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Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie

der Ruhr-Universität Bochum

Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone

und der Variabilität des agr-Genlocus

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Sven Hengesbach

aus Meschede

2006

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Manfred Köller

Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2006

Abstract

Hengesbach

Sven

Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone und der

Variabilität des agr-Genlocus

Problem: Weltweit wird das Phänomen beobachtet, dass Epidemien mit Methicillin-

resistenten Staphylococcus aureus von nur wenigen Stämmen dieser Spezies verursacht

werden. Die Entdeckung der agrBDC-Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass

ein bestimmter agr-Interferenztyp mit der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-

Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden könnte. Dies sollte in der

vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden.

Methoden: Anhand der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster wurden die Isolate der

MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt

Bochum nach epidemiologischen Kriterien klassifiziert und mit anerkannten nationalen

und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Zur Analyse der

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen erfolgte zunächst die DNA-Präparation.

Anschließend wurde eine PCR durchgeführt mit nachfolgender Aufreinigung der PCR-

Produkte. Zur Restriktionsanalyse wurde das Enzym DraI verwendet.

Ergebnisse: Es wurden vier epidemische MRSA-Stämme in Bochum identifiziert, die

51,2% aller Infektionen verursachten. Das PFGE-Muster von zwei Isolaten aus Bochum

war identisch mit anerkannten Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und

Großbritannien. Auch der Hannoversche-, Süddeutsche- und Berliner Epidemiestamm

waren in der Stammsammlung enthalten. Im ersten Beobachtungszeitraum (13.02.1998-

31.12.2000) wiesen 70,9% der epidemischen MRSA-Stämme das agr-Interferenzmuster

II auf. Bei Betrachtung des gesamten Untersuchungszeitraumes (13.02.1998-

12.01.2004) nahm sein Anteil auf 53,3% ab, während die Interferenzgruppen I und Ia

wesentlich häufiger unter den epidemischen Stämmen zu finden waren.

Diskussion: Da bei den MRSA-Epidemiestämmen mit den meisten Isolaten drei agr-

Interferenzmuster, I, Ia und II, zu finden waren, scheint es keine Präferenz der

epidemischen MRSA für ein bestimmtes Interferenzmuster zu geben. Dies gilt auch für

die Restriktionsmuster der anerkannten deutschen Epidemiestämme.

Für meine Eltern

Inhalt und Verzeichnisse

Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Staphylococcus aureus 1 1.1.1 Kolonisation und Infektion 1 1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus 2 1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 3 1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen 5 1.2.2 Resistenzentwicklung 6 1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die Entwicklung neuer Antibiotika 8 1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) 10 1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen 13 1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene Expression 14 1.4 Der agr-Genlocus 17 1.4.1 Globale Regulatorsysteme virulenzassoziierter Gene 17 1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme 19 1.4.3 Aufbau und Funktion des agr-Genlocus 22 1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus 26 1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies 28 1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar 29 1.6 Fragestellung 30 2 Material und Methoden 32 2.1 Material 32 2.1.1 Chemikalien 32 2.1.2 Stämme 32 2.1.3 Kulturmedien und Puffer 36 2.1.4 Enzyme 36 2.1.5 Oligonukleotide 36 2.2 Methoden 37 2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster 37 2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen Eigenschaften

„epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“ 39 2.2.3 DNA-Präparation 39 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 40 2.2.5 Agarosegelelektrophorese 41 2.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte 41 2.2.7 Restriktionsanalyse 42

I

Inhalt und Verzeichnisse

3 Ergebnisse 43 3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung 44 3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres klinischen Auftretens 44 3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004 47 3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen 51 3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme 54 3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme 63 3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA 64 3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen 68 4 Diskussion 76 4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen 76 4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien 78 4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum 79 4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation 80 4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus 82 4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen 83 4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem agr-Interferenzmuster 86 4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo 87 5 Zusammenfassung 90 6 Literaturverzeichnis 93 7 Danksagung 107 8 Lebenslauf 108

II

Inhalt und Verzeichnisse

Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden 33 Tabelle 2 mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens 34 Tabelle 3 In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa 35 Tabelle 4 Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens 36 Tabelle 5 Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000) 47 Tabelle 6 Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004 49 Tabelle 7 Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende zu Abbildung 13) 57 Tabelle 8 Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen 71 Tabelle 9 Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen 72 Tabelle 10 Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004 74 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren 18 Abbildung 2 Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells 21 Abbildung 3 Transkription des polycistronischen agr-Locus 23 Abbildung 4 Modell des agr-Systems von S. aureus 25 Abbildung 5 Hypervariable Region des agr-Genlocus 27 Abbildung 6 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software 38 Abbildung 7 Optimization 38 Abbildung 8 Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus 42 Abbildung 9 Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster (Stand der Sammlung: 31.12.2000) 46 Abbildung 10 Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer MRSA-Stammsammlung 48 Abbildung 11 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software,

Übereinstimmung mit PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme 52

Abbildung 12 Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien 54 Abbildung 13 Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen 56 Abbildung 14 Verteilung der 360 Isolate der Klinik A auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 15 Verteilung der 294 Isolate der Klinik B auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 16 Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 17 Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 18 Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR 65 Abbildung 19 Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI 67 Abbildung 20 Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme 69 Abbildung 21 Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung 73

III

Inhalt und Verzeichnisse

Verzeichnis der Abkürzungen

ABC ATP binding cassette ADP Adenosindiphosphat agr accessory gene regulator AIP autoinducing peptide ATP Adenosintriphosphat bidest. Bidestilliert bp Basenpaare °C Grad Celsius CDC Centers for Disease Control and Prevention CF Clumping factor cm Zentimeter cMRSA community acquired MRSA CMRSA Canadian methicillin-resistant Staphylococcus aureus cna collagen adhesion gen CNISP Canadian Nosocomial Infection Surveillance Program DNA Desoxyribonukleinsäure ds doppelsträngig EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EMRSA epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus EPIC European Prevalence of Infection in Intensive Care et al. et alii FDA Food and Drug Administration FnBPA Fibronektin-Bindeprotein A FnBPB Fibronektin-Bindeprotein B IgG Immunglobulin G g Gramm x g Gravitationskonstante der Erde GISA Glykopeptid-intermediäre Staphylococcus aureus GPI-Karte gram-positiv identification card h Stunde HCl Salzsäure hla Alphatoxin-Gen HIV human immunodeficiency virus H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HPK Histidin-Proteinkinase IL-2 Interleukin-2 kb Kilobasen kD Kilodalton (Einheit für das Molekulargewicht) KNS Koagulase-negative Staphylokokken l Liter M Molar mecA Penicillin-Resistenzgen mg Milligramm min Minute ml Milliliter MLEE Multilocus Enzyme Electrophoresis MLST Multilocus Sequence Typing

IV

Inhalt und Verzeichnisse

mM Millimolar mRNA messenger-Ribonukleinsäure MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MSCRAMM microbial-surface components recognizing adhesive matrix molecules MSSA Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards ng Nanogramm nm Nanometer NNIS National Nosocomial Infections Surveillance NRW Nordrhein-Westfalen ORF open reading frame PBP Penicillin-Bindeprotein PBP2a Penicillin-Bindeprotein 2a PCR Polymerase-Kettenreaktion pmol Pikomol RAP RNA III activating protein RIP RNA III inhibiting peptide RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RR response regulator sar staphylococcal accessory regulator spa Gen für Protein A TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq Thermophilus aquaticus TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung TE Tris-EDTA TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha Tris Tris(hydroxymethylaminomethan) U Unit µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer UV Ultraviolett V Volumen VISA Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus VRSA Vancomycin-resistente Staphylococcus aureus V/cm Volt/Zentimeter (v/v) Volumen/Volumen VRE Vancomycin-resistente Enterokokken WHO Weltgesundheitsorganisation (w/v) Gewicht/Volumen

V

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Staphylococcus aureus

Die Gattung Staphylococcus enthält über 30 Spezies und Subspezies und ist den

grampositiven Kokken zuzuordnen. Staphylokokken bilden keine Sporen, haben eine

kugelige bis ovale Zellform und einen Durchmesser von etwa 1 µm. Sie vermehren sich

sowohl aerob als auch anaerob und ordnen sich in Haufen oder Trauben an (griechisch

staphyle, die Traube). Das Enzym Koagulase wird nur von Staphylococcus aureus

gebildet und ist somit ein wesentliches diagnostisches Kriterium der klinisch

wichtigsten, fakultativ bis obligat pathogenen Spezies. Die oft goldgelben

Pigmentierungen der Kolonien führten zu der Bezeichnung „aureus“ (lateinisch aureus,

golden).

Koagulasenegative Staphylokokken sind klassische fakultativ pathogene Opportunisten.

Die beiden Hauptvertreter dieser Gruppe sind Staphylococcus epidermidis und

Staphylococcus saprophyticus (Kloos und Schleifer, 1986).

1.1.1 Kolonisation und Infektion

Ungefähr 30-50% der gesunden Individuen sind Träger von Staphylococcus aureus, von

denen 10-20% dauerhaft kolonisiert sind. Sowohl Methicillin- (Oxacillin-) sensible

(MSSA) als auch Methicillin- (Oxacillin-) resistente Isolate (MRSA) können einen Wirt

dauerhaft kolonisieren. Die bevorzugten Körperregionen einer asymptomatischen

Kolonisierung sind Nasenvorhöfe und Rachen. Außerdem werden häufig Vagina und

Perineum befallen. Die nasale Kolonisierung hat sich als einer der größten

Risikofaktoren für die Entwicklung nosokomialer und auch ambulant erworbener

Infektionen erwiesen (von Eiff et al., 2001). Etwa 20% der Bevölkerung sind ständig

und circa 60% intermittierend im Bereich der vorderen Nasenhöhle mit S. aureus

kolonisiert. Ausgehend von der Nase kann sich der Erreger auf weitere Bereiche der

Haut- und Schleimhäute ausbreiten.

1

Einleitung

Die Bakterien können als transiente Flora für Wochen oder Monate asymptomatisch

intakte Mukosa kolonisieren. Sobald es jedoch zu einem Gewebedefekt kommt, wird

der Erreger inokuliert und kann Krankheitsbilder auf drei verschiedene Arten

verursachen:

1. Die Bakterien befinden sich am Infektionsort, beziehungsweise breiten sich

lokal begrenzt aus, und führen zu Abszessen, Karbunkeln, Zellulitis, Impetigo

bullosa und Wundinfektionen.

2. Eine Invasion der Blutbahn mit hämatogener Streuung kann der Grund sein für

Krankheitsbilder wie eine Endokarditis, Osteomyelitis, epidurale Abszesse bis

hin zum septischen Schock.

3. Staphylococcus aureus sezerniert Toxine und verursacht auf diesem Wege das

Toxic-Schock-Syndrom und das „staphylococcal-scalded-skin-syndrome“

(Dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter von Rittershain) (Archer, 1998).

Nach von Eiff et al. (2001) haben Personen, die mit S.-aureus-Stämmen kolonisiert

sind, ein erhöhtes Risiko, sich mit diesen zu infizieren. Die meisten Fälle nosokomialer

Infektionen entstehen durch den Kontakt mit staphylokokkenbesiedelten Händen des

Krankenhauspersonals, entweder von ihrem eigenen Reservoir oder durch den Kontakt

mit einem infizierten Patienten. Die wichtigste prophylaktische Maßnahme ist deshalb

die regelmäßige Händedesinfektion. Dies scheint zunächst einfach zu realisieren, doch

Studien zeigen, dass es den Ärzten hierbei deutlich an Compliance mangelt (Archer,

1998; Kipp et al., 2004; Lowy, 1998; Pittet et al., 2004; Vandenbergh et al., 1999).

1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus

Als nosokomial werden im Krankenhaus erworbene Infektionen bezeichnet, die im

Durchschnitt bei ungefähr 4,8% aller hospitalisierten Patienten gefunden werden. Sie

entstehen häufiger in Schwerpunktkrankenhäusern als in kleineren Institutionen,

innerhalb eines Krankenhauses häufiger bei Patienten der Intensivstationen als bei

denen der Normalabteilungen (Schentag et al., 1998). S. aureus ist einer der häufigsten

Gründe für endemische und epidemische nosokomiale Infektionen. Er ist der häufigste

Erreger nosokomialer Wundinfektionen und Pneumonien sowie die zweithäufigste

Ursache einer Sepsis.

2

Einleitung

Weitere Beispiele nosokomialer S.-aureus-Infektionen sind Omphalitiden, Impetigo,

infizierte Dekubital-Ulzerationen, Brandwunden und Weichteilabszesse (Boyce, 1997).

Schon 1880 und 1882 beschrieb Sir Alexander Ogston in einer Reihe klinischer

Beobachtungen und Laborstudien die bedeutende Rolle von Staphylococcus aureus in

der Entstehung von Wundinfektionen, Abszessen und einer Sepsis (Ogston, 1882).

S. aureus ist ebenfalls schon lange als ein Erreger ambulanter Infektionen bekannt.

Bereits in den 1950er Jahren beschrieben Nahmias und Eikhoff (1961) das Auftreten

der epidemischen S.-aureus-Stämme des Phagentyps 80/81 außerhalb von

Krankenhäusern. Ein besonders hohes Risiko, an einer ambulant erworbenen S.-aureus-

Infektion zu erkranken, haben Patienten mit Diabetes mellitus, chronischen

Hauterkrankungen, Dialyse-Patienten, Abhängige von intravenös applizierten Drogen

und HIV-Infizierte (Kauffman und Bradley, 1997). Häufige Manifestationen sind

umschriebene Abszesse, die auch in Form von Furunkeln oder Karbunkeln in

Erscheinung treten sowie Pneumonien und Tonsillarabszesse (Archer, 1998).

1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)

S.-aureus-Stämme konnten anfänglich erfolgreich mit Penicillin behandelt werden, bis

schließlich ein Großteil resistent wurde. Man geht davon aus, dass mittlerweile 80-90%

der S.-aureus-Isolate Penicillin-resistent sind. Bis zu den 1980er Jahren konnten

Methicillin und andere halbsynthetische Penicilline erfolgreich gegen Penicillin-

resistente S. aureus eingesetzt werden. Doch schon im Jahre 1961 wurde über das

Auftreten sogenannter Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) berichtet und es kam

immer häufiger zu Infektionen mit MRSA, die in vielen Krankenhäusern endemisch

wurden. Dies führte Ende der 1970er Jahre wieder zu einem vermehrten Auftreten

grampositiver Keime, die nur mit neuen Wirkstoffen behandelt werden konnten (Grubb,

1991; Smith et al., 1999). In Deutschland sind inzwischen ungefähr 20% der

Staphylococcus-aureus-Stämme Methicillin-resistent. In den USA stieg, nach Angaben

der NNIS (National Nosocomial Infections Surveillance), die MRSA-Prävalenz von

2,4% im Jahre 1975 auf 29% im Jahr 1991 und beträgt mittlerweile circa 40% (Kipp et

al., 2004; Voss et al., 1994).

3

Einleitung

Bezüglich der MRSA-Prävalenz gibt es beträchtliche Unterschiede zwischen

europäischen Ländern, innerhalb Deutschlands zwischen verschiedenen

Krankenhäusern und selbst innerhalb verschiedener Abteilungen eines Krankenhauses.

In den USA, Japan und den südeuropäischen Ländern kann man von einer hohen

MRSA-Prävalenz ausgehen (zwischen 30 und 80%). In den Niederlanden und

Skandinavien liegt die MRSA-Rate unter 1%, vermutlich auf Grund eines restriktiveren

Antibiotika-Einsatzes in Klinik und Praxis und konsequenter Implementierung eines

gezielten MRSA-Screening-Programms mit Isolation von Patienten schon bei einem

vermuteten MRSA-Befall. Erst bei negativen Abstrichen wird der Patient auf die

Station verlegt („Search and Destroy-Politik“). Das Bewusstsein, MRSA-Infektionen

unter allen Umständen zu vermeiden, ist in diesen Ländern wesentlich stärker

ausgeprägt als zum Beispiel in Deutschland (Daschner et al., 2004; Heuck, 2003; Heuck

et al., 1995; Ibelings und Bruining, 1998; Kipp et al., 2004; Sader et al., 1993; Trindade

et al., 2003; Vincent et al., 1995; Weinstein, 2001; Witte et al., 1997, 2004).

Es galt lange Zeit als umstritten, dass Infektionen mit MRSA einen signifikant

schwereren klinischen Verlauf nehmen als solche mit Methicillin-sensiblen

Staphylococcus aureus (MSSA) (Boyce, 1997; Soriano et al., 2000). Inzwischen sind

jedoch mehrere Kohortenstudien erschienen, die eine höhere Mortalität, einen längeren

Krankenhausaufenthalt und höhere Kosten bei Patienten mit MRSA-Infektionen

nachgewiesen haben, denn durch infektions- und therapiebedingte Komplikationen

steigt die Krankenhausverweildauer und die Genesung der Patienten wird deutlich

hinausgezögert (Kopp et al., 2004; Rubin et al., 1999; Weinstein, 2001). Betrachtet man

die mit nosokomialen Wundinfektionen und Septikämien verbundenen Kosten, liegt das

jährliche Einsparpotenzial für ein Krankenhaus der Maximalversorgung sicherlich im

sechsstelligen Bereich (Engemann et al., 2003; Herr et al., 2003). In einigen Kliniken

der USA werden 10-15% des gesamten Arzneimittelbudgets für Vancomycin verwendet

(Fridkin et al., 2001). In Deutschland wird die Verbreitung und erhöhte

Resistenzsituation von MRSA auf Dauer ebenfalls zu einem immer größer werdenden

krankenhaushygienischen und –ökonomischen Problem werden. Die Prävalenz von zur

Zeit 20,7% MRSA-Stämmen in Deutschland, eine mögliche Ausbreitung von cMRSA

(community acquired MRSA), die Zunahme von VISA-Stämmen (Vancomycin-

intermediär-resistenter Staphylococcus aureus) oder VRSA (Vancomycin-resistenter

Staphylococcus aureus) kann bei knappen Ressourcen im Gesundheitswesen zu einer

4

Einleitung

medizinisch und wirtschaftlich nur noch schwer beherrschbaren Situation führen (Kipp

et al., 2004). Somit scheint die Implementierung eines Screening-Programms für MRSA

lohnenswert. Wernitz et al. (2005) analysierten die Kosten eines MRSA-Screening-

Programms über 19 Monate in mehreren Krankenhäusern Deutschlands basierend auf

dem DRG- („diagnosis related groups“-) Abrechnungssystem. Sie zeigten auf, dass mit

einer Reduktion nosokomialer MRSA-Infektionen durch ein konsequentes Screening

Einspareffekte erzielt werden konnten.

1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen

MRSA wurden lange als ein krankenhausspezifisches Problem angesehen. Diese

Ansicht musste korrigiert werden, als MRSA-Infektionen auch im ambulanten Bereich

nachgewiesen werden konnten (Salyers und Whitt, 2002). Abgesehen von

Drogenabhängigen gab es kaum einen Anhaltspunkt für die Ausbreitung von MRSA in

der Öffentlichkeit, obwohl sie in den Krankenhäusern der USA schon in den 1960er

Jahren auftraten. Erst in den frühen 1990er Jahren häuften sich die Berichte von

Patienten außerhalb der typischen Hoch-Risikogruppen, die mit MRSA infiziert waren

und bei denen der Keim schon vor Einlieferung ins Krankenhaus vorhanden war

(Kauffman und Bradley, 1997; Rosenberg, 1995). Seit einigen Jahren werden vermehrt

MRSA-Stämme von Patienten ohne direkten Kontakt zu stationären medizinischen

Einrichtungen beschrieben. Diese sogenannten „community acquired MRSA“ (cMRSA)

wurden zuerst bei Ureinwohnern Nordamerikas (indianische Bevölkerung im Gebiet

Albuquerque) und Australiens gefunden. Auf Grund der unzureichenden Datenlage ist

die Bedeutung dieser Stämme noch unklar. Sie scheinen in Deutschland bisher nur eine

marginale Rolle zu spielen (Kipp et al., 2004). Die in Deutschland bisher aufgetretenen

Isolate zeigen ein einheitliches SmaI-Makrorestriktionsmuster, den MLST- (Multilocus

Sequence Typing) Typ 80 und spa- (kodiert das Protein A) Typ 44, womit sie sich

deutlich von den in Deutschland verbreiteten nosokomialen Epidemiestämmen

unterscheiden (Robert Koch-Institut, 2004). In der zweiten Hälfte des Jahres 2002 trat

in Deutschland ein neuer cMRSA-Stamm bei Patienten ohne vorhergehenden

Krankenhausaufenthalt auf. Dieser Stamm scheint weit verbreitet zu sein, denn er wurde

schon in Frankreich, Schottland, Finnland und Norwegen isoliert (Witte et al., 2004).

5

Einleitung

Alten- und Pflegeheime werden als Reservoir für MRSA angesehen, insbesondere die

großen Heime, die mit Krankenhäusern der Maximalversorgung zusammenarbeiten.

Man geht derzeit davon aus, dass MRSA-Träger in Pflegeeinrichtungen ihre Besiedlung

eher bei früheren Krankenhausaufenthalten als im Pflegeheim selbst erworben haben.

Es scheint sich um eine komplexe epidemiologische Wechselwirkung zwischen

Akutversorgung und Pflege zu handeln (Bradley, 1997; Robert-Koch-Institut, 2003).

Bei nasaler Kolonisierung mit MRSA ist der Patient, je nach eigener Disposition,

grundsätzlich selbst infektionsgefährdet. Für Hämodialysepatienten zum Beispiel

besteht durch die nasale MRSA-Besiedlung eine große Infektionsgefahr (Heuck und

Nassauer, 1999). Das Risiko für eine ständige Besiedlung mit MRSA ist von einem zum

anderen Patienten sehr unterschiedlich. Risikofaktoren hierfür sind eine Kolonisierung

mit MRSA an mehreren Körperstellen und eine vor kurzem erhaltene

Antibiotikatherapie mit Fluorchinolonen. Außerdem scheint sowohl die fehlende

Mupirocin- (lokales Antibiotikum zur MRSA-Eradikation) Behandlung als auch die

Mupirocin-Resistenz der besiedelnden MRSA eine persistierende Kolonisierung zu

fördern (Harbarth et al., 2000).

1.2.2 Resistenzentwicklung

Von MRSA wurde erstmals 1961 in Großbritannien berichtet. Es gab in den 1960er

Jahren allerdings nur vereinzelte Ausbrüche. Bedingt durch die Einführung der

Isoxazolylpenicilline (Penicillinase-feste Penicilline) Anfang der 1960er Jahre und die

Entwicklung der Substanzklasse der Cephalosporine, wurde das Resistenzproblem bei

S. aureus zu einem untergeordneten Thema für den klinischen Alltag. Nach dieser

stummen Periode Mitte der 1970er Jahre häuften sich zu Beginn der 1980er Jahre die

Berichte über ein Wiederaufflammen von MRSA-Infektionen. Diese Phase scheint mit

der Entwicklung von Resistenzen gegenüber Gentamicin und anderen Aminoglykosiden

zusammenzuhängen.

Es besteht jedoch weiterhin Ungewissheit über die Gründe für die Zunahme von

MRSA-Infektionen; wahrscheinlich sind der häufige Einsatz von Antibiotika und eine

inadäquate Infektionskontrolle die entscheidenden Einflussfaktoren.

6

Einleitung

Durch den hohen Selektionsdruck entwickelten sich neue Stämme, die erfolgreicher im

Krankenhaus überlebten als die ursprünglichen MRSA (Grubb, 1991; Kipp et al., 2004).

Im mitteleuropäischen Raum blieb die Resistenzsituation bei S. aureus bis Mitte der

1980er Jahre im Wesentlichen unverändert und war zum Teil sogar rückläufig. 1990

und insbesondere 1995 folgte dann eine deutliche Zunahme der Methicillin-Resistenz,

die sich 1995 bei 12,9% der S.-aureus-Isolate fand (Kresken et al., 2000). Zu Beginn

der 1980er Jahre traten in den USA zunehmend MRSA-Klone auf, die parallel

Resistenzen gegen Aminoglykoside, Lincosamide, Makrolide, Tetracycline,

Fluorochinolone, Sulfonamide und weitere Substanzklassen aufwiesen, was die

Behandlungsmöglichkeiten schon zu diesem Zeitpunkt deutlich einschränkte. Die

Prävalenz von MRSA-Stämmen in Deutschland liegt mittlerweile bei 20,7%. Es hat

demnach in kurzer Zeit ein bedenklicher Anstieg Methicillin-resistenter S. aureus von

1,7% (1990) über 15,2% (1998) auf 20,7% (2001) stattgefunden (Kipp et al., 2004).

Die Paul-Ehrlich-Gesellschaft für Chemotherapie e.V. führt regelmäßig

Untersuchungen zur Resistenzsituation durch, wobei in jeder Erhebungsperiode dieser

sogenannten EPIC-Studie (European Prevalence of Infection in Intensive Care) die

gleiche Testmethodik angewandt wird. In der EPIC-Studie von 1995, bei der unter

Beteiligung von 17 Ländern Infektionen auf Intensivstationen vorwiegend großer und

universitärer Einrichtungen erfasst worden waren, fand man zu 30,1% S. aureus, von

denen sich 60% als MRSA herausstellten. Lediglich Enterobacteriacen waren mit

34,4% etwas häufiger Ursache von Infektionen. Der größte Risikofaktor für einen

Patienten an einer MRSA-Infektion zu erkranken, war die Dauer des Aufenthaltes auf

der Intensivstation. Diese Ergebnisse verdeutlichen die derzeitige Dominanz von

Staphylokokken. Beim europaweiten Vergleich der Ausbreitung von MRSA ist in

Deutschland und England ein besonders starker Anstieg von jährlich 6% zu beobachten.

Früher ging man davon aus, dass die globale Ausbreitung von MRSA auf einen

einzigen Klon zurückgeht. Nachfolgende Studien ließen jedoch vermuten, dass sich das

mecA-Gen für die Methicillin-Resistenz horizontal in eine Vielzahl von S.-aureus-

Stämmen ausgebreitet hat (Boyce, 1997). Die Resistenz gegenüber Methicillin entsteht

durch ein zusätzliches Penicillin-Bindeprotein, PBP2a, mit einer sehr geringen Affinität

zu β-Laktam-Antibiotika. Die genaue strukturelle Basis für diese erniedrigte Affinität

ist noch nicht geklärt.

