Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment

2. Proteindynamik

3. Strukturelle Evolution

U.Albrecht BC1

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A. Protein-Renaturierung

Reduktive Denaturierung und oxidative Renaturierungder RNAse A

Denaturierung in 8M HarnstoffDialyse und stehenlassen an Luft100% aktives Enzymkeine zufällige Renaturierung

1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105

native Konformation thermo-dynamisch günstig sein.

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Wahrscheinlichkeit für korrekte Fal-tung bei Gleichwertigkeit aller SH:

Enzymatische Renaturierung von Disulfid-Brücken

Protein-Disulfid-Isomerase (PDI)

kontinuierliches Öffnen der S-S Brücken. Thermodynamisch günstigste Proteinkonformation bestimmt die bevorzugten S-S Brücken.

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Posttranslationell modifizierte Proteine können sich einer spontanen Renaturierung widersetzen

Primärstruktur von Proinsulin

Insulin wird aus einer AS-Kette gebildet, demProinsulin. Spezifische proteolytische Reaktionführt zur Abspaltung eines ‚internen‘ Peptides(C chain) zwei kettiges Insulin

kann nicht mehrspontan ursprünglicheKonformation einnehmenund andere S-S Brückenausbilden

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Proteinfaltung wird hauptsächlich durch innere Reste gesteuert

Modifikation von AS an Proteinoberfläche verändern die native Konformationkaum

Mutationen von Oberflächenresten verändern native KonformationkaumAS an Oberfläche evolutionär weniger stark konserviert als innere Reste (hydro-phobe Reste)

Denaturierende Agenzien interagieren mit hydrophoben inneren Resten

Die Proteinfaltung ist ein von hydrophoben Kräften getriebener Prozess

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B. Faltungsabläufe

Es werden nicht alle möglichen Konfor-mationen ausprobiert (bräuchte Mia von Jahren) Faltung mehrstufiger, koopera-tiver Prozess.

1. zufällige Bildung kurzer Abschnitte von Sekundärstrukturen (α−Helices, β−Falt- blätter) Nuclei für weitere Faltung2. Nuclei wachsen in kooperativer Weise. Helices und Faltblätter gruppieren sich.3. in Multidomänenprot. kommen Domänen zusammen. Molten Globule Hydrophobe Seitenketten sind noch dem Lsm ausgesetzt.4. Kompaktere Tertiärstruktur bildet sich aus kleine konformationelle Anpassungen.5. Untereineheiten kommen zusammen6. konformationlelle Anpassungen führen zu nativer Konformation.

Hypothethscher Faltungsablauf einer dimerenProteins.

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BPTI faltet sich in geordneter Abfolge in seine native Konformation

Natives BPTI

BPTI = Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor

Inaktiviert Trypsin im Pankreas, welcherTrypsin sezerniert. Dadurch wird dieser vor Selbstzerstörung geschützt.

3 Disulfid-Brücken

U.Albrecht BC1BPTI wählt eine begrenzte Anzahl Faltungswege

70 %

30%

U.Albrecht BC1C. Faltungs Hilfsproteine

Hilfsproteine die Faltung von Proteinen erleichtern währendsie synthetisiert werden = Beschleunigung der Faltung1. Protein Disulfid Isomerasen (PDI)2. Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen3. Chaperone

PDI (siehe vorher) beschleunigt korrekte S-S Brückenbildungdurch shuffling von Disulfidbrücken.

Ähnliches Enzym in Bacterien = DsbA Protein mit Ähnlichkeitzu thioredoxin.

Schwefel Atom

Molekulare Oberfläche und Ladungsverteilung

90° gedreht

negativ geladene Gruppen

positiv geladene Gruppen

exponiertes Schwefelatom

U.Albrecht BC1Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen (PPI)

In globulären Proteinen Xaa-Pro Peptid Bin-dungen in trans Konformation, aber 10% in cisKonformation.Cis Konformation wird durch PPI (auchRotamase genannt) begünstigt

2 Familien von PPI‘s (Immunophiline):

cyclophiline

FK506 binding protein (FKBP)

Diese Proteine haben auch immunsupressiveEigenschaften, die jedoch nichts mit ihren enzymatischen Aktivitäten als Rotamasen zu tun haben.

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Molekulare Chaperons verhindern falsche Faltung und Agregation von Proteinen

Hydrophobe Regionen haben Tendenz zu agregieren. Solche Agregate können siche ineinem Peptidstrang selber bilden oder zwischen Peptidsträngen. Molekulare Chaperoneverhindern eine solche ungünstigen Assoziationen und kehren sie um. Chaperone bindenan hydrophobe Regionen die Lösungsmittel exponiert sind und verhindern so ungewollteAgregationen. Der genaue Mechanismus ist unbekannt jedoch haben viele Chaperone

ATPase Aktivität. ATP hydro-lyse scheint die Energie fürdie Funktion der Chaperone zu liefern.

E. coli PapD ein molekulares Chaperondas die korrekte Faltung von Pili fördert.

Boomerang Gestalt von PapD

Peptid wird in gestreckter Konformation gehalten

Verankerung des C-Terms anChaperon

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Verschiedene Klassen von Chaperons

1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so benannt da Synthese dieser Proteine er- höht bei angehobener Temperatur. Sie kehren Denaturierung und Agregation in Prokaryoten als auch in Eukaryoten um.

