDEMIOLOGISCHE KLASSIFIKATION DER 417 ISOLATE
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1
(insgesamt: 262) (insgesamt: 118) (insgesamt: 37)
62,8 % 28,3 % 8,9 %
3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004
Da sich die bisher dargestellten Ergebnisse auf den knapp dreijährigen Zeitraum vom
13.02.1998 bis 31.12.2000 beziehen und die Stammsammlung des Instituts für
Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum regelmäßig mit neuen Isolaten erweitert
wird, erfolgte eine zweite Analyse der Daten bis zum Monat Januar des Jahres 2004.
Der gesamte Beobachtungszeitraum dieser Studie beläuft sich somit auf knapp sechs
Jahre. Das erste Isolat der Stammsammlung wurde am 13.02.1998 als Dauerkultur
angelegt. Am 21.01.2004 fand das letzte MRSA-Isolat Eingang in diese Studie.
Die bis Ende 2000 in die Auswertung eingegangenen 417 Isolate waren von Januar
2001 bis Januar 2004 um 744 auf 1161 Isolate angestiegen. Die zwei
Beobachtungszeiträume ließen Aussagen über die zeitliche Entwicklung der Stämme
zu. Außerdem konnten gewisse Trends in der epidemiologischen Klassifikation der
MRSA, die sich in der Zeit vom 13.02.1998 bis 31.12.2000 abzeichneten, bis zum
12.01.2004 weiterverfolgt werden. So entstanden aus sporadischen Stämmen durch die
Erweiterung der MRSA-Sammlung neue PFGE-Gruppen, einige unklare Gruppen
entwickelten sich zu epidemischen Gruppen weiter wohingegen sich andere kaum oder
gar nicht verändert haben (siehe Abbildung 10 und Tabelle 6).
47
Ergebnisse
Kana
da (C
MR
SA 3
A &
3B)
USA
(SA
506)
& K
anad
a (C
MR
SA 4
) & U
K (E
MR
SA 1
6)
Berli
ner-E
.
USA
(SA
456)
& K
anad
a (C
MR
SA 2
A)
20
2
13
36
39
56
2
33
1
Han
nove
rsch
er- E
. Sü
ddeu
tsch
er-E
.
52
9
39
119
61
8
16
121
4
54
2
34
156
12
4
11
43
68
3 32
11
3 41 11
3
6 51
3 2 2
7
2 22
2 2
33
26
1
136
4 6 2 2 11
22
12
212
2 2 2 2
4 6 2 2 2 4 3 2 12 2 2 2 2 3 5 2 3 5 14 6 6 3 2 9 2 4 0 2 0 2 59 137 111 16 11 7 24 13 58 2 190 22 49 95 2 34 61 157Gesamtzahl der Isolate pro Gruppe (insgesamt: 1161)
47 48 45 4643 4441 4239 4037 3835 3633 3431 3229 3027 28 25 26 23 2421 2219 2017 1815 1613 1411 129 107 85 63 41 2
20
Isolate
oprGruppe
200
180
160
140
120
100
80
60
40
0
Sporadisch: 01.01.2001 - 12.01.2004Sporadisch: 13.02.1998 - 31.12.2000
Unklar: 01.01.2001 - 12.01.2004Unklar: 13.02.1998 - 31.12.2000
Epidemisch: 01.01.2001 – 12.01.2004Epidemisch: 13.02.1998 – 31.12.2000
PFGE-Gruppen
48
Ergebnisse
Abbildung 10: Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer
MRSA-Stammsammlung
Angelehnt an Abbildung 9 wurde in diesem Diagramm der Zeitraum der Datenerfassung bis Januar 2004
erweitert und PFGE-Muster-Übereinstimmungen einiger Gruppen mit anerkannten Epidemiestämmen
ergänzt. Durch unterschiedliche Farbkodierung der beiden Beobachtungszeiträume wird die zeitliche
Entwicklung der Gruppen veranschaulicht.
Die im zweiten Beobachtungszeitraum (01.01.2001–12.01.2004) um 744 Isolate
erweiterte MRSA-Stammsammlung enthielt 22 neue sporadische Stämme, 46
zusätzliche Isolate bei den unklaren und 676 bei den epidemischen Gruppen. Das führte
zu einem Anstieg der PFGE-Gruppen (epidemisch und unklar) von vormals 29 auf 45
und der sporadischen Stämme von 37 auf 59. Die Gruppe 34 stellt im eigentlichen Sinn
keine PFGE-Gruppe dar, sondern symbolisiert die sporadischen Stämme.
Innerhalb der einzelnen PFGE-Gruppen ließen sich mit zunehmender Gruppengröße oft
mehrere Subgruppierungen bilden, die aus Gründen der Übersichtlichkeit jedoch im
Weiteren unerwähnt bleiben. Die Gruppen 30 und 32 wurden in dieser Arbeit nicht
berücksichtigt (siehe Abbildung 10), da sich die Einsender der Isolate weit außerhalb
des Einzugsbereichs dieser Studie befinden.
Besonders ausgeprägt war beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume der
Anstieg der epidemischen Stämme, deren Anteil am gesamten Spektrum von vormals
62,8% auf 80,8% angestiegen war. Der Anteil der unklaren Stämme sank von 28,3% auf
14,1% und derjenige der sporadischen Stämme fiel von 8,9% auf 5,1% (siehe Tabellen
5 und 6).
Tabelle 6: Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004
Beim Vergleich der Ergebnisse der Tabellen 5 und 6 fällt im zeitlichen Verlauf eine prozentuale Zunahme
des epidemischen Anteils von Stämmen am Gesamtvorkommen auf, und zwar von 62,8% auf 80,8%.
Gegenläufig verhalten sich die unklaren Gruppen, deren Anzahl an Isolaten insgesamt weniger stark
anstieg. Ihr Anteil sank von 29,3% auf 14,1%. Der Anteil der sporadischen Stämme nahm ebenfalls von
8,9% auf 5,1% ab.
EPIDEMIOLOGISCHE KLASSIFIKATION DER 1161 ISOLATE
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1
(insgesamt: 938) (insgesamt: 164) (insgesamt: 59)
80,8 % 14,1 % 5,1 %
49
Ergebnisse
Mit 676 zusätzlichen Isolaten ist bei den epidemischen MRSA-Stämmen der größte
Anstieg zu erkennen. Die Anzahl der epidemischen PFGE-Gruppen ist von ursprünglich
7 auf 11 angestiegen und die der unklaren Gruppen von 22 auf 45.
Im Verlauf der gesamten Studie konnten bei einigen Gruppen deutliche Veränderungen
beobachtet werden. Einige von ihnen zählten im ersten etwa dreijährigen
Beobachtungszeitraum (13.02.1998–31.12.2000) zu den unklaren Gruppen und sind
durch deutlichen Anstieg von Isolaten während der folgenden dreijährigen
Datenerfassung (01.01.2001–12.01.2004) epidemisch geworden (Gruppen 2, 9 und 11).
Die Gruppe 35, mit 137 Isolaten der drittgrößte epidemische MRSA-Stamm, ist sogar
erst im zweiten Beobachtungszeitraum entstanden. Vorher gab es nur ein Isolat mit
diesem Muster, das somit zu den sporadischen zählte. Diesem einen Isolat folgten in
den anschließenden Jahren 136 Isolate. Hier ist demnach ein vormals sporadischer
Stamm im Verlauf von drei Jahren zu einem der häufigsten klinisch relevanten
Epidemiestämme geworden. Die unklaren kleinen Gruppen 19, 40 und 42 sind ebenfalls
aus ursprünglich sporadischen Stämmen entstanden.
Beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume (siehe Abbildung 10) ist erkennbar,
dass die Gruppen 2, 3, 7, 9, 11, 13, 16 (Berliner Epidemiestamm) und vor allem 35
deutlich an Isolaten zugenommen haben. Für die Gruppen 7, 13, und 35 lässt sich sogar
eine Zunahme von weit mehr als 100 Isolaten verzeichnen. Gruppe 13 ist insgesamt mit
190 Isolaten die größte und hatte mit 156 Isolaten auch den erkennbarsten Anstieg. Die
Gruppe 6, die für den Zeitraum bis Ende 2000 mit 52 Isolaten die größte Gruppe war,
ist mit 9 Isolaten nur geringfügig angestiegen.
Der Anteil der vier größten Gruppen mit jeweils über 100 Isolaten an den insgesamt
1161 Isolaten beträgt 51,2%. Im Einzelnen sind das für die PFGE-Gruppe 13 16,4%, für
die Gruppe 7 13,5% sowie für die Gruppe 35 11,8% und die Gruppe 16 9,6% (siehe
Abbildung 10). Da im zweiten Beobachtungszeitraum nur vier neue epidemische PFGE-
Gruppen entstanden sind, haben sich die 676 zusätzlichen epidemischen Isolate
hauptsächlich auf die schon bestehenden epidemischen Gruppen aufgeteilt. Durch den
enormen Anstieg einiger schon bestehender epidemischer Gruppen ist der Abstand zu
den unklaren PFGE-Gruppen deutlicher geworden. Dies untermauert die Annahme, dass
es sich in diesen Fällen um epidemische Stämme handelt.
50
Ergebnisse
Die großen Epidemiegruppen 13, 7 und 16 mit mehr als 100 Isolaten weisen über beide
Beobachtungszeiträume hinweg einen relativ stabilen zeitlichen Verlauf auf.
Im Gegensatz dazu fällt auf, dass der epidemischen PFGE-Gruppe 1 innerhalb der drei
Jahre des zweiten Beobachtungszeitraums nur zwei weitere Isolate zugeordnet werden
konnten, die am 19.03.2001 und am 06.08.2003 als Dauerkulturen in die
Stammsammlung aufgenommen wurden. Auch bei PFGE-Gruppe 5 (Süddeutscher
Epidemiestamm) ist in diesem Zeitraum nur ein weiteres Isolat hinzugekommen. Das
letzte Isolat mit dem PFGE-Muster von Gruppe 5 wurde am 28.02.2001 der Sammlung
hinzugefügt. Diese beiden Gruppen scheinen somit im zeitlichen Verlauf an Bedeutung
verloren zu haben. Der Zeitraum, in dem der Begriff „epidemisch“ Gültigkeit besitzt
und auf eine PFGE-Gruppe angewendet werden darf, ist nicht definiert. Bei isolierter
Betrachtung der zurückliegenden drei Jahre müsste Gruppe 1 als unklar und Gruppe 5
als sporadisch gelten. Die PFGE-Gruppe 35, die mit 137 Isolaten den dritthäufigsten
Epidemiestamm darstellt, erlangte ihre epidemiologische Bedeutung, im Gegensatz zu
den meisten anderen Gruppen, ausschließlich im zweiten Abschnitt der Studie
(01.01.2001–12.01.2004). Vorher galt dieser Stamm sporadisch.
3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit
anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen
Die PFGE-Bandenmuster der MRSA-Sammlung des Instituts für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum wurden mit bekannten deutschen, amerikanischen und
kanadischen Epidemiestämmen sowie einem österreichischen und englischen
Epidemiestamm verglichen. Dabei zeigten sich in einigen Fällen große
Übereinstimmungen in der Anordnung der Muster. Ein Vergleich mit sechs anerkannten
deutschen Epidemiestämmen (Süddeutscher-, Berliner-, Barnimer-, Rhein-Hessen-,
Hannoverscher-, Norddeutscher-Epidemiestamm) führte in zwei Fällen zu
Übereinstimmungen (siehe Abbildung 11).
51
Ergebnisse
Abbildung 11: Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software, Übereinstimmung mit
PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme
In diesem Screenshot der für den Bandenmuster-Vergleich verwendeten Software sind exemplarisch die
Übereinstimmungen von zwei PFGE-Gruppen mit anerkannten deutschen Epidemiestämmen (siehe
Material und Methoden, Tabelle 3) dargestellt. Rechts sind neben den Bandenmustern die Dauerkultur-
Nummern aufgeführt, links ist der Grad der Verwandtschaft der einzelnen Muster durch ein
Dendrogramm zu erkennen. Die beiden anerkannten deutschen Epidemiestämme sind durch rote Pfeile
gekennzeichnet. Auf dem oberen Bild ist die nahe Verwandtschaft des Süddeutschen Epidemiestammes
mit den Isolaten der Gruppe 5 zu erkennen, das untere Bild zeigt die Ähnlichkeit des Berliner
Epidemiestammes zur Gruppe 16.
