!!

Homöostatische,Mechanismen,der,,CD4+,T6Zellgenese,bei,Rheumatoider,Arthritis,

!!!!

Dissertation,zur,Erlangung,des,akademischen,Grades,

Dr.,med.,,

an,der,Medizinischen,Fakultät,,der,Universität,Leipzig,

!!!!

!!eingereicht!von:!Annika!Schatz!geboren!am!08.10.1986!in!Bad!Kreuznach!!angefertigt!an!der!Medizinischen!Klinik!II!der!Universität!Leipzig!!Klinik!und!Poliklinik!für!Gastroenterologie!und!Rheumatologie!!Sektion!Rheumatologie!!!

!

Betreuer:!Prof.!Dr.!med.!Ulf!Wagner!und!Dr.!rer.!nat.!Manuela!Rossol!!

Beschluss!über!die!Verleihung!des!Doktorgrades!vom:!22.11.2016!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Gewidmet!!

!

meinem!Großvater!Dietrich!Bunner,!!

meinem!Vater!Dieter!Schatz!!

und!!

meinem!Mann!Patrick!Jahnke!

Bibliographische.Beschreibung..Schatz,(Annika(Katrin(

(

Homöostatische.Mechanismen.der.CD4+.T<Zellgenese.bei.Rheumatoider.

Arthritis.

(

Universität(Leipzig,(Dissertation((

88(S.,(115(Lit.,(38(Abb.,(6(Tab.(

(

Referat:(

Die( Rheumatoide( Arthritis( ist( eine( Autoimmunerkrankung,( die( mit( grundlegenden(

Veränderungen( im( CD4+( TLZellpool( einhergeht.( Viele( Studien( konnten( zeigen,( dass( die(

Gruppe( der( TLHelferzellen( bei( erkrankten( Personen( vermehrt( Anzeichen( von( replikativer(

Seneszenz( und( das( adaptive( Immunsystem( deutliche( Zeichen( der( Immunoseneszenz(

aufweisen.(Als(zum(Teil(ursächlich(hierfür(konnte(ein(reduzierter(Thymusoutput(festgestellt(

werden.(Das(Ziel(der(vorliegenden(Studie(war(es,(aufbauend(auf(Erkenntnissen(von(Six(und(

Kollegen((anhand(einer(Lymphozytenvorläuferzelle,(die(im(peripheren(Blut(zirkuliert,(in(vivo(

in( der( Lage( ist,( den( Thymus( zu( besiedeln( und( sich( in( reife( TLZellen( zu( entwickeln,( den(

Thymusinput( abzuschätzen,( um( eine( defiziente( Thymusbesiedlung( als( eventuelle( Ursache(

des(reduzierten(Thymusoutput(festzustellen.(

Hierzu( wurde( das( Blut( ( von( 28( Patienten( mit( Rheumatoider( Arthritis( und(

altersentsprechenden( gesunden( Kontrollen( mittels( Durchflusszytometrie( auf( mehrere(

relevante( reife( TLHelferzellpopulationen,( naive( CD4+( TLZellen( und(benannte( lymphozytäre(

Vorläuferzelle( untersucht.( Es( konnten( dann( direkte( Vergleiche( des( prozentualen( Anteils(

bestimmter( TLHelferzellgruppen( zwischen( Erkrankten( und( Gesunden( gezogen( sowie(

Korrelationen(verschiedener(Zellgruppen(untereinander(hergestellt(werden.(

Die( gewonnenen( Ergebnisse(wurden(mit( der( hierzu( vorliegenden( Literatur( verglichen(und(

diskutiert.(

(

.

Inhaltsverzeichnis.

.

Abkürzungsverzeichnis..................................................................................................I((

Tabellen................................................................................................................................II((

Abbildungen......................................................................................................................III(

1.(Einleitung.......................................................................................................................1(

((1.1.(Epidemiologie,(Ätiologie(und(Pathogenese(der(Rheumatoiden(Arthritis........................1(

((1.2.(TLZellen(in(der(Pathogenese(der(Rheumatoiden(Arthritis...............................................2(

((1.3.(Die(TLZellgenese...............................................................................................................4(

(((((1.3.1(Entwicklung(im(Knochenmark:(von(der(hämatopoetischen(Stammzelle(zum(((

((((((((((((((common(lymphoid(progenitor((CLP)............................................................................4(

(((((1.3.2(Lymphoide(Vorläuferzellen(in(der(peripheren(Zirkulation..........................................6(

(((((1.3.3(Die(Entwicklung(von(CD4+(und(CD8+(einfach(positiven(TLZellen(im(Thymus..............7(

((1.4.(Immunoseneszenz(und(das(periphere(CD4+(TLZellkompartiment(bei(Rheumatoider((

(((((((((Arthritis..........................................................................................................................12(

(

2.(Material(und(Methoden.......................................................................................17(

((2.1.(Patientengut(und(gesunde(Kontrollen...........................................................................17(

((2.2.1.(Gewinnung(der(PBMCs...............................................................................................17(

((2.2.2.(Gewinnung(der(PBMCs(für(das(CD31LExperiment......................................................19(

((2.3.(Immunzytologische(Färbung..........................................................................................20(

((2.4.(Etablierung(der(Färbeansätze........................................................................................21((

((2.5.(Messung(am(Durchflusszytometer................................................................................22(

((2.6.(Auswertung(der(Messergebnisse(der(Durchflusszytometrie.........................................24(

(((((2.6.1(Messungen(1(bis(4.....................................................................................................24(

(((((2.6.2.(Messung(5................................................................................................................25(

(((((2.6.3.((Messung(6...............................................................................................................26(

2.7.(Erfassung(der(klinischen(Daten(der(Patienten.................................................................28(

2.8.(Statistische(Auswertung(der(Ergebnisse..........................................................................30(

(

3.(Ergebnisse...................................................................................................................31(

((3.1.(Beschreibung(des(CD4+(TLZellkompartiments(in(der(peripheren(Zirkulation................31(

(((((3.1.1.(CD4+CD8+(doppelt(positive(TLLymphozyten(in(der(peripheren(Zirkulation............31(

(((((3.1.2.(Frequenz(CD4+(CD28(negativer(TLLymphozyten(in(der(peripheren(Zirkulation.......33(

(((((3.1.3.(Untersuchung(der(CD85j(positiven(TLHelferzellpopulation.....................................35(

(((((3.1.4.(CD4+CD25+(TLZellen:(aktivierte(TLHelferzellen(und(TLregulatorische(Zellen...........38(

(((((3.1.5.(Quantifizierung(von(naiven(versus(MemoryLTLHelferzellen....................................40(

((3.2.(Recent(thymic(emigrants:(CD31+(thymic(naive(TLZellen...............................................42(

((3.3.(Zirkulierende(lymphoide(Progenitoren..........................................................................44(

((3.4.(CD34(positive(hämatopoetische(Stammzelle................................................................48(

(

4.(Diskussion....................................................................................................................52(

4.1.(Das(periphere(CD4+(TLZellkompartiment(bei(der(RA......................................................52(

4.2.(RALPatienten(weisen(eine(verringerte(Anzahl(von(RTEs(auf...........................................67(

4.3.(Die(Frequenz(von(Präthymozyten(im(peripheren(Blut(von(RALPatienten(ist(erhöht.......70(

(

5.(Zusammenfassung..................................................................................................76(

(

Literaturverzeichnis.....................................................................................................79(

(

Eigenständigkeitserklärung......................................................................................89(

(

(

Danksagung......................................................................................................................90(

(

(

.

.

.

(Abkürzungsverzeichnis.................................................................................I.

(

Abb.(AIRE((APC(ATM(bzw.(C(CCP(CCR(CD(CLP(CMP(CMV(CRP(CTL(CXCR(DAS(DMARD(DN(DP(EBV(EDTA(ELP(et(al.(EULAR(FITC(FKS(Flt3(FoxP3(g(GPCR(

Abbildung(autoimmune(regulator(Allophycocyanin,(antigen(presenting(cell((Ataxia(telangiectasia(mutated(beziehungsweise(Celcius(cyklisches(citrulliniertes(Peptid(CCLMotivLChemokinLRezeptor(cluster(of(differentiation(common(lymphoid(progenitor(common(myeloid(progenitor(Cytomegalievirus(CLreaktives(Protein(cytotoxic(T(lymphocytes(CXCLMotivLChemokinrezeptor(disease(activity(score(Disease(modifying(antiLrheumatic(Drugs(doppelt(negativ(doppelt(positiv(EpsteinLBarrLVirus(Ethylendiamintetraessigsäure(early(lymphoid(progenitor(et(alii(European(league(against(rheumatism(fluorescein(isothiocyanate(fetales(Kälberserum(fmsLlike(tyrosine(kinase(3(forkhead(box(P3(Gramm(GLProtein(gekoppelter(Rezeptor(

HLA((HSC(ICAM(IDO(IFN(Ig(IL(IL7Rα(ILTL2(IPEX((ITAM(ITIM(kDA(KIR(Lck(LILRB1(LIR1(LMPP(LTLHSC(LYP(MCP(MHC(ml(mM(mm(MPP(mRNA(µl(NKG2D(NKLZelle(PBMC(PBS(PE(PECAM(PIP(PSGL(PT(RA(RAG(RT(RTE(Runx(S(SEM(SFK(SP(

Humanes(Leukozytenantigen(hämatopoetische(Stammzelle(Intercellular(Adhesion(Molecule(IndolaminL2,3LDioxygenase(Interferon(Immunoglobulin(Interleukin(InterleukinL7LRezeptor(α(IgLlike(transcript(2(immunodysregulation(polyendocrinopathy(enteropathy(XLlinked(syndrome(immunoreceptor(tyrosineLbased(activation(motif(immunoreceptor(tyrosineLbased(inhibition(motif(Kilodalton(KillerLcell(immunoglobulinLlike(receptor(lymphocyteLspecific(protein(tyrosine(kinase(leukocyte(immunoglobulinLlike(receptor(1,(subfamily(B(leukocyte(immunoglobulinLlike(receptor(1(lymphoidLprimed(multipotent(progenitor(longLterm(haematopoietic(stem(cell(lymphoide(Phosphatase(Metacarpophalangealgelenk(major(histocompatibility(complex(Milliliter(millimolar(Millimeter(multipotent(progenitor(messengerRibonukleinsäure(Mikroliter(naturalLkiller(group(2,(member(D(Natürliche(Killerzelle(peripheral(blood(mononuclear(cell(PhosphateLbuffered(saline(Phycoerythrin(Platelet(endothelial(cell(adhesion(molecule(proximales(Interphalangealgelenk(PLSelectin(Glykoproteinligand(Präthymozyt(Rheumatoide(Arthritis(Recombination(activating(gene(Raumtemperatur(recent(thymic(emigrant(RuntLrelated(transcription(factor(Seite(standard(error(of(the(mean(Src(family(kinase(single(positive((

STLHSC(SW(TCR(TdT(TEN(ThPOK(TNFα(TREC(Treg(u.a.(VAS(VCAM(vs(z.B.(

shortLterm(heamatopoietic(stem(cell(swollen(joint(TLZellrezeptor(terminale(Desoxnukleotidytransferase(tender(joint(Th(inducing(POZLKruppel(Factor(Tumornekrosefaktor(α(TLcell(receptor(excision(circle(regulatorische(TLZelle(und(andere(visuelle(Analogskala(vascular(cell(adhesion(molecule(versus(zum(Beispiel(((((((

Tabellen..........................................................................................................II.

(

Abbildungen.................................................................................................III.

.

Tabelle(1( Hinweise(auf(die(entscheidende(Rolle(der(CD4+(TLZellen(für(die(Pathogenese(der(Rheumatoiden(Arthritis((

( S.(3(

Tabelle(2( Einteilung(der(MPPs(anhand(der(Expression(von(Flt3(und(VCAML1((

( S.(5(

Tabelle(3(( Einteilung(der(doppelt(negativen(Thymozyten(anhand(der(Expression(von(CD44,(CD25(und(CD117((

( S.(8(

Tabelle(4( Darstellung(der(wichtigsten(Thymozytenpopulationen(mit(den(grundlegenden(Entwicklungsschritten,(die(in(diesem(Stadium(stattfinden((

( S.(12(

Tabelle(5( Zusammensetzung(der(immunzytologischen(Färbeansätze(für(die(Experimente(1L5((

( S.(20(

Tabelle(6( Färbeansatz(zur(immunzytologischen(Färbung(für(das(6.(Experiment((

( S.(20(

Abb.(1( Histologisches( Bild( eines( juvenilen( Thymus( mit( schematischer(Darstellung( der( verschiedenen( Thymozytenpopulationen,( ihrer(Lokalisation(und(ihrer(Wanderungsrichtung((

( S.(11(

Abb.(2( Zusammenfassung( und( schematische( Darstellung( der( möglichen(pathogenetischen( Schritte( hin( zur( Entstehung(der(Veränderungen(des(CD4+(TLZellkompartimentes(bei(Rheumatoider(Arthritis((

( S.(16(

Abb.(3( Schematische( Darstellung( der( Tubes( vor( und( nach( Zentrifugation( von(verdünntem(Vollblut(auf((FicollLLösung((

( S.(18(

Abb.(4( Fluoreszenzspektren( gebräuchlicher( Fluorochrome( aus( „Einführung( in(die(Durchflusszytometrie“(BD(Biosciences(Customer(Education((

( S.(23(

Abb.(5( Darstellung( der( einzelnen( Schritte( zur( Auswertung( des( CD31LExperiments(mittels(Dotplots((generiert(mit(dem(Programm(WinMDI)((

( S.(25/26(

Abb.(6( Darstellung( der( einzelnen( Schritte( zur( Auswertung( des( ProgenitorLExperiments( mittels( Dotplots( (Beispieldotplots( generiert( mit( dem(Programm(WinMDI)((

( S.(27(

Abb.(7( Standardisierter( Erfassungsbogen( zur( Erhebung( der( klinischen(Parameter(der(RALPatienten((

( S.(29(

Abb.(8( Boxplot.( Vergleich( des( prozentualen( Anteils( der( CD4+CD8+( doppelt(positiven( TLZellen,( markiert( mittels( PCL5( CD4L( und( FITC( CD8L(Antikörpern( an( der( Gesamtlymphozytenzahl( zwischen( RALPatienten(und(gesunden(Kontrollen(((

( S.(32(

Abb.(9( Korrelation( des( Anteils( CD4+CD8+( doppelt( positiver( TLZellen(mit( dem(Alter(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(32(

Abb.(10( Korrelation( des( Anteils( CD4+CD8+( doppelt( positiver( TLZellen(mit( dem(Alter(bei(gesunden(Kontrollen(((

( S.(33(

Abb.(11( Korrelation( der( CD28Ldefizienten( CD4+( TLZellen( mit( dem( Alter( bei((Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(34(

Abb.(12( Korrelation( der( CD28Ldefizienten( CD4+( TLZellen( mit( dem( Alter( bei((gesunden(Kontrollen(((

( S.(34(

Abb.(13( Korrelation( der( CD4+CD85j+( TLZellen(mit( den( CD4+CD28L( TLZellen( bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(36(

Abb.(14( Korrelation( der( CD4+CD85j+( TLZellen(mit( den( CD4+CD28L( TLZellen( bei(gesunden(Kontrollen(((

( S.(36(

Abb.(15( Korrelation( der( CD4+CD28L( TLZellen( mit( den( CD4+CD8+( doppelt(positiven(TLZellen(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(37(

Abb.(16( Korrelation( der( CD4+CD85j+( TLZellen( mit( den( CD4+CD8+( doppelt(positiven(TLZellen(bei((Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(37(

Abb.(17( Boxplot.(Vergleich(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD25low(aktivierter(TLZellen( an( der( CD4+( Lymphozytenzahl( bei( RALPatienten( und( gesunden(Kontrollen((

( S.(38(

Abb.(18( Korrelation( des( Alters( mit( CD4+CD25low( aktivierten( TLZellen( bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(39(

Abb.(19( Boxplot.( Vergleich( des( prozentualen( Anteils( CD4+CD25high(regulatorischer( TLZellen( an( der( CD4+( Lymphozytenzahl( bei( RALPatienten(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(39(

Abb.(20( Boxplot.(Vergleich(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD45RA+(TLZellen(an(der(Gesamtzahl(CD4+(TLZellen(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(41(

Abb.(21( Boxplot.(Vergleich(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD45RO+(TLZellen(an(der(Gesamtzahl(CD4+(TLZellen(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(41(

Abb.(22( Boxplot.(Vergleich(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD45RA+CD45RO+(TLZellen( an( der( Gesamtzahl( CD4+( TLZellen( bei( Patienten( mit(Rheumatoider(Arthritis(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(42(

Abb.(23( Boxplot.( Vergleich( des( prozentualen( Anteils( CD4+CD45RA+CD31+( TLZellen( an( der( Gesamtzahl( ( CD4+( TLZellen( zwischen( RALPatienten( und(gesunden(Kontrollen(

( S.(43(

(Abb.(24(

(Korrelation( des( Alters( mit( dem( prozentualen( Anteil(CD4+CD45RA+CD31+( TLZellen( an( der( Gesamtzahl( ( CD4+( TLZellen( bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis((((

( (

S.(43(

Abb.(25( Korrelation( des( Alters( mit( dem( prozentualen( Anteil(CD4+CD45RA+CD31+( TLZellen( an( der( Gesamtzahl( ( CD4+( TLZellen( bei(gesunden(Kontrollen(((

( S.(44(

Abb.(26( Boxplot.(Vergleich(der(Anzahl(der(Präthymozyten((PT)(an(1x106(PBMCs(zwischen(RALPatienten(und(gesunden(Kontrollen((((((((((((((((((((((((((((((

( S.(45(

Abb.(27( Boxplot.(Vergleich(der(Anzahl(der(Präthymozyten((PT)(an(1x106(PBMCs(zwischen( shared( epitope( positiven( RALPatienten( und( gesunden(

( S.(45(

Kontrollen((((((((((((((((((((((((((((((

Abb.(28( Korrelation(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD45RA+CD31+(TLZellen(mit(der( Anzahl( des( Präthymozyten( an( 1x106( PBMCs( bei( gesunden(Kontrollen(((

( S.(46(

Abb.(29( Korrelation(des(prozentualen(Anteils(CD4+CD45RA+CD31+(TLZellen(mit(der(Anzahl(des(Präthymozyten(an(1x106(PBMCs(bei(RALPatienten(((

( S.(47(

Abb.(30( Korrelation( des( Alters( mit( der( Präthymozytenzahl( bei( gesunden(Kontrollen(((

( S.(47(

Abb.(31( Korrelation(des(Alters(mit(der(Präthymozytenzahl(bei(RALPatienten(((

( S.(48(

Abb.(32( Boxplot.( Vergleich( des( prozentualen( Anteils( aller( CD34+(hämatopoetischer( Stammzellen(an(den(PBMCs( zwischen(RALPatienten(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(49(

Abb.(33( Boxplot.( Vergleich( des( prozentualen( Anteils( CD34+( lineageLnegativer(hämatopoetischen(Stammzellen(an(den(PBMCs(zwischen(RALPatienten(und(gesunden(Kontrollen((

( S.(49(

Abb.(34( Korrelation(des(Alters(mit(dem(Anteil(aller(CD34+(Stammzellen(an(den(PBMCs(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis(((

( S.(50(

Abb.(35(( Korrelation(des(Alters(mit(dem(Anteil(aller(CD34+(Stammzellen(an(den(PBMCs(bei(gesunden(Kontrollen(((

( S.(50(

Abb.(36( Korrelation( des( Alters( mit( dem( Anteil( lineageLnegativer( CD34+(Stammzellen(an(den(PBMCs(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis((

( S.(51(

(Abb.(37(

(Korrelation( des( Alters( mit( dem( Anteil( lineageLnegativer( CD34+(Stammzellen(an(den(PBMCs(bei(Patienten(mit(Rheumatoider(Arthritis((

( (

S.(51(

Abb.(38( Normale( und( immunoseneszente( CD4+( TLZelle( mit( einer(antigenpräsentierenden(Zelle((APC)(

( S.(56(

(

!

!

!Einleitung)

!! !

1!

1.#Einleitung#

##

1.1.#Epidemiologie,#Ätiologie#und#Pathogenese#der#Rheumatoiden#Arthritis#

#Mit) einer) Prävalenz) von) etwa) 1%) in) den)westlichen) Industrieländern) ist) die) Rheumatoide)

Arthritis)(RA))eine)der)häufigsten)systemischen)Autoimmunerkrankungen)und)die)häufigste)

Arthritisform.) In) Deutschland) beläuft) sich) die) Zahl) der) Erkrankten) dementsprechend) auf)

rund)800)000)Menschen.)Die)RA)hat)die)höchste)Inzidenz)in)der)Altersgruppe)der)55K)bis)75K

Jährigen,)kann)aber)ab)etwa)dem)30.)Lebensjahr)bis)nach)dem)80.)Lebensjahr)auftreten.)Die)

Geschlechterverteilung)ist)mit)2)–)3):)1)zugunsten)der)Frauen)verschoben.))

Die)Lebenserwartung)von)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis)liegt)etwa)sieben)Jahre)unter)

der)der)Allgemeinbevölkerung.)Die)genaue)Ursache)der)Entstehung)der)Erkrankung)ist)nicht)

vollständig) bekannt.) Als) mögliche) auslösende) Antigene) dieser) Autoimmunerkrankung)

werden) zum) einen) exogene)Antigene,)wie) das) EpsteinKBarrKVirus) oder)HeatKShockKProtein)

aus) Mykobakterien) zum) anderen) aber) auch) endogene) Autoantigene) wie) zum) Beispiel)

abnormes)Kollagen)II)oder) IgG)(IgG,) Immunglobulin)G))diskutiert.)Dass)genetische)Faktoren)

eine)Rolle)spielen,)ist)lange)bekannt,)so)ist)die)RA)mit)gewissen)HLA)IIKTypen)(HLA,)humanes)

Leukozytenantigen)) assoziiert.) Die) Rheumatoide) Arthritis) präsentiert) sich) als) chronisch)

destruktive) Polyarthritis,) die) auch) remittierend) oder) schubweise) verlaufen) kann.)

Typischerweise)sind)die)kleinen)Gelenke)der)Hand,)insbesondere)PIPK)und)MCPKGelenke)(PIP,)

Proximales) Interphalangealgelenk;) MCP,) Metacarpophalangealgelenk)) symmetrisch)

betroffen.) Häufig) befallen) sind) des) Weiteren) die) HandK,) KnieK,) SprungK,) EllbogenK) und)

Zehengelenke.)Die)Synovialitis) steht) im)Zentrum)des)entzündlichen)Gelenkprozesses.)CD4+)

TKZellen) (CD,) cluster) of) differentiation)) aktivieren) die) Makrophagen) (Typ) A) Synoviozyten))

und) Fibroblasten) (Typ) B) Synoviozyten)) der) Synovia) sowie) BKZellen) und) Osteoklasten.) Die)

unter) physiologischen) Bedingungen) einschichtige) Synovialis) wird) zellulär) infiltriert) und)

entwickelt) sich) zum) sogenannten) Pannus,) der) im) weiteren) Verlauf) den) subchondralen)

Knochen) erodiert.) Typ) A) Synoviozyten) sezernieren) große) Mengen) an)

Entzündungsmediatoren,)beispielsweise)TNFα)(TNFα,)Tumornekrosefaktor)α))und)ILK1)und)K

6) (IL,) Interleukin).) Daraufhin) wird) eine) Entzündungskaskade) ausgelöst) mit) weiterer)

Aktivierung)von)BK)und)TKZellen.)Die)Typ)B)Synoviozyten)setzen)MatrixKMetalloproteinasen)

frei,) sodass) es) zur) Zerstörung) von) Faserknorpel,) hyalinem) Knorpel) und) gelenknahem)

!

!

!Einleitung)

!! !

2!

Knochen) kommt.) Zusammen) mit) der) gesteigerten) Osteoklastenaktivität) bewirkt) dies)

röntgenologisch) sichtbare) Gelenkerosionen) sowie) eine) gelenknahe) Osteoporose.) Klinisch)

manifestiert) sich) die) Arthritis) bzw.) Synovialitis) mit) Schmerzen,) Schwellung) und)

Überwärmung.) Im)Verlauf)kann)es)zu)Subluxation,)Mutilation,)mit)typischer)Ulnardeviation)

der) Finger) und)Ankylose) der) betroffenen)Gelenke) kommen.) Auch) periartikuläres)Gewebe,)

Muskeln) und) Sehnen) können) in) den) entzündlichen) Prozess) einbezogen) werden.)

Extraartikuläre) Manifestationen) treten) bei) etwa) 30%) der) RAKPatienten) auf.) Als) am)

häufigsten) auftretend) sind) hier) die) Rheumaknoten) zu) nennen,) die) typischerweise) an) den)

Streckseiten)der)Gelenke,) aber) auch) in) inneren)Organen) zu) finden) sind.)Weitere)mögliche)

systemische)Manifestationen) sind) Pleuritis) und) Perikarditis,) Lymphopenie,) Splenomegalie,)

Hepatomegalie,) interstitielle) Pneumonie) mit) Fibrose,) sekundäres) SjögrenKSyndrom,)

rheumatoide)Vaskulitis)und)eine)Amyloidose)als)Folge)der)chronischen)Entzündung.)

)

)

1.2.#T;Zellen#in#der#Pathogenese#der#Rheumatoiden#Arthritis#

#Wie) oben) beschrieben) scheint) den) TKZellen,) insbesondere) den) CD4+) TKHelferzellen,) eine)

entscheidende)Rolle)in)der)Pathogenese)der)Rheumatoiden)Arthritis)zuzukommen.))

Hierfür)spricht)die)erwähnte)genetische)Disposition:)HLA)II)KMoleküle)sind)Glykoproteine,)die)

aus)zwei)Peptidketten)bestehen.)Sie)sind)auf)der)Zellmembran)von)phagozytierenden)Zellen)

zu) finden) und) dienen) der) Präsentation) von) Antigenen) an) CD4+) TKHelferzellen.) Die)

Assoziation)zwischen)RA)und)dem)HLAKD)Genlocus)wurde)erstmals)von)Stastny)beschrieben)

(Stastny)1976)und)1978))und)später)durch)Gregersen)und)Winchester)zur)„shared)epitope“K

Hypothese) weiterentwickelt.) Diese) Hypothese) erklärt) das) gehäufte) Auftreten) der)

Rheumatoiden) Arthritis) mit) bestimmten) HLAKDR4) und) KDR1) Antigenvarianten) durch) eine)

identische)Aminosäurensequenz)im)Bereich)der)HLAKDRβKKette)des)aus)einer)αK)und)einer)βK

Kette) bestehenden) HLAKDimers) (Gregersen) et) al.) 1987).) Das) HLAKshared) epitope) ist) der)

größte) bekannte) Risikofaktor) für) die) Entwicklung) einer) RA)mit) einem) relativen) Risiko) von)

etwa)5K6)bei)Homozygoten)(Thomson)et)al.)1999,)Costenbader)et)al.)2008).)Ebenso)geht)die)

Homozygotie)einiger)dieser)HLAKAntigenvarianten,) insbesondere)HLAKDRB1*0401)und)HLAK

Dw4/Dw14) compound) Heterozygotie,) mit) einer) erhöhten) Krankheitsschwere) einher)

(Weyand)et)al.)1992,)Wordsworth)et)al.)1992).)

!

!

!Einleitung)

!! !

3!

Die)Entdeckung,)dass)verschiedene)Polymorphismen)des)PTPN22KGens,)das)für)die)ProteinK

Tyrosinphosphatase)LYP)(Lymphoide)Phosphatase))kodiert,)mit)der)RA)vergesellschaftet)sind,)

spricht) ebenfalls) für) die) entscheidende) Rolle) der) TKZellen) in) der) Pathogenese) der) RA.) Die)

lymphoide) Phosphatase) ist) ein) zytosolisches) Protein,) das) die) TCRKvermittelte) (TCR,) T) Cell)

Receptor))TKZellaktivierung)in)starkem)Maße)herunterreguliert.)Diese)Eigenschaft)ist)bei)den)

mit)RA)vergesellschafteten)Varianten)des)Gens)eingeschränkt)(Begovich)et)al.)2004,)Carlton)

et)al.)2005).)

Ein)sehr)anschauliches)Beispiel)für)die)große)pathogenetische)Rolle))der)CD4+)TKZellen)in)der)

Rheumatoiden) Arthritis) ist) die) Tatsache,) dass) es) zur) Anreicherung) dieser) in) der)

Synovialmembran)und)Synovialflüssigkeit)bei)betroffenen)Patienten)kommt)(Van)Boxel)und)

Paget)1975).)TKZellen)machen)etwa)40%)der)infiltrierenden)Zellen)im)Synovium)aus)(Toh)und)

Miossec)2007),)wobei) sogar)eine)positive)Korrelation) zwischen)Gelenkschaden)und)Anzahl)

der) TKZellen) in) der) Synovialmembran) nachgewiesen) werden) konnte) (Kraan) et) al.) 2004).)

Schließlich)ergibt)sich)ein)weiterer)Hinweis)auf)die)essentielle)Rolle)der)(CD4+))TKZellen)in)der)

Pathogenese) der) RA) aus) der) guten) therapeutischen) Wirkung) von) Präparaten,) wie) zum)

Beispiel) Abatacept,) die) die)Moleküle) CD80) oder) CD86) auf) antigenKpräsentierenden) Zellen))

blockieren.) Deren) Signale,) die) durch) Bindung) an) CD28,) das) kostimulatorische)Molekül) auf)

der) Oberfläche) von) CD8+) und) CD4+) TKZellen,) ausgelöst) werden,) sind) für) die) volle) TK

Zellaktivierung)nötig)(Moreland)et)al.)2002,)Emery)2003).)

)

)

)

)

Tabelle)1:)nach)Skapenko)et)al.)2005)

#

#

#

#

Hinweise#auf#die#entscheidende#Rolle#der#CD4+#T;Zellen#für#die#Pathogenese#der#Rheumatoiden#Arthritis#K)Assoziation)der)RA)mit)verschiedenen)HLAKDR4)und)HLAKDR1)Subtypen)(shared)epitope))K)Anreicherung)von)CD4+)TKZellen)in)peripherem)Blut,)Synovialmembran)und))Synovialflüssigkeit)K)klinische)Erfolge)von)gegen)TKZellen)gerichteten)Therapien)

!

!

!Einleitung)

!! !

4!

1.3.#Die#T;Zellgenese#

#

1.3.1#Entwicklung#im#Knochenmark:#von#der#hämatopoetischen#Stammzelle#zum#common#

lymphoid#progenitor#(CLP)#

#

Die)Hämatopoese,)also)die)Entwicklung)aller)das)periphere)Blut)ausmachenden)Zellen)und)

somit) auch) der) TKZellen,) beginnt) im) Knochenmark) mit) pluripotenten) CD34Kpositiven)

hämatopoetischen) Stammzellen) (HSC,) hematopoietic) stem) cells).) CD34) ist) ein)

Oberflächenmolekül) der) SialomucinKFamilie,) das) auf) rund) 1K3%) der) Knochenmarkzellen)

exprimiert)wird.) Diese) CD34+) Stammzellen) sind) in) der) Lage,) das) hämatopoetische) System)

nach) einer) myeloablativen) Therapie) komplett) wiederherzustellen) (Calloni) et) al.) 2013,)

Nakauchi) 1996).) Sie) werden) auch) „LSKKZellen“) genannt,) da) sie) negativ) für) solche)Marker)

sind,)die)einen)späteren)Entwicklungsweg)kennzeichnen)oder)festlegen)(L,)Lineage))und)ScaK

1) (S)) und) den) Zytokinrezeptor) Kit) (K)) exprimieren) (Zlotoff) und) Bhandoola) 2011).) Sie) sind)

selbsterneuernd.) Das) heißt,) sie) können) proliferieren) und) dabei) alle) Eigenschaften) und)

Fähigkeiten)von)der)Elterngeneration)auf)die)Tochtergeneration)übertragen.)Die)Entstehung)

der)verschiedenen)Blutzellen)aus)HSCs)geht)mit)dem)sukzessiven)Verlust)der)Fähigkeit,)sich)

in) andere) Zelllinien) zu)entwickeln,) einher.)Der) erste) Schritt) ist) der) allmähliche)Verlust) des)

Selbsterneuerungspotentials.) Anhand) dieses) Merkmals) sind) die) HSCs) in) zwei) Gruppen) zu)

unterteilen:) Die) so) genannten) „longKterm) HSCs“) (LTKHSC)) bewahren) die) Fähigkeit) zur)

Selbsterneuerung)lebenslang)und)sind)solch)frühe)Vorläuferzellen)der)Hämatopoese,)dass)sie)

noch)nicht)den)Oberflächenmarker)CD34)exprimieren.) )Die)„shortKterm)HSCs“)(STKHSC))auf)

der) anderen) Seite) sind)nur)über) einen) gewissen) Zeitraum)hinweg) in)der) Lage,) Zellen) aller)

hämatopoetischen) Zellreihen) hervorzubringen.) Sie) entwickeln) sich) im) Weiteren) zu) den)

sogenannten)MPPs,) „mulitpotenten) Progenitorzellen“,) welche) zwar) alle) Zellen) des) Blutes)

generieren,) die) Hämatopoese) aber) nicht) oder) nur) für) sehr) kurze) Zeit) aufrecht) erhalten)

können,)da)ihnen)das)Selbsterneuerungspotential)fehlt.)

MPPs) sind) eine) heterogene) Gruppe,) die) sich) beispielsweise) anhand) der) Expression) der)

Proteine) Flt3) (Flt,) FmsKlike) tyrosine) kinase)) und) VCAMK1) (VCAM,) vascular) cell) adhesion)

molecule)) in)drei)Untergruppen)mit) unterschiedlichen)Entwicklungspotentialen)unterteilen)

lassen)(Lai)und)Kondo)2008).))

)

!

!

!Einleitung)

!! !

5!

)

)

)))))))))

))))))))Tabelle)2:)Einteilung)der)MPPs)anhand)der)Expression)von)Flt3)und)VCAMK1)(nach)Lai)und)Kondo)2008))

)

MPPs) ihrerseits) entwickeln) sich) zu) den) sogenannten) „early) lymphoid) progenitors“) (ELP,)

frühe) lymphoide) Vorläuferzelle)) und) „lymphoidKprimed) multipotent) progenitors“) (LMPP,))

lymphopoetisch) ausgerichtete) multipotente) Vorläuferzelle),) welche) sich) durch) die)

Expression)von) lymphozytenspezifischen)Genen,)wie)RAGK1)(RAG,)recombination)activating)

gene))und) ILK7Rα) (αKKette)des) Interleukin)7)Rezeptor),)auszeichnen.) Im)klassischen)Modell)

der)Hämatopoese)wird) von) „common) lymphoid)progenitors“) (CLP))und) „common)myeloid)

progenitors“) (CMP)) gesprochen.) Dies) sind) Zellen,) die) entsprechend) alle) Zellen) der)

lymphoiden)oder)alle)Zellen)der)myeloiden)Zellreihe)generieren)können.)CLPs)entstehen)mit)

dem) Zwischenschritt) von) ELP) und) LMPPs) aus) den) in) der) Entwicklung) am) weitesten)

fortgeschrittenen) MPPs) der) dritten) Gruppe) (siehe) Tabelle) 2).) LMPPs) und) CLPs) sind)

diejenigen)Zellen)im)Knochenmark,)auf)denen)zum)ersten)Mal)die)für)die)Thymusbesiedlung)

essentiellen) Oberflächenrezeptoren) CCR7) und) CCR9) (CCR,) CCKMotivKChemokinKRezeptor))

nachweisbar) sind.)Ursprünglich)war)man)der)Meinung,)dass)CLPs)kein)myeloides)Potential)

mehr)besäßen.)Inzwischen)ist)bekannt,)dass)die)Gruppe)der)common)lymphoid)progenitors)

heterogen) ist) und) multiple) Untergruppen) mit) unterschiedlichen) Entwicklungspotentialen)

beinhaltet)(Zlotoff)und)Bhandoola)2011).))