2. Chaperonine (Hsp60, Hsp10) Multisubunit, käfigähnliche Moleküle Erhöhen nicht die Rate der Proteinfaltung sondern erhöhen die Ausbeute an richtig gefalteten Proteinen

Hsp60 Molekül von Rhodobacter spheroidesist aus 14 identischen Untereinheiten.

3. Nucleoplasmine steuern in vivo die Zusammensetzung von der Nucleosomen

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Reaktionszyklus der E. coli chaperonine GroEL (Hsp60) und GroES (Hsp10)

hydrophobischeBindungsstellen

ATP-abhängige Freisetzung von ungefalteten Proteinenvon den Bindungstellen im GroEL chaperon.

Nucleoplasmine

Nucleosomen werden durch Nucleoplasmine ausden Histoneinheiten zusammengefügt. An Nucleosomenist die DNA aufgewickelt und stellt eine sehr kompakteForm der Verpackung dar.

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C. Vorhersage der Proteinstruktur

Primärstruktur bestimmt Faltung. Theoretisch Berechungen möglich um Struktur zubestimmen, praktisch aber kaum durchführbar Empirische Methoden

1. Chou-Fasman-Schema

Frequenz f = Frequenz mit der ein bestimmter Rest in einer α-Helix auftritt

f = n n n = Anzahl AS eines Typs in α-Helix n = Gesamtzahl der AS dieses Typs im Protein

Tendenz P einer bestimmten AS in einer α-Helix aufzutreten

P = f f f = Durchschnittswert von f für alle 20 AS P > 1 heisst AS mit grösserer als durchschnit-

tlicher Wahrscheinlichkeit in α-Helix

Tendenz P einer bestimmten AS in einem β-Faltblatt aufzutreten analog definiert.

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Empirische Regeln zu Chou-Fasman-Schema:

1. Vier Helix bildende Reste in sechs aufeinanderfolgenden Resten dienen als Helixnucleus. Helixsegment pflanzt sich in beide Richtungen fort bis der durchschnittliche Wert von P < 1 ist. Ein Pro-Rest nur am N-Term einer Helix.

2. Drei β−Faltblatt bildenden Reste in fünf aufeinanderfolgenden Resten starten ein β−Faltblatt. Pflanzt sich in beide Richtungen fort bis P < 1.

3. Wenn α− und β−bildende Sequenzen überlappen gilt Überlappungsregion als helical wenn P > P α-Helix P > P β−Faltblatt Zuverlässigkeit ist bis zu 80 %

2. Regel von Rose

Umkehrschleifen sind durch ein Hydrophobizitäts-Minimum entlang der Polypeptid-kette charakterisiert. Dies gilt nur wenn die Region nicht gleichzeitig ein helicalerAbschnitt darstellt.

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Vorhersage von α-Helices, β−Faltblatt Strukturen und β−Schleifen

Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment

2. Proteindynamik

3. Strukturelle Evolution

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2. Proteindynamik

- Röntgenstruktur liefert zeitlich gemittelte Schnappschüsse der Proetinstruktur- Proteine sind aber flexibel fluktuierende Moleküle, deren strukturelle Mobilität eine funktionelle Signifikanz hat.

3 Arten von ‚Atmungsbewegungen‘:

1. atomare Fluktuationen: vibrationen von individuellen Bindungen 1-100 pm

2. kollektive Bewegungen: Gruppen von kovalent verknüpften Atomen bewegen sich 1-500 pm

3. induzierte Konformationsveränderungen: Atomgruppen und ganze Untereinheiten können können sich nach Stimulus (z.B. O2 an Hämoglobin) bewegen. 50-1000 pm

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Darstellung der ‚atmenden‘ Bewegungen im Myoglobin, die das Austreten eines gebundenenO2 Moleküls zulassen

O2 Molekül

Häm Gruppe

U.Albrecht BC1Proteine haben mobile Strukturen

Mehrere ‚Schnappschüsse‘ von Myoglobin überlagert

HämHis-Rest

α−Helix

Seitenketten

H-Brücken

Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment

2. Proteindynamik

3. Strukturelle Evolution

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3. Strukturelle Evolution

Hydrophobe Kräfte sehr wichtig für Faltung. Innere AS können nur konservativ substituiertwerden damit Struktur erhalten bleibt. Konservierung der Proteinstruktur wichtig, nicht Aminosäuresequenz.

A. Struktur des Cytochroms c

Häm Nische wichtig. AS die Häm fixieren sindevolutionär konserviert

Häm

strukturell wichtige AS

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Primärstruktur verschiedener Cytochrome c

Aminosäuresequenz nicht sehr konserviert. Strukturelemete aber sehr. Kritische Amino-säuren sind konwerviert

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Dreidimensionale Struktur von Cytochromen c

Struktur ist sehr konserviert im Gegensatz zur Primärstruktur

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B. Gen-Duplikation

In Multidomän Proteinen können Domänen ähnlich sein. Konvergente Evolution istunwahrscheinlich, Gen-Duplikation und dievergente Evolution eher wahrscheinlich

strukturell ähnliche Domänen von Rhodanase

Redox- Enzyme (Dehydrogenasen) aus 2 verschiednen Domänen: Coenzym bindendeDomäne und Substrat bindende Domäne Funktion aus 2 Einheiten

Genetische Kombination neue Funktion