52
Ergebnisse
Wie erwartet bestand bei diesem Vergleich keine Verwandtschaft der anerkannten
Epidemiestämme zu sporadischen Stämmen der Bochumer Stammsammlung. Das
PFGE-Muster der Gruppe 4, deren epidemiologische Bedeutung mit zwei Isolaten
unklar ist, weist eine große Ähnlichkeit zu dem des Hannoverschen Epidemiestammes
auf und das Muster der Gruppe 5, die mit 34 Isolaten zu den epidemischen Stämmen
zählt, entsprach dem des Süddeutschen Epidemiestammes. Weiterhin zeigten sich
übereinstimmende PFGE-Muster der Gruppe 16 -mit 111 Isolaten die viertgrößte
Gruppe- und dem Berliner Epidemiestamm (siehe Abbildung 10). Die drei größten
Epidemiegruppen (in absteigender Reihenfolge: 13, 7, 35) entsprachen jedoch keinem
der oben genannten deutschen Epidemiestämme.
Weitere PFGE-Muster-Vergleiche wurden mit kanadischen MRSA-Stämmen des
Department of Microbiology, Sunnybrook and Women’s College Health Science Center
in Toronto (Papakyriacou et al., 2000) und nordamerikanischen epidemischen MRSA-
und MSSA-Stämmen des Department of Microbiology and Immunology, University of
Oklahoma Health Sciences Center (Booth et al., 2001) durchgeführt. Zwei anerkannte
europäische Epidemiestämme, der EMRSA-16 aus Großbritannien und der Wiener–
Epidemiestamm, wurden ebenfalls hinsichtlich verwandter PFGE-Muster mit der
Bochumer Stammsammlung geprüft (siehe Material und Methoden 2.1.2).
Beim Vergleich der internationalen Stämme mit den 1161 MRSA-Stämmen aus
Nordrhein-Westfalen waren nur wenige Gemeinsamkeiten zu erkennen. Es fand sich ein
PFGE-Muster, das in mehreren Ländern und auch in der Bochumer Stammsammlung
gefunden wurde. Das Muster dieses Isolates aus Bochum mit der Dauerkultur-Nummer
429, das am 07.12.1999 in die Stammsammlung aufgenommen wurde, war im ersten
Untersuchungszeitraum bis Dezember 2000 einzigartig und somit den sporadischen
Stämmen zugeordnet. Bei der nachfolgenden Aktualisierung bis Januar 2004 hatte sich
ein weiteres Isolat mit dem gleichen Muster gefunden, sodass die Gruppe 19 mit zwei
Isolaten entstanden ist.
Obwohl diese beiden Stämme in der Region um Bochum nicht epidemisch sind,
entspricht ihr Bandenmuster dem von epidemischen Stämmen außerhalb Deutschlands.
Sie weisen einen hohen Verwandtschaftsgrad zu den PFGE-Mustern des kanadischen
Epidemiestammes CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000), SA 506 aus den USA (Booth
et al., 2001) und EMRSA-16 aus Großbritannien (Cox et al., 1995) auf.
53
Ergebnisse
Demzufolge entsprechen sich die MRSA-Stämme aus den vier Ländern Deutschland,
Kanada, den USA und Großbritannien im hohen Maße (siehe Abbildung 12).
Abbildung 12: Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien Der oberste Stamm, EMRSA-16, ist ein anerkannter Epidemiestamm aus Großbritannien; der zweite von
oben ist ein kanadischer, darunter der MRSA-Epidemiestamm aus den USA und ganz unten der Stamm,
der in Bochum zwei Mal innerhalb von sechs Jahren auftrat und den unklaren PFGE-Gruppen zugeordnet
wurde (PFGE-Gruppe 19). Bei Betrachtung der Bandenmuster fällt die enge Verwandtschaft der Isolate
untereinander auf. Eine Übereinstimmung von 96,2% - 100% der Bandenmuster bei Anwendung des
Algorithmus Jeffrey’s x coefficient in der rechnergestützten Clusteranalyse (siehe Material und Methoden
2.2.1) stützt die These, dass diese vier Bandenmuster einen gemeinsamen MRSA-Stamm repräsentieren.
EMRSA-16 ist bisher nicht in Deutschland beschrieben worden (siehe Material und
Methoden, Tabelle 3). Vorausgesetzt, es handelt sich bei den PFGE-Bandenmustern in
Abbildung 12 um einen gemeinsamen MRSA-Stamm, dann wurde EMRSA-16 als
PFGE-Gruppe 19 mit zwei Isolaten in Bochum nachgewiesen (siehe Abbildung 10).
3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme
Obwohl von einigen Kliniken nur sehr wenig Material zur Verfügung stand, konnte in
dieser Arbeit sichergestellt werden, dass die Isolate der epidemischen Gruppen aus
unterschiedlichen Krankenhäusern stammen. Die Isolate der PFGE-Gruppe 1, die
kleinste epidemische Gruppe, stammen aus zwei verschiedenen Krankenhäusern und
die anderen 10 epidemischen Gruppen enthalten MRSA-Isolate aus mindestens vier
verschiedenen Kliniken.
54
Ergebnisse
Um Auffälligkeiten hinsichtlich des Anteils der Kliniken an den PFGE-Gruppen
auszumachen, wurde untersucht, ob es PFGE-Gruppen gibt, deren Isolate hauptsächlich
aus einer bestimmten Klinik stammen (siehe Abbildung 13). Umgekehrt wurden für die
vier Kliniken mit über 100 eingesandten Isolaten die jeweils häufigsten MRSA-Stämme
(PFGE-Gruppen) ermittelt (siehe Abbildungen 14-17).
55
Ergebnisse
56
Isolate pro
Gruppe
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
15
15
14
4
13
6
8
9
2
Berli
ner-E
.
USA
(SA
456)
& K
anad
a (C
MR
SA 2
A)
Südd
euts
cher
-E.
H
anno
vers
cher
- E.
11
19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
PFGE-Gruppen
USA
(SA
506)
& K
anad
a (C
MR
SA 4
) & U
K (E
MR
SA 1
6)
Kana
da (C
MR
SA 3
A &
3B)
13
Spor
adis
che
Stäm
me
Anzahl der einsendenden Kliniken für die 11 epidemischen Gruppen
1715131197 5 3 1
56
Ergebnisse
Abbildung 13: Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen
Der Anteil der einsendenden Kliniken für die einzelnen PFGE-Gruppen ist farblich markiert. Tabelle 7
enthält die Farbcodes der Kliniken.
Tabelle 7: Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende Abbildung 13)
KLINIK ISOLATE & FARBCODE
A 360
B 294
C 110
D 81
E 37
F 34
G 34
H 33
I 26
J 26
K 22
L 13
M 18
N 18
O 14
P 12
Q 11
R 9
S 6
T 3
In Abbildung 13 und Tabelle 7 ist zu erkennen, dass von einigen Kliniken sehr viele
und von anderen kaum MRSA-Isolate durch das Institut für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum untersucht wurden. Das Spektrum reicht von 360
eingesandten Isolaten der Klinik A bis zu lediglich drei Isolaten des Krankenhauses T.
57
Ergebnisse
Die sporadischen Stämme, die als Gruppe 34 zusammengefasst wurden -auch wenn sie
im eigentlichen Sinne keine PFGE-Gruppe darstellen-, zeigen ein ähnliches
Verteilungsmuster der einsendenden Kliniken wie die epidemischen PFGE-Gruppen
(siehe Abbildung 13). Klinik A hat mit 35,6% den größten Anteil sporadischer Stämme,
gefolgt von Klinik B (18,6%) und nachfolgend Klinik C (11,9%).
Bei den unklaren MRSA-Stämmen fallen die PFGE-Gruppen 14 und 15 auf, deren
Isolate, gemessen an der geringen Gruppengröße, aus relativ vielen verschiedenen
Kliniken stammen. Gruppe 14 besteht aus 16 und Gruppe 15 aus 11 Isolaten, die jeweils
von sieben verschiedenen Kliniken zugesandt wurden. Im Vergleich dazu stammen die
22 Isolate der epidemischen Gruppe 1 nur aus zwei verschiedenen Kliniken, die 24
Isolate der Gruppe 9 aus nur vier und die 61 Isolate der Gruppe 6 aus sechs
verschiedenen Kliniken. Die Ausbreitung der MRSA-Stämme 14 und 15 auf die sieben
Kliniken lässt epidemisches Verhalten vermuten, obwohl sie die in dieser Arbeit
geforderte Mindestanzahl an Isolaten einer epidemischen PFGE-Gruppe nicht erreichen.
Bei einigen epidemischen PFGE-Gruppen gibt es Kliniken, aus denen auffällig viele
Isolate stammen. Bei PFGE-Gruppe 1 ist dies mit 77,3% die Klinik B. Der größte Anteil
von Isolaten der Gruppe 2 stammt mit 53,1% ebenfalls aus diesem Haus. Gleiches gilt
auch für die Isolate der dritten Gruppe mit 65,3%. Bei der epidemischen Gruppe 5 sind
die meisten Isolate aus Krankenhaus M (29,4%) und der zweite große Anteil stammt
auch hier wieder aus Klinik B (20,6%). Bei den Isolaten der Gruppe 6 überwiegen
Klinik B mit 36,1% und Klinik A mit 26,2%. Auch bei den Isolaten der Gruppe 7 lässt
sich eine ähnliche Verteilung beobachten: Klinik B hat 35,7% und Klinik A 32,5% ihrer
Isolate eingesandt. Auffällig bei Gruppe 9 ist der besonders hohe Anteil der Klinik A
mit 79,2%, ohne den sie nicht zu den epidemischen Gruppen zählen würde.
PFGE-Gruppe 11 besteht zum größten Teil (39,7%) aus Isolaten der
Gemeinschaftspraxis E. Bei Gruppe 13 überwiegt Klinik A mit einem Anteil von
40,5%. Klinik B (17,9%) und Klinik C (17,4%) machen zwei weitere größere Anteile
dieser Gruppe aus. PFGE-Gruppe 16 weist keine Präferenz zu einer bestimmten Klinik
auf. Klinik A ist hier mit lediglich 26,1% der führende Einsender von Isolaten. Bei der
letzten epidemischen Gruppe (35) fällt auf, dass auch wieder Klinik A mit 47,7% die
meisten MRSA-Isolate eingesandt hat (siehe Abbildung 13).
58
Ergebnisse
Zusammenfassend ist hervorzuheben, dass ein Großteil der Isolate aus wenigen
Kliniken stammt. Die größten Anteile der 11 epidemischen PFGE-Gruppen sind den
beiden Kliniken A und B zuzuschreiben. Somit unterscheidet sich diese Verteilung
nicht wesentlich von derjenigen der sporadischen Stämme. Ein Zusammenhang eines
bestimmten MRSA-Stammes zu einer Klinik scheint es nicht zu geben. Ausnahmen
sind die Gruppe 5, deren Isolate zum größten Teil aus dem Krankenhaus H kommen
und die Gruppe 11 mit besonders vielen Isolaten der Gemeinschaftspraxis E. Die
epidemische Gruppe 9 enthält im Gegensatz zu allen anderen epidemischen Gruppen
kein Isolat der Klinik B, obwohl dieses Haus nach der Klinik A die meisten Isolate
eingesandt hat. Ähnliches gilt für die relativ große Gruppe 16, die nur zwei Isolate der
Klinik B enthält.
In den folgenden Kreisdiagrammen wird –ähnlich wie in Abbildung 13- der
Zusammenhang von PFGE-Gruppen und einzelnen Kliniken aufgezeigt; sie
veranschaulichen die Verteilung der PFGE-Gruppen auf die verschiedenen Kliniken.
Diese Darstellung ist jedoch auf die vier Kliniken mit den meisten eingesandten Isolaten
(Klinik A, -B, -C und –D) begrenzt, welche in absteigender Reihenfolge abgebildet sind
(siehe Abbildungen 14-17).
59
Ergebnisse
Klinik A (360 Isolate)
23%
32% 6
35
Abbildung 14: Verteilung der 36
a
Im Kreisdiagramm ist die betreffe
Material des Krankenhauses aufg
wichtigsten PFGE-Gruppen, auf d
Isolate lassen sich hier der PFGE-G
35 und den drittgrößten Anteil bild
Abbildung 15: Verteilung der 29
Die Isolate dieses Hauses gehören
Gruppe 3 zuordnen und ein kaum g
-anders als in Klinik A- die PFGE-
I
4%95%
102%
112%14
2%
168%
346%
714%
18%
1321%
0 Isolate der Klinik A
nde PFGE-Gruppe und
eführt. Die römischen
ie im nächsten Absch
ruppe 13 zuordnen, ei
et die PFGE-Gruppe 7.