)

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))

))))))))

) Expressionsmuster# Entwicklungspotential#1.) Flt3lowVCAMK1+) Entwicklungspotential)in)alle)hämatopoetischen)Zellreihen)2.) Flt3highVCAMK1+) Verlust)eines)Großteils)des)Potentials)zur)Entwicklung)von)

Megakaryozyten)und)Erythrozyten)3.) Flt3highVCAMK1K) geringe)Fähigkeit)zur)Entwicklung)in)die)myeloide)Linie,)hohes))

lymphoides)Potential)

!

!

!Einleitung)

!! !

6!

1.3.2#Lymphoide#Vorläuferzellen#in#der#peripheren#Zirkulation#

#

Täglich)wandern)nach)Schätzungen)etwa)10)bis)100)Zellen)in)den)Thymus)ein)(Petrie))2007).)

Diese)Zellen)müssen)aus)dem)Knochenmark)in)die)periphere)Zirkulation)und)von)dort)in)den)

Thymus) gelangen.) Sowohl) HSCs) als) auch) MPPs,) LMPPs) und) CLPs) konnten) im) Blut)

nachgewiesen) werden) (Zlotoff) und) Bhandoola) 2011).) ) Offen) blieben) bislang) jedoch) die)

Fragen,)welche)Zellen)diejenigen)sind,)die)unter)physiologischen)Bedingungen)den)Thymus)

besiedeln)und)die)TKZellgenese)aufrechterhalten)und)ob)es)sich)hierbei)nicht)etwa)auch)um)

eine) Vielzahl) verschiedener) Zellen) handeln) könnte.) Unter) experimentellen) Bedingungen)

konnte) gezeigt) werden,) dass) es) verschiedenen) Vorläuferzellen) aus) dem) Knochenmark)

gelingt,)im)Thymus)TKZellen)zu)generieren)(Bhandoola)und)Sambandam)2006).)

)Six)et)al.)ist)es)gelungen)nachzuweisen,)dass)die,)erstmals)von)Hokland)et)al.)beschriebenen,)

im)Knochenmark)nachgewiesenen,)LinK)CD34+)und)CD10+)CLPs)(Hokland)et)al.)1987))ebenso)

in) der) peripheren) Zirkulation) wie) im) Thymus) anzutreffen) sind.) Diese) Zellen) weisen) kein)

erythroides) und) kaum) myeloides) Potential) auf.) Stattdessen) entwickeln) sie) sich,) wenn) in)

Kultur)gebracht,)schnell)und)effektiv)zu)CD4+CD8+)doppeltpositiven)TKZellen.)Diese)CLPs,)die)

das)gesamte)Leben)hindurch)im)Blut)nachgewiesen)werden)können,)zeichnen)sich)weiterhin)

durch)die)Expression)von)den)Lymphozytenmarkern)Terminale)Desoxynukleotidyltransferase)

(TdT)) und) InterleukinK7KRezeptor) αKKette) aus.) Letztere) unterdrückt) während) der)

Differenzierung) von) TKZellen) im) Thymus) apoptotische) Signale) und) ist) für) die) Entwicklung)

eines)reifen)TKZellphänotyps)unerlässlich)ist.)Ebenso)exprimieren)sie)RAG)1)und)die)εKKette)

des)CD3KProteinkomplexes,)der)der)Marker)aller)TKZellen) ist.)Des)Weiteren)konnte)auf)der)

Oberfläche)von)einer)Großzahl)dieser)„Präthymozyten“))CCR7)nachgewiesen)werden)(Six)et)

al.) 2007).) Dieses) Protein) ist) für) die) Besiedlung) des) Thymus) essentiell) und) wird)

bekanntermaßen) von) den) frühesten) Thymozyten) exprimiert.) Der) Phänotyp) und) die)

lymphopoetischen) Eigenschaften) dieser) LinKCD34+CD10+CD24K) Zellen) legen) nahe,) dass) sie)

tatsächlich) die) unmittelbaren) Thymozytenvorläuferzellen) darstellen) könnten,) wofür) im)

Rahmen)von)Experimenten)für)diese)Arbeit)sowie)der)Fortführung)derselben)durch)Wagner)

und)Kollegen)(Wagner)et)al.)2013))weitere)Hinweise)gefunden)werden)konnten)(siehe)unten)

Diskussion)4.3).)

#

!

!

!Einleitung)

!! !

7!

#

1.3.3#Die#Entwicklung#von#CD4+#und#CD8+#einfach#positiven#T;Zellen#im#Thymus#

#

Die)TKZellgenese)ist)ein)komplexer)Prozess,)der)die)fortwährende)Wanderung,)die)Expression)

von) verschiedensten) Oberflächenmarkern) und) die) Interaktion) mit) vielen,) zum) Teil) bisher)

noch)unbekannten)Molekülen)der)heranreifenden)Zellen)beinhaltet.)Aus)dem)Knochenmark)

wandern)multipotente)Vorläuferzellen)in)den)Thymus)ein.)Hier)beginnen)die)Thymozyten)als)

„doppelt)negative“)Zellen)(DN),)das)heißt)als)Zellen,)die)weder)CD4)noch)CD8)exprimieren,)

ihren) Weg) und) entwickeln) sich) in) einem) Zeitraum) von) etwa) 23) Tagen) über) den)

Zwischenschritt)als)„doppelt)positive“)Zellen)(DP),)also)Zellen,)die)sowohl)CD4)als)auch)CD8)

exprimieren,) zu) reifen,) selbsttoleranten,) eigenKMHCKbegrenzten) (MHC,) major)

histocompatibility) complex),) kompetenten,) einfach) positiven) (SP,) single) positive)) TKZellen,)

die)nur)einen,)der)für)TKZellen)charakteristischen)Oberflächenmarker)exprimieren.))

Über)spezialisierte)postkapilläre)Venolen)in)der)corticomedullären)Grenzschicht)gelangen)die)

lymphozytären)Vorläuferzellen)in)den)Thymus.)Dieses)sogenannte)„Homing“)wird)durch)eine)

Reihe) von) Zytokinen,) Adhäsionsmolekülen) und) Chemoattractants,) zum) Beispiel) PSGLK1)

(PSGL,) PKselectin) glycoprotein) ligand),) PKSelektin,) Integrinen,)CCR9,)CCR7)und)5)und)CD44,)

welches) von) den) frühesten) bekannten) intrathymischen) Vorläuferzellen) exprimiert) wird,)

vermittelt)(Petrie)und)ZúñigaKPflücker)2007,)Love)und)Bhandoola)2011).)

Die)Besiedlung)des)Thymus)vollzieht)sich)vermutlich)in)einem)dreistufigen)Prozess:))

1.)Rollen)entlang)der)endothelialen)Monoschicht)durch)Interaktion)von)PKSelektin)mit)seinen))))

))))Liganden))

2.)Aktivierung)von)Integrinen)α4β1)und)αLβ2)

3.)Festes)Binden)der)Vorläuferzellen)an)das)Endothel)über)VCAMK1)und)ICAMK1)(ICAM,)))

)))))intercellular)adhesion)molecule))

(Scimone)et)al.)2006).)

Während) ihrer) Verweildauer) im) Thymus) durchwandern) die) Thymozyten) das) Organ) in)

mehreren) koordinierten) Schritten) und) durchlaufen) dabei) die) essentiellen))

Entwicklungsschritte)hin)zur)reifen)TKZelle.)

Zellen,)die)gerade)den)Thymus)besiedelt)haben,)befinden)sich)also)in)der)corticomedullären)

Grenzschicht) (oder) perimedullärer) Cortex).) Sie) sind) definiert) als) CD3K,) CD4K,) und) CD8K)

negativ) und)werden) als) „doppelt) negativ“) bezeichnet.) Die) Gruppe) der) DNKZellen) ist) nicht)

!

!

!Einleitung)

!! !

8!

einheitlich) und) lässt) sich) anhand) ihrer) Expression) von) CD44) und) CD25) in) drei) weitere)

Untergruppen)unterteilen.)

)

)))))))

)

)

)

)

Tabelle)3:)Einteilung)der)doppelt)negativen)Thymozyten)anhand)der)Expression)von)CD44,)CD25)und)CD117)

)

Nur) die) DN1KZellen,) die) ) CD44,) aber) kein) CD25) exprimieren,) befinden) sich) in) der)

corticomedullären)Grenzschicht.)Hier)durchlaufen)die)Thymozyten)rund)zehn)Zellzyklen.)Ihre)

Gesamtzahl)erhöht)sich)so)um)circa)das)1000Kfache.)Insgesamt)befinden)sich)die)Thymozyten)

für)etwa)neun)bis)elf)Tage)im)DN1KStadium.)

Mit) dem)Übergang) in) das) DN2KStadium) beginnen) die) Zellen) auch) CD25) (ILK2Rα)) auf) ihrer)

Zelloberfläche)zu)exprimieren.)Diese)CD25)positiven)DN2KZellen)befinden)sich)in)der)inneren)

Hälfte)des)Cortex,) ausgeschlossen)der) corticomedullären)Grenzschicht.)Die) Expression) von)

RAG)wird) in)diesem)Stadium)der)TKZellentwicklung)signifikant)hochreguliert)und)es)kommt)

zur)ersten)Neuanordnung))der)TCRγK)und)TCRδK)Gene)und)somit)zur)Entscheidung)zwischen)

α/βK)und)γ/δK)Entwicklungsrichtung)der)TKZellen.))

Der)Migrationsprozess)durch)den)Thymus)setzt)sich)mit)der)Entwicklung)von)DN3KZellen)aus)

DN2KZellen)fort.)Die)Zellen)wandern)Richtung)Kapsel,)sodass)sich)die)Thymozyten)des)DN3K

Stadiums)in)der)äußeren)Hälfte)des)Cortex)befinden.)Im)Stadium)DN3)ist)die)Expression)von)

CD44)herunterreguliert.)Diese)Zellen)exprimieren)nur)noch)CD25.)Das)herausragend)wichtige)

Ereignis)in)diesem)Stadium)der)TKZellentwicklung)ist)das)Rearrangement)des)TCRβKGenlocus)

auf) Chromosom) 7) und) die) damit) verbundene) endgültige) Festlegung) auf) den) TKZellK) und)

TCRα/βK) Entwicklungsweg.) Zellen) des) DN3KStadiums) sind) nicht) mehr) in) der) Lage,) sich) in)

andere) Zellen) als) TKZellen) zu) entwickeln.) Die) für) diese) Rekombination) benötigten) Signale)

sind) noch) weitestgehend) unbekannt,) allein) für) InterleukinK7) konnte) eine) entscheidende)

Rolle) bewiesen) werden.) DN3KZellen) mit) rekombiniertem) TCRβKGenlocus) wandern) weiter)

Richtung) Kapsel.) Dieser) nächste) Wanderungsschritt) ist) mit) dramatischen) Veränderungen)

und)Fortschritten)in)der)Entwicklung)der)DNKZelle)zur)DPKZelle)verbunden.))

) DN1# DN2# DN3# PräDP#(DN4)#

CD44)) +) +) K) K)

CD25)(IL2Rα)) K) +) +) K)

CD117) ++) ++) +) K)

!

!

!Einleitung)

!! !

9!

In) der) subkapsulären) Zone) sammeln) sich) die) Zellen) des) späten) DN3KStadiums,) bei) denen)

intrazellulär) das) TCRβKProtein) nachgewiesen) werden) kann.) War) die) V(D)JKRekombination)

produktiv,)kann)also)ein)TCRβKProtein)synthetisiert)werden,)wird)auf)der)Zelloberfläche)der)

Thymozyten) ein) PräKTKZellKRezeptor) exprimiert.) War) die) Rekombination) nicht) produktiv,)

stirbt)die)Zelle)an)diesem)Punkt)ab.)Die)Funktionen)des)PräKTCR)sind)entscheidend) für)die)

Weiterentwicklung)der)DN3KZellen.)Sie)liegen))in)der)Regulation)der)Zellproliferation)sowie)in)

der)Bewahrung))von)TKZellen,)die)die)TCRKβKKetten)exprimieren,)vor)dem)Zelltod)und)somit)

in)ihrer)Selektion)für)die)weitere)Reifung.)Hierfür)benötigt)der)PräKTCR)keine)Kostimulatoren)

oder)Liganden.))

Eine)ebenfalls)in)der)subkapsulären)Zone)verweilende)Zellpopulation)besteht)aus)denjenigen)

PräKTKZellen,)die)zusätzlich)zur)Herunterregulation)von)CD44)auch)die)Expression)von)CD25)

eingestellt) haben.) Früher) wurden) diese) Zellen,) die) weder) CD44) noch) CD25) auf) ihrer)

Oberfläche) exprimieren,) als) DN4KZellen) bezeichnet.) Dies) ist) allerdings) eine) ungenaue)

Bezeichnung,) da) mit) der) Beendigung) der) CD25KExpression) nach) dem) DN3K) Stadium) alle)

Zellen,)die)sich) in)α/βKRichtung)entwickeln,) in)niedrigem)Grade)CD4)und)CD8)exprimieren.)

Weil)sich)diese)CD25K,)CD44K)negativen)Zellen)in)vitro)spontan)und)schnell)in)typische)CD4+)

CD8+) doppelt) positive) Thymozyten) entwickeln,) können) sie) als) präDPKZellen) bezeichnet)

werden.) In) diesem) frühen) DPKStadium) der) TKZellentwicklung) beginnt,) eingeleitet) durch)

Signale)des)PräKTCR,)die)Rekombination)des)TCRαKGenlocus)auf)Chromosom)14.)An)diesem)

Punkt)ändert)sich)auch)die)Wanderungsrichtung)der)Thymozyten.)Sie)setzen)ihren)Weg)in)die)

entgegengesetzte)Richtung,)also)in)Richtung)Medulla,)fort.)In)der)subkortikalen)Zone)findet)

demzufolge) der) Übergang) von) DN) zu) DP) Zellen) statt.) Diese) Zellen,) die) CD4) und) CD8) in)

hohem)Maße)exprimieren) (CD4highCD8high),)werden)als) „doppelt)positiv“)oder)als)DPKZellen)

bezeichnet.) Sie) sind) im) gesamten) Cortex)mit) Ausnahme)der) subkortikalen) Zone) lokalisiert)

und)durchlaufen)einen)wichtigen)Prozess)in)der)Entwicklung)hin)zu)reifen)selbsttoleranten)TK

Zellen,)die)positive)Selektion)(Petrie)und)ZúñigaKPflücker)2007).!)Noch) während) der) TCRαKGenlocus) immer) wieder) rekombiniert) wird,) exprimiert) der)

Thymozyt) einen) TKZellKRezeptor,) bestehend) aus) einer) βK) und) einer) αKKette.) Dieser) TCR)

interagiert)mit)MHCKMolekülen))kortikaler)Epithelzellen)des)Thymus.)Diese)Interaktion)dient)

der) Selektion)derjenigen)TKZellKVorläuferzellen,) deren)TKZellrezeptor) in) der) Lage) ist,) EigenK

MHCKMoleküle)zu)erkennen.)Sie)ist)zwingend)für)die)Weiterentwicklung)der)Zellen.)Ohne)das)

!

!

!Einleitung)

!! !

10!

Überlebenssignal,) welches) durch) die) TCRK„MHCKPeptidKKomplex“KLigation) bereitgestellt)

wird,)würden)sie)durch)den)programmierten)Zelltod)absterben.)

Der) größte) Teil) der) DPKZellen) ist) nicht) in) der) Lage,) einen) funktionstüchtigen) TCR) zu)

generieren,) der) mit) einem)MHCKPeptidKKomplex) interagieren) kann,) sodass) rund) 95%) der)

Thymozyten)an)diesem)Punkt)in)Apoptose)gehen)(Starr)et)al.)2003).)Ist)es)allerdings)zu)einer)

erfolgreichen)Interaktion)des)TCR)mit)einem)MHCKMolekül)auf)einer)kortikalen)Epithelzelle)

des) Thymus) gekommen,) endet) hier) die) Rekombination) des) TCRαKGenlocus) (Turka) et) al.)

1991).)

Während) der) positiven) Selektion) findet) ein) weiteres) entscheidendes) Ereignis) im)

Reifungsprozess)der)Thymozyten)statt:)der)Verlust)von)einem)der)beiden)Korezeptoren)des)

TKZellrezeptors.)Die)Thymozyten)fahren)die)Expression)von)CD4)oder)CD8)herunter)und)sind)

fortan) nur) noch) positiv) für) eines) der) beiden)Moleküle.) Sie) werden) dementsprechend) als)

„einfach)positiv“) (Single)Positive,)SP))bezeichnet.)Hierzu)wird)zuerst)auf)allen)DPKZellen)die)

Expression)von)CD8)herunterreguliert)und)die)Expression)des)Rezeptors)für)InterleukinK7)(ILK

7Rα)) heraufreguliert.) Wenn) der) TKZellrezeptor) dieser) intermediären) SPKZelle)

funktionstüchtig) ist,) das) heißt) mit) dem) CD4) Korezeptor) in) der) Lage) ist,) Signale)

weiterzuvermitteln,)entwickelt)sich)diese)Zelle)in)eine)reife)CD4Kpositive)TKZelle.)Endet)aber)

die)Signaltransduktion)durch)den)TCR,)nachdem)CD8)weggefallen) ist,) ist)der)TKZellrezeptor)

bestehend) aus) CD3) und) CD4) also) nicht) in) der) Lage,) Signale) weiterzuvermitteln,) wird) die)

Expression)von)CD4)wieder)herunterK)und)die)von)CD8)heraufgefahren.)Die)Zelle)entwickelt)

sich) folglich) zu) einer) reifen) CD8Kpositiven) TKZelle.) Dieser) Prozess) wird) als) “coreceptor)

reversal”)bezeichnet.))

Der) nächste) wichtige) Schritt) der) TKZellreifung) findet) in) einer) Zone) statt,) die) sich) in) den)

äußeren) Regionen) der) Medulla) befindet) und) durch) eine) hohe) Anzahl) von) Dendritischen)

Zellen)gekennzeichnet) ist.) )Dies) ist)der)Ort)der)negativen)Selektion,)einem)Prozess,) in)dem)

diejenigen) TKZellKVorläuferzellen) aussortiert) werden,) deren) TKZellrezeptoren) mit) hoher)

Avidität))mit)EigenantigenKMHCKKomplexen)reagieren.)

Vermittelt)durch)den)Transkriptionsfaktor)AIRE)(AIRE,)autoimmune)regulator))kommt)es)zur)

ektopen) Synthese) und) Präsentation) von) peripheren) Gewebeantigenen) durch) medulläre)

Epithelzellen)bzw.)Dendritische)Zellen.)Kommt)es)zur)einer)Bindung)des)TCR)der)Thymozyten)

mit) sehr) hoher)Affinität) an) die)Antigene) im)HLAKKontext,)welche) auf)Dendritischen) Zellen)

!

!

!Einleitung)

!! !

11!

präsentiert) werden,) so) wird) in) den) Thymozyten) die) klonale) Deletion,) eine) TKZellrezeptor)

vermittelte)Apoptose,)eingeleitet.)

Durch) diesen) von) kostimulatorischen) Liganden,) wie) CD28,) CD80/CD86) und) anderen,)

abhängigen) Vorgang) wird) sichergestellt,) dass) diejenigen) Thymozyten,) die) die) negative)

Selektion)überleben)und)den)Thymus)verlassen,)eine)ausreichende)Selbsttoleranz)aufweisen)

(zentrale)Toleranz).)

Die)meisten)postselektiven)SPKThymozyten)sind)noch)nicht)vollkommen)funktionell)reif)und)

durchlaufen)während)ihrer)Verweildauer)in)der)zentralen)Medulla)weitere)Reifungsprozesse.)

Anschließend) bewegen) sich) die) vollends) reifen) CD69lowCD62LhiCD24lowKThymozyten) in)

Richtung) corticomedulläre) Grenzschicht) um) am) Ort) ihres) Eintritts) in) den) Thymus,) diesen)

wieder)zu)verlassen)(Petrie)und)ZúñigaKPflücker)2007).)Für)diesen)Wanderungsprozess))und)

den) Thymusexport) sind) ) unter) anderem) Chemokine) (CCR7,) CXCR4) (CXCR,) CXCKMotivK

Chemokinrezeptor))u.a.))sowie)vor)allem)der)TCRKabhängig)exprimierte)GPCR)SphingosinK1K

Phosphatrezeptor) (GPCR,)G)proteinKcoupled)receptor))verantwortlich) (Love)und)Bhandoola)

2011).)

)

)

)

)

)

)

)

)

))))))))))))

Abbildung)1:)Histologisches)Bild)eines))juvenilen)Thymus))(http://www.uniKleipzig.de/~anatomie/CMS/te15lO1l/histoseiten/pub/data/lg/de/002_b.html,)am)19.07.2012))))mit)schematischer)Darstellung)der)verschiedenen)Thymozytenpopulationen,))ihrer)Lokalisation)und)ihrer)Wanderungsrichtung)))))))

!

!

!Einleitung)

!! !

12!

))))))))))))))))))

))Tabelle)4:)Darstellung)der)wichtigsten)Thymozytenpopulationen)mit)den)grundlegenden)Entwicklungsschritten,)die)in)diesem)Stadium)stattfinden))

#

1.4.#Immunoseneszenz#und#das#periphere#CD4+#T;Zellkompartiment#bei#Rheumatoider##

########Arthritis#

#

Der) Begriff) Immunoseneszenz,) erstmals) 1969) durch) den) Gerontologen) Roy) Walford)

verwendet,) beschreibt) die) Gesamtheit) der) im) Alterungsprozess) auftretenden)

Veränderungen)des)Immunsystems.)Insbesondere)die)erworbene)Immunabwehr)scheint)von)

den)im)Folgenden)beschriebenen)altersbedingten)Veränderungen)betroffen)zu)sein.)

Es) lässt) sich) eine) Abnahme) der) Gesamtzahl) der) TKLymphozyten) und) BKLymphozyten)

nachweisen) (Sansoni)et)al.)2008).)Die)eindrücklichste)Veränderung) ist) sicher)die) Involution)

des) Thymus,) die) bereits) im) ersten) Lebensjahr) beginnt.) Sie) schreitet) mit) einem)

durchschnittlichen)Verlust)von)etwa)3%)an)Cortex)und)Medulla)pro)Jahr)bzw.)1%)nach)dem)

45.) Lebensjahr) voran.) Letztlich) gehen) über) 85%) des) Thymus) dabei) zugrunde) und)werden)

durch)Fettgewebe)ersetzt,)sodass)bei)erwachsenen)Menschen)ein)retrosternaler)Fettkörper)

zurückbleibt)(Steinmann)et)al.)1985,)Lynch)et)al.)2009).)In)diesem)Rahmen)kommt)es))auch)

zu) einer) Abnahme) des) Thymusoutputs) an) naiven) TKZellen) und) zur) Akkumulation) von))

MemoryK)und)EffektorKZellen)mit)eingeschränktem)TKZellrepertoire)in)der)Peripherie.)Hierfür)

ist) insbesondere)der)Verlust)des)kostimulatorischen)Oberflächenmoleküls)CD28)ein)Marker)

Thymozyt# wichtige#Ereignisse#der#T;Zellgenese#DN1) Homing)des)Thymus,)Proliferation)

DN2) Expression) von) RAG,) Entscheidung) zwischen) α/βK) und) γ/δK)Entwicklungsrichtung)der)TKZellen.))

DN3) Neuanordnung) des) TCRβKGenlocus,) endgültige) Festlegung) auf) den) TKZellKEntwicklungsweg,)Expression)des)PräKTKZellKRezeptors)

PräDP) Rekombination)des)TCRαKGenlocus,)Änderung)der)Wanderungsrichtung))

DP) positive)Selektion,)coreceptor)reversal)

SP) negative)Selektion)

SP) weitere)Reifungsprozesse)

reife)TKZelle) Verlassen)des)Thymus)

#

!

!

!Einleitung)

!! !

13!

(Weiskopf)et)al.)2009).)Die)Akkumulation)dieser)CD28Knegativen)TKZellen)erklärt)sich)durch)

deren) oligoklonale) Expansion) und) eine) pathologische) Apoptoseresistenz) (Schmidt) et) al.)

1996).) Ein) Zeichen) für) ihre) replikative) Seneszenz) sind) verkürzte) Telomere) (Sansoni) et) al.)

2008).)Eine)direkte)Konsequenz)der)verringerten)Anzahl)an)naiven)TKZellen)ist)eine)geringere)

TCRKDiversität) bei) älteren) Menschen.) Nach) dem) 65.) Lebensjahr) etwa) soll) die) CD4+) TK

Zellrezeptordiversität)um) rund)95%)abgenommen)haben) (Goronzy)und)Weyand)2003).) Ein)

weiteres) Phänomen) der) Immunoseneszenz) ist) die) Verschiebung) verschiedener)

Serumparameter) hin) zu) einem)proinflammatorischen) Status,) der) durch) erhöhte)Werte) für)

CRP) (CRP,) CKreaktives) Protein),) TNF,) ILK6) und) andere) Infektionsmarker) gekennzeichnet) ist)

(Pawelec)et)al.)2010).))

Bei)verschiedenen)Autoimmunerkrankungen,)wie)zum)Beispiel)der)Multiplen)Sklerose,)aber)

allen) voran) auch) bei) der) Rheumatoiden) Arthritis) scheint) es) zu) einer) Voralterung) des)

Immunsystems) zu) kommen.)Hier) finden) sich)bereits) bei) jüngeren)Menschen)die) typischen)

Anzeichen) der) Immunoseneszenz,) so) dass) man) insgesamt) von) einer) Voralterung) des)

Immunsystems)bei)Patienten)mit)RA)von)bis)zu)etwa)20K25)Jahren)ausgehen)kann)(Koetz)et)

al.)2000).))

Die) Rheumatoide) Arthritis) ist) also) nicht,) wie) der) Name) vermuten) lässt,) allein) eine) die)

Gelenke) befallende) Autoimmunerkrankung.) Vielmehr) handelt) es) sich) bei) der) RA) um) eine)

Systemerkrankung)mit) extraartikulären)Manifestationen)und) einer) essentiellen)Beteiligung)

des) TKZellkompartiments.) Die) Bedeutung) der) (CD4+)) TKZellen) in) der) Pathogenese) dieser)

Erkrankung)wurde)bereits)erläutert)(s.o.)Einleitung)1.3).)Zusätzlich)lassen)sich)verschiedene)

Veränderungen)im)Phänotyp,)in)den)Eigenschaften)und)in)der)Genese)von)CD4+)TKZellen)bei)

RAKPatienten)nachweisen:)

Bei) Patienten)mit) Rheumatoider)Arthritis) sind)deutlich) geringere)Mengen) an)CD4+) thymic)

naiven) TKZellen,) welche) antigenunerfahren) sind) und) gerade) erst) den) Thymus) verlassen)

haben,) als) bei) gleichaltrigen) gesunden) Kontrollen) nachzuweisen) (Koetz) et) al.) 2000).) Diese)

thymic)naiven)CD4+)TKZellen)können)durch)ihren)TRECKGehalt)(TREC,)T)cell)receptor)excision)

circle))bzw.)die)Expression)von)CD31)auf)ihrer)Oberfläche)nachgewiesen)werden.))Für)diesen)

Befund)gibt)es)zwei)mögliche)Erklärungen.)Einerseits)könnte)ein)erhöhter)TKZellturnover)zur)

Reduktion) von) TRECKenthaltenden,) CD31+) thymic) naiven) TKZellen) führen.) Im) Allgemeinen)

geht)man)davon)aus,)dass)ein) solcher)Mechanismus) für)den)erniedrigten)TRECKGehalt) von)

CD4+)TKZellen)bei)HIVKPatienten)verantwortlich)zu)machen)ist)(Hazenberg)et)al.)2000).)Eine)

!

!

!Einleitung)

!! !

14!

Erklärungsalternative) ist) eine) eingeschränkte) thymische) TKZellgenese.) Für) diese) zweite)

Alternative) spricht,) dass) RAKPatienten) schon) in) frühen) Jahren,) im) Alter) von) 20K30) Jahren,)

deutlich)reduzierte)TRECKKonzentrationen)aufweisen)und)die) folgende)Abnahme)der)TRECK

Konzentration) im) Rahmen) des) weiteren) Alterungsprozesses) mit) der) von) gesunden)

Menschen)übereinstimmt)(Goronzy)und)Weyand)2001).)Die)TRECKReduktion)muss)also)schon)

früh) im) Leben,) zu) Zeiten) von) normalerweise) hoher) Thymusaktivität,) der) (späteren)) RAK

Patienten) stattgefunden) haben.) Für) eine) eingeschränkte) Thymusfunktion) spricht) auch) die)

Beobachtung,)dass)es)bei)RAKPatienten)zu) langanhaltenden,)schweren)Lymphopenien)nach)

therapeutischer)TKZelldepletion)mit)Entstehung)großer)klonal)expandierter)Populationen)von)

CD45RO+CD4+)TKZellen,)also)nicht)mehr)naiven)MemoryKZellen,)kommt)(Jendro)et)al.)1995).)

Letztlich) ist) es) natürlich) auch) möglich,) dass) für) die) RA) beide) Erklärungsmöglichkeiten)

zugleich)zutreffen.)

Um)trotz)einer)eingeschränkten)thymischen)Aktivität)ein)ausreichend)großes)peripheres)TK

Zellkompartiment) aufrecht) zu) erhalten,) ist) die) Proliferation) von) bereits) existierenden) TK

Zellen) in) der) Peripherie) (Homöostatische) Proliferation)) notwendig.) Solche) peripher)

proliferierten) Zellen) zeichnen) sich) dann) durch) vermehrte) Anzeichen) von) replikativer)

Seneszenz)aus.)Bei)an)Rheumatoider)Arthritis)erkrankten))Menschen)finden)sich)regelmäßig)

schon)in)der)frühen)dritten)Lebensdekade)und)in)frühen)Krankheitsstadien)unphysiologisch)

verkürzte) Telomerenden,) wohingegen) bei) gesunden) Menschen) die) Telomerlänge) bis) zu)

einem) Alter) von) etwa) 40) Jahren) relativ) konstant) bleibt) (Koetz) et) al.) 2000).) Durch) die)

periphere)Proliferation)von)TKZellen)kommt)es)nachfolgend)zur)Einschränkung)der))Diversität)

des)TKZellrezeptorrepertoires,)da)der)Nachschub)an)neu)selektierten)naiven)TKZellen)aus)dem)

Thymus)fehlt)und)stattdessen)nur)bereits)existierende)TCRKVarianten)vervielfältigt)werden.)

Hieraus) resultiert)eine) rund)10Kfach)geringere)Diversität)der)TCRβKKetten)bei)RAKPatienten)

im)Vergleich)zu)gesunden)Kontrollen)(Goronzy)und)Weyand)2003).)

Klonal)expandierte)Lymphozytenpopulationen)sind)im)CD8+)Kompartiment)durchaus)häufig)

und)auch)bei)gesunden)Menschen)vorzufinden.)Bei)CD4+)TKZellen)finden)sich)solche)klonal)

expandierten) CD28K) Lymphozytenpopulationen) hingegen) gehäuft) nur) bei)

Autoimmunerkrankungen) wie) der) Multiplen) Sklerose,) der) Granulomatösen) Vaskulitis) und)

auch)bei)RAKPatienten)(Goronzy)und)Weyand)2005,)Hohensinner)et)al.)2011).)Bei)der)RA)ist)

das)Auftreten)dieser)durch)homöostatische)Proliferation)entstandenen,)klonal)expandierten,)

CD28K)TKZellen)unabhängig)von)der)Krankheitsaktivität)und)stabil)über)die)Zeit)(Goronzy)und)

!

!

!Einleitung)

!! !

15!

Weyand)2003).)Ebenso)lässt)es)sich)in)sehr)frühen)Krankheitsstadien)nachweisen)(Goronzy)et)

al.) 1994),) sodass) man) hier) von) einer) primären) Erscheinung) und) nicht) von) einer) durch)

chronische) Inflammation) verursachten) Veränderung) ausgehen) kann.) Diese) CD28K) TK

Helferzellen) zeichnen) sich) durch) eine) gesteigerte) Autoreaktivität) und) durch) die) Fähigkeit)

aus,) Lymphokine) ohne) das) Vorhandensein) der) üblichen) kostimulatorischen) Signale) zu)

sezernieren)(Wagner)et)al.)1998).))

Es)zeigte)sich,)dass)RAKPatienten)zum)Zeitpunkt)ihrer)Erkrankung)keinen)erhöhten,)sondern)

vielmehr)einen)eher)verminderten)TKZellturnover)aufweisen,)da)die)Häufigkeit)an)KiK67+)TK

Zellen,)also)sich) in)Teilung)befindlichen)Zellen,) im)Vergleich)mit)gesunden)Kontrollen) leicht)

erniedrigt) ist.) Diese) Entdeckung) weist) darauf) hin,) dass) die) beschriebene) homöostatische)

Proliferation) mit) ihren) Folgen) nicht) im) Rahmen) des) aktiven) Krankheitsprozesses) selbst)

aufzutreten)scheint,)sondern)diesem)vielmehr)(um)mehrere)Jahre))vorausgeht)(Goronzy)und)

Weyand) 2003).) Da) auch) nicht) betroffene) Verwandte) von) RAKPatienten) und) gesunde)HLAK

DR4+)Menschen)gleiche)Abweichungen)aufweisen,)liegt)ebenfalls)die)Vermutung)nahe,)dass)

nicht) die) Krankheitsmanifestation) selbst) zu) den) erwähnten) Veränderungen) des) adaptiven)

Immunsystems)bei)RAKPatienten)führt)(Waase)et)al.)1996,)Schmidt)et)al.)1996)und)Schönland)

et)al.)2003).)

Insgesamt)lassen)die)erhobenen)Befunde)der)TCRKRepertoireeinschränkung,))der)Anzeichen)

von)replikativem)Stress)und)des)verminderten)TKZellturnovers)während)der)Erkrankung)also)

den) Schluss) zu,) dass) (spätere)) Patienten) mit) Rheumatoider) Arthritis) mindestens) zum)

Zeitpunkt)von)physiologischerweise)hoher)Thymusaktivität,)also) in)Kindheit)und)Jugend)bis)

zum) Ende) der) Pubertät,) eine) eingeschränkte) Thymusfunktion) aufweisen.) Die)

Thymusfunktion) ist) zwar) selbst) unter) physiologischen) Bedingungen) im) höheren) Alter)

signifikant) eingeschränkt) und) auch) bei) jungen) Erwachsenen) spielt) die) thymische) TK

Zellgenese)nur)eine)untergeordnete)Rolle)in)der)Aufrechterhaltung)des)peripheren,)naiven)TK

Zellkompartiments) (den) Braber) et) al.) 2012).) Die) Tatsache,) dass) es) zu) einer) Erhöhung) der)

TRECKZahlen)nach)einer)TKZelldepletion)auch)bei)Menschen)mittleren)Alters)kommt,)beweist)

jedoch,)dass)der)Thymus)seine)Arbeit,)wenn)auch)in)geringem)Maße,)aufrechterhält)und)in)

Situationen) mit) vorausgegangenem) vermehrtem) TKZelluntergang) gegebenenfalls) steigern)

kann)(Douek)et)al.)2000,)Lewin)et)al.)2002).)

)

)

!

!

!Einleitung)

!! !

16!

)

Abbildung)2:))

Zusammenfassung) und) schematische) Darstellung) der)möglichen) pathogenetischen) Schritte) hin) zur)Entstehung) der) Veränderungen) des) CD4+) TKZellkompartimentes)bei)Rheumatoider)Arthritis:)

)1.)reduzierter)Thymusoutput))2.)Homöostatische)Proliferation)mit)))))K)klonaler)Expansion)))))K)reduzierter)TCRKDiversität))3.)TKZellimmunoseneszenz)mit)Veränderungen)von)))))Genexpression)und)Eigenschaften))4.)Entwicklung)eines)zur)Autoreaktivität)neigenden)))))TK)Zellrepertoires)und)Manifestation)der)RA))aus)Goronzy)und)Weyand)2001)

)

Eine)Reduktion)der)Thymusaktivität)wird,)zumindest)zum)Teil,)für)die)Veränderungen)des)TK

Zellpools) bei) älteren)Menschen) verantwortlich) gemacht.) Bei) Patienten) mit) Rheumatoider)

Arthritis) kann) man) darüber) hinaus) von) einer) nicht) altersentsprechenden) Reduktion) des)

Thymusoutput) ausgehen.) Es) stellt) sich) nun) die) Frage,) ob) es) sich) hierbei) um) eine) primär)

thymische) Fehlfunktion) handelt) oder) ob) dieser) verminderte) Output) etwa) durch) einen)

ebenso) reduzierten) Thymusinput) ,) das) heißt) eine) zu) geringe) Besiedlung) des) Thymus) mit)

lymphozytären)Vorläuferzellen,)bedingt)sein)könnte.)

