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Molekulare Charakterisierung und Identifizierung

eines Aktivierungsmechanismus

von Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von: Julia Schön

geb. 03. September 1989 in Aschersleben

angefertigt im: Institut für Biochemie

Abteilung Molekulare Biochemie

Betreuer: Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 15. Dezember 2015

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Bibliographische Beschreibung

Schön, Julia

Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von

Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Universität Leipzig, Dissertation

89 Seiten, 135 Lit, 20 Abb, 5 Tab, 3 Anlagen

Referat:

Die Familie der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) stellt die zweitgrößte

Gruppe der GPCR dar. Ein strukturelles Charakteristikum der aGPCR ist der modular

aufgebaute N-Terminus, welcher eine GPCR-proteolytic site (GPS) mit einem konservierten

Spaltungsmotiv enthält. Trotz der hohen medizinischen Relevanz dieser Rezeptorgruppe sind

für die meisten der 33 humanen Vertreter der aGPCR bis heute weder Funktion noch

endogener Agonist bekannt. Um sie jedoch zukünftig als potentielle Angriffspunkte

diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, kommt der umfassenden Charakterisierung

der aGPCR hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion große

Bedeutung zu.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine kurze Peptidsequenz im C-terminalen

Bereich des N-Terminus (Stachel-Sequenz genannt) als gebundener Agonist der aGPCR

fungiert und G-Protein-vermittelte Signalwege aktiviert. Dazu wurden ortsgerichtete

Mutagenesestudien durchgeführt und synthetisierte Peptide analog der Stachel-Sequenz der

aGPCR in funktionellen second messenger-Akkumulationsexperimenten getestet. Während

die Untersuchungen des Aktivierungsmechanismus an den bereits initial charakterisierten

Rezeptoren GPR126 und GPR133 unternommen wurden, konnten 11 weitere aGPCR

hinsichtlich ihrer Kopplung an G-Proteine, Expression und ihres autoproteolytischen

Spaltungsverhaltens in vitro analysiert werden. Dabei ist herauszustellen, dass alle

untersuchten aGPCR an das Gs-Protein koppeln. GPR115, GPR116 und GPR128 zeigten

sogar eine multiple Kopplung an Gs-, Gq- und Gi-Proteine. Weiterhin konnte dargelegt

werden, dass die Zerstörung hoch konservierter Disulfidbrückenbindungen innerhalb der GPS

durch Aminosäuresubstitution in einer konstitutiven Aktivierung des Wildtyp-Rezeptors

resultiert.

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Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................................ 4

Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................................ 4

Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................................... 5

1 Einleitung ............................................................................................................................................................. 8

1.1 Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ................................................................................. 8

1.2 Kinetik der Pharmakon-Rezeptor-Interaktion ..................................................................................................10

1.3 Deorphanisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ..............................................................................11

1.4 Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren .........................................................................12

1.4.1 Struktureller Überblick der aGPCR ..............................................................................................................13

1.4.2 Physiologische Bedeutung der aGPCR .........................................................................................................15

1.4.3 Die Signaltransduktion der aGPCR ...............................................................................................................16

1.4.4 Liganden von aGPCR ...................................................................................................................................18

1.4.5 Die Bedeutung des cleavage der aGPCR ......................................................................................................18

1.4.6 Der GPR126 ..................................................................................................................................................20

1.4.7 Der GPR133 ..................................................................................................................................................22

2 Ziele und Fragestellungen ...................................................................................................................................24

3 Material/Methoden ..............................................................................................................................................26

3.1 Chemikalien und allgemeine Labormaterialien................................................................................................26

3.2 Molekularbiologische Standardmethoden ........................................................................................................26

3.3 Klonierung .......................................................................................................................................................27

3.3.1 E. coli–Stamm SW102 ..................................................................................................................................28

3.3.2 Gibson Assembly ..........................................................................................................................................29

3.4 Zellkultur und Transfektion .............................................................................................................................30

3.4.1 Messung der cAMP-Akkumulation mittels AlphaScreen-Technologie ........................................................31

3.4.2 Inositolphosphat–Akkumulationsassay .........................................................................................................32

3.4.3 Oberflächen-ELISA ......................................................................................................................................33

3.4.4 Sandwich-ELISA ..........................................................................................................................................33

3.4.5 Westernblot ...................................................................................................................................................35

3.4.6 Immunfluoreszenz .........................................................................................................................................35

3.5 Peptidsynthese ..................................................................................................................................................36

3.6 Statistische Auswertung ...................................................................................................................................37

4 Ergebnisse ...........................................................................................................................................................38

4.1 Aktivierung der aGPCR durch Deletion der ECD ...........................................................................................38

4.2 Identifizierung potentiell agonistischer Strukturen im N-Terminus .................................................................40

4.3 Aktivierung des GPR126 und GPR133 durch ein gebundenes Peptid .............................................................42

4.4 G-Protein-Kopplung als allgemeines Prinzip der aGPCR ................................................................................47

4.4.1 Promiskuität der aGPCR in der G-Protein-Kopplung ...................................................................................51

4.5 Autoproteolytische Spaltung der aGPCR .........................................................................................................51

4.6 Konstitutive Aktivierung von aGPCR durch Punktmutationen .......................................................................54

3

5 Diskussion ...........................................................................................................................................................57

5.1 Die agonistische Stachel-Sequenz der aGPCR ................................................................................................57

5.2 Gs-Protein-Kopplung ist ein generelles Charakteristikum ...............................................................................60

5.3 Multiple G-Protein-Interaktion ........................................................................................................................63

5.4 Autoproteolytische Spaltung ............................................................................................................................65

5.5 Konstitutive Aktivierung an konservierten Cysteinen .....................................................................................67

5.6 Ausblick ...........................................................................................................................................................68

6. Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................................................................71

7. Literaturverzeichnis ...........................................................................................................................................73

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ........................................................................................81

Anlagen ..................................................................................................................................................................82

Lebenslauf ..............................................................................................................................................................85

Veröffentlichungen ................................................................................................................................................87

Danksagung............................................................................................................................................................88

4

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Schematischer Aufbau eines aGPCR

Abb. 2 Strukturelle Eigenschaften von GPCR mit komplexen N-Termini

Abb. 3 Hypothetische Aktivierungsmechanismen der aGPCR

Abb. 4 Einfluss des CTF auf die Basalaktivität des GPR126 und GPR133

Abb. 5 Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz in der GPS des GPR126 und GPR133

Abb. 6 Sequentielle Aminosäure-Deletion in der GPS des GPR126

Abb. 7 Alaninscan innerhalb der GPS des GPR126 und GPR133 durch ortsgerichtete Mutagenese

Abb. 8 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR126 mit agonistischen Peptiden

Abb. 9 Konzentrationsabhängige cAMP-Akkumulation durch Stimulation mit p16

Abb. 10 Alaninscan des p16 Peptids des GPR126

Abb. 11 Endogene Expression des GPR126 in COS-7-Zellen

Abb. 12 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR133 mit agonistischen Peptiden

Abb. 13 Konzentrationsabhängige cAMP-Akkumulation durch Stimulation mit p13

Abb. 14 Spezifitätsprüfung der Peptide p16 und p13

Abb. 15 Immunfluoreszenz zur Detektion des GPR128

Abb. 16 Konzentrationsabhängige Signaltransduktion des GPR116

Abb. 17 Westernblot zur Analyse der Autoproteolyse von aGPCR

Abb. 18 Cystein-zu-Serin-Mutationen in aGPCR

Abb. 19 Untersuchung der CS-Mutationen für den GPR126 und GPR133

Abb. 20 Alignment der cleavage site von aGPCR

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Liste der verwendeten molekularbiologischen Standardmethoden

Tab. 2 Übersicht der verwendeten Laborgeräte

Tab. 3 Zusammenfassung der funktionellen Charakterisierung von aGPCR

Tab. 4 Übersicht cleavage–Analyse im Westernblot

Tab. 5 Übersicht der molekularen Charakterisierung von ausgewählten aGPCR

5

Abkürzungsverzeichnis

*O2 Singulett-Sauerstoff

7TM Sieben-Transmembran-Domäne

ß2-AR ß2-Adrenorezeptor

AC Adenylylcyclase

A2BR Adenosin 2B Rezeptor

ADP Adenosindiphosphat

aGPCR Adhesion-G-Protein-gekoppelter Rezeptor

Alpha Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay

ANOVA Analysis of Variance

AS Aminosäure

ATP Adenosintriphosphat

BAI Brain-specific angiogenesis inhibitor

BFPP bilaterale frontoparietale Polymikrogyrie

bp Basenpaar

BSA bovines Serumalbumin

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CD Cluster of Differentiation

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CELSR Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor

CIRL Calcium-independent Receptor of α-Latrotoxin

CRE cAMP Responsive Element

CREB cAMP Responsive Element Binding Protein

CRD cysteine-rich domain

CRP C-reaktives Protein

CTF C-terminales Fragment

CUB C1r/C1s urinary EGF and bone morphogenetic domain

DAF Decay Accelerating Factor

DAG Diacylglycerol

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DREG Developmentally Regulated G Protein–coupled Receptor

ECD extrazelluläre Domäne eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors

ECL extrazellulärer Loop

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF Epidermal Growth Factor

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMR EGF-like module-containing, Mucin-like hormone Receptor

6

ERK Extracellular-signal regulated Kinase

Fab Antigen-bindendes Fragment des Antikörpers

FAE Follikel-assoziiertes Epithel

FBS fetales Rinderserum

FLRT fibronectin-leucine-rich repeat transmembrane

Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe

GAIN GPCR Autoproteolysis Inducing domain

GDP Guanosindiphosphat

GEF Guanin-Austauschfaktor

GFP grün-fluoreszierendes Protein

GIRK G protein-gated inwardly rectifying potassium channel

G-Protein Guaninnukleotid-bindendes Protein

GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor

GPS GPCR proteolytic site

GRK GPCR-regulatorische Kinasen

GTP Guanosintriphosphat

h human, Mensch

HA humanes Influenza-Hämagglutinin

HBD Hormon-bindende Domäne

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

HPLC Hochdruckflüssigchromatographie

IBMX 3-Isobutyl-1-Methylxanthin

ICD intrazelluläre Domäne eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors

Ig Immunglobulin

IMPase Inositolmonophosphatase

IP Inositolphosphat

IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat

LAT1 Latrophilin-1

LB lysogeny broth, komplexes Nährmedium für Bakterien

LH luteinisierendes Hormon

LRR leucine-rich repeats

m murin, Maus

M3R muskarinischer M3-Acetylcholinrezeptor

MALDI-MS Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Massenspektrometrie

MALT Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe

MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MBP Myelin-Basisches Protein

MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1

MeS-ADP 2- Methylthioadenosin-5'-O-diphosphat

mRNA messenger Ribonukleinsäure

NFAT nuclear factor of activated T-cells

7

NK Negativkontrolle

NTF N-terminales Fragment

OD optische Dichte

OPD o-Phenylendiamin

ORL-1 Opioid Receptor-Like 1

PAR Protease-activated Receptor

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PBS-T Phosphat-gepufferte Salzlösung inklusive 0,05% Triton X-100

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PI3Kγ Phosphatidylinositol-3-Kinase γ

PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat

PK Positivkontrolle

POD Peroxidase

PTH Parathormon

PTX Pentraxin Domäne

R inaktiver Rezeptor

R* aktiver Rezeptor

RHO Rhodopsin

RhoGEF Rho guanine nucleotide exchange factor

RIPA Radio-Immunoprecipitation Assay

S1P1 Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1

SD Standardabweichung

SEA SEA urchin sperm protein domain

SEM Standardfehler

SNP Single Nucleotide Polymorphism

S.O.C. Super Optimal broth with Catabolic repressor

SP Signalpeptid

SRE serum response element

SV40 Simian-Virus 40

TL tethered receptor-activating ligand

TM Transmembrandomäne

TSHR Thyroidea stimulierendes Hormon Rezeptor

TSR thrombospondin type 1 repeat

THR Thyroidea stimulierendes Hormon Rezeptor

VFT Venus flytrap domain

VIGR Vascular inducible G Protein-coupled Receptor

VLGR Very Large GPCR

WT Wildtyp

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1 Einleitung

Die Kommunikation zwischen Zellen im Organismus beruht neben elektrophysiologischen

Vernetzungen häufig auf Transmitter-Rezeptor-Interaktionen. Transmitter in Form von

Aminosäuren, Polypeptidhormonen, Chemokinen, Calciumionen, Licht, Geruchs- oder

Geschmacksreizen initialisieren in Zusammenarbeit mit Rezeptoren die Aktivierung

intrazellulärer, biochemischer Signalwege, die zu zellulären Antworten und schließlich zu

physiologischen Veränderungen führen. Um diese chemisch und physikalisch diversen

Signale nach intrazellulär zu transduzieren, sind komplexe Erkennungsmechanismen

(Rezeptorklassen) notwendig. Die größte Anzahl solcher Oberflächenrezeptormoleküle stellt

dabei die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) dar (Civelli et al.,

2013).

1.1 Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Die Superfamilie der GPCR stellt mit über 800 Vertretern im menschlichen Genom eine

große und evolutionär alte Gruppe Membran-gebundener Proteine dar (Bjarnadóttir et al.,

2004). Während Bakterien keine GPCR exprimieren, sind sie in fast allen eukaryontischen

Lebensformen, z.B. Pflanzen, Insekten, Pilzen und der Amöbe Dictyostelium discoideum zu

finden (Nordström et al., 2008b). Allen Mitgliedern der GPCR sind ihre sieben Zellmembran-

durchspannenden Helices gemeinsam, aufgrund deren sie auch als Sieben-Transmembran-

Rezeptoren (7TM) bekannt sind. Weiterhin besitzen sie einen extrazellulär gelegenen N-

Terminus und einen intrazellulär lokalisierten C-Terminus. Namensgebend für diese

Rezeptorsuperfamilie ist die Interaktion mit intrazellulären G-Proteinen.

Die Bindung eines Agonisten an eine extrazelluläre und/oder transmembranäre Region des

Rezeptors initiiert dessen Interaktion mit einem heterotrimeren G-Protein. Aktivierte GPCR

kann man auch als guanine nucleotide exchange factors (GEF) für die α-Untereinheit des G-

Proteins bezeichnen, denn sie bewirken den Austausch von GDP gegen GTP an der Gα-

Untereinheit (Ritter and Hall, 2009). Die beiden verbliebenen Untereinheiten Gßγ dissoziieren

von der GTP-gebunden Gα-Untereinheit. Die Gα-Untereinheit kann nun an verschiedene

Effektormoleküle binden und deren Aktivität regulieren. Es sind verschiedene Familien von

G-Proteinen identifiziert worden, unter ihnen Gαs, Gαi, Gαq und Gα12/13, die über spezifische

Proteine die Bildung von second messengern veranlassen. So bewirkt eine GTP-gebundene

Gαs–Untereinheit eine Aktivierung der Adenylylcyclase, welche die Bildung von cyclischen

9

AMP aus ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat katalysiert. Der Botenstoff cAMP ist nun

in der Lage, weitere Effektorproteine, z.B. die Proteinkinase A, zu aktivieren. Die Gαi –

Untereinheit hemmt als Gegenspieler zu Gαs Adenylycyclasen. Über Gαq wird dagegen die

Phospholipase Cß aktiviert, wodurch es zu einer Akkumulation von Inositoltrisphosphat (IP3)

und Diacylglycerol (DAG) durch Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)

kommt. DAG führt zur Aktivierung der Proteinkinase C, IP3 ermöglicht die Freisetzung von

Calciumionen aus dem Endoplasmatischen Retikulum. Gα12/13 interagiert mit Rho guanine

nucleotide exchange factors (RhoGEFs), die über Aktivierung von Rho beispielsweise zur

Formation von Stressfasern in der Zelle führen. Es ist dabei erwähnenswert, dass viele GPCR

an mehr als nur eine Klasse von G-Proteinen binden (Gudermann et al., 1997).

Die bereits erwähnten Untereinheiten Gßγ können neben ihrer Interaktion mit der Gα-

Untereinheit auch auf primäre Effektoren wirken: beispielsweise auf N-Typ Calciumkanäle, G

protein-gated inwardly rectifying potassium channels (GIRK), Isoformen der Adenylycylase,

Phospholipase Cß2 /ß3 und Phosphatidylinositol-3-Kinasen γ (PI3Kγ) (Lin and Smrcka, 2011).

Agonist-gebundene GPCR werden jedoch nicht nur von G-Proteinen erkannt, sondern auch

durch GPCR regulierende Kinasen (GRK), welche eine Phosphorylierung der Rezeptoren

hervorrufen. Phosphorylierte GPCR gehen verstärkt eine Assoziation mit ß-Arrestin ein. ß-

Arrestin bewirkt nicht nur eine Desensibilisierung des Rezeptors für G-Proteine, sondern

leitet auch die Internalisierung des Rezeptors in Endosomen mit nachfolgender Degradation

oder Recycling des GPCR ein (Ritter and Hall, 2009). Neben diesem Mechanismus stellt auch

die intrinsische GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit die Signalabschaltung sicher.

Die Bedeutung von GPCR wird besonders im Hinblick auf die heute zur Verfügung

stehenden Pharmakotherapeutika deutlich: 36 % aller zugelassenen Medikamente wirken an

82 verschiedenen GPCR und machen diese Rezeptoren zu den wohl therapeutisch

interessantesten Zielstrukturen (Civelli et al., 2013).

Die Superfamilie der GPCR wird seit dem Jahre 2003 nach phylogenetischen

Gesichtspunkten in 5 Klassen eingeteilt: Glutamat (22 Vertreter im Menschen), Rhodopsin

(672 Vertreter), Adhesion (33 Vertreter), Frizzled/ Taste2 (11/25 Vertreter) und Sekretin (15

Vertreter), zusammengefasst unter dem Akronym GRAFS (Fredriksson et al., 2003).

10

1.2 Kinetik der Pharmakon-Rezeptor-Interaktion

Lefkowitz beschrieb im Jahre 1993 in seinem allosteric ternary complex model, dass sich

Rezeptoren in einem Gleichgewicht zwischen zwei Zuständen befinden: in der inaktiven R-

Form oder der entspannten, potentiell aktiven R*-Form. Man geht davon aus, dass nur R* in

der Lage ist, mit G-Proteinen zu interagieren. Substanzen, die die Rezeptorfunktion

aktivieren, werden als Agonist bezeichnet. Ein spezifischer Agonist für einen Rezeptor

beeinflusst das Gleichgewicht zwischen R und R* dahingehend, dass die Konversion zu R*

erleichtert und der ternäre Komplex zwischen Ligand-R* und G-Protein stabilisiert wird.

Ein Agonist bindet mit hoher Affinität an R* und mit niedriger Affinität an R. Die Affinität

eines Pharmakons (P) zu seinem Rezeptor wird dabei durch die Dissoziationskonstante KD

beschrieben:

KD=

1

1*

k

k

RP

PR ff

wobei [ ]f jeweils für freie Konzentrationen steht und k-1 und k+1 als

Geschwindigkeitskonstanten der Hin- und Rückreaktion definiert sind. KD entspricht

derjenigen Konzentration des Agonisten/ Antagonisten, bei der die Hälfte der Rezeptoren

durch das Pharmakon besetzt ist.

Substanzen, die die Rezeptorfunktion durch ihre Bindung nicht aktivieren, stattdessen aber

die Interaktion mit dem Agonist blockieren, werden als kompetitive Antagonisten bezeichnet.

Partielle Agonisten dagegen lösen - verglichen mit einem reinen Agonist - geringere

Wirkungen am Rezeptor aus. Sie binden mit nur leicht höherer Affinität den R*- als den R-

Zustand. Die intrinsische Aktivität a (Synonym efficacy) bezeichnet das Maß der maximalen

Wirkstärke eines Pharmakons. Während bei reinen Agonisten a=1 ist, binden Substanzen mit

a=0 R und R* mit gleicher Affinität. Eine weitere wichtige Konstante stellt der EC50–Wert als

mittlere effektive Konzentration dar. Der EC50–Wert ist die Pharmakonkonzentration, durch

die die halbmaximale Wirkung des Rezeptors erreicht wird. Je niedriger der EC50–Wert, desto

potenter verhält sich die Substanz. Die Charakterisierung des biologischen Effekts in

Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationsstufen kann in einer Konzentrations-

Wirkungs-Kurve grafisch verdeutlicht werden. Diese wird in vitro an Zellen (second

messenger-Konzentration) oder an isolierten Organen im Organbad und in vivo im

Tierversuch experimentell bestimmt. Beispielsweise kann durch Kontraktionsmessung eines

11

Aortenstreifens durch Titration einer gefäßkontrahierenden Substanz deren Wirkstärke

ermittelt werden. Zur Übertragung auf den menschlichen Organismus müssen jedoch

zusätzlich Resorption, Verteilungsvolumen, Elimination und Interaktionen mit anderen

Pharmaka in Betracht gezogen werden, sodass klinisch die Dosis-Wirkungs-Beziehung

höhere Relevanz aufweist (Aktories, 2006).