7

Einleitung

S.-aureus-Stämme produzieren zwar auch β-Laktamasen, aber die mecA-Resistenz

scheint die meisten Probleme zu verursachen, da das PBP2a eine Resistenz gegen

sämtliche β–Laktam-Antibiotika vermittelt, wohingegen β-Laktamasen nur gegen ein

begrenztes Spektrum von β–Laktam-Antibiotika wirken (Chambers, 1997; Salyers und

Whitt, 2002).

Die Multiresistenz und die Fähigkeit zur Ausbreitung in Krankenhäusern verleihen den

MRSA ihre große klinische Bedeutung. Sie sind resistent gegen eine Vielzahl

Antibiotika wie Penicilline, Aminoglykoside, Tetrazykline, Makrolide und

Lincosamide, Chloramphenicol sowie gegen Schwermetall-Ionen und teilweise

quaternäre Ammoniumverbindungen (Witte, 1991).

Vancomycin, ein Glykopeptid, ist oft das letzte verfügbare Antibiotikum für eine

Therapie gegen MRSA. Aus einem Gutachten der CDC (Centers for Disease Control

and Prevention) ging hervor, dass die Anzahl der MRSA, die nur noch sensibel auf

Vancomycin reagierten, von 22,8% im Jahr 1987 auf 56,2% im Jahr 1997 angestiegen

ist (Archer, 1998; CDC NNIS System, 1999).

1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die

Entwicklung neuer Antibiotika

Besondere Aufmerksamkeit verdient gegenwärtig eine Subpopulation von MRSA-

Stämmen, Vancomycin-intermediäre S. aureus (VISA), mit verminderter

Empfindlichkeit gegen Glykopeptid-Antibiotika (Robert Koch-Institut, 1998; Witte und

Klare, 1999). Der erste bekannte Fall trat 1996 bei einem vier Monate alten Jungen in

Japan auf, der als postoperative Komplikation nach einem herzchirurgischen Eingriff

eine MRSA-Infektion entwickelte, die nicht therapiert werden konnte. Zwei Wochen

nach der Operation bekam der Säugling Fieber und ein purulentes Sekret trat aus der

Inzisionswunde am Sternum. Der Patient wurde ohne eine Besserung der Symptomatik

29 Tage mit Vancomycin behandelt. Nach den NCCLS-Kriterien (National Committee

for Clinical Laboratory Standards) war der isolierte MRSA-Keim (Mu 50) weder

empfindlich noch resistent. Deshalb wurde er als S. aureus mit intermediärer Resistenz

gegen Vancomycin beschrieben.

8

Einleitung

Dass MRSA zunehmend Vancomycin-resistent werden, wurde schon vermutet, denn

der Transfer des vanA-Plasmids von hochgradig Vancomycin-resistenten Enterokokken

(VRE) auf S. aureus konnte bereits demonstriert werden. Der Stamm Mu 50 trägt aber

weder ein vanA- noch ein vanB-Gen, sodass die Resistenz hier über einen anderen Weg

vermittelt wird. Es gibt Hinweise auf eine verstärkte Zellwandsynthese, denn

elektronenmikroskopisch erschien die Wand zwei Mal so dick wie bei Kontrollstämmen

(Hiramatsu et al., 1997, 2002). Anschließend wurde von fünf ähnlichen Stämmen

berichtet, die in den USA, Frankreich und Korea auftraten. Wie im vorher geschilderten

Fall versagte die Vancomycin-Therapie bei den infizierten Patienten. Es ist leicht

vorstellbar, dass die Ausbreitung solcher Stämme die Morbidität und Mortalität

nosokomialer Infektionen signifikant erhöhen wird. In Thailand wurden MRSA-

Stämme entdeckt, die heterogen resistent (oder heteroresistent) gegen Vancomycin

waren. Sie mutieren mit einer Frequenz von eins zu einer Million oder mehr Fällen und

reagieren nur noch eingeschränkt empfindlich auf Vancomycin (Trakulsomboon et al.,

2001). Die Verbreitung vollständig Vancomycin-resistenter S. aureus (VRSA), von

denen bisher nur zwei Stämme bekannt sind, wurde erstmals 2002 in den USA

beschrieben. Aus in-vitro-Versuchen in New York und Japan geht hervor, dass 9,3%

von den getesteten nosokomialen MRSA-Stämmen Vancomycin-resistente

Subpopulationen besitzen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Vancomycin-intermediäre S.

aureus jederzeit unter selektivem Druck vollständig resistent werden könnten (Kipp et

al., 2004; Waldvogel, 1999).

Es wird intensiv an der Entwicklung neuer Antibiotika gearbeitet und seit wenigen

Jahren sind zwei von ihnen im Einsatz: eine Kombination zweier Streptogramine

(Synercid) und ein neuer Proteinsynthese-Inhibitor, Linezolid, aus der vollsynthetischen

Gruppe der Oxazolidinone. Streptogramine sind schon seit Jahren als Proteinsynthese-

Inhibitoren bekannt, welche die Translokation der Ribosomen verhindern. Das

Linezolid hingegen repräsentiert eine völlig neue Klasse von Antibiotika, die erstmalig

ein sehr frühes Stadium der Proteinsynthese blockieren. Die Substanz verhindert durch

Bindung an die 50S-Untereinheit der Ribosomen die Ausbildung eines 70S-

Ribosomenkomplexes, sodass kein Initiationskomplex entstehen kann. Als Erstes

marktfähiges Oxazolidinon wurde Linezolid im April 2000 in den USA von der FDA

(Food and Drug Administration) zugelassen (Hamel und Ford, 2001; Salyers und Whitt,

2002; Wilcox 2003).

9

Einleitung

1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)

Der Transfer MRSA-kolonisierter Patienten, der Hauptquelle von MRSA in

Krankenhäusern, führte zu einer Übertragung zwischen Krankenhäusern innerhalb von

Städten und Ländern, aber auch über Länder und sogar Kontinente hinweg (Boyce,

1997; Roman et al., 1997). Auffällig ist, dass nur bestimmte MRSA-Stämme diese

epidemischen Charakteristika aufweisen und sich in kurzer Zeit über große Distanzen

ausbreiten. So entstehen weltweit Epidemien, die von wenigen MRSA-Stämmen

verursacht werden.

Hierfür einige Beispiele:

In Lissabon fiel ein MRSA-Klon auf, der besonders häufig bei Infektionen isoliert

wurde. Dieser Klon wurde ebenso in Krankenhäusern von Barcelona und Madrid als

dominant beschrieben und war für mehrere Ausbrüche verantwortlich (Sanchez et al.,

1995). Eine weitere Epidemie in Barcelona verursachte ein bestimmter MRSA-Klon,

der sich äußerst effektiv über die Stationen im Krankenhaus verbreitete und bei

Patienten sowie beim Personal und auf Oberflächen der Umgebung gefunden wurde

(Dominguez et al., 1994).

In Brasilien wurden ähnliche Phänomene beobachtet. In fünf verschiedenen Regionen

Brasiliens ließen sich 77% der klinischen MRSA-Stämme auf einen Klon, den

„Brazilian Endemic Clone A“, zurückführen (Sader et al., 1993). Weiterhin ist in

Brasilien die Ausbreitung eines epidemischen MRSA-Klones gut dokumentiert. Eine

beachtliche Anzahl von Krankenhausinfektionen wurde von diesem multiresistenten

MRSA-Klon verursacht, der als „brasilianischer epidemischer Klon“ bezeichnet wurde.

Es konnte gezeigt werden, dass dieser Stamm kontinentale Schranken überwunden und

sich bis nach Portugal ausgebreitet hat (da Silva Coimbra et al., 2000).

Auch in britischen Krankenhäusern sind solche Fälle beschrieben:

Trotz Maßnahmen zur Kontrolle der Übertragung von Keimen, die bezüglich anderer

Erreger Erfolg zeigten, breiteten sich einige MRSA-Stämme (EMRSA) ungewöhnlich

schnell in englischen Kliniken aus. In den frühen 1980er Jahren war ein einziger

MRSA-Stamm die Ursache vieler Epidemien in Krankenhäusern von England und

Wales, sodass er fortan als Epidemiestamm (EMRSA, epidemic MRSA) galt.

10

Einleitung

Der Stamm EMRSA-1 breitete sich in der Region North Thames und EMRSA-3 in der

Region Southeast Thames in England aus.

Der Stamm EMRSA-16 erlangte besondere Berühmtheit als Auslöser vieler Epidemien.

In drei Krankenhäusern in East Northamptonshire kolonisierte und infizierte er über

einen Zeitraum von fast zwei Jahren 400 Patienten, wobei auch eine Kolonisation von

Angehörigen dieser Patienten und des Krankenhauspersonals nachgewiesen werden

konnte. Sieben Patienten starben als direkte Folge der Infektion. 1993 gab es in

Großbritannien 15 verschiedene EMRSA-Stämme, die allesamt multiresistent waren

und gehäuft bei Intensiv-Patienten auftraten (Boyce et al., 1997; Cox et al., 1995). Auch

in Deutschland hat die Zahl der MRSA deutlich zugenommen. Das Genom von

EMRSA-16 liegt mittlerweile vollständig vor und die bisher gemachten Analysen

zeigen, dass der Erreger äußerst anpassungsfähig ist und sich über die letzten 50 Jahre

ständig weiterentwickelt hat. Etwa 6% der 2675 Gene unterscheiden sich vom MSSA-

Genom (Holden et al., 2004).

Von Januar 1996 bis Dezember 1997 wurde eine zunehmende Zahl von Patienten mit

einem einzigen MRSA-Klon in der westlichen Schweiz kolonisiert beziehungsweise

infiziert. Dieser Klon war für einige Ausbrüche in verschiedenen Krankenhäusern

verantwortlich und wurde bei mindestens 136 Patienten und 20 Angestellten in 21

Krankenhäusern oder Pflegeheimen gefunden. Der Stamm war nicht zu unterscheiden

von dem belgischen Epidemiestamm 2, zu dem 1995 15% aller MRSA-Isolate gehörten,

und war verwandt mit einem MRSA-Klon, der 1996 für eine große Epidemie in Ontario

(Kanada) verantwortlich war (Blanc et al., 1999; Cox et al., 1995; Voss et al., 1994).

Papakyriacou et al. (2000) beschrieben zwei epidemische MRSA-Stämme als Auslöser

für die Hälfte aller MRSA-Infektionen in Kanada. Sie untersuchten von 1995 bis 1999

2780 MRSA aus kanadischen Kliniken und fanden sechs klonale Typen, die 87% aller

Infektionen ausgelöst hatten. Sie wurden als CMRSA (canadian MRSA) -1 bis -6

bezeichnet. Der häufigste Klon, CMRSA-1, repräsentierte 49% und CMRSA-3 8% aller

nosokomialen MRSA-Isolate in Kanada. CMRSA-3 ist dokumentiert als ein Stamm, der

ursprünglich mit einem Patienten aus Punjab (Indien) nach Kanada gelangte und sich

dort rasant ausgebreitet hatte.

11

Einleitung

Booth et al. (2001) charakterisierten 405 S.-aureus-Isolate aus verschiedenen Gebieten

der USA. Von diesen waren lediglich fünf Stämme für mehr als 65% aller Infektionen

verantwortlich.

Wesentliche Ursache für einen Anstieg der MRSA-Häufigkeit im deutschsprachigen

Raum dürfte die weiter fortschreitende überregionale Ausbreitung von MRSA-

Epidemiestämmen sein. In Deutschland und einigen seiner Nachbarstaaten sind seit

mehreren Jahren sechs klonale Gruppen überregional verbreiteter MRSA-Stämme

bekannt, die nach der geographischen Region ihres erstmaligen Nachweises benannt

wurden, wie zum Beispiel der „süddeutsche“ Epidemiestamm. Diese Epidemiestämme

sind inzwischen im gesamten Bundesgebiet verbreitet. Der Erwerb des mecA-Gens (für

die Methicillin-Resistenz) und die Mutation zur Chinolon-Resistenz könnten zumindest

für den „Berliner“-Epidemiestamm hinreichende Voraussetzungen gewesen sein, sich

im Hospitalmilieu auszubreiten (Braulke et al., 1999). In diesem Fall scheint eine

zusätzliche Resistenz die Ausbreitung erhöht zu haben. Im Gegensatz dazu wird seit

1996 eine Dynamik der Verbreitung von MRSA-Epidemiestämmen registriert, bei der

die „älteren“ Epidemiestämme mit „breitem“ Resistenzphänotyp zurückgehen und die

erst seit Mitte der 90er Jahre auftretenden klonalen Gruppen, mit einer vergleichsweise

nur geringen Mehrfachresistenz, zunehmen. Demnach breiten sich Epidemiestämme

aus, denen Resistenzgene fehlen, die in anderen, weniger vorherrschenden MRSA

enthalten sind. Deshalb ist die Resistenzsituation sicherlich keine hinreichende

Erklärung für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen (Braulke et al., 1999;

Robert Koch-Institut, 2003; Voss et al., 1994).

Dies sind nur wenige Beispiele für die weltweite Beobachtung, dass einige MRSA-

Stämme von großer epidemiologischer Bedeutung sind, sich schnell ausbreiten und zu

einem großen Problem werden, wohingegen andere MRSA-Stämme nur sporadisch in

einem begrenzten Bereich auftreten und von untergeordneter klinischer Relevanz sind

(Grubb, 1991). Das gleiche Phänomen trat in den 1950er und 1960er Jahren bei einigen

Phagentypen (80/81) von S. aureus auf, die fähig waren, schwere Infektionen bei

Patienten und Personal zu verursachen und sich sehr schnell in und zwischen den

Krankenhäusern ausbreiteten (Boyce, 1997).

12

Einleitung

Der Mechanismus, der MRSA und auch S. aureus allgemein dazu befähigt, sich

auszubreiten und epidemisch zu werden, ist noch nicht bekannt und die Ursache der

schnellen Verbreitung und Pathogenität einiger Klone muss noch gefunden werden

(Grubb, 1991; Lowy, 1998).

1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen

Um die klonale Ausbreitung von MRSA-Stämmen in Krankenhäusern zu erfassen,

stehen mehrere Verfahren zur Verfügung. In dieser Studie wurde zur Charakterisierung

der MRSA-Isolate die von Schwartz und Cantor (1984) entwickelte

Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) verwendet (siehe Material und Methoden 2.2.1). Sie

beruht auf der Verdauung bakterieller DNA mit Restriktionsendonukleasen, die

bestimmte Abschnitte des Chromosoms erkennen und große DNA-Fragmente (10-800

kb) generieren. Als geeignetste Restriktionsendonuklease hat sich SmaI herausgestellt.

Bei der PFGE wird die Orientierung des elektrischen Feldes periodisch geändert

(pulsed), was die DNA-Fragmente effektiv im Bereich der Megabasenpaare trennen

kann. Die Ergebnisse sind hoch reproduzierbar. Die Nachteile der PFGE sind: ein

langes Zeitintervall bis zu endgültigen Resultaten, hohe Kosten, eine relativ geringe

Anzahl an Banden und die schwierige Interpretation der Ergebnisse, besonders bei

PFGE-Muster-Vergleichen verschiedener Labore (Enright et al., 2002).

Eine weitere angemessene Technik für die molekulare infektionsepidemiologische

Forschung ist die MLST (Multilocus Sequence Typing). Sie wurde von Maiden et al.

(1998) entwickelt und ging aus der MLEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis), einer

phänotypischen Technik zur Typisierung von Proteinen, hervor. Da jedoch zwei

verschiedene Basensequenzen dasselbe Protein exprimieren können oder zwei Proteine

mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität bei der MLEE als eine Bande detektiert

werden, hat sich diese Methode durch die Entwicklung der MLST entscheidend

verbessert. Hierbei werden, statt der Genexpression, die Gene selbst durch Nukleotid-

Sequenzierung analysiert. Unterschiede in den Sequenzen bedeuten verschiedene Allele

des Gens.

13

Einleitung

Es wird jeweils eine bestimmte Anzahl an Genloci verwendet, wobei es sich meist um

das innere Fragment von Housekeeping-Genen handelt. Bei S. aureus wurden sieben

Loci ausgewählt. Bisher sind für jeden ungefähr 30 Allele beschrieben. Die MLST-

Technik wurde von Enright et al. (2000) mit der PFGE validiert. Sie beobachteten, dass

Stämme, die mit der MLST gruppiert wurden, auch ähnliche PFGE-Profile aufwiesen.

Ein großer Vorteil der MLST ist, dass der Stamm durch sein Allel-Profil definiert ist

und deshalb aus lediglich sieben Zahlen besteht. Diese Information lässt sich sehr leicht

mit elektronischen Medien über das Internet in die ganze Welt verbreiten. Somit werden

globale epidemiologische Daten vereinheitlicht und standardisiert. Diese Datenbank ist

unter folgender Internetadresse zugänglich „http://www.mlst.net“.

Nachteile der MLST sind die hohen Kosten und die aufwendige Ausstattung. Dessen

ungeachtet ist sie eine neue Technik, die auf Grund ihrer Standardisierbarkeit und

Reproduzierbarkeit zunehmend an Bedeutung gewinnen wird. Bis dato gilt jedoch die

PFGE als der Goldstandard (Enright et al., 2002; Kreiswirth et al., 1993; Maiden et al.,

1998; Trindade et al., 2003).

1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene

Expression

Infektionen mit S. aureus können jedes Organsystem betreffen und ohne eine

entsprechende Therapie nimmt die Letalität mit der Disseminierung des Erregers im

Wirtsorganismus zu. Durch die Sekretion von Toxinen ist es möglich, dass der Erreger,

auch ohne selbst Anschluss an die Blutbahn zu bekommen, bestimmte Syndrome

auslöst. Beispiele hierfür sind das Toxic-Schock-Syndrom und das „staphylococcal-

scalded-skin-syndrome“.

Die Fähigkeit, ein sehr breites Spektrum an Krankheiten zu verursachen und in vielen

verschiedenen Gewebetypen des Wirtes zu überleben, lässt sich auf die vielfältigen

Virulenzfaktoren zurückführen (Archer, 1998; Surette et al., 1999; Xiong et al., 2004),

wobei der Ausdruck Virulenzfaktor in diesem Zusammenhang sehr weit gefasst ist und

für jede Substanz gilt, die entweder vom Zytoplasma zur Zelloberfläche oder in die

Umgebung abgegeben wird und wenigstens hypothetisch am Krankheitsgeschehen

beteiligt ist (Projan und Novick, 1997).

14

Einleitung

Die Kombination von mehr als 40 verschiedenen extrazellulären Toxinen, Enzymen und

Zelloberflächen-Proteinen verleiht Staphylococcus aureus seine Pathogenität (Arvidson

und Tegmark, 2001).

Es lässt sich eine grobe Einteilung der Virulenzfaktoren vornehmen in:

1. Zellwandgebundene Oberflächenproteine:

Hierzu gehört zum Beispiel der „Clumping Factor“, ein zellwandständiges Protein

mit der Funktion eines Fibrinogenrezeptors, das die Bindung von Staphylokokken

im verletzten Gewebe, auf Kathetern und Implantaten ermöglicht. Protein A, ein

weiteres Oberflächenprotein, bindet an den Fc-Teil von IgG-Antikörpern, was die

Opsonierung und damit die Phagozytose verhindert.

2. Extrazelluläre Enzyme:

Die Koagulase ist das Hauptmerkmal für die Speziesbestimmung von S. aureus und

löst die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin aus, was zu der charakteristischen

Fibrinkapsel bei Abszessen führt. Ihr wird eine entscheidende Funktion bei der

Abgrenzung des Infektionsortes gegenüber der Umgebung zugeschrieben.

Die Staphylokinase, ein anderes extrazelluläres Enzym, erfüllt die entgegengesetzte

Funktion und löst das gebildete Fibrin wieder auf, wenn eine bestimmte Zelldichte

erreicht wird, die Nährstoffe knapp werden und eine Ausbreitung des Erregers

vorteilhaft für sein Überleben ist.

3. Toxine:

Hierzu zählen unter anderem die Enterotoxine, exfoliative Toxine, das Toxic-

Schock-Syndrom-Toxin und die Hämolysine. Es sind bisher vier

membranschädigende Hämolysine beziehungsweise Toxine, α-, β-, γ- und δ-

Hämolysin, bekannt. Da sie zytotoxisch sind, liegt ihre Funktion in der Invasion des

befallenen Gewebes. Einer der meist erforschten Virulenzfaktoren von

Staphylokokken ist das α-Hämolysin (α-Toxin). Durch die Entstehung von Poren in

Zellmembranen bewirkt α-Hämolysin eine Lyse von Erythrozyten. Ebenso werden

Phagozyten zerstört und die Phagozytose behindert. β-Hämolysin arbeitet wie eine

Sphingomyelinase und zerstört Membranen, die Sphingomyelin enthalten, wie die

von Erythrozyten (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Hahn et al., 2001; Lina et al.,

1997; Lowy, 1998; Projan und Novick, 1997; Wann et al., 2000; Xiong et al., 2004).

15

Einleitung

Es ist allgemein anerkannt, dass die Pathogenität eines S.-aureus-Stammes von der

Ausstattung mit Virulenzfaktoren abhängig ist. Diese Sicht wird unterstützt durch die

Entdeckung regulatorischer Mechanismen, die Oberflächenproteine, sezernierte

Proteine und Toxine steuern, denn neben der Fähigkeit zur Produktion von

Virulenzfaktoren nimmt die Regulation ihrer Expression während verschiedener Stadien

der Infektion eine Schlüsselrolle ein. So entsteht ein zeitlich konzertiertes Programm

der Expression dieser Faktoren, wodurch der Ablauf einer Infektion koordiniert wird.

Faktoren für die Adhäsion, Verteidigung und Invasion in das Gewebe, werden den

äußeren Bedingungen optimal angepasst, um das Überleben des Bakteriums zu sichern

(Projan und Novick, 1997).

Betrachtet man Ort, Funktion und Expression im zeitlichen Verlauf, lassen sich die

Virulenzfaktoren grob einteilen in Adhäsine und gewebezerstörende Enzyme

beziehungsweise Toxine (siehe oben). Die Adhäsine sind meist zellwandgebundene

Oberflächenproteine und werden mit der Phase der Kolonisierung des Wirtes assoziiert,

der exponentiellen Wachstumsphase.

Die gewebeabbauenden Enzyme und Toxine werden in der Mehrzahl der Fälle in die

Umgebung sezerniert und befinden sich extrazellulär. Sie werden mit Persistenz und

Invasion in Verbindung gebracht, was zeitlich der postexponentiellen Phase zuzuordnen

ist. Die Produktion der Virulenzfaktoren ist also gebunden an eine bestimmte

Wachstumsphase und abgestimmt auf die Umgebung (Novick et al., 1993; Projan und

Novick, 1997).

Globale Regulatorsysteme koordinieren die Expression der Virulenzfaktoren. Einer

dieser Regulatoren, agr, kontrolliert die Produktion von Virulenzfaktoren durch ein

regulatorisches RNA-Molekül (Arvidson und Tegmark, 2001) und soll im Folgenden

näher betrachtet werden.

16

Einleitung

1.4 Der agr-Genlocus

1.4.1 Globale Regulatorsyteme virulenzassoziierter Gene

Bakterien befinden sich in einem kontinuierlichen Prozess der Anpassung an sich

verändernde Umweltbedingungen. Signale vom Zytoplasma und aus der Umgebung

beeinflussen die zellulären Aktivitäten und vermitteln eine entsprechende Antwort

(Stock et al., 1989). Vermehren sich Bakterien exponentiell, ist ihr Metabolismus

schnell und effizient. In diesem Stadium werden bestimmte Regulatorsysteme so

koordiniert, dass eine konstante Wachstumsrate gewährleistet ist. Wird eine Kultur älter

und wächst langsamer oder stoppt ihr Wachstum auf Grund verschlechterter

Umweltbedingungen, werden andere als die vorherigen Regulatorsysteme aktiviert, um

dem zellulären Metabolismus ein Überleben auf lange Zeit zu sichern. Diese

Umstellung wird in der sogenannten postexponentiellen Phase eingeleitet. Ein

besonderes Merkmal dieser Phase ist die schnelle Synthese von nicht-essentiellen

Proteinen, von denen die meisten sezerniert werden. Bei grampositiven Bakterien, und

somit auch bei Staphylococcus aureus, handelt es sich vor allem um Enzyme, die

Biopolymere abbauen und so das Überleben, die Vermehrung und Ausbreitung im

infizierten Gewebe erleichtern (Balaban und Novick, 1995). Diese Exoproteine

erschließen für den bakteriellen Metabolismus neue Nahrungsquellen und würden

während der exponentiellen Wachstumsphase keinen Vorteil bringen, da ein

hinreichendes Nahrungsangebot besteht (Kornblum et al., 1991). Unter den optimalen

Wachstumsbedingungen der exponentiellen Phase werden vornehmlich

Oberflächenproteine, zum Beispiel Protein A, Koagulase und das Fibrinogen-

Bindeprotein synthetisiert, die eher für die Adhäsion eine wichtige Rolle spielen

(Arvidson, 1983). Das einzelne Bakterium muss somit den Zustand seiner Umwelt

wahrnehmen können und auf Änderungen der Umgebungsvariablen reagieren können,

um sein Überleben und das der eigenen Population zu sichern.

17

Einleitung

Abbildung 1: Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren Die zwei Komponenten dieses Systems sind das Protein mit der sensorischen Funktion, typischerweise in

der zytoplasmatischen Membran lokalisiert, und das Regulatorprotein. Das Sensor-Protein enthält eine

extrazelluläre Domäne für die Erfassung des Signals und eine intrazelluläre mit einer Histidin-Kinase.

Auf einen Stimulus hin, den die sensorische Komponente erfasst, wird die Histidin-Kinase direkt aktiviert

und es erfolgt eine Autophosphorylierung. Der Phosphatrest wird auf ein Regulatorprotein übertragen,

woraufhin es für die weitere Signalweiterleitung aktiviert wird und zur Transkription von Zielgenen führt.

Die Erkennung von Umweltsignalen und deren Übertragung in die Zelle erfolgt häufig

über sogenannte Zwei-Komponenten-Systeme von globalen Regulatoren, die den

wichtigsten Weg bakterieller Kommunikation untereinander und mit der Außenwelt

darstellen (siehe Abbildung 1). Ein Sensorprotein empfängt Signale aus der Umwelt.