Klinik B (294
113%
224%
242%
344%
355%
1312%
719%
4 Isolate der Klinik B
vornehmlich zwei groß
eringerer der Gruppe 7
Gruppe 13 vertreten.
I
auf die PFGE-Gruppen
ihr prozentualer Anteil am gesamten MRSA-
Ziffern zeigen die agr-Interferenzgruppen der
nitt (3.4) Bezug genommen wird. Die meisten
n weiterer großer Anteil entfällt auf die Gruppe
Isolate)
16%
29%
321%
I52%
67%
auf die PFGE-Gru
en Gruppen an. Der
. Mit deutlich wenig
II
II
pp
g
er
II
en
rößte Anteil lässt sich der
Isolaten ist
60
Ergebnisse
Klinik C (110 Isolate)
24%
78%
272%
346%
355%
432%
447%
372%
1330%
314%
1613%
II
Ia
I
Abbildung 16: Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen
Hier überwiegt mit deutlichem Abstand die PFGE-Gruppe 13. Die Anteile der nachfolgenden Gruppen 3
und 16 enthalten etwa gleich viele Isolate. Die restlichen Gruppen haben Anteile von weniger als 10%.
Klinik D (81 Isolate)
54%
67%
84%
92%
102%
112%
169%
184%
275%
344%
364%
1314%
716%
3516%
Ia
II
I
Abbildung 17: Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen
Die Isolate teilen sich hier hauptsächlich auf 3 PFGE-Gruppen (7,13 und 35) auf. Gruppe 35 und 7
enthalten dabei gleich viele Isolate und Gruppe 13 nur geringfügig weniger.
61
Ergebnisse
Bei Betrachtung der Kreisdiagramme (Abbildungen 14-17) lässt sich Folgendes
feststellen:
Bei Klinik A können mit 21% die meisten Isolate der PFGE-Gruppe 13 zugeordnet
werden. Sie ist mit 190 Isolaten die größte epidemische Gruppe. Der zweitgrößte Anteil
dieser Klinik entfällt mit 18% auf Gruppe 35, die mit 137 Isolaten drittgrößte der
epidemischen PFGE-Gruppen. Ein weiterer wichtiger Anteil wird mit 14% von der
PFGE-Gruppe 7 gebildet, der zweitgrößten Epidemiegruppe. Den Hauptanteil an
MRSA der Klinik A machen diese drei größten epidemischen Gruppen (13, 7 und 35) in
der verwendeten Stammsammlung aus.
Die Isolate der Klinik B gehören vornehmlich zwei großen Gruppen an. Den größten
Anteil hat mit 21% die Gruppe 3, die mit 95 Isolaten zu den epidemischen Stämmen zu
rechnen ist. 19% gehören zur Gruppe 7, der mit 157 Isolaten zweitgrößten
epidemischen Gruppe, und 12% der Isolate sind Gruppe 13 zuzurechnen, der größten
Epidemiegruppe mit 190 Isolaten. Hier herrschen, wie schon in Klinik A, die beiden
größten Epidemiegruppen vor. Der Hauptteil wird jedoch von Gruppe 3 gebildet, die –
was besonders in Abbildung 13 auffällt- zum überwiegenden Teil in Klinik B ein
Problem darzustellen scheint. Bei zeitlicher Betrachtung (siehe Abbildung 10) zeigt sich
für die PFGE-Gruppe 3 im zweiten Beobachtungszeitraum (01.01.2001–01.07.2004)
eine Zunahme um 56 Isolate. Damit wird klar, dass dieser MRSA-Stamm immer noch
eine relevante epidemische Gruppe darstellt.
Betrachtet man in Abbildung 16 die Verteilung der Isolate für Klinik C, so gehört mit
30% der Hauptteil der Isolate zur größten epidemischen PFGE-Gruppe 13. Gruppe 3 hat
demgegenüber nur einen Anteil von 14%. Aus Abbildung 13 geht hervor, dass die
Isolate aus den beiden Kliniken B und C den Hauptteil der PFGE-Gruppe 3 bilden
(81%). Die PFGE-Gruppe 3 scheint demnach ein Problemstamm bei den Kliniken B
und C zu sein. Ein Grund dafür könnte die häufige Verlegung von Patienten zwischen
diesen beiden Kliniken sein. Daten hierzu liegen jedoch nicht vor. 13% der Klinik C
lässt sich der PFGE-Gruppe 16 zuordnen, dem Berliner Epidemiestamm.
Bei Klinik D gibt es drei epidemische PFGE-Gruppen, auf die sich die Isolate dieses
Krankenhauses annähernd gleich verteilen. Die Gruppen 35 und 7 (sie gehören zu den
vier größten PFGE-Gruppen in dieser Studie) enthalten jeweils 16% der Isolate.
62
Ergebnisse
Gruppe 13 (die größte PFGE-Gruppe) bildet mit 14% den dritten großen Anteil der
Isolate dieses Hauses.
Insgesamt ergibt sich eine breitgefächerte Verteilung der epidemischen Stämme auf die
untersuchten Krankenhäuser und es lassen sich nur wenige Besonderheiten bei dieser
Verteilung beobachten, die eine Korrelation einer Klinik mit einem MRSA-Stamm
beschreiben.
Auch weiterhin wird es sinnvoll sein, in bestimmten Intervallen eine Bestandsaufnahme
der Stammsammlung anzufertigen, um die Zunahme der Isolate innerhalb der PFGE-
Gruppen, die Verteilung der Stämme auf die Kliniken und die Veränderungen im Pool
der sporadischen Stämme im zeitlichen Verlauf beobachten zu können.
3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der
epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme
Das zentrale Segment des agr-Locus, agrBDC, enthält eine Region, die eine große
Variation zwischen S.-aureus-Stämmen aufweist. Es handelt sich um die C-terminalen
zwei Drittel von agrB, agrD und die N-terminale Hälfte von agrC (siehe Abbildung 5).
Auf Grund dieser sogenannten hypervariablen Region, die mit dem Autoinducer und
dem Rezeptor des Zwei-Komponenten-Systems agr in Verbindung gebracht wird, kann
S. aureus in bisher vier verschiedene agr-Interferenzgruppen eingeteilt werden, die mit
den römischen Ziffern I-IV beschrieben werden. Von der Interferenzgruppe I gibt es
noch eine Subgruppe, die als Ia bezeichnet wird und nicht als eine eigenständige
Gruppe gilt, weil ihr Restriktionsmuster nur einen geringen Unterschied zu dem von I
aufweist. Im Allgemeinen kommt es innerhalb einer agr-Gruppe zu einer Aktivierung
des agr-Locus durch das Pheromon (Autoinducer) und damit zur RNA III-Produktion,
wohingegen die agr-Expression in anderen Gruppen unterdrückt wird. Eine Ausnahme
bildet das Zusammentreffen der Gruppen I und IV, weil sich die Interferenzgruppe IV
bis auf den Austausch einer Aminosäure nicht von der Gruppe I unterscheidet, sodass
sich nachvollziehen lässt, dass es zwischen diesen Gruppen zu einer mäßigen
Kreuzaktivierung und nicht zu einer Hemmung kommt.
63
Ergebnisse
Es hat sich gezeigt, dass es Zusammenhänge zwischen bestimmten klinischen
Symptomen, beziehungsweise der Produktion bestimmter Toxine von S. aureus, und der
agr-Interferenzgruppen-Zugehörigkeit gibt. Die Fähigkeit von S.-aureus-Stämmen,
TSST (Toxic-Schock-Syndrom-Toxin) zu produzieren, ist assoziiert mit der
Interferenzgruppe III. Die Produktion von exfoliativem Toxin korreliert –wenn auch nur
schwach- mit der Gruppe IV (Jarraud et al., 2000). Weil die Dokumentation über die
Krankheiten der Patienten, von denen das untersuchte Material stammt, auf Grund der
dezentralen Organisation des Klinikums der Ruhr-Universität Bochum nicht in dafür
notwendiger detaillierter Form verfügbar ist, musste auf Nachforschungen bezüglich der
Krankheitsassoziation der MRSA verzichtet werden.
3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA
Die agr-Interferenzmuster jedes einzelnen sporadischen Isolates mussten durch eine
Restriktionsanalyse ermittelt werden. Aus den 45 PFGE-Gruppen, die sich beim
Vergleich der PFGE-Muster der 1161 Isolate ergeben hatten, wurde je nach Größe der
Gruppe das Interferenzmuster von einer repräsentativen Anzahl an Stichproben
bestimmt. In dieser Arbeit wurde davon ausgegangen, dass die Isolate innerhalb einer
PFGE-Gruppe das gleiche agr-Interferenzmuster aufweisen, da die agr-
Gruppenzugehörigkeit mit nur vier Möglichkeiten -beziehungsweise fünf mit der
Subgruppe Ia- wesentlich weniger diskriminativ ist als die Bestimmung der
Pulsfeldgelelektrophorese-Muster (Trindade et al., 2003). Stämme mit dem gleichen
oder einem sehr ähnlichen Pulsfeldgelmuster sind nahe verwandt, sodass sie auch bei
der Restriktionsanalyse zur gleichen agr-Interferenzgruppe gehören müssten. Bei den
Stichproben bestätigte sich diese Annahme, denn es traten in keinem Fall
Unstimmigkeiten bezüglich der PFGE-Gruppe und dem dazugehörigen
Restriktionsmuster auf.
Auf diese Weise war es möglich, für die untersuchte Stammsammlung Zusammenhänge
herzustellen zwischen der Häufigkeit der vier bekannten Interferenzmuster -die auch
alle in der untersuchten Stammauswahl zu finden waren (siehe Abbildung 8)- und den
epidemiologischen Eigenschaften eines Stammes (sporadisch, unklar, epidemisch).
64
Ergebnisse
Um letztendlich die Interferenzgruppe des agr-Locus eines MRSA-Stammes bestimmen
zu können, musste die hypervariable Region von agr mit Hilfe des Restriktionsenzyms
DraI verdaut und die daraus entstehenden Bandenmuster auf einem Gel sichtbar
gemacht werden.
Der erste Schritt, die DNA-Präparation, diente zur Gewinnung genomischer DNA der
MRSA-Isolate (siehe Material und Methoden 2.2.3). Im nächsten Schritt wurden die
Primer so gewählt, dass der hypervariable Teil der jeweiligen genomischen DNA mit
einer PCR vervielfältigt werden konnte (siehe Material und Methoden 2.2.4). Um zu
kontrollieren, ob die durchgeführte PCR erfolgreich war, wurde eine
Agarosegelelektrophorese (siehe Material und Methoden 2.2.5) jedes PCR-Produktes
durchgeführt (siehe Abbildung 18).
Abbildung 18: Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR
Dieses Agarosegel wurde 15 Minuten in Ethidiumbromidlösung gefärbt und anschließend im UV-Licht
fotografiert. Das PCR-Amplifikat sollte 1884 bp lang sein, was in dieser Abbildung für jedes PCR-
Produkt zutrifft. „S“ steht für den Molekulargewichts-Längenstandard (1 kb-ladder, Life Technologies)
und „N“ zeigt die Spur der Negativ-Probe, auf der, wie in diesem Fall, nichts zu sehen sein sollte.
65
Ergebnisse
Wenn nach Durchführung, Färbung und Fotografie des Agarosegels ein Produkt mit
einem Molekulargewicht von 1884 kb sichtbar war, konnte es im nächsten Schritt über
Filter-Säulen aufgereinigt werden (siehe Material und Methoden 2.2.6). War nichts zu
sehen oder zeigten sich verschmierte Banden oder eine Bande, die dem
Molekulargewicht von 1884 kb nicht entsprach, wurden die bisher durchgeführten
Schritte wiederholt.
Auch bei mehrfachen Versuchen blieb die PCR von fünf Isolaten, die sich allesamt den
sporadischen Stämmen zuordnen lassen, erfolglos (Analyse bis 31.12.2000). Es konnte
kein Amplifikat im Gel nachgewiesen werden. Trotz Wiederholung der Anzüchtung
und DNA-Isolation sowie Änderungen der PCR-Parameter zur besseren Primerbindung
war kein PCR-Produkt im Agarosegel erkennbar.