1.3 Deorphanisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Kennt man über einen Rezeptor weder dessen Funktion noch seinen endogenen Agonist, so

bezeichnet man ihn als orphan. Die Geschichte der Deorphanisierung begann im Jahre 1988,

als für den 5TH1A - und den D2 Dopamin-Rezeptor mit Hilfe der Reversen Pharmakologie der

natürliche Agonist identifiziert werden konnte (Libert et al., 1991; Mills and Duggan, 1994).

Die Basis dieser Erkenntnisse stellten neue molekularbiologische Methoden dar, mit deren

Hilfe orphane GPCR kloniert und in heterologen Zellsystemen exprimiert werden konnten.

Potentielle GPCR-Agonisten, für die zuvor noch kein Rezeptor identifiziert wurde, konnten

so in Signaltransduktionsanalysen getestet werden. Im Jahre 1995 erreichte die

Deorphanisierung eine neue Dimension, als durch den orphanen ORL-1 (Opioid Receptor-

Like 1) ein zuvor unbekanntes Neuropeptid orphanin FQ als Agonist isoliert wurde (Meunier

et al., 1995; Reinscheid et al., 1995). Für ORL-1 war bereits bekannt, dass seine Aktivierung

mit einer verminderten intrazellulären cAMP-Konzentration einhergeht. Aufgrund von

Expressionsanalysen des ORL-1 im zentralen Nervensystem wurden schließlich

Hirngewebeextrakte hergestellt und Fraktionen auf ihre Fähigkeit getestet, die

Adenylylcyclase zu hemmen (Civelli et al., 2013). Mit der Entschlüsselung des menschlichen

Erbguts durch das International Human Genome Sequencing Consortium im Jahre 2004

erweiterte sich das Wissen über das Vorhandensein weiterer GPCR erheblich, jedoch ohne

Anhaltspunkte über deren Liganden bzw. Signaltransduktion in der Zelle zu liefern (Human

Genome Sequencing Consortium, 2004).

Doch auch in Abwesenheit eines Liganden ist ein gewisser Anteil der Rezeptoren spontan im

aktiven Zustand R* (Lefkowitz et al., 1993). Dies ermöglicht nun, auch ohne Kenntnis eines

Agonisten die Signaltransduktion eines orphanen Rezeptors mit Hilfe der artifiziellen

Überexpression zu untersuchen. Die Anzahl an spontan aktiven Rezeptoren steigt äquivalent

mit der Gesamtzahl an Rezeptoren in der Zellmembran und erlaubt dann mit einer

12

ausreichenden Anzahl an R* die Untersuchung von z.B. second messenger-Systemen wie

cAMP, Phosphatidylinositol oder Ca2+ (Basalaktivität).

Darüber hinaus kann durch bestimmte Veränderungen in der Aminosäureabfolge

(Mutationen) eines Rezeptors ein Zustand erreicht werden, in der die Bildung von R*

favorisiert ist. Diese konstitutiv aktive Form des ursprünglichen Wildtyp-Rezeptors imitiert

den aktiven Agonist-gebundenen Zustand des Rezeptors. Die so erlangten Kenntnisse der

intrazellulären Signalkaskaden können schließlich genutzt werden, um Substanzbibliotheken

auf aktivierende bzw. inaktivierende Eigenschaften am Wildtyp-Rezeptor zu testen.

Die GPCR-Deorphanisierung führte so zur Entdeckung dutzender neuer Neuropeptidfamilien,

wie der Orexin/ Hypocretin-, Kisspeptin- oder Ghrelinfamilie und leistet so einen

entscheidenden Beitrag zum Verständnis physiologischer Prozesse (Civelli et al., 2013). Bis

heute sind noch mehr als 100 GPCR orphane Rezeptoren, die größte Gruppe unter ihnen

bildet die Familie der aGPCR (Paavola and Hall, 2012).

1.4 Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Mit 33 Vertretern im menschlichen Genom stellt die Gruppe der Adhesion-G-Protein-

gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) die zweitgrößte Gruppe unter den GPCR dar. Die aGPCR

sind eine evolutionär alte Gruppe, die sowohl in Vertebraten als auch Invertebraten vertreten

sind. Einige aGPCR sind bis in die Gruppe der Urochordata (Manteltiere) und

Cephalochordata (Schädellose) konserviert, die aGPCR Latrophilin 1 und Flamingo sind

sogar im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in der Taufliege Drosophila melanogaster

gefunden worden (Nordström et al., 2008b). Alle Familienmitglieder werden durch Gene mit

multiplen Exons kodiert, sodass angenommen werden kann, dass sie durch Mechanismen wie

Genduplikation, -deletion oder –konversion entstanden sind (Kwakkenbos et al., 2006).

Während bis heute 31 murine Rezeptoren identifiziert wurden, exprimiert der Seeigel über 90

verschiedene aGPCR (Whittaker et al., 2006). Charakteristikum dieser GPCR-Klasse ist ihre

enorme Größe, welche vor allem durch die Länge ihrer extrazellulär gelegenen N-Termini

bedingt wird. Mit bis zu 6300 Aminosäureresten gehören die aGPCR zu den größten

existierenden Membranproteinen.

13

1.4.1 Struktureller Überblick der aGPCR

Die allgemeine Struktur der aGPCR besteht aus einem extrazellulären, N-terminal gelegenen

Bereich (ECD), einer membranständigen Domäne (7TM) sowie einem intrazellulären, C-

terminalen Bereich (ICD) (Abb. 1).

Abb. 1 Schematischer Aufbau eines aGPCR (nach Liebscher et al., 2013)

Die Struktur eines aGPCR besteht aus einer extrazellulären Domäne (ECD) mit Signalpeptid (SP), einer 7TM

und einer intrazellulären Domäne (ICD). Im C-terminalen Bereich der ECD befindet sich die GPCR

Autoproteolysis Inducing domain (GAIN) mit der GPCR proteolytic site (GPS), an welcher eine Spaltung des

Rezeptors in ein N-terminales Fragment (NTF) und C-terminales Fragment (CTF) erfolgt. Zur Detektion des

Rezeptors in funktionellen Assays wurden N-terminal ein Hämagglutinin (HA) und C-terminal ein FLAG-Epitop

eingebracht.

Die N-terminalen extrazellulären Bereiche der aGPCR weisen dabei bekannte strukturelle

Domänen auf, die in anderen Proteinen Aufgaben der Protein-Protein-Interaktion oder

Zelladhäsion übernehmen. Häufig identifizierte Strukturen innerhalb der aGPCR-N-Termini

sind EGF-(epidermal growth factor)-ähnliche Bereiche, Thrombospondin-Wiederholungen,

Leucin-reiche Regionen (LRR), Immunglobulin- (Ig) oder Cadherin-ähnliche Domänen

(Yona et al., 2008). Die Existenz solcher funktionellen Domänen ist unter den GPCR für die

Vertreter der aGPCR einzigartig (Foord et al., 2002). Des Weiteren finden sich in der

Sequenz der ECD dieser Rezeptoren vermehrt Serin- und Threoninreste, sodass davon

ausgegangen wird, dass die aGPCR stark glykosyliert werden (Bjarnadóttir et al., 2004). Am

C-terminal gelegenen Ende des N-Terminus schließt sich bei der Vielzahl der aGPCR eine

14

besondere Struktur an, die GPCR proteolytic site (GPS). Die GPS besteht aus einer

konservierten, 40 Aminosäuren umfassenden Sequenz mit Cystein- und Tryptophanresten und

ist Teil einer größeren Domäne, der GAIN (GPCR Autoproteolysis INducing domain) (Araç

et al., 2012). Vier konservierte Cystein-Reste bilden innerhalb der GPS zwei

Disulfidbrückenbindungen aus. Viele, jedoch nicht alle, aGPCR werden autoproteolytisch an

dieser Region gespalten. Dies bedeutet, dass ein N-terminales Fragment (NTF) von dem C-

Terminalen Fragment (CTF) des Rezeptors separiert wird, diese aber an der Zelloberfläche

nicht-kovalent verbunden bleiben. Dabei erfolgt die Spaltung (cleavage) zwischen einem

konservierten aliphatischen Rest (meist einem Leucin) und einem Threonin-, Serin- oder

Cysteinrest. Durch Araç et al. wurde 2012 beschrieben, dass nur die vollständige GAIN in der

Lage zu dieser autoproteolytischen Spaltung ist.

Interessanterweise gibt es unter den GPCR mehrere Gruppen von Rezeptoren, die

verblüffende Ähnlichkeiten zu den aGPCR aufweisen (Abb. 2). Die

Glykoproteinhormonrezeptoren gehören zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCR und weisen

neben 7TM sowie ICD auch einen langen, extrazellulären Bereich auf. Allen

Glykoproteinhormonrezeptoren, zu denen z.B. die Rezeptoren für Thyreotropin (TSH) oder

Lutropin (LH) gehören, ist eine besondere extrazelluläre Struktur gemeinsam. Nach einem

Signalpeptid schließen sich die Cysteinbox 1, welche Teil der leucine-rich repeat domain ist,

sowie die am Ende des N-Terminus lokalisierte hinge region an. Die hinge region enthält

ähnlich der GPS von aGPCR mehrere Cysteinreste, die untereinander

Disulfidbrückenbindungen formen. Diese Region wird für den TSH-Rezeptor (TSHR) auch

cleavage domain genannt. Durch Konformationsänderung dieser Domäne soll die Bindung

von TSH an den TSHR erleichtert werden. Weiterhin soll die hinge region notwendig für

Stabilisierung der Basalkonformation des TSHR sein. Auf Hormon-Rezeptor-Interaktion

folgend kommt es vermutlich durch Freilegung eines intramolekularen Agonisten zur

Aktivierung des Rezeptors (Sangkuhl, 2002; Kleinau et al., 2011).

15

Abb. 2 Strukturelle Eigenschaften von GPCR mit komplexen N-Termini (Liebscher et al., 2013).

Neben den aGPCR gibt es weitere Vertreter von GPCR, die ähnlich komplexe Strukturen im N-Terminus

aufweisen. Sowohl Glykoproteinhormonrezeptoren als auch Sekretin-ähnliche und glutamaterge Rezeptoren

weisen Cystein-reiche und proteolytische Regionen auf. Signal peptide (SP), cysteine-rich domain (CRD), Venus

flytrap domain (VFT), leucine-rich repeat domain (LRR)

1.4.2 Physiologische Bedeutung der aGPCR

Verschiedene Untersuchungen unterstreichen die physiologische Relevanz der aGPCR. So

besitzen einige Rezeptoren Bedeutung in der Entwicklung des Immunsystems, der

Embryogenese, Tumorigenese oder im Metabolismus. Der aGPCR CD97 zum Beispiel,

welcher sich durch zahlreiche EGF-Domänen im N-Terminus auszeichnet, scheint eine

wichtige Rolle in der Funktion und Migration von neutrophilen Granulozyten zu spielen.

Untersuchungen mit spezifischen EGF-blockierenden Antikörpern zeigen einen Einfluss des

CD97 vor allem für das angeborene Immunsystem, währenddessen die adaptive

Immunantwort unbeeinträchtigt bleibt (Hamann et al., 2010).

Weiterhin sind mehrere Vertreter der aGPCR essentielle Regulatoren der Embryogenese. So

soll der GPR125 den Wnt/planar cell polarity Signalweg während der Gastrulation im

Zebrafisch modulieren. Dabei trägt die Rekrutierung von Dishevelled als cytoplasmatisches

Protein an die Zellmembran durch den GPR125 zur entwicklungsgerechten Migration der

fazialen brachiomotorischen Neuronen des Embryos bei (Li et al., 2013). In diesem

Zusammenhang ist des Weiteren beschrieben worden, dass auch der aGPCR

Flamingo1/CELSR1 den Prozess der Konvergenz und Ausdehnung embryonaler Zellen

während der Gastrulation vermittelt (Formstone and Mason, 2005).

16

Bestimmte Mutationen des humanen GPR56 gehen mit einer gestörten Gehirnentwicklung

einher und rufen das Krankheitsbild der bilateralen frontoparietalen Polymikrogyrie (BFPP)

hervor (Piao et al., 2004). Das Usher Syndrom dagegen, eine angeborene Blind- und Taubheit,

entsteht durch Mutation des Very large G Protein-coupled receptor (VLGR) (Weston et al.,

2004). Auch in der Tumorigenese nehmen aGPCR eine wichtige Rolle ein. Es konnte gezeigt

werden, dass die Expression des Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) in

Karzinomen der Lunge, des Magens und des Kolorektums signifikant reduziert ist

(Fukushima et al., 1998; Hatanaka et al., 2000; Lee et al., 2001). Die Vaskularisierung in

Glioblastomen ist dabei erheblich durch BAI1-exprimierende Zellen gestört (Kang et al.,

2006). Der CD97 wird in einer Vielzahl von Tumoren (Schilddrüse, Magen,

Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre) exprimiert und ist mit schlechtem klinischen Staging

inklusive Lymphknotenmetastasen assoziiert (Aust et al., 1997; Aust et al., 2002; Steinert et

al., 2002). Auch der GPR56 soll in der Metastasenbildung von Melanomen beteiligt sein (Xu

et al., 2006).

Eine Deletion des aGPCR GPR116 im Fettgewebe beeinträchtigt die Insulinsensitivität durch

Störung der Fettgewebsentwicklung. Fettgewebs-spezifische, konditionelle knock-out-Mäuse

zeigen weiterhin einen erhöhten Grad an Leberverfettung als Wildtyp-Mäuse, verminderte

Adiponektinwerte und einen erhöhten Resistin-Spiegel im Serum (Nie et al., 2012).

Wie hier dargestellt, sind die größtenteils orphanen aGPCR in den letzten Jahren verstärkt in

den Fokus des klinischen Interesses gerückt. Um diese Rezeptorgruppe jedoch zukünftig als

potentielle Targets diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, steht deren umfassende

Charakterisierung hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion an

erster Stelle experimenteller Untersuchungen.

1.4.3 Die Signaltransduktion der aGPCR

Die besondere Struktur der aGPCR führte zu der Annahme, dass Rezeptoren dieser GPCR-

Klasse eine duale Rolle in der Physiologie einnehmen. Mit Hilfe ihrer funktionellen Domänen

in der ECD sollen sie als Zelloberflächenmoleküle Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen

vermitteln sowie weiterhin über G-Proteine die Aufgaben klassischer GPCR erfüllen (Yona et

al., 2008). Lange Zeit war jedoch nicht eindeutig geklärt, ob die aGPCR tatsächlich an ihre

namensgebenden G-Proteine koppeln. Erste Hinweise zur Klärung dieser Fragestellung

kamen im Jahre 1997 auf. Für das Latrophilin, dem identifizierten Rezeptor des α-Latrotoxins

17

(Gift der Schwarzen Witwe Latrodectus), konnte eine physische Interaktion mit der Gαo-

Untereinheit von G-Proteinen gezeigt werden. Dazu wurde eine zweistufige

Affinitätschromatographie eingesetzt (Lelianova et al., 1997). Mit Hilfe von serum response

element (SRE)-Reportergen-Experimenten und einem Pulldown-Assay mit Rho-GTP wurde

für den GPR56 eine Kopplung an Gα12/13 beschrieben (Iguchi et al., 2008).

Monk et al. zeigten für den GPR126 im Zebrafisch Danio rerio einen funktionellen

Anhaltspunkt für eine Gαs-Interaktion. Eine Myelinisierungsstörung auf Grund einer

GPR126-Defizienz im Zebrafisch konnte durch die Applikation von Forskolin, einem

Aktivator der Adenylylcyclase, und nachfolgender cAMP-Steigerung funktionell gerettet

werden (Monk et al., 2009).

Im Jahre 2011 konnte durch Bohnekamp und Schöneberg erstmalig die G-Protein-Kopplung

für den GPR133 mit Hilfe eines second messenger-Systems bewiesen werden. Transiente

Transfektion des humanen und murinen GPR133 zog eine konzentrationsabhängige cAMP-

Akkumulation nach sich, die spezifsch durch siRNA (gerichtet gegen endogenes Gαs)

gehemmt werden konnte (Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Später konnte vervollständigt

werden, dass der GPR133 nicht nur an Gαs, sondern auch eine Kopplung an Gαi eingeht

(Liebscher et al., 2013). Weiterhin konnte durch Gupte et al. sowohl eine Gαs-Kopplung des

GPR114 als auch Inositolphosphat-Akkumulationen nach Transfektion mit chimären G-

Proteinen für GPR97 und GPR110 gezeigt werden. Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten,

dass der GPR110 an Gαq und GPR97 an Gαo koppeln. GPR115 und EMR2 waren durch Co-

Transfektion mit Gα15 aktiv (Gupte et al., 2012). G-Protein-Kopplung scheint folglich auch

für die aGPCR eine generelle Eigenschaft zu sein.

Es sind jedoch auch G-Protein-unabhängige Signaltransduktionsmechanismen für die aGPCR

beschrieben worden. Der Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) bindet über seine

thrombospondin type 1 repeats (TSR) externalisiertes Phosphatidylserin auf der Zellmembran

apoptotischer Zellen. Nach Komplexbildung des BAI1 mit ELMO und Dock180 bewirkt dies

über die kleine GPTase Rac die Endozytose apoptotischer Zellen (Park et al., 2007). Das

120 kDa große Vasculostatin, das NTF des BAI1, verhindert weiterhin in vitro die Migration

von Endothelzellen und in vivo Angiogenese. Dies deutet an, dass auch das N-terminale

Fragment per se funktionelle Eigenschaften aufweist (Kaur et al., 2009).

Prömel et al. zeigten für die extrazelluläre Domäne des Latrophilins 1 (LAT1) eine von dem

CTF unabhängige Funktion in Caenorhabditis elegans. Dabei sind zwei unterschiedliche

Mechanismen denkbar: Die Interaktion der Ektodomäne als Ligand für Rezeptoren auf sich in

18

der Nähe befindlichen Zellen (reverse signaling) oder die Assoziation der ECD mit einem

Co-Rezeptor auf derselben Zelle (forward signaling) (Prömel et al., 2012a).

Auch der GPR126 besitzt eine unabhängige Funktion des N-Terminus. GPR126-knock-out

Mäuse und GPR126-knock-down Zebrafische weisen eine verminderte Trabekularisierung des

Herzmuskels auf. Ektope Expression des NTF (ohne GPS-Motiv) des GPR126 ist jedoch in

der Lage, diesem Phänotyp entgegen zu wirken (Patra et al., 2013).

1.4.4 Liganden von aGPCR

Bereits 1996 ist für den CD97 das Komplementsystem-regulierende Oberflächenmolekül

CD55 als Ligand geschrieben worden (Hamann et al., 1996). Auch in den darauf folgenden

Jahren wurden weitere Liganden verschiedener aGPCR veröffentlicht: Chondroitinsulfat-

Glykosaminoglykan für sowohl EMR2 als auch CD97 (Stacey, 2003), α5β1 Integrin für den

CD97 (Wang, 2005) und Gewebstransglutaminase 2 für den GPR56 (Xu et al., 2006). Für

Latrophilin 1 (LAT1) wurden neben dem Gift der Schwarzen Witwe Latrotoxin weitere drei

potentielle Liganden publiziert: Teneurin-2 (Silva et al., 2011), Neurexin (Boucard et al.,

2012) und FLRT (fibronectin leucine-rich repeat transmembrane)-Proteine (O'Sullivan et al.,

2012).

Es bleibt zu bedenken, dass die beschriebenen Interaktionen mit Chondroitinsulfat als niedrig-

affine und Calcium-abhängige Assoziationen charakterisiert sind. Bis heute gibt es auch

keinen Nachweis, dass CD55 die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion des CD97 aktiviert

(Paavola and Hall, 2012). Darüber hinaus ist auffällig, dass viele potentielle Liganden

Bestandteile der extrazellulären Matrix darstellen. Im Hinblick auf die Vielzahl funktioneller

Domänen in der ECD, deren Homologie zu Matrixproteinen charakteristisch für die aGPCR

ist, scheinen Interaktionen mit solchen Extrazellulärbestandteilen gut erklärbar. Fraglich

bleibt jedoch, ob es sich bei den Liganden tatsächlich um Agonisten der aGPCR handelt.

1.4.5 Die Bedeutung des cleavage der aGPCR

Im Jahre 1997 konnte für den aGPCR Calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL,

auch als Latrophilin bekannt) gezeigt werden, dass der Rezeptor aus zwei nicht-kovalent

gebundenen Fragmenten p120 und p85 besteht. Das extrazellulär gelegene, hydrophile p120

19

weist dabei strukturelle Eigenschaften eines Adhäsionsmoleküls auf, währenddessen p85

einem typischen GPCR entspricht. Da beide Untereinheiten auf demselben Gen kodiert

werden, lag die Vermutung nahe, dass ein Vorläufermolekül durch proteolytische Spaltung

prozessiert wird (Krasnoperov et al., 1997). Die Spaltungsstelle des CIRL wurde in einer

Cystein- und Tryptophan-reichen Region im N-terminalen Fragment lokalisiert. Es konnte

gezeigt werden, dass Mutationen in diesem Bereich die proteolytische Spaltung verhindern

und mit einer erhöhten Degradation des nichtgespaltenen Rezeptors einhergehen. Diese

spezielle Region - als G Protein-coupled Receptor proteolysis site (GPS) bezeichnet - wurde

in vielen aGPCR identifiziert und als besonderes Charakteristikum der gesamten Gruppe

postuliert (Krasnoperov et al., 2002).