Durch Phosphorylierung wird bei Erfassung des spezifischen Signals ein

Regulatorprotein aktiviert, woraufhin weitere Reaktionen in der Zelle ausgelöst werden

über welche die Transkription von Zielgenen gesteuert wird (Lyon et al., 2000, 2002;

Morschhäuser, 2000). Die Expression der meisten Virulenzfaktoren wird von

wenigstens einem gut charakterisierten globalen Regulator gesteuert (Ji et al., 1995).

18

Einleitung

Das agr-System ist solch ein Regulator von Staphylococcus aureus, bei dem das

spezifische Umweltsignal, was letztendlich die Expression der Zielgene veranlasst, die

Bakteriendichte ist. Hierbei sezernieren die Bakterien ein Peptid, das die interbakterielle

Kommunikation ermöglicht (Balaban et al., 2000).

1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme

Die Expression bestimmter bakterieller Eigenschaften ist nur dann sinnvoll, wenn eine

hohe Zelldichte vorhanden ist. Erreicht das spezifische Signal, in diesem Fall die

Bakteriendichte, einen Schwellenwert, dann werden -charakteristisch für ein globales

Regulatorsystem- eine Reihe unverbundener Gene aktiviert. Damit jedes einzelne

Bakterium die Dichte der Bakterienpopulation für eine koordinierte Genexpression

wahrnehmen kann, müssen die Bakterienzellen miteinander kommunizieren.

Quorum-sensing-Systeme vermitteln diese Kommunikation zwischen Bakterien durch

Signalmoleküle, sogenannte Pheromone oder Autoinducer mit einem geringen

Molekulargewicht, die in die Umgebung abgegeben werden. Durch Erfassung dieser

Signalmoleküle können die Bakterien die Zelldichte ihrer Population wahrnehmen und

die Expression von Virulenzgenen koordinieren (Morschhäuser, 2000; Winzer und

Williams, 2001). Der aus dem römischen Recht stammende Begriff „Quorum“

bezeichnet jene Teilnehmerzahl einer Versammlung, die mindestens erreicht sein muss,

um einen Beschluss zu fassen. Auf Bakterien übertragen meint Quorum die Anzahl der

Signalmoleküle, die zur Aktivierung der Genexpression von den Bakterien sezerniert

werden muss.

Diese Strategie setzt voraus, dass jede einzelne Bakterienzelle in der Lage ist, andere

Zellen der gleichen Spezies zu erkennen, deren Anzahl zu bestimmen und im Einklang

mit diesen bestimmte Genen zu exprimieren. Auf diesem Weg können die Bakterien ihr

Verhalten so aufeinander abstimmen, dass dem Wirt die Zeit fehlt, eine effektive

Verteidigung aufzubauen (Winzer und Williams, 2001). Sind die Exoproteine vieler

Bakterien zur gleichen Zeit an einem Fokus lokalisiert, haben sie einen viel größeren

Effekt, als wenn sie von nur wenigen Individuen zu verschiedenen Zeitpunkten

produziert werden.

19

Einleitung

Wundinfektionen durch Staphylococcus aureus sind oft durch große, mit Pus gefüllte

Läsionen gekennzeichnet, die Ausdruck eines konzertierten Zusammenwirkens vieler

Bakterien sind (Salyers und Whitt, 2002).

Für die koordinierte Genexpression verschiedener Bakterienzellen bedarf es eines

effektiven Signalmechanismus in Form des schon erwähnten Zwei-Komponenten-

Systems. Die Signaltransduktion beruht hierbei auf einem Phosphotransfer, somit ist das

entscheidende Mittel zur Informationsübertragung die Phosphorylierung. Die erste

Komponente, das Sensorprotein, ist eine Histidin-Proteinkinase (HPK), die bei vielen

dieser Systeme in der Zytoplasmamembran lokalisiert ist. Ihre N-terminale

Bindungsdomäne empfängt das Signal und überträgt es auf den C-Terminus (siehe

Abbildung 2). Es wird eine Phosphokinase aktiviert, die das Sensorprotein an einem

Histidin-Rest unter Verbauch von ATP (Adenosintriphosphat) phosphoryliert. ATP

wird zu ADP und stellt somit den Phosphatrest zur Verfügung, durch den die

Signalkaskade ermöglicht wird. Nach dieser Autophosphorylierung wird die

Phosphatgruppe vom Histidin des transmembranen Sensorproteins auf die Carboxyl-

Seitenkette eines Aspartat-Restes am N-Terminus der zweiten Komponente, dem

Regulatorprotein (response regulator), übertragen. Der C-Terminus des Sensorproteins

und der N-Terminus des Regulators, zwischen denen es zur Übertragung des

Phosphatrestes kommt, sind hoch konserviert. Durch Phosphorylierung des

Regulatorproteins wird seine C-terminale Domäne zu einem Aktivator, bindet in der

regulatorischen Region von Zielgenen und aktiviert oder reprimiert deren Transkription

(Kleerebezem et al., 1997; Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).

Im Fall des agr-Systems senden Bakterienzellen bestimmte Pheromone aus, die es

ihnen indirekt ermöglichen, die Zelldichte zu ermitteln. Bei Erreichen einer

Schwellenkonzentration von Pheromonen, die das entsprechende Signal für den Sensor

sind, kommt es zur Aktivierung der Signalkaskade, die, wie oben beschrieben, mittels

eines Phosphotransfers abläuft (Koenig et al., 2004; Qiu et al., 2005). Das Signal führt

beim agr-System einerseits dazu, dass bevorzugt Strukturgene für sezernierte

Virulenzfaktoren transkribiert werden, wie Hämolysine und Toxine, wohingegen

diejenigen für Oberflächenproteine nur noch abgeschwächt transkribiert werden;

andererseits werden über eine Feed-forward-Stimulierung die Proteine des

Signaltransduktionsweges selbst, einschließlich des Pheromons, vermehrt transkribiert.

20

Einleitung

Dies geschieht über einen anderen Promotor als die Transkription der Zielgene (siehe

Abbildung 2).

Abbildung 2: Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells Das Sensorprotein (sensor) empfängt das spezifische Signal und wird daraufhin an seinem Histidin-Rest

unter Verbrauch von ATP phosphoryliert. Das Phosphatmolekül wird auf das Regulatorprotein (response

regulator) übertragen. Nachfolgend aktiviert oder reprimiert der Regulator die Transkription von

Zielgenen. Zusätzlich werden die Proteine der Signaltransduktion über einen zweiten Promotor vermehrt

transkribiert. Hierzu gehört auch das Pheromon, beziehungsweise der Autoinducer, ein posttranslational

modifiziertes Protein, das aus einem größeren Peptid gebildet und über einen ABC- (ATP-binding

cassette-) Transporter sezerniert wird. Das Pheromon ist das Signal für das Sensorprotein und aktiviert

bei Bindung an diesen Sensor die Signalkaskade, sodass sich dieses System selbst verstärkt (aus

Kleerebezem et al., 1997).

Das Zwei-Komponenten-System hat als Signalweg in vielen Bakterien eine große

Bedeutung. Es steuert je nach Bakterium Vorgänge wie Chemotaxis, Osmoregulation,

Sporulation, Symbiosen und vieles mehr. Das agr-System von Staphylococcus aureus

kontrolliert die Expression von Virulenzfaktoren.

21

Einleitung

1.4.3. Aufbau und Funktion des agr-Genlocus

Die Expression des globalen Regulatorsystems agr von Staphylococcus aureus weist

eine starke Abhängigkeit vom Eintritt der Bakterien in die post-exponentielle

Wachstumsphase und der Aktivierung des Quorum-sensing-Systems über einen Zwei-

Komponenten-Signaltransduktionsweg auf (Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).

Sobald die Zellen das Ende der exponentiellen Wachstumsphase erreicht haben, wird

die Anzahl der Oberflächenproteine reduziert. Stattdessen werden gewebezerstörende

Proteine und Toxine vermehrt synthetisiert (Novick et al., 1995). Eine Zunahme der

Bakteriendichte führt demnach ab einem bestimmten Schwellenwert zur Up-Regulation

von sezernierten Virulenzfaktoren und der reziproken Down-Regulation von

Oberflächenproteinen. Startet man einen neuen Wachstumszyklus, indem man eine

Dilution der Bakterien mit einem neuen Medium durchführt, schalten die Bakterien

wieder um auf die vermehrte Synthese der Oberflächenproteine der exponentiellen

Phase (Peng et al., 1988).

Entdeckt wurde agr von Recsei et al. (1986) bei der Herstellung einer Mutante. Die

Insertion des Transposons Tn551 für die Erythromycin-Resistenz in das

Staphylococcus-aureus-Genom hatte einen weitreichenden Effekt auf die Expression

einiger extrazellulärer Proteine (siehe Abbildung 3). α-, β- und δ-Hämolysin, TSST-1

(Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-1) und die Staphylokinase wurden ungefähr um das

50fache reduziert, während Protein A um das circa 20fache anstieg. Das Transposon

musste somit ein Kontrollelement inaktiviert haben, das die Expression dieser Gene

steuert. Es wurde als agr (accessory gene regulator) bezeichnet (Recsei et al., 1986).

Der agr-Locus ist polycistronisch. Die transkribierte mRNA kodiert also für mehr als

ein Protein, wobei für jedes Protein ein eigenes Start- und Stoppsignal auf der mRNA

existiert (Stryer, 1988).

Der Genlocus agr besteht aus zwei divergierenden Operons, die von benachbarten,

jedoch nicht überschneidenden Promotoren, P2 und P3, transkribiert werden. Die

Sequenz des P2-Operons besteht aus vier offenen Leserahmen (ORFs, open reading

frames), agrA, -B, -C und -D (siehe Abbildung 3). Man geht davon aus, dass zwei

davon, agrA und agrC, die Proteine eines klassischen Zwei-Komponenten-

Signaltransduktionsweges kodieren.

22

Einleitung

Das Sensorprotein, die Histidin-spezifische Proteinkinase (HPK), wird vermutlich durch

den AgrC–Teil repräsentiert; agrA kodiert ein Protein, das dem Regulator (RR, response

regulator) und somit auch Aktivator der Zielgen-Transkription entsprechen könnte

(siehe Abbildung 4). Diese Annahme ist sehr verbreitet, allerdings bis zum jetzigen

Zeitpunkt noch nicht bewiesen.

Die Transkription von P2 beginnt an der Position 1750 der Nukleotidsequenz des agr-

Genlocus und es entsteht ein 3,5 kb (Kilobasen) langes Transkript, die RNA II (siehe

Abbildung 3). Die Transkription von P2 ist nur mit den Produkten des P2-Operons

möglich, sodass es sich hier um einen autokatalytischen Prozess handelt, der geeignet

ist, eine schnelle Produktion von Exoproteinen bei Stagnation des Bakterienwachstums

zu induzieren (Kornblum et al., 1991; Novick et al., 1993, 1995; Stock et al., 1989).

Abbildung 3: Transkription des polycistronischen agr-Locus Die Darstellung zeigt die Orte der drei Promotoren P1, P2, P3 und das ungefähre Ausmaß ihrer

Transkripte. Die RNA III, das Transkript des P3-Operons, wird in die gegensätzliche Richtung zu P1 und

P2 abgelesen. Außer der RNA III wird durch die ersten 160 Nukleotide des P3-Operons ein Toxin, das δ-

Hämolysin, kodiert. Entdeckt wurde agr bei der Herstellung einer Mutante durch Insertion des

Transposons Tn551 in agrA (aus Kornblum et al., 1991).

Das aus 0,5 kb bestehende Transkript des P3-Operons, die RNA III, beginnt an der

Position 1566 und wird in entgegengesetzter Richtung zum P2-Operon abgelesen. Die

ersten 160 Nukleotide enthalten oft die Sequenz für ein agr-reguliertes Protein, das δ-

Hämolysin (siehe Abbildung 3). Die RNA III ist aber das wesentliche Transkript, da sie

eine regulatorische RNA und daher selbst der eigentliche Effektor der agr-Antwort ist.

Sie kontrolliert in der postexponentiellen Wachstumsphase die Expression von

23

Einleitung

wenigstens 15 nicht miteinander verbundenen Exoprotein-Genen. Novick et al. (1993)

zeigten mit einem Klonierungsexperiment, dass allein die RNA III die gesamte

regulatorische Funktion des agr-Locus ersetzen kann und damit der agr-spezifische

Effektor für die Genregulation der Exoproteine in Staphylococcus aureus ist. Primär

beeinflusst die RNA III die Ebene der Zielgen-Transkription, jedoch hat sie in einigen

Fällen auch Einfluss auf die Translation. Auf welche Weise die RNA III die Zielgen-

Expression kontrolliert, ist bisher nicht bekannt (Kornblum et al., 1991; Novick et al.,

1993, 1995). Ein dritter Promotor, P1, befindet sich nahe des 5’-Endes von agrA und

zeigt nur wenig Aktivität. Er hat in etwa die gleiche Aktivität in agr+-Stämmen wie in

agr-defekten Stämmen. Zudem lässt sich kein Aktivitätsunterschied zwischen der

exponentiellen und postexponentiellen Wachstumsphase beobachten, sodass er von der

agr-Funktion unabhängig zu sein scheint. Seine Bedeutung innerhalb des agr-Systems

ist noch unbekannt. Er scheint -neben dem wesentlich stärkeren Promotor P2- die

Transkription des agrA-Gens zu regeln (Peng et al., 1988).

AgrA scheint die Rolle des Regulators und AgrC die des Sensorproteins in diesem

Zwei-Komponenten-System zu übernehmen (siehe Abbildung 4). Ji et al. (1995, 1997)

entschlüsselten die Funktion der Proteine AgrB und AgrD. Sie isolierten ein Oktapeptid

mit der Funktion des Quorum-sensing-Signalmoleküls, das sowohl die Transkription an

dem Promotor P2, als auch die am divergierenden Promotor P3 aktiviert. In der

postexponentiellen Wachstumsphase von Staphylococcus aureus akkumuliert es in der

Umgebung. Man geht davon aus, dass dieses Peptid (AIP, autoinducing peptide) aus

einem Fragment des agrD-Genproduktes gebildet wird, das von AgrB aus dem agrD-

Propeptid prozessiert und anschließend sezerniert wird. Das integrale Membranprotein

AgrB übernimmt demnach die Aufgabe eines modifizierenden Enzyms (Ji et al., 1995,

1997; van Leeuwen et al., 2000). Der genaue Mechanismus vom Vorläufer-Protein zum

funktionsfähigen Pheromon sowie die Interaktion von AgrB mit AgrD, ist bislang

unbekannt. Zhang et al. (2004) fanden heraus, dass das Propeptid AgrD für das agr-

Quorum-sensing-Signal (AIP) von S. aureus ein Membranprotein ist, dessen N-

terminale Region in die zytoplasmatische Membran integriert ist. Diese

Membranintegration ist notwendig, damit ein reifes AIP entstehen kann. Es wird

postuliert, dass dieses so entstandene Signalpeptid mit dem Transmembranrezeptor-

Protein eines klassischen Zwei-Komponenten-Regulatorsystems, AgrC, interagiert,

durch die Übertragung einer Phosphatgruppe den Regulator AgrA aktiviert und in

24

Einleitung

Verbindung mit einem zweiten Transkriptionsfaktor, SarA, die Transkription des P2-

und P3-Promotors triggert (Ji et al., 1995). Das AIP wird kontinuierlich sezerniert, zur

RNA III-Aktivierung kommt es -im Sinne des Quorum-sensing-Systems- jedoch erst,

wenn eine bestimmte Schwellendosis des AIP erreicht ist (Balaban und Novick, 1995).

Das Akronym AIP für „autoinducing peptide“ bezieht sich auf die funktionsfähigen

AgrD-Peptide, die schon von AgrB modifiziert wurden (Lyon et al., 2000).

Abbildung 4: Modell des agr-Systems von S. aureus Das P2-Operon kodiert neben AgrD, dem Vorläufer-Protein des autoinduzierenden Peptides (AIP), noch

drei weitere Proteine, nämlich AgrA, AgrB und AgrC. AgrB ist ein notwendiges Protein für die

Prozessierung von AgrD zum funktionsfähigen AIP. Dieses bindet dann an die extrazelluläre Domäne der

AgrC-Histidin-Proteinkinase, die daraufhin in der zytoplasmatischen Domäne eine Autophosphorylierung

erfährt. Der Phosphatrest wird vermutlich auf AgrA übertragen, das in seiner phosphorylierten Form

zusammen mit dem Protein SarA des globalen Regulators sar, die Promotoren P2 und P3 aktiviert. So

entsteht ein autoinduzierender Kreislauf, der über eine erhöhte RNA III-Transkription die Expression von

Oberflächenproteinen vermindert und die Anzahl der sezernierten Proteine erhöht (modifiziert nach

Novick, 1999).

Zusammenfassend gelten folgende Prinzipien für den Aufbau und die Funktion des agr-

Locus: Das P2-Operon kodiert in Form eines Oktapeptids seinen eigenen Aktivator

(AIP), der als Ligand an den Signalrezeptor bindet, welcher ebenfalls durch dasselbe

Operon kodiert wird. Die Hauptfunktion des Signal-Transduktionspfades ist die

Aktivierung seines eigenen Promotors P2 und die des divergierenden P3-Promotors.

25

Einleitung

Der Netto-Effekt dieser dualen Aktivierung ist eine schnelle RNA III-Expression auf

einem sehr hohen Level. Vermutlich ist die RNA III nicht besonders aktiv, sodass eine

hohe Konzentration benötigt wird. Das dichte-sensitive Merkmal dieses Systems

offenbart sich in der graduellen Akkumulation des Aktivators während der

Wachstumsphase und der plötzlichen Aktivierung bei Erreichen der Schwellendosis (Ji

et al., 1995).

1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus

Das AgrD-Peptid eines S.-aureus-Stammes aktiviert seinen eigenen agr-Locus und

inhibiert die agr-Expression anderer Stämme. Man nimmt an, dass dieser inhibitorische

Effekt auf andere Stämme vorteilhaft für die eigene Population und das Bakterium

selbst bezüglich Kolonisierungs- oder Infektionsort ist. Mayville et al. (1999) zeigten,

dass es diese Sequenzvariationen für agr tatsächlich gibt und zwar nicht nur für den

Autoinducer (AgrD), sondern auch für sein modifizierendes Protein (AgrB) und den

Rezeptor (AgrC). Dass diese drei Gene, agrD, agrB und agrC, von der

Sequenzvariation betroffen sind, stützt die Vorstellung, dass sie im Sinne eines Zwei-

Komponenten-Signaltransduktionsmechanismus zusammenwirken. Diese hypervariable

Region, agrBDC, besteht nicht aus den vollständigen drei Genen, sondern aus den C-

terminalen zwei Dritteln von agrB, dem kompletten agrD-Gen und der N-terminalen

Hälfte von agrC (siehe Abbildung 5) (Jarraud et al., 2000).

26

Einleitung

Abbildung 5: Hypervariable Region des agr-Genlocus Im oberen Teil des Schemas ist ein Shuttle-Vektor zu sehen, pRN7062, der zwei Segmente des agr-Locus

enthält, agrA und agrC sowie die P2- und P3-Region. Die C-terminalen zwei Drittel von agrB, das agrD-

Gen und die N-terminale Hälfte von agrC bilden die hypervariable Region des agr-Locus, welche die

Spezifität des Autoinducers und Rezeptors dieses Zwei-Komponenten-Systems ausmacht. Diese Gene für

das dichte-sensitive und sich selbst verstärkende Zwei-Komponenten-System liegen auf dem P2-Operon.

Der Effektor der Zielgen-Transkription, die RNA III, ist auf dem P3-Operon lokalisiert. Bei Bindung des

Autoinducers an den Rezeptor werden P2 und P3 aktiviert (aus Jarraud et al., 2000).

Auf der Basis dieser Autoinducer-Rezeptor-Spezifität, nämlich der

Aminosäurensequenz des AIP und des korrespondierenden Rezeptors, kann S. aureus in

vier verschiedene agr-Interferenzgruppen (I-IV) eingeteilt werden (siehe Material und

Methoden, Abbildung 8). Es gibt eine Besonderheit der Interferenzgruppe I des agr-

Genlocus, denn sie besitzt noch eine Subgruppe, Ia. Dies ist eine Variante, die sich von

I nur darin unterscheidet, dass ein Fragment aus 174 Basenpaaren fehlt und durch ein

anderes aus 270 bp ersetzt wurde (Papakyriacou et al., 2000). Innerhalb einer Gruppe

findet eine Kreuzaktivierung der agr-Antwort durch das autoinduzierende Peptid statt,

wohingegen die agr-Expression von anderen agr-Interferenzgruppen unterdrückt wird.

Dies bestätigte ein Vergleich der agrBDC-Sequenzen von S.-aureus-Stämmen, denn sie

waren innerhalb einer Gruppe identisch, verglichen mit den agrBDC-Sequenzen anderer

Gruppen wiesen sie aber deutliche Unterschiede auf (Ji et al., 1997). Lyon et al. (2000)

entdeckten, dass sowohl die Aktivierung innerhalb einer Gruppe als auch die

Inhibierung zwischen den Gruppen über den gruppenspezifischen AgrC-Rezeptor

vermittelt werden.

27

Einleitung

Jarraud et al. (2002) fanden die agr-Interferenzgruppe III gehäuft bei menstruellen

TSST- (Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-) Stämmen, wohingegen die Gruppen I und II

nicht bei bestimmten klinischen Symptomen gehäuft auftraten.

Sie entdeckten außerdem die vierte der bisher bekannten Interferenzgruppen, bei der das

AIP (autoinducing peptide) erwartungsgemäß deutliche Veränderungen zu dem der

Gruppen II und III aufwies. Verglichen mit dem Autoinducer der Interferenzgruppe I

zeigte sich jedoch bis auf den Austausch einer Aminosäure, Aspartat gegen Tyrosin,

kein Unterschied. Der agr-Locus der Gruppe IV ist demnach nahe verwandt mit dem

der Gruppe I. Diese Annahme stimmt mit der Beobachtung überein, dass die RNA III-

Synthese in Stämmen der agr-Gruppe I durch die Zugabe des Überstandes von S.

aureus der agr-Interferenzgruppe IV nicht gehemmt sondern stimuliert wird. Diese

Aktivierung erreichte ungefähr 30% der agr-Aktivierung, die bei Zusatz des

Überstandes der gleichen Interferenzgruppe (I) aufgetreten ist. Eine weitere

Besonderheit der agr-Interferenzgruppe IV ist ihre Korrelation zu S.-aureus-Stämmen,

die ein exfoliatives Toxin produzieren. Diese Korrelation ist aber nicht besonders eng,

da auch Stämme der Gruppen I und II exfoliative Toxine produzieren (Jarraud et al.,

2000).

1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies

Bei Staphylococcus epidermidis, der klinisch wichtigsten Koagulase-negativen Spezies,

konnte ebenfalls ein agr-System identifiziert werden, das bei der Wachstumsphasen-

abhängigen Regulation der Virulenzfaktoren eine zentrale Rolle spielt. Die Homologie

zwischen dem agr-Locus von S. aureus und S. epidermidis beträgt 68% (Kies et al.,

2003; Otto et al., 1998; van Wamel et al., 1995). Unter Staphylokokken wurde agr stark

konserviert. Studien der AIPs von Staphylococcus epidermidis haben im Allgemeinen

das bestätigt, was von ihnen bereits bei S. aureus bekannt ist (Kornblum et al., 1991;

Lyon et al., 2000; Otto, 2001; Otto et al., 1998, 1999). Dufour et al. (2002) fanden

durch Hybridisierung in mindestens 14 anderen Staphylokokken-Spezies oder

Subspezies Sequenzen, die mit dem agr-Regulon verwandt sind. Dieser

Regulationsmechanismus scheint somit unter Staphylokokken weit verbreitet zu sein.

28

Einleitung

1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar

Neben agr beeinflussen noch andere Regulatorsysteme die RNA III-Transkription. Der

sar- (staphylococcal accessory regulator-) Locus ist zum Beispiel ein weiterer

entscheidender Regulator. Er besteht aus drei überlappenden Transkripten, sarA, sarB

und sarC, die einer vom Wachstumszyklus abhängigen Regulation unterliegen, wobei

sarA und sarB in der frühen logarithmischen Wachstumsphase und sarC in der späten

stationären Phase die höchsten Konzentrationen zeigen. Sie werden von drei getrennten

Promotoren (P1, P2, P3) transkribiert; das Terminationssignal am 3’-Ende von allen

drei Transkripten ist jedoch identisch (Bayer et al., 1996). Das sarA-Transkript ist ein

regulatorisches Molekül, das die Expression der RNA II am Promotor P2 des agr-

Operon triggert und dadurch indirekt Einfluss auf die RNA III-Produktion nimmt

(Heinrichs et al., 1996).

Es wird angenommen, dass die beiden globalen Regulatoren agr und sar auf folgende

Weise interagieren:

Im Gegensatz zu agr aktiviert der sar-Locus sowohl die Synthese extrazellulärer als

auch Zellwand-assoziierter Proteine. SarA bindet zwischen der P2- und P3-

Promotorregion, der sogenannten Interpromotorregion. Die Bindungsstelle liegt

allerdings näher an P2, was die höhere Affinität zu diesem erklärt. Außerdem wirkt sich

eine sar-Mutation mehr auf die Transkription von RNA II als von RNA III aus (Chien

und Cheung, 1998). Es spricht vieles für die Annahme, dass sar den agr-Genlocus in

der Synthese von Exoproteinen kontrolliert.

Diese vereinfachte Darstellung wird dem komplexen Geflecht von Wechselwirkungen

zwischen agr und sar nicht gerecht. An dieser Stelle würde eine profundere Betrachtung

jedoch zu weit führen, zumal agr und sar nicht die einzigen Regulatorsysteme sind, die

Einfluss auf die Virulenzfaktorproduktion nehmen. Die Regulation der Synthese von

extrazellulären und Zellwand-assoziierten Proteinen von Staphylococcus aureus ist ein

äußerst komplexer und sorgfältig koordinierter Prozess, der von vielen Faktoren

beeinflusst wird. In diesem Netz von Interaktionen sind noch viele Wege unbekannt und

die jetzt schon bestehende Komplexität macht eine überschaubare Ansicht unmöglich

(Cheung und Projan, 1994; Cheung und Ying, 1994; Gertz et al., 2000; Heinrichs et al.,

1996; Smeltzer et al., 1993).