Zu diesen fünf Fehlschlägen gehörte auch der Stamm mit der Dauerkulturnummer 429,
dessen PFGE-Muster mit den Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und
Großbritannien übereinstimmte. Warum die PCR hier –auch nach Variation einiger
Parameter und mehrfachen Versuchen- nicht gelang, ist unklar.
Nach erfolgter PCR, der Kontrolle durch ein Agarosegel und der Aufreinigung der
PCR-Amplifikate, wurde die Agarosegelelektrophorese mit den gleichen
Chemikalien und Einstellungen wie bei der Gelelektrophorese nach der PCR
herangezogen, dieses Mal, um zu prüfen, ob die DNA-Banden auch nach dem
Reinigungsschritt noch vorhanden waren. Konnte die DNA nachgewiesen werden durch
eine Bande mit einer Länge von 1884 kb, wurde der eigentliche und letzte Schritt
durchgeführt, die Restriktionsanalyse (siehe Material und Methoden 2.2.7). Die
gereinigte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym DraI für 16-18 Stunden bei 37 °C
inkubiert. Die Zielsequenz von DraI beginnt 25 Nukleotide vom 5’-Ende der agrB
kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide vom 3’-Ende der agrC kodierenden Sequenz
entfernt (Papakyriacou et al., 2000). Die hypervariable Region liegt innerhalb des
herausgeschnittenen Sequenzabschnittes (siehe Einleitung, Abbildung 5).
Im Anschluss an den Verdau mit dem Restriktionsenzym wurde von dieser Sequenz
eine Agarosegelelektrophorese angefertigt (siehe Abbildung 19), die sich wegen des
Nachweises eines DNA-Fragmentes mit einem Molekulargewicht unter 1 kbp (kilo
Basenpaare) von den vorherigen Gelelektrophoresen durch Änderungen mehrerer
Parameter unterschied (siehe Material und Methoden 2.2.7).
66
Ergebnisse
Abbildung 19: Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI:
Es ist ein Ausschnitt eines Gels zu sehen, auf dem neun Restriktionsmuster von MRSA-Stämmen aus
Bochum dargestellt sind. Nach einer Inkubation von 16-18 Stunden bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym
DraI wurden die oben dargestellten Muster durch UV-Bestrahlung eines mit Ethidiumbromid versetzten
Agarosegels sichtbar. Die Restriktionsmuster wurden mit denen von Papakyriacou et al. (2000)
verglichen. Auf diesem Weg konnten die Bochumer MRSA den vier beschriebenen Interferenzgruppen
zugeordnet werden. Die linke Spur entspricht dem Molekulargewicht-Längenstandard VIII (Roche) und
ist als „S“ gekennzeichnet.
Die Restriktionsfragmente von Spur 1 entsprechen dem Muster der agr-Interferenzgruppe Ia, die der
Spuren 2, 4, 5, 6, 7 gehören zur Gruppe II, die Restriktionsmuster von 3 und 9 können der PFGE-Gruppe
I zugeordnet werden und das Muster von Spur 8 gehört zur Gruppe III. Das Isolat der Spur 1 (RFLP-
Muster Ia) ist eine Stichprobe der PFGE-Gruppe 15, sodass davon ausgegangen werden kann, dass jedes
Isolat in der PFGE-Gruppe 15 das RFLP-Muster Ia aufweist. Spur 3 enthält die Restriktionsfragmente
(RFLP-Muster I) eines Isolates aus der PFGE-Gruppe 23, Spur 5 (RFLP-Muster II) repräsentiert ein
Isolat der PFGE-Gruppe 5, die dem Süddeutschen Epidemiestamm entspricht und Spur 8 (RFLP-Muster
III) enthält ein Isolat der Gruppe 26. Die restlichen Bandenmuster gehören zu den sporadischen Stämmen,
die nur ein Mal in Bochum auftraten.
67
Ergebnisse
Auf diese Weise konnte die Zugehörigkeit der 417 im ersten Untersuchungszeitraum
(01.01.1998-01.01.2001) in die Studie eingeschlossenen MRSA-Isolate zu einer der vier
agr-Interferenzgruppen bestimmt werden. Allerdings gab es, wie bei der PCR (siehe
oben), auch hier einige Isolate, bei denen die Durchführung nicht gelang. Bei drei
Isolaten, von denen es ein PCR-Produkt gab, konnte auch nach mehrfachen Versuchen
keine Restriktionsanalyse durchgeführt werden. Zählt man die fünf Isolate dazu, bei
denen die PCR misslang, gab es insgesamt acht Isolate, bei denen eine Analyse der
Interferenzmuster nicht möglich war.
3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen
Um eine Darstellung zu haben, in der sowohl die Einteilung der Isolate in PFGE-
Gruppen und sporadische Stämme (siehe Abbildung 9) als auch die Ergebnisse der
Restriktionsanalyse Beachtung finden, wurde Abbildung 9 entsprechend modifiziert und
erweitert (siehe Abbildung 20).
Die Restriktionsanalyse wurde über einen Zeitraum durchgeführt, der etwas von dem
der Pulsfeldgelmuster-Untersuchungen abweicht. Sie wurde angewandt bei Stämmen,
die von Februar 1998 bis Juli 2001 in die Stammsammlung aufgenommen wurden.
Somit weicht die Anzahl der Stämme insgesamt und auch in den Kategorien
epidemisch, unklar und sporadisch geringfügig von denen des ersten
Beobachtungszeitraumes der PFGE-Musteranalyse (Februar 1998 bis Dezember 2000)
ab.
68
Ergebnisse
20
11
23
5
35
56
27
47
10
3 2
27
10 10
39
3 3 2 3 4
10
5 53 2 2 2
42 2 2 2
0
10
20
30
40
50
60
Isolate pro
Gruppe
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33PFGE - Gruppen
Interferenzgruppen:
29
1
17
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
48 Isolate ohne PFGE - Gruppenzugehörigkeit
= I = Ia = II = III = IV
Abbildung 20: Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme
Durch die Integration der Ergebnisse aus der Restriktionsanalyse in Abbildung 9 musste auf die zuvor
verwandte Farbkodierung zur Unterscheidung der Stämme in epidemisch und unklar verzichtet werden.
Der neue Farbcode symbolisiert, wie in der Legende dargestellt, die agr-Interferenzmuster der jeweiligen
Gruppe und der sporadischen Stämme. Die Daten dieses Diagrammes wurden im Zeitraum Februar 1998
bis Juli 2001 gewonnen. Es gibt 12 PFGE-Gruppen mit der Interferenzgruppe I, von denen nur eine, und
zwar Gruppe 13 mit 27 Isolaten, epidemisch ist. Alle anderen mit dem Restriktionsmuster I befinden sich
im unklaren Bereich. Die PFGE-Gruppe 16 (Berliner Epidemiestamm) ist mit 39 Isolaten der einzige
epidemische Stamm mit der Interferenzgruppe Ia; außer PFGE-Gruppe 16 weist sonst nur noch Gruppe
31 das RFLP-Muster Ia auf. Von den 33 PFGE-Gruppen haben 17 das Interferenzmuster II, fünf davon
zählen zu den epidemischen PFGE-Gruppen. Die Interferenzgruppe III kommt nur ein Mal in der PFGE-
Gruppe 27 vor und das Restriktionsmuster IV auch nur ein Mal in Gruppe 17. Beide Gruppen gehören zu
den unklaren Stämmen. Im rechten oberen Feld ist ein zweites Diagramm zu sehen, das den Anteil der
vier Interferenzmuster unter den sporadischen Stämmen darstellt. Mit 29 von 48 Isolaten gehören die
meisten zur Interferenzgruppe I, 17 Isolate weisen das Interferenzmuster II auf und jeweils eines lässt sich
dem Interferenzmuster III und IV zuordnen.
69
Ergebnisse
Mit 5 von 7 PFGE-Gruppen gehören die meisten epidemischen Stämme zur
Interferenzgruppe II. Nur ein epidemischer Stamm (Gruppe 13) weist das
Interferenzmuster I auf und bei einem weiteren (PFGE-Gruppe 16, Berliner
Epidemiestamm) findet sich das Muster Ia. 12 Mal ist das Interferenzmuster II und 11
Mal Muster I unter den unklaren Stämmen vertreten. Die Muster III und IV fanden sich
nur jeweils ein Mal bei sehr kleinen Gruppen. Bei den 48 sporadischen Stämmen
überwog, im Gegensatz zur agr-Interferenzmuster-Verteilung der epidemischen
Gruppen, die Interferenzgruppe I mit 29 Isolaten gegenüber Muster II mit nur 17
Isolaten. Auch die Muster Ia und III konnten, allerdings nur ein Mal, bei den
sporadischen Stämmen gefunden werden, wohingegen das Muster IV hier nicht auftrat.
Zur besseren Übersicht sind die Ergebnisse noch einmal tabellarisch zusammengetragen
(siehe Tabelle 8).
70
Ergebnisse
Tabelle 8: Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen
0
50
100
150
200
250
Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 393 MRSA-Isolaten
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe
(RFLP) (insgesamt: 227) (insgesamt: 118) (insgesamt: 48)
I 27 (11,9%) 49 (41,5%) 29 (60,4%)
Ia 39 (17,2%) 2 (1,7%) 1 (2,1%)
II 161 (70,9%) 62 (52,5%) 17 (35,4%)
III 0 (0%) 2 (1,7%) 1 (2,1%)
IV 0 (0%) 3 (2,6%) 0 (0%)
70,9%
r
Betrachtet man die Gesamtzahl der Isolate in den
auf, dass 161 der 227 Isolate dieser Kategorie (70
Dieses Muster ist demnach unter den epidem
vertreten, verglichen mit den 27 (11,9%) Isolate
(17,2%) der Gruppe Ia. Bei den unklaren Isolaten
aus; das Interferenzmuster II dominiert aber auch
Unter den 48 sporadischen Isolaten findet sich im
I mit 29 (60,4%) von 48 Isolaten am häufigsten
epidemischen Stämme zur Interferenzgruppe II
Gruppe I auf (siehe Tabelle 9).
Unkla
Epidemisch
52,5%
epidemischen PFG
,9%) zur Interferen
ischen Stämmen
n der Interferenzgr
fiel das Ergebnis
hier mit 62 von 11
Gegensatz dazu di
. Es fällt somit e
und der sporadi
Sporadisch
60,4%
E-Gruppen, so fällt
zgruppe II gehören.
auffallend häufig
uppe I und den 39
wesentlich knapper
8 Isolaten (52,5%).
e Interferenzgruppe
ine Korrelation der
schen Stämme zur
71
Ergebnisse
Tabelle 9: Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen
Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 393 MRSA-Isolaten
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe
(RFLP) (insgesamt: 227) (insgesamt: 118) (insgesamt: 48)
I, Ia, III, IV 66 (29,1%) 56 (47,5%) 32 (66,6%)
II 161 (70,9%) 62 (52,5%) 17 (35,4%)
Um die Dominanz der Interferenzgruppe II bei den epidemischen Stämmen
hervorzuheben, wurde Tabelle 8 modifiziert (siehe Tabelle 9). Hier ist zu erkennen, dass
die Interferenzmuster I, Ia, III und IV zusammengenommen nur bei 29,1% der
epidemischen Stämme zu finden sind und der wesentliche Anteil mit 70,9% das
Interferenzmuster II aufweist. Dies spricht für eine Korrelation epidemischer MRSA mit
der agr-Interferenzgruppe II, zumal das Muster II bei den sporadischen Stämmen nicht
dominiert.
Auch bei der Restriktionsanalyse wurde, wie für die epidemiologische Betrachtung
anhand der PFGE-Muster (siehe 3.1.2), eine Aktualisierung vorgenommen. Der
Beobachtungszeitraum von Februar 1998 bis Juli 2001 wurde auf Januar 2004
ausgeweitet (siehe Abbildung 21).
72
Ergebnisse
22
49
95
2
34
61
157
7
24
13
58
2
190
1611
111
3 5 2 3 514
6 6 3 29
2 4 2 2
59
137
4 62 2 2 4 3 2
122 2 2 2
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Isolate pro
Gruppe
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
PFGE - Gruppen
Interferenzgruppen: = I = Ia = II = III = IV
spor
adis
ch
73
Ergebnisse
Abbildung 21: Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung
Der Zeitraum der Datenerfassung wurde bis Januar 2004 erweitert. Auf Grund der verschiedenen
Interferenzmuster der sporadischen Stämme ist hier zur Vereinfachung nur ein grauer Balken abgebildet.