Interessanterweise zeigten verschiedene Arbeitsgruppen, dass durch die Abspaltung des NTF

die intrazelluläre Signaltransduktion von aGPCR aktiviert wird. So legte die Gruppe um

Okajima am Brain-specific angiogenesis inhibitor 2 (BAI2) dar, dass die an der GPS

trunkierte Variante in einem Reportergen-Assay NFAT (nuclear factor of activated T-cells)

10fach stärker aktiviert als der Wildtyp ist (Okajima et al., 2010). Für den GPR56 wurde

beschrieben, dass eine homolog verkürzte Form dieses Rezeptors mit einer erhöhten Gα12/13-

Protein-Kopplung im Vergleich zum WT einhergeht (Paavola et al., 2011). Neuere

Untersuchungen des Brain-specific angiogenesis inhibitors 1 (BAI1) zeigten eine Aktivierung

des Rho-Signalwegs über Gα12/13 und die Phosphorylierung der Extracellular-signal regulated

Kinase (ERK) auf, welche durch die Trunkierung des N-Terminus drastisch gesteigert werden

konnten (Stephenson et al., 2013).

In Hinblick auf die potenzielle Aktivierung durch das cleavage der aGPCR wurde 2002 für

den BAI2 ein Modell vorgeschlagen, das die bis dahin publizierten Forschungsergebnisse

vereint. Der BAI2 soll im Endoplasmatischen Retikulum glykosyliert und an der GPS (sowie

durch Furin) so gespalten werden, dass NTF und CTF weiterhin nicht-kovalent assoziiert

bleiben. Zur Zelloberfläche transportiert, kann der extrazellulär gelegene Bereich über seine

funktionellen Domänen mit Matrix- oder Membranproteinen interagieren und von dem CTF

dissoziieren. Dies löst in dem verbliebenen membrangebundenen CTF eine

Konformationsänderung zur aktiven Form des Rezeptors aus und resultiert in der Kopplung

an dessen spezifisches G-Protein. Bis heute ist diese generelle Vorstellung der aGPCR-

Aktivierung aktuell geblieben und wurde von verschiedenen Autoren erneut aufgegriffen. So

beschrieben auch Paavola et al. den inhibitorischen Effekt des N-Terminus des GPR56

(Paavola et al., 2011). Es wird davon ausgegangen, dass sich im N-Terminus ein gebundener

20

inverser Agonist befindet, der erst durch einen Liganden sterisch von der

Transmembranregion entkoppelt wird.

Obwohl die Struktur der GAIN-Domäne und der Mechanismus der autoproteolytischen

Spaltung gut verstanden zu sein scheinen (Paavola et al., 2011; Araç et al., 2012), bleibt die

Funktion des cleavage unklar. Zwei BFPP-assoziierte Mutationen in der GPS des GPR56

gehen mit einem gestörten intrazellulären Transport des Rezeptors zur Plasmamembran und

cleavage-Defizienz einher (Jin et al., 2007). Mutationen konservierter Cysteinreste innerhalb

der GPS des GPR126 wurden als cleavage-defizient postuliert und sollen in intrazellulären

Vesikeln lokaliert sein (Moriguchi et al., 2004). Für den EMR2 dagegen wurden verschiedene

Punktmutationen der cleavage site untersucht, ohne dass eine konsistente Korrelation

zwischen proteolytischer Spaltung und Expression gefunden werden konnte (Lin et al., 2004).

Cleavage-defiziente Mutationen des Latrophilins 1 (LAT1) zeigten hinsichtlich Fertilität und

Letalität in Caenorhabditis elegans keinen Unterschied zum Wildtyp auf, sodass cleavage für

LAT1 verzichtbar erscheint (Prömel et al., 2012a).

Erwähnenswert ist des Weiteren, dass einige Vertreter dieser Rezeptorfamilie wie GPR111

und GPR115 eine veränderte Struktur der GPS aufweisen und dort keine autoproteolytische

Spaltung erfolgt (Prömel et al., 2012b). Dem aGPCR GPR123 fehlt die GPS-Domäne

gänzlich (Bjarnadóttir et al., 2007a; UniProtKB/Swiss-Prot, 2014). Für den GPR56 und

GPR124 sind weiterhin gewebespezifische Splicevarianten ohne GPS erkannt worden

(Bjarnadóttir et al., 2007b).

1.4.6 Der GPR126

Der GPR126, auch als Developmentally Regulated G Protein–coupled Receptor (DREG) oder

Vascular inducible G Protein-coupled Receptor (VIGR) beschrieben, ist ein Vertreter der

aGPCR. Orthologe des GPR126 sind spezifisch in Vertebraten wie Fischen, Reptilien, Vögeln

und Säugetieren zu finden. Chordatiere wie Ciona intestinalis und das Neunauge Petromyzon

marinus exprimieren den GPR126 dagegen nicht (Waller-Evans et al., 2010). Nächster

Verwandter des GPR126 ist der GPR112, welcher auch nur in Vertebraten exprimiert ist.

Gewebespezifisch ist der GPR126 in der Plazenta, Schwannzellen und in Endothelzellen zu

finden (Moriguchi et al., 2004; Stehlik et al., 2004; Monk et al., 2009). Während der

Embryogenese ist der GPR126 im murinen Herz und in den Somiten hoch exprimiert, im

adulten Gewebe dagegen besonders in der Lunge (Moriguchi et al., 2004).

21

Das Gen für den humanen GPR126 ist auf dem langen Arm q24.1 des Chromosoms 6

lokalisiert. Es wurden bisher drei Splicevarianten des GPR126 beschrieben, von denen für

zwei eine funktionelle Bedeutung vorausgesagt wird. Eine Variante, der 26 Aminosäuren im

N-Terminus fehlen, ist sogar konserviert in Maus und Affe gefunden worden (Bjarnadóttir et

al., 2007b).

Der GPR126 weist typische strukturelle Charakteristika der aGPCR-Klasse auf. Im

extrazellulären Bereich des GPR126 sind als funktionelle Bestandteile die Pentraxin (PTX)-

und CUB-Domänen identifiziert worden. Pentraxine sind Pentamere und umfassen Akute-

Phase-Proteine wie das humane C-reaktive Protein (CRP) und das Serumamyloid P. Calcium-

abhängige Bindung von Bakterien, Chromatin und Kohlenhydraten sowie Interaktionen mit

dem Komplementsystem und Leukozyten verdeutlichen die Rolle von Pentraxinen in der

natürlichen Immunabwehr (Gewurz et al., 1995). Die CUB-Domäne wurde erstmalig in

Subkomponenten des Komplementsystems (C1r/C1s) erkannt und ist darüber hinaus als

Bestandteil von Kollagen-spaltenden Proteasen (Hulmes et al., 1997), in

Entwicklungsprozesse vermittelnden Proteinen (Bork and Beckmann, 1993) und in der

zellulären Immunabwehr beschrieben worden (Duke-Cohan et al., 2000). Es darf deshalb

vermutet werden, dass auch der GPR126 eine entscheidende Rolle in der angeborenen

Immunabwehr einnimmt (Stehlik et al., 2004).

Am C-terminalen Ende des N-Terminus befindet sich die GPS, an der der GPR126

intrazellulär autoproteolytisch gespalten wird. Moriguchi et al. beschrieben, dass resultierend

aus dieser Spaltung ein 35 kDa großes membrangebundenes Fragment im Westernblot

gefunden werden kann. Weiterhin soll aus einer N-terminal lokalisierten Furin-Spaltstelle ein

70 kDa großes Fragment hervorgehen. Es wurden bereits erste Untersuchungen zweier

GPR126-knock-out Mauslinien angestellt. Waller-Evans et al. beschrieben, dass homozygot

GPR126-negative Mausembryonen aufgrund kardiovaskulärer Fehlentwicklung nicht

lebensfähig sind. Defekte der Ventrikelentwicklung mit ausgedünnten Myokardwänden

wurden als wahrscheinlichste Todesursache bei GPR126-Funktionsverlust aufgezeigt.

Dagegen stellten Monk et al. heraus, dass Nachkommen einer anderen GPR126-knock-out

Mauslinie zwar auch vielfach schon in utero verstarben, einige jedoch postnatale Stadien

erreichen konnten. Diese wiesen Myelinisierungsstörungen des peripheren Nervensystems

sowie multiple Defekte peripherer Nerven auf (Monk et al., 2011). Ein ähnlicher Phänotyp

charakterisiert auch den GPR126-knock-out im Zebrafisch Danio rerio. Die Mutation st49

führt N-terminal der GPS des GPR126 ein vorzeitiges Stopcodon ein und bewirkt einen

Myelinisierungsdefekt im peripheren Nervensystem. Untersuchungen bekannter

22

Differenzierungsmarker von Schwannzellen ergaben, dass die frühsten Defekte durch

GPR126-knock-out ab Stunde 42 nach Fertilisation der Zebrafischlarven nachweisbar sind. Es

konnte geschlussfolgert werden, dass der GPR126 durch die Expression von Oct6 und krox20

die Myelinisierung von motorischen und sensorischen Nerven initiiert und sie im

Adultstadium aufrechterhält (Monk et al., 2009).

Neben einer Ohrschwellung gab es durch st49 keine weiteren Auffälligkeiten, insbesondere

keine kardiovaskulären Phänomene. Eine Erklärung für diese unterschiedlichen Phänotypen

lieferten nun neue Untersuchungen durch Patra et al.. Das GPR126-CTF, welches in der

Zebrafisch-Mutation st49 nachweislich fehlt, soll die strukturelle Ursache für die

Myelinisierungsstörung darstellen. Für eine regelrechte Herzentwicklung soll das GPR126-

CTF nicht notwendig sein. Im Gegensatz dazu genügt das GPR126-NTF-ΔGPS (N-terminaler

Bereich des Rezeptors ohne GPS) für eine korrekte Herzanlage, kann jedoch dem

Myelinisierungsschaden nicht entgegen wirken. Das lässt vermuten, dass der GPR126 als

Rezeptor das Myelingen in Schwannzellen beeinflusst und im Herzen möglicherweise durch

sein NTF als Ligand oder Co-Rezeptor einen unbekannten Rezeptor aktiviert (Patra et al.,

2013).

Genomweite Assoziationsstudien zeigten weiterhin eine entscheidende Rolle des humanen

GPR126 in der Ausprägung von Körpergröße auf (Hancock et al., 2009; Soranzo et al., 2009;

Zhao et al., 2010). Nach dem in vivo Hinweis im Zebrafisch, der eine Gs-Kopplung nahelegte,

konnten nun Ergebnisse der Arbeitsgruppe eine Interaktion des GPR126 mit Gs- und Gi-

Proteinen bestätigen (Mogha et al., 2013).

1.4.7 Der GPR133

Der aGPCR GPR133, früher auch als G-Protein Coupled Receptor PGR25 bezeichnet (NCBI

Gene, 2014), ist im humanen Genom auf dem langen Arm q24.33 des Chromosoms 12

lokalisiert. Orthologe des GPR133 finden sich in Säugetieren, Fischen, Vögeln und Reptilien,

aber auch im Plattentier Trichoplax adhaerens, Stachelhäutern und der kleinpolypigen

Steinkoralle Acropora millepora.

Der nächstverwandte Rezeptor ist der aGPCR GPR144 (Bjarnadóttir et al., 2007a). Man geht

heute davon aus, dass sich die GPCR der Sekretin-Familie ausgehend vom GPR133 und

GPR144 entwickelt haben (Nordström et al., 2008a).

23

Im Gegensatz zum GPR126 ist im extrazellulären Rezeptorbereich des GPR133 nur eine

Pentraxin-(PTX) Domäne enthalten. Bjarnadόttir et al. beschrieben zwei funktionelle

Splicevarianten des GPR133 und deren Expression in fetalem Gewebe, Lunge, Milz und

Testis (Bjarnadóttir et al., 2007b). Northernblot Untersuchungen wiesen Transkripte des

GPR133 in der humanen Hypophyse und im Putamen nach (Vanti et al., 2003). Kobayashi et

al. fanden des Weiteren die Expression des GPR133 im Follikel-assoziierten Epithel

(Kobayashi et al., 2012). Im Ileum erkennt man Follikel-assoziiertes Epithel in den

sogenannten Peyer´s Plaques. Diese Plaques als Zusammenschluss mehrerer hunderter

Lymphfollikel sind Orte der Immunabwehr: Exogene Antigene werden über spezialisierte M-

Zellen über Endozytose aufgenommen und Zellen der adaptiven Immunabwehr präsentiert

(Aumüller, 2010).

Ähnlich dem GPR126 ist auch der GPR133 in genomweiten Assoziationsstudien mit

Körpergröße assoziiert worden (Tönjes et al., 2009). Weiterhin soll der GPR133 das

Körpergewicht von Mäusen kontrollieren (Chan et al., 2012) und die Länge des RR-Intervals

im Elektrokardiogramm modulieren. Marroni et al. identifizierten zwei Single Nucleotide

Polymorphisms (SNP) des GPR133, welche die Herzfrequenz um durchschnittlich etwa einen

Herzschlag pro Minute erhöhen. Eine Herzfrequenzsteigerung stellt einen bekannten

Risikofaktor für die Morbidität und Mortalität kardiovaskulärer Erkrankungen dar (Marroni et

al., 2009). Genotyp-Phänotyp-Untersuchungen ergab eine Assoziation eines GPR133-SNP

mit vermehrter Lipidaufnahme (Kraja et al., 2013).

Der GPR133 ist der erste Vertreter der aGPCR für den G-Protein-Kopplung überzeugend

durch Akkumulation des second messengers cAMP bewiesen werden konnte. Heute ist

bekannt, dass der GPR133 sowohl über Gαs- als auch über Gαi–Proteine Signaltransduktion

ausübt (Bohnekamp and Schöneberg, 2011; Liebscher et al., 2013).

24

2 Ziele und Fragestellungen

Bis heute sind die aGPCR orphane Rezeptoren. Für die beschriebenen Liganden fehlt bisher

der Nachweis einer agonistischen Funktion. Die Rolle des enorm langen N-Terminus ist nach

wie vor unklar und für den überwiegenden Teil der aGPCR-Klasse ist die intrazelluläre

Signaltransduktion unbekannt. Für die beiden aGPCR Vertreter GPR126 und GPR133 wurde

am Institut für Biochemie die Signaltransduktion geklärt und damit ein funktionelles read-

out-System etabliert. Anhand dessen konnten Mutagenesestudien durchgeführt werden,

welche die Basis zur Klärung aktivitätsrelevanter Positionen und letztendlich des

Aktivierungsmechanismus bilden. Basierend auf Voruntersuchungen anderer Arbeitsgruppen

werden zwei Aktivierungsmechanismen postuliert (Liebscher et al., 2013):

a. Bereiche der ECD wirken als inverser gebundener Agonist und blockieren die

Rezeptorfunktion bis zum Zeitpunkt einer Ligandbindung.

b. In der ECD befindet sich ein gebundener Agonist, welcher durch Ligandbindung

freigelegt wird und die Signaltransduktion des Rezeptors aktiviert.

Abb. 3 Hypothetische Aktivierungsmechanismen der aGPCR

A) Der N-Terminus enthält einen gebundenen inversen Agonist, welcher die 7TM-Signaltransduktion inhibiert.

Ligandenbindung an die ECD oder künstliche Abspaltung der ECD beendet diese Inhibierung. B) Bindung eines

Ligandes an die ECD oder Entfernung von Teilen der ECD löst eine Konformationsänderung aus und legt einen

gebundenen Agonist frei.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularen Charakterisierung der Klasse der

aGPCR und soll dabei folgende Fragen beantworten:

1. Gibt es einen generellen Mechanismus, durch den alle aGPCR aktiviert werden? Wie

sieht dieser Mechanismus konkret aus (Hypothese des gebundenen inversen Agonist

versus gebundenen Agonist)?

A B

25

2. Gibt es generelle Kopplungsmerkmale der aGPCR-Klasse? Koppeln weitere Vertreter

(neben GPR126 und GPR133) an G-Proteine und wie spezifisch ist diese Kopplung?

3. Werden alle aGPCR, die eine charakteristische cleavage-Sequenz aufweisen,

tatsächlich gespalten? Hat dies einen Einfluss auf die Expression bzw. Basalaktivität

der Rezeptoren?

4. Können Punktmutationen identifiziert werden, welche eine konstitutive Aktivität des

Rezeptors nach sich ziehen?

Um diesen Fragestellungen nachzugehen, wurden 11 orphane aGPCR-Vertreter molekular

charakterisiert. Hauptsächlich basierend auf murinen cDNA-Bibliotheken wurden die

Rezeptoren in einen Säugetier-Expressionsvektor kloniert und hinsichtlich ihrer

intrazellulären G-Protein-abhängigen Signaltransduktion untersucht.

Die Frage eines allgemeinen Aktivierungsmechanismus der aGPCR wurde anhand der bereits

basal charakterisierten Rezeptoren GPR126 und GPR133 analysiert.

26

3 Material/Methoden

3.1 Chemikalien und allgemeine Labormaterialien

Falls nicht konkret angegeben, wurden alle Standardchemikalien von Sigma Aldrich

(Taufkirchen, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland) oder C. Roth GmbH

(Karlsruhe, Deutschland) erworben. Zellkultur- und Laborplastikmaterialien waren von

Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen, Deutschland) und Sarstedt (Nürnberg, Deutschland)

sowie Pipetten von Eppendorf (Hamburg, Deutschland) und VWR (Darmstadt, Deutschland)

bezogen. Primer wurden durch Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Deutschland)

hergestellt. Es wurden weiterhin Enzyme und DNA/Protein-Größenstandards von Thermo

Scientific (München, Deutschland) oder New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main,

Deutschland) bezogen.

3.2 Molekularbiologische Standardmethoden

Tab. 1 Liste der verwendeten molekularbiologischen Standardmethoden

Methode Protokoll Firma, System

Nukleinsäurekonzen-

trationsbestimmung Sambrook et al., 1989

Spektrophotometer, NanoDrop ND1000, Peq Lab

Biotechnologie (Nürnberg, Deutschland)

Agarosegelelektrophorese Sambrook et al., 1989 Horizontalgelelektrophorese-Systeme, Peq Lab

(Nürnberg, Deutschland)

Polyacylamidgelelektro-

phorese SDS-PAGE Laemmli, 1970

Mini-Protean II Cell BioRad, Laboratories, Inc.

(München, Deutschland)

Restriktionsverdau Nach Angaben des

Herstellers

Restriktionsendonukleasen, Thermo Scientific

(München, Deutschland)

Polymerasekettenreaktion Sambrook et al., 1989 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, Thermo

Scientific (München, Deutschland)

Agarosegel-Elution Nach Angaben des

Herstellers

Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System,

Promega (Mannheim, Deutschland)

DNA-Reinigung Nach Angaben des

Herstellers

Wizard Plus SV, Miniprep/Midiprep DNA

purification System, Promega (Mannheim,

Deutschland)

Sequenzierung Sanger et al., 1977

Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit,

Sequenziergerät ABI 3730, Applied Biosystems,

Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)

27

Tab 2. Übersicht der verwendeten Laborgeräte

Funktion Gerät, Firma

Zentrifuge für 50 ml Falcons und

96 Well-Platten

Multifuge 1 S-R, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,

Deutschland)

Zentrifuge für 0,5-2,0 ml

Röhrchen

Biofuge pico, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,

Deutschland)

Spektrophotometer Sunrise™, Tecan Deutschland GmbH (Crailsheim, Deutschland)

37 °C Kulturschrank Memmert (Schwabach, Deutschland)

37 °C Schüttel-Kulturschrank Kulturschrank, Edmund Bühler GmbH (Hechingen, Deutschland)

Kreisschüttler Heidolph Polymax 1040 (Schwabach Deutschland)

Überkopfschüttler Reax 2, Heidolph Instruments GmbH (Schwabach, Deutschland)

Vortexer Vortex-Genie 2, Scientific Industries (New York, USA)

PCR-Zykler DNA engine, thermal cycler, Bio-Rad Laboratories GmbH (München,

Deutschland)

Zellkultur Bench HERA Safe, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,

Deutschland)

Zellkultur Brutschrank, 37 °C

5% CO2

HERA (el) 150, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,

Deutschland)

Thermomixer Thermomixer comfort, Eppendorf AG (Hamburg, Deutschland)

Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200, Zeiss (Jena, Deutschland)

Kamerasystem (Westernblot) Decon Dc Sience Tec, DeVision DBOX (Hohengandern, Deutschland)

3.3 Klonierung

Während der Großteil an Wildtyp-Rezeptoren durch Verwendung von murinen cDNA-

Bibliotheken in den Säugetier-Expressionsvektor pcDps kloniert werden konnte, bedurfte es

für das Konstrukt des murinen Brain-specific angiogenesis inhibitors 2 (BAI2) die Nutzung

eines kommerziell erhältlichen Imageclons (Source BioScience LifeSciences, Nottingham,

Großbritannien). Der hier stets eingesetzte pcDps-Vektor besitzt eine Ampicillin-

Resistenzkassette, welche zur Selektion in Bakterien genutzt werden kann, und einen SV40-

Promotor (Okayama and Berg, 1983). Alle Rezeptoren wurden mit mindestens zwei Epitop-

tags (Markierungen) versehen, um die Expression der Konstrukte an der Zellmembran zu

gewährleisten und deren Detektion in Zellkompartimenten zu ermöglichen. N-terminal

wurden deshalb die Aminosäuren YPYDVPDYA des humanen Influenza-Hämagglutinins

(HA) hinter dem Signalpeptid eingebracht, am Ende des C-Terminus dagegen eine FLAG-

28

Sequenz (DYKDDDDKI). Für einige Rezeptoren war es zusätzlich notwendig, ein weiteres

tag N-terminal einzufügen: Das RHO-tag, welches den ersten 20 Aminosäuren des bovinen

Rhodopsins entspricht, konnte schon für andere GPCR erfolgreich eingesetzt werden, um

deren Oberflächenexpression an der Zellmembran zu erhöhen (Bohnekamp and Schöneberg,

2011). Länge und Lokalisation des Signalpeptids für diese Rezeptoren wurde durch SignalP

4.1 Server vorhergesagt (Center for Biological Sequence Analysis CBS). Alle

Vektorkonstrukte wurden mit einer Kozak-Sequenz im 5‘-Bereich des Start-Codons ATG als

ribosomale Bindungsstelle und damit als Startsignal für die Proteinbiosynthese versehen

(Kozak, 1987).