Um)die)Alteration)der)CD4+)TKZellgenese)bei)RA)zu)untersuchen)und)einer)Antwort)zu)dieser)

Frage) näherzukommen,) wurde) 28) Patienten) der) Rheumatologischen) Ambulanz) des)

Universitätsklinikums) Leipzig) EDTAKBlut) entnommen,) der) Gelenkstatus) sowie) weitere)

klinische)Parameter)erhoben.)Das)Blut)wurde)mittels)Durchflusszytometrie)auf)verschiedene)

relevante) CD4+) TKZellpopulationen) untersucht.) Des) Weiteren) konnte,) aufbauend) auf)

Erkenntnissen) von) Six) et) al.,) ein) lymphoider) Progenitor) im) peripheren) Blut) detektiert)

werden.)Von)dieser)CD34+CD10+CD24K)und)LineageKnegativen)Zelle)wird)vermutet,)dass)sie)

den)Thymus)besiedelt)und) lebenslang)die) thymische)TKZellgenese)aufrechterhält) (Six)et) al.)

2007).)

Die) gewonnenen) Ergebnisse) wurden)mit) den) Frequenzen) der) lymphoiden) Progenitorzelle)

gesunder)Kontrollprobanden)verglichen.)

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

17!

2.#Material#und#Methoden#

#

2.1.#Patientengut#und#gesunde#Kontrollen#

#Um( die( homöostatischen( Mechanismen( der( CD4+( T8Zell8Genese( bei( Patienten( mit(

Rheumatoider(Arthritis( zu(untersuchen,(wurden(28(RA8Patienten(der(Studienambulanz(des(

Universitätsklinikums( Leipzig( sowie( altersentsprechenden( gesunden(Kontrollen( jeweils( vier(

9ml8Monovetten(EDTA8Blut((EDTA,(Ethylendiamintetraessigsäure)(abgenommen.#

Die( Patienten( erfüllten( alle( die( neuen( Diagnosekriterien( des( American( College( of(

Rheumatology(und(der(European(League(Against(Rheumatism((EULAR)(von(2010((Aletaha(et(

al.(2010).(Sie(waren(alle(Rheumafaktor8((sowie(anti8CCP8positiv((CCP,(cyklisches(citrulliniertes(

Peptid).( Die( immungenetische( Charakterisierung( durch( HLA8DRB18Typisierung( ergab( 19(

shared(epitope8positive(und(neun(shared((epitope8negative(Patienten.((

Zum( Vergleich( mit( einer( Kontrollpopulation( wurden( 28( gesunde( Kontrollen( nach( Alter,((

Geschlecht(und(Erkrankungen(ausgesucht.(Für(jeden(Rheuma8Patienten(wurde(eine(gesunde(

Kontrolle(gewählt,(die(nicht(mehr(als( zwei( Jahre( jünger(oder(älter(war.(Es( schieden(solche(

aus,(die(chronisch(entzündliche(und(Autoimmunerkrankungen(hatten.(Andere(Erkrankungen,(

wie( zum( Beispiel( arterielle( Hypertonie( und( Diabetes( mellitus( Typ( II,( wurden( nicht(

berücksichtigt(oder(erfragt.(Der(Altersdurchschnitt(der(RA8Patienten(betrug(63,3(Jahre,(der(

der(gesunden(Kontrollen(ebenso.(Elf(der(Patienten(waren(männlich,(17(weiblich.(Unter(den(

gesunden(Kontrollen(fanden(sich(zehn(Männer(und(18(Frauen.(

Zur( Untersuchung( der( Alterskorrelationen( konnte( bei( den( gesunden( Kontrollen( auf( eine(

Gruppe(weiterer,(insbesondere(auch(jüngerer(Probanden(zurückgegriffen(werden,(wodurch(

eine(Fallzahl(von(n=33(resultierte.(

(

2.2.1.#Gewinnung#der#PBMCs#

#Zeitnah( nach( der( Blutentnahme( wurde( die( Separation( der( mononukleären( Zellen( des(

peripheren(Blutes(vorgenommen((PBMCs,(peripheral(blood(mononuclear(cells).(

Als(PBMCs(werden(im(Allgemeinen(diejenigen(Zellen(bezeichnet,(die((sich(bei(einer,(wie(auch(

in( dieser( Arbeit( durchgeführten( Dichtegradientenzentrifugation( in( der( sogenannten(

„Interphaseschicht“(befinden.(Hierzu(zählen(Monozyten,(Lymphozyten,(NK8Zellen((NK8Zellen,(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

18!

Natürliche(Killerzellen)(und(Dendritische(Zellen.(Vereinzelte(Basophile(Granulozyten(können(

darunter(auftreten.(Für(die((genannte(Dichtegradientenzentrifugation(wurde(das(EDTA(8(Blut(

1(:(3(mit(2(mM(PBS8EDTA((PBS,(phosphate(buffered(saline)((Dulbecco`s(PBS,(PAA)(verdünnt.(

Die(PBS8EDTA8Lösung(hierfür(wurde(selbst(hergestellt:(

1,8612g(EDTA( (Tritriplex)(der( Firma(Merck(Chemicals(wurden( in(50(ml(Aquadest( (B.Braun)(

gelöst,(der(pH8Wert(wurde(auf(7,0(eingestellt(und(die(Lösung(anschließend(sterilfiltriert.(Von(

der(so(hergestellten(Lösung(wurden(2(ml(einer(herkömmlichen(Dulbecco`s(PBS8Flasche(mit(

einem(Inhalt(von(1000(ml(hinzugegeben.((

Nachdem( je( 10ml( des( hydrophilen( Saccharose8Polymer( Ficoll8Paque( (Dichte:( 1.077( ±0.001(

g/ml,(GE8Healthcare)( in( 50(ml( Tubes( vorgelegt(wurden,(wurde(dieses( vorsichtig(mit( 35(ml(

des( verdünnten( Blutes( ( überschichtet,( woraufhin( die( Zentrifugation( bei( Raumtemperatur(

(RT)(für(25(Minuten(bei((700(G(mit(ausgeschalteter(Bremse(erfolgte.(

Bei( einer( Dichtegradientenzentrifugation( reichern( sich( die( PBMCs( in( einem( Interphasering(

über( der( Ficoll8Lösung( an,( da( diese( eine( etwas( höhere( Dichte( aufweist( als( die( zu(

separierenden( Zellen.( Erythrozyten( und( Granulozyten( hingegen( sinken( aufgrund( ihrer(

Dichte,(die(höher(ist,(als(die(der(Ficoll8Lösung(zu(Boden.(Die(Thrombozyten(verbleiben(in(der(

Plasmaphase,(die(sich(über(der(Ficoll8Lösung(und(dem(Interphasering(befindet.(

(

(((((((((((((((((((((((vor(Zentrifugation((((((((( nach(Zentrifugation(

(

(mit(PBS8EDTA(verdünntes(Blut((((((((((((( Serum(

(

(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( Interphasering((

((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( Ficoll8Lösung(

((((((((((((((((((((((((((((((((((((Ficoll8Lösung((((((((((((((((((((((((((((((((((( Granulozyten(und(Erythrozyten(

(

Abbildung(3:(schematische(Darstellung(der(Tubes(vor(und(nach(Zentrifugation(von(verdünntem(Vollblut(auf(((((((((((((((((((((((((((((((((((Ficoll8Lösung(((Nun(konnten(die(PBMCs(leicht(detektiert(und(mittels(Pasteurpipette(gewonnen(werden.(

Um(die(Reinheit(der( Zielzellen( zu( steigern,(wurde(die( Zellsuspension(einmal(mit(PBS8EDTA(

gemischt( und( danach( bei( 500( G( für( zehn( Minuten( bei( 5°C( zentrifugiert.( Nach( einer(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

19!

Resuspension( in( PBS8EDTA( erfolgte( ein( zweiter(Waschschritt( bei( 430( (G( für( zehn(Minuten(

ebenfalls( bei( 5°C.( Anschließend( konnte( die( Zellzahlbestimmung( mittels( Neubauer8(

Zählkammer( vorgenommen(werden.(Hierfür(wurden(5µl( der( Zellsuspension( 1:2(mit( Türks8

Lösung((Merck(Chemicals(Germany)(gemischt,(um(die(kernhaltigen(Zellen(besser(gegen(die(

Erythrozyten(abgrenzen(zu(können.(

Nachdem(die(Zellzahl(in(der(Suspension(bekannt(war,(wurde,(nach(erneutem(Zentrifugieren(

bei(430(G(für(zehn(Minuten(bei(5°C(und(Verwerfen(des(Überstandes,(durch(Zugabe(von(PBS8

EDTA(eine(Zelldichte(von(1(x(107(Zellen(pro(Milliliter(für(alle(Proben(eingestellt.(

(

2.2.2.#Gewinnung#der#PBMCs#für#das#CD31=Experiment#

#Zur(Gewinnung(der(PBMCs,(die(mit(einem(CD318Antikörper(gefärbt(werden(sollten,(war( im(

Vorfeld( das( Abseren( der(Monovette( nötig,( um( eine(möglichst( geringe( Verunreinigung(mit(

Thrombozyten( zu( gewährleisten,( da( diese( aufgrund( der( hohen( CD318Dichte( auf( ihrer(

Oberfläche(eine(korrekte(Messung(unmöglich(gemacht(hätten.(Hierfür(wurde(die(EDTA8Blut8

Monovette( vor( allen( anderen( Schritten( bei( RT( für( zehn(Minuten( bei( 1400( U( pro( Minute(

zentrifugiert.( Danach( konnte( das( Serum( abpipettiert( werden.( Die( zurückgebliebenen(

Blutbestandteile(wurden(mit(PBS8EDTA(wieder(auf(9(ml(aufgefüllt.(Von(diesen(wurden(5(ml(

entnommen(und(1(:(6(mit(PBS8EDTA(verdünnt.(Das(verdünnte(Blut(wurde(vorsichtig(auf(10ml(

Ficoll8Paque( (GE8Healthcare,( Dichte:( 1.077( ±0.001( g/ml),( das( in( 50( ml( Tubes( vorgelegt(

worden(war,(geschichtet(und(danach(bei(RT(für(25(Minuten(bei((700(G(mit(ausgeschalteter(

Bremse( zentrifugiert.( Die( Flüssigkeitsbestandteile,( die( sich( über( dem( Interphasering(

gesammelt( hatten,( wurden( bis( zu( einer( Höhe( von( etwa( ( 2( cm( über( dem( Interphasering(

abpipettiert,( um( eine( Verunreinigung( der( PBMCs( zu( minimieren.( Nachdem( die( PBMCs(

mittels( Pasteurpipette( aus( dem( Interphasering( gewonnen( worden( waren,( wurden( sie(mit(

PBS8EDTA( bei( 500( G( für( zehn(Minuten( bei( 5°C( zentrifugiert.( Diesem(Waschschritt( folgten(

zwei(weitere(bei(430(G(und(5°C(ebenfalls(für(zehn(Minuten.(

Jetzt(konnte(die(Zellzahl(in(einer(Neubauer8Zählkammer(bestimmt(werden(und(wie(bei(den(

anderen( PBMCs( wurde( in( der( Probe( eine( Zelldichte( von( 1( x( 107( Zellen( pro( Milliliter(

eingestellt.((

#

#

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

20!

2.3.#Immunzytologische#Färbung#

#Mit(den(gewonnenen(PBMCs(konnten(für(die(RA8Patienten(und(gesunden(Kontrollen(je(sechs(

immunzytologische( Färbeansätze( zur( Messung( mit( einem( Durchflusszytometer( hergestellt(

werden:(

(

Tabelle(5:(Zusammensetzung(der(immunzytologischen(Färbeansätze(für(die(Experimente(185(((

Tabelle(6:(Färbeansatz(zur(immunzytologischen(Färbung(für(das(6.(Experiment((

Für(die(Färbeansätze(eins(bis(fünf(wurden(je(50(µl(der(jeweiligen(Zellsuspension,(was(5(x(105(

Zellen(entsprach,(mittels(Pipette(in(ein(FACS8Röhrchen(überführt.(

Danach(wurden(die(entsprechenden(Antikörper(hinzugegeben(und( für(30(Minuten(bei(4°C(

und(Dunkelheit(inkubiert.(Im(nächsten(Schritt(wurden(2000µl(FACS8Waschpuffer((hergestellt(

aus( 1000ml( Dulbecco`s( PBS,( 20ml( FKS( (Invitrogen( GmbH)( und( 10ml( einer( 10%igen(

Natriumazidlösung((1g(NaN3((sodium(azide(pure(von(AppliChem)(in(10ml(PBS))(hinzugegeben(

und(die(Färbeansätze(wurden( für( zehn(Minuten(bei(430(G(und(5°C(zentrifugiert.(Nach(der(

Ansatz( FITC( PE( PC85( APC(1.( anti8CD8(Isotyp(IgG1(

(1µl,(BD(Biosciences)(anti8CD28,(Isotyp(IgG1((1µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD4,(Isotyp(IgG1((1µl,(Beckman(Coulter)(

888(

2.( anti8CD85,(Isotyp(IgG2b((5µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD8,(Isotyp(IgG2a(((1µl,(Miltenyi(Biotec)(

anti8CD4,(Isotyp(IgG1(((1µl,(Beckman(Coulter)(

888(

3.( anti8CD45RO,((Isotyp(IgG2a((5µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD45RA,(Isotyp(IgG2b(((1µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD4,(Isotyp(IgG1(((1µl,(Beckman(Coulter)(

888(

4.( anti8CD8,(Isotyp(IgG2b((1µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD25,(Isotyp(IgG1(((4µl,(eBioscience)(

anti8CD4,(Isotyp(IgG1(((1µl,(Beckman(Coulter)(

888(

5.( 888( anti8CD45RA,(((Isotyp(IgG2b(((1µl,((BD(Biosciences()(

anti8CD4,(Isotyp(IgG1(((1µl,(Beckman(Coulter)(

anti8CD31,(Isotyp(IgG1(((20µl,(Miltenyi(Biotec)(

Ansatz( FITC( PE((lineage(Cocktail)( Cy7( APC(6.( anti8CD24,(

Isotyp(IgG2a((10µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD2,(Isotyp(IgG2b((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD3,(Isotyp(IgG2a((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD4,(Isotyp(IgG1((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD8,(Isotyp(IgG2a((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD14,(Isotyp(IgG2a((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD15,(Isotyp(IgGM((5µl,(Miltenyi(Biotec)((anti8CD16,(Isotyp(IgG1((5µl,(BD(Biosciences)(anti8CD19,(Isotyp(IgG1((5µl,(BD(Biosciences)(anti8CD33,(Isotyp(IgG1((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD56,(Isotyp(IgG1((5µl,(Miltenyi(Biotec)(anti8CD235a,(Isotyp(IgG2a((20µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD10,(Isotyp(IgG1(((20µl,(BD(Biosciences)(

anti8CD34,((Isotyp(IgG2a(((40µl,(Miltenyi(Biotec)(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

21!

Zentrifugation( wurde( der( Überstand( verworfen( und( das( zurückgebliebene( Pellet( sofort( in(

400µl( FACS8Fixierpuffer( (hergestellt( aus( 100ml( PBS( und( 3ml( 37%iger( Formaldehydlösung(

(Merck(Chemicals))(resuspendiert.(So(wurden(die(Proben(für(mindestens(24(Stunden(haltbar.((

Für( den( sechsten( Färbeansatz( wurden( 1( x( 107( Zellen( verwendet.( Dies( entsprach( bei( der(

eingestellten( Zelldichte( einem( Milliliter.( In( diesem( großen( Volumen( wären( die(

Konzentrationen(der(Antikörper( zu(gering( für(eine(ausreichende(Färbung(gewesen.(Darum(

wurden( die( 1( x( 107(Zellen( zunächst( in( ein( 15ml( 8( Tube( gegeben( und( bei( 430( G( für( zehn(

Minuten( bei( 5°C( zentrifugiert.( Der( Überstand( wurde( verworfen( und( die( Zellen( in( der(

Restflüssigkeit,( die( etwa(100µl( entsprach,( resuspendiert.(Hierbei(musste(besonders(darauf(

geachtet(werden,(dass(es(nicht(zu(einer(Blasenbildung(in(der(Zellsuspension(kam.(

Jetzt( konnten(die( Zellen( in( ein( FACS( 8( Röhrchen(überführt( und(die(Antikörper( hinzugefügt(

werden.( Nach( Inkubation( für( 30(Minuten( bei( 4°C( in( Dunkelheit( wurden( dem( Färbeansatz(

1500µl( FACS( 8(Waschpuffer( hinzugegeben( und( es( erfolgte( eine( erneute( Zentrifugation( bei(

430(G(und(5°C(für(10(Minuten.(Der(Überstand(wurde(verworfen(und(das(zurückgebliebene(

Zell8Pellet(in(500µl(FACS8Fixierpuffer(resuspendiert.(Somit(war(die(Probe(für(mindestens(24(

Stunden(haltbar(gemacht.(Um(eine(ausreichende(Messgenauigkeit(am(Durchflusszytometer(

zu( gewährleisten,( musste( der( Färbeansatz( noch( mit( 1000µl( FACS8Waschpuffer( verdünnt(

werden,( da( sonst( die( während( der( Messung( pro( Minute( erfassten( Ereignisse( zu( hoch(

gewesen(wären,(um(verlässliche(Daten(zu(liefern.(

(2.4.#Etablierung#der#Färbeansätze#

#Für( die( Färbeansätze( 1.( bis( 4.( konnte( auf( laborinterne( Protokolle( zurückgegriffen(werden.(

Beim( Färbeansatz( für( die( 5.( Messung( war( die( Abgrenzbarkeit( der( CD31+CD45RA+(

Lymphozyten(das(entscheidende(Kriterium.((

Bei(einer(ersten(Messung,( für(die(die(PBMCs(auf(die(herkömmliche(Weise,(wie( in(Material(

und( Methoden( 2.2.1( beschrieben,( gewonnen( wurden,( konnte( keinerlei( Abgrenzung( der(

CD31+CD45RA+( Lymphozytenpopulation( erkannt( werden.( Dies( lag( an( einer( zu( starken(

Verunreinigung( der( PBMCs( mit( Thrombozyten.( Deshalb( wurde( für( die( anschließenden(

Experimente(der(Gewinnungsvorgang(der(PBMCs(für(diese(FACS8Messung(entsprechend(der(

oben(beschriebenen(Schritte((Material(und(Methoden(2.2.2)(verändert.(Im(Anschluss(konnte(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

22!

die(Antikörperkonzentration(austitriert(und(deren(optimale(Konzentration(für(die(folgenden(

Experimente(verwendet(werden.(

Auch( für(die(Etablierung(des(6.(Färbeansatzes(konnte( in(einer(Reihe(mehrerer(Testansätze(

die(geeignete(Antikörperkonzentration(ermittelt(werden.(Hier(musste(insbesondere(auf(eine(

ausreichende(Anfärbung(und(somit(Markierung(als(„lineage8positiv“(der(Erythrozyten(sowie(

auf(die(Entwicklung(eines(kostengünstigen(Protokolls(hingearbeitet(werden.(#

#

#

2.5.#Messung#am#Durchflusszytometer#

#

Die( Messungen( der( Färbeansätze( wurden( an( dem( Durchflusszytometer( FACScalibur( der(

Firma(BD(biosciences(vorgenommen.((

Bei( der( Durchflusszytometrie( werden( suspendierte( Zellen( an( einem( Laser( vorbeigeführt.(

Dabei( senden( die( Zellen,( abhängig( von( ihrer( Größe,( Gestalt( und( spezifischen( Anfärbung(

charakteristische(Lichtsignale(aus.(Jede(Zelle(wird(einzeln(durch(eine(Mikroküvette(aus(Glas(

oder(Quarz(in(den(Messbereich(eines(Lasers(geführt.(Ein(optisches(Detektionssystem(und(die(

Elektronik( quantifizieren( dabei( Streulicht( und( Fluoreszenzemission.( Das( Vorwärtsstreulicht(

(Forward(Scatter)(ist(ein(Maß(für(das(Volumen(einer(Zelle,(das(Seitwärtsstreulicht((Sideward(

Scatter)(hängt(von(deren(Granularität(ab.(Allein(schon(mit(diesen(beiden(Parametern(lassen(

sich(verschiedene(Untergruppen(der(PBMCs(deutlich(voneinander(unterscheiden.(Zusätzliche(

Informationen( liefern(die(mit( Immunfluoreszenzfarbstoffen(markierten(Antikörper,(die(sich(

je( nach( Expressionsverhalten( an( die( Zellen( binden( können.(Werden( diese( Antikörper( von(

einem(Laserstrahl(getroffen,(absorbiert(das(Fluorochrom(die(Energie(des(Laserlichts(und(gibt(

diese(Energie(anschließend(wieder( frei,( zum(Teil(als(Schwingungsenergie(und(Wärme,(zum(

Teil( aber( auch( durch( Emission( eines( Photons( mit( größerer( Wellenlänge,( also( geringerer(

Energie.( Je( nach(Art( des( Fluorochroms( kommt(es( zur( Emission( von( Licht( unterschiedlicher(

Wellenlängen.(

(

(

(

(

(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

23!

(

(

Fluoreszenzspektren(gebräuchlicher(Fluorochrome((FITC:(grünlich(PE:(orange(APC:(lila(PerCP:(rot((

(

(

(

(

((Abbildung(4:(Fluoreszenzspektren(gebräuchlicher(Fluorochrome(aus(„Einführung(in(die(Durchflusszytometrie“(((((((((((((((((((((((((((BD(Biosciences(Customer(Education((

Auf(diese(Weise(können(eine(große(Anzahl(von(Zellen( in(sehr(kurzer(Zeit(auf(verschiedene(

Eigenschaften( untersucht( werden.( In( diesem( Fall( wurden( PBMCs( verwendet( und(

insbesondere( CD4+( Lymphozyten( auf( ihre( Expression( bestimmter( Oberflächenmoleküle(

untersucht.(

Mittels( des( Programms(BD( CellQuest™( Pro( konnten( die( Ergebnisse(während( der(Messung(

dargestellt(werden.(Bei(der(Darstellung(der(Events(mit(dem(Forward(Scatter(auf(der(X8Achse(

und( dem( Sideward( Scatter( auf( der( Y8Achse( war( die( Lymphozytenpopulation( leicht( zu(

erkennen,( sodass( um(diese( ein(Gate( gesetzt(wurde.(Die( Proben( eins( bis( fünf(wurden( nun(

nacheinander( jeweils( so( lange( gemessen,( bis( im( Gate( insgesamt( 20( 000( Zellen( detektiert(

worden(waren.(Die(Messung(der(sechsten(Probe(erfolgte(mit(einem(Gate(um(die(gesamten(

PBMCs,(welche(sich(ebenfalls(durch(ihre(Eigenfluoreszenz(leicht(erkennen(lassen,(wenn(man(

den(Forward(Scatter(gegen(den(Sideward(Scatter(aufträgt,(bis(im(Gate(insgesamt(5(000(000(

Zellen(detektierte(worden(waren.(

(

(

(

(

(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

24!

(

2.6.#Auswertung#der#Messergebnisse#der#Durchflusszytometrie##

#2.6.1#Messungen#1#bis#4#

#Die( in( der( Durchflusszytometrie( gewonnenen( Daten( wurden( mit( Hilfe( des( Programms(

WinMDI( (Windows(Multiple(Document( Interface(Flow(Cytometrie(Application,(Version(2.9,(

http://facs.scripps.edu/software.html)(ausgewertet.(Für(alle(Proben(erfolgte(die(Darstellung(

als(Dotplots.(

Für(die(Ansätze(eins,(zwei(und(vier(waren(pro(Patient(beziehungsweise(gesunder(Kontrolle(je(

zwei(Dotplots(nötig.(Bei(dem(ersten(Dotplot(wurde(die(X8Achse(des(Koordinatensystems(mit(

CD4( PC85( und( die( Y8Achse(mit( dem( Sideward( Scatter( versehen.( Auf( diese(Weise( war( die(

Population(der(T8Helferzellen(leicht(auszumachen.(Mittels(der(Option(„create(region“(konnte(

um(diese(Zellgruppe(eine(Region(gesetzt(werden.(Dies(ermöglichte((zum(einen,(die(Zahl(der(

detektierten(CD4+(Lymphozyten(zu(erfahren,(zum(anderen(konnten(die(übrigen(Dotplots(auf(

diese(Region(„gegatet“(werden,(sodass(nur(die(Zellen,(die(sich(in(dieser(Region(befanden,(in(

den(folgenden(Dotplots(zur(Darstellung(kamen.( Im(zweiten(Dotplot(wurde(CD4(PC85(gegen(

den( jeweils( anderen( zu( untersuchenden(Antikörper( aufgetragen( und( der( gesamte(Dotplot(

auf(die(erstellte(Region(gegatet,(sodass(nur(solche(Ereignisse(zur(Darstellung(kamen,(die(sich(

im( Fenster( um( die( T8Helferzellen( befanden.( So( konnten( jeweils( die( beiden( CD4+( T8

Zellpopulationen,( die( sich( hinsichtlich( der( Expression( des( zu( untersuchenden(

Oberflächenmoleküls(unterschieden,(detektiert(werden.((

Für(die(Auswertung(der(dritten(Messung(wurden(weitere(Dotplots(benötigt.(Es(wurden,(nach(

„Gating“(auf(T8Helferzellen(nach(oben(genanntem(Schema,(jeweils(CD45RA(PE((und(CD45RO((

FITC(gegen(CD4(PC85(aufgetragen,(um(die(CD45RA(oder(CD45RO(einfach(positiven(Zellen(zu(

detektieren.(Außerdem(wurde(CD45RA(PE(gegen(CD45RO(FITCS(aufgetragen,(um(die(Größe(

der(doppelt(positiven(Population(bestimmen(zu(können.((

Für( die( Erfassung( einer( CD4+CD8+( doppelt( positiven( T8Zellpopulation( war( ein( anderes(

Vorgehen( erforderlich.( Hier( wurde( zuerst( eine( Region( um( die( im( Sideward( Scatter( und(

Forward( Scatter( gut( darstellbare( Lymphozytenpopulation( gesetzt.( Diese( Region( diente( im(

folgenden( Dotplot,( in( dem( CD4( gegen( CD8( aufgetragen( wurde,( als( Gate,( sodass( allein(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

25!

Lymphozyten(zur(Darstellung(kamen.(Jetzt(konnten(sowohl(der(Anteil(CD4+(T8Zellen(als(auch(

der(Anteil(CD4+CD8+(doppelt(positiver(T8Zellen(an(den(Lymphozyten(bestimmt(werden.(

#

2.6.2.#Messung#5#

#Im(ersten(Schritt(wurde(wie(zuvor(auch(der(Sideward(Scatter(auf(die(Y8Achse(und(CD4(PC85(

auf( die( X8Achse( aufgetragen.( So( konnte( die( Gruppe( der( CD4+( Lymphozyten( leicht(

aufgefunden( und( eine( Region( darum( gesetzt( werden.( Diese( Region(war( die( Basis( für( den(

folgenden(Dotplot,(in(dem(CD4(PC85(gegen(CD45RA(PE(aufgetragen(wurde.(

In( manchen( Messungen( war( es( nicht( einfach,( die( Grenze( zwischen( CD45RA+CD31+( und(

CD45RA+CD318( Zellen( zu( setzen.( Darum( wurde( ein( Zwischenschritt( vollzogen,( in( dem(

zunächst( die( CD45RA( negativen( CD4+( T8Zellen( auf( ihre( Expression( von( CD31( untersucht(

wurden.(Diese(Zellen(exprimieren(das(Oberflächenmolekül(CD31(natürlicherweise(nicht(oder(

nur(in(sehr(geringem(Ausmaß,(sodass(hier(leicht(die(Abgrenzung(der(CD31(negativen(Zellen(

festgelegt(werden(konnte.(Die(so(ermittelte(Grenze(konnte(im(Folgenden(für(den(Dotplot,(in(

dem(CD45RA(PE(auf(der(Y8Achse(und(CD31(APC(auf(der(X8Achse(aufgetragen(worden(war,(

übernommen(werden(und( so(der(Anteil(CD31( tragender(CD4+CD45RA+(T8Zellen(detektiert(

werden.(

(

(

#

#

#

#

#

#

#

(

(

1.(Schritt:(Markieren(der(CD4(positiven(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((2.(Schritt:(Markieren(der(CD4(positiven(((((((((Lymphozyten(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((CD45RA(negativen(Lymphozyten((

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

26!

#

#

#

#

#

#

#

#

#

3.(Schritt:(Festlegung(der(Grenze(für(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((4.(Schritt:(Markieren(der(CD4(positiven(((((((CD31(negative(Zellen((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((CD45RA(positiven(Zellen(#

(

(

(

(

(

(((5.(Schritt:(Auftragen(der(CD45RA(positiven(T8Helferzellen(gegen(((((((CD31(mit(den(zuvor(bestimmten(Grenzen(#

Abbildung(5:(Darstellung(der(einzelnen(Schritte(zur(Auswertung(des(CD318Experiments(mittels(Dotplots(((((((((((((((((((((((((((((generiert(mit(dem(Programm(WinMDI)(#

2.6.3.##Messung#6#

#Mittels( des( Auswertungsprogrammes( für( Durchflusszytometrie( FlowJo( (www.FlowJo.com( 8(

Tree(Star,( Inc.(199782011)(wurden(die(Daten(als(Dotplots(dargestellt.(Nach(Markierung(der(

PBMCs(wurden(im(ersten(Schritt(zur(Detektion(der(lineage8negativen(Zellpopulation(1%(der(

insgesamt( detektierten( Ereignisse( in( einem( Koordinatensystem( eingetragen,( bei( dem( der(

lineage8Cocktail( auf( der( X8Achse( und( der( Sideward( Scatter( auf( der( Y8Achse( aufgetragen(

waren.(Die(sich(darstellende(Population(lineage8negativer(PBMCs(wurde(markiert.(

Im( nächsten( Schritt( galt( es,( die( CD34( positiven( und( lineage8negativen( Zellen( aufzufinden.(

Hierzu(wurden(die(als(lineage8negativ(markierten(Zellen(im(nächsten(Fenster(so(aufgetragen,(

dass( der( Forward( Scatter( auf( der( X8Achse( und( CD34( auf( der( Y8Achse( lagen.( ( Im( oberen(

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

27!

Mittelfeld(des(Dotplots( ließ( sich( so(eine( leicht( abzugrenzende(Population(an(CD34+(Zellen(

finden.( Diese( Zellen( wurden( im( letzten( Schritt( auf( ihre( Expression( von( CD10( und( CD24(

untersucht.(CD10(wurde(auf(der(Y8Achse(und(CD24(auf(der(X8Achse(aufgetragen.(Eine(sich(im(

oberen(linken(Quadranten(darstellende(Zellpopulation(war(die(gesuchte(CD34+CD10+CD248(

und(lineage8negative(Gruppe(an(lymphoiden(Progenitorzellen.(Die(absoluten(Zahlen(für(die(

lymphoiden(Progenitorzellen(wurden(auf(1x106(PBMCs(normalisiert.(

Die(Anzahl(der(CD34+(Stammzellen(wurde(in(einem(separaten(Dotplot(ermittelt,(bei(dem(auf(

der( X8Achse( des( Koordinatensystems( der( Sideward( Scatter( und( die( Y8Achse( CD34( APC(

aufgetragen(worden(waren.((

#

##################################

(

(

(

(

(

(

(

(

1.(Schritt:(Markierung(der(lineage8negativen(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((2.(Schritt:(Detektion(der(CD34(positiven(((((((((((((((((((PBMCs((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((lineage8negativen(Zellen(#

#

#

#

##

#

#

((3.(Schritt:(Erfassung(der(CD10+CD34+CD248(lineage8negativen(((((((lymphoiden(Progenitorzellen((((Abbildung(6:(Darstellung(der(einzelnen(Schritte(zur(Auswertung(des(Progenitor8Experiments(mittels(Dotplots(((((((((((((((((((((((((((((Beispieldotplots(generiert(mit(dem(Programm(WinMDI)((

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

28!

(2.7.#Erfassung#der#klinischen#Daten#der#Patienten#

#Bei(jedem(Patienten(wurden(am(Tag(der(Blutentnahme(mehrere(klinische(Daten(erhoben:(

der(CRP8Wert,(das(subjektive(Schmerzempfinden(auf(der(visuellen(Analogskala((VAS,(visuelle(

Analogskala)( sowie( der( Gelenkstatus( aller( Gelenke,( die( im( Disease8Activity8Score( DAS828(

(DAS,(Disease(Activity(Score)(nach(den(Vorgaben(der(EULAR(erfasst(werden.(Diese(sind(die(

proximalen( Interphalangealgelenke,( die( Metacarpophalangealgelenke,( die( Hand8,(

Ellenbogen8,(Schulter8(und(Kniegelenke(beidseits.((

Die(Gelenke(wurden(auf( Schwellung( (SW,( swollen( Joint)(und(Druckschmerzhaftigkeit( (TEN,(

tender( joint)( geprüft.( Hierfür( stand( ein( standardisierter( Erfassungsbogen( zur( Verfügung.(

Anschließend(wurde(nach(folgender(Formel(der(DAS828(errechnet:(

(

DAS828(=(0,56(x(√((TEN(28)(+(0,28(x(√((SW(28)(+(0,70(x(ln((CRP8Wert)(+(0,014(x((VAS(in(mm).(

(

Zusätzlich( wurde( das( Jahr( des( Krankheitsbeginns( vermerkt,( um( die( Erkrankungsdauer( zu(

ermitteln.(Ebenso(wurde(die(aktuelle(antirheumatische(Medikation(aufgenommen.(

#

#

#

#

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

29!

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

(

Abbildung(7:(Standardisierter(Erfassungsbogen(zur(Erhebung(der(klinischen(Parameter(der(RA8Patienten(

#

#

#

!

!

!Material(und(Methoden(

!! !

30!

#

2.8.#Statistische#Auswertung#der#Ergebnisse#

#Der(statistischen(Auswertung(der(Ergebnisse(diente(das(Programm(Graph(Pad(Prism(5.00(für(

Windows((GraphPad(Software,(San(Diego(Californien(USA,(www.graphpad.com)#

Die( Testung( der( ermittelten(Werte( auf(Normalverteilung( erfolgte( durch( den( Kolmogorow8

Smirnow( Test.( Von( einer( Normalverteilung( wurde( ausgegangen,( wenn( die(

Wahrscheinlichkeit(p,(dafür(dass(die(erhobenen(Werte(einer(Zufallsauswahl(von(Werten(aus(

einer(Gauss`schen(Verteilung(entsprechen(könnten,(>0,05(war.(

Für(die( statistische(Auswertung(der(Whisker(Plots(wurde(bei( normalverteilten(Werten(der(

student`s(t8Test(verwendet,(bei(solchen,(die(nicht(normalverteilt(waren,(der(Mann8Whitney8

Test.((

Für(normalverteilte(Bestimmungen(wurden(der(Mittelwert(und(der(SEM((Standard(error(of(

the( mean)( angegeben.( Bei( nicht( normalverteilten( Werten( wurden( der( Median( und( SEM(

angegeben.(

Alle(Unterschiede(mit(einem(p<0,05(wurden(als(statistisch(signifikant(angesehen.(

Für( die( Auswertung( der( Scatter( Plots( fand( die( Korrelationsanalyse( Anwendung.( Ein(

Zusammenhang( für( zwei( Werte( X( und( Y( wurde( dann( angenommen,( wenn( die(

Wahrscheinlichkeit( für( einen( statistischen( Zusammenhang( p<0,05( war.( Wobei( p( hier( die(

Wahrscheinlichkeit( dafür( ist,( dass( der( berechnete( Korrelationskoeffizient( r( so( weit( oder(

weiter(von(Null(entfernt(sein(könnte,(wie(bei(Berechnung(von(r(aus(einer(Zufallsstichprobe.(

Entsprechend(der(Verteilungen(der(erhobenen(Daten(wurde(für(normalverteilte(Werte(der(

Pearson( Korrelationskoeffizient( und( für( nicht( normalverteilte( Werte( der(

Korrelationskoeffizient(nach(Spearman(berechnet.(Zur(besseren(bildlichen(Darstellung(wurde(

in(die(Graphiken(zusätzlich(die(Regressionsgerade(eingefügt.(

(

#

#

(

(

!