Details sind der Tabelle 10 zu entnehmen.
Insgesamt fällt bei Betrachtung von Abbildung 21 auf, dass die großen epidemischen
Gruppen wesentlich deutlicher als auf Abbildung 20 zu sehen, unterschiedliche
Interferenzmuster aufweisen. Unter den am häufigsten vorkommenden
Epidemiestämmen finden sich die agr-Restriktionsmuster I, Ia und II. Diese
Beobachtung widerlegt die Annahme, dass die epidemischen Stämme mit einem
bestimmten Interferenzmuster korrelieren. Betrachtet man nun noch einmal die
Abbildungen 14 bis 17 des Kapitels 3.3, so fällt auch hier auf, dass die wichtigen
PFGE-Gruppen, denen viele Isolate zuzuordnen sind, die Interferenztypen I, Ia und II
aufweisen. Eine Sonderstellung für das Muster II ist nicht mehr zu erkennen.
Bei Vergleich der Abbildungen 20 und 21 finden sich bei einigen PFGE-Gruppen in der
aktualisierten Darstellung andere Interferenzmuster als vorher. Der Grund dafür liegt in
nachträglich erfolgten Änderungen der Gruppen-Zusammensetzung.
Die Daten der aktualisierten Fassung wurden, wie dies zuvor in Tabelle 8 für den ersten
Beobachtungszeitraum erfolgte, in tabellarischer Form aufgeführt (siehe Tabelle 10).
Tabelle 10: Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004
Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 1161 MRSA-Isolaten
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe
(RFLP) (insgesamt: 938) (insgesamt: 164) (insgesamt: 59)
I 190 (20,3%) 70 (42,7%) 35 (59,3%)
Ia 248 (26,4%) 26 (15,9%) 1 (1,7%)
II 500 (53,3%) 54 (32,9%) 22 (37,3%)
III 0 (0%) 11 (6,7%) 1 (1,7%)
IV 0 (0%) 3 (1,8%) 0 (0%)
Vergleicht man die zuvor gewonnenen Daten (siehe Abbildung 20 und Tabelle 8) mit
der bis Januar 2004 aktualisierten Version (siehe Abbildung 21 und Tabelle 10), so lässt
sich Folgendes zusammenfassen:
74
Ergebnisse
Der Anteil der Interferenzgruppe II unter den epidemischen Stämmen hat von 70,9%
auf 53,3% deutlich abgenommen. Im Gegensatz dazu findet sich das Interferenzmuster I
häufiger im Pool der epidemischen Stämme. Hier ist der Anteil von 11,9% auf 20,3%
angestiegen. Der prozentuale Anteil von Interferenzmuster Ia ist ebenfalls von 17,2%
auf 26,4% deutlich angestiegen, was insbesondere auf die enorme Zunahme der Gruppe
35 zurückzuführen ist.
Bei den unklaren PFGE-Gruppen sind die Veränderungen für das Interferenzmuster I
mit einem geringfügigen Anstieg von 41,5% auf 42,7% nicht besonders ausgeprägt. Das
Muster Ia hingegen ist –wie auch für die epidemischen Stämme beschrieben- unter den
unklaren PFGE-Gruppen mit 15,9% gegenüber vormals 1,7% wesentlich häufiger zu
finden. Vier Gruppen (36, 37, 44, 48) mit dem Muster Ia sind im zweiten
Beobachtungszeitraum von Juli 2001 bis Januar 2004 neu hinzugekommen. Das
ehemals häufigste Muster der unklaren PFGE-Gruppen, II, hat, ähnlich wie bei den
epidemischen Stämmen, seine herausragende Position von 52,5% im ersten
Beobachtungszeitraum verloren und nimmt nur noch einen Anteil von 32,9% ein.
Führend ist nunmehr das Muster I mit 42,7%. Bei dem Interferenzmuster III lässt sich
ein Anstieg von 1,7% auf 6,7% verzeichnen und es gibt nach wie vor nur drei Isolate
mit dem agr-Interferenzmuster IV, dessen Anteil durch die Erweiterung der
Stammsammlung von vormals 2,6% auf 1,8% abgesunken ist. Bei den sporadischen
Stämmen gibt es keine wesentliche Veränderung in der Verteilung.
Durch die Aktualisierung der Daten wurde die Dynamik deutlich, mit der sich die
Anteile der Interferenzmuster bei den epidemischen und unklaren Gruppen verändern.
Dies gilt insbesondere für die Muster I, Ia und II, die allesamt bei den großen
epidemischen PFGE-Gruppen zu finden sind. Die Gruppen III und IV sind hingegen nur
selten vorhanden und zeigen wenige Veränderungen im zeitlichen Verlauf.
75
Diskussion
4 Diskussion
4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen
Seit einigen Jahren werden in der infektionsepidemiologischen Forschung MRSA-
Stämme beobachtet, die sich in einem kurzen Zeitraum über große Distanzen ausbreiten
und in vielen Ländern zu einem epidemiologischen Problem werden.
Es wird postuliert, dass nur eine begrenzte Anzahl von Staphylococcus-aureus-Klonen
klinische Relevanz hat und unverhältnismäßig häufig mit Infektionen assoziiert ist.
Booth et al. (2001) charakterisierten zum Beispiel 405 S.-aureus-Isolate mit der
Pulsfeldgelelektrophorese, die unterschiedliche Infektionstypen verursachten und aus
verschiedenen Regionen der USA stammten. Dabei fielen fünf MRSA-Stämme auf, die
für mehr als 65% aller Infektionen verantwortlich waren. Es ist davon auszugehen, dass
sie über besondere Eigenschaften verfügen, die ihre Ausbreitungsfähigkeit erhöhen.
Weltweit entstehen immer wieder Epidemien, die von wenigen, sich schnell
ausbreitenden MRSA-Stämmen verursacht werden, die zu einer medizinischen und
ökonomischen Krise führen können (siehe Einleitung 1.2.4). Der Vergleich des mecA-
Gens und seiner regulatorischen Gene erhärtet den Verdacht einer globalen Ausbreitung
bestimmter epidemischer MRSA (Lim et al., 2002). Durch die zunehmende
Antibiotikaresistenz von MRSA bleiben immer weniger Möglichkeiten, Infektionen mit
diesen Erregern zu therapieren. Deshalb ist es dringend erforderlich, neben
konsequenten hygienischen Maßnahmen zur Prophylaxe und Eindämmung von MRSA-
Infektionen, die Ursache dieser besonderen Ausbreitungsfähigkeit der Epidemiestämme
zu ergründen.
Ist die zunehmende Antibiotikaresistenz für die Epidemieentstehung einiger Klone
verantwortlich? Enright et al. (2002) beobachteten, dass sich MRSA–Klone wiederholt
aus erfolgreichen epidemischen MSSA-Klonen entwickelt haben. Isolate mit
verminderter Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin sind wiederum aus epidemischen
MRSA-Klonen hervorgegangen. Dies zeigt die gefährliche Entwicklung einer
zunehmenden Antibiotikaresistenz innerhalb einer kleinen Gruppe ökologisch
erfolgreicher S.-aureus-Genotypen, gegen die es kaum noch Therapiemöglichkeiten gibt
(Enright et al., 2002; Robinson und Enright, 2004).
76
Diskussion
Der Erwerb zusätzlicher Resistenzen ist sicherlich ein begünstigender Faktor für die
erfolgreiche Ausbreitung eines S.-aureus-Stammes. Dies reicht als Erklärung jedoch
nicht aus, denn dann müssten sich immer diejenigen Stämme mit den meisten
Antibiotikaresistenzen am erfolgreichsten ausbreiten. In den letzten Jahren ist in
Deutschland allerdings eine Abnahme der breiten Mehrfachresistenz bei epidemischen
MRSA-Stämmen zu beobachten. Ihnen fehlen Resistenzgene, die in vielen anderen,
weit weniger verbreiteten MRSA enthalten sind (Braulke et al., 1999; Voss et al., 1994).
Seit Mitte der 1990er Jahre nehmen diese neuen klonalen Gruppen mit geringerer
Mehrfachresistenz zu. Der Grund dieser Entwicklung ist bislang nicht bekannt (Robert
Koch-Institut, 1999; Robert Koch-Institut, 2003).
Papakyriacou et al. (2000) entdeckten zwei epidemische Stämme von S. aureus, die für
die Hälfte aller Infektionen in Kanada verantwortlich waren und einen einheitlichen
Phänotyp aufwiesen. Die Sekretion von Exoproteinen dieser Stämme ist zu Gunsten
einer vermehrten Bindung an Wirtszellproteine begrenzt. Es wird nun vermutet, dass
dieser spezielle Phänotyp die Kolonisierungsphase der Infektion favorisiert und dass
dieses Phänomen für die starke Prävalenz der Stämme unter den klinischen Isolaten
verantwortlich sein könnte (Gillaspy et al., 1995). Eine Gruppe von Regulatorgenen, zu
denen unter anderem die Genloci agr, sar und sae gehören, werden mit diesen
Eigenschaften in Verbindung gebracht, sodass es sinnvoll erscheint, hier nach einer
Erklärung für die genetische und molekulare Basis der Überrepräsentation einiger
MRSA-Stämme zu suchen.
Eines dieser Regulatorsysteme, agr, wurde in dieser Arbeit näher untersucht, denn eine
mögliche Erklärung für die Ausbreitungsfähigkeit bestimmter MRSA-Stämme könnte
mit der Variabilität des agr-Genlocus zusammenhängen. Zunächst wurde für NRW -und
hier hauptsächlich für Bochum und Umgebung- ermittelt, ob es auch in dieser Region
epidemische MRSA-Stämme gibt und, falls ja, ob sie bereits bekannten nationalen und
internationalen Epidemiestämmen entsprechen. Nachfolgend wurde untersucht, ob einer
der vier bekannten Polymorphismen des agr-Locus, agr I,-II,-III oder –IV, besonders
häufig mit epidemischen MRSA-Stämmen assoziiert ist.
77
Diskussion
4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien
Die Suche nach den Ursachen für die epidemische Verbreitung einiger MRSA-Klone
bildete den Schwerpunkt dieser Arbeit. Um herauszufinden, ob es epidemische MRSA-
Stämme auch in Bochum gibt, wurden aus der untersuchten Stammsammlung
diejenigen Stämme erfasst, die sehr häufig im Untersuchungsmaterial von Patienten
auftraten und somit von besonderem klinischen Interesse sind.
Anhand der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Bandenmuster wurde der
Verwandtschaftsgrad von MRSA-Isolaten aus 20 Kliniken in Nordrhein-Westfalen
ermittelt. Die meisten Isolate stammten aus Krankenhäusern Bochums.
Die Studie wurde in zwei Untersuchungszeiträume aufgeteilt, da die Stammsammlung
des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum regelmäßig mit neuen
Isolaten erweitert wird, sodass sich der gesamte Beobachtungszeitraum dieser Arbeit
auf annähernd sechs Jahre erstreckte.
Im ersten etwa dreijährigen Zeitraum, von Februar 1998 bis Dezember 2000, wurden
417 Isolate analysiert. Von Januar 2001 bis Januar 2004 wurde die Anzahl der Isolate
um 744 auf 1161 erweitert. Die Verwandtschaftsgrade der Isolate untereinander wurden
computergestützt anhand der PFGE-Muster errechnet und anschließend manuell
korrigiert (siehe Ergebnisse 3.1.1).
Bei der epidemiologischen Klassifizierung der MRSA-Isolate fielen im ersten
Untersuchungszeitraum sieben Stämme auf, von denen 20 oder mehr Isolate in den
Kliniken auftraten. Diese Stämme könnten somit die gesuchte Fähigkeit besitzen, sich
effektiv und schnell im Klinikmilieu auszubreiten. Im zweiten Untersuchungszeitraum
traten vier zusätzliche Epidemiestämme auf.
Besonders hervorzuheben waren insgesamt vier MRSA-Stämme mit jeweils mehr als
100 Isolaten, zu denen 51,2% der klinischen Isolate in der untersuchten
Stammsammlung gerechnet werden konnten. Somit dominieren auch in Bochum
bestimmte MRSA-Stämme, wobei vier von diesen für mehr als die Hälfte der
Infektionen verantwortlich sind.