Für die Klonierung von Rezeptoren mit bis 4000 bp Sequenzlänge wurde eine Standard-PCR

durchgeführt. Teilweise war es jedoch unumgänglich, die Sequenz eines aGPCR in mehrere

Teilstücke zur besseren Handhabung während der Klonierungsschritte zu zerlegen. Die

Sequenz des murinen BAI2 ist beispielsweise 1561 Aminosäuren lang und wurde in drei

Teilstücke aufgeteilt. In einem ersten Schritt wurden die Teilbereiche des Rezeptors in den

Plasmidvektor pCR™4-TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen) eingefügt und

sequenziert. Da sich der übliche Einsatz von Restriktionsenzymen dieses Rezeptors

kompliziert gestaltete, wurden unter Nutzung des E.coli.-Stamms SW102 und des Gibson

Assembly zwei Rekombinationsmethoden eingesetzt.

3.3.1 E. coli–Stamm SW102

Der Rekombinationsstamm SW102 erlaubt die Klonierung von DNA in E. coli ohne den

üblichen Einsatz von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase. Zellen des Stamms SW102

enthalten einen defekten λ Prophagen. Dabei sind drei λ-kodierte Gene von Bedeutung: Exo,

Bet und Gam. Der λPL Promotor für diese Gene wird bei 32 °C durch einen Temperatur-

sensitiven Repressor behindert. Während bei 32 °C demnach keine Rekombinationsproteine

produziert werden, veranlasst eine kurze Temperaturerhöhung auf 42 °C (Hitzeschock für 15

Minuten) die Produktion einer ausreichenden Menge solcher Rekombinationsproteine: Exo

kodiert für eine 5´-3´-Exonuklease, die 3´-Überhange der eingebrachten doppelsträngigen

DNA produziert. Bet schützt diese Überhänge und unterstützt den nachfolgenden

Rekombinationsprozess, wohingegen Gam die Degradation der linearen DNA durch das

E. coli RecBCD-Protein verhindert.

29

Im ersten Schritt erfolgt die Transformation des nativen pcDps-Vektors in die SW102-Zellen

mit nachfolgender Kompetenzerzeugung mit Calciumchlorid (Mandel and Higa, 1970) und

Aktivierung der Rekombinaseaktivität durch 15-minütige Inkubation bei 42 °C. Danach

schließt sich die Transformation des PCR-Produktes in die nun chemisch-kompetenten

SW102-Zellen inklusive pcDps an, welche allein durch die drei λ-kodierten Gene ermöglicht

wird. Die SW102-Zellen werden bei 32 °C für 32-48 Stunden auf LB-Platten inkubiert, bis

Zellklone erkennbar sind.

Zum Gelingen der Rekombination ist ein spezielles Primerdesign nötig, welche 5‘ 60 bp

homologe Sequenzen zum Zielvektor und 3‘ 30 bp Homologie zur Resistenzkassette

sicherstellen. Für die Klonierung des BAI2 wurde dafür eine zusätzliche Kanamycin-

Resistenzkassette an das Ende des 1. Teilstückes durch eine Overlap-PCR eingefügt. Die

Kanamycin-Resistenz konnte so zur Unterscheidung zwischen nativem pcDps-Vektor und

erfolgreicher Rekombination in den Vektor auf Kanamycin-haltigen Kulturplatten dienen. Die

Kanamycin-Resistenzkassette wurde nachträglich über eine XbaI-Restriktionsenzymstelle

entfernt (NCI at Frederick; Warming, 2005).

3.3.2 Gibson Assembly

Die Gibson Assembly Methode erlaubt eine effiziente Vereinigung multipler überlappender

DNA-Fragmente in einer einstufigen isothermalen Reaktion. Das Protokoll ermöglicht die

Fusion von bis zu mehreren hundert Kilobasenfragmenten. Wichtig dabei ist, dass die

Fragmentenden mindestens 16 bp lange homologe Sequenzen zum zu überlappenden

Fragment aufweisen (Gibson et al., 2009).

Es werden gleichzeitig drei verschiedene Enzyme eingesetzt: 5′ T5-Exonuklease, Phusion

DNA-Polymerase und Taq DNA-Ligase. Die Exonuklease erzeugt 3‘-Einzelstrangüberhänge

und erleichtert so das Annealing komplementärer Fragmente. Die Polymerase füllt Lücken

innerhalb der überlappenden Regionen mit Desoxy-Nukleosidtriphosphaten (dNTPs) auf.

Schließlich verbindet die Ligase die vereinigten DNA-Fragmente.

Alle Reaktionsbestandteile (Exonuklease, Polymerase, Ligase, DNA-Fragmente, Puffer,

ddH2O) werden in einem Thermocycler bei 50 °C für 15 Minuten inkubiert. Nun schließt sich

eine gewöhnliche Transformation an. Eine Reinigung des Reaktionsansatzes ist nicht nötig.

Dazu werden chemisch kompetente Zellen (One Shot E. coli DH5α, Invitrogen) auf Eis

langsam aufgetaut und 1 µl des Reaktionsansatzes unter vorsichtigem Mischen hinzugefügt.

30

Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis erfolgt ein kurzer Hitzeschock der Proben bei 42 °C für

30 Sekunden. Zur Regeneration wird nun auf 37 °C erwärmtes S.O.C.-Medium (350 µl pro

Reaktionsgefäß) zugegeben und bei 37 °C für eine weitere Stunde unter konstanter Rotation

inkubiert. 150 µl der Zellsuspension werden schließlich auf angewärmten LB-Platten mit

geeignetem Antibiotikum (Kanamycin) ausgestrichen. Über Nacht werden die Platten in

einem Brutschrank bei 37 °C aufbewahrt und gewachsene Klone am darauf folgenden Tag auf

das Vorhandensein der gewünschten Fragmente mithilfe einer PCR untersucht. Auch hier

wurde ähnlich der SW102-Klonierungsstrategie eine zusätzliche Antibiotikaresistenzkassette

in das Konstrukt des BAI2 eingebaut.

3.4 Zellkultur und Transfektion

Die Zelllinie COS-7 besteht aus Simian Vacuolating Virus 40 (SV40)-immortalisierten

Nierenzellen der äthiopischen Grünmeerkatze Cercopithecus aethiops. Die Zellen werden in

Dulbecco's Modified Eagle´s Medium (DMEM) inklusive 10 % fetalem Rinderserum (FBS),

100 units/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 unter gesättigter

Luftfeuchtigkeit kultiviert. Für funktionelle Untersuchungen werden die Zellen in 6-Well-

(3x106 Zellen/Well), 12-Well- (1x105 Zellen/Well) und 48-Well-Platten (3×104 Zellen/Well)

oder in 25-cm²-Zellkulturflaschen (7x106 Zellen) ausgesetzt. Dazu wird der Zellrasen mit PBS

gewaschen und durch Inkubation mit Trypsin/EDTA für zwei Minuten bei 37 °C abgelöst. In

einer Neubauer-Zählkammer wird die Anzahl der vereinzelten Zellen bestimmt.

Am darauf folgenden Tag wird bei 80-90 % Konfluenz des Zellrasens in den Wells eine

transiente Transfektion der Rezeptorkonstrukte mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley,

UK) laut Herstellerprotokoll vorgenommen. Dafür setzt man für den cAMP-Assay 100-

600 ng, für die PI-Assay 500-1500 ng, für den Oberflächen-ELISA 300 ng bzw. 1000 ng des

DNA-Rezeptorkonstrukts im Sandwich-ELISA pro Well ein. Für die Transfektion kommt ein

speziell dafür entwickeltes Minimalmedium Opti-MEM (Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland) zum Einsatz. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wird in jedem Assay

zusätzlich ein GFP-Expressionsplasmid mitgeführt, sodass dessen Expression nach 24

Stunden durch grün-fluoreszierende COS-7-Zellen im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen

werden kann.

31

3.4.1 Messung der cAMP-Akkumulation mittels AlphaScreen-Technologie

GPCR, welche eine Interaktion mit der Gαs-Untereinheit von G-Proteinen eingehen, führen

zur Aktivierung der Adenylylcyclase und vermitteln somit eine intrazelluläre Steigerung des

cAMP-Spiegels. Zur Bestimmung des cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Gehalts

werden die Zellen in Wells 48 Stunden nach erfolgter Transfektion mit 1 mM 3-Isobutyl-1-

Methylxanthin (IBMX)-versetztem DMEM zuerst gewaschen und anschließend für 60

Minuten inkubiert. IBMX ist ein kompetitiver, nicht-selektiver Inhibitor von

Phosphodiesterasen. Durch Blockierung des endogenen Abbauweges von cAMP führt der

Einsatz von IBMX schließlich zur intrazellulären cAMP-Akkumulation. Wird zusätzlich

während dieser Inkubationsperiode mit 10 µM Forskolin stimuliert, steigt die cAMP-

Konzentration erheblich an (Positivkontrolle). Forskolin aktiviert nicht-selektiv

Adenylylcyclasen, welche die cAMP-Generation aus ATP katalysieren. Nach der erwähnten

Inkubation wird das IBMX-Medium gründlich auf Eis abgesaugt und jedes Well mit 50 µl

gekühltem LI-Lysepuffer (5 mM 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-Ethansulfonsäure

(HEPES), pH 7.6, 0,3 % Tween-20, 0,1 % BSA, 1 mM IBMX) versetzt. Die Zellkulturplatten

werden nun für mindestens 30 Minuten bei -20 °C eingefroren, bevor für die Messung der

cAMP-Konzentration jeweils 5 µl des Lysats in eine spezielle 384-Well-Platte (White

Opaque, PerkinElmer) übertragen werden. Eine Standardmessreihe mit definierten cAMP-

Konzentrationen ist dabei mitzuführen.

Die AlphaScreen-Methode (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,

PerkinElmer, Rodgau, Deutschland) setzt zwei verschiedene Antikörper-gekoppelte beads

ein: Der Akzeptor-bead bindet im Zelllysat vorhandenes cAMP. Der anschließend dazu

gegebene Donor-bead enthält bereits Streptavidin-gebundenes biotinyliertes cAMP und kann

darüber nur mit freien Akzeptor-beads interagieren, deren Antikörper nicht mit cAMP aus

dem Zelllysat besetzt sind. Eine solche Interaktion, die von Donor- und Akzeptor-beads

eingegangen wird, kann in der Messung im Fusion™ α-FP (PerkinElmer, Rodgau,

Deutschland) detektiert werden. Dazu wird der Donor-bead durch Licht einer Wellenlänge

von 680 nm angeregt. Es kommt nur dann zum Energietransfer in Form von Singulett-

Sauerstoff (*O2) zwischen Donor und Akzeptor, wenn diese räumliche Nähe aufweisen, also

eine Assoziation eingegangen sind. Ein durch den Donor- angeregter Akzeptor-bead emittiert

nun grünes Licht, das bei 520 nm gemessen wird.

Ein Zelllysat ohne cAMP erzeugt dementsprechend maximal hohe Emissionswerte, weil alle

Akzeptor-beads frei von den Donor-beads gebunden werden können und so einen hohen

32

Energietransfer zulassen. Dagegen sprechen niedrige Punktwerte im AlphaScreen für eine

hohe endogene Konzentration an cAMP.

3.4.2 Inositolphosphat–Akkumulationsassay

GPCR, welche eine Interaktion mit der Gαq-Untereinheit von G-Proteinen eingehen, führen

zur Aktivierung der Phospholipase Cß und vermitteln somit eine intrazelluläre Steigerung der

Diacylglycerol (DAG)- und Inositoltriphosphat (IP3)-Spiegel. Dies erfolgt durch die

Hydrolyse von Zellmembran-gebundenem Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2).

Inkubiert man nun die transfizierten Zellen mit 3H-markiertem myo-Inositol über Nacht, wird

dies in Form von PIP2 in die Zellmembran eingelagert. Auch in diesem Assay wird zur

Bestimmung der second messenger-Konzentration deren intrazellulärer Abbau blockiert. In

diesem Fall hemmt Lithium Inositolmonophosphatasen (IMPase) und führt dabei zur

Akkumulation von 3H-markierten Inositoltriphosphaten (IP, im Wesentlichen IP1), wenn der

zu untersuchende Rezeptor den Gq-Signalweg aktiviert. Durch Co-Transfektion mit dem

chimären G-Protein Gqi4, bei welchem die vier C-terminalen Aminosäuren von Gq durch die

korrespondierenden von Gi ersetzt sind, können in diesem Experiment auch endogene Gi-

Koppler detektiert werden. Das chimäre G-Protein Gqi4 leitet dann Aktivität anstelle des Gi-

Signalwegs auf die Phospholipase Cß und IP3 um. Nach dem Zellaufschluss erfolgt die

Messung von IP mittels sequenzieller Ionenaustauschchromographie (Berridge, 1983).

Am Tag nach der Transfektion werden konkret 2 µCi/ml myo-3H-Inositol in DMEM für eine

mindestens 16-stündige Inkubation eingesetzt. Dem schließt sich ein Waschschritt und eine

Inkubation für eine Stunde mit 1 mM LiCl bei 37 °C im Zellkulturschrank an. Sollen

potentielle Liganden getestet werden, können diese dem Lithiumchlorid in diesem Schritt

zugefügt werden. Als Positivkontrollen für diesen Assay werden der muskarinische

Acetylcholinrezeptor M3, ein bekannter Gq-Koppler mit 10 µM Carbachol stimuliert, bzw. der

purinerge P2Y12 Rezeptor, als bekannter Gi-Koppler mit 10 µM MeS-ADP stimuliert,

eingesetzt. Nachdem die Stimulationslösung abgesaugt ist, werden zur Lyse nun 300 µl 0,1 M

NaOH, 100 µl 0,2 M Ameisensäure und 2 ml Verdünnungspuffer (5 mM Natriumborat, 0,5

mM EDTA) auf die Zellen pipettiert. Die Lysate werden dann (ohne Zelldetritus) auf die

Dowexsäulen (AG1 X8, 2 g/Säule, Säulendurchmesser 8 mm) überführt und mittels 5 ml

Elutionspuffer (0,2 M Ammoniumformiat, 0,1 M Ameisensäure) in Szintillationsgefäße mit

15 ml LumaSafe Plus (PerkinElmer) eluiert. Die Messung der darin enthaltenen

33

Radioaktivität wird mit einem ß-Counter (Beckmann) durchgeführt. Vor und nach jedem

Experiment sind die Dowexsäulen zu wässern und zu regenerieren (3 M Ammoniumformiat,

0,25 M Ameisensäure).

3.4.3 Oberflächen-ELISA

GPCR sind Transmembranproteine. Um den Anteil der Rezeptoren zu bestimmen, die

tatsächlich an die Plasmamembran transportiert worden sind, wird in diesem Enzyme-linked

Immunosorbent Assay (ELISA) der N-terminal eingefügte HA-tag detektiert.

Dazu werden 48 Stunden nach Transfektion die Zellen mit 4 % Formaldehyd in PBS für 20

Minuten fixiert und nach dreimaligem Waschen mit PBS schließlich mit FBS-haltigem

DMEM blockiert. Die Blockierung beugt unspezifischen Antikörperbindungen vor und

erfolgt unter leichten Schwenkbewegungen bei 37 °C für eine Stunde. Nach weiteren drei

Waschschritten mit PBS werden die Proben mit Peroxidase-gekoppeltem monoklonalen Anti-

HA-Antikörper (3F10, Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland, 1:1000 verdünnt in

Blockierungslösung) inkubiert. Da die Zellen in diesem Assay nicht lysiert werden, kann der

Antikörper nur an Rezeptoren binden, deren HA-tag nach extrazellulär weist, somit

ausschließlich an in der äußeren Zellmembran lokalisierte GPCR. In Anwesenheit von H2O2

katalysiert die Peroxidase die Oxidation des nahezu farblosen o-Phenylendiamin (OPD) in ein

orange-gelbes Produkt mit einem Absorptionsmaximum bei 420 nm Wellenlänge. Daher wird

zur Detektion (nach drei erneuten Waschschritten) 200 µl des Substratpuffers (0,1 M

Zitronensäuremonohydrat, 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 5 versetzt mit 10 mg OPD

und 40 µl H2O2) auf die Zellen gegeben und nach 2 bis 20 Minuten mit 50 µl 1 M HCl die

Reaktion beendet. Der Farbumschlag wird bichromatisch bei 492 und 620 nm in einem

Mikrotiterplattenlesegerät (Sunrise, Tecan Group Ltd, Crailsheim, Deutschland) ermittelt. Je

höher die Absorptionswerte einer Probe ausfallen, desto mehr HA-markierter Rezeptor

befindet sich in der Zellmembran.

3.4.4 Sandwich-ELISA

Werden für einen Rezeptor nur niedrige Absorptionswerte im Oberflächen-ELISA

festgestellt, so kann dies verschiedene Ursachen haben. Es ist z.B. denkbar, dass der

34

intrazelluläre Transport eines Rezeptors gestört ist und der Rezeptor in einem

Zellkompartiment retiniert wird oder aber auch, dass dies in einer unzureichenden

Produktionsmenge des Rezeptors per se begründet liegt. Der Sandwich-ELISA weist nun die

basale Produktionsrate eines Rezeptors nach, unabhängig davon, in welchem Zellbestandteil

konkret der Rezeptor lokalisiert ist.

Hierfür werden die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion mit Versene (0,5 mM EDTA in

PBS) von den Zellkulturplatten abgelöst und in Reaktionsgefäße, gefüllt mit 500 µl PBS,

überführt. Nach Zentrifugation bei 13000 rpm für fünf Minuten wird das Zellpellet lysiert (10

mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,2 mM Natriumdesoxycholat, 1 %

NP-40) und über Nacht in einem Überkopfschüttler bei 4 °C konstant rotiert. Weiterhin

werden NUNC MaxiSorp-Platten (Thermo Scientific) mit monoklonalem Anti-FLAG-

Antikörper (M2, Sigma-Aldrich, München, Deutschland, 1:100 in Coating-Puffer (0,15 mM

Natriumtetraborat, pH 8)) beschichtet.

Am darauf folgenden Tag werden die Reaktionsgefäße erneut bei 13000 rpm für 10 Minuten

zentrifugiert und schließlich der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß mit 300 µl PBS-T

übertragen. Das darin enthaltene Triton X-100 als ungeladenes neutrales Detergens

permeabilisiert die Zellmembran, denaturiert Proteine dagegen nur schwach. Auf die

abgesaugte und mit PBS-T gewaschene MaxiSorp-Platte wird eine Blockierungslösung

bestehend aus 10 %igem FBS in DMEM gegeben und diese für eine Stunde bei 37 °C im

Schüttelschrank inkubiert. Nach weiteren drei Waschschritten mit PBS-T werden nun die

Zelllysatproben jeweils in Dreifachbestimmung in Wells der Mitrotiterplatte pipettiert.