!

!

!Ergebnisse)

!! !

31!

3.#Ergebnisse#)

Zur) Untersuchung) der) CD4+) T6Zellgenese) bei) Rheumatoider) Arthritis) wurden,) wie) oben)

beschrieben,) die) PBMCs) aus) dem) venösen) Blut) von) 28) RA6Patienten) aus) der)

Rheumatologischen) Ambulanz) des) Universitätsklinikums) Leipzig) und) von) 28)

altersentsprechenden,) gesunden) Kontrollen) gewonnen,) mit) floureszenz6markierten)

Antikörpern) angefärbt) und) anschließend) durchflusszytometrisch) untersucht,) um))

verschiedene)relevante)Leukozytenpopulationen)in)den)PBMCs)detektieren)zu)können.)

)

3.1.#Beschreibung#des#CD4+#T7Zellkompartiments#in#der#peripheren#Zirkulation#

#

Das) periphere) CD4+) T6Zellkompartiment) bei) Menschen,) die) unter) Rheumatoider) Arthritis)

leiden,)weist,)wie)eingangs)erläutert)(Einleitung)1.4,)siehe)auch)Diskussion)4.),)verschiedene)

typische) Veränderungen) auf.) Um) diese) nachzuvollziehen) und) die) Phänotypen) der)

zirkulierenden) T6Helferzellen) zu) charakterisieren,) wurde) je) ein) Anteil) der) gewonnenen)

PBMCs)mit) ) Antikörpern) gegen) die)Oberflächenmoleküle) CD4,) CD8,) CD25,) CD28,) CD45RA,)

CD45RO)und)CD85j) inkubiert.)So)konnten)verschiedene)relevante)Subgruppen)des)CD4+)T6

Zellpools) detektiert) und) Vergleiche) zwischen) den) bei) den) RA6Patienten) und) bei) gesunden)

Kontrollprobanden))erhobenen)Ergebnissen)durchgeführt)werden.)

)

Die) Gesamtzahl) der) CD46positiven) Lymphozyten) unterschied) sich) nicht) ) zwischen) RA6

Patienten) (Mean) ±) SEM) =) 47,45) ±) 2,53%) CD46Zellen) an) der) Gesamtlymphozytenzahl)) und)

gesunden)Kontrollen)(Mean)±)SEM)=)46,09))±�1,53%,)p)=)0,6498).)

)

)

)

3.1.1.#CD4+CD8+#doppelt#positive#T7Lymphozyten#in#der#peripheren#Zirkulation#

#

Gleichermaßen) auffällig) in) beiden) untersuchten) Gruppen) war) eine) Population) von)

CD4+CD8+)doppelt)positiven)T6Lymphozyten)mit)einem)Median)±)SEM)von)1,62)±)0,29%))bei)

den) RA6Patienten) bzw.) von) 1,41) ±) 0,24%) bei) den) gesunden) Kontrollen) an) der)

Gesamtlymphozytenzahl.) Ein) Unterschied) bezüglich) des) Anteils) dieser) doppelt) positiven)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

32!

Lymphozytenpopulation) an) der) Gesamtlymphozytenzahl) konnte) zwischen) den) beiden)

untersuchten)Gruppen)nicht)festgestellt)werden)(RA:)Median)±)SEM)=)1,62%)±)0,29%,)))

GK:)Median)±)SEM)=)1,41)±)0,24%,)p6Wert)=)0,7363).))

)

)

))))))))))))))))))))))))))))))))))))

Abbildung)8:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils) der)CD4+CD8+)doppelt)positiven)T6Zellen,)markiert)

mittels) PC65) CD46) und) FITC) CD86Antikörpern) an) der) Gesamtlymphozytenzahl) zwischen) RA6Patienten) und)

gesunden)Kontrollen.))

)

Bei)den)gesunden)Kontrollen)war)ein)signifikanter)Anstieg)der)Zahl)der)doppelt)positiven)T6

Zellen)mit) dem)Alter) festzustellen) (Spearmann) r) =) 0,4311,) p) =) 0,0122).) Bei) Patienten)mit)

Rheumatoider)Arthritis)war)dies)nicht)der)Fall)(Spearmann)r)=)0,02002,)p)=)0,9194).)

!

RA vs GK CD4+CD8+ DP

RA GK0

2

4

6

8

CD

4+C

D8+

dop

pelt

posi

tive

T-Ze

llen

an G

esam

tlym

phoz

yten

zahl

(%

)

RA: Alter vs CD4+CD8+DP

0 20 40 60 80 1000

2

4

6

8

AlterCD

4+C

D8+

dop

pelt

posi

tive

T-Ze

llen

an G

esam

tlym

phoz

yten

zahl

(%

)

)

)

)

)

Abbildung) 9:) Korrelation) des) Anteils)

CD4+CD8+)doppelt)positiver)T6Zellen)mit)dem)

Alter)bei)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis.)

Auf)der)X6Achse) ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)

der)Anteil)der)CD4+CD8+)doppelt)positiven)T6

Zellen)aufgetragen.)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

33!

!

GK: Alter vs CD4+CD8+DP

0 20 40 60 80 1000

2

4

6

8

AlterCD

4+C

D8+

dop

pelt

posi

tive

T-Ze

llen

an G

esam

tlym

phoz

yten

zahl

(%

)

)

Abbildung) 10:) Korrelation) des) Anteils) CD4+CD8+) doppelt) positiver) T6Zellen) mit) dem) Alter) bei) gesunden)

Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)Anteil)der)CD4+CD8+)doppelt)positiven)T6Zellen)

aufgetragen.)

#

#

#

3.1.2.#Frequenz#CD4+#CD28#negativer#T7Lymphozyten#in#der#peripheren#Zirkulation#

#

Durch) Anfärbung) mit) einem) Anti6CD28) PE6Antikörper) konnten) solche) T6Helferzellen)

detektiert)werden,) die)das) entsprechende) kostimulatorische)Oberflächenmolekül) auf) ihrer)

Oberfläche)trugen,)und) im)Gegenzug)ebenso)solche,)die)diesen)Oberflächenmarker)bereits)

verloren) hatten.) Auch) hier) fand) sich) in) der) Anzahl) dieser) Zellen) prozentual) an) der)

Gesamtzahl) CD4+) Lymphozyten) kein) signifikanter) Unterschied) zwischen) den) beiden)

untersuchten)Gruppen)(Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis:)Median)±)SEM)=)0,43)±)0,68%,)

gesunde)Kontrollen:)Median)±)SEM)=)0,52)±)0,60%,)p)=)0,9530).)

Trotz)des))bekannten)Zusammenhangs)zwischen)der)Anzahl)der)CD4+CD286)T6Lymphozyten)

und) dem) Alter) (zB:) Weyand) et) al.) 1998)) konnte) in) beiden) untersuchten) Gruppen) keine)

signifikante) Korrelation) zwischen) diesen) beiden) Parametern) nachgewiesen) werden)

(Spearman)r)=)0,1475,)p)=)0,4538)für)RA6Patienten,)Spearman)r)=)0,1390,))))))))))))

p)=)0,4403)für)gesunde)Kontrollen).))

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

34!

!

RA: Alter vs CD4+D28-

0 20 40 60 80 1000

5

10

15

20

Alter

CD

4+C

D28

- Ze

llen

an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

)

Abbildung)11:)Korrelation)der)CD286defizienten)CD4+)T6Zellen)mit)dem)Alter)bei))Patienten)mit)Rheumatoider)

Arthritis.) Auf) der) X6Achse) ist) das) Alter,) auf) der) Y6Achse) der) Anteil) CD4+CD286) T6Zellen) an) allen) CD4+)

Lymphozyten)aufgetragen.)

)

)

)

GK: Alter vs CD4+CD28-

0 20 40 60 80 1000

5

10

15

20

Alter

CD

4+C

D28

- Ze

llen

an C

D4+

Lym

phoz

yten

(%

)

)

)

Abbildung)12:)Korrelation)der)CD286defizienten)CD4+)T6Zellen)mit)dem)Alter)bei))gesunden)Kontrollen.)Auf)der)

X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)Anteil)CD4+CD286)T6Zellen)an)allen)CD4+)Lymphozyten)aufgetragen.)

#

#

!

!

!Ergebnisse)

!! !

35!

#

3.1.3.#Untersuchung#der#CD85j#positiven#T7Helferzellpopulation#

#

)

Das) inhibitorisch)wirkende)Oberflächenmolekül)CD85j)oder)auch) leukocyte) Ig6like) receptor)

(LIR61))genannt,)wird)auf)einer)ganzen)Reihe)von)Zellen)der)angeborenen)und)erworbenen)

Immunabwehr) exprimiert,) wie) zum) Beispiel) NK6Zellen,) Monozyten,) Dendritische) Zellen))

sowie) auf) CD8) und) auch) auf) CD4) positiven) T6Zellen.) In) den) beiden) in) dieser) Arbeit)

untersuchten) Gruppen) konnte) nach) Inkubation) der) PBMCs) mit) einem) FITC6konjugierten)

Antikörper) gegen) CD85j) kein) Unterschied) hinsichtlich) der) Expression) von) CD85j) auf) CD4+)

Lymphozyten)nachgewiesen)werden)(Median)±)SEM)=)0,55)±)0,56%)bei)RA6Patienten,))

Median)±)SEM)=)0,41)±)0,57%)bei)gesunden)Kontrollen,)p)=)0,6194).)

)

)

)

In) Zusammenschau) der) Ergebnisse) für) die) bisher) beschriebenen) CD4+) T6Zellpopulationen)

fielen)interessante)Korrelationen)auf.)

So)konnten)sowohl)für)die)RA6Patienten)(Spearmann)r)=)0,8503,)p)<)0,0001))als)auch)für)die)

gesunden)Kontrollen)(Spearman))r)=)0,8969,)p)<)0,0001))signifikante)Korrelationen)zwischen)

den)Werten)für)CD4+CD286)und)CD4+CD85j+)T6Helferzellen)nachgewiesen)werden.)

Für)die)RA6Patienten)galt)dies)auch)für)Korrelationen)zwischen)CD4+CD8+)doppelt)positiven)

T6Zellen)und)CD4+CD286)bzw.)CD4+CD85j+)T6Zellen))

(Korrelationsanalyse) CD4+CD8+) doppelt) positive) Lymphozyten) mit) CD4+CD286) T6Zellen:)

Spearman) r) =) 0,5892,) p) =) 0,0010,) ) Korrelationsanalyse) CD4+CD8+) doppelt) positive)

Lymphozyten)mit))CD4+CD85j+)T6Zellen:)Spearman)r)=)0,5582,#p)=)0,0020))

Für) die) Kontrollgruppe) konnte) dieser) Zusammenhang) nicht) nachgewiesen) werden)

(Korrelationsanalyse) CD4+CD8+) doppelt) positive) Lymphozyten) mit) CD4+CD85j+) T6Zellen:)

Spearman) r) =) 0,2675,) p) =) 0,1773,) Korrelationsanalyse) CD4+CD8+) doppelt) positive)

Lymphozyten)mit)CD4+CD286)T6Zellen:)Spearman)r)=)0,2868,)p)=)0,1470).)

)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

36!

)

)

RA: CD4+CD28- vs CD4+CD85+

0 5 10 15 200

5

10

15

CD4+CD28- an CD4+ Lymphozyten (%)

CD

4+C

D85

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

)

)

Abbildung) 13:) Korrelation) der) CD4+CD85j+) T6Zellen) mit) den) CD4+CD286) T6Zellen) bei) Patienten) mit)

Rheumatoider)Arthritis.)Auf)der)X6Achse)ist)der)prozentuale)Anteil)der)CD4+CD286)T6Helferzellen)an)allen)CD4+)

T6Zellen,) auf) der) Y6Achse) der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD85j+) T6Helferzellen) an) der) Gesamtzahl) CD4+) T6

Zellen))aufgetragen.)

)))))))))))))))))))))))

)

GK: CD4+CD28- vs CD4+CD85+

0 5 10 15 200

5

10

15

CD4+CD28- an CD4+ Lymphozyten (%)

CD

4+C

D85

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

))))))))))))))))))))))))

Abbildung)14:)Korrelation)der)CD4+CD85j+)T6Zellen)mit)den)CD4+CD286)T6Zellen)bei)gesunden)Kontrollen.)Auf)

der)X6Achse) ist)der)prozentuale)Anteil)der)CD4+CD286)T6Helferzellen)an)allen)CD4+)T6Zellen,)auf)der)Y6Achse)

der)prozentuale)Anteil)der)CD4+CD85j+)T6Helferzellen)an)der)Gesamtzahl)CD4+)T6Zellen))aufgetragen.)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

37!

RA: CD4+CD8+DP vs CD4+CD28-

0 2 4 6 80

5

10

15

20

CD4+CD8+ doppelt positive T-Zellen anGesamtlymphozytenzahl (%)

CD

4+C

D28

- an

CD

4+Ly

mpo

zyte

n (%

)

!!!))))))))))))))))))))))))))))

Abbildung)15:)Korrelation)der)CD4+CD286)T6Zellen)mit)den)CD4+CD8+)doppelt)positiven)T6Zellen)bei)Patienten)

mit) Rheumatoider) Arthritis.) Auf) der) X6Achse) ist) der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD8+) doppelt) positiven) T6

Zellen)an)der)Gesamt6T6Zellzahl,)auf)der)Y6Achse)der)prozentuale)Anteil)der)CD4+CD286)T6Helferzellen)an)der)

Gesamtzahl)CD4+)T6Zellen))aufgetragen.)

)

)

RA: CD4+CD8+DP vs CD4+CD85+

0 2 4 6 80

5

10

15

CD4+CD8+ doppelt positive T-Zellen an Gesamtlymphozytenzahl (%)

CD

4+C

D85

+ an

CD

4+Ly

mph

oyzt

en (

%)

))))))))))))))

#Abbildung) 16:) Korrelation) der) CD4+CD85j+) T6Zellen) mit) den) CD4+CD8+) doppelt) positiven) T6Zellen) bei))

Patienten) mit) Rheumatoider) Arthritis.) Auf) der) X6Achse) ist) der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD8+) doppelt)

positiven) T6Zellen) an) der) Gesamt6T6Zellzahl,) auf) der) Y6Achse) der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD85j+) T6

Helferzellen)an)der)Gesamtzahl)CD4+)T6Zellen))aufgetragen.)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

38!

#

3.1.4.#CD4+CD25+#T7Zellen:#aktivierte#T7Helferzellen#und#T7regulatorische#Zellen#

#

CD25) ist)die)α6Kette)des) Interleukin626Rezeptors)und)wird)von)aktivierten) reifen)B6)und)T6

Zellen)sowie)von)frühen)B6)und)T6Zellvorläufern)exprimiert.)Anhand)der)Höhe)der)Expression)

des) CD6Moleküls) CD25) können) CD4+) T6Zellen) in) zwei) Gruppen) eingeteilt) werden,) ) die)

CD4+CD25low) T6Zellen) sind) sogenannte) aktivierte) T6Helferzellen,) CD4+CD25

high) T6Zellen)

werden)als)„regulatorische)T6Zellen“)(Treg))bezeichnet.)

In)den)durchgeführten)Experimenten)zeigte) sich,)dass)RA6Patienten) in) signifikantem)Maße))

mehr) aktivierte) T6Helferzellen) in) der) peripheren) Zirkulation) aufweisen) als) gesunde)

Kontrollen)(Mean)±)SEM)=)53,21)±)2,36%)versus)36,07)±)2,36%,)p)<)0,0001).)Ebenso)kam)es)

in)der)Gruppe)der)RA6Patienten)zu)einem)signifikanten)Anstieg)des)Anteils)CD4+)CD25low)T6

Zellen)mit)dem)Alter) (Pearson)r=)0,4104,)p)=)0,0301).)Ein)signifikanter)Zusammenhang)mit)

der)Erkrankungsdauer)oder)anderen)klinischen)Parametern)bestand)nicht.))Für)die)gesunden)

Kontrollen) konnte) ein) Anstieg) der) aktivierten) CD4+) T6Zellen) mit) dem) Alter) nicht)

nachgewiesen) werden) (Pearson) r) =) 0,1652,) p) =) 0,3583).) Im) Bezug) auf) den) prozentualen)

Anteil) der) regulatorischen) T6Zellen) an) der) Gesamt6T6Helferzellzahl) konnte) kein) statistisch)

relevanter) Unterschied) zwischen) den) beiden) untersuchten) Gruppen) gefunden) werden)

(Mean)±)SEM)bei)RA6Patienten)=)3,83)±)0,34%,)Mean)±)SEM)bei)gesunden)Kontrollen)=)3,74)

±)0,29%,)p)=))0,8375).)

RA vs GKCD4+CD25low aktivierte T-Zellen

RA GK0

20

40

60

80

100

CD

4+C

D25

low

akt

ivie

rte

T-Ze

llen

an C

D4+

Lym

phoz

yten

(%)

))))))))))))))))))))))))))))))))))))

Abbildung)17:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)CD4+CD25low)aktivierter)T6Zellen)an)der)CD4+)

Lymphozytenzahl)bei)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen))

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

39!

)

RA: Alter vs aktivierte CD4+ T-Zellen

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Alter

CD

4+C

D25

low

akt

ivie

rte

T-Ze

llen

an C

D4+

Lym

phoz

yten

(%)

)

)

Abbildung) 18:) Korrelation) des) Alters) mit) CD4+CD25low) aktivierten) T6Zellen) bei) Patienten) mit) Rheumatoider)

Arthritis.)Auf)der)X6Achse)wurde)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)prozentuale)Anteil)CD4+CD25low)aktivierter)T6

Zellen)an)der)CD4+)Lymphozytenzahl)aufgetragen.)

)

)

RA vs GKCD4+CD25high regulatorische T-Zellen

RA GK0

2

4

6

8

10

CD

4+C

D25

hig

hTr

egs

an C

D4+

Lym

phoz

yten

(%)

)

Abbildung)19:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)CD4+CD25high

)regulatorischer)T6Zellen)an)der)CD4+)

Lymphozytenzahl)bei)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen))

)

)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

40!

)

3.1.5.#Quantifizierung#von#naiven#versus#Memory7T7Helferzellen#

#

Der) Oberflächenmarker) CD45RA) ist) ein) hochmolekulares) transmembranöses) Protein,) das)

eine) intrinsische) Tyrosinphosphataseaktivität) aufweist.) Es)wird) auf) naiven)CD4+)und)CD8+)

Lymphozyten)sowie)einer)Reihe)von)B6Zellen,)NK6Zellen)und)Monozyten)exprimiert.)

Im)T6Helferzellkompartiment)charakterisiert)es)die)naiven)Zellen.)

Nach) Antigenkontakt) kommt) es) zum) Verlust) von) CD45RA) auf) der) Oberfläche) der) CD4+T6

Zellen.) Stattdessen) wird) CD45RO) exprimiert.) Dieser) Oberflächenmarker) ist) ein) Produkt)

alternativen)Splicings)und)charakterisiert)die)Memory6Zellen.)

Mittels) Durchflusszytometrie) wurden) im) peripheren) Blut) der) untersuchten) Probanden)

sowohl) die) Gruppe) der) CD4+CD45RA+) als) auch) der) CD4+CD45RO+) T6Zellen) untersucht.)

Während)der)Auswertung)war)weiterhin)auch)eine)Gruppe)CD4+CD45RA+CD45RO+)doppelt)

positiver)Zellen)auffällig,)sodass)diese)ebenfalls)quantifiziert)wurde.)

Hinsichtlich)des)Anteils)CD4+CD45RA+)und)CD4+CD45RO+)Lymphozyten)an)der)Gesamtzahl)

der)CD4+Lymphozyten)unterschieden)sich)die)beiden)untersuchten)Gruppen)nicht)signifikant)

(CD45RA:)Mean)±)SEM)=)39,28)±)3,68%)bei)RA,)Mean)±)SEM)=)37,89)±)2,10%)bei)gesunden)

Kontrollen,)p)=)0,7494;)CD45RO:)Mean)±)SEM)=)38,70)±)3,21%)bei)RA,)Mean)±)SEM)=)36,86)±)

1,73%)bei)gesunden)Kontrollen,)p)=)0,6233).)Für)die)CD4+CD45RO+)Memory6Zellpopulation)

ist)ein)Anstieg)im)Alter)(>70)Jahre))beschrieben)worden)(Naylor)et)al.)2005).)Dieser)konnte,)

wohl)auch)wegen)der)zu)geringen)Probenzahl,) in)dieser)Arbeit)nicht)nachvollzogen)werden)

(RA:) Pearson) r) =) 60,006270,) p) =) 0,9747,) GK:) Pearson) r) =) 0,3092,) p) =) 0,1243).) Ebenfalls)

beschrieben) worden) ist) eine) kleine) Population) CD4+CD45RA+CD45RO+) doppelt) positiver)

Zellen.) Es) wird) vermutet,) dass) es) sich) hierbei) um) ruhende) Memory6Zellen) handelt.)

Hinsichtlich)dieser) Zellen)unterschieden) sich)die)untersuchten)RA6Patienten)und)gesunden)

Kontrollen)in)signifikantem)Maße)(Mean)±)SEM)=)25,23)±)1,10%)bei)den)gesunden)Kontrollen)

und))Mean)±)SEM)=)21,60))±)1,41%)bei)den)rheumatologischen)Patienten,)p)=)0,0499).)

)

)

)))))))))))))))))))

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

41!

)

)

RA vs GK CD45RA

RA GK0

20

40

60

80

100

CD

4+C

D45

RA

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

)

))))))))))))))))))

Abbildung)20:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)CD4+CD45RA+)T6Zellen)an)der)Gesamtzahl)CD4+)T6

Zellen)bei)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis)und)gesunden)Kontrollen.)

)

)))))))

)))))))))))

))

RA vs GK CD45RO

RA GK0

20

40

60

80

CD

4+C

D45

RO

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (%

)

))

)

Abbildung)21:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)CD4+CD45RO+)T6Zellen)an)der)Gesamtzahl)CD4+)T6

Zellen)bei)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis)und)gesunden)Kontrollen.)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

42!

)

)

RA vs GK CD45 DP

RA GK0

10

20

30

40

50

CD

4+C

D45

RA

+CD

45R

o+ a

n C

D4+

Lym

phoz

yten

(%

)

)

)

Abbildung)22:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)CD4+CD45RA+CD45RO+)T6Zellen)an)der)Gesamtzahl)

CD4+)T6Zellen)bei)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis)und)gesunden)Kontrollen.)

)

)

3.2.#Recent#thymic#emigrants:#CD31+#thymic#naive#T7Zellen#

#

CD31,)auch)bekannt)als)„platelet)endothelial)cell)adhesion)molecule)1“)(PECAM61),)wird)auf)

Monozyten,) Thrombozyten,) Granulozyten) und) auf) einer) Untergruppe) von) CD4+) T6Zellen)

exprimiert.)Solche)CD4+)T6Zellen,)die)auf)ihrer)Oberfläche)das)Molekül)CD31)aufweisen,)sind)

CD45RA+) und) gehören) zu) einer) Zellpopulation,) die) gerade) erst) den) Thymus) verlassen) hat)

(recent) thymic) emigrants) –) RTEs).)Man)bezeichnet) sie) als) „thymic) naive“.) Im)Rahmen)der)

peripheren)Proliferation)verlieren)die)CD4+CD45RA+)Zellen)CD31)auf) ihrer)Oberfläche)und)

werden)fortan)„central)naive“)genannt.)

Viele)Autoren)konnten)bei)RA6Patienten)im)Vergleich)zu)altersgleichen)gesunden)Individuen)

reduzierte) Werte) für) RTEs) nachweisen.) Um) dies) nachzuvollziehen,) wurden,) wie) oben)

beschrieben,) PBMCs) mit) Antikörpern) gegen) CD4,) CD45RA) und) CD31) angefärbt,) um) die)

Population) der) thymic) naiven) T6Zellen) innerhalb) des) CD4+T6Zellkompartiments) zu)

detektieren.))

!

!

!Ergebnisse)

!! !

43!

Der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD45+CD31+) Zellen) an) allen) T6Helferzellen) war) bei)

gesunden)Kontrollen) signifikant)höher) als)bei)RA6Patienten) (Mean)±) SEM)=)42,24)±)3,38%))

bei)gesunden)Kontrollen,)Mean)±)SEM)=)31,87)±)2,75%)bei)RA6Patienten,)p)=)0,0207).)

)

thymic-naive CD4+CD45+CD31+

RA GK0

20

40

60

80

CD

45R

A+C

D31

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

))

)

Abbildung) 23:) Boxplot.) Vergleich) des) prozentualen) Anteils) CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) an) der) Gesamtzahl))

CD4+)T6Zellen)zwischen)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen.)

)

)

Es) ist) bekannt,) dass) die) Zahl) der) CD31)T6Helferzellen)mit) dem)Alter) abnimmt.) Eine) solche)

Korrelation) konnte) in) den) durchgeführten) Experimenten) aber) weder) für) RA6Patienten)

(Pearson)r)=)60,3846,)p)=)0,0700))noch)für)die)Kontrollgruppe)(Pearson6r)=)60,2546,))

p)=)0,2928))nachgewiesen)werden.)

)

RA: Alter vs thymic-naive

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

Alter

CD

45R

A+C

D31

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

)

)

)

Abbildung) 24:) Korrelation) des) Alters) mit)

dem) prozentualen) Anteil)

CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) an) der)

Gesamtzahl))CD4+)T6Zellen)bei)Patienten)mit)

Rheumatoider)Arthritis.) Auf) der) X6Achse) ist)

das) Alter,) auf) der) Y6Achse) der) Anteil)

CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) an) der)

Gesamtzahl))CD4+)T6Zellen)aufgetragen.)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

44!

)

)

GK: Alter vs thymic-naive

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

Alter

CD

45R

A+C

D31

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

Abbildung) 25:) Korrelation) des) Alters) mit) dem) prozentualen) Anteil) CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) an) der)

Gesamtzahl) )CD4+)T6Zellen)bei)gesunden)Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)Anteil)

CD4+CD45RA+CD31+)T6Zellen)an)der)Gesamtzahl))CD4+)T6Zellen)aufgetragen.)

#

#

#

3.3.#Zirkulierende#lymphoide#Progenitoren#

#

Die)T6Zellgenese)beginnt)im)Knochenmark.)Von)hier)aus)wandern)T6Vorläuferzellen)über)die)

periphere)Zirkulation)in)den)Thymus)ein.)Denkbar)wäre,)dass)neben)anderen)Mechanismen)

ein) Mangel) an) Thymusinput) für) einen) Mangel) an) Thymusouptut) und) damit) für) die)

reduzierten)RTE6Werte)verantwortlich)ist.)Auf)der)Grundlage)der)Entdeckungen)von)Six)et)al.)

(siehe) Einleitung) 1.3.2)) wurde) eine) Population) von) CD34+) Zellen) im) peripheren) Blut)

untersucht,) die) fähig) ist,) den) Thymus) zu) besiedeln.) Diese) Zellen) zeichnen) sich) durch) die)

Expression) von) CD10) und) das) Fehlen) von) lineage6determinierenden)Molekülen) sowie) von)

CD24)auf)ihrer)Oberfläche)aus)(Six,)E.)et)al.,)2007).)

Die)Anzahl)dieser)Gruppe)von)CLPs)pro)1)x)106)PBMCs)war)bei)den)RA6Patienten)im)Vergleich)

zu)den)gesunden)Kontrollen)signifikant)erhöht)(Mean)±)SEM)Wert)bei)RA6Patienten)=)44,36)±)

4,95,)Mean)±)SEM)bei)gesunden)Kontrollen)=)27,18)±)2,85,)p)=)0,0040))

Dieser)Unterschied)wurde)noch)deutlicher,)wenn)man)die)Gruppe)der)gesunden)Kontrollen)

nur)mit)denjenigen)RA6Patienten)verglich,)die)positiv)für)das)shared)epitope)(RA6SE+))waren)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

45!

(Mean)±) SEM)bei) RA6SE+)=) 47,47)±) 6,23,)Mean)±) SEM)bei) gesunden)Kontrollen) =) 27,18)±)

2,85,)p)=)0,0020).)

Präthymozyt

RA GK0

20

40

60

80

100

Prä

thym

ozyt

en /

1x10

6 PB

MC

s

)

)

Abbildung)26:)Boxplot.)Vergleich)der)Anzahl)der)Präthymozyten) (PT))an)1x106)PBMCs)zwischen)RA6Patienten)

und)gesunden)Kontrollen.)))))))))))))))))))))))))))))

#

#

RA SE+ vs GK Präthymozyt

RA SE+

GK 0

20

40

60

80

100

Prä

thym

ozyt

en /

1x10

6 PB

MC

s

##

Abbildung)27:)Boxplot.)Vergleich)der)Anzahl)der)Präthymozyten)(PT))an)1x106)PBMCs)zwischen)shared)epitope)

positiven)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen.)))))))))))))))))))))))))))))

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

46!

In) der) Untersuchung) auf) Zusammenhänge) zwischen) der) Krankheitsaktivität) der) RA6

Patienten,)dargestellt)durch)den)CRP6Wert)zum)Zeitpunkt)der)Blutentnahme)bzw.)durch))den)

CRP6DAS628) oder) der) Erkrankungsdauer) und) dem) Auftreten) des) Präthymozyten,) konnten)

keine)statistisch)relevanten)Ergebnisse)erbracht)werden.)

)

)

Auffällig) war) eine) positive) Korrelation) der) Anzahl) der) Präthymozyten)mit) dem) Anteil) von)

RTEs) an) CD4+) T6Zellen) in) der) Gruppe) der) gesunden) Kontrollen) (Pearson) r) =) 0,483,) p) =)

0,0362).) Bei) den) RA6Patienten) konnte) keine) solche) Korrelation) nachgewiesen) werden)

(Pearson)r)=)0,338,)p)=)0,1149).)

)

)

#

GK: PT/PBMCs vs thymic-naive

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

PT/ 1x106 PBMCs

CD

45R

A+C

D31

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

))

)

#

Abbildung) 28:) Korrelation) des) prozentualen) Anteils) CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) mit) der) Anzahl) des)

Präthymozyten)an)1x106)PBMCs)bei)gesunden)Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)wurde)die)Präthymozytenzahl,)auf)

der) Y6Achse) der) prozentuale) Anteil) der) CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) an) der) Gesamtzahl) ) CD4+) T6Zellen)

aufgetragen.)

)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

47!

RA: PT/PBMCs vs thymic-naive

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

PT/ 1x106 PBMCs

CD

45R

A+C

D31

+ an

CD

4+Ly

mph

ozyt

en (

%)

))

Abbildung) 29:) Korrelation) des) prozentualen) Anteils) CD4+CD45RA+CD31+) T6Zellen) mit) der) Anzahl) der)

Präthymozyten)an)1x106)PBMCs)bei)RA6Patienten.)Auf)der)X6Achse)wurde)die)Präthymozytenzahl,) auf)der)Y6

Achse)der)prozentuale)Anteil)der)CD4+CD45RA+CD31+)T6Zellen)an)der)Gesamtzahl))CD4+)T6Zellen)aufgetragen.)

)

)

Ebenso) fand) sich) ein) signifikanter) Rückgang) der) Präthymozyten) mit) dem) Alter) bei) den)

gesunden) Kontrollen) (Pearson) r) =) 60,411,) p) =) 0,0297).) Wiederum) konnte) dieser)

Zusammenhang)nicht)für)die)RA6Patienten)nachgewiesen)werden)(Pearson)r)=)60,1152,)p)=)

0,5594).)

GK: Alter vs Präthymozyt

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Alter

Prä

thym

ozyt

en /

1x10

6 PB

MC

s

#Abbildung)30:)Korrelation)des)Alters)mit)der)Präthymozytenzahl)bei)gesunden)Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)ist)

das)Alter,)auf)der)Y6Achse)die)Zahl)der)Präthymozyten)pro)1x106)PBMCs)aufgetragen.)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

48!

#

#

RA: Alter vs Präthymozyt

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Alter

Prä

thym

ozyt

en /

1x10

6 PB

MC

s

#Abbildung)31:)Korrelation)des)Alters)mit)der)Präthymozytenzahl)bei)RA6Patienten.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)

auf)der)Y6Achse)die)Zahl)der)Präthymozyten)pro)1x106)PBMCs)aufgetragen.)

#

#

3.4.#CD34#positive#hämatopoetische#Stammzelle#

#

Die) T6Zellgenese) hin) zum) reifen) zirkulierenden) T6Zellkompartiment) beginnt) im)

Knochenmark.) Es) ist) allgemein) anerkannt,) dass) sich) alle) hämatopoetischen) Zellreihen) aus)

pluripotenten) CD34+) Stammzellen) entwickeln.) Auch) in) der) peripheren) Zirkulation) sind)

solche) CD34+) Zellen) nachweisbar.)Mittels) eines) CD34) APC6Antikörpers) wurden) diejenigen)

PBMCs)markiert,)die)dieses)Oberflächenmolekül)auf)ihrer)Oberfläche)trugen,)um)die)Anzahl)

dieser)Zellen)bei)den)beiden)Untersuchungsgruppen)vergleichen)zu)können.)

Weder)für)die)Gesamtheit)der)CD34+)Zellen)an)den)PBMCs)(Median)±)SEM)bei)RA)=)0,079)±)

0,012%,)Median)±)SEM)bei)gesunden)Kontrollen)=))0,078)±)0,009%,)p)=)0,4362))noch)für)die)

lineage6negativen)CD34+)Zellen)(Median)±)SEM)bei)RA6Patienten)=)0,018)±)0,005%,)Median)±)

SEM)bei)gesunden)Kontrollen)=)0,014)±)0,011%,)p)=)0,0961))konnte)ein)Unterschied)

zwischen)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen)erfasst)werden.)

)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

49!

)

)

CD34+ Stammzellen

RA GK0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

CD

34+

Sta

mm

zelle

n an

PB

MC

s (%

)

)

CD34+lin- Stammzellen

RA GK0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

CD

34+l

in-

an P

BM

Cs

(%)

)

))

Abbildung)32:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)

aller)CD34+)hämatopoetischen)Stammzellen)an)den)PBMCs)

zwischen)RA6Patienten)und)gesunden)Kontrollen.)

)

Abbildung)33:)Boxplot.)Vergleich)des)prozentualen)Anteils)

CD34+) lineage6negativer) hämatopoetischer) Stammzellen)

an) den) PBMCs) zwischen) RA6Patienten) und) gesunden)

Kontrollen.)

)

)

Auch)für)CD34+)und)CD34+lin6)Stammzellen)erbrachten)die)Auswertungen)keine)statistisch)

relevanten) Zusammenhänge) mit) Erkrankungsschwere,) repräsentiert) durch) CRP) zum)

Zeitpunkt)der)Blutentnahme)und)CRP6DAS)28)oder)Erkrankungsdauer.)

)

)

Zu) bemerken) war) allerdings) wieder) für) die) gesunde) Kontrollgruppe) eine) signifikante)

Abnahme)sowohl)der)gesamten)CD34+)Zellen)(Pearson)r)=)60,473,)p)=)0,0111))als)auch)der)

lineage6negativen)CD34+)Zellen)(Spearman)r)=)60,4516,)p)=)0,0159))mit)dem)Alter.))

Erneut) konnte) dies) nicht) bei) den) RA6Patienten) nachgewiesen)werden) (Gesamtzahl) CD34+)

Zellen:) Spearman) r) =) 60,2823,) p) =) 0,1455,) lin6) CD34+) Zellen:) Spearman) r) =) 0,2116,) p) =)

0,2682).)

)))))))))))

)

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

!

!

!Ergebnisse)

!! !