29

Einleitung

1.6 Fragestellung

Es gibt seit langem in vielen Ländern die Beobachtung, dass sich einige MRSA-Stämme

besonders erfolgreich, zum Teil weltweit ausbreiten und zu einem enormen

epidemiologischen Problem werden. Andere Stämme hingegen treten nur sporadisch in

Erscheinung und sind von untergeordneter klinischer Relevanz. Somit entstehen

weltweit Epidemien, die von wenigen MRSA-Stämmen verursacht werden. Dieser

epidemiologische Unterschied führt zu der Frage, was den epidemischen MRSA-

beziehungsweise S.-aureus-Stämmen die enorme Fähigkeit zur Ausbreitung verleiht.

Welche Faktoren sind daran beteiligt, dass ein Stamm epidemisch wird, sich schnell

über große Entfernungen ausbreitet und zu einem erheblichen klinischen Problem wird?

Dieses Phänomen ist bisher nur wenig erforscht.

Es ist allgemein anerkannt, dass die Pathogenität eines S.-aureus-Stammes von seiner

Ausstattung mit Virulenzfaktoren abhängt. Neben der Fähigkeit zur Produktion von

Virulenzfaktoren ist auch die Regulation ihrer Expression in den verschiedenen

Infektionsstadien für die Pathogenität von entscheidender Bedeutung.

Papakyriacou et al. (2000) entdeckten zwei epidemische Stämme von S. aureus, die für

die Hälfte aller Infektionen in Kanada verantwortlich waren und einen einheitlichen

Phänotyp aufwiesen. Die Sekretion von Exoproteinen war bei ihnen begrenzt zu

Gunsten einer erhöhten Bindungsfähigkeit an Wirtszellproteine. Dieser spezielle

Phänotyp könnte der Grund sein für die starke Prävalenz dieser Stämme unter

klinischen Isolaten.

Durch seine regulatorische Funktion auf die Expression von Virulenzfaktoren und der

Variabilität seines zentralen Segmentes, agrBDC, könnte der agr-Genlocus einen

entscheidenden Einfluss auf die Epidemiologie von MRSA ausüben. Deshalb erscheint

es sinnvoll, hier nach einer Erklärung zu suchen. Die Entdeckung der agrBDC-

Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass möglicherweise ein bestimmter agr-

Interferenz-Typ mit Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden kann. Dies

sollte in der vorliegenden Arbeit genauer betrachtet werden.

30

Einleitung

Als Erstes galt es in dieser Studie herauszufinden, ob es in den untersuchten Kliniken

epidemische MRSA-Stämme gibt. Dazu wurden die MRSA-Isolate der

Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach

epidemiologischen Kriterien klassifiziert. Weiterhin sollten die in Bochum

vorherrschenden Stämme mit anerkannten nationalen und internationalen

Epidemiestämmen verglichen werden.

Nachfolgend sollte nach Auffälligkeiten in der Verteilung der MRSA-Stämme auf die

Kliniken gesucht werden, damit mögliche Zusammenhänge von MRSA-Klonen mit den

Kliniken hergestellt werden können. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht jedoch die

Suche nach einer Korrelation zwischen den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen

und den epidemiologischen Eigenschaften der MRSA-Stämme, denn der agr-Locus gilt

als eine mögliche Erklärung für das unterschiedliche epidemiologische Verhalten der

MRSA-Stämme. Die Erforschung der Regulatorsysteme und der bakteriellen

Kommunikation könnten für zukünftige therapeutische Entwicklungen von Bedeutung

sein.

31

Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien waren von höchstem Reinheitsgrad und wurden, falls

nicht anders angegeben, von den Firmen Merck Eurolab (Darmstadt) und

Sigma/Aldrich (München) bezogen.

2.1.2 Stämme

Die für diese Arbeit ausgewählten MRSA- (Methicillin-resistente Staphylococcus

aureus-) Stämme waren klinische Isolate aus dem Institut für Medizinische

Mikrobiologie der Stadt Bochum, zugesandt aus einer Gemeinschaftspraxis und 19

Kliniken Nordrhein-Westfalens, insbesondere aus Bochum und Städten der näheren

Umgebung (siehe Tabelle 1). Der Einfachheit halber werden im Folgenden 20 Kliniken

als Einsender beschrieben. Aus Gründen des Datenschutzes wurden die Kliniken selbst

nicht genannt, sondern durch Buchstaben gekennzeichnet. Insgesamt wurden in der Zeit

vom 13.02.1998 bis zum 31.12.2000 417 MRSA-Stämme in die Studie aufgenommen.

Bei einer nachfolgend durchgeführten Aktualisierung der Untersuchung stieg die

Anzahl der MRSA-Stämme um 744 auf 1161. Einige MRSA der Stammsammlung

blieben dabei unberücksichtigt, da sich deren einsendende Kliniken weit außerhalb des

Einzugsbereiches dieser Studie befinden oder nicht mehr sicher identifiziert werden

konnten.

Das Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum identifizierte im

Grampräparat alle Stämme als grampositive Kokken; der Nachweis von Katalase mit

H2O2 und der des Fibrinogenrezeptors mit dem Clumping-factor-Test (CF) waren

positiv. Bei nicht eindeutig zu differenzierenden Stämmen wurde zusätzlich das

VITEK-System (bioMerieux, Nürtingen) mit der GPI-Karte (gram-positiv identification

card) Nr. V 1305 eingesetzt.

32

Material und Methoden

Die als Kontrollstämme verwendeten S. aureus ATCC 38591 (Oxacillin-resistent) und

ATCC 25923 (Oxacillin-sensibel) sind Referenzstämme der „American Type Culture

Collection“.

Tabelle 1: Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden

KLINIK ANZAHL DER ISOLATE

A 360

B 294

C 110

D 81

E 37

F 34

G 34

H 33

I 26

J 26

K 22

L 13

M 18

N 18

O 14

P 12

Q 11

R 9

S 6

T 3

33

Material und Methoden

Die Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster der für diese Arbeit verwendeten

Stämme wurden mit denen folgender anerkannter epidemischer MRSA und MSSA

verglichen:

CMRSA-1A, -1B, -1D = -1E, -2A, -3A, -3B, -4 sind MRSA-Stämme des

Department of Microbiology, Sunnybrook and Women's College Health Science

Centre, Toronto, Ontario, Canada (Papakyriacou et al., 2000).

Diese MRSA wurden aus der Sammlung des Canadian Nosocomial Infection

Surveillance Program (CNISP) ausgewählt.

SA 441 (MRSA), 442 (MSSA), 456 (MRSA), 493 (MSSA), 506 (MRSA), 518

(MSSA), 553 (MSSA), 554 (MSSA) sind Stämme des Department of

Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

(Booth et al., 2001). Da aus der genannten Publikation nicht eindeutig

hervorging, in welchem Fall es sich um MRSA handelt und in welchem um

MSSA, wurden die Stämme mit einer mecA-PCR (siehe Tabelle 2) näher

klassifiziert.

Diese PCR wurde wie in Abschnitt 2.2.4 beschrieben durchgeführt. Bei 96 °C wurde die

DNA 30 Sekunden denaturiert, die Primerbindung erfolgte in 30 Sekunden bei 50 °C

und die Elongation wurde für 40 Sekunden bei 72 °C durchgeführt. Der primär

abgelaufene Denaturierungsschritt dauerte 7 Minuten bei 95 °C und der terminale

Elongationsschritt 7 Minuten bei 72 °C. Es wurden insgesamt 30 Amplifikationszyklen

durchlaufen.

Tabelle 2: mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens

PRIMER SEQUENZ SEQUENZ-LÄNGE

mecA forward 5' -GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA- 3' 25

mecA reverse 5' -CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA- 3' 25

34

Material und Methoden

Um das Ergebnis der mecA-PCR zu überprüfen, folgte noch ein Oxacillin-Screening-

Test zum Nachweis der Oxacillin-Resistenz:

Dazu wurden 10 µl einer Bakteriensuspension der Dichte McFarland 0,5 auf Oxacillin-

Screeningplatten getropft und diese dann bei 30 °C bis zu zwei Tagen bebrütet

(NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standard, 1997).

Zur Kontrolle wurden die S.-aureus-Stämme ATCC 38591 (mecA-positiv) und ATCC

25923 (mecA-negativ) mitgetestet. Sowohl die mecA-PCR als auch der Oxacillin-

Screening-Test führten zu dem gleichen Ergebnis (siehe oben).

Des Weiteren wurden die PFGE-Muster mit denen europäischer MRSA

verglichen. Dazu gehörten sechs bekannte deutsche Epidemiestämme des

Nationalen Referenzzentrums für Staphylokokken am Robert Koch-Institut

(Bereich Wernigerode), ein österreichischer und ein englischer Epidemiestamm

(siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa

(nach Enright et al., 2002; Robert Koch-Institut, 2002)

Klonale Gruppe, Bezeichnung in D Internat.Kennziffer MLST-TYP Internationale Verteilung

„Süddeutscher“-Epidemiestamm ST 28 1-4-1-4-12-24-29 D,SL

„Berliner“-Epidemiestamm ST 45 10-14-8-6-10-3-2 B,Fin,D,S,Nl

„Barnimer“-Epidemiestamm = EMRSA 15 ST 22 7-6-1-5-8-8-6 D,Ir,UK,S

„Rhein-Hessen“-Epidemiestamm ST 5 1-4-1-4-12-1-10 F,Por,D,UK,US

„Hannoverscher“-Epidemiestamm ST 254 3-32-1-1-4-4-3 D,UK

„Norddeutscher“-Epidemiestamm ST 247 3-3-1-12-4-4-16 B,Fin,F,D,Por,Sp,Sl,S,UK,US

„Wiener“-Epidemiestamm ST 239 3-3-1-1-4-4-3 Fin,D,Gr,Ir,Nl,Pol,Sl,S,UK,US

EMRSA 16 ST 36 2-2-2-2-2-3-2 Fin,UK

B = Belgien, D = Deutschland, F = Frankreich, Fin = Finnland, Gr = Griechenland, Ir = Irland, Nl = Niederlande,

Pol = Polen, Por = Portugal, S = Schweden, Sl = Slowenien, UK = Großbritannien, US = USA

35

Material und Methoden

2.1.3 Kulturmedien und Puffer

Die S.-aureus-Stämme wurden auf Blutagarplatten (Columbia Agar-Basis mit Zusatz

von 4% defibriniertem Schafsblut, beides Oxoid) und in LB-Medium (Life

Technologies, Karlsruhe) angezüchtet.

TAE-Puffer x 1: 40mM Tris-acetat (pH=8,0), 1mM EDTA

TBE-Puffer x 0,5: 45mM Tris-borat (pH=8,0), 1mM EDTA

Lysepuffer: 20mM Tris-HCl (pH=8,0), 2mM EDTA,

1,2% Triton x 100, sterilfiltriert

2.1.4 Enzyme

Die in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsenzyme wurden bezogen von:

1. DraI mit dem React 1-Puffer x 10 von Life Technologies und

2. Taq-Polymerase mit dem PCR-Puffer x 10 von Amersham Pharmacia.

2.1.5 Oligonukleotide

Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden bei MWG Biotech (Ebersberg) mit der

Reinheitsstufe HPSF synthetisiert.

Tabelle 4: Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens

PRIMER SEQUENZ SEQUENZ-LÄNGE POSITION

agr forward 5' -ACC AGT TTG CCA CGT ATC- 3' 18 1801-1818

agr reverse 5' -TAA ACC ACG ACC TTC ACC- 3' 18 3685-3668

Die ausgewählten Primer-Sequenzen beginnen 25 Nukleotide vor dem 5’-Ende der

agrB-kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide nach dem 3’-Ende der agrC-kodierenden

Sequenz und enthalten somit die hypervariable Region.

Die Auswahl der Primer erfolgte nach den Angaben von Papakyriacou et al. (2000).

36

Material und Methoden

2.2 Methoden

2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien

anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster

Die in dieser Arbeit verwendeten Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus

(MRSA) wurden anhand der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) nach der Methode von

Goering und Winters (1992) typisiert. Das Restriktionsenzym Sma I hat sich für diese

Methode der Makrorestriktion von Staphylococcus aureus als besonders nützlich

erwiesen und wurde dementsprechend eingesetzt. Die Anzahl der entstehenden

Restriktionsfragmente beläuft sich auf 12 bis 20 mit einer Fragmentgröße von 10 bis

700 Kilobasen (Tenover et al., 1995).

Mit der Software Molecular-Analyst der Firma Bio-Rad wurden die PFGE-Muster auf

ihren Verwandtschaftsgrad hin überprüft (siehe Abbildung 6). Hierzu konnte eine

Cluster-Analyse der PFGE-Muster mit verschiedenen Algorithmen durchgeführt

werden: Der Pearson’sche Korrelationskoeffizient ist von definierten Banden

unabhängig und reflektiert den linearen Zusammenhang zweier quantitativer Merkmale.

Des Weiteren standen vier verschiedene, von definierten Banden abhängige

Koeffizienten zur Auswahl. Einer dieser bandenbasierten Koeffizienten, der

Algorithmus Jeffrey’s x coefficient, wurde für die Cluster-Analyse zur Berechnung der

Verwandschaft von Bandenmustern verwendet. Zusätzlich wurde der Cluster-

Algorithmus Ward verwendet (siehe Abbildung 6).

Es erfolgte eine anschließende Kontrolle und gegebenenfalls Korrektur der durch die

Algorithmen errechneten Verwandtschaftsgrade nach den Konsensus-Leitlinien zur

Interpretation von PFGE-Mustern chromosomaler DNA (Tenover et al., 1995).

Diesen Kriterien zufolge wurden Isolate mit gleichen oder nah verwandten PFGE-

Mustern in einer PFGE-Gruppe zusammengefasst.

37

Material und Methoden

Abbildung 6: Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software

Das Dendrogramm veranschaulicht den Verwandtschaftsgrad der Bandenmuster,

errechnet mit Jeffrey’s x coefficient.

Durch Aktivierung der Option „global optimization“ wurde ein durchschnittliches

Bandenmuster errechnet und die Banden innerhalb vorgegebener Grenzen soweit

verschoben, bis sie die höchste Korrelation mit diesem Durchschnittsmuster aufwiesen.

Damit wurden kleinste Linienunterschiede der zu vergleichenden Bandenlinien

herausgefiltert (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Optimization

Zwei identische Bandenmuster werden in der linken Abbildung nicht exakt nebeneinander dargestellt und

somit nicht als gleich erkannt. Durch die Optimierung werden die Bandenlinien einander angeglichen und

als gleich identifiziert (aus Instruction Manual, Molecular Analyst Fingerprinting Software).

38

Material und Methoden

2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen

Eigenschaften „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“

Isolate mit identischen oder nahezu identischen Pulsfeldgelelektrophorese-Mustern

wurden in einer PFGE-Gruppe zusammengefasst. Auf diese Weise entstanden Gruppen

mit sehr vielen Isolaten, solche, die wenige oder nur zwei Isolate enthielten, und solche,

die in dieser Stammsammlung einzigartig waren. Somit lässt sich eine Klassifizierung

vornehmen in häufig, selten oder nur ein Mal vorkommende Stämme. Die in dieser

Arbeit gewählte Nomenklatur für die epidemiologische Zuordnung der PFGE-Gruppen

ist „epidemisch“ und „unklar“. Für die nur ein Mal in der Sammlung aufgetretenen

Stämme fand die Bezeichnung „sporadisch“ Verwendung. Als „endemisch“ lassen sich

diese Stämme nicht ohne Zweifel benennen, da nicht sicher auszuschließen ist, dass sie

noch außerhalb von Bochum und der näheren Umgebung vorkommen. Da es für

infektionsepidemiologische Untersuchungen in der Literatur keine eindeutige Definition

der Begriffe „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“ gibt, wurde für die 1161

Bochumer Stämme eine Operationalisierung vorgenommen. Eine PFGE-Gruppe, die 20

oder mehr Isolate aus mindestens zwei verschiedenen Krankenhäusern enthielt, galt als

epidemisch. Gruppen mit mindestens zwei und weniger als 20 Isolaten konnten zum

gegebenen Zeitpunkt nicht als epidemisch oder sporadisch klassifiziert werden und

erhielten deshalb die Bezeichnung unklar. Durch weitere Untersuchungen zu einem

späteren Zeitpunkt lassen sich möglicherweise noch einige dieser Gruppen als

epidemisch einstufen. Bei nur ein Mal aufgetretenen PFGE-Mustern, ohne nähere

Verwandtschaft zu anderen, galten die Stämme als sporadisch.

2.2.3 DNA-Präparation

Genomische DNA von S. aureus wurde mit dem DNeasy Kit der Firma Qiagen (Hilden)

hergestellt; dabei wurde wie folgt vorgegangen:

Jeweils eine Kolonie eines auf Blutagar angezüchteten MRSA wurde in 5 ml LB-

Boullion gegeben und über Nacht bei 37 °C und 130 Rotationen pro Minute in einem

Schüttelinkubator (Innova 4330, New Brunswick Scientific) inkubiert.

39

Material und Methoden

Von dieser Bakteriensuspension wurden 2 ml in ein Eppendorfgefäß pipettiert und eine

Minute bei 16060 x g in einer Mikroliterzentrifuge (Heraeus Biofuge Pico, Kendro

Laboratory Products) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in

170 µl Lysepuffer resuspendiert. Außerdem wurden 20 µl Lysozym (10 mg/ml) und 10

µl Lysostaphin (1 mg/ml) hinzugegeben. Der Ansatz wurde für 30 Minuten bei 37 °C

inkubiert.

Nachfolgend wurden 25 µl der im Kit enthaltenen Proteinase K, 20 µl RNAse (20

mg/ml), 210 µl Ethanol (99,8%) und die vorgeschriebenen Puffer an entsprechender

Stelle hinzugefügt. Die Lösung wurde direkt auf eine spezielle Filtersäule gegeben,

unter welcher sich ein 2-ml-Gefäß befand, und eine Minute bei 6000 x g zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen und es folgten zwei Waschschritte, bei denen jeweils

ein Puffer hinzugefügt und mit den oben genannten Filtersäulen eine Minute bei 6000 x

g zentrifugiert wurde. Nach jedem Waschschritt wurde der Überstand verworfen.

Daraufhin folgte ein zweiminütiger Zentrifugationsschritt bei 16060 x g ohne Zugabe

eines Puffers, der Überstand wurde anschließend wiederum verworfen. Nachfolgend

wurden 200 µl einer Pufferlösung zugegeben, die Lösung dann eine Minute bei 6000 x

g zentrifugiert und von dem verdünnten Eluat (1:10) eine PCR angefertigt.

2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR wurde in einem „Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler“ durchgeführt. In einer

Standardreaktion wurden 100 pmol von jedem Primer, 20 pmol von jedem

Desoxynukleotid und 2,5 U Taq-Polymerase eingesetzt. Als Ziel-DNA wurden von der

genomischen DNA circa 30 ng pro Reaktion zugefügt. Es wurde ein Ansatz hergestellt,

der insgesamt 100 µl je Probe für die PCR betrug.

Die DNA wurde für 30 Sekunden bei 94 °C denaturiert, die Primerbindung erfolgte in

30 Sekunden bei einer Annealing-Temperatur von 55 °C, die Kettenverlängerung

(Elongation) wurde für 1 Minute bei 72 °C durchgeführt. Die PCR begann mit einem

Denaturierungsschritt (5 Minuten bei 94 °C) und endete mit einem Elongationsschritt (7

Minuten bei 72 °C), dazwischen lagen 30 Amplifikationszyklen.

40

Material und Methoden

2.2.5 Agarosegelelektrophorese

In einem 10 µl-Ansatz wurden 5 µl des jeweiligen PCR-Produktes (200-250 ng DNA)

mit 5 µl verdünntem (1:5) Stopp-Mix (50% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau) versetzt

und durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel (Spezialagarose für die

Elektrophorese von Nukleinsäuren > 500 bp, Biozym agarose) in TAE-Puffer

aufgetrennt (8 Volt/ cm). Jedes Gel enthielt außer den Proben noch einen

Molekulargewicht-Längenstandard und eine Negativ-Probe. Das Molekulargewicht

konnte anhand dieses Standards, der 1 kb-ladder (Life Technologies), beurteilt werden

und betrug bei erfolgreicher Durchführung 1884 kb. Das Gel wurde ungefähr 15

Minuten in Ethidiumbromidlösung gefärbt, mit H2O von Ethidiumbromidresten befreit

und im UV-Licht fotografiert. Dazu diente die Polaroid-Kamera DS 34, ausgestattet mit

einem UV-Filter und eingestellt auf die Blendenzahl 8 bei der Belichtungszeit 4 (1/4

Sekunde).

2.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte

Zur Aufreinigung der durch das Agarosegel nachgewiesenen Amplifikate wurde das

„QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen) verwendet und entsprechend des Protokolls

verfahren: 500 µl des PB-Puffers wurden mit den 100 µl PCR-Produkt vermischt, über

eine QIAquick-Filter-Säule gegeben und eine Minute bei 16060 x g zentrifugiert. Die

folgenden Zentrifugationsschritte dauerten ebenfalls eine Minute und es wurde auch

hier auf 16060 x g beschleunigt. Der Überstand wurde verworfen, 0,75 ml des PE-

Puffers hinzugefügt und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt wurde anschließend ohne

Zugabe eines Puffers wiederholt. Zuletzt wurden 50 µl EB-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH

8,5) auf die QIAquick-Filter-Säule gegeben und nach anschließender Zentrifugation

konnten 50 µl aufgereinigte DNA in ein Eppendorfgefäß eluiert werden.

Mit einem erneuten Kontrollgel (siehe 2.2.5) wurde diesmal die gereinigte DNA

nachgewiesen (1884 kb).

41

Material und Methoden

2.2.7 Restriktionsanalyse

Ein 10 µl Ansatz mit 8,5 µl gereinigter DNA (24-29 ng), 0,5 µl des Restriktionsenzyms

DraI (1,250 U; 10 U/µl) und 1 µl Enzympuffer wurde für 16-18 Stunden bei 37 °C

inkubiert. DraI schneidet einen Abschnitt heraus, der 25 Nukleotide vom 5’-Ende der

agrB kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide vom 3’-Ende der agrC kodierenden

Sequenz entfernt ist und somit die hypervariable Region enthält (Papakyriacou et al.,

2000).

Anschließend wurde ein Tropfen unverdünnter Stopp-Mix (50% Glycerin, 0,25%

Bromphenolblau) zugegeben und die Restriktionsfragmente durch Elektrophorese in

einem 2%igen mit Ethidiumbromid versetzten Agarosegel (small dna low melt,

Spezialagarose für die Elektrophorese von Nukleinsäuren < 1 kbp, Biozym agarose) in

TBE-Puffer nachgewiesen (6 Volt/cm). Der Molekulargewicht-Längenstandard

„molecular weight standard VIII“ (Roche) wurde zur Bestimmung der Fragmentgröße

eingesetzt. Nachdem das Gel mit der Polaroid-Kamera wie in Abschnitt 2.2.5

beschrieben fotografiert worden war, erfolgte zusätzlich ein Scan-Vorgang. Das Gel

wurde dabei mit dem „Fluor-STM Multi-Imager“ (Bio-Rad) und der zugehörigen

Software „Multi-Analyst“ (Bio-Rad) im UV-Licht mit dem Filter „520 nm Long Pass

Ethidiumbromide“ gescannt.

Die eingestellte Belichtungszeit variierte je nach Gel zwischen 30 Sekunden und 2

Minuten. Es wurde, abhängig vom jeweiligen Gel, entweder mit der Option „High

Resolution“ oder „High Sensitivity“ gescannt, die Scan-Breite betrug 80 mm oder 160

mm.

Die hier beschriebene Erfassung der

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP)

der hypervariablen Region des agr-Locus führte zu den

in der Literatur beschriebenen vier verschiedenen

Bandenmustern (Jarraud et al., 2000; Papakyriacou et

al., 2000).

Abbildung 8: Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus

Zu erkennen sind fünf verschiedene RFLP-Muster, wobei Ia als Subgruppe von I gilt, da sich diese beiden

nur geringfügig in ihren Bandenmustern unterscheiden.

42

Ergebnisse

3 Ergebnisse

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, der Frage nachzugehen, warum bestimmte

MRSA (Methicillin-resistente Staphylococcus aureus) epidemisch sind, sich über große

Entfernungen und manche sich sogar weltweit innerhalb kurzer Zeit ausbreiten können,

wohingegen andere MRSA-Stämme anscheinend nicht über diese Fähigkeit verfügen

und nur selten oder ein Mal in einem geographisch begrenzten Bereich auftreten. Um

der Antwort näher zu kommen, wurde eine von vielen möglichen Erklärungen dieses

Phänomens, die Variabilität des agr-Genlocus, genauer untersucht.

Das Vorgehen lässt sich in vier Punkten zusammenfassen:

1. Es wurde ermittelt, welche MRSA, eingesandt aus 20 Kliniken Nordrhein-

Westfalens mit Konzentration auf die Stadt Bochum und Umgebung, häufig und

welche bisher selten oder nur ein Mal im Untersuchungsmaterial von Patienten

dieser Krankenhäuser auftraten. Um epidemische von sporadischen Stämmen

abzugrenzen, wurden von allen Isolaten Pulsfeldgelelektrophorese-

Untersuchungen durchgeführt. Diejenigen, deren Pulsfeldgel-Muster sehr

ähnlich oder identisch waren (Tenover et al., 1995), wurden in Gruppen

zusammengefasst, sodass die Häufigkeit, mit der ein Stamm klinisch auftrat, der

Anzahl der Isolate in einer Gruppe entsprach. Pulsfeldgelelektrophorese-

(PFGE-) Gruppen einer bestimmten Größe (≥ 20 Isolate) wurden als

„epidemisch“ definiert. Diejenigen, die mindestens zwei und weniger als 20

Isolate aufwiesen, erhielten die Bezeichnung „unklar“. Isolate, deren Muster in

der Stammsammlung einzigartig waren, wurden als „sporadisch“ eingeordnet

(siehe Material und Methoden 2.2.2).

2. Anschließend wurde die Stammsammlung des Instituts für Medizinische

Mikrobiologie der Stadt Bochum mit bereits bekannten nationalen und

internationalen Epidemiestämmen verglichen, wobei auch hier die

Bandenmuster der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) zur Bestimmung des

Verwandtschaftsgrades herangezogen wurden.