Während der nun erfolgenden Inkubation interagiert der an die MaxiSorp-Platte gebundene

M2-Antikörper mit seinen Fab-Anteilen (antigen-binding fragment) mit dem C-terminalen

FLAG-tag des Rezeptors. Es folgen drei weitere Waschschritte und eine Inkubation mit

Peroxidase-gekoppeltem monoklonalen Anti-HA-Antikörper (3F10, Roche Applied Science,

Mannheim, Deutschland, 1:1000 in PBS-T) für eine Stunde. Auch in diesem Assay sorgt die

Peroxidase für einen orange-gelben Farbumschlag bei Zugabe des Substratpuffers mit OPD.

Absorptionsmesswerte ermittelt man bichromatisch bei 492 und 620 nm (Sunrise, Tecan

Group Ltd, Crailsheim, Deutschland).

35

3.4.5 Westernblot

Cleavage, die Spaltung des N-terminalen vom C-terminalen Fragment, ist als bedeutsames

Charakteristikum der aGPCR-Familie beschrieben und wird nach wie vor kontrovers

diskutiert. Um für die untersuchten Rezeptoren eine Aussage über diese autoproteolytische

Spaltung treffen zu können, wurden Zelllysate angefertigt und mittels HA-tag versucht, N-

terminale Rezeptorteilbereiche im Westernblot zu detektieren.

Zwei Tage nach der Transfektion werden dazu COS-7-Zellen mit 4 °C kaltem PBS

gewaschen und 200 µl RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid, 1 % Triton X-100, 0,5 %

Natriumdeoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulphat, 50 mM Tris, pH 8,0 inklusive

Proteaseinhibitoren (cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche)) in die

Zellkulturflasche zugefügt. Mithilfe eines Zellschabers (Greiner Bio One) können die Zellen

abgelöst und in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt werden. Nach 30-minütiger

Rotation bei 4 °C wird die Zellsuspension bei 13000 rpm zentrifugiert und der Überstand in

ein neues Reaktionsgefäß aufgenommen. Äquimolare Probenmengen werden durch eine

10 %ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) dem Molekulargewicht gemäß

aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran (GE Healthcare Amersham

Hybond ECL, München, Deutschland) mittels Westernblot übertragen (BioRad Mini-Protean

II Cell, BioRad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell). Als Referenz wird ein

Proteingrößenmarker mitgeführt (Thermo Scientific PageRuler Unstained Protein Ladder).

Anschließend erfolgt eine Inkubation für eine Stunde bei 20 °C in 5 % Magermilch-PBS

inklusive 0,05 % Tween 20, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Über Nacht bei 4 °C

reiht sich eine weitere Inkubation mit monoklonalem Ratten-Anti-HA-Peroxidase

gekoppelten Antikörper (Roche 3F10, 1:1000 in PBS-0,05 % Tween 20) an. Die Membran

wird nachfolgend mehrfach mit PBS-0,05 % Tween 20 gewaschen, um sie mit SuperSignal

West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Thermo Scientific) zu inkubieren. Identische

zelluläre Expressionslevel bestätigt man durch Färbung mit monoklonalem Kaninchen-Anti-

ß-Aktin-Antikörper (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland).

3.4.6 Immunfluoreszenz

COS-7-Zellen werden auf Coverslips (Thermo Scientific, Cover Glasses, Ø 12mm) ausgesetzt

und am zweiten Tag nach Transfektion mit PBS gewaschen, um anschließend bei

36

Raumtemperatur mit 4 % Formaldehyd in PBS für 30 Minuten fixiert zu werden.

Anschließend werden die Zellen mehrfach für fünf Minuten mit PBS und Zusatz von 0,05 %

Triton X-100 gewaschen und permeabilisiert. Es folgt eine einstündige Blockierung mit 10 %

FBS-haltigem DMEM bei 37 °C. Nach drei Waschschritten für jeweils fünf Minuten mit

PBS-0,05 % Triton X-100 (PBS-T) schließt sich die Inkubation mit primärem monoklonalen

Maus-Anti-FLAG-M2-Antikörper (1:100 in Blockierungsmedium, Sigma-Aldrich F9291) für

eine Stunde bei Raumtemperatur an. Die mehrfach gewaschenen Zellen werden dann mit

sekundärem TRITC markierten Maus-Anti-IgG-Antikörper (1:1000 in Blockierungsmedium,

Sigma T2402) für eine weitere Stunde bei 20 °C inkubiert. Erneutem Waschen der Coverslips

reiht sich eine Zellkernfärbung mit DAPI (1:1000 in PBS) an. Schließlich können die

Glaszellträger mithilfe von Fluoromount (Sigma Aldrich F4680) mit Deckgläschen versehen

und lichtgeschützt getrocknet werden. Diese Methode ermöglicht, die genaue Lokalisation

eines Rezeptors in Zellorganellen mit einem konfokalen Mikroskop (LSM 510, Zeiss,

Germany) festzustellen und kann eingesetzt werden, wenn Oberflächen- und Sandwich-

ELISA Hinweise auf eine inkorrekte Rezeptorprozessierung geben.

3.5 Peptidsynthese

Die getesteten Peptide wurden durch die Core Unit Peptid-Technologien (Interdisziplinäres

Zentrum für Klinische Forschung (IZKF), Universität Leipzig) mit dem automatischen

Peptidgenerator MultiPep (Intavis AG, Köln, Deutschland) nach dem zugrunde liegenden

Prinzip der Festphasen-Peptidsynthese (Merrifield RB) und unter Verwendung von

Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppen (Fmoc) hergestellt. Die Fmoc-Gruppen werden

von der finalen Seitenkette mittels eines Gemisches aus Trifluoressigsäure, H2O und

Benzylmercaptan (95:2,5:2,5 Vol %) entfernt (Entschützung) und die Peptide von einem

soliden Träger abgespalten. Die Peptide werden auf >95 % Reinheit durch eine

Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie RP-HPLC (Shimadzu LC-8,

Duisburg, Deutschland) mittels einer PLRP-S Säule (300x25mm, Agilent, Waldbronn,

Deutschland) purifiziert. Sowohl für den analytischen als auch präparativen Gebrauch werden

als mobile Phase H2O und Acetonitril inklusive 0,1 % Trifluoressigsäure eingesetzt. Durch

einen linearen Gradienten von 5 % bis zu 90 % Acetonitril können die Proben in 30 Minuten

(eines analytischen Zyklus) beziehungsweise in 90 Minuten (eines präparativen Zyklus)

eluiert werden. Abschließend werden alle Peptide durch eine analytische HPLC (Agilent

37

1100) und Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Massenspektrometrie MALDI-MS

(Bruker Microflex LT, Bremen, Deutschland) charakterisiert.

3.6 Statistische Auswertung

Funktionelle Daten sind als arithmetisches Mittel mit jeweiligem Standardfehler angegeben

und wurden in drei unabhängigen Experimenten jeweils in Triplikaten erhoben. Analyse und

graphische Darstellung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,

Inc., La Jolla, USA). Dazu wurde eine einseitige ANOVA (Analysis of Variance) in

Kombination mit einer Bonferroni-Korrektur als post-hoc Test eingesetzt (*p<0,05, **p<0,01,

***p<0,001).

Speziell für die Wildtypen-Charakterisierung wurden Effekte steigender Rezeptor-

konzentrationen mittels eines einfachen linearen Regressionsmodels hinsichtlich Signifikanz

untersucht (R, Version 3.0.1). Der daraus resultierende p-Wert (probability,

Wahrscheinlichkeit) wird als signifikant (*p<0,05), sehr signifikant (**p<0,01) und hoch

signifikant (***p<0,001) eingeordnet. Rezeptoren, welche keine Signifikanz in der linearen

Regression aufwiesen, wurden in einem zweiten Schritt in einem Einstichproben-t-Test der

niedrigsten getesteten Konzentration überprüft (cAMP-Assay 100 ng/Well, PI-Assay 500

ng/Well). So konnte sichergestellt werden, dass auch Rezeptoren mit

konzentrationsunabhängigem Signalplateau als signifikant detektiert werden (°P<0,05,

°°P<0,01, °°°P<0,001).

38

4 Ergebnisse

4.1 Aktivierung der aGPCR durch Deletion der ECD

Es ist bereits bekannt, dass einige aGPCR-Vertreter wie der GPR56, BAI1 und BAI2 durch

die Abspaltung des N-Terminus an der cleavage site der GPS in ihrer Rezeptorfunktion

aktiviert werden (Okajima et al., 2010; Paavola et al., 2011; Stephenson et al., 2013). Um die

Frage nach einer generellen Übertragbarkeit dieser Erkenntnis nachzugehen, wurden auch für

den GPR126 und GPR133 die extrazellulären Domänen (ECD) an ihrer natürlich

vorkommenden GPS-Spaltstelle trunkiert und im cAMP-Assay untersucht. Da für beide

Wildtyp-Rezeptoren bereits eine Gαs-Kopplung mit einer konzentrationsabhängigen cAMP-

Akkumulation demonstriert werden konnte (Bohnekamp and Schöneberg, 2011; Mogha et al.,

2013), deuten nun Veränderungen des cAMP-Levels im Vergleich zum WT auf eine

modifizierte Signaltransduktion durch die spezifische Mutation hin. Die beiden Konstrukte

CTF(GPR126) und CTF(GPR133) beinhalten neben dem jeweiligen Signalpeptid nur den C-

terminalen Bereich der GPS, 7TM und den C-Terminus des Rezeptors (Abb. 4A). Wie

erwartet wiesen die CTF-Mutanten signifikant gesteigerte cAMP-Signalwerte in Bezug zum

jeweiligen WT-Rezeptor auf und waren somit konform mit Vorergebnissen anderer

Arbeitsgruppen. Überraschend war jedoch, dass CTF(GPR126) und CTF(GPR133) im ELISA

nur in geringem Maße an der Zellmembranoberfläche detektiert werden konnten (Abb. 4F).

Um jedoch eine entsprechende Detektion der Oberflächenexpression zu gewährleisten, wurde

der N-Terminus des P2Y12 den CTF-Konstrukten vorangestellt (Abb. 4B). Der P2Y12 gehört

zu den purinergen GPCR und ist als Chemorezeptor für Adenosindiphosphat (ADP) bekannt

(Hollopeter et al., 2001). Durch diese Substitution - als P2Y12-CTF(GPR126) und P2Y12-

CTF(GPR133) bezeichnet - gelang es, bei erhaltener Oberflächenexpression des Rezeptors bis

zu sechsfach gesteigerte cAMP-Level im Vergleich zum WT zu messen.

39

CTF P2Y12-CTF ΔGPS-CTF P2Y12-ΔGPS-CTF

Abb. 4 Einfluss des CTF auf die Basalaktivität des GPR126 und GPR133

A) Im CTF-Konstrukt ist der N-Terminus bis auf den C-terminalen Bereich der GPS deletiert. B) Im P2Y12-

CTF–Konstrukt ist der N-Terminus des P2Y12 an das Spaltungsmotiv der GPS angefügt. C) Deletion des

aGPCR-N-Terminus inklusive GPS-Domäne. D) Der N-Terminus des P2Y12 ist dem ΔGPS-CTF-Konstrukt

vorangestellt. Roter Halbkreis: C-terminaler Teil der GPS nach der cleavage site, Gelbes Dreieck: Signalpeptid,

Gelbe Quadrate: N-terminales HA-tag und C-terminales FLAG-tag, Hellgraue Linie: N-Terminus des P2Y12

E) COS-7-Zellen wurden mit jeweils 500 ng/Well Plasmid-DNA transfiziert und bezüglich cAMP-

Akkumulation getestet. Ergebnisse im cAMP-Assay sind in % des jeweiligen Wildtyp-Rezeptors angegeben,

wobei der leere pcDps-Vektor als Negativkontrolle mit cAMP-Spiegel von 3,68 ± 2,54 nM/Well diente. F) COS-

7-Zellen wurden mit jeweils 300 ng/Well Plasmid-DNA transfiziert und anschließend im ELISA getestet. Im

Oberflächen-ELISA ist die spezifische optische Dichte (OD) zur Referenz des P2Y12 in % dargestellt.

Angegeben sind das arithmetische Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten

(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

wt

CT

F

P2Y

12 -

CT

F

G

PS

-CT

F

P2Y

12 -G

PS

-CT

F wt

CT

F

P2Y

12 -C

TF

G

PS

-CT

F

P2Y

12 -G

PS

-CT

F

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

*

***

***

G P R 1 26 G P R 1 33

cA

MP

ac

cu

mu

lati

on

[% o

f w

t]

***

wt

CT

F

P2Y

12 -

CT

F

G

PS

-CT

F

P2Y

12 -

GP

S-C

TF w

t

CT

F

P2Y

12 -

CT

F

G

PS

-CT

F

P2Y

12 -

GP

S-C

TF

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

G P R 1 26 G P R 1 33

Ce

ll s

urf

ac

e

ex

pre

ss

ion

[%

of

pC

]

D C B A

cAM

P A

kkum

ula

tion

[% d

es W

T]

Ober

fläc

hen

expre

ssio

n

[% d

er P

K]

E F

40

4.2 Identifizierung potentiell agonistischer Strukturen im N-Terminus

Interessanterweise reduzierte sich die Signaltransduktion im cAMP-Spiegel erheblich, wenn

nicht nur der N-terminale Bereich der GPS, sondern die gesamte Domäne deletiert wurde. Im

Vergleich zum jeweiligen WT erzeugten ΔGPS-CTF–Konstrukte nur 39 % (GPR126)

beziehungsweise 5 % (GPR133) der Signalintensität im cAMP-Assay (Abb. 4E). Während

also durch Deletion des N-Terminus bis zur cleavage site der GPS die Rezeptorfunktion

signifikant gesteigert werden konnte, reduzierte sich das cAMP-Signal durch Deletion der

nachfolgenden Aminosäuren der GPS nach der Spaltungsstelle. Auch chimäre Konstrukte mit

dem P2Y12-N-Terminus (vgl. P2Y12-ΔGPS-CTF in Abb. 4D) konnten trotz nachgewiesener

Oberflächenexpression die cAMP-Akkumulation in diesem Fall nicht retten.

Die Ergebnisse der Konstrukte ΔGPS-CTF(GPR126) und ΔGPS-CTF(GPR133) deuteten

dabei auf eine entscheidende Rolle der C-terminalen GPS bei der Signaltransduktion hin. An

dieser Stelle konnte bereits ein wichtiger Hinweis zur Beantwortung der Frage des aGPCR-

Aktivierungsmechanismus abgeleitet werden. Würde der N-Terminus des GPR126 und

GPR133 tatsächlich einen inversen gebundenen Agonist enthalten, so hätten auch für die

ΔGPS-CTF-Varianten signifikant erhöhte cAMP-Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp

detektiert werden müssen. Die Ergebnisse der beiden aGPCR sprachen demnach vermehrt für

das Postulat eines gebundenen Agonisten im N-Terminus, der sich im C-terminalen Bereich

der GPS vermuten ließ.

Um den mutmaßlichen Agonist näher lokalisieren zu können, wurde mithilfe ortsgerichteter

Mutagenesestudien nachfolgend jede Aminosäure beginnend an der cleavage-Stelle der GPS

deletiert (Abb. 5). Auch für diese Untersuchung war es zur Sicherung der

Oberflächenexpression notwendig, chimäre Konstrukte mit dem P2Y12-N-Terminus zu

verwenden. Abbildung 6 zeigt, dass für den GPR126 nur die erste Aminosäure (+1, Thr813) C-

terminal der Spaltungsstelle nicht notwendig für die Rezeptoraktivierung zu sein scheint. Es

muss jedoch beachtet werden, dass durch Deletion des Thr813 die letzte C-terminale

Aminosäure des P2Y12-N-Terminus an Position +1 der cleavage site rückte. Demnach

entsprach diese Mutation eher einer Substitution zu einem Glutamin. Alle sich anschließenden

Aminosäuren ab +2 zogen durch ihre Deletion radikal verminderte Signaltransduktionslevel

nach sich. Es konnte damit vermutet werden, dass mindestens die Sequenz ab Position +2

His814 essentiell für die Basalaktivität des GPR126 ist.

41

Abb. 6 Sequentielle Aminosäure-Deletion in der GPS des GPR126

Zur Darstellung kommen auf der linken Seite die Ergebnisse der cAMP-Akkumulationsmessung (Transfektion

mit 500 ng/Well). Es ist ersichtlich, dass die Deletion des Thr813 mit einer zusätzlichen Signalsteigerung

verbunden ist, während alle sich anschließenden Aminosäuredeletionen die Rezeptorbasalaktivität auslöschen

(jeweils angegeben als % des WT GPR126). Auf der rechten Seite sind die Ergebnisse im Oberflächen- und

Sandwich-ELISA als OD zur Referenz des P2Y12 aufgezeigt. Angegeben sind das arithmetische Mittel ±

Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Um einen Effekt der Verkürzung der Aminosäuresequenz per se auszuschließen, wurden die

hoch konservierten Aminosäuren der GPS systematisch durch Alanin ersetzt (sogenannter

Alaninscan). Da ein Austausch einer funktionell oder strukturell essentiellen Aminosäure

gegen Alanin meist einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge hat, können mit dieser

wt

P2Y

12 -C

TF

P2Y

12 -C

TF

-T

P2Y

12 -C

TF -TH

P2Y

12 -C

TF -TH

F

P2Y

12 -C

TF -TH

FG

P2Y

12 -C

TF -TH

FG

V

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

cA

MP

ac

cu

mu

lati

on

[% o

f w

t]

***

***

wt

P2Y

12 -C

TF

P2Y

12 -C

TF -T

P2Y

12 -C

TF -TH

P2Y

12 -C

TF -TH

F

P2Y

12 -C

TF -TH

FG

P2Y

12 -C

TF -TH

FG

V

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ex

pre

ss

ion

[%

of

pC

]

c e ll s u r fa c e E L IS A

w h o le c e ll E L IS A

Abb. 5 Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz

in der GPS des GPR126 und GPR133

Roter Halbkreis: C-terminaler Teil der GPS nach der

cleavage site

Gelbes Dreieck: Signalpeptid

Gelbe Quadrate: N-terminales HA-tag und C-terminales

FLAG-tag

cAM

P A

kkum

ula

tion

[% d

es W

T]

Oberflächen-ELISA

Sandwich-ELISA

Expre

ssio

n

[% d

es W

T]

42

Methode die für die Rezeptorfunktion notwendigen Aminosäuren identifiziert werden

(Morrison and Weiss, 2001). Ersetzte man Position +1, Thr813 des GPR126 durch Alanin, als

P2Y12-CTF T813A bezeichnet, erhielt man eine gesteigerte Basalaktivität, während die

Position +3, +6 oder +7 die Signalaktivität des Rezeptors auslöschten (Abb. 7). Eine

Aminosäuresubstitution an Position +10 dagegen besaß für beide untersuchten aGPCR keinen

Einfluss auf die Signaltransduktion. Alle untersuchten Rezeptormutanten wurden dank P2Y12-

N-Terminus an die Zellmembran transportiert, meist in geringerem Maße als der jeweilige

WT. Die erhöhten Basalaktivitäten einzelner Mutationen waren daher nicht auf eine

gesteigerte Zellmembranexpression zurückzuführen. Dies verdeutlicht, dass es sich hier

tatsächlich um konstitutiv aktive Rezeptorvarianten handelte.

Abb. 7 Alaninscan innerhalb der GPS des GPR126 und GPR133 durch ortsgerichtete Mutagenese

Dargestellt sind sowohl das cAMP second messenger-Signal im Vergleich zum WT als auch die

Oberflächenexpression als OD im Vergleich zur P2Y12-Expression in COS-7. Angegeben sind das arithmetische

Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten (*p<0,05, **p<0.01, ***p<0,001).

4.3 Aktivierung des GPR126 und GPR133 durch ein gebundenes Peptid

Um die vermutete agonistische Struktur innerhalb der GPS von aGPCR nachzuweisen,

wurden synthetisierte Peptide analog der Aminosäuresequenz des GPR126 und GPR133 auf

ihren Effekt für die P2Y12-ΔGPS-CTF-Konstrukte getestet. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und

P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) besaßen jeweils bis auf eine kleine Spacer-Region zwischen

GPS und TM1 keine endogenen Sequenzabschnitte der ECD (Abb. 4D), wurden jedoch an

der Zellmembran exprimiert.

wt

P2Y

12 -C

TF

P2Y

12 -C

TF -T813 A

P2Y

12 -C

TF -H

814 A

P2Y

12 -C

TF -F815 A

P2Y

12 -C

TF -L818 A

P2Y

12 -C

TF -M

819 A

P2Y

12 -C

TF -P822 A

w

t

P2Y

12 -C

TF

P2Y

12 -C

TF -T545 A

P2Y

12 -C

TF -N

546 A

P2Y

12 -C

TF -F547 A

P2Y

12 -C

TF -L550 A

P2Y

12 -C

TF -M

551 A

P2Y

12 -C

TF -V554 A

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ce

ll s

urfa

ce

ex

pre

ss

ion

[%

of

pC

]

G P R 1 2 6 G P R 1 3 3

cAM

P A

kkum

ula

tion

[% d

es W

T]

Ober

fläc

hen

expre

ssio

n

[% d

er P

K]

43

Für den GPR126 wurden Peptide einer Länge von vier bis 19 Aminosäuren im cAMP-Assay

getestet. Die mit p4 bis p19 bezeichneten Peptide entsprachen der jeweils um eine

Aminosäure verlängerten Sequenz der GPS nach der cleavage site, beginnend mit THFG (p4).