50!

RA: Alter vs CD34+ Stammzelle

0 20 40 60 80 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

AlterCD

34+

Stam

mze

llen

an P

BM

Cs

(%)

)

)

Abbildung)34:)Korrelation)des)Alters)mit)dem)Anteil)aller)CD34+)Stammzellen)an)den)PBMCs)bei)Patienten)mit)

Rheumatoider) Arthritis.) Auf) der) X6Achse) ist) das) Alter,) auf) der) Y6Achse) der) prozentuale) Anteil) der) CD34+)

Stammzellen)an)der)Gesamtzahl)der)PBMCs)aufgetragen.)

)

)

)

)

GK: Alter vs CD34+ Stammzelle

0 20 40 60 80 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

AlterCD

34+

Stam

mze

llen

an P

BM

Cs

(%)

))

)

Abbildung) 35:) Korrelation) des) Alters)mit) dem) Anteil) aller) CD34+) Stammzellen) an) den) PBMCs) bei) gesunden)

Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)prozentuale)Anteil)der)CD34+)Stammzellen)an)der)

Gesamtzahl)der)PBMCs)aufgetragen.)

)

)

)

)

!

!

!Ergebnisse)

!! !

51!

RA: Alter vs CD34+lin- Zellen

0 20 40 60 80 1000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Alter

CD

34+l

in- a

n PB

MC

s (%

)

))

Abbildung)36:)Korrelation)des)Alters)mit)dem)Anteil)lineage6negativer)CD34+)Stammzellen)an)den)PBMCs)bei)

Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)prozentuale)Anteil)der)

lin6)CD34+)Stammzellen)an)der)Gesamtzahl)der)PBMCs)aufgetragen.)

)

)

)

)

GK: Alter vs CD34+lin- Zellen

0 20 40 60 80 1000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Alter

CD

34+l

in- a

n PB

MC

s (%

)

)

!Abbildung)37:)Korrelation)des)Alters)mit)dem)Anteil)lineage6negativer)CD34+)Stammzellen)an)den)PBMCs)bei)

gesunden)Kontrollen.)Auf)der)X6Achse)ist)das)Alter,)auf)der)Y6Achse)der)prozentuale)Anteil)der)lin6)CD34+)

Stammzellen)an)der)Gesamtzahl)der)PBMCs)aufgetragen.)

)

!

!

!

!

!Diskussion!

!! !

52!

4.#Diskussion##

Die)Rheumatoide)Arthritis)ist)eine)Autoimmunerkrankung,)die)mit)typischen)Veränderungen)

der)adaptiven)Immunabwehr)und)insbesondere)des)CD4+)TAZellkompartimentes)einhergeht.)

Im) Rahmen) dieser) Studie) wurde) versucht,) bereits) ) bekannte) Veränderungen)

nachzuvollziehen,) eventuelle) weitere,) assoziierte) Auffälligkeiten) nachzuweisen) und) der)

Ursache) dieser) Abweichungen) nachzugehen.) Hierzu) wurden) relevante)

Lymphozytenpopulationen,) eine) anzunehmende,) den) Thymus) besiedelnde) lymphozytäre)

Vorläuferzelle)sowie)CD34+)Stammzellen)aus)dem)peripheren)Blut)von)28)RAAPatienten)und)

altersgleichen,) gesunden) Kontrollen) mittels) immunzytologischer) Färbung) und)

Durchflusszytometrie)untersucht.)

)

4.1.#Das#periphere#CD4+#T4Zellkompartiment#bei#der#RA#

#

Man) war) lange) der) Annahme,) dass) CD4+CD8+) doppelt) positive) TAZellen) beim) Menschen)

allein) als) unreife) Zellen) im) Thymus) während) der) TAZellreifung) vorkommen) würden) (s.o.)

Einleitung)1.3.3).)Es)ist)allerdings)bekannt,)dass)solche)doppelt)positiven)TAZellen)bei)vielen)

Spezies,)wie) Schweinen,)Hühnern) und)Affen,) in) der) peripheren) Zirkulation) zu) finden) sind.)

Dass)solche)Zellen)auch)beim)gesunden)Menschen)in)geringem)Maße)im)Blut)zu)detektieren)

sind,) wurde) erstmals) von) Blue) et) al.) beschrieben.) Hier) wurden) Anteile) von) CD4+CD8+)

doppelt)positiven)TAZellen)von)rund)3)±)0,5%)(mit)MinimalA)und)Maximalwerten)von)0,5)und)

8%))an)der)GesamtATAZellzahl)bei)gesunden)erwachsenen)Probanden)nachgewiesen)(Blue)et)

al.)1985).)Später)beschrieben)auch)andere)Autoren)diese)Zellen)im)peripheren)menschlichen)

Blut)(Sala)et)al.)1993,)Tonutti)et)al.)1994).)Außerdem)wurde)ein)gehäuftes)Vorkommen)der)

DPATAZellen) bei) einigen) Erkrankungen) unterschiedlichster) Art,) wie) unter) anderem) akuten)

EBVA)und)CMVA)Infektion,)solide)Malignome)wie)BrustA)Ovarialkarzinom,)hämatologische)und)

Autoimmunerkrankungen) wie) Polyzythämia) vera,) Haarzellleukämie) und) ChurgAStrauss)

Syndrom)nachgewiesen)(Ortolani)et)al.)1993).)

Die) Tatsache,) dass) bei) diesen) CD4+CD8+) TAZellen) das) Oberflächenmolekül) CD1,) welches)

typisch) für) Thymozyten) ist,) nicht) exprimiert) wird,) zeigt) eindeutig,) dass) es) sich) bei) diesen)

zirkulierenden) Zellen) nicht) etwa) um) unreife) Zellen) handelt,) die) vorzeitig) den) Thymus)

verlassen)hätten,)sondern)dass)diese)vielmehr)reife)TAZellen)sind,)die)zur)Expression)beider)

!

!

!Diskussion!

!! !

53!

Korezeptoren)in)der)Lage)sind)(Sala)et)al.)1993,)Zuckermann)1999).)Hierfür)spricht)auch,)dass)

die)meisten)DPAZellen) in)der)Peripherie)das)Oberflächenmolekül)CD45RO)exprimieren,)also)

Zeichen)von)Antigenkontakt)aufweisen)(Colombatti)et)al.)1998).)

Ghia)und)Kollegen)unterschieden)unter)den)DPAZellen)des)peripheren)Blutes)zwei)Gruppen:)

CD4highCD8low) und) CD4lowCD8high.) Diese) Unterscheidung) wurde) für) die) vorliegende) Arbeit)

nicht)getroffen.)Des)Weiteren)konnten)Ghia)et)al.)zeigen,)dass)es)zu)einem)altersabhängigen)

Anstieg) sowohl) des) prozentualen) Anteils) der) CD4+CD8+) doppelt) positiven) TAZellen) an) der)

Gesamtlymphozytenzahl)mit)im)Durchschnitt)einem)Anteil)von)1,30%)bei)älteren)Menschen)

(Altersdurchschnitt)75)Jahre))im)Vergleich)zu)0,5%)bei)jungen)Probanden)(Altersdurchschnitt)

41) Jahre),) als) auch) zu) einem) Anstieg) der) absoluten) CD4+CD8+) Zellzahlen) bei) gesunden)

Individuen)kommt.)Diese)Zellen)wiesen)in)vielen)Fällen)ein)eingeschränktes)TAZellrepertoire)

auf,)was)einen)Hinweis)auf)die)klonale)Expansion)der)DPAZellen)in)der)Peripherie)gibt.)Hierfür)

könnte) auch) sprechen,) dass)DPATAZellen) im)peripheren)Blut)wenig) bis) kein)CD28) auf) ihrer)

Oberfläche)exprimieren)(Ghia)et)al.)2007).)Es)ist)bekannt,)dass)CD4+CD28A)und)CD8+CD28A)TA

Zellen) klonal) expandierte) Lymphozytenpopulationen) darstellen,) die) sich) mit) dem) Alter)

ansammeln.))

Zusätzlich) weisen) periphere) DPATAZellen) erniedrigte) TRECAKonzentrationen) und) verkürzte)

Telomere)auf,)was)auf)replikative)Seneszenz)dieser)Zellen)schließen)lässt)und)im)Einklang)mit)

der)Hypothese)der)klonalen)Expansion)steht.)

Die) Funktion) von) CD4+CD8+) doppelt) positiven) TAZellen) liegt) vermutlich) in) der))

Immunantwort)auf)persistierende)latente)virale)Erreger,)wie)das)ZytomegalieAVirus)und)das)

EppsteinABarrAVirus.)Sie)weisen)einen)PerforinA)und)Granzym)AAGehalt)auf,)der)genauso)hoch)

wie) in)CD8+)SPAZellen) ist.)Dieses) zytotoxische)Potential)dient)demnach)wahrscheinlich)der)

Lyse)virusinfizierter)Zellen)(Nascimbeni)et)al.)2004).)

Im) Vergleich) der) für) diese) Arbeit) erhobenen) Daten) mit) denen) aus) der) Literatur) fällt) ein)

geringfügig) höherer) Anteil) an) CD4+CD8+) DPATAZellen) in) der) Peripherie) an) der)

Gesamtlymphozytenzahl) (1,93) ±) 0,29%) bei) den) RAAPatienten) bzw.) 1,73) ±) 0,24%) bei) den)

gesunden)Kontrollen)versus)1,30%)bei)den)älteren)Probanden)in)der)Arbeit)von)Ghia)et)al.))

auf,) trotz) eines) um)mehr) als) 10) Jahre) niedrigeren)Altersdurchschnitts) ) (63) Jahre) in) dieser)

Arbeit)versus)75)Jahre)bei)Ghia)et)al.).)Eine)mögliche)Erklärung)hierfür)könnte)sein,)dass)in)

den) verschiedenen) Arbeiten) unterschiedliche) Fluoreszenzantikörper) zur) Markierung) der)

Oberflächenmoleküle)CD4)und)CD8)verwendet)wurden.)Am)wahrscheinlichsten)scheint)aber,)

!

!

!Diskussion!

!! !

54!

dass) es) zu) einem) scheinbaren) Unterschied) aufgrund) der) unterschiedlichen) Anzahl) an)

Probanden) kam) (103) ältere) gesunde) Probanden) bzw.) 51) jüngere) Individuen) bei) Ghia) und)

Kollegen)versus)28)RAAPatienten)und)27)gesunde)Kontrollen) in)dieser)Arbeit),) der) sich)bei)

einer)größeren)Anzahl)an)Spendern)für)diese)Arbeit)ausgleichen)würde.)Die)altersabhängige)

Zunahme)an)CD4+)CD8+)DPATAZellen)konnte) zumindest) für)die)gesunden) Individuen) in)der)

vorliegenden)Arbeit)nachvollzogen)werden.)

)

CD28)ist)ein)kostimulatorisches)Oberflächenmolekül,)das)von)CD4+)TALymphozyten)ubiquitär)

exprimiert)wird)und)an)Moleküle)der)B7AFamilie)auf)antigenpräsentierenden)Zellen)bindet.)

Vereinfacht) geht) die) Aktivierung) von) TAZellen) über) den) TCR) und) das) kostimulatorische)

Molekül) CD28) folgendermaßen) vonstatten:) Es) kommt) zur) Ligation) des) TCRs) und) eines)

PeptidAMHCAKomplexes) auf) der) Oberfläche) einer) antigenpräsentierenden) Zelle.) Zusätzlich)

aktivieren)die)konstant)exprimierten)Oberflächenmoleküle)der)B7AFamilie)(CD80,)CD86))eine)

Bindung)mit)CD28.)Dies)bewirkt)die)Hochregulation)von)CD40ALigand)(CD40L))auf)der)TAZelle.)

CD40L)wiederum)bindet)an)CD40,)welches)von)der)APC)exprimiert)wird.))Über)eine)positive)

FeedbackASchleife)bewirkt)die)CD40ACD40LABindung)eine)Steigerung)der)B7AExpression)und)

somit)eine)Verstärkung)des)CD28/CD40Akostimulatorischen)Signals.))

Die)Notwendigkeit)der)Signale)von)CD28)und)anderen)Molekülen)erlaubt)es,)die)Aktivierung)

von)Lymphozyten)durch)die)Modulation)der)Expression)von)einem)oder)beiden)Teilen)des)

kostimulatorischen) LigandenARezeptorAPaares) streng) zu) kontrollieren) (Frauwirth) und)

Thompson)2002).)Allerdings)nimmt)die)Anzahl)der)pathologischen)CD28Anegativen)TAZellen)

mit)dem)Alter)kontinuierlich)zu.)Zum)Zeitpunkt)der)Geburt)kann)das)Oberflächenmolekül)auf)

allen) TAZellen) nachgewiesen) werden.) Ab) einem) Alter) von) 80) Jahren) hingegen) weisen)

gesunde) Menschen) einen) Anteil) von) 10A17%) von) CD28) negativen) Zellen) an) allen) TA

Helferzellen)und)60A67%)an)den)CD8+)TAZellen)auf.)Fagnoni)und)Kollegen)beschrieben)diesen)

Zusammenhang)mit)dem)Alter)und)zeigten)weiterhin,)dass)sich)CD28Anegative)TAZellen)durch)

die) Expression) von) MemoryAMarkern) (wie) CD2) und) CD11a)) auszeichnen) (Fagnoni) et) al.)

1996).))

Man)könnte)nun)annehmen,)dass)TAZellen)nach)dem)Verlust)von)CD28)deutlich)schwieriger)

zu)aktivieren)seien)und)in)Anergie)verfallen)könnten.)Tatsächlich)sind)naive)TAZellen)auf)das)

von)der)CD28AB7ALigation)ausgehende)kostimulatorische)Signal)essentiell)angewiesen.)CD28A)

negative) TAZellen) hingegen) sind) teilweise) beziehungsweise) vollkommen) unabhängig) von)

!

!

!Diskussion!

!! !

55!

dem) CD28ASignal) und) können) stattdessen) auf) regulatorische) Signale) anderer)

Oberflächenmoleküle)zurückgreifen.)Hierzu)zählen)unter)anderem)NKG2D)(ein)aktivierender)

Rezeptor,)der)normalerweise)auf)NKA)und)CD8+)TAZellen)gefunden)wird))und)KIR)(KIR,)killer)

immunoglobulinAlike) receptor).) KIRAMoleküle) werden) typischerweise) von) Natürlichen)

Killerzellen)exprimiert)(Goronzy)und)Weyand)2004).)

Warrington) et) al.) wiesen) nach,) dass) CD4+) TAZellen) in) der) peripheren) Zirkulation) von)

gesunden)Probanden)und)Patienten)mit)Rheumatoider)Arthritis)CD158b)und)CD161)auf)ihrer)

Oberfläche) tragen,) welche) bekannterweise) Rezeptoren) sind,) die) regulierend) in) die) NKA

Zellaktivierung) eingreifen.) Zellen,) die) diese)Moleküle) exprimieren,) sind) fast) ausschließlich)

solche) TAHelferzellen,) die) das) Oberflächenmolekül) CD28) verloren) haben.) Des) Weiteren)

konnten) sie) zeigen,)dass)diese)CD28Anegativen)CD4+)TAZellen)ebenso)CD8)koexprimierten.)

Hierbei) handelt) es) sich) allerdings) nicht) um) den) üblichen) CD8) Korezeptor) zytotoxischer) TA

Zellen,)der)aus)einer)αA)und)einer)βAKette)besteht,)sondern)um)einen)ααAHomodimer,)wie)er)

auch)auf)NKAZellen)zu)finden)ist.)Die)Expression)des)CD8AααAHomodimer)sowie)aktivierender)

und) inhibierender) NKAZellARezeptoren) legt) die) Vermutung) nahe,) dass) die) Aktivität) von)

CD4+CD28A) TAZellen) unter) der) Kontrolle) von) MHCAI) Molekülen) steht) (Warrington) et) al.)

2001).) Tatsächlich) weisen) CD4+CD28A) TAZellen) noch) weitere) CD8) bzw.) NKAzelltypische)

Merkmale)auf.)Sie)produzieren)Perforin)und)Granzyme,)besitzen)also)zytotoxische)Kapazität)

(Namekawa)et)al.)1998).)Zusätzlich)sezernieren)CD4+)TAZellen,)die)die)Expression)von)CD28)

verloren) haben,) deutlich) höhere) Mengen) an) Interferon) γ) nach) TCRAAktivierung) als)

CD4+CD28+) TAZellen) (Park) et) al.) 1997) und) Pieper) et) al.) 2014).) Interferon) γ) wiederum)

bewirkt,)dass)die)Expression)von)MHCAII)Molekülen)auf)APCs)und)die)Expression)von)MHCAI)

Molekülen) auf) normalen,) nicht) antigenpräsentierenden) Zellen) gesteigert) wird.) Außerdem)

unterstützt)es)Makrophagen)bei)der)Bekämpfung)pathologischer)Zellen.)Diese)Eigenschaften)

von) CD4+CD28A) TAZellen) wie) auch) die) Tatsache,) dass) sie) krankhaftes) Gewebe)

verschiedenster)Erkrankungen,)wie)Multipler)Sklerose,)Myopathien,)akutes)Koronarsyndrom)

und)RA,)infiltrieren)(Broux)et)al.)2012))und)dass)die)Krankheitsschwere)bei)der)RA)positiv)mit)

der)Anzahl)CD28)negativer)CD4+)TAZellen)korreliert) (Pawlik)et)al.)2003),) lassen)den)Schluss)

zu,)dass)sie)im)Krankheitsprozess)von)entscheidender)Bedeutung)sind.)

)

)

)

!

!

!Diskussion!

!! !

56!

)Abbildung)38:))Normale) und) immunoseneszente) CD4+) TAZelle) mit)einer)antigenpräsentierenden)Zelle)(APC):))CD4+) TAZellen) verlieren) das) Oberflächenmolekül)CD28) sowie) die) Expression) des) CD40ALiganden)(CD40L),) sodass) diese) kostimulatorischen) Moleküle)keinen) Einfluss) mehr) auf) die) TCRAAktivität) haben.)Stattdessen) beginnen) immunoseneszente) TAHelferzellen) regulatorische) Moleküle) zu)exprimieren,) die) normalerweise) auf) der) Oberfläche)Natürlicher) Killerzellen) zu) finden) sind.) Zusätzlich)erlangen) sie) die) Fähigkeit,) große) Mengen) an)Interferon) γ) zu) produzieren) und) APCs) mittels) des)Perforin/Granzym)ASignalwegs)abzutöten.))

aus)Goronzy)und)Weyand)2001)))

Trotz) unterschiedlicher) Angaben) über) die) Höhe) des) Anteils) CD4+CD28A) TAZellen) in) der)

Literatur) herrscht) Einigkeit) darüber,) dass) Patienten)mit) RA) eine) größere)Menge) an) CD28A

negativen) CD4+) TAZellen) in) der) peripheren) Zirkulation) aufweisen) als) gesunde) Individuen))

(zum)Beispiel)Schmidt)et)al.)1996)mit)9,7%)vs.)1,7%;)Wagner)et)al.)2003)mit)4,03%)vs.)1,45%)

und)Pawlik)et)al.)2003)mit)7,86%)vs.)1,4%).)Dieser)Unterschied)konnte) in)der)vorliegenden)

Arbeit) allerdings) nicht) nachvollzogen)werden:) Für) die) gesunden) Kontrollen) entsprach) der)

gemessene)Anteil)CD4+CD28A)TAZellen)mit)1,90)±)0,60%)in)etwa)denen)in)der)Literatur.)Die)

erhobenen)Werte)für)RAAPatienten)hingegen)unterschieden)sich)nicht)signifikant)von)denen)

der) gesunden) Kontrollen) und) liegen) dementsprechend) mit) 2,32) ±) 0,68%) deutlich) unter)

denen)anderer)Forschungsgruppen.)Zu)diskutieren)ist)hier)wiederum,)ob)dies)durch)eine)zu)

geringe) Stichprobenanzahl) bedingt) sein) könnte.) Eine) Erklärungsmöglichkeit) könnte) aber)

auch)in)der)Therapie)der)Patienten)gesucht)werden.)Bryl)und)Kollegen)konnten)zeigen,)dass)

die) Anzahl) CD4+CD28+) TAZellen) im) Zuge) einer) antiATNFα) Therapie)wieder) ansteigen) kann)

(Bryl)et)al.)2005).)Ein)ebensolcher)Effekt)konnte)für)die)Therapie)mit)Abatacept)festgestellt)

werden)(Scarsi)et)al.)2010).)Von)den)für)die)vorliegende)Arbeit)untersuchten)RAAPatienten)

erhielten)8)Personen)eine)antiATNFα)Therapie)und)eine)weitere)Person)wurde)mit)Abatacept)

behandelt.)Im)Vergleich)der)beiden)Patientengruppen)(antiATNFαA)oder)AbataceptATherapie)

vs.) andere) antirheumatische) Medikation)) mit) einander) und) der) Gruppe) derjenigen)

Patienten,)die)weder)mit)einer)antiATNFα)Therapie)oder)Abatacept)behandelt)wurden,)mit)

den)gesunden)Kontrollen)zeigte)sich)allerdings)wiederum)kein)signifikanter)Unterschied.)Es)

!

!

!Diskussion!

!! !

57!

ist) dennoch) zu) bemerken,) dass) solche) RAAPatienten)mit) hohen)Werten) an) CD4+CD28A) TA

Zellen) (Anteil) >3%) an) den) gesamten) CD4+) TAZellen)) bis) auf) eine) einzige) Ausnahme) in) der)

Gruppe) derjenigen) Patienten) zu) finden) waren,) die) keine) Therapie) mit) antiATNFα) oder)

Abatacept)erhielten.)Demnach)scheint)die)Ursache)tatsächlich)am)ehesten)in)der)zu)geringen)

Stichprobenzahl)zu)suchen)zu)sein.)Auch)die)fehlende)positive)Korrelation)der)CD4+CD28A)TA

Zellen) mit) dem) Alter) der) untersuchten) Probanden) erscheint) dadurch) bedingt.) Allerdings)

konnte)auch)in)einer)Studie)von)Fasth)et)al.)trotz)deutlich)höherer)Stichprobenzahl)(95)RAA

Patienten)) kein) signifikanter) Zusammenhang) zwischen) diesen) beiden) Parametern)

nachgewiesen)werden)(Fasth)et)al.)2004).))

Des) Weiteren) haben) Weyand) et) al.) beschrieben,) dass) es) Individuen) gibt,) die) auch) im)

höheren) Alter) nicht) zur) Anreicherung) solcher) seneszenter) Zellen) neigen) (Weyand) et) al.)

1998).))

In) der) vorliegenden) Studie) fanden) sich) zwar) diejenigen) Probanden) unter) den) gesunden)

Kontrollen)mit) einem) Anteil) an) CD4+CD28A) TAZellen) >3%) nur) in) der) Gruppe) der) über) 65A

Jährigen,) trotzdem) lässt) sich) beim) Vergleich) aller) Probanden,) die) älter) als) 65) sind,) mit)

denjenigen,) die) jünger) sind,) kein) signifikanter) Unterschied) hinsichtlich) der) CD4+CD28A) TA

Zellen)nachweisen.)Dies)und)die) fehlende)Alterskorrelation)könnte)sich)also)auch)auf)eben)

solche) Individuen) zurückführen) lassen,) die) auch) im) höheren) Alter) nicht) zur) Akkumulation)

von) CD4+CD28A) TAZellen) neigen.) Für) die) RAAPatienten) könnte) dies) ebenso) eine) weitere)

Erklärungsmöglichkeit)für)die)fehlende)Alterskorrelation)darstellen.)

)

Die)Beobachtung,)dass)bei)RAAPatienten,)die)für)diese)Arbeit)untersucht)wurden,)der)Anteil)

CD4+CD8+)doppelt)positiver)TAZellen)mit)dem)CD4+CD28A)TAZellen)positiv)korreliert,)legt)den)

Schluss)nahe,)dass)es)sich)bei)diesen)doppelt)positiven)TAZellen)ebenfalls)um)CD4+)TAZellen)

handeln) könnte,) die) den) CD8AααAHomodimer) exprimieren,) wie) von) Warrington) und)

Kollegen)beschrieben)(Warrington)et)al.)2001).))

Neuere) Forschungsergebnisse) könnten) diese) These) stützen.) Mucida) und) Kollegen)

untersuchten)sogenannte)CD4)CTLs)(CTL,)cytotoxic)T) lymphocytes).)Diese)weisen)wie)CD8+)

TAZellen)zytolytische)Aktivität)auf)und)exprimieren)Gene)für)Granzym,)Perforin,)Interferon)γ)

und) verschiedene) Rezeptoren,) welche) gewöhnlich) auf) Natürlichen) Killerzellen) und) reifen)

CD8+) TAZellen) zu) finden) sind.) Zusätzlich) konnten) auch) sie) die) Expression) des) CD8AααA

!

!

!Diskussion!

!! !

58!

Homodimers)auf)eben)diesen)CD4)CTLs,)die)in)ihren)Eigenschaften)scheinbar)CD28Anegativen)

CD4+)TAZellen)entsprechen,)nachweisen.)Weiterhin) konnte)die) Forschungsgruppe)belegen,)

dass) sich) solche) CD8α) exprimierenden) CD4) CTLs) aus) reifen) CD4) TAZellen) entwickeln,) und)

zwar)durch)Herunterregulation)des)Transkriptionsfaktors)ThPOK.) In)CD4+)einfach)positiven)

TAZellen) ist) ThPOK) kontinuierlich) aktiv) und) unterdrückt) die) Expression) von)Genen,) die) für)

CTLs) typisch) sind) (Mucida) et) al.) 2013).) In) der) Fortrührung) dieser) Arbeit) wurde) weiterhin)

bewiesen,)dass)außerdem)die)erhöhte)Aktivität)des)Transkriptionsfaktors)Runx,)der) für)die)

Entwicklung) von) CD8+) TAZellen) essentiell) ist,) die) Entwicklung) von) CD4+) TAHelferzellen) zu)

CD4+)CD8αα+)CTLs)bewirkt,)indem)er)an)ThPOKAsilencer)Elemente)bindet)(Reis)et)al.)2013).)

CD4+) CTLs) sind) zunächst) als) intraepitheliale) Lymphozyten) im) Intestinum) beschrieben)

worden,) können) aber) unter) bestimmten)Bedingungen)wie) virale) Infektionen,)AutoimmunA)

und)Tumorerkrankungen)auch)in)der)peripheren)Zirkulation)nachgewiesen)werden.)In)ihrer)

Funktion)scheinen)sie)neben)der)Lyse)von)virusinfizierten)Zellen),)wie)schon)von)Nascimbeni)

und)Kollegen)vermutet,)einen)protektiven)Effekt)gegen)ausufernde)entzündliche)Reaktionen)

zu)haben)(Mucida)et)al.)2013).)Für)diese)Annahme)konnte) in)Experimenten)mit)knockAoutA

Mäusen,)welche)kein)Runx)exprimieren,)Hinweise)gefunden)werden.)Wurden)CD4+)TAZellen)

solcher)Mäuse)in))Rag1−/− AMäuse)ohne)eigene)Lymphozyten)transferiert,)entwickelten)diese)

eine)schwere)Schwundkrankheit)(Reis)et)al.)2013).

)

Bei) den) untersuchten) gesunden) Kontrollen) war) ein) positiver) Zusammenhang) zwischen)

Expression)von)CD8)und)dem)Verlust)von)CD28)auf)CD4+)TAZellen)nicht)nachweisbar.)Nur)für)

die)CD4+CD8+)doppelt)positiven)TAZellen)fand)sich)eine)signifikante)positive)Korrelation)mit)

dem) Alter.) Daraus) lässt) sich) schließen,) dass) zumindest) für) gesunde) Individuen) der) Anteil)

CD4+CD8+)doppelt)positiver)TAZellen)an)der) Lymphozytenpopulation)einen)zuverlässigeren)

Immunoseneszenzmarker)darstellt) als)der)Anteil)CD4+CD28A)TAZellen.)Allerdings)wären) zur)

Verifikation)dieser)Annahme)natürlich)weitere)Studien,)vor)allem)mit)einer)größeren)Anzahl)

an)untersuchten)Personen)notwendig.)

)

Ein)weiteres)zur)Beschreibung)des)peripheren)CD4+)TAZellpools)für)diese)Arbeit)untersuchtes)

Oberflächenmolekül)ist)CD85j,)auch)ILTA2,)LILRB1)oder)LIRA1)genannt.)Hierbei)handelt)es)sich)

um)ein)Glykoprotein,)das)bei)Aktivierung)inhibitorische)Signale)aussendet.)Es)wird)auf)einer)

Reihe)von)hämatologischen)Zellen)exprimiert,)wie)Monozyten,)Makrophagen,)Dendritischen)

!

!

!Diskussion!

!! !

59!

Zellen)und)vor)allem)NKAZellen)(Anderson)und)Allen)2009).)Seine)physiologischen)Liganden)

sind) vor) allem) MHC) Klasse) IAMoleküle.) Ebenso) wie) die) oben) beschriebenen) NKA

Zellrezeptoren) CD158b) und) CD161) kann) auch) dieses) für) Natürliche) Killerzellen) typische)

Oberflächenmolekül) auf) TAZellen) exprimiert)werden.) Auch) hier)wirkt) es) inhibierend) durch)

Abschwächung)der)TCRAinitiierten)Aktivierung)von)sowohl)CD4+)als)auch)CD8+)TAZellen.)Des)

Weiteren) kann) es) die) CD3Avermittelte) Proliferation) von) CD4+) TAZellen) unterdrücken)

(Saverino) et) al.) 2000).) Insbesondere) im) Alter) scheinen) vor) allem) CD8+) TAZellen) CD85j) zu)

akquirieren) (Cavanagh) et) al.) 2011).) TAHelferzellen) hingegen) tragen) dieses)Molekül) nur) in)

geringem)Maße) auf) ihrer) Oberfläche) und) trotz) eines) Trends) zu) höheren)Werten) im) Alter)

konnte)hier)bislang)kein)signifikanter)Zusammenhang)gefunden)werden.)

Interessanterweise)ist)es)aber)so,)dass)der)Gewinn)von)CD85j)als)Oberflächenmolekül)von)TA

Zellen)hoch)mit)dem)Verlust)von)CD28)korreliert.)Dies)könnte)darauf)hindeuten,)dass)es)sich)

auch)bei)CD85j)um)ein)auf)Immunoseneszenz)hinweisendes)Protein)handelt)(CzesnikiewiczA

Guzik)et)al.)2008).))

MonsivàisAUrenda)und)Kollegen)zeigten,)dass)CD85j)sowohl)bei)gesunden)Personen)als)auch)

bei) Menschen) mit) Rheumatoider) Arthritis) in) sehr) unterschiedlichem) Ausmaß) von)

Lymphozyten) exprimiert)wird) (<10A80%)der) TAZellen)) und) es) hinsichtlich) dieser) Expression)

auf) sowohl) CD4+) als) auch) CD8+) TAZellen) keinen) Unterschied) zwischen) den) untersuchten)

Gruppen)gibt)(MonsiváisAUrenda)et)al.)2007).)

Saverino) et) al.) beschrieben) einen) Anteil) von) 4A20%) der) TAZellen,) die) CD85j) auf) der)

Oberfläche)tragen)(Saverino)et)al.)2000).)

Auch) in) der) vorliegenden) Arbeit) konnte) kein) Unterschied) im) Expressionsverhalten) von)

(CD4+))TAZellen)bezüglich)CD85j)zwischen)RAAPatienten)und)gesunden)Kontrollen)festgestellt)

werden) (Anteil) von)CD4+CD85j+)TAZellen)an)der)GesamtATAHelferzellzahl) von)1,86)±)0,56%)

bei)den)RAAPatienten)vs.)1,54)±)0,57%)bei)den)gesunden)Kontrollen).)Zwar)konnten)auch)hier)

vereinzelte)Probanden)mit)Werten)von)8%)bis)etwa)13%)von)CD4+CD85j+)TAZellen)detektiert))

werden,) insgesamt)ist)die)Expression)dieses) inhibitorischen)Oberflächenmoleküls,)wie)auch)

in)der)Literatur)beschrieben,)auf)CD4+)TAZellen)aber)nur)gering)ausgeprägt.)Tatsächlich)fielen)

auch)in)der)vorliegenden)Arbeit)hochsignifikante)Korrelationen)für)den)Verlust)von)CD28)und)

dem) Gewinn) von) CD85j) als) Oberflächenmolekül) auf) (CD4+)) TAZellen) sowohl) für) die) RAA

Patienten)als)auch) für)die)gesunden)Kontrollen)auf.)Ebenfalls)gab)es)bei)den)RAAPatienten)

eine)positive)Korrelation)zwischen)CD85j)und)CD4+CD8+)doppelt)positiven)TAZellen.)

!

!

!Diskussion!

!! !

60!

Diese) Ergebnisse) zeigen,) dass) es) sich) sowohl) bei) CD85j) als) auch) bei) der) CD4+CD8+)

Doppelexpression) offensichtlich) um) Immunoseneszenzmarker) handelt.) Bei) größeren)

Untersuchungsgruppen)wären)wahrscheinlich)sowohl)für)RAAPatienten)als)auch)für)gesunde)

Kontrollen) positive) Korrelationen) für) CD4+CD28A,) CD4+CD85j+) und) CD4+CD8+) doppelt)

positive)TAZellen)mit)dem)Alter)zu)erwarten.)

)

Eine)andere)wichtige)Gruppe)von)CD4+)TAZellen,)die) für)diese)Arbeit)untersucht)wurde,) ist)

eine)CD25Apositive)Subpopulation.)Als)CD25)wird)die)αAKette)des)hochaffinen)ILA2ARezeptors)

bezeichnet.)Er)wird)auf)frühen)BA)und)TAZellvorläufern)sowie)von)reifen)BA)und)TAZellen)und)

sogenannten)TAregulatorischen)Zellen)(Treg))exprimiert.)Wichtig) ist)die)Unterscheidung)der)

Expressionsstärke.) Reife) TAZellen) im) peripheren) Blut) zeigen) nach) Aktivierung) eine)

konstitutive)niedrige)CD25AExpression)(CD25low))(Kuniyasu)et)al.)2000,)Pekalski)et)al.)2013).)

Sie)weisen)keinerlei)regulatorische)Funktion)auf.)

Tregs) hingegen,) die) sich) durch) CD25) auf) ihrer) Oberfläche) auszeichnen,) finden) sich) nur) in)

einer)TAHelferzellpopulation,)die)CD25)in)sehr)hohem)Maße)exprimiert)(CD25high))(BaecherA

Allan)et)al.)2004,)BaecherAAllan)et)al.)2005).)Eine)immunoregulatorische)Funktion)von)CD4+)

TAZellen,)die)CD25)koexprimieren,)wurde)erstmals)von)Sakaguchi)und)Kollegen)beschrieben.)

Bei) Mäusen) ohne) diese) Zellpopulation) kam) es) zur) Manifestation) verschiedenster)

Autoimmunerkrankungen,) wie) Thyreoiditis,) Gastritis,) Glomerulonephritis,) Polyarthritis) u.a.

wohingegen)der)Transfer)von)Tregs) in) solche)Mäuse)ebendiese)autoimmunen)Phänomene)

verhindern) konnte.) Auch) gegen) Alloantigene) konnten) in) solchen) Experimenten) deutlich)

stärkere) Immunreaktionen) bei) CD25Adefizienten) Mäusen) nachgewiesen) werden.) Diese)

Befunde) wurden) von) den) Autoren) dahingehend) interpretiert,) dass) CD4+CD25+) TAZellen)

essentiell) zur) Aufrechterhaltung) der) Selbsttoleranz) des) Immunsystems) beitragen,) durch)

Herunterregulation)der) Immunantwort)von)TAZellen)auf)AlloA)und)Autoantigene) (Sakaguchi)

et)al.)1995).))