43

Ergebnisse

3. Für jede PFGE-Gruppe wurde ermittelt, von wie vielen und von welchen

Kliniken die MRSA-Isolate eingesandt wurden. Nachfolgend wurde für die vier

Kliniken, von denen mehr als 100 Isolate eingeschickt wurden, die Verteilung

ihrer MRSA-Isolate auf die PFGE-Gruppen dargestellt.

4. Den Schwerpunkt der Arbeit bildet die Suche nach einem Zusammenhang

zwischen den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen und den

epidemiologischen Eigenschaften der MRSA-Stämme (epidemisch, unklar,

sporadisch). Dazu war es erforderlich, die agr-Interferenzmuster sämtlicher

sporadischer Isolate zu erfassen. Von den auf Grund ähnlicher PFGE-Muster in

Gruppen (epidemisch oder unklar) zusammengefassten Isolaten wurden nur

Stichproben aus jeder Gruppe zur Restriktionsanalyse herangezogen, da davon

auszugehen ist, dass die nahe verwandten Isolate innerhalb einer PFGE-Gruppe

auch zur gleichen agr-Interferenzgruppe gehören. Zudem stellt die

Pulsfeldgelelektrophorese im Vergleich zur Analyse der Restriktionsfragment-

längen-Polymorphismen der hypervariablen Region des agr-Genlocus die

wesentlich diskriminativere Methode dar.

3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit

Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung

3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für

Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres

klinischen Auftretens

Es wurden 417 MRSA-Isolate in die Studie eingeschlossen, die von Februar 1998 bis

Dezember 2000 in die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie

aufgenommen wurden. Das älteste Isolat stammt vom 13.02.1998 und trägt die

Dauerkultur-Nummer 1. Das Untersuchungsmaterial stammt aus 20 Krankenhäusern in

Nordrhein-Westfalen, hauptsächlich aus Bochum und Umgebung.

Da die Einsender zumeist Universitätskliniken oder akademische Lehrkrankenhäuser

sind, kann von einem breiten Spektrum an Grunderkrankungen ausgegangen werden.

44

Ergebnisse

Um herauszufinden, ob es auch in Bochum und im näheren Umfeld epidemische

MRSA-Stämme gibt, die häufig und in verschiedenen Krankenhäusern auftreten,

mussten die Isolate der Stammsammlung nach bestimmten Kriterien geordnet werden:

Anhand der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Bandenmuster der 417 MRSA-Isolate

wurde durch Anwendung entsprechender Software der Verwandtschaftsgrad der Isolate

errechnet. Danach bedurfte es einer manuellen Kontrolle und Korrektur des

rechnergestützten Ergebnisses mit Hilfe der Konsensus-Leitlinien zur Interpretation von

PFGE-Mustern (Tenover et al., 1995). Gleiche oder sehr ähnliche Bandenmuster

wurden zu einer PFGE-Gruppe zusammengefasst (siehe Material und Methoden 2.2.1

und 2.2.2). Auf diesem Weg ergab sich eine Einteilung der 417 Isolate in 22

verschiedene PFGE-Gruppen. Die Bandenmuster von 37 Isolaten entsprachen keinem

der anderen Stämme, was vermuten lässt, dass diese Isolate für sich stehen und

innerhalb der Stammsammlung keinen oder einen nur sehr geringen

Verwandtschaftsgrad zu anderen Isolaten aufweisen, sodass sie als „sporadisch“

klassifiziert wurden (siehe Abbildung 9).

45

Ergebnisse

21

13

39

34

52

39

68

12

42

34

1211

43

3 3 3 4

11

6 53 2 2 2 2 2

37

20

10

20

30

40

50

60

Isolate pro

Gruppe

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

PFGE - Gruppen

= unklar = sporadisch= epidemisch

Abbildung 9: Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster

(Stand der Stammsammlung: 31.12.2000)

Die insgesamt sieben rot markierten Säulen stehen für die PFGE-Gruppen, in denen sich mindestens 20

Isolate befinden und die deshalb als epidemisch klassifiziert wurden. Die 22 blauen Säulen symbolisieren

die unklaren PFGE-Gruppen, in denen sich mindestens zwei und höchstens 19 Isolate befinden, deren

epidemiologisches Verhalten somit zum Zeitpunkt der Datenerhebung nicht ausreichend erfassbar war.

Die Bandenmuster von 37 Isolaten konnten keiner Gruppe zugeordnet werden und gelten als sporadisch.

Einige PFGE-Gruppen sind ohne Isolate dargestellt, da sie erst in einem späteren Untersuchungszeitraum

entstanden sind (01.01.2001–12.01.2004) und deshalb hier nur eine Platzhalterfunktion einnehmen. Diese

Gruppen sind in der aktualisierten Fassung des Diagramms (siehe Abbildung 10) von Bedeutung.

Nach den oben genannten Kriterien ergaben sich sieben epidemische Gruppen mit 20

oder mehr Isolaten, von denen die meisten der PFGE-Gruppe 6 (52 MRSA) angehörten.

Insgesamt wurde der Großteil des Kollektivs mit 262 Isolaten (62,8%) den

epidemischen Gruppen zugeordnet. Bei 22 PFGE-Gruppen mit insgesamt 118 Isolaten

(28,3%) war zum damaligen Zeitpunkt keine Klassifikation in epidemisch oder

sporadisch möglich, ihre Zuordnung blieb somit unklar. 37 Isolate (8,9%) wiesen mit

anderen PFGE-Mustern keine Übereinstimmung auf und waren demnach sporadisch

(siehe Tabelle 5). Sie wurden für die Abbildungen als Gruppe 34 zusammengefasst.

46

Ergebnisse

Tabelle 5: Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000)

Im Folgenden sind die Kriterien zur Operationalisierung der Begriffe „epidemisch“, „unklar“ und

„sporadisch“ aufgeführt (siehe Material und Methoden 2.2.2), wobei „N“ für die Anzahl der Isolate steht.

Des Weiteren wird aus der Tabelle ersichtlich, wie viele Isolate den jeweiligen Eigenschaften absolut und

in Prozent bis zum 31.12.2000 zugeordnet werden konnten.

EPIDEMIOLOGISCHE KLASSIFIKATION DER 417 ISOLATE

Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1

(insgesamt: 262) (insgesamt: 118) (insgesamt: 37)

62,8 % 28,3 % 8,9 %

3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004

Da sich die bisher dargestellten Ergebnisse auf den knapp dreijährigen Zeitraum vom

13.02.1998 bis 31.12.2000 beziehen und die Stammsammlung des Instituts für

Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum regelmäßig mit neuen Isolaten erweitert

wird, erfolgte eine zweite Analyse der Daten bis zum Monat Januar des Jahres 2004.

Der gesamte Beobachtungszeitraum dieser Studie beläuft sich somit auf knapp sechs

Jahre. Das erste Isolat der Stammsammlung wurde am 13.02.1998 als Dauerkultur

angelegt. Am 21.01.2004 fand das letzte MRSA-Isolat Eingang in diese Studie.

Die bis Ende 2000 in die Auswertung eingegangenen 417 Isolate waren von Januar

2001 bis Januar 2004 um 744 auf 1161 Isolate angestiegen. Die zwei

Beobachtungszeiträume ließen Aussagen über die zeitliche Entwicklung der Stämme

zu. Außerdem konnten gewisse Trends in der epidemiologischen Klassifikation der

MRSA, die sich in der Zeit vom 13.02.1998 bis 31.12.2000 abzeichneten, bis zum

12.01.2004 weiterverfolgt werden. So entstanden aus sporadischen Stämmen durch die

Erweiterung der MRSA-Sammlung neue PFGE-Gruppen, einige unklare Gruppen

entwickelten sich zu epidemischen Gruppen weiter wohingegen sich andere kaum oder

gar nicht verändert haben (siehe Abbildung 10 und Tabelle 6).

47

Ergebnisse

Kana

da (C

MR

SA 3

A &

3B)

USA

(SA

506)

& K

anad

a (C

MR

SA 4

) & U

K (E

MR

SA 1

6)

Berli

ner-E

.

USA

(SA

456)

& K

anad

a (C

MR

SA 2

A)

20

2

13

36

39

56

2

33

1

Han

nove

rsch

er- E

. Sü

ddeu

tsch

er-E

.

52

9

39

119

61

8

16

121

4

54

2

34

156

12

4

11

43

68

3 32

11

3 41 11

3

6 51

3 2 2

7

2 22

2 2

33

26

1

136

4 6 2 2 11

22

12

212

2 2 2 2

4 6 2 2 2 4 3 2 12 2 2 2 2 3 5 2 3 5 14 6 6 3 2 9 2 4 0 2 0 2 59 137 111 16 11 7 24 13 58 2 190 22 49 95 2 34 61 157Gesamtzahl der Isolate pro Gruppe (insgesamt: 1161)

47 48 45 4643 4441 4239 4037 3835 3633 3431 3229 3027 28 25 26 23 2421 2219 2017 1815 1613 1411 129 107 85 63 41 2

20

Isolate

oprGruppe

200

180

160

140

120

100

80

60

40

0

Sporadisch: 01.01.2001 - 12.01.2004Sporadisch: 13.02.1998 - 31.12.2000

Unklar: 01.01.2001 - 12.01.2004Unklar: 13.02.1998 - 31.12.2000

Epidemisch: 01.01.2001 – 12.01.2004Epidemisch: 13.02.1998 – 31.12.2000

PFGE-Gruppen

48

Ergebnisse

Abbildung 10: Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer

MRSA-Stammsammlung

Angelehnt an Abbildung 9 wurde in diesem Diagramm der Zeitraum der Datenerfassung bis Januar 2004

erweitert und PFGE-Muster-Übereinstimmungen einiger Gruppen mit anerkannten Epidemiestämmen

ergänzt. Durch unterschiedliche Farbkodierung der beiden Beobachtungszeiträume wird die zeitliche

Entwicklung der Gruppen veranschaulicht.

Die im zweiten Beobachtungszeitraum (01.01.2001–12.01.2004) um 744 Isolate

erweiterte MRSA-Stammsammlung enthielt 22 neue sporadische Stämme, 46

zusätzliche Isolate bei den unklaren und 676 bei den epidemischen Gruppen. Das führte

zu einem Anstieg der PFGE-Gruppen (epidemisch und unklar) von vormals 29 auf 45

und der sporadischen Stämme von 37 auf 59. Die Gruppe 34 stellt im eigentlichen Sinn

keine PFGE-Gruppe dar, sondern symbolisiert die sporadischen Stämme.

Innerhalb der einzelnen PFGE-Gruppen ließen sich mit zunehmender Gruppengröße oft

mehrere Subgruppierungen bilden, die aus Gründen der Übersichtlichkeit jedoch im

Weiteren unerwähnt bleiben. Die Gruppen 30 und 32 wurden in dieser Arbeit nicht

berücksichtigt (siehe Abbildung 10), da sich die Einsender der Isolate weit außerhalb

des Einzugsbereichs dieser Studie befinden.

Besonders ausgeprägt war beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume der

Anstieg der epidemischen Stämme, deren Anteil am gesamten Spektrum von vormals

62,8% auf 80,8% angestiegen war. Der Anteil der unklaren Stämme sank von 28,3% auf

14,1% und derjenige der sporadischen Stämme fiel von 8,9% auf 5,1% (siehe Tabellen

5 und 6).

Tabelle 6: Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004

Beim Vergleich der Ergebnisse der Tabellen 5 und 6 fällt im zeitlichen Verlauf eine prozentuale Zunahme

des epidemischen Anteils von Stämmen am Gesamtvorkommen auf, und zwar von 62,8% auf 80,8%.

Gegenläufig verhalten sich die unklaren Gruppen, deren Anzahl an Isolaten insgesamt weniger stark

anstieg. Ihr Anteil sank von 29,3% auf 14,1%. Der Anteil der sporadischen Stämme nahm ebenfalls von

8,9% auf 5,1% ab.

EPIDEMIOLOGISCHE KLASSIFIKATION DER 1161 ISOLATE

Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1

(insgesamt: 938) (insgesamt: 164) (insgesamt: 59)

80,8 % 14,1 % 5,1 %

49

Ergebnisse

Mit 676 zusätzlichen Isolaten ist bei den epidemischen MRSA-Stämmen der größte

Anstieg zu erkennen. Die Anzahl der epidemischen PFGE-Gruppen ist von ursprünglich

7 auf 11 angestiegen und die der unklaren Gruppen von 22 auf 45.

Im Verlauf der gesamten Studie konnten bei einigen Gruppen deutliche Veränderungen

beobachtet werden. Einige von ihnen zählten im ersten etwa dreijährigen

Beobachtungszeitraum (13.02.1998–31.12.2000) zu den unklaren Gruppen und sind

durch deutlichen Anstieg von Isolaten während der folgenden dreijährigen

Datenerfassung (01.01.2001–12.01.2004) epidemisch geworden (Gruppen 2, 9 und 11).

Die Gruppe 35, mit 137 Isolaten der drittgrößte epidemische MRSA-Stamm, ist sogar

erst im zweiten Beobachtungszeitraum entstanden. Vorher gab es nur ein Isolat mit

diesem Muster, das somit zu den sporadischen zählte. Diesem einen Isolat folgten in

den anschließenden Jahren 136 Isolate. Hier ist demnach ein vormals sporadischer

Stamm im Verlauf von drei Jahren zu einem der häufigsten klinisch relevanten

Epidemiestämme geworden. Die unklaren kleinen Gruppen 19, 40 und 42 sind ebenfalls

aus ursprünglich sporadischen Stämmen entstanden.

Beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume (siehe Abbildung 10) ist erkennbar,

dass die Gruppen 2, 3, 7, 9, 11, 13, 16 (Berliner Epidemiestamm) und vor allem 35

deutlich an Isolaten zugenommen haben. Für die Gruppen 7, 13, und 35 lässt sich sogar

eine Zunahme von weit mehr als 100 Isolaten verzeichnen. Gruppe 13 ist insgesamt mit

190 Isolaten die größte und hatte mit 156 Isolaten auch den erkennbarsten Anstieg. Die

Gruppe 6, die für den Zeitraum bis Ende 2000 mit 52 Isolaten die größte Gruppe war,

ist mit 9 Isolaten nur geringfügig angestiegen.

Der Anteil der vier größten Gruppen mit jeweils über 100 Isolaten an den insgesamt

1161 Isolaten beträgt 51,2%. Im Einzelnen sind das für die PFGE-Gruppe 13 16,4%, für

die Gruppe 7 13,5% sowie für die Gruppe 35 11,8% und die Gruppe 16 9,6% (siehe

Abbildung 10). Da im zweiten Beobachtungszeitraum nur vier neue epidemische PFGE-

Gruppen entstanden sind, haben sich die 676 zusätzlichen epidemischen Isolate

hauptsächlich auf die schon bestehenden epidemischen Gruppen aufgeteilt. Durch den

enormen Anstieg einiger schon bestehender epidemischer Gruppen ist der Abstand zu

den unklaren PFGE-Gruppen deutlicher geworden. Dies untermauert die Annahme, dass

es sich in diesen Fällen um epidemische Stämme handelt.

50

Ergebnisse

Die großen Epidemiegruppen 13, 7 und 16 mit mehr als 100 Isolaten weisen über beide

Beobachtungszeiträume hinweg einen relativ stabilen zeitlichen Verlauf auf.

Im Gegensatz dazu fällt auf, dass der epidemischen PFGE-Gruppe 1 innerhalb der drei

Jahre des zweiten Beobachtungszeitraums nur zwei weitere Isolate zugeordnet werden

konnten, die am 19.03.2001 und am 06.08.2003 als Dauerkulturen in die

Stammsammlung aufgenommen wurden. Auch bei PFGE-Gruppe 5 (Süddeutscher

Epidemiestamm) ist in diesem Zeitraum nur ein weiteres Isolat hinzugekommen. Das

letzte Isolat mit dem PFGE-Muster von Gruppe 5 wurde am 28.02.2001 der Sammlung

hinzugefügt. Diese beiden Gruppen scheinen somit im zeitlichen Verlauf an Bedeutung

verloren zu haben. Der Zeitraum, in dem der Begriff „epidemisch“ Gültigkeit besitzt

und auf eine PFGE-Gruppe angewendet werden darf, ist nicht definiert. Bei isolierter

Betrachtung der zurückliegenden drei Jahre müsste Gruppe 1 als unklar und Gruppe 5

als sporadisch gelten. Die PFGE-Gruppe 35, die mit 137 Isolaten den dritthäufigsten

Epidemiestamm darstellt, erlangte ihre epidemiologische Bedeutung, im Gegensatz zu

den meisten anderen Gruppen, ausschließlich im zweiten Abschnitt der Studie

(01.01.2001–12.01.2004). Vorher galt dieser Stamm sporadisch.

3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit

anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen

Die PFGE-Bandenmuster der MRSA-Sammlung des Instituts für Medizinische

Mikrobiologie der Stadt Bochum wurden mit bekannten deutschen, amerikanischen und

kanadischen Epidemiestämmen sowie einem österreichischen und englischen

Epidemiestamm verglichen. Dabei zeigten sich in einigen Fällen große

Übereinstimmungen in der Anordnung der Muster. Ein Vergleich mit sechs anerkannten

deutschen Epidemiestämmen (Süddeutscher-, Berliner-, Barnimer-, Rhein-Hessen-,

Hannoverscher-, Norddeutscher-Epidemiestamm) führte in zwei Fällen zu

Übereinstimmungen (siehe Abbildung 11).

51

Ergebnisse

Abbildung 11: Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software, Übereinstimmung mit

PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme

In diesem Screenshot der für den Bandenmuster-Vergleich verwendeten Software sind exemplarisch die

Übereinstimmungen von zwei PFGE-Gruppen mit anerkannten deutschen Epidemiestämmen (siehe

Material und Methoden, Tabelle 3) dargestellt. Rechts sind neben den Bandenmustern die Dauerkultur-

Nummern aufgeführt, links ist der Grad der Verwandtschaft der einzelnen Muster durch ein

Dendrogramm zu erkennen. Die beiden anerkannten deutschen Epidemiestämme sind durch rote Pfeile

gekennzeichnet. Auf dem oberen Bild ist die nahe Verwandtschaft des Süddeutschen Epidemiestammes

mit den Isolaten der Gruppe 5 zu erkennen, das untere Bild zeigt die Ähnlichkeit des Berliner

Epidemiestammes zur Gruppe 16.

52

Ergebnisse

Wie erwartet bestand bei diesem Vergleich keine Verwandtschaft der anerkannten

Epidemiestämme zu sporadischen Stämmen der Bochumer Stammsammlung. Das

PFGE-Muster der Gruppe 4, deren epidemiologische Bedeutung mit zwei Isolaten

unklar ist, weist eine große Ähnlichkeit zu dem des Hannoverschen Epidemiestammes

auf und das Muster der Gruppe 5, die mit 34 Isolaten zu den epidemischen Stämmen

zählt, entsprach dem des Süddeutschen Epidemiestammes. Weiterhin zeigten sich

übereinstimmende PFGE-Muster der Gruppe 16 -mit 111 Isolaten die viertgrößte

Gruppe- und dem Berliner Epidemiestamm (siehe Abbildung 10). Die drei größten

Epidemiegruppen (in absteigender Reihenfolge: 13, 7, 35) entsprachen jedoch keinem

der oben genannten deutschen Epidemiestämme.

Weitere PFGE-Muster-Vergleiche wurden mit kanadischen MRSA-Stämmen des

Department of Microbiology, Sunnybrook and Women’s College Health Science Center

in Toronto (Papakyriacou et al., 2000) und nordamerikanischen epidemischen MRSA-

und MSSA-Stämmen des Department of Microbiology and Immunology, University of

Oklahoma Health Sciences Center (Booth et al., 2001) durchgeführt. Zwei anerkannte

europäische Epidemiestämme, der EMRSA-16 aus Großbritannien und der Wiener–

Epidemiestamm, wurden ebenfalls hinsichtlich verwandter PFGE-Muster mit der

Bochumer Stammsammlung geprüft (siehe Material und Methoden 2.1.2).

Beim Vergleich der internationalen Stämme mit den 1161 MRSA-Stämmen aus

Nordrhein-Westfalen waren nur wenige Gemeinsamkeiten zu erkennen. Es fand sich ein

PFGE-Muster, das in mehreren Ländern und auch in der Bochumer Stammsammlung

gefunden wurde. Das Muster dieses Isolates aus Bochum mit der Dauerkultur-Nummer

429, das am 07.12.1999 in die Stammsammlung aufgenommen wurde, war im ersten

Untersuchungszeitraum bis Dezember 2000 einzigartig und somit den sporadischen

Stämmen zugeordnet. Bei der nachfolgenden Aktualisierung bis Januar 2004 hatte sich

ein weiteres Isolat mit dem gleichen Muster gefunden, sodass die Gruppe 19 mit zwei

Isolaten entstanden ist.

Obwohl diese beiden Stämme in der Region um Bochum nicht epidemisch sind,

entspricht ihr Bandenmuster dem von epidemischen Stämmen außerhalb Deutschlands.

Sie weisen einen hohen Verwandtschaftsgrad zu den PFGE-Mustern des kanadischen

Epidemiestammes CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000), SA 506 aus den USA (Booth

et al., 2001) und EMRSA-16 aus Großbritannien (Cox et al., 1995) auf.

53

Ergebnisse

Demzufolge entsprechen sich die MRSA-Stämme aus den vier Ländern Deutschland,

Kanada, den USA und Großbritannien im hohen Maße (siehe Abbildung 12).

Abbildung 12: Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien Der oberste Stamm, EMRSA-16, ist ein anerkannter Epidemiestamm aus Großbritannien; der zweite von

oben ist ein kanadischer, darunter der MRSA-Epidemiestamm aus den USA und ganz unten der Stamm,

der in Bochum zwei Mal innerhalb von sechs Jahren auftrat und den unklaren PFGE-Gruppen zugeordnet

wurde (PFGE-Gruppe 19). Bei Betrachtung der Bandenmuster fällt die enge Verwandtschaft der Isolate

untereinander auf. Eine Übereinstimmung von 96,2% - 100% der Bandenmuster bei Anwendung des

Algorithmus Jeffrey’s x coefficient in der rechnergestützten Clusteranalyse (siehe Material und Methoden

2.2.1) stützt die These, dass diese vier Bandenmuster einen gemeinsamen MRSA-Stamm repräsentieren.

EMRSA-16 ist bisher nicht in Deutschland beschrieben worden (siehe Material und

Methoden, Tabelle 3). Vorausgesetzt, es handelt sich bei den PFGE-Bandenmustern in

Abbildung 12 um einen gemeinsamen MRSA-Stamm, dann wurde EMRSA-16 als

PFGE-Gruppe 19 mit zwei Isolaten in Bochum nachgewiesen (siehe Abbildung 10).

3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme

Obwohl von einigen Kliniken nur sehr wenig Material zur Verfügung stand, konnte in

dieser Arbeit sichergestellt werden, dass die Isolate der epidemischen Gruppen aus

unterschiedlichen Krankenhäusern stammen. Die Isolate der PFGE-Gruppe 1, die

kleinste epidemische Gruppe, stammen aus zwei verschiedenen Krankenhäusern und

die anderen 10 epidemischen Gruppen enthalten MRSA-Isolate aus mindestens vier

verschiedenen Kliniken.

54

Ergebnisse

Um Auffälligkeiten hinsichtlich des Anteils der Kliniken an den PFGE-Gruppen

auszumachen, wurde untersucht, ob es PFGE-Gruppen gibt, deren Isolate hauptsächlich

aus einer bestimmten Klinik stammen (siehe Abbildung 13). Umgekehrt wurden für die

vier Kliniken mit über 100 eingesandten Isolaten die jeweils häufigsten MRSA-Stämme

(PFGE-Gruppen) ermittelt (siehe Abbildungen 14-17).

55

Ergebnisse

56

Isolate pro

Gruppe

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

15

15

14

4

13

6

8

9

2

Berli

ner-E

.

USA

(SA

456)

& K

anad

a (C

MR

SA 2

A)

Südd

euts

cher

-E.

H

anno

vers

cher

- E.

11

19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

PFGE-Gruppen

USA

(SA

506)

& K

anad

a (C

MR

SA 4

) & U

K (E

MR

SA 1

6)

Kana

da (C

MR

SA 3

A &

3B)

13

Spor

adis

che

Stäm

me

Anzahl der einsendenden Kliniken für die 11 epidemischen Gruppen

1715131197 5 3 1

56

Ergebnisse

Abbildung 13: Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen

Der Anteil der einsendenden Kliniken für die einzelnen PFGE-Gruppen ist farblich markiert. Tabelle 7

enthält die Farbcodes der Kliniken.

Tabelle 7: Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende Abbildung 13)

KLINIK ISOLATE & FARBCODE

A 360

B 294

C 110

D 81

E 37

F 34

G 34

H 33

I 26

J 26

K 22

L 13

M 18

N 18

O 14

P 12

Q 11

R 9

S 6

T 3

In Abbildung 13 und Tabelle 7 ist zu erkennen, dass von einigen Kliniken sehr viele

und von anderen kaum MRSA-Isolate durch das Institut für Medizinische

Mikrobiologie der Stadt Bochum untersucht wurden. Das Spektrum reicht von 360

eingesandten Isolaten der Klinik A bis zu lediglich drei Isolaten des Krankenhauses T.

57

Ergebnisse

Die sporadischen Stämme, die als Gruppe 34 zusammengefasst wurden -auch wenn sie

im eigentlichen Sinne keine PFGE-Gruppe darstellen-, zeigen ein ähnliches

Verteilungsmuster der einsendenden Kliniken wie die epidemischen PFGE-Gruppen

(siehe Abbildung 13). Klinik A hat mit 35,6% den größten Anteil sporadischer Stämme,

gefolgt von Klinik B (18,6%) und nachfolgend Klinik C (11,9%).