Dazu wurden die mit jeweils 100 ng Plasmid-DNA transient transfizierten COS-7-Zellen für

60 Minuten mit 1 mM IBMX-DMEM inkubiert, welches zusätzlich 1 mM des entsprechenden

Peptids beinhaltete. Neben dem P2Y12-ΔGPS-CTF-Konstrukt wurde auch der leere

Säugetierexpressionsvektor pcDps mitgeführt, um unspezifische Nebeneffekte der Peptide auf

die Zellen detektieren zu können (Abb. 8). Alle Peptide wurden zuvor in 50 mM Tris, pH 8

und DMSO mit einer Endkonzentration von 1 % gelöst. Darin begründete sich folglich ein

äquivalenter Einsatz von Tris/DMSO zur IBMX-DMEM-Stimulationslösung für Kontrollen

dieses Experiments. Die stärkste Aktivierung konnte dabei mit dem Peptid p16 mit einer bis

zu 10,2-fachen cAMP-Steigerung im Vergleich zur Negativkontrolle pcDps erreicht werden.

Konzentrationsabhängige Testungen mit 10 µM bis 1000 µM des p16 zeigten auf, dass erst

mit relativ hohen Peptidkonzentrationen (EC50>100 µM) signifikante second messenger-

Steigerungen erreicht werden. p16 war dabei in der Lage, nicht nur das chimäre Konstrukt

P2Y12-ΔGPS-CTF (GPR126) sondern auch den Wildtyp-Rezeptor GPR126 zu aktivieren

(Abb. 9).

Abb. 8 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR126 mit agonistischen Peptiden

COS-7 wurden mit 100 ng pcDps bzw. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) transfiziert und mit 1 mM des jeweiligen

Peptids für 60 Minuten stimuliert. In der Grafik sind x-fache der cAMP-Akkumulation zur Negativkontrolle

angegeben. p16 zeigte hierbei die höchste stimulierende Potenz aller untersuchten Peptide. Dargestellt sind die

Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler

(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

0 4 812

16

p 1 6 - 1 : F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 6 - 2 : H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 6 - 3 : N H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 6 - 4 : C N H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 6 + 2 : F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 6 + 1 : H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 4 : T H F G _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 5 : T H F G V _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 6 : T H F G V L _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 7 : T H F G V L M _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 8 : T H F G V L M D _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 9 : T H F G V L M D L _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 1 0 : T H F G V L M D L P _ _ _ _ _ _ _ _ _

p 1 1 : T H F G V L M D L P R _ _ _ _ _ _ _ _

p 1 2 : T H F G V L M D L P R S _ _ _ _ _ _ _

p 1 3 : T H F G V L M D L P R S A _ _ _ _ _ _

p 1 4 : T H F G V L M D L P R S A S _ _ _ _ _

p 1 5 : T H F G V L M D L P R S A S Q _ _ _ _

p 1 6 : T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _

p 1 7 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D _ _

p 1 8 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D A _

p 1 9 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D A R

n o p e p t i d e

P 2 Y 1 2 -G P S -C T F

p c D p s

c A M P a c c u m u la tio n

[x - fo ld o v e r p c D p s ]

cAMP Akkumulation

[x-faches der NK]

kein Peptid

44

Weitere Variationen des p16-Peptids durch N-terminale Verkürzung (p16+1/p16+2) oder

durch Verlängerung (p16-1 bis p16-4) konnten keine zusätzlichen Signalsteigerungen erzielen

(Abb. 8). Stattdessen zeigte sich, dass die erste Aminosäure Thr813 des p16 essentiell für die

Signalaktivierung zu sein scheint, da sich durch Stimulation mit p16+1 die cAMP-

Akkumulation signifikant verhindern ließ. Im Gegensatz zum P2Y12-CTF T813A Konstrukt

stellte dieses Experiment eine tatsächliche Deletion der Thr813 dar und verdeutlichte den

enormen Einfluss des Threonins für die aktivierende Potenz des p16.

Vergleichsweise niedrige cAMP-Werte des p16-1 bis p16-4 unterstrichen, dass Aminosäuren

vor der cleavage site keinen Bestandteil des Agonisten darstellen.

Ein Alaninscan, bei dem alle spezifischen Aminosäuren des p16 systematisch durch Alanin

ersetzt wurden, untermauerte zusätzlich die durch Mutagenese generierten Vorergebnisse:

Während Substitutionen an Position +2 bis +7 das cAMP-Signal auslöschten, konnten die

Positionen +8 bis +16 ohne Signalbeeinträchtigung mit Alanin ersetzt werden (Abb. 10). Dass

die C-terminalen Aminosäuren trotzdem eine Beteiligung zur Funktion des p16 aufweisen,

zeigte sich darin, dass deren Deletion mit signifikantem Aktivitätsverlust des Peptids

einherging (vgl. Peptid p7 in Abb. 8). Auffällig war, dass alle getesteten GPR126-Peptide

auch in mit pcDps transfizierten COS-7-Zellen leichte cAMP-Akkumulationen auslösten.

Dies ließ sich durch eine endogene Expression des GPR126 in dieser Zelllinie erklären

(Abb. 11).

p16 Peptid, log [M]

cAM

P A

kku

mu

lati

on

[x-f

ach

es d

er N

K]

Abb. 9 Konzentrationsabhängige cAMP-

Akkumulation durch Stimulation mit p16

100 ng der Plasmid-DNA/Well wurden transfiziert und

mit 10 µM, 100 µM und 1 mM des p16 stimuliert.

Dargestellt sind die Ergebnisse als x-faches der

Negativkontrolle pcDps für den WT GPR126, für

P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und P2Y12. Ergebnisse

sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM

für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben.

45

Abb. 10 Alaninscan des p16 Peptids des GPR126

Darstellung des cAMP-Signals nach Stimulation mit 1 mM des angegebenen Peptids als x-faches der

Negativkontrolle pcDps. Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige

Assays in Triplikaten analysiert.

Um eine Aussage zur Allgemeingültigkeit dieser Ergebnisse treffen zu können, wurden

identische Experimente für den aGPCR GPR133 unternommen. Die höchsten

Stimulationsergebnisse erbrachten in diesem Fall 1 mM des p13 mit einer 5,2-fachen cAMP-

Steigerung mit Vergleich zur Negativkontrolle (Abb. 12). Im Gegensatz zum p16 des

GPR126 verursachte bereits eine Konzentration von 100 µM des p13 eine leichte cAMP-

Steigerung (Abb. 13), weshalb geschlussfolgert werden konnte, dass EC50(p13)<EC50(p16).

0 2 0 4 0 6 0

T H F G V L M D L P R S A S Q A

T H F G V L M D L P R S A S A L

T H F G V L M D L P R S A A Q L

T H F G V L M D L P R A A S Q L

T H F G V L M D L P A S A S Q L

T H F G V L M D L A R S A S Q L

T H F G V L M D A P R S A S Q L

T H F G V L M A L P R S A S Q L

T H F G V L A D L P R S A S Q L

T H F G V A M D L P R S A S Q L

T H F G A L M D L P R S A S Q L

T H F A V L M D L P R S A S Q L

T H A G V L M D L P R S A S Q L

T A F G V L M D L P R S A S Q L

A H F G V L M D L P R S A S Q L

T H F G V L M D L P R S A S Q L

n o p e p t i d e

p c D p s

P 2 Y 12 - G P S -C T F

c A M P a c c u m u la tio n

[x - fo ld o v e r p c D p s ]

kein Peptid

cAMP Akkumulation

[x-faches der NK]

Abb. 11 Endogene Expression des GPR126 in COS-7-

Zellen

Durch die Verwendung von Primern (Tab.S2), die an

konservierte Bereiche des GPR126 binden, konnten

Transkripte des GPR126 in cDNA von COS-7-Zellen

nachgewiesen werden. Die Detektion des housekeeping-Gens

ß-Aktin in der cDNA durch entsprechende Primer bzw. ohne

cDNA im selben PCR-Setup gelten als Positiv- und

Negativkontrollen.

46

Abb. 12 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR133 mit agonistischen Peptiden

COS-7-Zellen wurden mit 100 ng pcDps bzw. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) transfiziert und mit 1 mM des

jeweiligen Peptids für 60 Minuten stimuliert. In der Grafik sind x-fache der cAMP-Akkumulation zur

Negativkontrolle pcDps angegeben. p13 zeigte hierbei die höchste stimulierende Potenz aller untersuchten

Peptide. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches

Mittel ± Standardfehler.

Zur Überprüfung der Spezifität der eingesetzten Peptide wurden der Wildtyp GPR126 und das

Konstrukt P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) auch mit dem GPR133-Peptid p13 stimuliert, der WT

GPR133 und das Konstrukt P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) umgekehrt mit dem GPR126-Peptid

p16. Zusätzlich wurden die Peptide auf dem purinergen Rezeptor P2Y12 getestet (Abb. 14A).

Es konnte festgestellt werden, dass p16 spezifisch auf den GPR126 wirkt, p13 dagegen

spezifisch auf den GPR133. Zu erwähnen ist, dass es durch die Stimulation mit p16 zu

0 2 4 6 8

p4:TNFA_______________

p5:TNFAI______________

p6:TNFAIL_____________

p7:TNFAILM____________

p8:TNFAILMQ___________

p9:TNFAILMQV__________

p10:TNFAILMQVV_________

p11:TNFAILMQVVP________

p12:TNFAILMQVVPL_______

p13:TNFAILMQVVPLE______

p14:TNFAILMQVVPLEL_____

p15:TNFAILMQVVPLELA____

p16:TNFAILMQVVPLELAR___

p17:TNFAILMQVVPLELARG__

p18:TNFAILMQVVPLELARGH_

p19:TNFAILMQVVPLELARGHQ

no peptide

P2Y12-GPS-CTF

pcDps

cAMP accumulation[x-fold over pcDps]

cAMP Akkumulation

[x-faches der NK]

p13 Peptid, log [M]

cAM

P A

kku

mu

lati

on

[x-f

aches

der

NK

] kein Peptid

Abb. 13 Konzentrationsabhängige cAMP-

Akkumulation durch Stimulation mit p13

100 ng der Plasmid-DNA/Well wurden transfiziert und

mit 10 µM, 100 µM und 1 mM des p13 stimuliert.

Dargestellt sind die Ergebnisse als x-faches der

Negativkontrolle pcDps für den WT GPR133, für

P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und P2Y12. Ergebnisse

sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM

für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben.

47

leichten cAMP-Akkumulationen auf mit GPR133 und P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133)

transzifierten COS-7-Zellen gekommen ist. Dies war durch die endogene Expression des

GPR126 in COS-7-Zellen zu erklären (Abb. 11). Experimente mit HEK 293-T-Zellen, welche

den GPR126 nicht exprimieren, bestätigten diese Vermutung (Abb. 14B). Durch dieses

Experiment wurde deutlich, dass p16 spezifisch auf den WT GPR126 und dessen

Rezeptormutante P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) wirkt. Der GPR133 wurde durch p16 nicht

aktiviert.

pcD

ps

P2Y

12

P2Y

12-

GP

S-C

TF

wt

P2Y

12-

GP

S-C

TF

wt

0

1 0

2 0

3 0

4 0

- p 1 6 p e p t id e

+ p 1 6 p e p tid e

cA

MP

ac

cu

mu

lati

on

[x-fo

ld o

ve

r p

cD

ps

]

G P R 1 2 6

G P R 1 3 3

Abb. 14 Spezifitätsprüfung der Peptide p16 und p13

A) COS-7-Zellen wurden mit 100 ng/Well pcDps, P2Y12, GPR126, GPR133, P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) bzw.

P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) transfiziert. Am dritten Tag nach der Transfektion wurde jeweils mit 1 mM p16,

1 mM p13 und ohne Peptid in IBXM-DMEM stimuliert. Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel ±

Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben. B) HEK293-T-Zellen wurden mit

100 ng Plasmid-DNA pro Well transfiziert und mit/ohne 1 mM p16 Peptid für eine Stunde in IBMX-DMEM

inkubiert. Angegeben sind die cAMP-Akkumulationswerte als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM aus

drei unabhängigen Assays jeweils in Triplikaten.

4.4 G-Protein-Kopplung als allgemeines Prinzip der aGPCR

Zur Beantwortung der Frage, ob die namensgebenden G-Proteine tatsächlich an alle Vertreter

der aGPCR binden, wurden in dieser Arbeit 11 murine Rezeptoren kloniert und mit Hilfe

etablierter second messenger-Akkumulationsassays funktionell getestet. Die jeweiligen

Accession numbers und die eingesetzten Primer zur Klonierung finden sich in der Tabelle S1

im Anhang. Alle Konstrukte sind mit einem N-terminalen HA- und einem C-terminalem

pcD

ps

P2Y

12

P2Y

12-

GP

S-C

TF

wt

P2Y

12-

GP

S-C

TF

wt

0

1 0

2 0

3 0

n o p e p t id e

+ p 1 6 p e p tid e

cA

MP

ac

cu

mu

lati

on

[x-f

old

ov

er

pc

Dp

s]

G P R 1 26

G P R 1 33

+ p 1 3 p e p tid e

cAM

P A

kk

um

ula

tion

[x-f

ach

es d

er N

K]

kein Peptid

+ p16

+ p13

+ p16 Peptid

- p16 Peptid cA

MP

Akkum

ula

tion

[x-f

ach

es d

er N

K]

A B

48

FLAG-tag versehen. Für einige Rezeptoren stellte eine ausreichende Expression an der

Zellmembran ein Problem dar, welchem meist durch die zusätzliche Insertion eines N-

terminalen Rhodopsin-tags entgegnet werden konnte. Für den GPR111 galt dies jedoch nicht.

Auch durch die Rhodopsin-Markierung wurden nur 4,2 % der Oberflächenexpression der

Positivkontrolle P2Y12 erreicht. Der HA-markierte GPR128 dagegen zeigte trotz niedriger

Ergebnisse im Oberflächen-ELISA relativ hohe Signalwerte im cAMP- und PI-Assay. Zum

Nachweis des GPR128 wurden zusätzlich Immunfluoreszenz-Bilder angefertigt (Abb. 15).

Diese verdeutlichten zwar eine Expression des GPR128 in der Zelle, jedoch nicht in der

äußeren Zellmembran, sondern vermutlich eine Retention des Rezeptors im Golgi-Apparat.

Jeder Rezeptor wurde in mindestens drei unabhängigen Assays im cAMP- und im PI-Assay

sowie im Oberflächen- und Sandwich-ELISA getestet. Dazu wurden für den cAMP-Assay

100 bis 600 ng Plasmid-DNA eingesetzt, im PI-Assay 500 bis 1500 ng Plasmid. Um eine Gαi-

Kopplung detektieren zu können, wurden 100 ng des chimären G-Proteins Gαi4 co-transfiziert,

welches eine Umleitung des Gi-Signalwegs auf Gq-Effektorproteine bewirkt.

Als Positivkontrolle im cAMP-Assay fungierte eine mit 10 µM Forskolin stimulierte pcDps-

Leervektor-Transfektion. Im PI-Assay stellte ein mit 10 µM Carbachol aktivierter M3-

Rezeptor als Gq-Koppler und ein mit 10 µM MeS-ADP stimulierter P2Y12 als Gi-Koppler den

Erfolg des Experiments sicher.

Die Zusammenfassung der Charakterisierung der 11 aGPCR findet sich in Tabelle 3. Für den

cAMP-Assay sind jeweils die Ergebnisse einer Transfektion mit 600 ng/Well, für den PI-

Assay einer Transfektion mit 1500 ng Plasmid/Well als Mittelwert und Standardfehler

angegeben. Im Oberflächen-ELISA wurden 300 ng, im Sandwich-ELISA 1000 ng Plasmid

pro Well eingesetzt. Statistische Signifikanz wurde mit einer einfachen linearen Regression

über alle Konzentrationen (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) überprüft. Für Rezeptoren ohne

signifikantes Ergebnis innerhalb der linearen Regression wurde zusätzlich ein Einstichproben-

t-Test für Werte der 100 ng (cAMP-Assay) bzw. 500 ng (PI-Assay) Plasmid-Transfektion

angeschlossen (°P<0,05, °°P<0,01, °°°P<0,001).

Es war augenscheinlich, dass alle hier untersuchten aGPCR die Gαs-Kopplung gemeinsam

haben. Besonders ist der GPR114 zu erwähnen, welcher bereits in der Basalaktivität ein

cAMP-Signal (27-faches der Negativkontrolle) auf der Höhe der eingesetzten Positivkontrolle

erzeugte. Der GPR114 konnte damit als ein konstitutiv aktiver Rezeptor identifiziert werden.

Eine Ausnahme stellte nur der murine BAI2 dar, für den bisher als HA-markiertes Konstrukt

keine signifikante G-Protein-Kopplung dargestellt werden konnte. Da jedoch auch nur

niedrige Oberflächenexpressionsspiegel (25,1 % der PK) erzielt wurden, ist zu erwarten, dass

49

mithilfe des RHO-tags eindeutige Ergebnisse in der Signaltransduktion erreicht werden.

GPR115, GPR116 und GPR128 vermittelten über die Gαq-Untereinheit. EMR1, GPR64,

GPR115, GPR116 und GPR128 dagegen bewirkten intrazellulär den Gαi- Signalweg. G-

Protein-Kopplung ist somit ein allgemein gültiges Prinzip für die meisten aGPCR.

Abb. 15 Immunfluoreszenz zur Detektion des GPR128

COS-7-Zellen wurden mit dem HA- und FLAG-markierten Konstrukt des murinen GPR128 transfiziert. Zwei

Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 4 % Formaldehydlösung fixiert, mit DAPI und Anti-FLAG-

M2-Antikörper detektiert und mit Anti-Mouse-markiertem TRITC Antikörper angefärbt. Die Zellkerne sind in

blau und FLAG-markierte GPR128-Konstrukte sind in rot dargestellt. Der GPR128 wird zwar in der Zelle

exprimiert, jedoch im Golgi-Apparat retiniert.

0

Rezeptor N-terminales tag

cAMP-

Akkumualtion

x-faches der NK

IP-Akkumulation x-faches der NK

Oberflächen-ELISA

% der PK

Sandwich-ELISA

% der PK + Gαqi4

Human P2Y12 + MeS ADP HA - 1,3 ± 0,1 8,1 ± 0, 7*** 100 100

Ratte M3R + CCh HA - 20,4 ± 7,9*** - 102,4 ± 8,7 87,5 ± 10,9

Forskolin 32,9 ± 8,5*** - - - -

Maus BAI2 HA 1,21± 0,5 1,04± 0,39 1,14± 0,25 25,1± 10,6 61,1± 13,6

Maus EMR1 HA 2,3 ± 1,2* 1,0 ± 0,5 3,9 ± 1,2*** 45,3 ± 11,1 93,4 ± 7,0

Maus GPR64 Isoform 4 HA 5,5 ± 1,6* 1,0 ± 0,1 1,6 ± 0,4° 63,9 ± 23,7 71,8 ± 14,0

Maus GPR97 HA 2,6 ± 0,8° 1,1 ± 0,5 1,1 ± 0,3 29,4 ± 10,7 91,2 ± 1,2

Maus GPR111

HA 1,9 ± 0,7° 1,1 ± 0,2 2,9 ± 1,9 1,6 ± 0,5 39,0 ± 19,1

HA-RHO 1,1 ± 0,2 0,9±0,02 1,1±0,1 4,2±2,4 72,9±17,6

Maus GPR114 Isoform 1

HA 26,9 ± 7,1** 0,9 ± 0,1 1,3 ± 0,4 1,1 ± 0,8 5,2 ± 1,6

HA-RHO 21,4±6,6* 1,3±0,3 1,3±0,2 64,5±25,9 95,2±9,3

Maus GPR115 HA 2,5 ± 1,0°°° 2,4 ± 1,1* 4,4 ± 1,5°° 75,7 ± 13,0 81,6 ± 3,9

Maus GPR116

HA 4,6 ± 2,4° 1,5 ± 0,4°°° 2,2 ± 0,6* 8,2 ± 2,6 88,5 ± 7,3

HA-RHO 2,4 ± 1,6° 1,7 ± 0,5** 2,2 ± 0,9** 99,1 ± 17,8 89,8 ± 7,2

Maus GPR123

HA 1,5 ± 0,3 1,0 ± 0,0 1,1 ± 0,3 0,9 ± 0,4 31,0 ± 6,3

HA-RHO 2,3 ± 0,9°° 1,2 ± 0,6 1,1 ± 0,3 85,3 ± 19,3 86,5 ± 3,5

Maus GPR124

HA 2,0 ± 0,6 1,1 ± 0,2 1,4 ± 0,2 54,0 ± 8,1 61,4 ± 9,5

HA-RHO 2,4 ± 0,7°° 1,1 ± 0,2 1,0 ± 0,1 71,6 ± 8,9 94,6 ± 4,8

Maus GPR128 HA 12,5 ± 5,4*** 7,0 ± 1,8*** 10,5 ± 3,6** 0,1 ± 0,1 0,0 ± 0,6

Tab. 3 Zusammenfassung der

funktionellen

Charakterisierung von aGPCR

Untersucht wurden 11 aGPCR im

cAMP- und PI-Assay sowie im

Oberflächen- und Sandwich-

ELISA. Als Positivkontrollen sind

die Ergebnisse mit 10 µM

Forskolin (Gs), 10 µM

Carbachol/M3R (Gq), 10 µM

MeS-ADP/P2Y12 (Gi) angegeben.