Im)Verlauf)konnten)die)TregAZellen)noch)weiter)charakterisiert)werden,)insbesondere)um)die)

Differenzierung) von) aktivierten) TAZellen) zu) verbessern) und) erleichtern.) Als) besonders)

hilfreich) hat) sich) hier) ein) Transkriptionsfaktor) erwiesen.) ForkheadABoxAProtein) P3) (Foxp3))

wird) fast) ausschließlich) nur) von) Tregs) exprimiert,) nicht) aber) CD25Anegativen) TAZellen) und)

von) aktivierten) CD25low) TAZellen) nur) in) sehr) geringem)Maße) (Valencia) et) al.) 2006).) Dieser)

Transkriptionsfaktor)ist)unabdingbar)für)die)thymische)TregAGenese)sowie)die)TregAFunktion.)

!

!

!Diskussion!

!! !

61!

So)sind)Mutationen)im)XAchromosomal)gelegenen)Foxp3AGen)beim)Menschen)mit)schweren)

polyendokrinen) Autoimmunerkrankungen) assoziiert) (zB.) IPEX,) immunodysregulation)

polyendocrinopathy)enteropathy)XAlinked)syndrome))(Fontenot)et)al.)2003,)Hori)et)al)2003).)

Doch)auch)diese)Foxp3+)TregAPopulation) ist)eine)heterogene)Gruppe,)da)man)unter) ihnen)

solche) Zellen,) die) im) Thymus) produziert) wurden) (nTregs) oder) tTregs),) von) solchen)

unterscheiden) kann,) die) in) der) Peripherie) entstanden) sind) (iTregs) oder) pTregs).) Es) wird)

vermutet,) dass) Tregs) thymischer) Genese) eher) der) Prävention) systemischer) und)

gewebespezifischer)Autoimmunität)dienen)und)peripher)entstandene)Tregs)unterdrückend)

auf)allergische)Entzündungen) im)Bereich)von)Schleimhäuten)wirken) (Dhamne)et)al.)2013).)

Diese) )beiden)Gruppen)weisen)gleiche)Phänotypen)und)immunsuppressive)Funktionen)auf.)

Sie) unterscheiden) sich) aber) zum) Beispiel) hinsichtlich) mRNAATranskription) und)

Proteinexpression.) Bezüglich) differenzierender) Eigenschaften) gibt) es) bisher) jedoch) noch)

keine)definitiven)Übereinkünfte)(Lin)et)al.)2013).)

TregAZellen)zeichnen)sich)im)Allgemeinen)durch)die)Fähigkeit)aus,)CD25Anegative)TAZellen)in)

ZellAZellAKontakt) abhängiger) Weise) in) Proliferation) und) Zytokinsekretion) zu) hemmen,)

darüber)hinaus)auch)durch)eine) fehlende)Proliferation)nach)TCRAStimulation.)Allerdings) ist)

die) TCRALigation) trotzdem) notwendig,) um) ihre) regulatorischen) Funktionen) zu) aktivieren,)

welche) antigenunspezifisch) und) zytokinunabhängig) sind) (Dieckmann) et) al.) 2001,) BaecherA

Allan)et)al.)2004).)Tregs)haben)aber)auch)Einfluss)auf)andere)Zellen)des)Immunsystems,)wie)

Mastzellen,) Dendritische) Zellen) und) BAZellen.) So) können) sie) in) APCs) die) Aktivität) der)

IndolaminA2,3ADioxygenase) (IDO)) heraufregulieren,) einem) immunsuppressiv) wirkenden)

Enzym.) Außerdem) können) sie) hohe) Mengen) an) zytotoxischen) Granula,) die) zum) Beispiel))

Granzym)B)enthalten,)exprimieren)und)somit)aktiv)den)Zelltod)von)APCs)und)anderer)Zellen)

bewirken,)um)eine)Immunantwort)zu)unterdrücken)(Tang)und)Bluestone)2008).)

Die) angeführten) Forschungsergebnisse) weisen) eindeutig) auf) die) essentielle) Rolle) von)

regulatorischen)TAZellen)in)der)Aufrechterhaltung)der)Selbsttoleranz)des)Immunsystems)hin.)

Trotzdem) ist) ihre) Beteiligung) im) Rahmen) von) Autoimmunerkrankungen) schwierig) zu)

beurteilen.) Insbesondere) für) die) RA) gibt) es) viele,) sich) widersprechende) Beobachtungen)

verschiedener)Forschungsgruppen.)Einerseits)wurden)erhöhte)Mengen)zirkulierender)TregA

Zellen)bei)RAAPatienten)in)Vergleich)zu)gesunden)Kontrollen)beschrieben)(van)Amelsfort)et)

al.) 2004,) Han) et) al.) 2008).) Aber) andererseits) konnten) einige) Forschungsgruppen) keine)

signifikanten) Unterschiede) hinsichtlich) des) Anteils) CD4+CD25high) Tregs) an) der) GesamtATA

!

!

!Diskussion!

!! !

62!

Helferzellzahl) feststellen) (Cao) et) al.) 2003,) Ehrenstein) et) al.) 2004).) Tatsächlich) konnten)

Lawson)et)al.)sogar)geringere)Mengen)an)TregAZellen)im)Blut)von)Patienten)im)Frühstadium)

einer) RA,) die) bisher) nicht)mit)DMARDs) (DMARD,)Disease)modifying) antiArheumatic)Drugs))

behandelt)wurden,)als)bei)gesunden) Individuen)nachweisen.)Bei) solchen)RAAPatienten,)bei)

denen) die) Krankheit) medikamentös) gut) kontrolliert) war,) fanden) aber) auch) sie) keine)

signifikanten) Unterschiede) zwischen) diesen) Patienten) und) gesunden) Individuen) bezüglich)

regulatorischer) TAZellen) in) der) peripheren) Zirkulation) (Lawson) et) al.) 2006).) Zu) gleichen)

Ergebnissen) kamen) auch) Jiao) und) Kollegen) bei) 11) RAAPatienten,) die) nicht) mit) DMARDs)

behandelt) wurden) (Jiao) et) al.) 2007).) Ebenso) widersprüchlich) sind) die) Ergebnisse) zur)

Funktion) von) CD4+CD25high) Tregs) bei) RAAPatienten.) Ehrenstein) und) Kollegen) beschrieben,)

dass) regulatorische) TAZellen) von) RAAPatienten) in) gleichem) Maße) wie) bei) gesunden)

Menschen)in)der)Lage)sind,)andere)TAZellen)an)der)Proliferation)zu)hindern,)wohingegen)sie)

die)Zytokinproduktion)nicht)ausreichend)unterdrücken)konnten)(Ehrenstein)et)al.)2004).) In)

den)Experimenten)von)Valencia)und)Kollegen)allerdings)waren)Tregs)von)RAAPatienten)nicht)

einmal)in)der)Lage,)die)Proliferation)anderer)CD4+)TAZellen)zu)unterdrücken)(Valencia)et)al.)

2006).)

)

Für) die) vorliegende) Arbeit) wurde) bei) 28) RAAPatienten) sowie) 27) altersentsprechenden)

gesunden) Kontrollen) die) Frequenz) von) ) aktivierten) CD4+CD25low) TAZellen) sowie) von)

CD4+CD25high) ) regulatorischen) TAZellen) untersucht.) Wie) bereits) von) anderen) Autoren)

beschrieben) fand) sich) kein)Unterschied)hinsichtlich)des)Anteils) regulatorischer) TAZellen) an)

der)Gesamtzahl)CD4+)Lymphozyten)(RAAPatienten:)3,83)±)0,34%,)gesunde)Kontrollen:)3,74)±)

0,29%).)Über)die)Menge)dieser)Zellen) in)der)Zirkulation)sowohl)von)RAAPatienten)als)auch)

von)gesunden)Individuen)gibt)es)in)der)Literatur)unterschiedliche)Angaben)von))etwa)0,5A2%)

bei) Valencia) et) al.) über) rund) 2A4%) bei) BaecherAAllen) und) Kollegen) bis) 5,5A6,7%) in) der)

Publikation)von)Möttönen)und)Kollegen) (BaecherAAllan)et)al.,)2005,)Möttönen)et)al.)2005,)

Valencia) et) al.) 2006).) Die) für) diese) Arbeit) erhobenen) Ergebnisse) lassen) sich) also) ohne)

weiteres)in)diese)Gruppe)einreihen)und)liegen)in)etwa)im)Mittelfeld.)Die)Ursache)für)die)so)

unterschiedlichen)Frequenzen)für)Tregs)in)der)Literatur)kann)zum)einen)in)der)Art)und)Weise)

der) Auswertung,) also) unterschiedlicher) GatingAStrategien) der) durchflusszytometrisch)

generierten) Dotplots,) oder) an) den) verschiedenen) von) den) einzelnen) Forschungsgruppen)

verwendeten)fluoreszenzmarkierten)Antikörpern)liegen.)Weiterhin)kommt)hinzu,)dass)nicht)

!

!

!Diskussion!

!! !

63!

für) alle) Arbeiten) Foxp3) bestimmt) wurde.) Weder) in) der) vorliegenden) Arbeit) noch) in) den)

Arbeiten)von)BaecherAAllan)und)Möttönen)wurde)dieser)bisher)empfindlichste)TregAMarker)

verwendet,) um) regulatorische) TAZellen) von) CD4+CD25high) TAZellen) ohne)

immunoregulatorische)Eigenschaften)zu)differenzieren.)Möttönen)und)Kollegen)beschrieben)

lediglich,)dass)die)Population)CD4+CD25high)Zellen)reich)an)Foxp3Aexprimierenden)Zellen)war.)

In)der)Arbeit)von)Valencia)et)al.)hingegen)fanden)sich)in)allen)CD4+CD25high)TregAZellen)hohe)

Foxp3AKonzentrationen.) Es) ist) also) am) ehesten) davon) auszugehen,) dass) die) in) der)

vorliegenden) Arbeit) sowie) in) den) Arbeiten) von) BaecherAAllan) und) Möttönen) als)

„regulatorische)TAZellen“)bezeichnete)TAHelferzellpopulation)tatsächlich)einen)hohen)Anteil)

von) Tregs) beinhaltet,) aber) ebenso) auch) einige) CD4+CD25high) TAZellen) ohne)

immunoregulatorische)Eigenschaften,)sodass)der)tatsächliche)Anteil)regulatorischer)TAZellen)

an)der)CD4+)TAZellpopulation)etwas)niedriger,)am)ehesten)vergleichbar)mit)den)Ergebnissen)

von)Valencia)und)Kollegen,)anzusiedeln)ist.)

Der)hochsignifikante)Unterschied)zwischen)RAAPatienten)und)gesunden)Kontrollen)bezüglich)

der)aktivierten)TAZellen)(CD4+CD25low,)RA:)53,21)±)2,36%)vs.)GK:)36,07)±)2,36%),)der)in)der)

Auswertung) der) Experimente) zu) der) vorliegenden) Arbeit) auffiel,) stimmt) überein) mit) den)

Ergebnissen) von) Han) und) Kollegen) (Han) et) al.) 2008).) Auch) sie) fanden) erhöhte) Werte)

zirkulierender)CD4+CD25low)TAZellen)bei)RAAPatienten)(33,5)±)0,8)%)versus)28,3)±)1,2)%)bei)

den)gesunden)Kontrollen).)))

Wie)auch)von)anderen)Autoren)beschrieben,)fand)sich)keine)Korrelation)zwischen)den)von)

uns)erhobenen)klinischen)Parametern)(CRP,)geschwollene)und)druckschmerzhafte)Gelenke))

oder)dem)Alter)und)der)Anzahl) regulatorischer)TAZellen) in)der)Zirkulation) (Cao)et)al.)2003,)

Van)Amelsfort)et)al.)2004,)Han)et)al.)2008).)Eine)interessante)positive)Korrelation)zwischen)

dem)Alter)und)dem)Anteil)CD4+CD25low)TAZellen)war)in)dieser)Arbeit)bei)den)RAAPatienten,)

aber)nicht) in) der) gesunden)Kontrollgruppe) zu) erheben.) Eine)positive)Korrelation) zwischen)

dem) Anteil) dieser) CD4+CD25low) Zellen) und) der) Erkrankungsdauer) oder) anderer) klinischer)

Parameter) fand) sich) nicht.) Es) scheint) plausibel,) dass) Menschen) mit) einer) chronischen)

inflammatorischen) Erkrankung) durch) „chronische) Antigenstimulation“) erhöhte) Werte) an)

aktivierten) CD4+) TAZellen) im) Vergleich) mit) einer) gesunden) Kontrollgruppe) aufweisen.)

Warum) sich) aber) deren)Anteil)mit) dem)Alter) ) und) unabhängig) von) der) Erkrankungsdauer)

erhöht,) ist) schwieriger) zu) erklären,) insbesondere,) da) dies) für) die) Kontrollgruppe) nicht)

zutrifft.) Man) könnte) einen) RAA) oder) zumindest) inflammationsA) oder)

!

!

!Diskussion!

!! !

64!

autoimmunerkrankungsspezifischen) ImmunoseneszenzAMarker) postulieren.) Allerdings)

müssten) zur) Untermauerung) dieser) Hypothese) noch) weitere) Untersuchungen) bei) RAA

Patienten)zur)Überprüfung)und)Verifizierung)der)für)diese)Arbeit)erhobenen)Werte)und)bei)

Menschen) mit) anderen) chronisch) entzündlichen) Autoimmunerkrankungen) erfolgen.) Das)

Fehlen) eines) signifikanten) Zusammenhangs) zwischen) Alter) und) dem) Anteil) aktivierter)

CD4+CD25low)TAZellen) für)die)untersuchte)Kontrollgruppe) ist)möglicherweise)auch)einer) zu)

geringen)Fallzahl)geschuldet.)

Insgesamt)ist)zu)bedenken,)dass)auf)dem)Gebiet)der)regulatorischen)TAZellen)im)Allgemeinen)

und) insbesondere) auch) bei) der) Rheumatoiden) Arthritis) aufgrund) vieler) sich)

widersprechender)Forschungsergebnisse)noch)weitere)Forschungsarbeit)notwendig)scheint.)

Diesen) Hintergrund) bedenkend) ist) eine) abschließende) Interpretation) der) Ergebnisse) der)

Experimente) zu) diesem) Thema) im) Rahmen) der) vorliegenden) Arbeit) schwierig) und) nur)

eingeschränkt)möglich.)

)

Das)CD45AMolekül)ist)eine)Tyrosinphosphatase,)die)auf)Zellen)der)lymphoiden)Zellreihe)und)

Thymozyten)exprimiert)wird.)Die)Funktion)dieses)Oberflächenmoleküls)auf)TAZellen) liegt) in)

der) Modulation) der) durch) TCRALigation) ausgelösten) TAZellaktivität.) Dies) geschieht) durch)

sowohl) aktivierenden) als) auch) inhibierenden) Einfluss) auf) die) Proteinkinasen) Lck) und) Fyn,)

welche) zur) SrcAFamilie) der) ProteinATyrosinAKinasen) gehören.) Sie) stehen) in) der) Kette) der)

Signaltransduktion) nach) TCRAAktivierung) relativ) weit) am) Anfang) und) können) die) TA

Zellaktivität) durch) Phosphorylierung) von) ITAMs) (ITAM,) Immunoreceptor) tyrosinAbased)

activation)motif))und)ITIMs)(ITIM,)Immunoreceptor)tyrosinAbased)inhibitory)motif))entweder)

fördern) oder) hemmen.) CD45) beeinflusst) also) die) TAZellantwort) auf) externe) Stimuli) durch)

Kontrolle)der)relativen)Reizschwelle)für)dieselben)(Hermiston)et)al.)2003).)Das)Gen)für)das)

CD45AMolekül) liegt) auf) Chromosom) 1.) Durch) alternatives) Splicing) können) verschiedene)

Varianten)entstehen,)die)sich)durch)ihren)extrazellulären)Anteil)unterscheiden.)

Auf)den)TAZellen)lassen)sich)die)Formen)CD45RA)und)CD45RO)unterscheiden.)Sie)sind)für)die)

Differenzierung) von) naiven) TAZellen) und) MemoryATAZellen,) welche) schon) Kontakt) zu)

Antigenen) hatten,) von) großer) Bedeutung) und) wurden) auch) in) der) vorliegenden) Arbeit)

mittels)Durchflusszytometrie))untersucht.)

CD45RA) ist) die) schwere) 220) kDa) Form) des) CD45AProteins) und) wird) von) relativ) reifen)

Thymozyten)der)medullären)Zone)exprimiert.)Außerdem)ist)es))auf)naiven)reifen)TAZellen)zu)

!

!

!Diskussion!

!! !

65!

finden) (Clement)1992).)Nach)Aktivierung)der)naiven)TAZelle)durch)Antigenkontakt)des)TCR)

verliert)diese)Zelle)CD45RA)als)Oberflächenmolekül)und)im)Gegenzug)fährt)sie)die)Expression)

von)CD45RO)hoch) (Serra)et)al.) 1988,)Arlettaz)et)al.) 1999).)CD45RO)stellt)die) kleinere,)180)

kDa)schwere)Isoform)des)Moleküls)dar.)Im)Nabelschnurblut)Neugeborener)tragen)mehr)als)

90%))der)TAZellen)CD45RA)auf)ihrer)Oberfläche.)Mit)zunehmendem)Alter)nimmt)die)Zahl)der)

CD45RAAtragenden)Zellen) jedoch)deutlich) ab,) sodass)bei) gesunden)Erwachsenen)nur)noch)

rund)40A60%)der)CD4+)TAZellen)CD45RA)exprimieren.)Die)Rate,)mit)der)der)Anteil)CD45RA+)

TAZellen) abnimmt,) liegt) im) Alter) allerdings) deutlich) niedriger) als) während) der) Kindheit.)

CD45RAA)und)CD45ROAtragende)Zellen)unterscheiden) sich) in)der) Expression) verschiedener)

Oberflächenmoleküle) und) der) Fähigkeit) zur) Zytokinproduktion.) So) weisen) hauptsächlich)

diejenigen) Zellen,) die) die) 220) kDa) Isoform) tragen,) für) das)Homing) von)Gewebe) relevante)

Rezeptoren)wie)CD31)und)CD)62L)auf.)Hingegen)zeichnen)sich)CD45RO+)TAZellen)durch)eine)

deutlich) höhere) Produktion) von) IFNγA) und) ILA4) als) CD45RA+) TAZellen) sowie) durch) eine)

höhere) Konzentration) von) aktivierenden) Oberflächenmolekülen,) wie) IL2AR,) MHC) Typ) II)

Molekülen) und) Adhäsionsmolekülen,) die) ZellAZellAInteraktionen) vermitteln) (zum) Beispiel)

CD58)oder)CD29),)aus.)Des)Weiteren)sind)es)nur)diese)CD45ROAtragenden)TAZellen,)die)in)der)

Lage) sind,) die) Antikörperproduktion) durch) BAZellen) suffizient) zu) unterstützen) (Clement)

1992).)Flüchtig)betrachtet)stellen)CD45RA+)und)CD45RO+)TAZellen)zwei)verschiedene,)nicht)

überlappende) Populationen) des) peripheren) TAZellpools) dar.) Allerdings) gibt) es) eine) relativ)

große) Population) von) CD4+) TAZellen,) die) beide) Splicingvarianten,) also) sowohl) CD45RA) als)

auch)CD45RO)exprimieren.)Diese)doppelt)positiven)Zellen)wurden)von)Hamann)und)Kollegen)

eingehend)untersucht.)Sie)ähneln)sehr)stark)den)CD45RO+)einfach)positiven)CD4+)TAZellen,)

da) sie) IL4) und) IFNγ) produzieren) und) BAZellen) zur) Antikörperproduktion) anregen,) wozu)

CD4+CD45RA+) TAZellen) nicht) in) der) Lage) sind.) Hinsichtlich) der) Expression) von)

Oberflächenmolekülen)nehmen)die)doppelt)positiven)Zellen)eine)Zwischenstellung)zwischen)

CD45RA) und) CD45RO) ein.) Sie) tragen) sowohl) Homingrezeptoren) wie) CD31) und) CD62L) als)

auch)Adhäsionsmoleküle)wie)CD58)(Hamann)et)al.)1996).)Am)wahrscheinlichsten)handelt)es)

sich)bei)diesen)CD45RA+CD45RO+)doppelt)positiven)CD4+)TAZellen)um)Memory)TAZellen,)die)

CD45RA) reexprimieren.) Diese) Annahme) wird) durch) Beobachtungen) bei) Menschen) nach)

Knochenmarktransplantation) untermauert.) Hier) erlangten) CD4+) Memory) TAZellen) die)

Expression) von) CD45RA) wieder) (Arlettaz) et) al.) 1999).) Die) Funktion) von)

CD4+CD45RA+CD45RO+)TAZellen)ist)nicht)vollständig)klar.)Hamann)et)al.)vermuteten,)dass)es)

!

!

!Diskussion!

!! !

66!

sich) hierbei) um) solche) Memoryzellen) handeln) könnte,) die) sich) in) einer) Art) Ruhezustand)

befinden)(Hamann)et)al.)1996).)

Für) die) vorliegende) Arbeit) wurden) CD4+) TAZellen) aus) peripher) venösem) Blut) von) 28) RAA

Patienten) und) altersentsprechenden) gesunden) Kontrollen) mittels) eines) FITCAkonjugierten)

antiACD45ROA)und)eines)PEAkonjugierten)antiACD45RAAAntikörpers)auf)die)Expression)sowohl)

von) CD45RA) als) auch) CD45RO) untersucht.) Wie) auch) von) anderen) Forschungsgruppen)

beschrieben,) konnte) in) den) Experimenten) für) diese) Arbeit) kein)Unterschied) zwischen) RAA

Patienten) und) gesunden) Kontrollen) bezüglich) des) Anteils) CD45RA) oder) CD45RO)

exprimierender)CD4+)TAZellen)gefunden)werden)(Koetz)et)al.)2000,)Summers)et)al.)1994).)Im)

Vergleich)der)in)der)vorliegenden)Arbeit)erhobenen)Werte)für)den)Anteil)von)CD4+CD45RA+)

TAZellen)mit)denen)anderer) Forschungsarbeiten) fällt) auf,)dass) sowohl)die)RAAPatienten)als)

auch)die)gesunden)Kontrollen)mit)einem)Anteil)von)39,28)±)3,68%)beziehungsweise)37,89)±)

2,10%) an) der) Gesamtzahl) CD4+) TAZellen) leicht) unter) den) in) der) Literatur) angegebenen)

Werten) mit) 40A60%) bzw.) 45%) liegen) (Clement) 1992,) Kilpatrick) et) al.) 2008).) Für) die)

CD45RA+CD45RO+)doppelt)positiven)CD4+)TAZellen)hingegen)konnten)jeweils)höhere)Anteile)

festgestellt) werden) (RAAPatienten:) 21,60) ±) 1,41%,) gesunde) Kontrollen:) 25,23) ±) 1,10%) in)

dieser)Arbeit)vs.)17,4)±)2,5%)bei)Hamann)et)al.).)Die)leicht)erniedrigten)erhobenen)Werte)für)

CD45RA+) TAHelferzellen) könnten) mit) dem) Altersdurchschnitt) der) in) dieser) Arbeit)

untersuchten)Gruppen)mit) rund)63) Jahren) zusammenhängen.)Wie)bereits)beschrieben,) ist)

eine) Abnahme) der) CD45RA+CD4+) TAZellen) mit) dem) Alter) bekannt,) auch) wenn) keine)

signifikante) negative) Korrelation) der) genannten) Zellpopulation) mit) dem) Alter) von) uns)

nachgewiesen)werden)konnte.)Zwar)wird)in)der)Arbeit)von)Hamann)et)al.)nur)von)„gesunden)

Kontrollen“) gesprochen,)ohne)dass)deren)Alter) explizit) erwähnt)wird,) doch) ist) der)übliche)

Altersdurchschnitt)für)gesunde)Kontrollen)in)der)Regel)eher)niedriger)gesetzt.)Bei)Kilpatrick)

und)Kollegen)wird)nur)von)Individuen)mit)einem)Alter)höher)als)40)Jahre)gesprochen,)wobei)

das)Maximalalter)der)an)dieser)Studie)teilnehmenden)Menschen)bei)nur)62)Jahren)lag.)Der)

Altersdurchschnitt)muss)also)deutlich)unter)dem)der)für)die)vorliegende)Arbeit)untersuchten)

Individuen)liegen.))

Auffällig) war) in) den) Untersuchungsergebnissen) der) vorliegenden) Studie) der) signifikante)

Unterschied) zwischen) RAAPatienten) und) gesunden) Kontrollen) hinsichtlich) der) doppelt)

positiven) Population:) Die) gesunden) Kontrollen)wiesen)mit) 25,23) ±) 1,10%) deutlich) höhere)

Werte) als) die) RAAPatienten) auf) (21,60) ±) 1,41%).) In) der) Annahme,) dass) es) sich) bei) diesen)

!

!

!Diskussion!

!! !

67!

Zellen) tatsächlich,) wie) von) Hamann) und) Kollegen) vermutet,) um) ruhende) MemoryAZellen)

handeln)könnte,)ließe)sich)diese)Entdeckung)durch)den)chronischen)Entzündungsprozess)bei)

der) Rheumatoiden) Arthritis) erklären.) Im) Rahmen) der) Inflammation) käme) es) ständig) zur)

Reaktivierung)von)MemoryAZellen,)die)den)Entzündungsprozess)aufrecht)hielten,)sodass)hier)

die)Zahl)ruhender)MemoryAZellen,)die)CD45RA)reexprimieren,)geringer)wäre.))))))))))))))))))))))))))))))))

))))))

)

4.2.#RA4Patienten#weisen#eine#verringerte#Anzahl#von#RTEs#auf#

)Im) vorangegangenen)Abschnitt)wurden)CD45RAApositive) TAHelferzellen) aufgrund)des) noch)

nicht)stattgehabten)Antigenkontaktes)als)„naive)Zellen“)bezeichnet.)Die)Gruppe)der)naiven)

CD4+) TAZellen) lässt) sich) allerdings) noch) weiter) unterteilen.) Hierzu) dient) zum) Beispiel) der)

TRECAGehalt) der) verschiedenen) Untergruppen) der) naiven) Lymphozyten.) TRECs) sind)

episomale) DNA) (TCR) DALocus),) die) beim) Rearrangement) des) TCR) αALocus) entstehen.) Sie)

werden) während) der) Mitose) nicht) repliziert,) sodass) sich) deren) Konzentration) in) jeder)

Tochtergeneration)vermindert) (Kohler)und)Thiel)2009).) Zellpopulationen)mit)hohem)TRECA

Gehalt) haben) demnach) noch) wenige) Zellteilungen) durchgemacht) und) können) als) naive)

Zellen) angesehen) werden.) Ein) Oberflächenmarker,) der) hochgradig) mit) dem) TRECAGehalt)

korreliert,) ist)CD31.)Dieses)Molekül,)das)auch)PECAMA1)genannt)wird,)hat)eine)Masse)von)

130kDa)und)weist)eine)große)strukturelle)Ähnlichkeit)zu)IgGAFcARezeptoren)auf.)Es)wird)von)

Thrombozyten,) Monozyten,) Granulozyten,) Endothelzellen,) Thymozyten) und) Lymphozyten)

exprimiert)(Stockinger)et)al.)1992).)Die)Funktionen)von)CD31)könnten)in)der)Vermittlung)von)

Zelladhäsion)durch)homophile)Bindungen)liegen.)Des)Weiteren)scheint)das)Molekül)auch)als)

hemmender) Regulator) in) die) ImmunorezeptorASignalkaskade) von) BA) und) TAZellen)

einzugreifen) via) zwei) zum) intrazytoplasmatischen) Anteil) des) Moleküls) gehörenden) ITIMA

Einheiten.)Diese) immunoregulatorische)Funktion)scheint)von)großer)Bedeutung)zu)sein,)da)

gezeigt) werden) konnte,) dass) CD31AknockAoutAMäuse) zur) Entwicklung) chronischA

inflammatorischer)Krankheiten)neigen)(Fornasa)et)al.)2010).)CD4+CD45RA+)TAZellen)können)

nun) anhand) ihres) CD31AExpressionsverhaltens) in) zwei) Gruppen) unterteilt) werden.)

Diejenigen)CD4+CD45RA+)TAZellen,)die)zusätzlich)CD31)auf) ihrer)Oberfläche)tragen)(thymic)

naiv),) weisen) signifikant) höhere) TRECAKonzentrationen) auf) als) die,) die) kein) CD31)

exprimieren) (central) naiv).) Ein) verminderte) TRECAGehalt) weist) auf) die) durchgemachten)

!

!

!Diskussion!

!! !

68!

postthymischen) Replikationen) in) der) Peripherie) der) ) central) naiven) CD4+) TAZellen) hin)

(Kimming)et)al.)2002).)Zum)Verlust)von)CD31)kommt)es)durch)TCRAAktivierung)der)CD45RA+)

naiven)TAHelferzellen.)Hierbei)werden)die)extrazellulären)IgAähnlichen)Domänen)abgestoßen)

(Fornasa)et)al.)2010).)Wichtig)ist)zu)erwähnen,)dass)die)Signale)des)TAZellrezeptors,)die)zum)

Verlust)der)Oberflächenexpression)von)CD31)führen,)nicht)stark)genug)sind,)die)naive)TAZelle)

zu) aktivieren) und) den) Verlust) von) CD45RA) bzw.) den) Erwerb) von) CD45RO) zu) bewirken)

(Pekalski)et)al.)2013).)

Wie) es) auch) für) TRECs) beschrieben) wird,) gibt) es) eine) signifikante) negative) Korrelation)

zwischen) dem) Alter) und) der) CD31AExpression) von) CD4+CD45RA+) TAZellen.) Der) Verlust) an)

CD31+CD4+) TAZellen) beträgt) pro) Jahr) rund) 0,3A0,5%) (Kilpatrick) et) al.) 2008,) Goronzy) und)

Weyand) 2005).) Weitere) Studienergebnisse) stützen) ) die) Vermutung,) dass) es) sich) bei)

CD4+CD45RA+CD31+) TAZellen) tatsächlich) um)eine)Gruppe) der) TAZellen) im) peripheren) Blut)

mit) der) geringsten) replikativen)Geschichte,) also) um)RTEs) handeln) könnte.)Nach) autologer)

Stammzelltransplantation) exprimieren) alle) neuentstandenen)CD4+) TAZellen) CD31) auf) ihrer)

Oberfläche.) Außerdem) ist) der) TRECAGehalt) der) thymic) naiven) TAHelferzellpopulation) nur)

gering) reduziert) im) Vergleich) zum) TRECAGehalt) von) Thymozyten.) Des) Weiteren) weisen)

thymic) naive) TAZellen) ein) hochdiverses) TCRARepertoire) auf,) wohingegen) central) naive) TA

Zellen)schon)Repertoireeinschränkungen)zeigen.)Ebenso)ist)die)Telomeraseaktivität)in)CD31+)

TAZellen)trotz)fehlender)TCRAAktivierung)sehr)hoch,)wie)es)auch)in)Thymozyten)und)TAZellen)

Neugeborener)zu)finden)ist.)CD31A)CD45RA+)TAZellen)zeichnen)sich)im)Gegensatz)dazu)durch)

eine) deutlich) geringere) Telomeraseaktivität) aus.) Anhand) der) Anzahl) der) TRECAtragenden)

Zellen)sowie)der)CD31+)thymic)naiven)CD4+)TAZellen)lässt)sich)also)die)Neugeneration)von)TA

Zellen)und)somit)der)Thymusoutput)abschätzen.)

Dass)der)TRECAGehalt)von)CD31+)Lymphozyten)nicht)identisch)mit)dem)von)Thymozyten)ist)

und)dass)mit)dem)Alter)außerdem)eine)leichte)Abnahme)der)TRECAKonzentration)bei)diesen)

thymic) naiven) TAZellen) zu) verzeichnen) ist,) deutet) auf) einen) geringen) replikativen) Prozess)

innerhalb)dieser)Gruppe)hin,)aber)zeigt)auch,)dass)nicht)alle)thymic)naiven)CD31+)TAZellen)

tatsächlich) im)Thymus)entstanden)sind.)Allerdings) ist)die)Population)der)CD31+)TAZellen)so)

hochangereichert)mit) TRECAtragenden) RTEs,) dass) sie) trotzdem) ein) brauchbares)Werkzeug)

zur)Abschätzung)des)Thymusoutputs)darstellt)(Junge)et)al.)2007,)Kohler)und)Thiel)2009).)Zu)

bedenken)ist)aber)weiterhin,)dass)auch)der)TRECAGehalt)nur)zur)gröberen)Beurteilung)der)TA

Zellneogenese)und)somit)der)Thymusaktivität)vor)allem)bei)älteren)Individuen)dienen)kann.)

!

!

!Diskussion!

!! !

69!

Zwei)Mechanismen)schränken)die)Aussagekraft)von)T)cell) receptor)excision)circleAAnalysen)

ein:)

Naive) TAZellen) haben) eine) lange) Lebensdauer) von) durchschnittlich) 1000) A) 10) 000) Tagen.)

Selbst) bei)Menschen,) die) vor) 39) Jahren) thymektomiert)wurden,) konnten)noch) vereinzelte)

TRECAtragende)Zellen)nachgewiesen)werden.)Demzufolge)ist)eine)TRECAtragende)Zelle)zwar)

im)Thymus)produziert)worden,)aber)nicht)notgedrungen)ein)„Recent“)Thymic)Emigrant,)trotz)

des)naiven)Phänotyps.)Der) zweite)Mechanismus) ist) die)Reduktion)der) TRECAKonzentration)

durch)periphere)Proliferation.))Wie)beschrieben)nimmt)der)TRECAGehalt)einer)Zellpopulation)

mit) jeder) Zellteilung) ab,) da) TRECs) nicht) repliziert) werden.) Bei) einem) höheren) Zellumsatz)

würde) der) Anteil) TRECAtragender) Zellen) also) sinken,) ohne) dass) sich) die) thymische) TA

Zellproduktion) verändert) hätte) (Hazenberg) et) al.) 2003).) Ebenso) schränken) die) Ergebnisse)

von) den) Braber) und) Kollegen) die) Aussagekraft) der) Bestimmung) von) CD31+) TAZellen) zur)

Einschätzung)der)Thymusaktivität)ein.) Sie)konnten)nachweisen,)dass)der)Anteil)der) thymic)

naiven) Zellen,) die) tatsächlich) im)Thymus)neu)produziert)werden,)mit) dem)Alter) abnimmt,)

von)über)99%)bei)Neugeborenen)bis)auf)nur)noch)etwa)23%)im)Erwachsenenalter,)und)dass)

somit) die) große)Mehrheit) der) CD31Atragenden) TAZellen) bei) Erwachsenen) durch) periphere)

Proliferation) entsteht) (den) Braber) et) al.) 2012).) Dass) dieser) Mechanismus) zur)

Aufrechterhaltung) des) naiven,) peripheren) CD31+CD4+) TAZellpool) beiträgt,) wurde) erstmals)

von) Kilpatrick) und) Kollegen) postuliert) (Kilpatrick) et) al.) 2008).) Weiterhin) muss) angeführt)

werden,)dass)es)eine)TAZellgenese)außerhalb)des)Thymus)zu)geben)scheint.)Hierfür)sprechen)

Forschungsergebnisse) von) McClory) und) Kollegen,) die) beweisen,) dass) in) menschlichen)

Tonsillen) dieselben) TAVorläuferzellen) zu) finden) sind)wie) im) Thymus) (McClory) et) al.) 2012).)

Eine) naive) CD4+) TAZelle) könnte) also) eventuell) den) Phänotyp) eines) RTEs) aufweisen,) ohne)

tatsächlich) im) Thymus) entstanden) zu) sein.) ) Insofern) sind) die) für) die) vorliegende) Arbeit)

erhobenen) Werte) und) Ergebnisse,) in) Ermangelung) einer) zuverlässigeren) Methode) zur)

Evaluierung)des)Thymusoutput,)kritisch)zu)betrachten.))

)

In) den) beiden) für) diese) Studie) untersuchten) Gruppen) konnte) jeweils) kein) signifikanter)

Zusammenhang) zwischen) dem) Alter) und) der) Abnahme) von) CD4+CD45RA+CD31+) TAZellen)

nachgewiesen) werden.) Wiederum) ist) dies) am) wahrscheinlichsten) den) zu) kleinen)

Stichprobengrößen) (RA) n=23,) GK) n=19)) geschuldet.) Dafür) spricht) auch,) dass) in)

weiterführenden)Studien)durch)Wagner)und)Kollegen)mit)größeren)Stichprobenzahlen) (RA)

!