Bei den unklaren MRSA-Stämmen fallen die PFGE-Gruppen 14 und 15 auf, deren

Isolate, gemessen an der geringen Gruppengröße, aus relativ vielen verschiedenen

Kliniken stammen. Gruppe 14 besteht aus 16 und Gruppe 15 aus 11 Isolaten, die jeweils

von sieben verschiedenen Kliniken zugesandt wurden. Im Vergleich dazu stammen die

22 Isolate der epidemischen Gruppe 1 nur aus zwei verschiedenen Kliniken, die 24

Isolate der Gruppe 9 aus nur vier und die 61 Isolate der Gruppe 6 aus sechs

verschiedenen Kliniken. Die Ausbreitung der MRSA-Stämme 14 und 15 auf die sieben

Kliniken lässt epidemisches Verhalten vermuten, obwohl sie die in dieser Arbeit

geforderte Mindestanzahl an Isolaten einer epidemischen PFGE-Gruppe nicht erreichen.

Bei einigen epidemischen PFGE-Gruppen gibt es Kliniken, aus denen auffällig viele

Isolate stammen. Bei PFGE-Gruppe 1 ist dies mit 77,3% die Klinik B. Der größte Anteil

von Isolaten der Gruppe 2 stammt mit 53,1% ebenfalls aus diesem Haus. Gleiches gilt

auch für die Isolate der dritten Gruppe mit 65,3%. Bei der epidemischen Gruppe 5 sind

die meisten Isolate aus Krankenhaus M (29,4%) und der zweite große Anteil stammt

auch hier wieder aus Klinik B (20,6%). Bei den Isolaten der Gruppe 6 überwiegen

Klinik B mit 36,1% und Klinik A mit 26,2%. Auch bei den Isolaten der Gruppe 7 lässt

sich eine ähnliche Verteilung beobachten: Klinik B hat 35,7% und Klinik A 32,5% ihrer

Isolate eingesandt. Auffällig bei Gruppe 9 ist der besonders hohe Anteil der Klinik A

mit 79,2%, ohne den sie nicht zu den epidemischen Gruppen zählen würde.

PFGE-Gruppe 11 besteht zum größten Teil (39,7%) aus Isolaten der

Gemeinschaftspraxis E. Bei Gruppe 13 überwiegt Klinik A mit einem Anteil von

40,5%. Klinik B (17,9%) und Klinik C (17,4%) machen zwei weitere größere Anteile

dieser Gruppe aus. PFGE-Gruppe 16 weist keine Präferenz zu einer bestimmten Klinik

auf. Klinik A ist hier mit lediglich 26,1% der führende Einsender von Isolaten. Bei der

letzten epidemischen Gruppe (35) fällt auf, dass auch wieder Klinik A mit 47,7% die

meisten MRSA-Isolate eingesandt hat (siehe Abbildung 13).

58

Ergebnisse

Zusammenfassend ist hervorzuheben, dass ein Großteil der Isolate aus wenigen

Kliniken stammt. Die größten Anteile der 11 epidemischen PFGE-Gruppen sind den

beiden Kliniken A und B zuzuschreiben. Somit unterscheidet sich diese Verteilung

nicht wesentlich von derjenigen der sporadischen Stämme. Ein Zusammenhang eines

bestimmten MRSA-Stammes zu einer Klinik scheint es nicht zu geben. Ausnahmen

sind die Gruppe 5, deren Isolate zum größten Teil aus dem Krankenhaus H kommen

und die Gruppe 11 mit besonders vielen Isolaten der Gemeinschaftspraxis E. Die

epidemische Gruppe 9 enthält im Gegensatz zu allen anderen epidemischen Gruppen

kein Isolat der Klinik B, obwohl dieses Haus nach der Klinik A die meisten Isolate

eingesandt hat. Ähnliches gilt für die relativ große Gruppe 16, die nur zwei Isolate der

Klinik B enthält.

In den folgenden Kreisdiagrammen wird –ähnlich wie in Abbildung 13- der

Zusammenhang von PFGE-Gruppen und einzelnen Kliniken aufgezeigt; sie

veranschaulichen die Verteilung der PFGE-Gruppen auf die verschiedenen Kliniken.

Diese Darstellung ist jedoch auf die vier Kliniken mit den meisten eingesandten Isolaten

(Klinik A, -B, -C und –D) begrenzt, welche in absteigender Reihenfolge abgebildet sind

(siehe Abbildungen 14-17).

59

Ergebnisse

Klinik A (360 Isolate)

23%

32% 6

35

Abbildung 14: Verteilung der 36

a

Im Kreisdiagramm ist die betreffe

Material des Krankenhauses aufg

wichtigsten PFGE-Gruppen, auf d

Isolate lassen sich hier der PFGE-G

35 und den drittgrößten Anteil bild

Abbildung 15: Verteilung der 29

Die Isolate dieses Hauses gehören

Gruppe 3 zuordnen und ein kaum g

-anders als in Klinik A- die PFGE-

I

4%

95%

102%

112%14

2%

168%

346%

714%

18%

1321%

0 Isolate der Klinik A

nde PFGE-Gruppe und

eführt. Die römischen

ie im nächsten Absch

ruppe 13 zuordnen, ei

et die PFGE-Gruppe 7.

Klinik B (294

113%

224%

242%

344%

355%

1312%

719%

4 Isolate der Klinik B

vornehmlich zwei groß

eringerer der Gruppe 7

Gruppe 13 vertreten.

I

auf die PFGE-Gruppen

ihr prozentualer Anteil am gesamten MRSA-

Ziffern zeigen die agr-Interferenzgruppen der

nitt (3.4) Bezug genommen wird. Die meisten

n weiterer großer Anteil entfällt auf die Gruppe

Isolate)

16%

29%

321%

I

52%

67%

auf die PFGE-Gru

en Gruppen an. Der

. Mit deutlich wenig

II

II

pp

g

er

II

en

rößte Anteil lässt sich der

Isolaten ist

60

Ergebnisse

Klinik C (110 Isolate)

24%

78%

272%

346%

355%

432%

447%

372%

1330%

314%

1613%

II

Ia

I

Abbildung 16: Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen

Hier überwiegt mit deutlichem Abstand die PFGE-Gruppe 13. Die Anteile der nachfolgenden Gruppen 3

und 16 enthalten etwa gleich viele Isolate. Die restlichen Gruppen haben Anteile von weniger als 10%.

Klinik D (81 Isolate)

54%

67%

84%

92%

102%

112%

169%

184%

275%

344%

364%

1314%

716%

3516%

Ia

II

I

Abbildung 17: Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen

Die Isolate teilen sich hier hauptsächlich auf 3 PFGE-Gruppen (7,13 und 35) auf. Gruppe 35 und 7

enthalten dabei gleich viele Isolate und Gruppe 13 nur geringfügig weniger.

61

Ergebnisse

Bei Betrachtung der Kreisdiagramme (Abbildungen 14-17) lässt sich Folgendes

feststellen:

Bei Klinik A können mit 21% die meisten Isolate der PFGE-Gruppe 13 zugeordnet

werden. Sie ist mit 190 Isolaten die größte epidemische Gruppe. Der zweitgrößte Anteil

dieser Klinik entfällt mit 18% auf Gruppe 35, die mit 137 Isolaten drittgrößte der

epidemischen PFGE-Gruppen. Ein weiterer wichtiger Anteil wird mit 14% von der

PFGE-Gruppe 7 gebildet, der zweitgrößten Epidemiegruppe. Den Hauptanteil an

MRSA der Klinik A machen diese drei größten epidemischen Gruppen (13, 7 und 35) in

der verwendeten Stammsammlung aus.

Die Isolate der Klinik B gehören vornehmlich zwei großen Gruppen an. Den größten

Anteil hat mit 21% die Gruppe 3, die mit 95 Isolaten zu den epidemischen Stämmen zu

rechnen ist. 19% gehören zur Gruppe 7, der mit 157 Isolaten zweitgrößten

epidemischen Gruppe, und 12% der Isolate sind Gruppe 13 zuzurechnen, der größten

Epidemiegruppe mit 190 Isolaten. Hier herrschen, wie schon in Klinik A, die beiden

größten Epidemiegruppen vor. Der Hauptteil wird jedoch von Gruppe 3 gebildet, die –

was besonders in Abbildung 13 auffällt- zum überwiegenden Teil in Klinik B ein

Problem darzustellen scheint. Bei zeitlicher Betrachtung (siehe Abbildung 10) zeigt sich

für die PFGE-Gruppe 3 im zweiten Beobachtungszeitraum (01.01.2001–01.07.2004)

eine Zunahme um 56 Isolate. Damit wird klar, dass dieser MRSA-Stamm immer noch

eine relevante epidemische Gruppe darstellt.

Betrachtet man in Abbildung 16 die Verteilung der Isolate für Klinik C, so gehört mit

30% der Hauptteil der Isolate zur größten epidemischen PFGE-Gruppe 13. Gruppe 3 hat

demgegenüber nur einen Anteil von 14%. Aus Abbildung 13 geht hervor, dass die

Isolate aus den beiden Kliniken B und C den Hauptteil der PFGE-Gruppe 3 bilden

(81%). Die PFGE-Gruppe 3 scheint demnach ein Problemstamm bei den Kliniken B

und C zu sein. Ein Grund dafür könnte die häufige Verlegung von Patienten zwischen

diesen beiden Kliniken sein. Daten hierzu liegen jedoch nicht vor. 13% der Klinik C

lässt sich der PFGE-Gruppe 16 zuordnen, dem Berliner Epidemiestamm.

Bei Klinik D gibt es drei epidemische PFGE-Gruppen, auf die sich die Isolate dieses

Krankenhauses annähernd gleich verteilen. Die Gruppen 35 und 7 (sie gehören zu den

vier größten PFGE-Gruppen in dieser Studie) enthalten jeweils 16% der Isolate.

62

Ergebnisse

Gruppe 13 (die größte PFGE-Gruppe) bildet mit 14% den dritten großen Anteil der

Isolate dieses Hauses.

Insgesamt ergibt sich eine breitgefächerte Verteilung der epidemischen Stämme auf die

untersuchten Krankenhäuser und es lassen sich nur wenige Besonderheiten bei dieser

Verteilung beobachten, die eine Korrelation einer Klinik mit einem MRSA-Stamm

beschreiben.

Auch weiterhin wird es sinnvoll sein, in bestimmten Intervallen eine Bestandsaufnahme

der Stammsammlung anzufertigen, um die Zunahme der Isolate innerhalb der PFGE-

Gruppen, die Verteilung der Stämme auf die Kliniken und die Veränderungen im Pool

der sporadischen Stämme im zeitlichen Verlauf beobachten zu können.

3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der

epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme

Das zentrale Segment des agr-Locus, agrBDC, enthält eine Region, die eine große

Variation zwischen S.-aureus-Stämmen aufweist. Es handelt sich um die C-terminalen

zwei Drittel von agrB, agrD und die N-terminale Hälfte von agrC (siehe Abbildung 5).

Auf Grund dieser sogenannten hypervariablen Region, die mit dem Autoinducer und

dem Rezeptor des Zwei-Komponenten-Systems agr in Verbindung gebracht wird, kann

S. aureus in bisher vier verschiedene agr-Interferenzgruppen eingeteilt werden, die mit

den römischen Ziffern I-IV beschrieben werden. Von der Interferenzgruppe I gibt es

noch eine Subgruppe, die als Ia bezeichnet wird und nicht als eine eigenständige

Gruppe gilt, weil ihr Restriktionsmuster nur einen geringen Unterschied zu dem von I

aufweist. Im Allgemeinen kommt es innerhalb einer agr-Gruppe zu einer Aktivierung

des agr-Locus durch das Pheromon (Autoinducer) und damit zur RNA III-Produktion,

wohingegen die agr-Expression in anderen Gruppen unterdrückt wird. Eine Ausnahme

bildet das Zusammentreffen der Gruppen I und IV, weil sich die Interferenzgruppe IV

bis auf den Austausch einer Aminosäure nicht von der Gruppe I unterscheidet, sodass

sich nachvollziehen lässt, dass es zwischen diesen Gruppen zu einer mäßigen

Kreuzaktivierung und nicht zu einer Hemmung kommt.

63

Ergebnisse

Es hat sich gezeigt, dass es Zusammenhänge zwischen bestimmten klinischen

Symptomen, beziehungsweise der Produktion bestimmter Toxine von S. aureus, und der

agr-Interferenzgruppen-Zugehörigkeit gibt. Die Fähigkeit von S.-aureus-Stämmen,

TSST (Toxic-Schock-Syndrom-Toxin) zu produzieren, ist assoziiert mit der

Interferenzgruppe III. Die Produktion von exfoliativem Toxin korreliert –wenn auch nur

schwach- mit der Gruppe IV (Jarraud et al., 2000). Weil die Dokumentation über die

Krankheiten der Patienten, von denen das untersuchte Material stammt, auf Grund der

dezentralen Organisation des Klinikums der Ruhr-Universität Bochum nicht in dafür

notwendiger detaillierter Form verfügbar ist, musste auf Nachforschungen bezüglich der

Krankheitsassoziation der MRSA verzichtet werden.

3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA

Die agr-Interferenzmuster jedes einzelnen sporadischen Isolates mussten durch eine

Restriktionsanalyse ermittelt werden. Aus den 45 PFGE-Gruppen, die sich beim

Vergleich der PFGE-Muster der 1161 Isolate ergeben hatten, wurde je nach Größe der

Gruppe das Interferenzmuster von einer repräsentativen Anzahl an Stichproben

bestimmt. In dieser Arbeit wurde davon ausgegangen, dass die Isolate innerhalb einer

PFGE-Gruppe das gleiche agr-Interferenzmuster aufweisen, da die agr-

Gruppenzugehörigkeit mit nur vier Möglichkeiten -beziehungsweise fünf mit der

Subgruppe Ia- wesentlich weniger diskriminativ ist als die Bestimmung der

Pulsfeldgelelektrophorese-Muster (Trindade et al., 2003). Stämme mit dem gleichen

oder einem sehr ähnlichen Pulsfeldgelmuster sind nahe verwandt, sodass sie auch bei

der Restriktionsanalyse zur gleichen agr-Interferenzgruppe gehören müssten. Bei den

Stichproben bestätigte sich diese Annahme, denn es traten in keinem Fall

Unstimmigkeiten bezüglich der PFGE-Gruppe und dem dazugehörigen

Restriktionsmuster auf.

Auf diese Weise war es möglich, für die untersuchte Stammsammlung Zusammenhänge

herzustellen zwischen der Häufigkeit der vier bekannten Interferenzmuster -die auch

alle in der untersuchten Stammauswahl zu finden waren (siehe Abbildung 8)- und den

epidemiologischen Eigenschaften eines Stammes (sporadisch, unklar, epidemisch).

64

Ergebnisse

Um letztendlich die Interferenzgruppe des agr-Locus eines MRSA-Stammes bestimmen

zu können, musste die hypervariable Region von agr mit Hilfe des Restriktionsenzyms

DraI verdaut und die daraus entstehenden Bandenmuster auf einem Gel sichtbar

gemacht werden.

Der erste Schritt, die DNA-Präparation, diente zur Gewinnung genomischer DNA der

MRSA-Isolate (siehe Material und Methoden 2.2.3). Im nächsten Schritt wurden die

Primer so gewählt, dass der hypervariable Teil der jeweiligen genomischen DNA mit

einer PCR vervielfältigt werden konnte (siehe Material und Methoden 2.2.4). Um zu

kontrollieren, ob die durchgeführte PCR erfolgreich war, wurde eine

Agarosegelelektrophorese (siehe Material und Methoden 2.2.5) jedes PCR-Produktes

durchgeführt (siehe Abbildung 18).

Abbildung 18: Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR

Dieses Agarosegel wurde 15 Minuten in Ethidiumbromidlösung gefärbt und anschließend im UV-Licht

fotografiert. Das PCR-Amplifikat sollte 1884 bp lang sein, was in dieser Abbildung für jedes PCR-

Produkt zutrifft. „S“ steht für den Molekulargewichts-Längenstandard (1 kb-ladder, Life Technologies)

und „N“ zeigt die Spur der Negativ-Probe, auf der, wie in diesem Fall, nichts zu sehen sein sollte.

65

Ergebnisse

Wenn nach Durchführung, Färbung und Fotografie des Agarosegels ein Produkt mit

einem Molekulargewicht von 1884 kb sichtbar war, konnte es im nächsten Schritt über

Filter-Säulen aufgereinigt werden (siehe Material und Methoden 2.2.6). War nichts zu

sehen oder zeigten sich verschmierte Banden oder eine Bande, die dem

Molekulargewicht von 1884 kb nicht entsprach, wurden die bisher durchgeführten

Schritte wiederholt.

Auch bei mehrfachen Versuchen blieb die PCR von fünf Isolaten, die sich allesamt den

sporadischen Stämmen zuordnen lassen, erfolglos (Analyse bis 31.12.2000). Es konnte

kein Amplifikat im Gel nachgewiesen werden. Trotz Wiederholung der Anzüchtung

und DNA-Isolation sowie Änderungen der PCR-Parameter zur besseren Primerbindung

war kein PCR-Produkt im Agarosegel erkennbar.

Zu diesen fünf Fehlschlägen gehörte auch der Stamm mit der Dauerkulturnummer 429,

dessen PFGE-Muster mit den Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und

Großbritannien übereinstimmte. Warum die PCR hier –auch nach Variation einiger

Parameter und mehrfachen Versuchen- nicht gelang, ist unklar.

Nach erfolgter PCR, der Kontrolle durch ein Agarosegel und der Aufreinigung der

PCR-Amplifikate, wurde die Agarosegelelektrophorese mit den gleichen

Chemikalien und Einstellungen wie bei der Gelelektrophorese nach der PCR

herangezogen, dieses Mal, um zu prüfen, ob die DNA-Banden auch nach dem

Reinigungsschritt noch vorhanden waren. Konnte die DNA nachgewiesen werden durch

eine Bande mit einer Länge von 1884 kb, wurde der eigentliche und letzte Schritt

durchgeführt, die Restriktionsanalyse (siehe Material und Methoden 2.2.7). Die

gereinigte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym DraI für 16-18 Stunden bei 37 °C

inkubiert. Die Zielsequenz von DraI beginnt 25 Nukleotide vom 5’-Ende der agrB

kodierenden Sequenz und 93 Nukleotide vom 3’-Ende der agrC kodierenden Sequenz

entfernt (Papakyriacou et al., 2000). Die hypervariable Region liegt innerhalb des

herausgeschnittenen Sequenzabschnittes (siehe Einleitung, Abbildung 5).

Im Anschluss an den Verdau mit dem Restriktionsenzym wurde von dieser Sequenz

eine Agarosegelelektrophorese angefertigt (siehe Abbildung 19), die sich wegen des

Nachweises eines DNA-Fragmentes mit einem Molekulargewicht unter 1 kbp (kilo

Basenpaare) von den vorherigen Gelelektrophoresen durch Änderungen mehrerer

Parameter unterschied (siehe Material und Methoden 2.2.7).

66

Ergebnisse

Abbildung 19: Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI:

Es ist ein Ausschnitt eines Gels zu sehen, auf dem neun Restriktionsmuster von MRSA-Stämmen aus

Bochum dargestellt sind. Nach einer Inkubation von 16-18 Stunden bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym

DraI wurden die oben dargestellten Muster durch UV-Bestrahlung eines mit Ethidiumbromid versetzten

Agarosegels sichtbar. Die Restriktionsmuster wurden mit denen von Papakyriacou et al. (2000)

verglichen. Auf diesem Weg konnten die Bochumer MRSA den vier beschriebenen Interferenzgruppen

zugeordnet werden. Die linke Spur entspricht dem Molekulargewicht-Längenstandard VIII (Roche) und

ist als „S“ gekennzeichnet.

Die Restriktionsfragmente von Spur 1 entsprechen dem Muster der agr-Interferenzgruppe Ia, die der

Spuren 2, 4, 5, 6, 7 gehören zur Gruppe II, die Restriktionsmuster von 3 und 9 können der PFGE-Gruppe

I zugeordnet werden und das Muster von Spur 8 gehört zur Gruppe III. Das Isolat der Spur 1 (RFLP-

Muster Ia) ist eine Stichprobe der PFGE-Gruppe 15, sodass davon ausgegangen werden kann, dass jedes

Isolat in der PFGE-Gruppe 15 das RFLP-Muster Ia aufweist. Spur 3 enthält die Restriktionsfragmente

(RFLP-Muster I) eines Isolates aus der PFGE-Gruppe 23, Spur 5 (RFLP-Muster II) repräsentiert ein

Isolat der PFGE-Gruppe 5, die dem Süddeutschen Epidemiestamm entspricht und Spur 8 (RFLP-Muster

III) enthält ein Isolat der Gruppe 26. Die restlichen Bandenmuster gehören zu den sporadischen Stämmen,

die nur ein Mal in Bochum auftraten.

67

Ergebnisse

Auf diese Weise konnte die Zugehörigkeit der 417 im ersten Untersuchungszeitraum

(01.01.1998-01.01.2001) in die Studie eingeschlossenen MRSA-Isolate zu einer der vier

agr-Interferenzgruppen bestimmt werden. Allerdings gab es, wie bei der PCR (siehe

oben), auch hier einige Isolate, bei denen die Durchführung nicht gelang. Bei drei

Isolaten, von denen es ein PCR-Produkt gab, konnte auch nach mehrfachen Versuchen

keine Restriktionsanalyse durchgeführt werden. Zählt man die fünf Isolate dazu, bei

denen die PCR misslang, gab es insgesamt acht Isolate, bei denen eine Analyse der

Interferenzmuster nicht möglich war.

3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen

Um eine Darstellung zu haben, in der sowohl die Einteilung der Isolate in PFGE-

Gruppen und sporadische Stämme (siehe Abbildung 9) als auch die Ergebnisse der

Restriktionsanalyse Beachtung finden, wurde Abbildung 9 entsprechend modifiziert und

erweitert (siehe Abbildung 20).

Die Restriktionsanalyse wurde über einen Zeitraum durchgeführt, der etwas von dem

der Pulsfeldgelmuster-Untersuchungen abweicht. Sie wurde angewandt bei Stämmen,

die von Februar 1998 bis Juli 2001 in die Stammsammlung aufgenommen wurden.

Somit weicht die Anzahl der Stämme insgesamt und auch in den Kategorien

epidemisch, unklar und sporadisch geringfügig von denen des ersten

Beobachtungszeitraumes der PFGE-Musteranalyse (Februar 1998 bis Dezember 2000)

ab.

68

Ergebnisse

20

11

23

5

35

56

27

47

10

3 2

27

10 10

39

3 3 2 3 4

10

5 53 2 2 2

42 2 2 2

0

10

20

30

40

50

60

Isolate pro

Gruppe

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33PFGE - Gruppen

Interferenzgruppen:

29

1

17

1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

48 Isolate ohne PFGE - Gruppenzugehörigkeit

= I = Ia = II = III = IV

Abbildung 20: Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme

Durch die Integration der Ergebnisse aus der Restriktionsanalyse in Abbildung 9 musste auf die zuvor

verwandte Farbkodierung zur Unterscheidung der Stämme in epidemisch und unklar verzichtet werden.

Der neue Farbcode symbolisiert, wie in der Legende dargestellt, die agr-Interferenzmuster der jeweiligen

Gruppe und der sporadischen Stämme. Die Daten dieses Diagrammes wurden im Zeitraum Februar 1998

bis Juli 2001 gewonnen. Es gibt 12 PFGE-Gruppen mit der Interferenzgruppe I, von denen nur eine, und

zwar Gruppe 13 mit 27 Isolaten, epidemisch ist. Alle anderen mit dem Restriktionsmuster I befinden sich

im unklaren Bereich. Die PFGE-Gruppe 16 (Berliner Epidemiestamm) ist mit 39 Isolaten der einzige

epidemische Stamm mit der Interferenzgruppe Ia; außer PFGE-Gruppe 16 weist sonst nur noch Gruppe

31 das RFLP-Muster Ia auf. Von den 33 PFGE-Gruppen haben 17 das Interferenzmuster II, fünf davon

zählen zu den epidemischen PFGE-Gruppen. Die Interferenzgruppe III kommt nur ein Mal in der PFGE-

Gruppe 27 vor und das Restriktionsmuster IV auch nur ein Mal in Gruppe 17. Beide Gruppen gehören zu

den unklaren Stämmen. Im rechten oberen Feld ist ein zweites Diagramm zu sehen, das den Anteil der

vier Interferenzmuster unter den sporadischen Stämmen darstellt. Mit 29 von 48 Isolaten gehören die

meisten zur Interferenzgruppe I, 17 Isolate weisen das Interferenzmuster II auf und jeweils eines lässt sich

dem Interferenzmuster III und IV zuordnen.

69

Ergebnisse

Mit 5 von 7 PFGE-Gruppen gehören die meisten epidemischen Stämme zur

Interferenzgruppe II. Nur ein epidemischer Stamm (Gruppe 13) weist das

Interferenzmuster I auf und bei einem weiteren (PFGE-Gruppe 16, Berliner

Epidemiestamm) findet sich das Muster Ia. 12 Mal ist das Interferenzmuster II und 11

Mal Muster I unter den unklaren Stämmen vertreten. Die Muster III und IV fanden sich

nur jeweils ein Mal bei sehr kleinen Gruppen. Bei den 48 sporadischen Stämmen

überwog, im Gegensatz zur agr-Interferenzmuster-Verteilung der epidemischen

Gruppen, die Interferenzgruppe I mit 29 Isolaten gegenüber Muster II mit nur 17

Isolaten. Auch die Muster Ia und III konnten, allerdings nur ein Mal, bei den

sporadischen Stämmen gefunden werden, wohingegen das Muster IV hier nicht auftrat.

Zur besseren Übersicht sind die Ergebnisse noch einmal tabellarisch zusammengetragen

(siehe Tabelle 8).

70

Ergebnisse

Tabelle 8: Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen

0

50

100

150

200

250

Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 393 MRSA-Isolaten

Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe

(RFLP) (insgesamt: 227) (insgesamt: 118) (insgesamt: 48)

I 27 (11,9%) 49 (41,5%) 29 (60,4%)

Ia 39 (17,2%) 2 (1,7%) 1 (2,1%)

II 161 (70,9%) 62 (52,5%) 17 (35,4%)

III 0 (0%) 2 (1,7%) 1 (2,1%)

IV 0 (0%) 3 (2,6%) 0 (0%)

70,9%

r

Betrachtet man die Gesamtzahl der Isolate in den

auf, dass 161 der 227 Isolate dieser Kategorie (70

Dieses Muster ist demnach unter den epidem

vertreten, verglichen mit den 27 (11,9%) Isolate

(17,2%) der Gruppe Ia. Bei den unklaren Isolaten

aus; das Interferenzmuster II dominiert aber auch

Unter den 48 sporadischen Isolaten findet sich im

I mit 29 (60,4%) von 48 Isolaten am häufigsten

epidemischen Stämme zur Interferenzgruppe II

Gruppe I auf (siehe Tabelle 9).