Dargestellt sind die Ergebnisse

aus drei unabhängigen

Experimenten mit Triplikaten als

arithmetisches Mittel ±

Standardfehler. Für den cAMP-

Assay sind die Ergebnisse für 600

ng/Well, PI-Assay 1500 ng/Well,

Oberflächen-ELISA 300 ng/Well

und Sandwich-ELISA 1000

ng/Well hier eingetragen.

Signifikanz in der linearen

Regression (*p<0,05, **p<0,01,

***p<0,001), Signifikanz im

Einstichproben-t-Test (°P<0,05,

°°P<0,01, °°°P<0,001).

51

4.4.1 Promiskuität der aGPCR in der G-Protein-Kopplung

In der Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass GPR126 und GPR133 jeweils

sowohl mit Gs- als auch mit Gi-Proteinen interagiert. Neu war, dass auch EMR1, GPR64,

GPR115, GPR116 und GPR128 an multiple G-Proteinfamilien binden. Drei der getesteten

aGPCR-Vertreter - GPR115, GPR116 und GPR128 - waren sogar in der Lage mit drei (Gs, Gi,

Gq) verschiedenen G-Protein-Familien zu interagieren. In der Abbildung 16 ist die

konzentrationsabhängige G-Protein-Kopplung des GPR116 exemplarisch dargestellt.

PK PK PK0

2

4

6

8

10

15

35

55Gs

Gq Gi

x-fa

ches d

er

NK

Abb. 16 Konzentrationsabhängige Signaltransduktion des GPR116

Der GPR116 wurde konzentrationsabhängig im cAMP-Assay (100-600 ng/Well) und im PI-Assay (500-1500

ng/Well) getestet. Zur Detektion als Gi-Koppler wurden 100 ng des chimären Gqi4-Proteins co-transfiziert.

Als Positivkontrollen (PK) wurden der transfizierte pcDps-Vektor mit 10 µM Forskolin (Gs), M3R mit 10 µM

Carbachol (Gq) und P2Y12 mit 10 µM MeS-ADP (Gi) stimuliert. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei

unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler.

4.5 Autoproteolytische Spaltung der aGPCR

Unabhängig von einer potentiellen funktionellen Bedeutung des cleavage für den einzelnen

Rezeptor sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche der zu untersuchenden Rezeptoren

autoproteolytisch gespalten werden. Dazu wurden die mit HA- und FLAG-tag versehenen

Rezeptorkonstrukte in COS-7-Zellen transfiziert, die Zellen lysiert und schließlich mit Hilfe

eines Anti-HA-Antikörpers im Westernblot detektiert. Rezeptoren, welche durch das

52

Rhodopsin-tag eine verbesserte Oberflächenexpression aufwiesen, wurden in dieser Variante

bevorzugt verwendet.

Die komplexe Struktur von GPCR mit ihren sieben membrandurchspannenden Helices

machte eine vollständige Membranlyse kompliziert. Die hier eingesetzte Lyse war jedoch in

der Lage, die nicht-kovalente Bindung nach dem cleavage zwischen NTF und CTF zu

zerstören. Somit konnten HA-markierte NTF im Lysat durch einen Westernblot analysiert

werden. Der Auftrag äquimolarer Proteinmengen wurde durch den Nachweis von ß-Aktin als

Housekeeping-Protein gezeigt. Den Westernblot-Ergebnissen zufolge zeigten EMR1,

GPR116 und GPR133 deutlich autoproteolytische Spaltung.

Detektierte Banden mit einer theoretischen Größe>200 kDa stellten vermutlich unspezifische

Reaktionen gegenüber nicht vollständig lysierten Zellmembranbestandteilen mit den

überexprimierten aGPCR dar. Einige Rezeptoren waren im Westernblot nur als vollständiger

Rezeptor detektiert worden - wie der GPR64, für den eine Länge von 108 kDa ohne

Glykosylierungen vorausgesagt wird. Beim GPR123, dem die Domäne der GPS

einschließlich des Spaltungsmotivs der aGPCR fehlt, wurde eine Bande um 70 kDa detektiert.

Da für den gesamten Rezeptor eine Größe von 64 kDa vorhergesagt wird, konnte

geschlussfolgert werden, dass es sich auch hier um den vollständigen, nichtgespaltenen

Rezeptor handelte. Der humane GPR133 besitzt eine Gesamtlänge von rund 96 kDa. Man

konnte davon ausgehen, dass die beiden Banden im Westernblot den gespaltenen und

ungespaltenen Rezeptor darstellten (Abb.17C). Für den GPR126 wurde bereits 2004 cleavage

beschrieben (Moriguchi et al., 2004). Das hier gezeigte Ergebnis in Abbildung 17C war somit

unerwartet. In einer unabhängigen Wiederholung dieses Experiments konnte für den GPR126

eine Bande auf Höhe von rund 70 kDa detektiert werden (Abb. 17E). Dies stellte jedoch

vermutlich nicht den an der cleavage site, sondern den an der postulierten Furinspaltstelle

abgetrennten NTF des GPR126 dar (Moriguchi et al., 2004). Das an der cleavage site

gespaltene CTF des GPR126 beträgt rund 140 kDa (inklusive 25 putative N-

Glykosylierungsstellen, vgl. Tab.4). Der GPR97 wies eine dünne Bande auf Höhe von 35 kDa

auf (in Abb. 17A mit Pfeil markiert). Im Hinblick auf die vorhergesagte Größe seines N-

Terminus inklusive drei potentieller Glykosylierungsstellen bis zur cleavage site war auch der

GPR97 als spaltbarer aGPCR denkbar. Einige aGPCR (BAI2, GPR111, GPR114, GPR115,

GPR124, GPR128) konnten im Westernblot nicht detektiert werden, obgleich zumindest das

Gesamtprotein durch die HA-Markierung zu erwarten gewesen wäre.

Abweichungen in der Proteingröße waren auf die zusätzlichen Insertionen N-terminaler tags

(HA und RHO) und die zahlreichen für die aGPCR typischen Glykosylierungen (Bjarnadóttir

53

et al., 2004) zurückzuführen. Die Tabelle 4 fasst die erwarteten und erzielten Ergebnisse des

cleavage zusammen.

Abb. 17 Westernblot zur Analyse der Autoproteolyse von aGPCR

60 µg Proteinmenge von COS-7-Zelllysaten nach Transfektion des entsprechenden aGPCR wurden in der SDS-

PAGE aufgetrennt. Der anschließende Westernblot wurde mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-HA-Antikörper

(A+C+E) bzw. mit Anti-ß-Aktin-Antikörper (B+D+F) inkubiert. Die Detektion erfolgte mit SuperSignal West

Pico Chemilumineszenzsubstrat (Thermo Scientific). Für den GPR97 verdeutlicht ein Pfeil (A) eine Bande auf

35 kDa.

A

B

C

D

E

F

54

Tab. 4 Übersicht cleavage–Analyse im Westernblot

Das Molekulargewicht der Proteinsequenzen wurde für die NTF der aGPCR errechnet (Protein Molecular

Weight Calculator, 2014), dabei wurde das HA-tag mit 1,1 kDa, das RHO-tag zusätzlich mit 2,2 kDa

einbezogen. Für den GPR123 konnte aufgrund der nicht vorhandenen GPS nur das Gesamtprotein angegeben

werden. Die Anzahl potentieller Glykosylierungen wurden mithilfe des UniProt Consortiums

(http://www.uniprot.org) ermittelt, je Glykosylierung wurden 2 kDa in die errechnete cleavage Größe

einbezogen. Für den GPR111 war es nur möglich, Glykosylierungen der humanen Orthologe zu erheben.

Größe Anzahl

errechnet publiziert im Westernblot Glykosylierungen

Maus Bai2 113 kDa

80 kDa (Okajima et al.,

2010) 8

Maus EMR1 85 kDa 70 kDa 9

Maus GPR64 Iso 4 97 kDa 120 kDa 19

Maus GPR97 32 kDa 35 kDa 3

Maus GPR111 54 kDa

Kein cleavage (Prömel et

al., 2012b) (7)

Maus GPR114 Iso 1 36 kDa 6

Maus GPR115 56 kDa

Kein cleavage (Prömel et

al., 2012b) 7

Maus GPR116 153 kDa (34 kDa SEA)

150 kDa (Abe et al.,

2002) (32 kDa SEA)

(Fukuzawa and Hirose,

2006) 35 kDa SEA 21 (SEA-Site 4)

Maus GPR123 (64 kDa Gesamtprotein) 80 kDa nicht eingetragen

Maus GPR124 104 kDa 12

Human GPR126 140 kDa (69 kDa Furin)

135 kDa (70 kDa Furin)

(Moriguchi et al., 2004) 70 kDa Furin 25 (Furin-Site 10)

Maus GPR128 68 kDa 12

Human GPR133 78 kDa 80 kDa 9

4.6 Konstitutive Aktivierung von aGPCR durch Punktmutationen

Moriguchi et al. beschrieben für den GPR126 vier interessante Mutationen innerhalb der GPS,

welche die Konformation der GPS negativ beeinträchtigt haben sollen. Vier Cysteine, welche

gegen Serine ausgetauscht worden waren, wurden als cleavage-defizient beschrieben

(Moriguchi et al., 2004). Darüber hinaus sollten diese Mutationen mit einer Retention des

Rezeptors in intrazellulären Vesikeln einhergehen, eine Untersuchung der damit verbundenen

Signaltransduktion erfolgte jedoch bisher nicht. Unter den aGPCR-Vertretern sind diese vier

Cysteine (Abb. 18) hoch konserviert und an der Ausbildung von Disulfidbrückenbindungen

beteiligt. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch diese Cystein-Substitutionen

das cAMP-Signal im Vergleich zum WT GPR126 erheblich gesteigert werden konnte (Abb.

55

19A). Die Mutante C807S, die den Austausch des dritten Cysteins enthält, versechsfachte

sogar das second messenger-Signal des nativen GPR126. Die Übertragung dieser spezifischen

Mutationen auf den GPR133 verdeutlichte, dass auch für diesen aGPCR die Cysteine in der

GPS aktivitätsentscheidend sind. Es war auffällig, dass die beiden C-terminal positionierten

CysteinSerin-Substitutionen in GPR126 und GPR133 besonders aktiv waren. In eigenen

Westernblot-Untersuchungen konnte die cleavage-Defizienz dieser CysteinSerin

Mutationen für den GPR126 bestätigt werden. In Abbildung 19C ist exemplarisch die

Detektion des GPR126 CSII Konstrukts im Vergleich zum WT GPR126 durch einen Anti-

HA-Antikörper dargestellt.

Trotz vermutlicher Konformationsänderung in der GPS wurden alle mutierten Konstrukte in

zum WT vergleichbarem Maße an die Zellmembran transportiert. Es konnten somit vier

konstitutiv aktive Rezeptormutationen identifiziert werden, die für sowohl den GPR126 als

auch den GPR133 gelten.

Abb. 18 Cystein-zu-Serin-Mutationen in aGPCR

In die allgemeine Struktur eines aGPCR ist die konservierte

Aminosäuresequenz der GPS angegeben. Mit CSI bis CSIV

sind die vier Aminosäuresubstitutionen von Cystein zu Serin

eingezeichnet.

56

wt

C

S I

C

S II

C

S II I

C

S IV w

t

C

S I

C

S II

C

S II I

C

S IV

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

***

***

***

G P R 1 2 6 G P R 1 3 3

cA

MP

ac

cu

mu

lati

on

[%

of w

t]

wt

C

S I

C

S II

C

S II I

C

S IV w

t

C

S I

C

S II

C

S II I

C

S IV

0

5 0

1 0 0

1 5 0

G P R 1 2 6 G P R 1 3 3

c e ll s u r fa c e E L IS A

w h o le c e ll E L IS A

Ex

pre

ss

ion

[%

of

pC

]

Abb. 19 Untersuchung der CS-Mutationen für den GPR126 und GPR133

(A) Ergebnisse der cAMP-Akkumulationen für die CS Mutationen des GPR126 und GPR133 sind jeweils im

Vergleich zum jeweiligen WT angegeben. (B) Die jeweilige Oberflächenexpression und Gesamtzellexpression

sind als % zur Expression des P2Y12-Konstrukts zu sehen. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei unabhängigen

Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler, Signifikanz als (*p<0,05, **p<0,01,

***p<0,001) angegeben. (C+D) COS-7-Zellen, transfiziert mit WT GPR126 bzw. GPR126 CSII Konstrukt,

wurden lysiert und im Westernblot mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-HA-Antikörper (C) bzw. mit Anti-ß-Aktin-

Antikörper (D) inkubiert. Die Detektion erfolgte mit SuperSignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat (Thermo

Scientific).

Oberflächen-ELISA

Sandwich-ELISA

cAM

P A

kku

mu

lati

on

[% d

es W

T]

Exp

ress

ion

[% d

er P

K]

A B

C

D

57

5 Diskussion

5.1 Die agonistische Stachel-Sequenz der aGPCR

Die Klasse der aGPCR ist die zweitgrößte Gruppe unter den GPCR. Trotz vermehrter

Hinweise auf enorme physiologische und pathophysiologische Relevanz dieser

Rezeptorgruppe sind bis heute alle 33 humanen Vertreter der aGPCR als orphan zu

bezeichnen. Die Suche nach dem spezifischen Agonist, der die Rezeptorfunktion zu

aktivieren vermag, ist bei der Charakterisierung eines Rezeptors wohl eine der vermutlich

schwierigsten, aber auch für mögliche therapeutische Zwecke bedeutsamsten Aufgaben. Für

einige Vertreter der aGPCR ist bereits beschrieben worden, dass durch die Abspaltung des N-

Terminus die Basalaktivität des Rezeptors gesteigert werden kann (Okajima et al., 2010;

Paavola et al., 2011; Stephenson et al., 2013). Verbunden mit dieser wiederholten

Beobachtung verschiedener Arbeitsgruppen entstand die Hypothese, dass sich im N-Terminus

von aGPCR ein inverser gebundener Agonist befinden muss. Es ist jedoch auch ein zweiter

Aktivierungsmechanismus denkbar, welcher einen gebundenen Agonist im N-Terminus von

aGPCR vorsieht.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion des N-Terminus an der cleavage

site auch für GRP126 und GPR133 zu einer Steigerung der Basalaktivität führt. Dies ging

jedoch mit einer verminderten Oberflächenexpression der CTF-Konstrukte einher. Um diesem

Problem entgegenzuwirken, wurde anstelle des aGPCR-spezifischen NTF der N-Terminus

des purinergen GPCR P2Y12 eingesetzt. Diese als P2Y12-CTF bezeichneten

Rezeptorkonstrukte erzielten sogar noch höhere cAMP-Akkumulationen bei nachgewiesener

Oberflächenexpression. Um das Vorhandensein eines inversen gebundenen Agonisten im N-

Terminus von aGPCR zu analysieren, wurde basierend auf diesen Vorergebnissen das

gesamte NTF inklusive GPS-Domäne in dem Konstrukt ΔGPS-CTF deletiert. Entsprechend

der Hypothese eines inversen gebundenen Agonisten wäre von dieser Mutation konstitutiv

aktive Signaltransduktion zu erwarten gewesen. Da der gesamte N-Terminus im ΔGPS-CTF-

Konstrukt deletiert wurde, müssten folglich auch alle potentiell invers agonistischen

Sequenzen innerhalb dessen beseitigt worden sein. Entgegen dieser Vermutung wurden

jedoch nur minimale cAMP-Spiegel im Vergleich zum jeweiligen WT gemessen. Auch bei

nachweisbarer Oberflächenexpression durch den P2Y12-N-Terminus wurden konstant

niedrige Basalaktivitäten erzielt. Während diese Ergebnisse die Existenz eines inversen

gebundenen Agonisten unwahrscheinlich machten, schien der GPS-Domäne, insbesondere

58

deren C-terminaler Bereich, eine besondere Rolle in der Rezeptoraktivierung zuzukommen.

Die beiden Mutationen CTF (hoch aktiv) und ΔGPS-CTF (inaktiv) unterschieden sich

lediglich im Vorhandensein einer kurzen Sequenz (12 AS bei GPR126) nach der cleavage site

des aGPCR. Untersuchungen, in denen der potentiell aktivierende Bereich in der GPS-

Domäne schrittweise eingekürzt bzw. jede einzelne Aminosäure gegen Alanin substituiert

wurde, bestärkten die Hypothese eines gebundenen Agonisten. Schließlich gelang es, Peptide

analog der Sequenz dieser agonistischen Region nach der cleavage site zu generieren, mit

denen der WT und P2Y12-ΔGPS-CTF Konstrukte signifikant in der Signaltransduktion

aktiviert werden konnten. Für den GPR126 erzielte ein 16 AS langes Peptid (p16) die besten

Ergebnisse, währenddessen p13 für den GPR133 identifiziert worden ist. Beide Peptide

wirkten spezifisch nur auf die jeweiligen aGPCR.

Dass ein gebundener Agonist einen GPCR zu aktivieren vermag, ist bereits für die protease-

activated receptors (PAR) gezeigt worden. Aktivierung dieser nur vier Mitglieder

umfassenden Familie der GPCR benötigt die proteolytische Freilegung einer N-terminalen

Rezeptorsequenz durch beispielsweise Thrombin oder Trypsin. Dadurch faltet sich der

gebundene Rezeptor-aktivierende Ligand (TL) der PARs und aktiviert Signaltransduktion

über Gi, Gq und G12/13. Synthetische Rezeptor-aktivierende Peptide analog der exponierten

TL-Sequenz initiieren auch ohne proteolytische Spaltung G-Protein-Kopplung, benötigen

jedoch 100- bis 1000-fach höhere Konzentrationen als die der Proteinasen (Hollenberg et al.,

2013).

Zwei bereits basal charakterisierte Vertreter der aGPCR, GPR126 und GPR133, wurden in

dieser Arbeit hinsichtlich eines allgemein gültigen Aktivierungsmechanismus mit Hilfe

ortsgerichteter Mutagenesestudien und spezifisch synthetisierten Peptiden analysiert. Dabei

konnte die Sequenz zwischen der cleavage site und der TM1 als agonistische Region

identifiziert werden. Aufgrund ihrer Position am C-terminalen Ende der GPS und der

räumlichen Beziehung zur TM1 wurde der aktivierende Bereich als „Stachel-Sequenz“

bezeichnet.

Die Basis für unser heutiges Verständnis über Aktivierungswege von GPCR und

Konformationsänderungen stellen u.a. primäre biophysikalisch und biochemische

Experimente am bovinen Rhodopsin-Rezeptor dar, welcher durch Licht-induzierte

Isomerisierung aktiviert wird (Ahuja et al., 2009).

Die für den GPR126 und GPR133 auf dieser Grundlage der Stachel-Sequenz hergestellten

aktivierenden Peptide (p16 bzw. p13) zeigten nur niedrig-affine Eigenschaften mit einer EC50

>100 µM. Ein klassischer Agonist sollte dagegen in der Lage sein, einen hoch-affinen

59

Zustand des Rezeptors zu initialisieren und zu stabilisieren (Lefkowitz et al., 1993). In diesem

Zusammenhang waren nun mehrere Hypothesen als Erklärung der niedrigen Affinität des p16

und p13 diskutierbar: Theoretisch denkbar wäre, dass sich p16/p13 und der natürlich

vorkommende gebundene Agonist in der ECD in Form einer kompetitiven Hemmung durch

Konkurrenz an der Bindungsstelle behindern. Experimente mit P2Y12-∆GPS-CTF-

Konstrukten, denen die endogene agonistische Sequenz des N-Terminus fehlt, zeigten jedoch

vergleichbare Stimulationswerte durch die Peptide wie Wildtyp-Rezeptoren mit intrinsischer

Stachel-Sequenz. Ein kompetitiver Mechanismus scheint deshalb ausgeschlossen.