!

!Diskussion!

!! !

70!

n=51,)GK)n=101)) sehr)wohl) eine) signifikante)negative)Korrelation) zwischen)Alter)und)dem)

Anteil) CD4+CD45RA+CD31+) TAZellen) an) der) Gesamtzahl) CD4+CD45RA+) TAHelferzellen) für)

beide)Untersuchungsgruppen)nachgewiesen)werden) konnte) (Wagner) et) al.) 2013).) Es) fand)

sich) in)der)vorliegenden)Arbeit)ein)signifikanter)Unterschied) im)CD31AExpressionsverhalten)

von)CD4+CD45RA+)TAZellen)zwischen)gesunden)Kontrollen)(42,24)±)3,38%)der)CD4+CD45RA+)

TAZellen) koexprimierten) CD31)) und) RAAPatienten) (nur) 31,87) ±) 2,75%) der) naiven) TAZellen)

trugen)auch)CD31)auf)ihrer)Oberfläche).)Nimmt)man)nun)CD31)als)Marker)für)Recent)Thymic)

Emigrants,) so) stimmt) dieses) Ergebnis) mit) denen) vieler) anderer) Forschungsgruppen,) die)

erniedrigte) TRECAKonzentrationen) bei) RAAPatienten) nachgewiesen) haben,) überein.) RAA

Patienten) besitzen) also) weniger) thymic) naive) RTEs.) Hieraus) lässt) sich) ein) verringerter)

Thymusoutput)postulieren.)Dessen)Folge)ist)ein)schneller)alterndes)Immunsystems)mit)allen)

daraus) entstehenden) Konsequenzen,) die) zwar) in) der) vorliegenden) Arbeit) großteils) nicht)

nachvollzogen)werden)konnten,)aber)von)verschiedensten)Autoren) für)die)RA)beschrieben)

wurden)(s.o.)Einleitung)1.4).))

)

)

4.3.#Die#Frequenz#von#Präthymozyten#im#peripheren#Blut#von#RA4Patienten#ist#erhöht#

)Im)vorangegangenen)Abschnitt)konnte)gezeigt)werden,)dass)RAAPatienten)geringere)Werte)

an)RTEs) aufweisen)als) altersgleiche)gesunde)Kontrollen.) Zur)Klärung)der) Frage,)worin)dies)

begründet) liegt,) scheinen) mehrere) Ansätze) möglich.) Wie) oben) beschrieben,) dient) die)

Erfassung) des) TRECAGehalts) oder) des) CD31AExpressionsverhaltens) von) CD45RA+) TA

Helferzellen) zur) Abschätzung) der) thymischen) TAZellgenese.) Neben) der) Größe) des)

Thymusoutputs) ) können) aber) auch) periphere) Mechanismen) den) Gehalt) an) RTEs)

beeinflussen:) Eine) gesteigerte)periphere)Proliferation)würde) zwangsläufig) zur)Verdünnung)

des) RTEAGehaltes) einer) Lymphozytenpopulation) führen.) Ein) solcher) Mechanismus) konnte)

tatsächlich)für)naive)TAZellen)bei)der)RA)nachgewiesen)werden.)Fuji)et)al.)zeigten,)dass)naive)

TAZellen) von) RAAPatienten) eine) reduzierte) Telomeraseaktivität) nach) TCRAAktivierung)

aufweisen.) Hieraus) resultierten) nicht) nur) unzureichende) Telomerverlängerungen,) sondern)

auch)eine)erhöhte)Apoptoseneigung)mit)TAZellverlust)(Fuji)et)al.)2009).)Zusätzlich)konnte)bei)

der)Rheumatoiden)Arthritis)eine)geringere)Expression)der)ATMAProteinkinase)zur)Reparatur)

von) DNAADoppelstrangbrüchen) nachgewiesen) werden.) Dies) bedingt) eine) ungenügende)

!

!

!Diskussion!

!! !

71!

Reparatur)und)nachfolgende)Akkumulation)von)DNAASchäden,)insbesondere)im)naiven)CD4+)

TAZellkompartiment,)und)wiederum)eine)erhöhte)Apoptoseneigung)(Shao)et)al.)2009).)Beide)

Prozesse) führen) zu) einem) bevorzugten) Untergang) von) naiven) TAZellen) und) der) daraus)

resultierenden)Notwendigkeit,)den)TAZellpool)durch)periphere)homöostatische)Proliferation)

aufrechtzuerhalten,)was)die)beschriebene)Verdünnung)des)RTEAGehaltes)bewirkt.)Weiterhin)

scheint) aber) auch) eine) tatsächliche) Verringerung) des) Thymusoutputs) als) Ursache) des)

beschriebenen) verringerten) RTEAGehaltes) im) peripheren) Blut) von) Patienten) mit)

Rheumatoider) Arthritis) möglich.) Als) Ursache) hierfür) müsste) nun) unterschieden) werden)

zwischen) einer) eingeschränkten) Thymusfunktion) oder) einem) Mangel) an) Thymusinput,)

welche)beide)in)Konsequenz))einen)Mangel)an)Thymusoutput)zur)Folge)hätten.)

Wie) oben) beschrieben) (siehe) Einleitung) 1.3.)) wird) die) thymische) TAZellgenese) lebenslang)

durch)lymphoide)Vorläuferzellen,)die)aus)dem)Knochenmark)in)den)Thymus)einwandern,)um)

sich) dort) zu) reifen) TAZellen) zu) entwickeln,) aufrechterhalten.) Lange) Zeit) war) unbekannt,)

welche)diese)lymphoiden)Vorläuferzellen)genau)sind.)Six)et)al.)wiesen)eine)Population)von))

CLPs) in) der) Zirkulation) nach,) die) den) typischen,) erstmalig) von) Hokland) und) Kollegen)

beschriebenen,) lineageAnegativen,) CD34+) und) CD10+) Phänotyp) von) lymphoiden)

Vorläuferzellen) aufweisen) (Hokland) et) al.) 1987).) Weiterhin) zeichnen) sie) sich) durch) das)

Fehlen)von)CD24)als)Oberflächenmolekül)aus,)welches)Prälymphozyten)mit)Festlegung)auf)

eine) Entwicklung) in) die) BAZelllinie) charakterisiert.) Außerdem) exprimieren) diese) Zellen)

diverse)Moleküle,) die) sie) als) potentielle) TAZellvorläuferzellen) prädestinieren,) wie) TdT,) die)

IL7ARAαAKette,)RAG1,)die)εAKette)des)CD3AProteinkomplexes)und)CCR7)(Six)et)al.)2007).))

Zur)Klärung)der)Frage)nach)der)Ursache)eines)möglichen)verminderten)Thymusoutputs)bei)

RAAPatienten) wurde) nun) für) diese) Arbeit,) aufbauend) auf) den) Erkenntnissen) von) Six) und)

Kollegen,)die)Frequenz)dieser) lymphozytären)Vorläuferzelle,)die) in)vivo) in)der)Lage) ist,)den)

Thymus)zu)besiedeln,)sowie)von)CD34+)hämatopoetischen)Stammzellen)im)peripheren)Blut)

von)28)RAAPatienten)und)28)altersgleichen)gesunden)Kontrollprobanden)untersucht.))

Wie) oben) beschrieben) (Ergebnisse) 3.3.) und) 3.4.),) nahm) die) Frequenz) des) lymphoiden)

Vorläufers) wie) auch) die) der) lineageAnegativen) CD34+) HSCAPopulation) sowie) die) der)

gesamten) zirkulierenden) CD34+) hämatopoetischen) Stammzellen) bei) den) untersuchten)

gesunden)Kontrollen)kontinuierlich)mit)dem)Alter)ab.)Zusätzlich) fand)sich)eine)signifikante)

positive)Korrelation)der)vorgenannten)lymphoiden)Vorläuferzelle)mit)dem)Anteil)an))CD31+)

thymic)naiven)CD4+CD45RA+)TAZellen)an)allen)naiven)(CD45RA+))TAHelferzellen.)Es)besteht)

!

!

!Diskussion!

!! !

72!

also) eine) enge) Beziehung) zwischen) der) Anzahl) an) LinACD34+CD10+CD24A) CLPs) und) dem)

Thymysoutput,) abgeschätzt) durch) Detektion) von) CD45RA+CD31+) RTEs.) Dies) macht) es)

wahrscheinlich,) dass) diese) Subpopulation) der) LinACD34+CD10+CD24A) HSCs) unter)

physiologischen) Bedingungen) tatsächlich) eine) thymische) Vorläuferzelle) ist) und) die) TA

Zellgenese)im)Thymus)aufrechterhält.)Mit)zunehmendem)Alter)nehmen)Thymusaktivität)wie)

Thymusoutput)bekanntermaßen)ab.)Die)Ergebnisse)der)vorliegenden)Arbeit)zeigen)nun,)dass)

dies) der) Thymusinput) in) gleichem) Maße) tut.) Welches) Phänomen) am) Anfang) dieser)

Entwicklung) steht,) ob) durch) einen) mit) der) Zeit) nachlassenden) Thymusinput) der)

Thymusoutput) nachlässt) oder) ob) eine) Reduktion) der) Thymusaktivität)mit) dem) Alter) über)

Regelkreise)und)Feedbackmechanismen)die)Mobilisation)von)TAZellvorläuferzellen)aus)dem)

Knochenmark) abschwächt,) ist) hieraus) nicht) zu) erkennen) und) muss) gegebenenfalls) in)

weiteren)Experimenten)untersucht)werden.))

Für) die) RAAPatienten) konnten) in) der) vorliegenden) Studie) keine) signifikanten)

Zusammenhänge)für)Präthymozyten)bzw.)CD34+)HSCs)mit)dem)Alter)oder)den)CD31+)RTEs)

nachgewiesen)werden.)In)der)Weiterführung)der)Experimente)durch)Wagner)et)al.)mit)einer)

höheren) Fallzahl) (28) RAAPatienten) und) 28) gesunde) Kontrollen) in) dieser) Arbeit) vs.) 51)

Patienten)und)101)gesunde)Individuen)bei)Wagner)und)Kollegen))aber)fanden)sich)auch)für)

die)Gruppe)der)RAAPatienten)eine)positive) Korrelation) von)Präthymozyten)mit) RTEs) sowie)

negative)Korrelationen)für)Präthymozyten)und)RTEs)mit)dem)Alter)(Wagner)et)al.)2013).)Dies)

lässt)darauf)schließen,)dass)gleiche)Mechanismen)zur)Regelung)von)ThymusinA)und)Aoutput)

sowohl) bei) gesunden) Individuen) als) auch)bei)Menschen,) die) unter) Rheumatoider)Arthritis)

leiden,)zu)wirken)scheinen.)Weitere)Experimente)durch)Wagner)und)Kollegen)machten)die)

Beziehung) von) RTEs) und) Präthymozyten) noch) deutlicher:) Sie) konnten) zeigen,) dass) unter)

Therapie)mit)Etanercept,)einem)TNFαABlocker,)die)Frequenz)an)lymphoiden)Vorläuferzellen)

bei)RAAPatienten)noch)weiter)zunahm)und)daraus)resultierend)auch)die)Anzahl)der) thymic)

naiven) CD31+CD4+TAZellen) anstieg,) sogar) über) die) Durchschnittswerte) von) gesunden)

Kontrollen) hinaus) (Mittelwert) für) CD31+) thymic) naiven) CD4+TAZellen) bei) gesunden)

Kontrollen) in)der)Arbeit)von)Wagner)und)Kollegen:)46,7%)vs.)Mittelwert) für)CD31+)thymic)

naiven)CD4+TAZellen)bei)RAAPatienten)41,8)±)5,9%)vor)antiATNFαATherapie,)48,6)±)5,6%)nach)

16)Wochen)und)58,1)±)5,5%)nach)24)Wochen)antiATNFαATherapie))(Wagner)et)al.)2013).)

In)der)vorliegenden)Arbeit)konnte)weiterhin)bewiesen)werden,)dass)sich)RAAPatienten)und)

gesunde) Kontrollen) hinsichtlich) des)Anteils) CD34+) Stammzellen) nicht) unterscheiden,)wohl)

!

!

!Diskussion!

!! !

73!

aber,)was)die)Frequenz)der)lymphoiden)Vorläuferzellen)anbelangt.)Hier)wiesen)RAAPatienten)

mit) Werten) im) Mittel) von) ) 44,36) ±) 4,954) Präthymozyten) pro) 1) x) 106) PBMCs) signifikant)

höhere)Werte)als)die)Kontrollgruppe)mit)Mittelwerten)von)27,18)±)2,848/1)x)106)PBMCs)auf.)

Dass)dieser)Unterschied)noch)deutlicher)wurde,)wenn)man)nur)die)Ergebnisse)der)sheared)

epitopeApositiven)RAAPatienten)(47,47)±)6,227)Präthymozyten/1)x)106)PBMCs))mit)denen)der))

gesunden)Probanden)verglich,)macht))die)enge)Assoziation)von)erhöhten)Werten)an)diesem)

CLP) nicht) nur) mit) chronisch) inflammatorischen) oder) Autoimmunerkrankungen) im)

Allgemeinen,) sondern) insbesondere) mit) der) RA) deutlich.) Die) Menge) an) lymphoiden)

Vorläuferzellen) war) hierbei) unbeeinflusst) von) Krankheitsdauer,) Krankheitsaktivität) oder)

Therapieregime.) Diese) Veränderung) im) Stammzellkompartiment) von) RAAPatienten)

erstreckte) sich) nur) auf) die) beschriebenen) lineageAnegativen) Präthymozyten,) also) TA

Zellvorläuferzellen,)da,)wie)beschrieben,)keine)Unterschiede)hinsichtlich)der)Gesamtzahl))

CD34+)hämatopoetischer)Stammzellen)zwischen)RAAPatienten)und)gesunden)Kontrollen)zu)

finden)war,)unabhängig)davon,)ob)diese)CD34+)Zellen)schon)auf)eine)Entwicklungsrichtung)

determiniert)waren)oder)nicht.)

Die)in)dieser)Arbeit)nachgewiesene)negative)Korrelation)des)Alters)mit)CD34+)zirkulierenden)

hämatopoetischen)Stammzellen)bei)gesunden)Kontrollen)wurde)auch)von)anderen)Autoren)

beschrieben.) In)einer)Studie)wiesen)Povsic)und)Kollegen)diese) inverse)Beziehung)zwischen)

dem)Alter) und) der)Anzahl) an) CD34+)HSC) in) der) peripheren) Zirkulation) nach) (Povsic) et) al.)

2010).)Sie)differenzierten)allerdings)nicht)zwischen)lineageApositiven)und)lineageAnegativen)

Zellen.)Da)die)Experimente)zu)der)vorliegenden)Arbeit)aber)zeigten,)dass)die)beschriebene)

negative)Korrelation)mit)dem)Alter)sowohl)für)lineageAnegative)als)auch)für)die)Gesamtheit)

der) CD34+) HSC) (lineageAnegative) und) lineageApositve)) zu) finden) war,) sind) die) jeweiligen)

Ergebnisse)der)zwei)Studien)trotzdem)vergleichbar)und)stimmen)in)ihren)Aussagen)überein.)

Zu)diskutieren)ist)die)Frage,)ob)es)bei)den)RAAPatienten,)wie)in)dieser)Arbeit)nachgewiesen,)

tatsächlich) keinen) Zusammenhang) zwischen) dem)Anteil) CD34+)HSC) an) den) PBMCs) in) der)

Zirkulation) mit) dem) Alter) gibt.) Da) keine) signifikanten) Unterschiede) zwischen) gesunden)

Kontrollen)und)RAAPatienten)hinsichtlich)des)Anteils)dieser)Zellen)an)den)PBMCs)gefunden)

werden) konnten,) auch) nicht) im) Vergleich) höherer) Altersgruppen,) scheint) am) ehesten))

wieder) eine) zu) geringe) Fallzahl) bei) den) RAAPatienten) für) den) fehlenden) Nachweis) einer)

negativen)Korrelation)verantwortlich)zu)sein,)wie)es))auch)bei)der)lymphoiden)Vorläuferzelle)

der)Fall)ist.)

!

!

!Diskussion!

!! !

74!

Besonders) interessant) ist) die) Zusammenschau) der) Ergebnisse) der) Experimente) zur)

lymphoiden) Vorläuferzelle) und) denen) der) Experimente) zum) Thymusoutput.) Wie)

beschrieben) )zeigt)sich,)dass)RAAPatienten)einen)niedrigeren)RTEAGehalt) im)Blut)aufwiesen)

als) gesunde) Kontrollprobanden,) aber) dafür) im) Gegenzug) signifikant) mehr) CLPs.) Diese)

Beobachtung) lässt)mehrere)mögliche)Schlüsse)zu.)Die)erste) Interpretationsmöglichkeit) legt)

eine) eingeschränkte) Thymusfunktion) nahe.) Diese) resultiert) in) einem) reduzierten)

Thymusoutput.) Über) eine) KnochenmarkAThymusAperiphereAZirkulationAFeedbackschleife)

werden) als) Reaktion) darauf) vermehrt) Präthymozyten) mobilisiert,) um) die) unzureichende)

Thymusfunktion)durch)gesteigerten)Thymusinput)auszugleichen.)Eine)zweite)Möglichkeit)ist,)

dass) die) aus) dem) Knochenmark) stammenden,) zirkulierenden) Präthymozyten) bei) RAA

Patienten) funktionell) eingeschränkt) sind)und,) sobald) sie)den)Thymus)besiedelt)haben,)nur)

unzureichend)in)der)Lage)sind,)die)thymische)TAZellproduktion)aufrechtzuerhalten.)Auch)eine)

dritte)Erklärungsalternative)wäre)denkbar,)bei)der)die)Präthymozyten)der)RAAPatienten)eine)

eingeschränkte) Thymusbesiedlungsfähigkeit) aufweisen.) Wiederum) würden)

Feedbackmechanismen) bei) reduziertem) Thymusoutput) den) Thymusinput) steigern,) was) in)

einer) gesteigerten) Anzahl) der) Präthymozyten) in) der) Zirkulation) resultieren) würde.) Eine)

Differenzierung)zwischen)diesen)Möglichkeiten)ist)anhand)der)vorliegenden)Ergebnisse)nicht)

möglich.) Es) scheinen) neue) Experimente) zur) Fähigkeit) der) Präthymozyten) den) Thymus) zu)

besiedeln)und)reife)TAZellen)zu)generieren)bei)RAAPatienten)notwendig.))

Weiterhin) könnte) aber) auch) die) These) von) Bhandoola) und) Sambandam) weiterentwickelt)

werden)(Bhandoola)und)Sambandam)2006):)Es)wurde)eine)Vielzahl)von)thymusbesiedelnden)

lymphozytären) Vorläurferzellen) vermutet.) Unter) Umständen) liegt) bei) RAAPatienten) ein)

absolutes) oder) funktionelles) Defizit) an) einer) oder) mehreren) solcher) Zellen) vor,) sodass)

kompensatorisch)der)von)uns)untersuchte)Prätyhmozyt)zwar)in)gesteigertem,)aber)dennoch)

unzureichendem) Ausmaß) in) der) peripheren) Zirkulation) anzutreffen) ist) und) den) Thymus)

besiedelt.)

)

)

Es) lässt)sich)also)zusammenfassend)feststellen)und)als)Ergebnis)dieser)Studie)präsentieren,)

dass) neben) anderen)Mechanismen,) wie) homöostatischer) Proliferation,) angetrieben) durch)

periphere) TAZellverluste,) ein) unzureichender) Thymusinput) an) den) in) dieser) Studie)

untersuchten) lymphozytären) Vorläuferzellen) nicht) für) die) reduzierten) RTEAWerte) bei) RAA

!

!

!Diskussion!

!! !

75!

Patienten)verantwortlich)ist.)Vielmehr)scheinen,)bei)erhöhten)Werten)für)Präthymozyten)bei)

RAAPatienten) im) Vergleich) zu) gesunden) Kontrollen,) intrathymische) Ursachen) oder) eine)

unzureichende)generative)Fähigkeit)jener)Präthymozyten)bei)RAAPatienten)für)dieses)schon)

häufig)beobachtete)Phänomen)verantwortlich)zu)sein.)Die)profunden)Veränderungen)im)TA

Zellkompartiment,) die)mit) der) RA) einhergehen,) scheinen) also) nicht) (ausschließlich)) durch)

periphere) und) entzündungsassoziierte) Mechanismen) bedingt,) sondern) müssen) vielmehr)

auch) auf) eine) erkrankungsbedingte,) eingeschränkte) Fähigkeit,) TAZellen) zu) generieren,)

zurückgeführt)werden.)

)

!!

!

!

!Zusammenfassung*

!! !

76!

*************Zusammenfassung*der*Arbeit***Dissertation*zur*Erlangung*des*akademischen*Grades*Dr.*med.**Homöostatische* Mechanismen* der* CD4+* TBZellgenese* bei*Rheumatoider*Arthritis***eingereicht*von*Annika*Schatz***angefertigt*an*der*Medizinischen*Klinik*II*der*Universität*Leipzig**

Klinik*und*Poliklinik*für*Gastroenterologie*und*Rheumatologie**

Sektion*Rheumatologie**

betreut*von*Prof.*Dr.*med.*Ulf*Wagner*und*Dr.*rer.*nat.*Manuela*Rossol**

*

Mai*2016*

*

*

Die*Rheumatoide*Arthritis* ist*eine*systemische*Autoimmunerkrankung,*bei*der*klinisch*der*

Befall* kleiner* und* mittelgroßer* Gelenke* im* Vordergrund* steht.* Sie* geht* mit* komplexen*

Veränderungen*sowohl*des*adaptiven*als*auch*des*angeborenen*Immunsystems*einher.*Für*

eine* relevante* pathogenetische* Rolle* von* CD4+* TBZellen* bei* dieser* Erkrankung* gibt* es*

hinreichend* Belege.* Viele* Autoren* konnten* phänotypische* Veränderungen* des* CD4+* TB

Zellpools*mit*einem*erhöhten*Anteil*von*CD28Bnegativen*TBHelferzellen,*einer*Reduktion*an*

CD31Btragenden* CD4+* TBZellen,* einer* Erhöhung* des* Anteils* zirkulierender* CD4+CD25lowBTB

Zellen*nachweisen.*Darüber*hinaus*kommt*es*auch*zur*Veränderung*funktioneller*Aspekte.**

B*Beispiele*sind*verkürzte*Telomerenden*und* *eine*eingeschränkte*TBZellrezeptorBDiversität*

im*Sinne*eines*vorgealterten*Immunsystems.*Für*die*Annahme,*dass*dies*zum*Teil*durch*eine*

!

!

!Zusammenfassung*

!! !

77!

eingeschränkte*thymische*TBZellgenese*bedingt*sein*könnte,*gibt*es*viele*Hinweise.*Ziel*der*

vorliegenden* Studie* war* es,* zu* eruieren,* ob* ursächlich* für* den* postulierten* reduzierten*

Thymusoutput*ein*ebenso*reduzierter*Thymusinput*sein*könnte.*Hierfür*wurde*im*venösen*

Blut* von* 28* RABPatienten* aus* der* Rheumatologischen* Ambulanz* des* Uniklinikums* Leipzig*

sowie* im* Blut* von* 28* altersentsprechenden* gesunden* Kontrollen* B* in* Anlehnung* an* die*

Forschungsergebnisse* von* Six* und* Kollegen* B* * lineageBnegative* CD34+CD10+* und* CD24B*

Zellen* quantifiziert,*welche* in* vivo* in* der* Lage* sind,* den* Thymus* zu* besiedeln* und* sich* in*

CD4+CD8+* Thymozyten* und* weiter* in* reife* TBZellen* zu* differenzieren.* Dazu* wurden* die*

PBMCs* des* Blutes* isoliert* und* mit* Immunfluoreszenzantikörpern* gefärbt.* Im*

Durchflusszytometer*(FacsCalibur)*konnten*so*die*benannten*lymphozytären*Vorläuferzellen*

sowie* verschiedene* relevante* TBZellpopulationen* quantifiziert* und* zwischen* RABPatienten*

und*gesunden*Kontrollen*verglichen*werden.**

Zunächst* wurde* der* peripher* zirkulierende* CD4+* TBZellpool* untersucht.* Die* Ergebnisse*

lieferten*Hinweise*für*die*Akkumulation*von*CD4+CD25low*und*CD4+CD8+*Lymphozyten*mit*

dem*Alter,* sodass*hier* zwei*neue* Immunoseneszensmarker*postuliert*werden*konnten.* Es*

konnte* weiterhin* gezeigt* werden,* dass* RABPatienten* signifikant* weniger* TBHelferzellen*

aufweisen,*die*beide*Splicingvarianten*des*CD45BMoleküls*CD45RA*und*CD45RO*exprimieren*

als* gesunde* Kontrollen.* Diese* Zellen* werden* im* Allgemeinen* als* ruhende*MemoryBZellen*

betrachtet.* Deren* verminderte* Anzahl* in* der* peripheren* Zirkulation* bei* an* Rheumatoider*

Arthritis*erkrankten*Menschen*lässt*sich*mit*dem*chronischen*Entzündungsprozess*und*der*

damit*verbundenen*ständigen*Reaktivierung*von*Memoryzellen*in*Verbindung*bringen.*

Wie* in*der*Literatur*beschrieben,*konnte*auch* in*der*vorliegenden*Arbeit*bei*RABPatienten*

eine* verminderte* Frequenz* von* CD31+CD4+* TBZellen* nachgewiesen*werden,*welche* durch*

die* Expression* von* CD31* als* recent* thymic* emigrants* (RTEs)* gekennzeichnet* waren.* Des*

Weiteren*zeigte*sich*jedoch*der*Thymusinput,*gemessen*an*den,*von*Six*et*al.*beschriebenen*

Präthymozyten,* bei* RABPatienten* nicht* etwa* vermindert,* sondern* vielmehr* gesteigert* im*

Vergleich*zu*gesunden*Kontrollen.**

Ein* verminderter* Thymusinput* an* den* untersuchten* lymphoiden* Progenitorzellen* ist* also*

nicht* die* Ursache* für* den* reduzierten* Thymusoutput* und* den* damit* verbundenen*

phänotypischen*und*funktionellen*Veränderungen*von*CD4+BTBZellen*bei*der*Rheumatoiden*

Arthritis.*Dass*dies*nicht*nur* für*Autoimmunerkrankungen* im*Allgemeinen*und* chronische*

!

!

!Zusammenfassung*

!! !

78!

Entzündungsprozesse*gilt,*sondern*eine*speziell*mit*der*RA*assoziierte*Abweichung*darstellt,*

belegt*die*Tatsache,*dass*bei*RABPatienten,*die*positiv* für*das*sogenannte*shared*epitope,*

d.h.*für*erkrankungsassoziierte*DR4B*oder*DR1BAllele,*waren,*der*Thymusinput*im*Vergleich*

mit*gesunden*Kontrollen*sogar*noch*weiter*gesteigert*war.*

Die*Interpretation*dieser*Ergebnisse*lässt*verschiedene*Schlüsse*zu.*Möglicherweise*sind*die*

von* Six* und* Kollegen* beschriebenen* Präthymozyten* entweder* in* ihrer* Funktion* der*

Thymusbesiedlung*eingeschränkt*oder*aber*bei*RABPatienten*nicht*ausreichend*in*der*Lage,*

sich*in*reifen*TBZellen*zu*differenzieren.*Möglicherweise*liegt*das*Defizit*jedoch*auch*an*den*

Bedingungen*im*Thymus*von*RABPatienten*selbst.*Weiterhin*ist*es*möglich,*dass*es*mehrere*

verschiedene* lymphoide* Progenitorzellen* gibt,* die* den* Thymus* unter* physiologischen*

Bedingungen* besiedeln* und* sich* zu* reifen* TBZellen* entwickeln,* wie* von* Bhandoola* und*

Sambandam*(2006)*vermutet.*Eventuell* ist*es*eine*dieser*alternativen*PräBTBZellen,*welche*

in*unzureichendem*Maß*produziert*wird*oder*welche*funktionell*eingeschränkt*ist.*Unter*all*

diesen* möglichen* Bedingungen* käme* es* zu* einem* verminderten* Thymusoutput* mit*

kompensatorischer* Steigerung* des* Thymusinput* durch* die* in* dieser* Studie* untersuchten*

CD34+CD10+CD24B*und*lineageBnegativen*lymphoiden*Vorläuferzellen.*

Zur* Klärung* dieses* Zusammenhangs* wird* weitere* Forschung* zu* den* funktionellen*

Eigenschaften* des* untersuchten* Präthymozyten* und* zur* Detektion* weiterer* möglicher*

lymphoider*Progenitorzellen*notwendig*sein.*

*

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

79!

Literaturverzeichnis..Anderson,. K.. J.,. Allen,. R.. L.,. 2009,. Regulation. of. T5cell. immunity. by. leucocyte.immunoglobulin5like. receptors:. innate. immune. receptors. for. self. on. antigen5presenting.cells..Immunology,.127(1):.8–17...Aletaha,. D.,. Neogi,. T.,. Silman,. A.. J.,. Funovits,. J.,. Felson,. D.. T.,. Bingham,. C.. O.. 3rd,.Birnbaum,.N..S.,.Burmester,.G..R.,.Bykerk,.V..P.,.Cohen,.M..D.,.Combe,.B.,.Costenbader,.K..H.,. Dougados,. M.,. Emery,. P.,. Ferraccioli,. G.,. Hazes,. J.. M.,. Hobbs,. K.,. Huizinga,. T.. W.,.Kavanaugh,.A.,.Kay,. J.,.Kvien,.T..K.,.Laing,.T.,.Mease,.P.,.Ménard,.H..A.,.Moreland,.L..W.,.Naden,. R.. L.,. Pincus,. T.,. Smolen,. J.. S.,. StanislawskaRBiernat,. E.,. Symmons,.D.,. Tak,. P.. P.,.Upchurch,. K.. S.,. Vencovsky,. J,. Wolfe,. F,. Hawker,. G.,. 2010,. 2010. rheumatoid. arthritis.classification. criteria:. an. American. College. of. Rheumatology/European. League. Against.Rheumatism.collaborative.initiative..Arthritis.Rheum.,.62(9):.2569–2581. .Arlettaz,.L.,.Barbey,.C.,.DumontRGirard,.F.,.Helg,.C.,.Chapuis,.B.,.Roux,.E.,.Roosnek,.E.,.1999,.CD45. isoform. phenotypes. of. human. T. cells:. CD4(+)CD45RA(5)RO(+)

.memory. T. cells. re5

acquire.CD45RA.without.losing.CD45RO..Eur..J..Immunol.,.29(12):!3987–3994...BaecherRAllan,. C.,. Viglietta,. V.,.Hafler,.D..A.,. 2004,.Human.CD4+CD25+.regulatory.T.cells..Semin..Immunol.,.16(2):89598...BaecherRAllan,.C.,.Wolf,.E.,.Hafler,.D..A.,.2005,.Functional.analysis.of.highly.defined,.FACS5isolated.populations.of.human.regulatory.CD4+CD25+.T.cells..Clin..Immunol.,.115(1):10518...Bhandoola,.A.,.Sambandam.A.,.2006,.From.stem.cell.to.T.cell:.one.route.or.many?.Nat..Rev..Immunol.,.6(2):1175126...Begovich,. A.. B.,. Carlton,. V.. E.,. Honigberg,. L.. A.,. . Schrodi,. S.. J.,. Chokkalingam,. A.. P.,.Alexander,.H..C.,.Ardlie,.K..G.,.Huang,.Q.,.Smith,.A..M.,.Spoerke,.J..M.,.Conn,.M..T.,.Chang,..M.,. Chang,. S.. Y.,. Saiki,. R..K.,. Catanese,. J.. J.,. Leong,.D..U.,.Garcia,.V.. E.,.McAllister,. L..B.,.Jeffery,.D..A.,.Lee,.A..T.,.Batliwalla,.F.,.Remmers,.E.,.Criswell,.L..A.,.Seldin,.M..F.,.Kastner,.D..L.,. Amos,. C.. I.,. Sninsky,. J.. J.,. Gregersen,. P.. K.,. . 2004,. A. missense. single5nucleotide.polymorphism. in. a. gene. encoding. a. protein. tyrosine. phosphatase. (PTPN22). is. associated.with.rheumatoid.arthritis..Am..J..Hum..Genet.,.75(2):.3305337...Blue,.M..L.,.Daley,.J..F.,.Levine,.H.,.Schlossman,.S..F.,. .1985,.Coexpression.of.T4.and.T8.on.peripheral. blood. T. cells. demonstrated. by. two5color. fluorescence. flow. cytometry.. J..Immunol.,.134(4):.228152286...Broux,.B.,.MarkovicRPlese,.S.,.Stinissen,.P.,.Hellings,.N.,.2012,.Pathogenic.features.of.CD4+.CD285.T.cells.in.immune.disorders..Trends..Mol..Med.,.18(8):4465453...Bryl,. E.,. Vallejo,. A.. N.,.Matteson,. E.. L.,.Witkowski,. J..M.,.Weyand,. C..M.,. Goronzy,. J.. J.,.2005,. Modulation. of. CD28. expression. with. anti5tumor. necrosis. factor. alpha. therapy. in.rheumatoid.arthritis..Arthritis.Rheum.,.52(10):.2996–3003...

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

80!

Calloni. R.,. Cordero. E..A.,.Henriques. J.. A.,. Bonatto,.D.,. 2013,.Reviewing.and.updating. the.major.molecular.markers.for.stem.cells..Stem.Cells.Dev.,.22(9):.145551476...Cao,. D.,. Malmström,. V.,. BaecherRAllan,. C.,. Hafler,. D.,. Klareskog,. L.,. Trollmo,. C.,. 2003,.Isolation. and. functional. characterization. of. regulatory. CD25brightCD4+. T. cells. from. the.target.organ.of.patients.with.rheumatoid.arthritis..Eur..J..Immunol.,.33(1):.2155223...Cavanagh,. M.. M.,. Qi,. Q.,. Weyand,. C.. M.,. Goronzy,. J.. J.,. 2011,. Finding. Balance:. T. cell.regulatory.receptor.expression.during.aging..Aging.Dis.,.2(5):.398–413...Carlton,. V.. E.,. Hu.. X.,. Chokkalingam,. A.. P.,. Schrodi,. S.. J.,. Brandon,. R.,. Alexander,. H.. C.,.Chang,.M.,.Catanese,.J..J.,.Leong,.D..U.,.Ardlie,.K..G.,.Kastner,.D..L.,.Seldin,.M..F.,.Criswell,.L..A.,. Gregersen,. P.. K.,. Beasly,. E.,. Thomson,.G.,. Amos,. C.. I.,. Begovich,. A.. B.,. 2005,.PTPN22.genetic.variation:.evidence.for.multiple.variants.associated.with.rheumatoid.arthritis..Am..J..Hum..Genet.,.77(4):.567–581...Clement,.L..T.,.1992,.Isoforms.of.the.CD45.common.leukocyte.antigen.family:.markers.for..human.T.cell.differentiation..J..Clin..Immunol.,.12(1):.1510...Colombatti,.A.,.Doliana,.R.,.Schiappacassi,.M.,.Argentini,.C.,.Tonutti,.E.,.Feruglio,.C.,.Sala,.P.,.1998,.Age5related.persistent.clonal.expansions.of.CD28(5).cells:.phenotypic.and.molecular.TCR.analysis.reveals.both.CD4(+)

.and.CD4(+)CD8(+)

.cells.with.identical.CDR3.sequences..Clin..