78
Diskussion
4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum
Die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum
wurde mit bekannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Die
Pulsfeldgelmuster der Isolate mit der Dauerkultur-Nummer 429 und 1268 in der PFGE-
(Pulsfeldgelelektrophorese-) Gruppe 19, die nur aus diesen beiden Isolaten besteht,
entsprechen den bekannten Epidemiestämmen SA 506 (Booth et al., 2001) aus den
USA, CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000) aus Kanada sowie EMRSA-16 (Cox et al.,
1995) aus Großbritannien (siehe Ergebnisse, Abbildung 12). Es handelt sich hier
vermutlich um einen Stamm, der in allen vier Ländern, Deutschland, Großbritannien,
Kanada und den USA, zu finden ist, wobei das Isolat aus der Stammsammlung in
Bochum im Gegensatz zu allen anderen nicht epidemisch ist. Eine mögliche Erklärung
dafür könnten Interaktionen mit den lokal vorhandenen Stämmen oder veränderte
Umweltbedingungen sein, die eine Ausbreitung des MRSA-Stammes in Bochum
verhinderten, sodass bislang nur zwei Isolate dieses Stammes vorliegen.
Möglicherweise sind die verglichenen Stämme aber auch genetisch verschiedener, als
die PFGE-Muster vermuten lassen. Es könnte sich hier um Unterschiede handeln, die
mit der Pulsfeldgelelektrophorese nicht erfasst werden. Da jedoch die Akkumulation
von genetischen Variationen bei Anwendung der PFGE schnell zu beträchtlichen
Veränderungen im Pulsfeldgelmuster führt, ist eher vom umgekehrten Fall auszugehen,
dass nämlich sehr nahverwandte MRSA-Klone unterschiedlich klassifiziert werden
(Enright et al., 2002).
Inzwischen wurde die MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum auch mit anderen Methoden charakterisiert, wobei die
MLST (Multilocus Sequence Typing) eine wichtige Stellung einnimmt. Die Ergebnisse
der MLST verifizierten die mit der PFGE ermittelten Verwandtschaftsverhältnisse unter
den MRSA (Tenover et al., 1995). Deshalb scheinen die PFGE-Ergebnisse für einen
Vergleich der MRSA-Isolate geeignet zu sein (van Belkum et al., 1998).
Auch in der Literatur werden Fälle beschrieben, bei denen ein Stamm in einem Land
epidemisch und in einem anderen Land nur sporadisch auftritt. In Kanada war ein Isolat
(PFGE CDN-type 160) identisch mit dem PFGE-Muster des iberischen Klons, dem
Epidemiestamm, der zuerst in Spanien und Portugal und anschließend auch in anderen
europäischen Ländern zu einem klinischen Problem geworden war.
79
Diskussion
Nachdem er 1995 erstmals in Kanada identifiziert wurde, hat er sich nicht wie in Europa
ausgebreitet, sondern ist auf dem amerikanischen Kontinent nur noch ein einziges Mal
in New York aufgefallen. Ebenso wurde der brasilianische Epidemiestamm in Kanada
insgesamt nur vier Mal während eines Ausbruchs im November 1998 identifiziert.
Gründe für ein Ausbleiben der Verbreitung in Kanada sind bislang nicht bekannt (Simor
et al., 2002). Blanc et al. (2002) nehmen an, dass die Ausbreitung bestimmter MRSA-
Klone mit intrinsischen Faktoren wie Überlebensfähigkeit, Kolonisierung und
antimikrobieller Resistenz sowie extrinsischen Faktoren wie Populationsmigration und
Infektionskontrolle zusammenhängen.
Bei weiteren Vergleichen der Stammsammlung mit anerkannten Epidemiestämmen fiel
eine große Ähnlichkeit des PFGE-Musters der Gruppe 4 (epidemiologische Bedeutung
unklar) mit dem des Hannoverschen Epidemiestammes auf. Die epidemische PFGE-
Gruppe 5 entsprach dem Süddeutschen Epidemiestamm. Der vierthäufigste MRSA-
Stamm in Bochum, PFGE-Gruppe 16, zeigte das gleiche Bandenmuster wie der Berliner
Epidemiestamm (siehe Ergebnisse, Abbildung 11). Es wurden demnach drei der
anerkannten Epidemiestämme in Bochum identifiziert. Die drei größten epidemischen
PFGE-Gruppen der Stammsammlung (13, 7 und 35) lassen sich jedoch keinem
anerkannten Epidemiestamm zuordnen und breiten sich möglicherweise nur im Raum
Bochum aus.
4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation
Da für eine Beurteilung des epidemischen Verhaltens der MRSA-Stämme nicht nur die
Anzahl der Isolate, sondern auch die Verteilung auf die Kliniken bedeutsam ist, wurde
analysiert, aus welchen Kliniken die einzelnen Isolate eines Stammes beziehungsweise
einer PFGE-Gruppe eingeschickt wurden (siehe Ergebnisse 3.3).
Die Isolate der epidemischen PFGE-Gruppen stammen aus vielen unterschiedlichen
Krankenhäusern (siehe Ergebnisse, Abbildung 13). Auf Grund dessen kann davon
ausgegangen werden, dass die Stämme nicht nur als epidemisch klassifiziert wurden,
weil 20 oder mehr Isolate mit dem gleichen PFGE-Muster identifiziert wurden (siehe
Material und Methoden 2.2.2), sondern weil sie sich auch in vielen verschiedenen
Kliniken ausgebreitet haben.
80
Diskussion
Wenn nur die Anzahl der Isolate als ein Kriterium für die epidemiologische
Klassifikation diente, wäre es möglich, dass alle Isolate eines epidemischen Stammes
von der gleichen Klinik stammen. Deshalb wurde in dieser Studie die Verteilung der
Isolate auf die Kliniken berücksichtigt und es zeigte sich, dass die epidemischen PFGE-
Gruppen in hohem Maße in den untersuchten Kliniken verbreitet sind (siehe Ergebnisse,
Abbildung 13).
Es gibt jedoch einige Ausnahmen, bei denen die epidemiologische Einteilung in Frage
gestellt werden muss. Auffällig war, dass einige Stämme sehr stark in den Kliniken
verbreitet waren, die Anzahl ihrer Isolate aber nur knapp die für diese Studie willkürlich
gesetzte Grenze für epidemische Stämme überschritt. Bei den unklaren PFGE-Gruppen
14 und 15 stammen die Isolate aus jeweils sieben verschiedenen Kliniken, erreichen
aber nicht die Grenze von 20 Isolaten. Somit gelten sie nach dieser Einteilung nicht als
epidemisch. Gruppe 14 besteht aus 16 und Gruppe 15 aus 11 Isolaten. Der Stamm 1 mit
22 Isolaten hingegen wird zu den epidemischen Stämmen gezählt, obwohl er nur in
zwei Kliniken zu finden war. Die starke Ausbreitung der MRSA-Stämme 14 und 15 auf
die sieben Kliniken lässt ein epidemisches Verhalten vermuten, auch, wenn dazu die
notwendige Anzahl der Isolate fehlt. Da die epidemiologische Einteilung auf einer
willkürlichen Operationalisierung beruht (siehe Material und Methoden 2.2.2), mindert
das die Validität der epidemiologischen Klassifizierung bei den Gruppen, die nur etwas
mehr als 20 Isolate aufweisen. Es stellt sich deswegen die Frage, ob Gruppe 14 und 15
nicht eher den epidemischen Stämmen zugeordnet werden müssten als zum Beispiel
PFGE-Gruppe 1.
Bei den großen epidemischen Gruppen treten diese Probleme nicht auf. Sie enthalten
viele Isolate aus vielen verschiedenen Krankenhäusern, was die Annahme ihres
epidemischen Verhaltens stützt. Die Isolate der größten Gruppe, 13, stammen aus 15
verschiedenen Kliniken und ebenso die der viertgrößten Gruppe, 16. Eine besonders
ausgeprägte Fähigkeit, sich bei relativ geringer Anzahl an Isolaten auszubreiten, scheint
Gruppe 11 der epidemischen Stämme zu besitzen. Sie ist mit 58 Isolaten zwar nicht
besonders groß, jedoch stammen diese aus 14 verschiedenen Kliniken (siehe
Ergebnisse, Abbildung 13).
Solange es keine genaue Definition für Epidemiestämme gibt, wird eine Ungewissheit
bei der PFGE-Gruppen-Einteilung bestehen bleiben. Mit steigender Gesamtzahl der
Isolate sollte die Grenze, ab welcher ein Stamm als epidemisch gilt, angepasst werden.
81
Diskussion
4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus
Auf Grund der immensen klinischen Bedeutung hat sich ein zunehmend wichtiger
werdendes Forschungsfeld gebildet, um Gene und regulatorische Mechanismen zu
entschlüsseln, die mit der Pathogenität von S. aureus in Verbindung gebracht werden.
Eine der dabei angewandten Strategien zielt darauf ab, die Kommunikation der
Bakterien untereinander zu studieren, um dadurch einen Ansatz für ein therapeutisches
Vorgehen zu erhalten. Im Unterschied zu den Antibiotika, welche bakterizid oder
bakteriostatisch wirken, würden die Bakterien hierbei von ihren Informationskanälen
abgeschnitten. Lange Zeit hat man sich bei der Erforschung der bakteriellen
Kommunikation auf Umweltsignale konzentriert, die die Regulatorsysteme für
Virulenzfaktoren in Bakterien aktivieren. Demgegenüber reagieren Bakterien jedoch
nicht nur auf Änderungen der Umwelt, sondern sie verfügen außerdem über ein
autoinduzierendes Regulatorsystem, durch das sie selbst die Regulation beeinflussen
(Balaban und Novick, 1995). Bei diesem werden jedoch nicht nur einfache Signale
vermittelt, sondern die Individuen kommunizieren mittels weit reichender chemischer
Signale und synchronisieren sich durch Mehrheitsentscheid (Quorum) zu einem
kollektiven Verhaltensmuster (Yarwood et al., 2004).
Die meisten Quorum-sensing-Systeme sind spezies- oder gruppenspezifisch, allerdings
sind auch solche bekannt, die Interaktionen zwischen verschiedenen Bakterienspezies
zulassen (Taga und Bassler, 2003; Zhu et al., 2001). Sie übernehmen die Regulation
komplexer Vorgänge wie Sporulation, Reifung, Biolumineszenz, Virulenzfaktor-
Expression und Biofilm-Formation (Engebrecht et al., 1983; Engebrecht und Silverman,
1984; Greenberg, 2003). Die Entdeckung solcher Kommunikationssysteme und das
zunehmende Verständnis ihrer Funktion und Wechselwirkungen könnten in Zukunft
von therapeutischem Nutzen sein. In der biotechnologischen Industrie werden
Strategien zur Modifikation der bakteriellen Kommunikation erforscht, um neue
antimikrobielle Substanzen zu entwickeln (Federle und Bassler, 2003).
82
Diskussion
4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von
MRSA-Stämmen
Gibt es unter den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen Präferenzen für
bestimmte epidemiologische Eigenschaften der MRSA-Stämme (epidemisch, unklar,
sporadisch)? Infektionen, die von S. aureus verursacht werden, beruhen
höchstwahrscheinlich zu einem Großteil auf der enormen Fähigkeit dieses Bakteriums,
sich auf verändernde Umweltbedingungen einzustellen. In jeder Phase der Infektion
scheint dieses hohe Maß an Koordination und Anpassung der Erreger durch die
Expression von Genen mittels eines Signaltransduktionsmechanismus moduliert zu
werden (Bayer et al., 1996).
Die Suche nach Unterschieden zwischen epidemischen und sporadischen MRSA-
Stämmen hinsichtlich ihrer agr-Interferenzgruppen steht im Mittelpunkt dieser Arbeit.
Es soll untersucht werden, welche Faktoren bestimmte MRSA-Stämme dazu befähigen,
sich stark auszubreiten und lange Zeit zu persistieren, sodass sie zu einem
epidemiologischen Problem werden.
Diese Studie basiert auf der Entdeckung, dass die Sequenzvariationen innerhalb der
agrBDC-Region des agr-Locus einen Mechanismus mikrobieller Interferenz fördern
und wurde in Anlehnung an die Methoden von Papakyriacou et al. (2000) durchgeführt.