Unkla

Epidemisch

52,5%

epidemischen PFG

,9%) zur Interferen

ischen Stämmen

n der Interferenzgr

fiel das Ergebnis

hier mit 62 von 11

Gegensatz dazu di

. Es fällt somit e

und der sporadi

Sporadisch

60,4%

E-Gruppen, so fällt

zgruppe II gehören.

auffallend häufig

uppe I und den 39

wesentlich knapper

8 Isolaten (52,5%).

e Interferenzgruppe

ine Korrelation der

schen Stämme zur

71

Ergebnisse

Tabelle 9: Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen

Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 393 MRSA-Isolaten

Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe

(RFLP) (insgesamt: 227) (insgesamt: 118) (insgesamt: 48)

I, Ia, III, IV 66 (29,1%) 56 (47,5%) 32 (66,6%)

II 161 (70,9%) 62 (52,5%) 17 (35,4%)

Um die Dominanz der Interferenzgruppe II bei den epidemischen Stämmen

hervorzuheben, wurde Tabelle 8 modifiziert (siehe Tabelle 9). Hier ist zu erkennen, dass

die Interferenzmuster I, Ia, III und IV zusammengenommen nur bei 29,1% der

epidemischen Stämme zu finden sind und der wesentliche Anteil mit 70,9% das

Interferenzmuster II aufweist. Dies spricht für eine Korrelation epidemischer MRSA mit

der agr-Interferenzgruppe II, zumal das Muster II bei den sporadischen Stämmen nicht

dominiert.

Auch bei der Restriktionsanalyse wurde, wie für die epidemiologische Betrachtung

anhand der PFGE-Muster (siehe 3.1.2), eine Aktualisierung vorgenommen. Der

Beobachtungszeitraum von Februar 1998 bis Juli 2001 wurde auf Januar 2004

ausgeweitet (siehe Abbildung 21).

72

Ergebnisse

22

49

95

2

34

61

157

7

24

13

58

2

190

1611

111

3 5 2 3 514

6 6 3 29

2 4 2 2

59

137

4 62 2 2 4 3 2

122 2 2 2

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Isolate pro

Gruppe

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

PFGE - Gruppen

Interferenzgruppen: = I = Ia = II = III = IV

spor

adis

ch

73

Ergebnisse

Abbildung 21: Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung

Der Zeitraum der Datenerfassung wurde bis Januar 2004 erweitert. Auf Grund der verschiedenen

Interferenzmuster der sporadischen Stämme ist hier zur Vereinfachung nur ein grauer Balken abgebildet.

Details sind der Tabelle 10 zu entnehmen.

Insgesamt fällt bei Betrachtung von Abbildung 21 auf, dass die großen epidemischen

Gruppen wesentlich deutlicher als auf Abbildung 20 zu sehen, unterschiedliche

Interferenzmuster aufweisen. Unter den am häufigsten vorkommenden

Epidemiestämmen finden sich die agr-Restriktionsmuster I, Ia und II. Diese

Beobachtung widerlegt die Annahme, dass die epidemischen Stämme mit einem

bestimmten Interferenzmuster korrelieren. Betrachtet man nun noch einmal die

Abbildungen 14 bis 17 des Kapitels 3.3, so fällt auch hier auf, dass die wichtigen

PFGE-Gruppen, denen viele Isolate zuzuordnen sind, die Interferenztypen I, Ia und II

aufweisen. Eine Sonderstellung für das Muster II ist nicht mehr zu erkennen.

Bei Vergleich der Abbildungen 20 und 21 finden sich bei einigen PFGE-Gruppen in der

aktualisierten Darstellung andere Interferenzmuster als vorher. Der Grund dafür liegt in

nachträglich erfolgten Änderungen der Gruppen-Zusammensetzung.

Die Daten der aktualisierten Fassung wurden, wie dies zuvor in Tabelle 8 für den ersten

Beobachtungszeitraum erfolgte, in tabellarischer Form aufgeführt (siehe Tabelle 10).

Tabelle 10: Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004

Bestimmung der Interferenzmuster von insgesamt 1161 MRSA-Isolaten

Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1 Interferenzgruppe

(RFLP) (insgesamt: 938) (insgesamt: 164) (insgesamt: 59)

I 190 (20,3%) 70 (42,7%) 35 (59,3%)

Ia 248 (26,4%) 26 (15,9%) 1 (1,7%)

II 500 (53,3%) 54 (32,9%) 22 (37,3%)

III 0 (0%) 11 (6,7%) 1 (1,7%)

IV 0 (0%) 3 (1,8%) 0 (0%)

Vergleicht man die zuvor gewonnenen Daten (siehe Abbildung 20 und Tabelle 8) mit

der bis Januar 2004 aktualisierten Version (siehe Abbildung 21 und Tabelle 10), so lässt

sich Folgendes zusammenfassen:

74

Ergebnisse

Der Anteil der Interferenzgruppe II unter den epidemischen Stämmen hat von 70,9%

auf 53,3% deutlich abgenommen. Im Gegensatz dazu findet sich das Interferenzmuster I

häufiger im Pool der epidemischen Stämme. Hier ist der Anteil von 11,9% auf 20,3%

angestiegen. Der prozentuale Anteil von Interferenzmuster Ia ist ebenfalls von 17,2%

auf 26,4% deutlich angestiegen, was insbesondere auf die enorme Zunahme der Gruppe

35 zurückzuführen ist.

Bei den unklaren PFGE-Gruppen sind die Veränderungen für das Interferenzmuster I

mit einem geringfügigen Anstieg von 41,5% auf 42,7% nicht besonders ausgeprägt. Das

Muster Ia hingegen ist –wie auch für die epidemischen Stämme beschrieben- unter den

unklaren PFGE-Gruppen mit 15,9% gegenüber vormals 1,7% wesentlich häufiger zu

finden. Vier Gruppen (36, 37, 44, 48) mit dem Muster Ia sind im zweiten

Beobachtungszeitraum von Juli 2001 bis Januar 2004 neu hinzugekommen. Das

ehemals häufigste Muster der unklaren PFGE-Gruppen, II, hat, ähnlich wie bei den

epidemischen Stämmen, seine herausragende Position von 52,5% im ersten

Beobachtungszeitraum verloren und nimmt nur noch einen Anteil von 32,9% ein.

Führend ist nunmehr das Muster I mit 42,7%. Bei dem Interferenzmuster III lässt sich

ein Anstieg von 1,7% auf 6,7% verzeichnen und es gibt nach wie vor nur drei Isolate

mit dem agr-Interferenzmuster IV, dessen Anteil durch die Erweiterung der

Stammsammlung von vormals 2,6% auf 1,8% abgesunken ist. Bei den sporadischen

Stämmen gibt es keine wesentliche Veränderung in der Verteilung.

Durch die Aktualisierung der Daten wurde die Dynamik deutlich, mit der sich die

Anteile der Interferenzmuster bei den epidemischen und unklaren Gruppen verändern.

Dies gilt insbesondere für die Muster I, Ia und II, die allesamt bei den großen

epidemischen PFGE-Gruppen zu finden sind. Die Gruppen III und IV sind hingegen nur

selten vorhanden und zeigen wenige Veränderungen im zeitlichen Verlauf.

75

Diskussion

4 Diskussion

4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen

Seit einigen Jahren werden in der infektionsepidemiologischen Forschung MRSA-

Stämme beobachtet, die sich in einem kurzen Zeitraum über große Distanzen ausbreiten

und in vielen Ländern zu einem epidemiologischen Problem werden.

Es wird postuliert, dass nur eine begrenzte Anzahl von Staphylococcus-aureus-Klonen

klinische Relevanz hat und unverhältnismäßig häufig mit Infektionen assoziiert ist.

Booth et al. (2001) charakterisierten zum Beispiel 405 S.-aureus-Isolate mit der

Pulsfeldgelelektrophorese, die unterschiedliche Infektionstypen verursachten und aus

verschiedenen Regionen der USA stammten. Dabei fielen fünf MRSA-Stämme auf, die

für mehr als 65% aller Infektionen verantwortlich waren. Es ist davon auszugehen, dass

sie über besondere Eigenschaften verfügen, die ihre Ausbreitungsfähigkeit erhöhen.

Weltweit entstehen immer wieder Epidemien, die von wenigen, sich schnell

ausbreitenden MRSA-Stämmen verursacht werden, die zu einer medizinischen und

ökonomischen Krise führen können (siehe Einleitung 1.2.4). Der Vergleich des mecA-

Gens und seiner regulatorischen Gene erhärtet den Verdacht einer globalen Ausbreitung

bestimmter epidemischer MRSA (Lim et al., 2002). Durch die zunehmende

Antibiotikaresistenz von MRSA bleiben immer weniger Möglichkeiten, Infektionen mit

diesen Erregern zu therapieren. Deshalb ist es dringend erforderlich, neben

konsequenten hygienischen Maßnahmen zur Prophylaxe und Eindämmung von MRSA-

Infektionen, die Ursache dieser besonderen Ausbreitungsfähigkeit der Epidemiestämme

zu ergründen.

Ist die zunehmende Antibiotikaresistenz für die Epidemieentstehung einiger Klone

verantwortlich? Enright et al. (2002) beobachteten, dass sich MRSA–Klone wiederholt

aus erfolgreichen epidemischen MSSA-Klonen entwickelt haben. Isolate mit

verminderter Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin sind wiederum aus epidemischen

MRSA-Klonen hervorgegangen. Dies zeigt die gefährliche Entwicklung einer

zunehmenden Antibiotikaresistenz innerhalb einer kleinen Gruppe ökologisch

erfolgreicher S.-aureus-Genotypen, gegen die es kaum noch Therapiemöglichkeiten gibt

(Enright et al., 2002; Robinson und Enright, 2004).

76

Diskussion

Der Erwerb zusätzlicher Resistenzen ist sicherlich ein begünstigender Faktor für die

erfolgreiche Ausbreitung eines S.-aureus-Stammes. Dies reicht als Erklärung jedoch

nicht aus, denn dann müssten sich immer diejenigen Stämme mit den meisten

Antibiotikaresistenzen am erfolgreichsten ausbreiten. In den letzten Jahren ist in

Deutschland allerdings eine Abnahme der breiten Mehrfachresistenz bei epidemischen

MRSA-Stämmen zu beobachten. Ihnen fehlen Resistenzgene, die in vielen anderen,

weit weniger verbreiteten MRSA enthalten sind (Braulke et al., 1999; Voss et al., 1994).

Seit Mitte der 1990er Jahre nehmen diese neuen klonalen Gruppen mit geringerer

Mehrfachresistenz zu. Der Grund dieser Entwicklung ist bislang nicht bekannt (Robert

Koch-Institut, 1999; Robert Koch-Institut, 2003).

Papakyriacou et al. (2000) entdeckten zwei epidemische Stämme von S. aureus, die für

die Hälfte aller Infektionen in Kanada verantwortlich waren und einen einheitlichen

Phänotyp aufwiesen. Die Sekretion von Exoproteinen dieser Stämme ist zu Gunsten

einer vermehrten Bindung an Wirtszellproteine begrenzt. Es wird nun vermutet, dass

dieser spezielle Phänotyp die Kolonisierungsphase der Infektion favorisiert und dass

dieses Phänomen für die starke Prävalenz der Stämme unter den klinischen Isolaten

verantwortlich sein könnte (Gillaspy et al., 1995). Eine Gruppe von Regulatorgenen, zu

denen unter anderem die Genloci agr, sar und sae gehören, werden mit diesen

Eigenschaften in Verbindung gebracht, sodass es sinnvoll erscheint, hier nach einer

Erklärung für die genetische und molekulare Basis der Überrepräsentation einiger

MRSA-Stämme zu suchen.

Eines dieser Regulatorsysteme, agr, wurde in dieser Arbeit näher untersucht, denn eine

mögliche Erklärung für die Ausbreitungsfähigkeit bestimmter MRSA-Stämme könnte

mit der Variabilität des agr-Genlocus zusammenhängen. Zunächst wurde für NRW -und

hier hauptsächlich für Bochum und Umgebung- ermittelt, ob es auch in dieser Region

epidemische MRSA-Stämme gibt und, falls ja, ob sie bereits bekannten nationalen und

internationalen Epidemiestämmen entsprechen. Nachfolgend wurde untersucht, ob einer

der vier bekannten Polymorphismen des agr-Locus, agr I,-II,-III oder –IV, besonders

häufig mit epidemischen MRSA-Stämmen assoziiert ist.

77

Diskussion

4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien

Die Suche nach den Ursachen für die epidemische Verbreitung einiger MRSA-Klone

bildete den Schwerpunkt dieser Arbeit. Um herauszufinden, ob es epidemische MRSA-

Stämme auch in Bochum gibt, wurden aus der untersuchten Stammsammlung

diejenigen Stämme erfasst, die sehr häufig im Untersuchungsmaterial von Patienten

auftraten und somit von besonderem klinischen Interesse sind.

Anhand der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Bandenmuster wurde der

Verwandtschaftsgrad von MRSA-Isolaten aus 20 Kliniken in Nordrhein-Westfalen

ermittelt. Die meisten Isolate stammten aus Krankenhäusern Bochums.

Die Studie wurde in zwei Untersuchungszeiträume aufgeteilt, da die Stammsammlung

des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum regelmäßig mit neuen

Isolaten erweitert wird, sodass sich der gesamte Beobachtungszeitraum dieser Arbeit

auf annähernd sechs Jahre erstreckte.

Im ersten etwa dreijährigen Zeitraum, von Februar 1998 bis Dezember 2000, wurden

417 Isolate analysiert. Von Januar 2001 bis Januar 2004 wurde die Anzahl der Isolate

um 744 auf 1161 erweitert. Die Verwandtschaftsgrade der Isolate untereinander wurden

computergestützt anhand der PFGE-Muster errechnet und anschließend manuell

korrigiert (siehe Ergebnisse 3.1.1).

Bei der epidemiologischen Klassifizierung der MRSA-Isolate fielen im ersten

Untersuchungszeitraum sieben Stämme auf, von denen 20 oder mehr Isolate in den

Kliniken auftraten. Diese Stämme könnten somit die gesuchte Fähigkeit besitzen, sich

effektiv und schnell im Klinikmilieu auszubreiten. Im zweiten Untersuchungszeitraum

traten vier zusätzliche Epidemiestämme auf.

Besonders hervorzuheben waren insgesamt vier MRSA-Stämme mit jeweils mehr als

100 Isolaten, zu denen 51,2% der klinischen Isolate in der untersuchten

Stammsammlung gerechnet werden konnten. Somit dominieren auch in Bochum

bestimmte MRSA-Stämme, wobei vier von diesen für mehr als die Hälfte der

Infektionen verantwortlich sind.

78

Diskussion

4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum

Die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum

wurde mit bekannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Die

Pulsfeldgelmuster der Isolate mit der Dauerkultur-Nummer 429 und 1268 in der PFGE-

(Pulsfeldgelelektrophorese-) Gruppe 19, die nur aus diesen beiden Isolaten besteht,

entsprechen den bekannten Epidemiestämmen SA 506 (Booth et al., 2001) aus den

USA, CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000) aus Kanada sowie EMRSA-16 (Cox et al.,

1995) aus Großbritannien (siehe Ergebnisse, Abbildung 12). Es handelt sich hier

vermutlich um einen Stamm, der in allen vier Ländern, Deutschland, Großbritannien,

Kanada und den USA, zu finden ist, wobei das Isolat aus der Stammsammlung in

Bochum im Gegensatz zu allen anderen nicht epidemisch ist. Eine mögliche Erklärung

dafür könnten Interaktionen mit den lokal vorhandenen Stämmen oder veränderte

Umweltbedingungen sein, die eine Ausbreitung des MRSA-Stammes in Bochum

verhinderten, sodass bislang nur zwei Isolate dieses Stammes vorliegen.

Möglicherweise sind die verglichenen Stämme aber auch genetisch verschiedener, als

die PFGE-Muster vermuten lassen. Es könnte sich hier um Unterschiede handeln, die

mit der Pulsfeldgelelektrophorese nicht erfasst werden. Da jedoch die Akkumulation

von genetischen Variationen bei Anwendung der PFGE schnell zu beträchtlichen

Veränderungen im Pulsfeldgelmuster führt, ist eher vom umgekehrten Fall auszugehen,

dass nämlich sehr nahverwandte MRSA-Klone unterschiedlich klassifiziert werden

(Enright et al., 2002).

Inzwischen wurde die MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische

Mikrobiologie der Stadt Bochum auch mit anderen Methoden charakterisiert, wobei die

MLST (Multilocus Sequence Typing) eine wichtige Stellung einnimmt. Die Ergebnisse

der MLST verifizierten die mit der PFGE ermittelten Verwandtschaftsverhältnisse unter

den MRSA (Tenover et al., 1995). Deshalb scheinen die PFGE-Ergebnisse für einen

Vergleich der MRSA-Isolate geeignet zu sein (van Belkum et al., 1998).

Auch in der Literatur werden Fälle beschrieben, bei denen ein Stamm in einem Land

epidemisch und in einem anderen Land nur sporadisch auftritt. In Kanada war ein Isolat

(PFGE CDN-type 160) identisch mit dem PFGE-Muster des iberischen Klons, dem

Epidemiestamm, der zuerst in Spanien und Portugal und anschließend auch in anderen

europäischen Ländern zu einem klinischen Problem geworden war.

79

Diskussion

Nachdem er 1995 erstmals in Kanada identifiziert wurde, hat er sich nicht wie in Europa

ausgebreitet, sondern ist auf dem amerikanischen Kontinent nur noch ein einziges Mal

in New York aufgefallen. Ebenso wurde der brasilianische Epidemiestamm in Kanada

insgesamt nur vier Mal während eines Ausbruchs im November 1998 identifiziert.

Gründe für ein Ausbleiben der Verbreitung in Kanada sind bislang nicht bekannt (Simor

et al., 2002). Blanc et al. (2002) nehmen an, dass die Ausbreitung bestimmter MRSA-

Klone mit intrinsischen Faktoren wie Überlebensfähigkeit, Kolonisierung und

antimikrobieller Resistenz sowie extrinsischen Faktoren wie Populationsmigration und

Infektionskontrolle zusammenhängen.

Bei weiteren Vergleichen der Stammsammlung mit anerkannten Epidemiestämmen fiel

eine große Ähnlichkeit des PFGE-Musters der Gruppe 4 (epidemiologische Bedeutung

unklar) mit dem des Hannoverschen Epidemiestammes auf. Die epidemische PFGE-

Gruppe 5 entsprach dem Süddeutschen Epidemiestamm. Der vierthäufigste MRSA-

Stamm in Bochum, PFGE-Gruppe 16, zeigte das gleiche Bandenmuster wie der Berliner

Epidemiestamm (siehe Ergebnisse, Abbildung 11). Es wurden demnach drei der

anerkannten Epidemiestämme in Bochum identifiziert. Die drei größten epidemischen

PFGE-Gruppen der Stammsammlung (13, 7 und 35) lassen sich jedoch keinem

anerkannten Epidemiestamm zuordnen und breiten sich möglicherweise nur im Raum

Bochum aus.

4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation

Da für eine Beurteilung des epidemischen Verhaltens der MRSA-Stämme nicht nur die

Anzahl der Isolate, sondern auch die Verteilung auf die Kliniken bedeutsam ist, wurde

analysiert, aus welchen Kliniken die einzelnen Isolate eines Stammes beziehungsweise

einer PFGE-Gruppe eingeschickt wurden (siehe Ergebnisse 3.3).

Die Isolate der epidemischen PFGE-Gruppen stammen aus vielen unterschiedlichen

Krankenhäusern (siehe Ergebnisse, Abbildung 13). Auf Grund dessen kann davon

ausgegangen werden, dass die Stämme nicht nur als epidemisch klassifiziert wurden,

weil 20 oder mehr Isolate mit dem gleichen PFGE-Muster identifiziert wurden (siehe

Material und Methoden 2.2.2), sondern weil sie sich auch in vielen verschiedenen

Kliniken ausgebreitet haben.

80

Diskussion

Wenn nur die Anzahl der Isolate als ein Kriterium für die epidemiologische

Klassifikation diente, wäre es möglich, dass alle Isolate eines epidemischen Stammes

von der gleichen Klinik stammen. Deshalb wurde in dieser Studie die Verteilung der

Isolate auf die Kliniken berücksichtigt und es zeigte sich, dass die epidemischen PFGE-

Gruppen in hohem Maße in den untersuchten Kliniken verbreitet sind (siehe Ergebnisse,

Abbildung 13).

Es gibt jedoch einige Ausnahmen, bei denen die epidemiologische Einteilung in Frage

gestellt werden muss. Auffällig war, dass einige Stämme sehr stark in den Kliniken

verbreitet waren, die Anzahl ihrer Isolate aber nur knapp die für diese Studie willkürlich

gesetzte Grenze für epidemische Stämme überschritt. Bei den unklaren PFGE-Gruppen

14 und 15 stammen die Isolate aus jeweils sieben verschiedenen Kliniken, erreichen

aber nicht die Grenze von 20 Isolaten. Somit gelten sie nach dieser Einteilung nicht als

epidemisch. Gruppe 14 besteht aus 16 und Gruppe 15 aus 11 Isolaten. Der Stamm 1 mit

22 Isolaten hingegen wird zu den epidemischen Stämmen gezählt, obwohl er nur in

zwei Kliniken zu finden war. Die starke Ausbreitung der MRSA-Stämme 14 und 15 auf

die sieben Kliniken lässt ein epidemisches Verhalten vermuten, auch, wenn dazu die

notwendige Anzahl der Isolate fehlt. Da die epidemiologische Einteilung auf einer

willkürlichen Operationalisierung beruht (siehe Material und Methoden 2.2.2), mindert

das die Validität der epidemiologischen Klassifizierung bei den Gruppen, die nur etwas

mehr als 20 Isolate aufweisen. Es stellt sich deswegen die Frage, ob Gruppe 14 und 15

nicht eher den epidemischen Stämmen zugeordnet werden müssten als zum Beispiel

PFGE-Gruppe 1.

Bei den großen epidemischen Gruppen treten diese Probleme nicht auf. Sie enthalten

viele Isolate aus vielen verschiedenen Krankenhäusern, was die Annahme ihres

epidemischen Verhaltens stützt. Die Isolate der größten Gruppe, 13, stammen aus 15

verschiedenen Kliniken und ebenso die der viertgrößten Gruppe, 16. Eine besonders

ausgeprägte Fähigkeit, sich bei relativ geringer Anzahl an Isolaten auszubreiten, scheint

Gruppe 11 der epidemischen Stämme zu besitzen. Sie ist mit 58 Isolaten zwar nicht

besonders groß, jedoch stammen diese aus 14 verschiedenen Kliniken (siehe

Ergebnisse, Abbildung 13).

Solange es keine genaue Definition für Epidemiestämme gibt, wird eine Ungewissheit

bei der PFGE-Gruppen-Einteilung bestehen bleiben. Mit steigender Gesamtzahl der

Isolate sollte die Grenze, ab welcher ein Stamm als epidemisch gilt, angepasst werden.

81

Diskussion

4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus

Auf Grund der immensen klinischen Bedeutung hat sich ein zunehmend wichtiger

werdendes Forschungsfeld gebildet, um Gene und regulatorische Mechanismen zu

entschlüsseln, die mit der Pathogenität von S. aureus in Verbindung gebracht werden.

Eine der dabei angewandten Strategien zielt darauf ab, die Kommunikation der

Bakterien untereinander zu studieren, um dadurch einen Ansatz für ein therapeutisches

Vorgehen zu erhalten. Im Unterschied zu den Antibiotika, welche bakterizid oder

bakteriostatisch wirken, würden die Bakterien hierbei von ihren Informationskanälen

abgeschnitten. Lange Zeit hat man sich bei der Erforschung der bakteriellen

Kommunikation auf Umweltsignale konzentriert, die die Regulatorsysteme für

Virulenzfaktoren in Bakterien aktivieren. Demgegenüber reagieren Bakterien jedoch

nicht nur auf Änderungen der Umwelt, sondern sie verfügen außerdem über ein

autoinduzierendes Regulatorsystem, durch das sie selbst die Regulation beeinflussen

(Balaban und Novick, 1995). Bei diesem werden jedoch nicht nur einfache Signale

vermittelt, sondern die Individuen kommunizieren mittels weit reichender chemischer

Signale und synchronisieren sich durch Mehrheitsentscheid (Quorum) zu einem

kollektiven Verhaltensmuster (Yarwood et al., 2004).

Die meisten Quorum-sensing-Systeme sind spezies- oder gruppenspezifisch, allerdings

sind auch solche bekannt, die Interaktionen zwischen verschiedenen Bakterienspezies

zulassen (Taga und Bassler, 2003; Zhu et al., 2001). Sie übernehmen die Regulation

komplexer Vorgänge wie Sporulation, Reifung, Biolumineszenz, Virulenzfaktor-

Expression und Biofilm-Formation (Engebrecht et al., 1983; Engebrecht und Silverman,

1984; Greenberg, 2003). Die Entdeckung solcher Kommunikationssysteme und das

zunehmende Verständnis ihrer Funktion und Wechselwirkungen könnten in Zukunft

von therapeutischem Nutzen sein. In der biotechnologischen Industrie werden

Strategien zur Modifikation der bakteriellen Kommunikation erforscht, um neue

antimikrobielle Substanzen zu entwickeln (Federle und Bassler, 2003).

82

Diskussion

4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von

MRSA-Stämmen

Gibt es unter den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen Präferenzen für

bestimmte epidemiologische Eigenschaften der MRSA-Stämme (epidemisch, unklar,

sporadisch)? Infektionen, die von S. aureus verursacht werden, beruhen

höchstwahrscheinlich zu einem Großteil auf der enormen Fähigkeit dieses Bakteriums,

sich auf verändernde Umweltbedingungen einzustellen. In jeder Phase der Infektion

scheint dieses hohe Maß an Koordination und Anpassung der Erreger durch die

Expression von Genen mittels eines Signaltransduktionsmechanismus moduliert zu

werden (Bayer et al., 1996).

Die Suche nach Unterschieden zwischen epidemischen und sporadischen MRSA-

Stämmen hinsichtlich ihrer agr-Interferenzgruppen steht im Mittelpunkt dieser Arbeit.