Immunol..Immunopathol.,.89(1):.61–70...Costenbader,. K.. H.,. Chang,. S.. C.,. De. Vivo,. I.,. Plenge,. R.,. Karlson,. E.. W.,. . 2008,.Genetic.polymorphisms. in. PTPN22,. PADI54,. and. CTLA54. and. risk. for. rheumatoid. arthritis. in. two.longitudinal.cohort.studies:.evidence.of.gene5environment.interactions.with.heavy.cigarette.smoking..Arthritis.Res..Ther.,.10(3):R52...CzesnikiewiczRGuzik,. M.,. Lee,. W.. W.,. Cui,. D.,. Hiruma,. Y.,. Lamar,. D.. L.,. Yang,. Z.. Z.,.Ouslander,.J..G.,.Weyand,.C..M.,.Goronzy,.J..J.,.2008,.T.cell.subset5specific.susceptibility.to.aging..Clin..Immunol.,.127(1):.107–118...den. Braber,. I.,. Mugwagwa,. T.,. Vrisekoop,. N.,. Westera,. L.,. Mögling,. R.,. de. Boer,. A.. B.,.Willems,.N.,.Schrijver,.E..H.,.Spierenburg,.G.,.Gaiser,.K.,.Mul,.E.,.Otto,.S..A.,.Ruiter,.A..F.,.Ackermans,. M.. T.,. Miedema,. F.,. Borghans,. J.. A.,. de. Boer,. R.. J.,. Tesselaar.. K.,. 2012,.Maintenance. of. peripheral. naive. T. cells. is. sustained. by. thymus. output.in. mice. but. not.humans..Immunity.36(2),.288–297...Dhamne,.C.,.Chung,.Y.,.Alousi,.A..M.,.Cooper,.L..J.,.Tran,.D..Q.,.2013,.Peripheral.and.thymic.Foxp3(+).regulatory.T.cells.in.search.of.origin,.distinction,.and.function..Front..Immunol.,.4:.253...Dieckmann,.D.,.Plottner,.H.,.Berchtold,.S.,.Berger,.T.,.Schuler,.G.,.2001,.Ex.vivo.isolation.and.characterization.of.CD4(+)CD25(+).T.cells.with.regulatory.properties.from.human.blood..J..Exp..Med.,.193(11):.130351310. ..

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

81!

Douek,.D..C.,.Vescio,.R..A.,.Betts,.M..R.,.Brenchley,.J..M.,.Hill,.B..J.,.Zhang,.L.,.Berenson,.J..R.,. Colllins,. R.. H.,. Koup,. R.. A.,. 2000,. Assessment. of. thymic. output. in. adults. after.haematopoietic. stem5cell. transplantation. and. prediction. of. T5cell. reconstitution.. Lancet,.355(9218):.187551881...Ehrenstein,.M..R.,.Evans,.J..G.,.Singh,.A.,.Moore,.S.,.Warnes,.G.,.Isenberg,.D..A.,.Mauri,.C.,.2004,. Compromised. function. of. regulatory. T. cells. in. rheumatoid. arthritis. and. reversal. by.anti5TNF.alpha.therapy..J..Exp..Med.,.200(3):.2775285...Emery,. P.,. 2003,. The. therapeutic. potential. of. costimulatory. blockade. with. CTLA4Ig. in.rheumatoid.arthritis..Expert.Opin..Investig..Drugs,.12(4):6735681.. Fagnoni,.F..F.,.Vescovini,.R.,.Mazzola,.M.,.Bologna,.G.,.Nigro,.E.,.Lavagetto,.G.,.Franceschi,.C.,. Passeri,. M.,. Sansoni,. P.,. 1996,. Expansion. of. cytotoxic. CD8+. CD285. T. cells. in. healthy.ageing.people,.including.centenarians..Immunology,.88(4):.501–507...Fasth,.A..E.,.Cao,.D.,.van.Vollenhoven,.R.,.Trollmo,.C.,.Malmström,.V.,.2004,.CD28null.CD4+

.

T. cells. 5. characterization. of. an. effector. memory. T5cell. population. in. patients. with.rheumatoid.arthritis..Scand..J..Immunol.,.60(152):.199–208...Fontenot.J..D.,.Gavin,.M..A.,.Rudensky,.A..Y.,.2003,.Foxp3.programs.the.development.and.function.of.CD4+CD25+.regulatory.T.cells..Nat..Immunol.,.4(4):.3305336.. Fornasa,.G.,.Groyer,.E.,.Clement,.M.,.Dimitrov,.J.,.Compain,.C.,.Gaston,.A..T.,.Varthaman,.A.,. KhallouRLaschet,. J.,. Newman,.D.. K.,. GraffRDubois,. S.,. Nicoletti,. A.,. Caligiuri,. G.,. 2010,.TCR. stimulation. drives. cleavage. and. shedding. of. the. ITIM. receptor. CD31.. J.. Immunol.,.184(10):.548555492...Frauwirth,. K.. A.,. Thompson,. C.. B.,. 2002,. Activation. and. inhibition. of. lymphocytes. by.costimulation..J..Clin..Invest..109(3):.295–299.. Fujii,. H.,. Shao,. L.,. Colmegna,. I.,. Goronzy,. J.. J.,. . Weyand,. C.. M.,. 2009,. Telomerase.insufficiency.in.rheumatoid.arthritis..Proc..Natl..Acad..Sci..USA,.106(11):.436054365...Ghia,. P.,. Prato,. G.,. Stella,. S.,. Scielzo,. C.,. Geuna,. M.,. CaligarisRCappio,. F.,. 2007,. Age5dependent. accumulation. of. monoclonal. CD4+CD8+. double. positive. T. lymphocytes. in. the.peripheral.blood.of.the.elderly..Br..J..Haematol.,.139(5):.7805790...Goronzy,.J..J.,.BartzRBazzanella,.P.,.Hu,.W.,.Jendro,.M..C.,.WalserRKuntz,.D..R.,.Weyand,.C..M.,. 1994,.Dominant.clonotypes. in. the. repertoire.of.peripheral.CD4+.T.cells. in. rheumatoid.arthritis..J..Clin..Invest.,.94(5):.206852076...Goronzy,. J.. J.,.Weyand,.C..M.,. 2001,.Thymic.function.and.peripheral.T5cell.homeostasis. in.rheumatoid.arthritis..Trends.Immunol.,.22(5):.2515255. .Goronzy,. J.,.Weyand,. C.,. 2003,.Ageing,. autoimmunity. and. arthritis:.T5cell. senescence. and.contraction. of. T5cell. repertoire. diversity. 5. catalysts. of. autoimmunity. and. chronic.inflammation..Arthritis.Res..Ther.,.5(5):.2255234..

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

82!

Goronzy,. J.. J.,.Weyand,. C..M.,. 2004,. T5cell. regulation. in. rheumatoid. arthritis.. Curr..Opin..Rheumatol..16(3):212–217...Goronzy,.J..J.,.Weyand,.C..M.,.2005,.T.cell.development.and.receptor.diversity.during.aging..Curr..Opin..Immunol.,.17(5):.468–475...Gregersen,. P.. K.,. Silver,. J.,. Winchester,. R.. J.,. 1987,. The. shared. epitope. hypothesis.. An.approach.to.understanding.the.molecular.genetics.of.susceptibility.to.rheumatoid.arthritis..Arthritis.Rheum.,.30(11):.120551213...Hamann,.D.,.Baars,.P..A.,.Hooibrink,.B.,.van.Lier,.R..W.,.1996,.Heterogeneity.of.the.human.CD4+. T5cell. population:. two. distinct. CD4+. T5cell. subsets. characterized. by. coexpression. of.CD45RA.and.CD45RO.isoforms..Blood,.88(9):.351353521...Han,.G..M.,.O`NeilRAnderson,.N..J.,.Zurier,.R..B.,.Lawrence,.D..A.,.2008,.CD4+CD25high.T.cell.numbers. are. enriched. in. the. peripheral. blood. of. patients. with. rheumatoid. arthritis.. Cell..Immunol..253(152):.92–101...Hazenberg,. M.. D.,. Otto,. S.. A.,. Cohen. Stuart,. J.. W.,. Verschuren,. M.. C.,. Borleffs,. J.. C,.Boucher,.C..A,.Coutinho,.R..A.,.Lange,.J..M,.Rinke.de.Wit,.T..F.,.Tsegaye,.A.,.van.Dongen,.J..J.,. Hamann,. D.,. de. Boer. R.. J.,. Miedema,. F.,. 2000,. Increased. cell. division. but. not. thymic.dysfunction. rapidly. affects. the. T5cell. receptor. excision. circle. content. of. the. naive. T. cell.population.in.HIV51.infection..Nat..Med..6(9):.1036–1042...Hazenberg,.M..D.,.Borghans,.J..A.,.de.Boer,.R..J.,.Miedema,.F.,.2003,.Thymic.output:.a.bad.TREC.record..Nat..Immunol.,.4(2):.97599...Hermiston,.M..L.,.Xu,.Z.,.Weiss,.A.,.2003,.CD45:.a.critical.regulator.of.signaling.thresholds.in.immune.cells..Annu..Rev..Immunol.,.21:.107–137...Hohensinner,. P.. J.,. Goronzy,. J.. J.,. Weyand,. C.. M.,. 2011,. Telomere. dysfunction,.autoimmunity.and.aging..Aging.Dis.,.2(6):.5245537...Hokland,.P.,.Hokland,.M.,.Daley,.J.,.Ritz,.J.,.1987,.Identification.and.cloning.of.a.prethymic.precursor.T.lymphocyte.from.a.population.of.common.acute.lymphoblastic.leukemia.antigen.(CALLA)5positive.fetal.bone.marrow.cells..J..Exp..Med.,.165(6):.174951754...Hori,. S.,.Nomura,. T.,. Sakaguchi,. S.,. 2003,.Control.of. regulatory.T.cell.development.by.the.transcription.factor.Foxp3..Science,.299(5609):.105751061...Jendro,.M..C.,.Ganten,.T.,.Matteson,.E..L.,.Weyand,.C..M.,.Goronzy,.J..J.,.1995,.Emergence.of. oligoclonal. T. cell. populations. following. therapeutic. T. cell. depletion. in. rheumatoid.arthritis..Arthritis.Rheum.,.38(9):.124251251...Jiao,.Z.,.Wang,.W.,.Jia,.R.,.Li,.J.,.You,.H.,.Chen,.L.,.Wang,.Y.,.2007,.Accumulation.of.FoxP35expressing.CD4+CD25+

.T.cells.with.distinct.chemokine.receptors.in.synovial.fluid.of.patients.

with.active.rheumatoid.arthritis..Scand..J..Rheumatol.,.36(6):.428–433..

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

83!

Junge,. S.,. KloeckenerRGruissem,. B.,. Zufferey,. R.,. Keisker,. A.,. Salgo,. B.,. Fauchere,. J.. C.,.Scherer,. F.,. Shalaby,. T.,. Grotzer,. M.,. Siler,. U.,. Seger,. R.,. Güngör,. T.,. 2007,. Correlation.between.recent.thymic.emigrants.and.CD31+.(PECAM51).CD4+.T.cells. in.normal. individuals.during.aging.and.in.lymphopenic.children..Eur..J..Immunol.,.37(11):.327053280...Kilpatrick,.R..D.,.Rickabaugh,.T.,.Hultin,.L..E.,.Hultin,.P.,.Hausner,.M..A.,.Detels,.R.,.Phair,.J.,.Jamieson,.B..D.,. 2008,.Homeostasis.of. the.naive.CD4+.T.cell.compartment.during.aging.. J..Immunol.,.180(3):.149951507...Kimming,.S.,.Przybylski,.G..K.,.Schmidt,.C..A.,.Laurisch,.K.,.Möwes,.B.,.Radbruch,.A.,.Thiel,.A.,. 2002,. Two. subsets. of. naive. T. helper. cells. with. distinct. T. cell. receptor. excision. circle.content.in.human.adult.peripheral.blood..J..Exp..Med..195(6):.7895794...Koetz,.K..Bryl,.E.,.Spickschen,.K.,.O'Fallon,.W..M.,.Goronzy,.J..J.,.Weyand,.C..M.,.2000,.T.cell.homeostasis.in.patients.with.rheumatoid.arthritis..Proc..Natl..Acad..Sci..USA,.97(16):..9203–9208...Kohler,.S.,.Thiel,.A.,.2009,.Life.after.the.thymus:.CD31+.and.CD315.human.naive.CD4+.T5cell.subsets..Blood,.113(4):.7695774...Kraan,.M..C.,.Haringman,.J..J.,.Weedon,.H.,.Barg,.E..C.,.Smith,.M..D.,.Ahern,.M..J.,.Smeets,.T..J.,.Breedveld,.F..C.,.Tak,.P..P.,..2004,.T.cells,.fibroblast5like.synoviocytes,.and.granzyme.B+.cytotoxic. cells. are. associated.with. joint. damage. in. patients.with. recent.onset. rheumatoid.arthritis..Ann..Rheum..Dis.,.63(5):.483–488. .Kuniyasu,. Y.,. Takahashi,. T.,. Itoh,.M.,. Shimizu,. J.,. Toda,.G.,. Sakaguchi,. S.,. 2000,.Naturally.anergic.and.suppressive.CD25(+)CD4(+).T.cells.as.a. functionally.and.phenotypically.distinct.immunoregulatory.T.cell.subpopulation..Int..Immunol.,.12(8):.114551155...Lai,. A.. Y.,. Kondo,.M.,. 2008,. T. and.B. lymphocyte.differentiation. from.hematopoietic. stem.cell..Sem..Immunol.,.20(4):.2075212...Lawson,.C..A.,.Brown,.A..K.,.Bejarano,.V.,.Douglas,.S..H.,.Burgoyne,.C..H.,.Greenstein,.A..S.,.Boylston,. A.. W.,. Emery,. P.,. Ponchel,. F.,. Isaacs,. J.. D.,. 2006,. Early. rheumatoid. arthritis. is.associated. with. a. deficit. in. the. CD4+CD25high. regulatory. T. cell. population. in. peripheral.blood..Rheumatology.(Oxford),.45(10):.121051217...Lewin,.S..R.,.Heller,.G.,.Zhang,.L.,.Rodrigues,.E.,.Skulsky,.E.,.van.den.Brink,.M..R.,.Small,.T..N.,.Kernan,.N..A.,.O'Reilly,.R..J,.Ho,.D..D.,.Young,.J..W.,.2002,.Direct.evidence.for.new.T5cell.generation.by.patients.after.either.T5cell5depleted.or.unmodified.allogeneic.hematopoietic.stem.cell.transplantations..Blood,.100(6):.223552242. .Lin,. X.,. Chen,. M.,. Liu,. Y.,. Guo,. Z.,. He,. X.,. Brand,. D.,. Zheng,. S.. G.,. 2013,. Advances. in.distinguishing.natural.from.induced.Foxp3(+).regulatory.T.cells..Int..J..Clin..Exp..Pathol.,.6(2):.1165123...Love. P.. E.,. Bhandoola,. A.,. 2011,. Signal. integration. and. cross5talk. during. thymocyte.migration.and.emigration..Nat..Rev..Immunol.,.11(7):.4695477..

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

84!

Lynch,.H..E.,.Goldberg,.G..L.,.Chidgey,.A.,.Van.den.Brink,.M..R.,.Boyd,.R.,.Sempowski,.G..D.,.2009,.Thymic.involution.and.immune.reconstitution..Trends.Immunol.,.30(7):.3665373.....McClory,. S.,.Hughes,. T.,. . Freud,.A..G.,.Briercheck,. E.. L.,.Martin,.C.,. Trimboli,.A.. J.,. Yu,. J.,.Zhang,.X.,.Leone,.G.,.Nuovo,.G.,.Caligiuri,.M..A.,.2012,.Evidence.for.a.stepwise.program.of.extrathymic.T.cell.development.within.the.human.tonsil..J..Clin..Invest.,.122(4):.140351415...MonsiváisRUrenda,.A.,.NiñoRMoreno,.P.,.AbudRMendoza,.C.,.Baranda,.L.,.LaysecaREspinosa,.E.,. LópezRBotet,.M.,.GonzálezRAmaro,.R.,. 2007,.Analysis.of.expression.and.function.of. the.inhibitory. receptor. ILT2. (CD85j/. LILRB1/LIR51). in. peripheral. blood.mononuclear. cells. from.patients.with.systemic.lupus.erythematosus.(SLE)..J..Autoimmun.,.29(253):.975105...Moreland,.L..W.,.Alten,.R.,.Van.den.Bosch,.F.,.Appelboom,.T.,.Leon,.M.,.Emery,.P.,.Cohen,.S.,. Luggen,. M.,. Shergy,. W.,. Nuamah,. I.,. Becker,. J.. C.,. 2002,. Costimulatory. blockade. in.patients. with. rheumatoid. arthritis:. A. pilot,. dose5finding,. double5blind,. placebo5controlled.clinical.trial.evaluating.CTLA54Ig.and.LEA29Y.eighty5five.days.after.the.first.infusion..Arthritis.Rheum.,.46(6):.147051479. .Möttönen,.M.,.Heikkinen,. J.,.Mustonen,. L.,. Isomäki,.P.,. Luukkainen,.R.,. Lassila,.O.,.2005,.CD4+

.CD25+

.T.cells.with.the.phenotypic.and.functional.characteristics.of.regulatory.T.cells.

are.enriched.in.the.synovial.fluid.of.patients.with.rheumatoid.arthritis..Clin..Exp..Immunol.,.140(2):.3605367...Mucida,.D.,. Husain,.M..M.,.Muroi,. S.,. van.Wijk,. F.,. Shinnakasu,. R.,.Naoe,. Y.,. Reis,. B.. S.,.Huang,. Y.,. Lambolez,. F.,. Docherty,. M.,. Attinger,. A.,. Shui,. J.. W.,. Kim,. G.,. Lena,. C.. J.,.Sakaguchi,. S.,. Miyamoto,. C.,. Wang,. P.,. Atarashi,. K.,. Park,. Y.,. Nakayama,. T.,. Honda,. K.,.Ellmeier,. W.,. Kronenber,. M.,. Taniuchi,. I.,. Cheroutre,. H.,. 2013,. Transcriptional.reprogramming. of. mature. CD4+

.helper. T. cells. generates. distinct. MHC. class. II5restricted.

cytotoxic.T.lymphocytes...Nat..Immunol.,.14(3):.2815289...Nakauchi.H.,.1998,.Hematopoietic.stem.cells:.are.they.CD345positive.or.CD345negative?.Nat..Med.,.4(9):.100951010...Namekawa,.T.,.Wagner,.U..G.,.Goronzy,. J.. J.,.Weyand,.C..M.,.1998,.Functional.subsets.of.CD4.T.cells.in.rheumatoid.synovitis..Arthritis.Rheum.,.41(12):.210852116...Nascimbeni,.M.,. Shin,. E..C.,. Chiriboga,. L.,. Kleiner,.D.. E.,.Rehermann,.B.,. 2004,.Peripheral.CD4(+)CD8(+).T.cells.are.differentiated.effector.memory.cells.with.antiviral.functions..Blood,.104(2):.4785486...Naylor,.K.,.Li,.G.,.Vallejo,.A..N.,.Lee,.W..W.,.Koetz,.K.,.Bryl,.E.,.Witkowski,.J.,.Fulbright,.J.,.Weyand,. C..M.,. Goronzy,. J.. J.,. 2005,. The. Influence. of. Age. on. T. Cell. Generation. and. TCR.Diversity..J..Immunol.,.174(11):.744657452...Ortolani,.C.,.Forti,.E.,.Radin,.E.,.Cibin,.R.,.Cossarizza,.A.,.1993,.Cytofluorimetric.identification.of. two. populations. of. double. positive. (CD4+,CD8+). T. lymphocytes. in. human. peripheral.blood..Biochem..Biophys..Res..Commun.,.191(2):.6015609...

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

85!

Park,. W.,. Weyand,. C.. M.,. Schmidt,. D.,. Goronzy,. J.. J.,. 1997,. Co5stimulatory. pathways.controlling.activation.and.peripheral.tolerance.of.human.CD4+CD285.T.cells..Eur..J..Immunol.,.27(5):.108251090...Pawelec,.G.,.Larbi,.A.,.Derhovanessian,.E.,.2010,.Senescence.of.the.human.immune.system..J..Comp..Pathol.,.142(Suppl.1):.39544...Pawlik,.A.,.Ostanek,.L.,.Brzosko,. I.,.Brzosko,.M.,.Masiuk,.M.,.Machalinski,.B.,.GawronskaRSzklarz,.B.,.2003,.The.expansion.of.CD4+CD285.T.cells.in.patients.with.rheumatoid.arthritis..Arthritis..Res..Ther.,.5(4):.R210–R213...Pekalski,.M..L.,.Ferreira,.R..C.,.Coulson,.R..M.,.Cutler,.A..J.,.Guo,.H.,.Smyth,.D..J.,.Downes,.K.,.Dendrou,.C..A.,.Castro.Dopico,.X.,.Esposito,.L.,.Coleman,.G.,.Stevens,.H..E.,.Nutland,.S.,.Walker,.N..M.,.Guy,.C.,.Dunger,.D..B.,.Wallace,.C.,.Tree,.T..I.,.Todd,.J..A.,.Wicker,.L..S.,.2013,.Postthymic.expansion.in.human.CD4.naive.T.cells.defined.by.expression.of.functional.high5affinity.IL52.receptors..J..Immunol.,.190(6):.255452566...Petrie,.H..T.,.2007,.Early.commitment:.T.cell.progenitors.in.the.blood..Immunity,.26(1): 7-8...Petrie,.H..T.,.ZúñigaRPflücker,.J..C.,.2007,.Zoned.out:.functional.mapping.of.stromal.signaling.microenvironments.in.the.thymus..Annu..Rev..Immunol.,.25:.6495679...Pieper,. J.,. Johansson,.S.,. .Snir,.O.,. . Linton,.L.,.Rieck,.M.,.Buckner,. J..H.,.Winqvist,.O.,.van.Vollenhoven. R.,.Malmström,. V.,. 2014,. Peripheral. an. site5specific. CD4(+)CD28(null). T. cells.from. Rheumatoid. Arthritis. patients. show. distinct. characteristics.. Scand.. J.. Immunol.,.79(2):1495155....Povsic,.T..J.,.Zhou,.J.,.Adams,.S..D.,.Bolognesi,.M..P.,.Attarian,.D..E.,.Peterson,.E..D.,.2010,.Aging.is.not.associated.with.bone.marrow5resident.progenitor.cell.depletion..J..Gerontol..A..Biol..Sci..Med..Sci.,.65(10):.104251050...Reis,.B..S.,.Rogoz,.A.,.CostaRPinto,.F..A.,.Taniuchi.I.,.Mucida,.D.,.2013,.Mutual.expression.of.the. transcription. factors. Runx3. and. ThPOK. regulates. intestinal. CD4+. T. cell. immunity..Nat..Immunol.,.14(3):.2715280...Sakaguchi. S.,. Sakaguchi,. N.,. Asano,. M.,. Itoh,. M.,. Toda,. M.,. 1995,. Immunologic. self5tolerance. maintained. by. activated. T. cells. expressing. IL52. receptor. alpha5chains. (CD25)..Breakdown.of.a.single.mechanism.of.self5tolerance.causes.various.autoimmune.diseases..J..Immunol.,.155(3):.115151164...Sala.P.,.Tonutti,.E.,.Feruglio,.C.,.Florian,.F.,.Colombatti,.A.,.1993,.Persistent.expansions.of.CD4+.CD8+.peripheral.blood.T.cells..Blood,.82(5):.154651552...Sansoni,.P.,.Vescovini,.R.,.Fagnoni,.F.,.Biasini,.C.,.Zanni,.F.,.Zanlari,.L.,.Telera,.A.,.Lucchini,.G.,.Passeri,.G.,.Monti,.D.,.Franceschi,.C.,.Passeri,.M.,.2008,.The.immune.system.in.extreme.longevity..Exp..Gerontol.,.43(2):.61565....

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

86!

Saverino,.D.,.Fabbi,.M.,.Ghiotto,.F.,.Merlo,.A.,.Bruno,.S.,.Zarcone,.D.,.Tenca,.C.,.Tiso,.M.,.Santoro,. G.,. Anastasi,. G.,. Cosman,. D.,. Grossi,. C.,. Ciccone,. E.,. 2000,. The. CD85/LIR51/ILT2.inhibitory. receptor. is. expressed. by. all. human. T. lymphocytes. and. down5regulates. their.functions..J..Immunol.,.165(7):.374253755...Scarsi,.M.,.Ziglioli,.T.,.Airò,.P.,.2010,.Decreased.circulating.CD285negative.T.cells.in.patients.with. rheumatoid. arthritis. treated. with. abatacept. are. correlated. with. clinical. response.. J..Rheumatol.,.37(5):.9115916...Schmidt,.D.,.Goronzy,.J.. J.,.Weyand,.C..M.,.1996,.CD4+.CD75.CD285.T.cells.are.expanded.in.rheumatoid. arthritis. and. are. characterized. by. autoreactivity.. J.. Clin.. Invest.,. 97(9):. 202752037....Schönland,.S..O.,.Lopez,.C.,.Widmann,.T.,.Zimmer,.J.,.Bryl,.E.,.Goronzy,.J..J.,.Weyand,.C..M.,.2003,. Premature. telomeric. loss. in. rheumatoid. arthritis. is. genetically. determined. and.involves.both.myeloid.and.lymphoid.cell.lineages..Proc..Natl..Acad..Sci..USA,.100(23):.13471513476...Scimone,.M.. L.,. Aifantis,. I.,. Apostolou,. I.,. von. Boehmer,. H.,. von.Andrian,. U.. H.,. 2006,.A.multistep.adhesion.cascade.for. lymphoid.progenitor.cell.homing.to.the.thymus..Proc..Natl..Acad..Sci..USA,.103(18):.700657011...Serra,. H..M.,. Krowka,. J.. F.,. Ledbetter,. J.. A.,. Pilarski,. L..M.,. 1988,. Loss. of. CD45R. (Lp220).represents.a.post5thymic.T.cell.differentiation.event..J..Immunol.,.140(5):.143551441...Shao,.L.,.Fujii,.H.,.Colmegna,.I.,.Oishi,.H.,.Goronzy,.J..J.,.Weyand,.C..M.,.2009,.Deficiency.of.the.DNA.repair.enzyme.ATM.in.rheumatoid.arthritis..J..Exp..Med.,.206(6):.143551449...Six,. E..M.,.Bonhomme,.D.,.Monteiro,.M.,.Beldjord,.K.,. Jurkowska,.M.,.CordierRGarcia,.C.,.Garrigue,.A.,.Dal.Cortivo,. L.,.Rocha,.B.,. Fischer,.A.,. CavazzanaRCalvo,.M.,.AndrèRSchmutz,.M.,. 2007,. A. human. postnatal. lymphoid. progenitor. capable. of. circulating. and. seeding. the.thymus..J..Exp..Med.,.204(13):.308553093..Skapenko,. A.. Leipe,. J.,. Lipsky,. P.. E.,. SchulzeRKoops,. H.,. 2005,. The. role. of. the. T. cell. in.autoimmune.inflammation..Arthritis..Res..Ther.,.7(Suppl.2):.S4514. .Starr,.T..K.,.Jameson,.S..C.,.Hogquist,.K..A.,.2003,.Positive.and.negative.selection.of.T.cells..Annu..Rev..Immunol..21:.1395176...Stastny,.P.,.1976,.Mixed.lymphocyte.cultures. in.rheumatoid.arthritis.. J..Clin.. Invest.,.57(5):.114851157...Stastny,.P.,.1978,.Association.of.the.B5cell.alloantigen.DRw4.with.rheumatoid.arthritis...N..Engl..J..Med.,.298(16):.8695871...Steinmann,. G.. G.,. Klaus,. B.,.MüllerRHermelink,. H.. K.,. 1985,. The. involution. of. the. ageing.human. thymic. epithelium. is. independent. of. puberty.. A. morphometric. study.. Scand.. J..Immunol.,.22(5):.5635575...

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

87!

Stockinger,. H.,. Schreiber,. W.,. Majdic,. O.,. Holter,. W.,. Maurer,. D.,. Knapp,. W.,. 1992,.Phenotype.of.human.T.cells.expressing.CD31,.a.molecule.of.the.immunoglobulin.supergene.family..Immunology.,.75(1):.53558...Summers,. K.. L.,. O´Donnell,. J.. L.,. Hart,. D.. N.,. 1994,. Co5expression. of. the. CD45RA. and.CD45RO.antigens.on.T.lymphocytes.in.chronic.arthritis..Clin..Exp..Immunol.,.97(1):.39544...Tang,.Q.,.Bluestone,.J..A.,.2008,.The.Foxp3+.regulatory.T.cell:.a.jack.of.all.trades,.master.of.regulation..Nat..Immunol.,.9(3):.2395244...Thomson,. W.,. Harrison,. B.,. . Ollier,. B.,. Wiles,. N.,. Payton,. T.,. Barrett,. J.,. Symmons,. D.,.Silman,. A.,. 1999,. Quantifying. the. exact. role. of. HLA5DRB1. alleles. in. susceptibility. to.inflammatory. polyarthritis:. results. from.a. large,. population5based. study.. Arthritis. Rheum.,.42(4): 757-762...Toh,.M.. L.,.Miossec,. P.,. 2007,.The.role.of.T.cells. in.rheumatoid.arthritis:.new.subsets.and.new.targets..Curr..Opin..Rheumatol.,.19(3):.2845288....Tonutti,.E.,.Sala,.P.,.Feruglio,.C.,.Yin,.Z.,.Colombatti,.A.,.1994,.Phenotypic.heterogeneity.of.persistent.expansions.of.CD4+.CD8+.T.cells..Clin..Immunol..Immunopathol.,.73(3):.3125320...Turka,.L..A.,.Schatz,.D..G.,.Oettinger,.M..A.,.Chun,.J..J.,.Gorka,.C.,.Lee,.K.,.Mc.Cormack,.W..T.,.Thompson,.C..B.,.1991,.Thymocyte.expression.of.RAG51.and.RAG52:.termination.by.T.cell.receptor.cross5linking..Science,.253(5021):.7785781...Valencia,.X.,.Stephens,.G.,.GoldbachRMansky,.R.,.Wilson,.M.,.Shevach,.E..M.,.Lipsky,.P..E.,..2006,. TNF. downmodulates. the. function. of. human. CD4+CD25hi. T5regulatory. cells.. Blood,.108(1):.2535261...Van. Amelsfort,. J.. M.,. Jacobs,. K.. M.,. Bijlsma,. J.. W.,. Lafeber,. F.. P.,. Taams,. L.. S.,. 2004,.CD4(+)CD25(+). regulatory. T. cells. in. rheumatoid. arthritis. differences. in. the. presence,.phenotype,. and. function. between. peripheral. blood. and. synovial. fluid.. Arthritis.Rheum.,.50(9):.2775–2785...Van.Boxel,. J..A.,. Paget,. S..A.,. 1975,.Predominantly.T5cell. infiltrate. in. .rheumatoid.synovial.membranes..N..Engl..J..Med.,.293(11):..5175520....Waase,. I.,.Kayser,.C.,.Carlson,.P..J.,.Goronzy,.J.. J.,.Weyand,.C..M.,.1996, Oligoclonal.T.cell.proliferation. in. patients. with. rheumatoid. arthritis. and. their. unaffected. siblings.. Arthritis.Rheum..39(6):.9045913. .Wagner,. U.. G.,. Koetz,. K.,.Weyand,. C..M.,. Goronzy,. J.. J.,. 1998,. Perturbation.of. the.T. cell.repertoire.in.rheumatoid.arthritis..Proc..Natl..Acad..Sci..USA,.95(24):.14447514452...Wagner,.U.,.Pierer,.M.,.Kaltenhäuser,.S.,.Wilke,.B.,.Seidel,.W.,.Arnold,.S.,.Häntzschel,.H.,.2003,. Clonally. expanded. CD4+CD28null

.T. cells. in. rheumatoid. arthritis. use. distinct.

combinations.of.T.cell.receptor.BV.and.BJ.elements..Eur..J..Immunol..33(1):.79–84...

!

!

!Literaturverzeichnis.

!! !

88!

Wagner,.U.,.Schatz,.A.,.Baerwald,.C.,.Rossol,.M.,.2013,.Brief.report:.deficient.thymic.output.in. rheumatoid. arthritis. despite. abundance. of. prethymic. progenitors.. Arthritis. Rheum.,.65(10):.256752572...Warrington,.K..J.,.Takemura,.S.,.Goronzy,.J..J.,.Weyand,.C..M.,.2001,.CD4+,CD285.T.cells.in.rheumatoid.arthritis.patients.combine.features.of.the.innate.and.adaptive.immune.systems..Arthritis.Rheum.,.44(1):.13–20...Weiskopf,.D.,.Weinberger,.B.,.GrubeckRLoebenstein,.B.,.2009,.The.aging.of.the.immune.system..Transpl..Int.,.22(11):.104151050...Weyand,.C..M.,.Xie,.C,.Goronzy,.J..J.,.1992,.Homozygosity.for.the.HLA5DRB1.allele.selects.for.extraarticular.manifestations.in.rheumatoid.arthritis..J..Clin..Invest.,.89(6):.203352039...Weyand,.C..M.,.Brandes,.J..C.,.Schmidt,.D.,.Fulbright,.J..W.,.Goronzy,.J..J.,.1998,.Functional.properties.of.CD4+CD285.T. cells. in. the.aging. immune. system..Mech..Aging.Dev.,. 102(253):.1315147...Wordsworth,.P.,.Pile,.K..D.,.Buckely,.J..D.,.Lanchbury,.J..S.,.Ollier,.B.,.Lathrop,.M.,.Bell,.J..I.,.1992,.HLA.heterozygosity.contributes.to.susceptibility.to.rheumatoid.arthritis..Am..J..Hum..Genet.,.51(3):.5855591...Zlotoff,. D.. A.,. Bhandoola,. A.,. 2011,. Hematopoietic. progenitor. migration. to. the. adult.thymus..Ann..N..Y..Acad..Sci.,.1217:.1225138...Zuckermann,. F.. A.,. 1999,. Extrathymic. CD4/CD8. double. positive. T. cells.. Vet.. Immunol..Immunopathol.,.72(152):.55566..

! 89!

Eigenständigkeitserklärung..

.Erklärung.über.die.eigenständige.Abfassung.der.Arbeit..

Hiermit.erkläre.ich,.dass.ich.die.vorliegende.Arbeit.selbständig.und.ohne.unzulässige.Hilfe.

oder.Benutzung.anderer.als.der.angegebenen.Hilfsmittel.angefertigt.habe..Ich.versichere,.

dass.Dritte.von.mir.weder.unmittelbar.noch.mittelbar.geldwerte.Leistungen.für.Arbeiten.

erhalten.haben,.die.im.Zusammenhang.mit.dem.Inhalt.der.vorgelegten.Dissertation.stehen,.

und.dass.die.vorgelegte.Arbeit.weder.im.Inland.noch.im.Ausland.in.gleicher.oder.ähnlicher.

Form.einer.anderen.Prüfungsbehörde.zum.Zweck.einer.Promotion.oder.eines.anderen.

Prüfungsverfahrens.vorgelegt.wurde..Alles.aus.anderen.Quellen.und.von.anderen.Personen.

übernommene.Material,.das.in.der.Arbeit.verwendet.wurde.oder.auf.das.direkt.Bezug.

genommen.wird,.wurde.als.solches.kenntlich.gemacht..Insbesondere.wurden.alle.Personen.

genannt,.die.direkt.an.der.Entstehung.der.vorliegenden.Arbeit.beteiligt.waren..

.

.

.

Leipzig,.den.16..Mai.2016.

.

!!!!!!!!!!!!!Leipzig,!16.05.2016!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Annika!Schatz!!

! 90!

Danksagung.

.

Ich.möchte.mich.an.dieser.Stelle.bei.Herrn.Prof..Dr..med..Ulf.Wagner.für.die.Bereitstellung.

des.Themas.und.die.Unterstützung.bei.der.Anfertigung.der.vorliegenden.Dissertation.

bedanken..

.

Weiterhin.gilt.mein.Dank.Frau.Dr..rer..nat..Manuela.Rossol.für.die.Betreuung.während.der.

Labortätigkeit.und.für.die.Zeit.darüber.hinaus..sowie.für.das.geduldige.Beantworten.meiner.

Fragen..

.

Ganz.besonders.zu.Dank.bin.ich.all.den.freiwilligen.Blutspendern.aus.der.rheumatologischen.

Ambulanz.des.Universitätsklinikums.Leipzig.und.vor.allem.all.den.gesunden.KontrollT

Spendern.verpflichtet...

.

Vielen.Dank.an.meine.große,.großartige.Familie,.die.mich.die.ganze.Zeit.über.in.jeder.

möglichen.Form.unterstützt.hat..

!!