Angenommen wird eine Kolonisierung epidemischer MRSA in Gegenwart anderer S.-
aureus-Stämme, was vor allem für den nosokomialen Bereich zutrifft. Der agr-Locus
von epidemischen MRSA müsste demnach eine verstärkte Kolonisierung in der
Gegenwart residenter S. aureus und Koagulase-negativer-Staphylokokken, die auch ein
agr besitzen, zulassen. Papakyriacou et al. (2000) untersuchten, ob die Aktivität des
agr-Genlocus in epidemischen MRSA-Stämmen entweder die Kolonisierung oder die
Invasion fördert. Unter Berücksichtigung des bisherigen Modells zur Funktionsweise
des agr-Locus, kann angenommen werden, dass eine verstärkte Kolonisierung durch
eine Verzögerung oder Abschwächung der RNA-III-Transkription erreicht werden
kann. Sie untersuchten weiterhin, ob und inwiefern sich epidemische MRSA von
sporadischen hinsichtlich der bisher vier bekannten agr-Interferenzgruppen
unterscheiden.
83
Diskussion
Um herauszufinden, ob es eine agr-Interferenzgruppe gibt, die besonders für die
epidemiologischen Eigenschaften prädestiniert ist, befassten sich Papakyriacou et al.
(2000) mit epidemischen MRSA in Kanada, den sogenannten CMRSA. Sie fanden die
allgemein akzeptierte These bestätigt, dass die Expression von Kolonisierungsfaktoren
reduziert wird und die Expression von Toxinen und gewebezerstörenden Faktoren mit
der vermehrten RNA-III-Transkription zunimmt, wenn der agr-Locus bei hoher
Zelldichte aktiviert ist.
Papakyriacou et al. (2000) fanden bei der Suche nach unterschiedlichen agr-
Interferenzmustern von epidemischen und sporadischen MRSA insgesamt drei
verschiedene RFLP-Muster und entdeckten einen Subtyp von I, nämlich Ia. Diesen
fanden sie bei nur einem der sporadischen Stämme, dagegen aber bei allen Subtypen des
epidemischen Stammes CMRSA-1. In der vorliegenden Studie wurden durch
Ermittlung der Restriktionslängen alle vier bekannten Interferenztypen nachgewiesen
(siehe Material und Methoden, Abbildung 8). Papakyriacou et al. (2000) fanden heraus,
dass die Typ-I-Interferenzgruppe, die mit dem epidemischen CMRSA-3 in Verbindung
gebracht wird, ebenfalls unter den sporadischen Stämmen am häufigsten zu finden ist.
Hieraus schlossen sie, dass die Interferenzgruppe I möglicherweise am besten geeignet
ist, um eine Kolonisierung in Gegenwart anderer S. aureus zu erlauben, die ebenfalls
dieser Interferenzgruppe angehören.
In dieser Arbeit wurde analog verfahren und ebenso nach einer vorherrschenden
Interferenzgruppe unter den epidemischen Stämmen gesucht. Hierzu wurden die agr-
Interferenzmuster der MRSA-Stämme bestimmt (siehe Material und Methoden 2.2.7).
Im ersten Zeitraum der etwa sechsjährigen Studie konnten 161 der 227 Isolate von den
epidemischen MRSA-Stämmen der Interferenzgruppe II (70,9%) zugeordnet werden.
Dieses Muster schien, verglichen mit den 27 Isolaten (11,9%) der Interferenzgruppe I
und den 39 Isolaten (17,2%) der Gruppe Ia, unter den epidemischen Stämmen
auffallend häufig vertreten zu sein. Das Interferenzmuster II trat auch bei den bisher
unklaren PFGE-Gruppen häufiger als die anderen Interferenzmuster auf, nämlich bei 62
von 118 Isolaten (52,5%). Im Gegensatz dazu fand sich unter den 48 sporadischen
Isolaten die Interferenzgruppe I mit 29 (60,4%) von 48 Isolaten am häufigsten (siehe
Ergebnisse 3.1.1). Zunächst schien somit eine deutliche Korrelation der epidemischen
Stämme zur Interferenzgruppe II und der sporadischen Stämme zum Interferenztyp I zu
bestehen.
84
Diskussion
Sakoulas et al. (2003) fanden in Blutkulturen von MRSA-Isolaten aus Kliniken in
Boston und Baltimore ebenfalls einen überwiegenden Anteil der agr-Interferenzgruppe
II mit 56%. Diese Ergebnisse widersprechen jedoch denen der kanadischen Studie von
Papakyriacou et al. (2000). In ihrer Studie überwog die Interferenzgruppe I sowohl bei
den epidemischen als auch bei den sporadischen MRSA-Stämmen. Auch in anderen,
vor allem europäischen Studien, kam man zu dem Ergebnis, dass die große Mehrheit
der klinischen S.-aureus-Isolate zur agr-Gruppe I gehören (Moore und Lindsay, 2001;
van Leeuwen, 2000).
Im zweiten Beobachtungszeitraum dieser Arbeit zeigte sich zwar noch eine Präferenz
der epidemischen Gruppen für das agr-Interferenzmuster II, deren Anteil hatte jedoch
deutlich abgenommen. Die Interferenzgruppen I und Ia waren unter den epidemischen
Stämmen wesentlich häufiger zu finden (siehe Ergebnisse 3.4.2).
Die anfängliche Annahme einer Dominanz der Interferenzgruppe II unter den
epidemischen MRSA-Stämmen muss entsprechend korrigiert werden. Es lässt sich nach
Auswertung des gesamten Beobachtungszeitraumes eher vermuten, dass die
epidemiologischen Eigenschaften nicht wesentlich von den agr-Interferenztypen
beeinflusst werden.
Bei den größten Epidemiegruppen der untersuchten Stammsammlung finden sich drei
agr-Interferenzmuster, I, Ia und II. Auch die anerkannten deutschen Epidemiestämme
weisen verschiedene Interferenzmuster auf. So zählt der Hannoversche Epidemiestamm
(PFGE-Gruppe 4) zur agr-Interferenzgruppe I, der Berliner Epidemiestamm (PFGE-
Gruppe 15) zur Interferenzgruppe Ia und beim Süddeutschen Epidemiestamm (PFGE-
Gruppe 5) findet sich das Interferenzmuster II. Die Muster III und IV konnten nur bei
kleinen, unklaren PFGE-Gruppen identifiziert werden (siehe Ergebnisse, Abbildung 21
und Tabelle 10). Eine Voraussage über das epidemiologische Verhalten eines MRSA-
Stammes anhand seines agr-Interferenzmusters ist somit nicht möglich.
85
Diskussion
4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem
agr-Interferenzmuster
Ambulante Infektionen mit cMRSA (community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus) weisen scheinbar ausschließlich das agr-Interferenzmuster III
auf (Dufour et al., 2002; Witte et al., 2004). Ebenso scheint es eine Verbindung der agr-
Interferenzgruppe III mit dem Toxic-Schock-Syndrom und dem agr-Interferenzmuster
IV mit dem „staphylococcal scalded skin syndrome“ zu geben (Jarraud et al., 2002;
Musser et al., 1990).
Des Weiteren gibt es Hinweise auf eine erhöhte intrinsische
Überlebenswahrscheinlichkeit des agr-Gruppe-II-Polymorphismus unter einer
Vancomycin-Therapie (Moise-Broder et al., 2004; Verdier et al., 2004).
Sakoulas et al. (2002) fanden bei allen acht bekannten GISA- und hetero-GISA-
Stämmen aus den Vereinigten Staaten und Japan die agr-Interferenzgruppe II.
Außerdem wurde bei ihnen durch die fehlende Expression von δ-Hämolysin eine
fehlerhafte agr-Funktion nachgewiesen. Bei einigen klinischen GISA-Isolaten fielen
Punktmutationen innerhalb des agr-Genlocus auf, was die fehlerhafte agr-Funktion
erklären könnte. Ein im Labor generierter agr-Null-Stamm zeigte einen geringen,
jedoch reproduzierbaren Anstieg der Vancomycin-Heteroresistenz nach in-vitro-
Wachstum in subinhibitorischen Vancomycin-Konzentrationen (1 µg/ml). Dies war in
dem isogenen Mutterstamm der agr-Gruppe II mit intaktem agr nicht der Fall. Die in
vitro bakterizide Aktivität von Vancomycin war im agr-Null-Stamm, verglichen mit
dem Mutterstamm, abgeschwächt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine
eingeschränkte oder defekte agr-Funktion für die Entwicklung einer Vancomycin-
Heteroresistenz von Vorteil sein könnte (Sakoulas et al., 2002).
Die Bestimmung der agr-Interferenzgruppen ist kein anerkanntes Verfahren zur
Ermittlung der Vorfahren aktueller MRSA-Klone. Besser geeignet zur Stammbaum-
Erstellung ist eine neuere Methode, MLST (Multilocus Sequence Typing), womit
Sakoulas et al. (2003) zeigten, dass die Sequenz ST-5 der genetische Vorfahre der
meisten weltweiten GISA ist. Nicht verwunderlich war, auf Grund der identischen
MLST-Typen, dass die Stämme auch mit den schon genannten Methoden (agr-
Typisierung und PFGE-Muster-Vergleich) Verwandtschaftsverhältnisse erkennen
ließen.
86
Diskussion
Somit liegt die Vermutung nahe, dass der MRSA-Stamm ST-5 den klonalen
Hintergrund für die GISA-Stämme bildet und außerdem zur agr-Gruppe II gehört
(Sakoulas et al., 2003).
Ein besonderer Effekt nur einer bestimmten agr-Interferenzgruppe auf die
Ausbreitungsfähigkeit ist bisher nicht bekannt und konnte in der vorliegenden Arbeit
auch nicht nachgewiesen werden.
4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo
Ist der agr-Genlocus der entscheidende Faktor für die Überrepräsentation einiger
MRSA-Stämme?
Strommenger et al. (2003) beobachteten während der letzten acht Jahre einen Wechsel
in der Prävalenz und Ausbreitung verschiedener epidemischer MRSA in Zentraleuropa.
Sie verglichen die agr-Gruppenspezifität der älteren und der neueren Epidemiestämme
miteinander und stellten fest, dass diese Dynamik nicht auf die agr-Gruppenspezifität
zurückgeführt werden kann. Weltweit weisen die meisten MRSA-Stämme
verschiedener klonaler Abstammung die agr-Spezifität I auf, und zwar unabhängig von
ihrer epidemiologischen Relevanz. Strommenger et al. (2003) schließen daraus, dass
agr für die Epidemieentstehung keine entscheidende Rolle spielt.
Unter in-vitro-Bedingungen wurde bereits mehrfach nachgewiesen, dass die Expression
der meisten Virulenzfaktoren von S. aureus durch den globalen Regulator agr
koordiniert werden. Erstaunlich sind hingegen Ergebnisse, bei denen der agr-Locus
zwar identifiziert wurde, jedoch keine Funktion zeigte. Goerke et al. (2000)
entwickelten eine Methode, um die bakterielle Genregulation im Wirt zu überwachen.
Mit einer direkten Transkript-Analyse von klinischen S.-aureus-Isolaten fanden sie
heraus, dass die RNA III, das Effektormolekül für das agr-Regulationssystem, in der
Lunge von Patienten mit zystischer Fibrose kaum exprimiert wird. Dies legt den Schluss
eines inaktiven agr in vivo nahe. Die Transkription der RNA III in vivo war
vergleichbar mit dem Level der Expression in der exponentiellen Wachstumsphase der
Bakterien und lag immer weit unter dem Transkriptionslevel der postexponentiellen
Phase. Auch die Expressionsprofile von spa (Protein A) und hla (α-Toxin) sprachen für
einen inaktiven agr-Locus.
87
Diskussion
Bei Patienten, die unter zystischer Fibrose leiden, scheint die agr-Aktivität nicht
essentiell zu sein. Goerke et al. (2000) schlossen aus ihren Ergebnissen, dass für die
Virulenz von S. aureus in vivo andere regulatorische Mechanismen verantwortlich sind,
als die bisher in vitro charakterisierten. Sie vermuteten weiter, dass das agr-System
möglicherweise nur bei besonderen Typen von Infektionen, in diesem Fall chronischen
Infektionen, oder in bestimmten Phasen der Infektion aktiv ist. Bei der chronischen
Lungenentzündung einer zystischen Fibrose ist S. aureus in dem hochviskösen Schleim
lokalisiert, sodass es keine systemische Manifestation gibt. Somit ist das Fehlen der
agr-Aktivität vielleicht einzigartig bei Patienten mit CF (Goerke et al., 2000; Goerke et
al., 2003; Goerke und Wolz, 2004). Des Weiteren fanden sie keinen Anhaltspunkt für
eine agr-abhängige Interferenz zwischen den S.-aureus-Stämmen während einer
Pneumonie von Patienten mit zystischer Fibrose. Die These, dass die Dominanz
bestimmter Klone nicht von der agr-Gruppenspezifität abhängig ist, wird auch von Kahl
et al. (2003) unterstützt. Sie verglichen die agr-Interferenzgruppen-Verteilung von
persistenten S. aureus bei Patienten mit zystischer Fibrose mit denen nasal kolonisierter
gesunder Träger. Dabei fanden sie keinen Unterschied.