Es soll untersucht werden, welche Faktoren bestimmte MRSA-Stämme dazu befähigen,

sich stark auszubreiten und lange Zeit zu persistieren, sodass sie zu einem

epidemiologischen Problem werden.

Diese Studie basiert auf der Entdeckung, dass die Sequenzvariationen innerhalb der

agrBDC-Region des agr-Locus einen Mechanismus mikrobieller Interferenz fördern

und wurde in Anlehnung an die Methoden von Papakyriacou et al. (2000) durchgeführt.

Angenommen wird eine Kolonisierung epidemischer MRSA in Gegenwart anderer S.-

aureus-Stämme, was vor allem für den nosokomialen Bereich zutrifft. Der agr-Locus

von epidemischen MRSA müsste demnach eine verstärkte Kolonisierung in der

Gegenwart residenter S. aureus und Koagulase-negativer-Staphylokokken, die auch ein

agr besitzen, zulassen. Papakyriacou et al. (2000) untersuchten, ob die Aktivität des

agr-Genlocus in epidemischen MRSA-Stämmen entweder die Kolonisierung oder die

Invasion fördert. Unter Berücksichtigung des bisherigen Modells zur Funktionsweise

des agr-Locus, kann angenommen werden, dass eine verstärkte Kolonisierung durch

eine Verzögerung oder Abschwächung der RNA-III-Transkription erreicht werden

kann. Sie untersuchten weiterhin, ob und inwiefern sich epidemische MRSA von

sporadischen hinsichtlich der bisher vier bekannten agr-Interferenzgruppen

unterscheiden.

83

Diskussion

Um herauszufinden, ob es eine agr-Interferenzgruppe gibt, die besonders für die

epidemiologischen Eigenschaften prädestiniert ist, befassten sich Papakyriacou et al.

(2000) mit epidemischen MRSA in Kanada, den sogenannten CMRSA. Sie fanden die

allgemein akzeptierte These bestätigt, dass die Expression von Kolonisierungsfaktoren

reduziert wird und die Expression von Toxinen und gewebezerstörenden Faktoren mit

der vermehrten RNA-III-Transkription zunimmt, wenn der agr-Locus bei hoher

Zelldichte aktiviert ist.

Papakyriacou et al. (2000) fanden bei der Suche nach unterschiedlichen agr-

Interferenzmustern von epidemischen und sporadischen MRSA insgesamt drei

verschiedene RFLP-Muster und entdeckten einen Subtyp von I, nämlich Ia. Diesen

fanden sie bei nur einem der sporadischen Stämme, dagegen aber bei allen Subtypen des

epidemischen Stammes CMRSA-1. In der vorliegenden Studie wurden durch

Ermittlung der Restriktionslängen alle vier bekannten Interferenztypen nachgewiesen

(siehe Material und Methoden, Abbildung 8). Papakyriacou et al. (2000) fanden heraus,

dass die Typ-I-Interferenzgruppe, die mit dem epidemischen CMRSA-3 in Verbindung

gebracht wird, ebenfalls unter den sporadischen Stämmen am häufigsten zu finden ist.

Hieraus schlossen sie, dass die Interferenzgruppe I möglicherweise am besten geeignet

ist, um eine Kolonisierung in Gegenwart anderer S. aureus zu erlauben, die ebenfalls

dieser Interferenzgruppe angehören.

In dieser Arbeit wurde analog verfahren und ebenso nach einer vorherrschenden

Interferenzgruppe unter den epidemischen Stämmen gesucht. Hierzu wurden die agr-

Interferenzmuster der MRSA-Stämme bestimmt (siehe Material und Methoden 2.2.7).

Im ersten Zeitraum der etwa sechsjährigen Studie konnten 161 der 227 Isolate von den

epidemischen MRSA-Stämmen der Interferenzgruppe II (70,9%) zugeordnet werden.

Dieses Muster schien, verglichen mit den 27 Isolaten (11,9%) der Interferenzgruppe I

und den 39 Isolaten (17,2%) der Gruppe Ia, unter den epidemischen Stämmen

auffallend häufig vertreten zu sein. Das Interferenzmuster II trat auch bei den bisher

unklaren PFGE-Gruppen häufiger als die anderen Interferenzmuster auf, nämlich bei 62

von 118 Isolaten (52,5%). Im Gegensatz dazu fand sich unter den 48 sporadischen

Isolaten die Interferenzgruppe I mit 29 (60,4%) von 48 Isolaten am häufigsten (siehe

Ergebnisse 3.1.1). Zunächst schien somit eine deutliche Korrelation der epidemischen

Stämme zur Interferenzgruppe II und der sporadischen Stämme zum Interferenztyp I zu

bestehen.

84

Diskussion

Sakoulas et al. (2003) fanden in Blutkulturen von MRSA-Isolaten aus Kliniken in

Boston und Baltimore ebenfalls einen überwiegenden Anteil der agr-Interferenzgruppe

II mit 56%. Diese Ergebnisse widersprechen jedoch denen der kanadischen Studie von

Papakyriacou et al. (2000). In ihrer Studie überwog die Interferenzgruppe I sowohl bei

den epidemischen als auch bei den sporadischen MRSA-Stämmen. Auch in anderen,

vor allem europäischen Studien, kam man zu dem Ergebnis, dass die große Mehrheit

der klinischen S.-aureus-Isolate zur agr-Gruppe I gehören (Moore und Lindsay, 2001;

van Leeuwen, 2000).

Im zweiten Beobachtungszeitraum dieser Arbeit zeigte sich zwar noch eine Präferenz

der epidemischen Gruppen für das agr-Interferenzmuster II, deren Anteil hatte jedoch

deutlich abgenommen. Die Interferenzgruppen I und Ia waren unter den epidemischen

Stämmen wesentlich häufiger zu finden (siehe Ergebnisse 3.4.2).

Die anfängliche Annahme einer Dominanz der Interferenzgruppe II unter den

epidemischen MRSA-Stämmen muss entsprechend korrigiert werden. Es lässt sich nach

Auswertung des gesamten Beobachtungszeitraumes eher vermuten, dass die

epidemiologischen Eigenschaften nicht wesentlich von den agr-Interferenztypen

beeinflusst werden.

Bei den größten Epidemiegruppen der untersuchten Stammsammlung finden sich drei

agr-Interferenzmuster, I, Ia und II. Auch die anerkannten deutschen Epidemiestämme

weisen verschiedene Interferenzmuster auf. So zählt der Hannoversche Epidemiestamm

(PFGE-Gruppe 4) zur agr-Interferenzgruppe I, der Berliner Epidemiestamm (PFGE-

Gruppe 15) zur Interferenzgruppe Ia und beim Süddeutschen Epidemiestamm (PFGE-

Gruppe 5) findet sich das Interferenzmuster II. Die Muster III und IV konnten nur bei

kleinen, unklaren PFGE-Gruppen identifiziert werden (siehe Ergebnisse, Abbildung 21

und Tabelle 10). Eine Voraussage über das epidemiologische Verhalten eines MRSA-

Stammes anhand seines agr-Interferenzmusters ist somit nicht möglich.

85

Diskussion

4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem

agr-Interferenzmuster

Ambulante Infektionen mit cMRSA (community-acquired methicillin-resistant

Staphylococcus aureus) weisen scheinbar ausschließlich das agr-Interferenzmuster III

auf (Dufour et al., 2002; Witte et al., 2004). Ebenso scheint es eine Verbindung der agr-

Interferenzgruppe III mit dem Toxic-Schock-Syndrom und dem agr-Interferenzmuster

IV mit dem „staphylococcal scalded skin syndrome“ zu geben (Jarraud et al., 2002;

Musser et al., 1990).

Des Weiteren gibt es Hinweise auf eine erhöhte intrinsische

Überlebenswahrscheinlichkeit des agr-Gruppe-II-Polymorphismus unter einer

Vancomycin-Therapie (Moise-Broder et al., 2004; Verdier et al., 2004).

Sakoulas et al. (2002) fanden bei allen acht bekannten GISA- und hetero-GISA-

Stämmen aus den Vereinigten Staaten und Japan die agr-Interferenzgruppe II.

Außerdem wurde bei ihnen durch die fehlende Expression von δ-Hämolysin eine

fehlerhafte agr-Funktion nachgewiesen. Bei einigen klinischen GISA-Isolaten fielen

Punktmutationen innerhalb des agr-Genlocus auf, was die fehlerhafte agr-Funktion

erklären könnte. Ein im Labor generierter agr-Null-Stamm zeigte einen geringen,

jedoch reproduzierbaren Anstieg der Vancomycin-Heteroresistenz nach in-vitro-

Wachstum in subinhibitorischen Vancomycin-Konzentrationen (1 µg/ml). Dies war in

dem isogenen Mutterstamm der agr-Gruppe II mit intaktem agr nicht der Fall. Die in

vitro bakterizide Aktivität von Vancomycin war im agr-Null-Stamm, verglichen mit

dem Mutterstamm, abgeschwächt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine

eingeschränkte oder defekte agr-Funktion für die Entwicklung einer Vancomycin-

Heteroresistenz von Vorteil sein könnte (Sakoulas et al., 2002).

Die Bestimmung der agr-Interferenzgruppen ist kein anerkanntes Verfahren zur

Ermittlung der Vorfahren aktueller MRSA-Klone. Besser geeignet zur Stammbaum-

Erstellung ist eine neuere Methode, MLST (Multilocus Sequence Typing), womit

Sakoulas et al. (2003) zeigten, dass die Sequenz ST-5 der genetische Vorfahre der

meisten weltweiten GISA ist. Nicht verwunderlich war, auf Grund der identischen

MLST-Typen, dass die Stämme auch mit den schon genannten Methoden (agr-

Typisierung und PFGE-Muster-Vergleich) Verwandtschaftsverhältnisse erkennen

ließen.

86

Diskussion

Somit liegt die Vermutung nahe, dass der MRSA-Stamm ST-5 den klonalen

Hintergrund für die GISA-Stämme bildet und außerdem zur agr-Gruppe II gehört

(Sakoulas et al., 2003).

Ein besonderer Effekt nur einer bestimmten agr-Interferenzgruppe auf die

Ausbreitungsfähigkeit ist bisher nicht bekannt und konnte in der vorliegenden Arbeit

auch nicht nachgewiesen werden.

4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo

Ist der agr-Genlocus der entscheidende Faktor für die Überrepräsentation einiger

MRSA-Stämme?

Strommenger et al. (2003) beobachteten während der letzten acht Jahre einen Wechsel

in der Prävalenz und Ausbreitung verschiedener epidemischer MRSA in Zentraleuropa.

Sie verglichen die agr-Gruppenspezifität der älteren und der neueren Epidemiestämme

miteinander und stellten fest, dass diese Dynamik nicht auf die agr-Gruppenspezifität

zurückgeführt werden kann. Weltweit weisen die meisten MRSA-Stämme

verschiedener klonaler Abstammung die agr-Spezifität I auf, und zwar unabhängig von

ihrer epidemiologischen Relevanz. Strommenger et al. (2003) schließen daraus, dass

agr für die Epidemieentstehung keine entscheidende Rolle spielt.

Unter in-vitro-Bedingungen wurde bereits mehrfach nachgewiesen, dass die Expression

der meisten Virulenzfaktoren von S. aureus durch den globalen Regulator agr

koordiniert werden. Erstaunlich sind hingegen Ergebnisse, bei denen der agr-Locus

zwar identifiziert wurde, jedoch keine Funktion zeigte. Goerke et al. (2000)

entwickelten eine Methode, um die bakterielle Genregulation im Wirt zu überwachen.

Mit einer direkten Transkript-Analyse von klinischen S.-aureus-Isolaten fanden sie

heraus, dass die RNA III, das Effektormolekül für das agr-Regulationssystem, in der

Lunge von Patienten mit zystischer Fibrose kaum exprimiert wird. Dies legt den Schluss

eines inaktiven agr in vivo nahe. Die Transkription der RNA III in vivo war

vergleichbar mit dem Level der Expression in der exponentiellen Wachstumsphase der

Bakterien und lag immer weit unter dem Transkriptionslevel der postexponentiellen

Phase. Auch die Expressionsprofile von spa (Protein A) und hla (α-Toxin) sprachen für

einen inaktiven agr-Locus.

87

Diskussion

Bei Patienten, die unter zystischer Fibrose leiden, scheint die agr-Aktivität nicht

essentiell zu sein. Goerke et al. (2000) schlossen aus ihren Ergebnissen, dass für die

Virulenz von S. aureus in vivo andere regulatorische Mechanismen verantwortlich sind,

als die bisher in vitro charakterisierten. Sie vermuteten weiter, dass das agr-System

möglicherweise nur bei besonderen Typen von Infektionen, in diesem Fall chronischen

Infektionen, oder in bestimmten Phasen der Infektion aktiv ist. Bei der chronischen

Lungenentzündung einer zystischen Fibrose ist S. aureus in dem hochviskösen Schleim

lokalisiert, sodass es keine systemische Manifestation gibt. Somit ist das Fehlen der

agr-Aktivität vielleicht einzigartig bei Patienten mit CF (Goerke et al., 2000; Goerke et

al., 2003; Goerke und Wolz, 2004). Des Weiteren fanden sie keinen Anhaltspunkt für

eine agr-abhängige Interferenz zwischen den S.-aureus-Stämmen während einer

Pneumonie von Patienten mit zystischer Fibrose. Die These, dass die Dominanz

bestimmter Klone nicht von der agr-Gruppenspezifität abhängig ist, wird auch von Kahl

et al. (2003) unterstützt. Sie verglichen die agr-Interferenzgruppen-Verteilung von

persistenten S. aureus bei Patienten mit zystischer Fibrose mit denen nasal kolonisierter

gesunder Träger. Dabei fanden sie keinen Unterschied.

Yarwood et al. (2002) stellten fest, dass für die Ausbildung des TSS (Toxic-Schock-

Syndrom) bei S. aureus die Aktivität des agr-Systems nicht erforderlich ist. Die

Zerstörung des agr-Locus zeigte in vivo nur einen minimalen Effekt auf die Expression

von Virulenzfaktoren.

Andererseits gibt es Tiermodelle, die den agr-Locus als einen wichtigen Virulenzfaktor

validieren. In diesen Modellen waren agr-Mutanten weniger virulent als der

korrespondierende Wildtyp-Stamm (Projan und Novick, 1997). Bei agr- und sar-

Mutanten wurde fast in jedem Tiermodell eine Reduktion der Virulenz beobachtet. Eine

verminderte Virulenz bei agr-Mutanten zeigte sich in Modellen von subkutanen

Abszess-Formationen (Mayville et al., 1999), einer Arthritis in Mäusen (Abdelnour et

al., 1993) sowie einer Osteomyelitis (Gillaspy et al., 1995) und Endokarditis (Cheung et

al., 1994) in Kaninchen. Jedoch konnte in diesen Tiermodellen die Fähigkeit von S.

aureus, Krankheiten auszulösen, nicht eliminiert werden. Vielleicht führt die vermehrte

Expression von Oberflächenproteinen auch zu einer erhöhten Fähigkeit, bestimmte

Gewebetypen des Wirtes zu kolonisieren, sodass der Organismus im Wirt persistieren

kann, ohne eine offenkundige Krankheit auszulösen (Gillaspy et al., 1995).

88

Diskussion

Ein weiterer Kritikpunkt gegen eine Übertragung der in vitro gewonnen Ergebnisse auf

die Situation in vivo ist, dass ein Großteil der Studien über die

Regulationsmechanismen von sar und agr an dem Laborstamm RN6390 durchgeführt

wurde. Es ist jedoch äußerst fraglich, ob diese Ergebnisse für klinische Isolate

repräsentativ sind (Blevins et al., 2002).

Des Weiteren gibt es außer agr zahlreiche andere Faktoren, die mit der Regulation der

Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden. Versuche, die Umweltbedingungen

zu verändern, haben gezeigt, dass zum Beispiel bei Erhöhung der Salzkonzentration die

Transkription und damit die Toxinproduktion bestimmter Virulenzfaktoren agr- und

sarA-unabhängig beeinflusst wird (Regassa und Betley, 1993). Lindsay und Foster

(1999) beschrieben, dass der agr-Locus die Transkription von hla aktiviert, für diese

jedoch nicht essentiell ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SarA einen

aktivierenden Effekt auf agr ausübt und damit indirekt die hla-Transkription fördert

(Cheung und Projan, 1994; Cheung et al., 1997; Chien und Cheung, 1998; Heinrichs et

al., 1996; Lindsay und Foster, 1999). Des Weiteren muss bedacht werden, dass die Liste

von Virulenzfaktoren limitiert ist durch die in-vitro-Experimente zu ihrer

Identifizierung. Es wäre möglich, dass in vivo bisher unbekannte Virulenzfaktoren eine

wichtige Rolle spielen (Dunman et al., 2001).

Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Virulenz und Ausbreitungsfähigkeit bleibt

somit weiterhin ungewiss. Auf Grund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit muss man

davon ausgehen, dass es keine agr-Interferenzgruppe gibt, die besonders für die

Entstehung von Epidemien prädestiniert ist.

89

Zusammenfassung

5 Zusammenfassung Die deutlich zunehmende und mit modernen molekularbiologischen

Typisierungsmethoden nachgewiesene Verbreitung von MRSA-Epidemiestämmen

macht eine intensive Auseinandersetzung mit den Ursachen dieses Phänomens

erforderlich. Die epidemische Ausbreitungsfähigkeit ist eine komplexe Eigenschaft von

einigen S.-aureus-Stämmen, die von Faktoren des Stammes selbst

(Widerstandsfähigkeit, Ausstattung mit Enzymen und Toxinen, Regulation der

Virulenzfaktoren) und Faktoren seiner Umwelt (hygienische und antibakterielle

Maßnahmen) bestimmt werden. Mit der Überrepräsentation bestimmter MRSA-Stämme

wird vor allem das Regulatorgen agr von Staphylococcus aureus in Verbindung

gebracht. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Variabilität des agr-Genlocus mit

der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Epidemiestämmen korreliert.

Zunächst wurde die Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der

Stadt Bochum durch die Analyse der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster auf epidemische

MRSA-Stämme hin untersucht. Es wurden Kriterien zur epidemiologischen

Klassifikation der MRSA-Isolate erstellt und im Rahmen dessen eine

Operationalisierung der Definitionen „epidemisch“, „unklar“ und „sporadisch“

vorgenommen. Die MRSA-Stammsammlung wurde nachfolgend mit anerkannten

nationalen und internationalen Epidemiestämmen verglichen.

Im ersten etwa dreijährigen Beobachtungszeitraum der Studie (13.02.1998–31.12.2000)

wurden 417 MRSA-Isolate analysiert. Dabei fielen sieben Stämme auf, von denen

mindestens 20 Isolate gefunden wurden.

Im zweiten Untersuchungszeitraum (01.01.2001-12.01.2004) wurde die Anzahl der

Isolate um 744 auf 1161 erweitert und es fielen besonders vier MRSA-Stämme mit

jeweils mehr als 100 Isolaten auf, die für 51,2% aller Infektionen im Einzugsgebiet der

Studie verantwortlich waren. Diese könnten über die gesuchte Fähigkeit zur effektiven

und schnellen Ausbreitung im Klinikmilieu verfügen.

Das Pulsfeldgelmuster der PFGE- (Pulsfeldgelelektrophorese-) Gruppe 19, die nur aus

zwei Isolaten besteht, entsprach den anerkannten Epidemiestämmen SA 506 (Booth et

al., 2001) aus den USA, CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000) aus Kanada und

EMRSA-16 (Cox et al., 1995) aus Großbritannien.

90

Zusammenfassung

Da jedoch in der Bochumer Stammsammlung nur zwei Isolate dieses international

anerkannten Epidemiestammes zu finden waren, scheint er im Gegensatz zu

Großbritannien, Kanada und den USA in Deutschland nicht epidemisch aufzutreten.

Das PFGE-Muster der Gruppe 4 (unklares epidemiologisches Verhalten) entsprach

demjenigen des Hannoverschen Epidemiestammes und das der epidemischen PFGE-

Gruppe 5 dem Süddeutschen Epidemiestamm. Der vierthäufigste MRSA-Stamm in

Bochum, PFGE-Gruppe 16, wies das gleiche Bandenmuster wie der Berliner

Epidemiestamm auf. Insgesamt wurden drei der anerkannten deutschen

Epidemiestämme in Bochum identifiziert. Die drei größten epidemischen PFGE-

Gruppen der Stammsammlung (13, 7 und 35) lassen sich jedoch keinem anerkannten

Epidemiestamm zuordnen und breiten sich möglicherweise nur im Raum Bochum aus.

Es folgte eine Analyse des agr-Genlocus der epidemischen, unklaren und sporadischen

MRSA-Stämme, um herauszufinden, ob es unter den vier bekannten agrBDC-

Interferenzgruppen Präferenzen für bestimmte epidemiologische Eigenschaften

(epidemisch, unklar, sporadisch) gibt. Dabei wurde untersucht, ob sich epidemische von

sporadischen MRSA hinsichtlich ihres agr-Locus unterscheiden.

Im ersten Beobachtungszeitraum der etwa sechsjährigen Studie wurden 161 der 227

epidemischen MRSA-Isolate der agrBDC-Interferenzgruppe II (70,9%) zugeordnet. Bei

den 48 sporadischen Isolaten dominierte das Interferenzmuster I mit 29 Isolaten

(60,4%). Im ersten Untersuchungszeitraum fiel somit eine deutliche Korrelation der

epidemischen Stämme zur Interferenzgruppe II und der sporadischen Stämme zum

Interferenztyp I auf. Aus diesen Ergebnissen könnte man ableiten, dass die

Interferenzgruppe II für Epidemien besonders prädestiniert ist.

Bei Auswertung des gesamten Beobachtungszeitraumes (13.02.1998-12.01.2004) zeigte

sich zwar weiterhin eine Präferenz der epidemischen Gruppen für das agr-

Interferenzmuster II, jedoch hatte deren Anteil im zweiten Beobachtungszeitraum von

70,9% auf 53,3% deutlich abgenommen. Man muss den Ergebnissen der gesamten

Studie zufolge eher davon ausgehen, dass die epidemiologischen Eigenschaften nicht

mit einem der agr-Interferenzmuster korrelieren. Zudem fanden sich bei den größten

Epidemiegruppen der untersuchten Stammsammlung drei verschiedene agr-

Interferenzmuster, I, Ia und II. Auch die anerkannten deutschen Epidemiestämme

weisen jeweils unterschiedliche Interferenzmuster auf.

91

Zusammenfassung

Die Suche nach weiteren möglichen Faktoren für die Ausbreitungsfähigkeit von

MRSA-Epidemiestämmen sollte dieser Arbeit folgen. Außerdem gilt es, die Bedeutung

des agr-Systems in vivo zu klären.

92

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Yarwood, J.M., McCormick, J.K., Paustian, M.L., Kapur, V., Schlievert, P.M. (2002) Repression of the

Staphylococcus aureus accessory gene regulator in serum and in vivo. J. Bacteriol. 184, 1095-1101

Zhang, L., Lin, J., Ji, G. (2004) Membrane anchoring of the AgrD N-terminal amphipathic region is

required for its processing to produce a Quorum sensing pheromone in Staphylococcus aureus. J. Biol.

Chem. 279, 19448-19456

Zhu, J., Miller, M.B., Vance, R.E., Dziejman, M., Bassler, B.L., Mekalanos, J.J. (2001) Quorum-sensing

regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 3129-3134

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7 Danksagung

Bedanken möchte ich mich bei all denen, die mich bei der Durchführung der Experimente und

bei der Anfertigung der Dissertationsschrift unterstützt haben.

Zu großem Dank verpflichtet bin ich Prof. Dr. med. S. G. Gatermann für die Überlassung des

Themas sowie die intensive, ausdauernde und freundliche Betreuung.

Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie

der Ruhr-Universität Bochum, ohne deren wohlwollende und kompetente Hilfe diese Arbeit

nicht möglich gewesen wäre.

Insbesondere möchte ich mich bei Frau Susanne Friedrich und Michaela Stieglitz-Rumberg

bedanken für die kontinuierliche Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation.

Helen Papakyriacou und Mary C. Booth danke ich für die Überlassung der epidemischen

MRSA-Stämme.

Des Weiteren möchte ich mich bei Christof Albers für die fachkundigen sprachlichen

Korrekturen und hilfreichen Anregungen bedanken. Der gesamten Familie Albers danke ich

für die moralische und kulinarische Unterstützung.

Kaschayar Saadat-Gilani und Christian Kersting möchte ich für die Ratschläge bei den

Abbildungen danken.

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung meines

Studiums.

Vor allem gilt aber mein zutiefst empfundener Dank meiner lieben und geduldigen Freundin

Nicole.

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Sven Hengesbach, Geiststraße 84, 48151 Münster

Curriculum Vitae

Sven Hengesbach geboren am 08.10.1975 in Meschede

Schulausbildung 1982 – 1986 Marien-Grundschule in Meschede 1986 – 1995 Gymnasium der Benediktiner in Meschede, Abschluss Abitur Zivildienst Juli 1995 – Juli 1996 Pflegehilfe im St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Hochschulausbildung Oktober 1996 – Oktober 2002 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum August 1998 Physikum August 1999 1. Staatsexamen August 2001 2. Staatsexamen Oktober 2002 3. Staatsexamen

Famulaturen März 1999 Allgemein-Chirurgie, Kingston Hospital, London September 1999 Innere Medizin, St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Februar 2000 Allgemeinmedizinische Praxis, Meschede März 2000 Urologische Praxis, Meschede Juli/ August 2000 Viszeral- und Thoraxchirurgie, Charité, Berlin Februar/ März 2001 Radiologie, St. Josefs-Hospital, Bochum Praktisches Jahr Oktober 2001 – Oktober 2002 St. Josefs-Hospital Bochum (Universitätsklinik) Allgemein- und Gefäßchirurgie, Innere Medizin,

Anästhesie Berufspraxis Januar 2003 – Juni 2004 Arzt im Praktikum in der Chirurgischen Klinik I, Clemenshospital Münster Juli 2004 – Dezember 2004 Aktualisierung der Daten für die Dissertation und journalistische Hospitationen beim ZDF und NDR Ab Januar 2005 Assistenzarzt in der Inneren Klinik I, Raphaelsklinik Münster

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