Yarwood et al. (2002) stellten fest, dass für die Ausbildung des TSS (Toxic-Schock-
Syndrom) bei S. aureus die Aktivität des agr-Systems nicht erforderlich ist. Die
Zerstörung des agr-Locus zeigte in vivo nur einen minimalen Effekt auf die Expression
von Virulenzfaktoren.
Andererseits gibt es Tiermodelle, die den agr-Locus als einen wichtigen Virulenzfaktor
validieren. In diesen Modellen waren agr-Mutanten weniger virulent als der
korrespondierende Wildtyp-Stamm (Projan und Novick, 1997). Bei agr- und sar-
Mutanten wurde fast in jedem Tiermodell eine Reduktion der Virulenz beobachtet. Eine
verminderte Virulenz bei agr-Mutanten zeigte sich in Modellen von subkutanen
Abszess-Formationen (Mayville et al., 1999), einer Arthritis in Mäusen (Abdelnour et
al., 1993) sowie einer Osteomyelitis (Gillaspy et al., 1995) und Endokarditis (Cheung et
al., 1994) in Kaninchen. Jedoch konnte in diesen Tiermodellen die Fähigkeit von S.
aureus, Krankheiten auszulösen, nicht eliminiert werden. Vielleicht führt die vermehrte
Expression von Oberflächenproteinen auch zu einer erhöhten Fähigkeit, bestimmte
Gewebetypen des Wirtes zu kolonisieren, sodass der Organismus im Wirt persistieren
kann, ohne eine offenkundige Krankheit auszulösen (Gillaspy et al., 1995).
88
Diskussion
Ein weiterer Kritikpunkt gegen eine Übertragung der in vitro gewonnen Ergebnisse auf
die Situation in vivo ist, dass ein Großteil der Studien über die
Regulationsmechanismen von sar und agr an dem Laborstamm RN6390 durchgeführt
wurde. Es ist jedoch äußerst fraglich, ob diese Ergebnisse für klinische Isolate
repräsentativ sind (Blevins et al., 2002).
Des Weiteren gibt es außer agr zahlreiche andere Faktoren, die mit der Regulation der
Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden. Versuche, die Umweltbedingungen
zu verändern, haben gezeigt, dass zum Beispiel bei Erhöhung der Salzkonzentration die
Transkription und damit die Toxinproduktion bestimmter Virulenzfaktoren agr- und
sarA-unabhängig beeinflusst wird (Regassa und Betley, 1993). Lindsay und Foster
(1999) beschrieben, dass der agr-Locus die Transkription von hla aktiviert, für diese
jedoch nicht essentiell ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SarA einen
aktivierenden Effekt auf agr ausübt und damit indirekt die hla-Transkription fördert
(Cheung und Projan, 1994; Cheung et al., 1997; Chien und Cheung, 1998; Heinrichs et
al., 1996; Lindsay und Foster, 1999). Des Weiteren muss bedacht werden, dass die Liste
von Virulenzfaktoren limitiert ist durch die in-vitro-Experimente zu ihrer
Identifizierung. Es wäre möglich, dass in vivo bisher unbekannte Virulenzfaktoren eine
wichtige Rolle spielen (Dunman et al., 2001).
Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Virulenz und Ausbreitungsfähigkeit bleibt
somit weiterhin ungewiss. Auf Grund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit muss man
davon ausgehen, dass es keine agr-Interferenzgruppe gibt, die besonders für die
Entstehung von Epidemien prädestiniert ist.
89
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung Die deutlich zunehmende und mit modernen molekularbiologischen
Typisierungsmethoden nachgewiesene Verbreitung von MRSA-Epidemiestämmen
macht eine intensive Auseinandersetzung mit den Ursachen dieses Phänomens
erforderlich. Die epidemische Ausbreitungsfähigkeit ist eine komplexe Eigenschaft von
einigen S.-aureus-Stämmen, die von Faktoren des Stammes selbst
(Widerstandsfähigkeit, Ausstattung mit Enzymen und Toxinen, Regulation der
Virulenzfaktoren) und Faktoren seiner Umwelt (hygienische und antibakterielle
Maßnahmen) bestimmt werden. Mit der Überrepräsentation bestimmter MRSA-Stämme
wird vor allem das Regulatorgen agr von Staphylococcus aureus in Verbindung
gebracht. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Variabilität des agr-Genlocus mit
der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Epidemiestämmen korreliert.
Zunächst wurde die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der
Stadt Bochum durch die Analyse der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster auf epidemische
MRSA-Stämme hin untersucht. Es wurden Kriterien zur epidemiologischen
Klassifikation der MRSA-Isolate erstellt und im Rahmen dessen eine
Operationalisierung der Definitionen „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“
vorgenommen. Die MRSA-Stammsammlung wurde nachfolgend mit anerkannten
nationalen und internationalen Epidemiestämmen verglichen.
Im ersten etwa dreijährigen Beobachtungszeitraum der Studie (13.02.1998–31.12.2000)
wurden 417 MRSA-Isolate analysiert. Dabei fielen sieben Stämme auf, von denen
mindestens 20 Isolate gefunden wurden.
Im zweiten Untersuchungszeitraum (01.01.2001-12.01.2004) wurde die Anzahl der
Isolate um 744 auf 1161 erweitert und es fielen besonders vier MRSA-Stämme mit
jeweils mehr als 100 Isolaten auf, die für 51,2% aller Infektionen im Einzugsgebiet der
Studie verantwortlich waren. Diese könnten über die gesuchte Fähigkeit zur effektiven
und schnellen Ausbreitung im Klinikmilieu verfügen.
Das Pulsfeldgelmuster der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Gruppe 19, die nur aus
zwei Isolaten besteht, entsprach den anerkannten Epidemiestämmen SA 506 (Booth et
al., 2001) aus den USA, CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000) aus Kanada und
EMRSA-16 (Cox et al., 1995) aus Großbritannien.
90
Zusammenfassung
Da jedoch in der Bochumer Stammsammlung nur zwei Isolate dieses international
anerkannten Epidemiestammes zu finden waren, scheint er im Gegensatz zu
Großbritannien, Kanada und den USA in Deutschland nicht epidemisch aufzutreten.
Das PFGE-Muster der Gruppe 4 (unklares epidemiologisches Verhalten) entsprach
demjenigen des Hannoverschen Epidemiestammes und das der epidemischen PFGE-
Gruppe 5 dem Süddeutschen Epidemiestamm. Der vierthäufigste MRSA-Stamm in
Bochum, PFGE-Gruppe 16, wies das gleiche Bandenmuster wie der Berliner
Epidemiestamm auf. Insgesamt wurden drei der anerkannten deutschen
Epidemiestämme in Bochum identifiziert. Die drei größten epidemischen PFGE-
Gruppen der Stammsammlung (13, 7 und 35) lassen sich jedoch keinem anerkannten
Epidemiestamm zuordnen und breiten sich möglicherweise nur im Raum Bochum aus.
Es folgte eine Analyse des agr-Genlocus der epidemischen, unklaren und sporadischen
MRSA-Stämme, um herauszufinden, ob es unter den vier bekannten agrBDC-
Interferenzgruppen Präferenzen für bestimmte epidemiologische Eigenschaften
(epidemisch, unklar, sporadisch) gibt. Dabei wurde untersucht, ob sich epidemische von
sporadischen MRSA hinsichtlich ihres agr-Locus unterscheiden.
Im ersten Beobachtungszeitraum der etwa sechsjährigen Studie wurden 161 der 227
epidemischen MRSA-Isolate der agrBDC-Interferenzgruppe II (70,9%) zugeordnet. Bei
den 48 sporadischen Isolaten dominierte das Interferenzmuster I mit 29 Isolaten
(60,4%). Im ersten Untersuchungszeitraum fiel somit eine deutliche Korrelation der
epidemischen Stämme zur Interferenzgruppe II und der sporadischen Stämme zum
Interferenztyp I auf. Aus diesen Ergebnissen könnte man ableiten, dass die
Interferenzgruppe II für Epidemien besonders prädestiniert ist.
Bei Auswertung des gesamten Beobachtungszeitraumes (13.02.1998-12.01.2004) zeigte
sich zwar weiterhin eine Präferenz der epidemischen Gruppen für das agr-
Interferenzmuster II, jedoch hatte deren Anteil im zweiten Beobachtungszeitraum von
70,9% auf 53,3% deutlich abgenommen. Man muss den Ergebnissen der gesamten
Studie zufolge eher davon ausgehen, dass die epidemiologischen Eigenschaften nicht
mit einem der agr-Interferenzmuster korrelieren. Zudem fanden sich bei den größten
Epidemiegruppen der untersuchten Stammsammlung drei verschiedene agr-
Interferenzmuster, I, Ia und II. Auch die anerkannten deutschen Epidemiestämme
weisen jeweils unterschiedliche Interferenzmuster auf.
91
Zusammenfassung
Die Suche nach weiteren möglichen Faktoren für die Ausbreitungsfähigkeit von
MRSA-Epidemiestämmen sollte dieser Arbeit folgen. Außerdem gilt es, die Bedeutung
des agr-Systems in vivo zu klären.
92
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Zhu, J., Miller, M.B., Vance, R.E., Dziejman, M., Bassler, B.L., Mekalanos, J.J. (2001) Quorum-sensing
regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 3129-3134
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7 Danksagung
Bedanken möchte ich mich bei all denen, die mich bei der Durchführung der Experimente und
bei der Anfertigung der Dissertationsschrift unterstützt haben.
Zu großem Dank verpflichtet bin ich Prof. Dr. med. S. G. Gatermann für die Überlassung des
Themas sowie die intensive, ausdauernde und freundliche Betreuung.
Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum, ohne deren wohlwollende und kompetente Hilfe diese Arbeit
nicht möglich gewesen wäre.
Insbesondere möchte ich mich bei Frau Susanne Friedrich und Michaela Stieglitz-Rumberg
bedanken für die kontinuierliche Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation.
Helen Papakyriacou und Mary C. Booth danke ich für die Überlassung der epidemischen
MRSA-Stämme.
Des Weiteren möchte ich mich bei Christof Albers für die fachkundigen sprachlichen
Korrekturen und hilfreichen Anregungen bedanken. Der gesamten Familie Albers danke ich
für die moralische und kulinarische Unterstützung.
Kaschayar Saadat-Gilani und Christian Kersting möchte ich für die Ratschläge bei den
Abbildungen danken.
Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung meines
Studiums.
Vor allem gilt aber mein zutiefst empfundener Dank meiner lieben und geduldigen Freundin
Nicole.
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Sven Hengesbach, Geiststraße 84, 48151 Münster
Curriculum Vitae
Sven Hengesbach geboren am 08.10.1975 in Meschede
Schulausbildung 1982 – 1986 Marien-Grundschule in Meschede 1986 – 1995 Gymnasium der Benediktiner in Meschede, Abschluss Abitur Zivildienst Juli 1995 – Juli 1996 Pflegehilfe im St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Hochschulausbildung Oktober 1996 – Oktober 2002 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum August 1998 Physikum August 1999 1. Staatsexamen August 2001 2. Staatsexamen Oktober 2002 3. Staatsexamen
Famulaturen März 1999 Allgemein-Chirurgie, Kingston Hospital, London September 1999 Innere Medizin, St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Februar 2000 Allgemeinmedizinische Praxis, Meschede März 2000 Urologische Praxis, Meschede Juli/ August 2000 Viszeral- und Thoraxchirurgie, Charité, Berlin Februar/ März 2001 Radiologie, St. Josefs-Hospital, Bochum Praktisches Jahr Oktober 2001 – Oktober 2002 St. Josefs-Hospital Bochum (Universitätsklinik) Allgemein- und Gefäßchirurgie, Innere Medizin,
Anästhesie Berufspraxis Januar 2003 – Juni 2004 Arzt im Praktikum in der Chirurgischen Klinik I, Clemenshospital Münster Juli 2004 – Dezember 2004 Aktualisierung der Daten für die Dissertation und journalistische Hospitationen beim ZDF und NDR Ab Januar 2005 Assistenzarzt in der Inneren Klinik I, Raphaelsklinik Münster
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