Ein Agonist muss in einer spezifischen Konformation vorliegen, um den Rezeptor effektiv

aktivieren zu können. Geht man beispielsweise davon aus, dass eine einzelne Proteinbindung

in drei unterschiedlichen Rotationszuständen vorliegen kann, ergeben sich bei nur 10 solcher

Bindungen innerhalb eines Peptids theoretisch 310 = 59049 verschiedene Konformationen

(Stockwell and Thornton, 2006). Auch wenn nicht jede dieser Konformationen physikalisch

möglich und andere energetisch unvorteilhaft sind, bleiben eine Vielzahl unterschiedlicher

Raumanordnungen für ein solches Peptid möglich. In den meisten Fällen unterscheidet sich

zusätzlich die Konformation eines Liganden im gebundenen Zustand von seiner günstigsten

sterischen Anordnung in Lösung (Gao et al., 2010). Für die aktivierenden Peptide p16 und

p13 ist deshalb nicht auszuschließen, dass nur ein geringer Teil in einer Konformation

vorliegt, welche tatsächlich die Rezeptorfunktion beeinflussen kann. Dementsprechend waren

hohe Konzentrationen notwendig, um den halbmaximalen Effekt (EC50) des Rezeptors zu

erreichen. Innerhalb der ECD des Wildtyp-Rezeptors wird dagegen die korrekte räumliche

Positionierung der Stachel-Sequenz durch ihre Einbindung in die Domänenstruktur

sichergestellt. Die Generierung einer Kristallstruktur für die Stachel-Sequenz ähnlich der

GAIN durch Araç et al. (Araç et al., 2012) könnte bei der Optimierung von therapeutisch oder

diagnostisch nutzbaren aGPCR-Agonisten hilfreich sein.

Die Fähigkeit eines Peptids eine bestimmte Konformation einzunehmen, kann trotz allem

auch als große Chance gesehen werden: Peptidmedikamente zeichnen sich durch höhere

Selektivität als andere small molecule Agonisten aus, was bedeutet, dass sie nur ihren

Zielrezeptor binden. Ernsthafte Nebenwirkungen können dadurch theoretisch minimiert

werden.

Einen weiteren Erklärungsansatz der niedrigen Affinität bieten experimentelle Daten des

Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) Rezeptors. Ligandenbindung und

Rezeptoraktivierung beinhalten demnach einen Zwei-Stufen-Mechanismus: Während MCP-1

im ersten Schritt mit hoher Affinität an den N-Terminus des Rezeptors bindet, erfolgt im

60

zweiten Schritt eine niedrig-affine Interaktion des „pseudo-gebundenen“ Liganden mit den

extrazellulären Loops. In Abwesenheit des N-Terminus wurden jedoch höhere MCP-1

Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung benötigt. Übertragen auf die Stachel-Sequenz ist der

erste Schritt nicht notwendig, da der aktivierende Ligand bereits Teil des N-Terminus ist.

Geht man weiterhin davon aus, dass die Stachel-Sequenz mit extrazellulären Loops und

oberen Helixbündeln ähnlich anderen Peptid-GPCR-Komplexen interagiert (Thompson et al.,

2012), scheinen die hohen p16 und p13 Peptid-Konzentrationen eher nachvollziehbar.

Bekannte Peptidhormone wie TSH oder Insulin besitzen nur kurze Halbwertszeiten, da

zirkulierende Enzyme für die Degradation im Blutstrom sorgen. Man kann vermuten, dass die

agonistische Stachel-Sequenz innerhalb der GPCR-Struktur dagegen keinen so rasanten

Abbauvorgängen ausgesetzt ist. Würde die Stachel-Sequenz, welche ja in einer 1:1

Stöchiometrie zur 7TM vorliegt, zusätzlich noch eine hohe Affinität zur Bindungsstelle

aufweisen, wären alle Rezeptoren dauerstimuliert.

Neue Untersuchungen zur Interaktion des aGPCR CD97 und seines Liganden CD55 zeigten

eine ähnlich niedrige Affinität (KD von 86 μM) auf. Die Expressionsregulation des CD97

nach CD55-Bindung soll dabei von mechanischen Kräften (Scherspannung) in vitro und in

vivo abhängig sein. Da für die CD97-CD55-Interaktion keine Änderung von downstream

Effektorproteinen gefunden werden konnte, erscheint es den Autoren denkbar, dass CD55

allein adhäsive Kontakte vermittelt (Karpus et al., 2013). In Zusammenschau der Ergebnisse

mit den niedrig-affinen Peptiden p16/p13 ist auch der Gedanke möglich, dass zur

vollständigen Rezeptoraktivierung eine Kombination aus endogenem Agonist und exogener

Ligandenbindung an den extrazellulären Domänen nötig ist.

Dieser neue Mechanismus eines endogen gebundenen Agonisten der aGPCR widerspricht

demnach nicht den zuvor publizierten Liganden, welche an adhäsive Domänen des N-

Terminus binden, sondern erweitert sie durch einen zusätzlichen Gesichtspunkt.

5.2 Gs-Protein-Kopplung ist ein generelles Charakteristikum

2011 konnte für den GPR133 als ersten Vertreter der aGPCR erstmalig G-Protein-Kopplung

anhand eines second messenger-Signalexperiments bewiesen werden. Das Gs-Signal wurde

u.a. durch den spezifischen knock-down von Gαs mit siRNA und Überexpression von Gαs

verifiziert (Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Nachfolgend wurden für den GPR114 eine

Bindung an Gαs, für den GPR110 an Gαq sowie GPR97 an Gαo gezeigt (Gupte et al., 2012).

61

Signaltransduktionsmechanismen und G-Protein-Kopplung blieben für den Großteil der

aGPCR jedoch weiterhin unbekannt.

In dieser Arbeit wurden deshalb 11 murine Rezeptoren der aGPCR aus cDNA-Bibliotheken

kloniert und funktionell anhand von second messenger-Akkumulationsassays getestet. Eine

Alternativmethode zum Nachweis einer G-Protein-Kopplung stellt die Bindung von

radioaktiv-markiertem GTP an einen GPCR dar. Dazu wird meist ein 35S markiertes, nicht-

hydrolysierbares Analogon von GTP (GTPγS) eingesetzt. GPCR, überexprimiert in

Zellmembranen, binden nach Agonistaktivierung entsprechende G-Proteine, welche den

Austausch von GDP durch GTP bewirken. Die Höhe der Rezeptoraktivierung kann in der

Menge des radioaktiv-markierten GTP an die Zellmembranen gemessen werden

(PerkinElmer, 2014). In den hier eingesetzten Methoden wurden second messenger-Signale

ausgelesen. Diese liegen zwar downstream der G-Protein-vermittelten Signalkaskade und sind

damit per se nur indirekter G-Protein-Bindungsnachweis, jedoch ist ein entscheidender

Vorteil dieser Methode, dass zur Bestimmung von second messengern meist auf den Einsatz

radioaktiver Substanzen verzichtet werden kann und somit Konstrukte im Hochdurchsatz

getestet werden können. Eine nicht-radioaktive Variante zum Nachweis von G-Protein-

Kopplung ist der hier verwendete AlphaScreen cAMP Assay von PerkinElmer. Der second

messenger 3´5´-cyclisches AMP (cAMP) wird durch die Adenylylcyclase aus ATP gebildet.

Die Regulation der Adenylylcyclase ist weitreichend untersucht. Neben den durch G-Proteine

vermittelten Effekten kann die Adenylycyclase nur durch Forskolin aktiviert und durch

Calcium/Calmodulin moduliert werden (Tang and Hurley, 1998). Da Forskolin eine

chemische Verbindung aus dem Harfenstrauch Plectranthus barbatus ist (Metzger and

Lindner, 1981) und endogen im Säugetierorganismus nicht vorkommt, verweist ein erhöhtes

cAMP-Signal spezifisch auf eine Gs-Protein-Aktivierung durch GPCR. Die verwendeten

Methoden sind darüber hinaus seit Jahrzehnten in der Arbeitsgruppe etabliert und sind in der

Validität und Spezifität umfangreich bestätigt (Sangkuhl et al., 2002; Bohnekamp and

Schöneberg, 2011).

Für einige Rezeptoren wie GPR111, GPR114 und GPR128 wurden nur niedrige

Expressionsspiegel an der Zellmembran im ELISA detektiert. Teilweise konnte dem durch die

Insertion eines N-terminalen Rhodopsin-tags entgegnet werden. Das Rhodopsin-tag umfasst

die ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus des bovinen Rhodopsin-Rezeptors und konnte

bereits für unterschiedlichste GPCR als Modifikation, welche die Zelloberflächenexpression

erhöht, gezeigt werden (Liberles and Buck, 2006; Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Für

einige Rezeptoren wurden jedoch trotz niedriger Oberflächenexpression im ELISA

62

signifikante second messenger-Akkumulationen gemessen, beispielsweise für die HA- und

FLAG-markierten Konstrukte des GPR114 und des GPR128. Dank interner Assay-

spezifischer Kontrollen konnten unspezifische Nebenreaktionen ausgeschlossen werden: In

jedem Experiment wurde als Negativkontrolle der leere pcDps-Vektor transfiziert, auf den

sich alle Rezeptor-spezifischen Daten beziehen (x-faches der Negativkontrolle). Am

wahrscheinlichsten war, dass sich der HA-tag aufgrund sterischer Anordnung im N-Terminus

nicht durch den eingesetzten Antikörper (Anti-HA-Antikörper 3F10, Roche Applied Science)

erfassen ließ. Eine andere Möglichkeit zur Expressionskontrolle ist der Nachweis des

Rezeptors im Westernblot. In einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Sekundär-

und Tertiärstrukturen eines Proteins durch die Zugabe von SDS und anschließendem Erhitzen

auf 95 °C zerstört. Neben diesem Aufbrechen der Wasserstoffbrücken können vorhandene

Disulfidbrücken durch ß-Mercaptoethanol gespalten werden. So ist es im Westernblot eher

möglich, eine zu untersuchende Struktur mit einem Antikörper nachzuweisen als bei intakter

Tertiärstruktur des Proteins. Westernblot-Untersuchungen dieser Rezeptoren ließen leider

keine eindeutige Aussage über die Expression zu. Der GPR114 und der GPR128 konnten

nicht als Gesamtprotein detektiert werden.

Die HA-Markierung wurde C-terminal des vorausgesagten Signalpeptids des Rezeptors

eingefügt (SignalP 4.1 Server, Center for Biological Sequence Analysis CBS). Daher ist es

nicht auszuschließen, dass es durch diese exogene Insertion zu einer Fehlfaltung oder zur

Funktionslosigkeit des Signalpetids kam. Versuche, das HA-tag um einzelne

Aminosäurepositionen nach C-terminal zu versetzen, erhöhten bislang die

Oberflächenexpression des Rezeptors nicht.

Zum gleichen Zwecke diente auch der Nachweis des Immunfluoreszenz-markierten FLAG-

tags des GPR128: Der GPR128 konnte zwar mikroskopisch detektiert werden, schien jedoch

in der Zelle retiniert zu werden. Eine nähere Bestimmung der intrazellulären Lokalisation

wäre durch die Anfärbung spezifischer Golgi-Marker (z.B. α-Mannosidase II) oder ER-

Marker (z.B. Calnexin) möglich. Die Retention des Rezeptors schien jedoch keine negative

Auswirkung auf die intrazelluläre Signaltransduktion zu besitzen, konnte doch für den

GPR128 multiple G-Protein-Kopplung an Gs, Gq und Gi ermittelt werden. Neben der

klassischen Vorstellung, welche GPCR in der Zellmembran lokalisiert sieht, gibt es starke

Hinweise darauf, dass heterotrimere G-Proteine und Adenylylcyclasen auch in Endosomen

vorkommen. Es konnte gezeigt werden, dass internalisierte TSH-TSHR-Komplexe

intrazellulär die cAMP-Produktion fortführend stimulieren (Calebiro et al., 2009). Darüber

hinaus soll intrazellulär der Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1 (S1P1) Gi-vermittelte

63

Signalwege aktivieren (Mullershausen et al., 2009). GPCR sollen in sekretorischen Granula,

dem Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat eine Rolle im Vesikeltransport

übernehmen (Slessareva et al., 2006). Möglicherweise übt auch der GPR128 eine solche

Funktion im Golgi-Apparat aus.

Alle in dieser Arbeit untersuchten aGPCR zeigten eine Bindung an Gs-Proteine. Die Sekretin-

Familie der GPCR, welche sich aus den aGPCR entwickelt hat, soll sowohl intrazelluläre

cAMP- als auch Calciumspiegel regulieren und umfasst die Rezeptoren für u.a. Sekretin,

Calcitonin und Parathormon (Patel et al., 1995). Damit fügt sich die Fähigkeit der aGPCR an

Gs-Proteine zu binden, adäquat in den evolutionären Kontext ein.

5.3 Multiple G-Protein-Interaktion

Es wurden 11 orphane aGPCR hinsichtlich ihrer G-Protein-Kopplungseigenschaften

untersucht. Eine duale Kopplung an Gi/o und Gq/11-Proteine ist bereits 1994 für den

muskarinischen Acetylcholinrezeptor beschrieben worden (Offermanns et al., 1994), an Gs-

und Gq/11-Proteine 2001 für den stimulierten D1 Dopaminrezeptor (Jin et al., 2001). Seltener

dagegen scheint die simultane Interaktion mit drei oder vier G-Protein-Familien zu sein (Gs-,

Gi/o-, Gq/11- und G12/13-Kopplung des Thyrotropinrezeptors) (Laugwitz et al., 1996)). Es wird

nach wie vor dabei die Frage diskutiert, ob multiple G-Protein-Kopplung Pleiotropie

(physiologische Aktivierung mehrerer unterschiedlicher G-Proteine) oder Promiskuität

(niedereffiziente unspezifische G-Protein-Aktivierung als Ergebnis von Rezeptor- oder G-

Protein-Überexpression) darstellt (Maudsley et al., 2005). Ein GPCR, welcher von einem

Agonist aktiviert wird, soll dabei intrazellulär jedes G-Protein mit unterschiedlicher

intrinsischen Aktivität/ Potenz binden können (Offermanns et al., 1994).

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der dualen G-Protein-Kopplung des

GPR126 (Mogha et al., 2013) und des GPR133 (Bohnekamp and Schöneberg, 2011;

Liebscher et al., 2013) auch andere Vertreter der aGPCR an mehr als eine G-Protein-Familie

binden. Herauszustellen waren dabei GPR115, GPR116 sowie GPR128, welche an jeweils

alle drei getesteten G-Proteine (Gs, Gq und Gi) koppeln konnten. Weiterführende

Untersuchungen sollten klären, ob auch der G12/13-Signalweg durch die genannten aGPCR

aktiviert werden kann. Die Gα12/13 Untereinheit heterotrimärer G-Proteine stimuliert mitogene

Signalwege wie die Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) und führt zur Formation von

Stressfasern in der Zelle über Rho-Aktivierung (Dhanasekaran and Dermott, 1996).

64

Zur Untersuchung des Gq- und Gi-Signalwegs wurde der bereits in der Arbeitsgruppe

etablierte PI-Assay verwendet. Prinzip dessen ist die Hydrolyse von 3H-markiertem

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) durch Gq-vermittelte Aktivierung der

Phospholipase Cß. Das dabei entstehende 3H-markierte IP3 kann mit Hilfe eines ß-Counters

quantifiziert werden. Durch Co-Transfektion eines chimären G-Protein Gqi4 erlaubt dieser

Ansatz auch die Untersuchung des Gi-Signalwegs. Um den Erfolg eines jeden Assays

gewährleisten zu können, wurden bekannte Gq- bzw. Gi-koppelnde GPCR, stimuliert mit dem

jeweils bekannten endogenen Agonist, als Positivkontrolle mitgeführt (M3R und P2Y12).

Unspezifische Nebenreaktionen in der Zelle konnten vernachlässigt werden, da alle

Ergebnisse als x-faches des transfizierten Leervektors angegeben sind.

Darin begründet, dass alle aGPCR bislang orphan sind, man also keine endogene Agonisten

kennt, konnte nur die Basalaktivität der Rezeptoren nachverfolgt werden. Es ist denkbar, dass

mehrfache G-Protein-Kopplung durch den Einsatz des spezifischen Agonisten (z.B. Peptide

analog der jeweiligen Stachel-Sequenz) sogar noch häufiger aufträte.

Die duale Kopplung an Gs- und Gi-Proteine eines Rezeptors mit simultaner Stimulierung und

Inhibierung der Adenylylcyclase mag kontrovers erscheinen. Für den ß2-Adrenozeptor,

welcher Gs- und Gi-Proteine aktiviert, konnte der Mechanismus einer wechselnden G-Protein-

Kopplung aufgeklärt werden. Die ß2-AR-vermittelte MAPK-Aktivierung durch die ßγ-

Untereinheit des Gi-Proteins wird dabei erst durch Gs-Protein-Rezeptorbindung ermöglicht:

Durch Aktivierung der Proteinkinase A und nachfolgende Phosphorylierung des ß2-AR

kommt es zur Stimulation des Gi-Signalwegs. Die ßγ-Untereinheit des Gi-Proteins vermittelt

dabei über die Tyrosinkinase c-Src und das G-Protein Ras das MAPK-Signal des ß2-AR

(Lefkowitz et al., 1997). Anstelle konkurrierender Effekte sind also auch synergistische

Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen G-Proteinen bedeutsam.

In murinen Schwannzellen sind darüber hinaus niedrige cAMP-Spiegel mit Proliferation und

hohe cAMP-Level mit Differenzierung assoziiert worden (Arthur-Farraj et al., 2011). Der

aGPCR GPR126 nimmt dabei eine entscheidende Position ein (Mogha et al., 2013). Es darf

vermutet werden, dass multiple G-Protein-Kopplung der aGPCR eine wichtige Rolle bei der

Feinabstimmung dieser und anderer physiologisch notwendigen second messenger-Spiegel

spielt.

65

5.4 Autoproteolytische Spaltung

Cleavage, die autoproteolytische Spaltung an einer konservierten Stelle innerhalb der GPS, ist

ein viel diskutiertes Charakteristikum der aGPCR. Die intrazelluläre Spaltung ist für einige

Vertreter der aGPCR beschrieben worden (CD97 (Hsiao et al., 2009), GPR56 (Paavola et al.,

2011), GPR126 (Moriguchi et al., 2004)), für andere jedoch Gegenteiliges (GPR111 und

GPR115 (Prömel et al., 2012b)).

Da die Spaltung des NTF im Endoplasmatischen Retikulum zu einer frühen Phase der

Proteinprozessierung erfolgen soll, kam die Vermutung auf, dass cleavage für die Reifung,

Transport und Funktion der aGPCR von großer Bedeutung sein muss. Krasnoperov et al.

schlussfolgerten, dass cleavage an der GPS essentiell für den Transport des Latrophilins an

die Plasmamembran sei (Krasnoperov et al., 2002). Andere Untersuchungen zeigten, dass

Oberflächenexpression und cleavage von aGPCR keinen direkten Zusammenhang aufweisen

(Lin et al., 2004). Für die bilaterale frontoparietale Polymikrogyrie, einer

Gehirnentwicklungsstörung, sind unter anderen Mutationen (C346S und W349S) des GPR56

beschrieben, welche die autoproteolytische Spaltung und zugleich den Austritt des Rezeptors

aus dem Endoplasmatischen Retikulum behindern (Jin et al., 2007). In vivo konnte kürzlich

jedoch gezeigt werden, dass die GPS des Latrophilins 1 nicht notwendig für

Rezeptortransport und –aktivität ist (Prömel et al., 2012a). Die physiologische Relevanz

dieser Spaltung bleibt somit kontrovers diskutiert.

In dieser Arbeit wurden für die 11 primär auf Signaltransduktion untersuchten aGPCR

Westernblots angefertigt, um eine Aussage zum cleavage dieser Rezeptoren treffen zu

können. Zusätzlich wurden GPR126 und GPR133, für welche bereits Vorergebnisse

bezüglich der autoproteolytischen Spaltung existieren, mitgeführt. In dieser Arbeit zeigten

GPR97, GPR116, GPR126, GPR133 und EMR1 das für die aGPCR charakteristische

cleavage.

GPR116, GPR126, GPR133 sowie EMR1 sind gute Oberflächenexpression und multiple G-

Protein-Kopplung gemeinsam. Der GPR97, dessen NTF nur in geringem Maße im

Westernblot dargestellt wurde, war dagegen im Vergleich zur Positivkontrolle P2Y12 in

niedrigerem Maße an der Zellmembran lokalisiert und vermittelt nur den Gs-Signalweg. In

Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die

Detektion von cleavage im Westernblot mit der Expression eines aGPCR assoziiert ist. Es

lässt sich vermuten, dass möglicherweise auch andere aGPCR - wie GPR114 oder GPR128 -

cleavage zeigen würden, wären sie stärker an der Zelloberfläche exprimiert. Aufgrund einer

66

mutierten cleavage site des GPR115 und GPR111 (Prömel et al., 2012b) wäre dies jedoch

nicht von allen aGPCR zu erwarten.

Für EMR2 und EMR4 ist bereits Proteolyse an der GPS beschrieben worden (Stacey et al.,

2002; Lin et al., 2004). In dieser Arbeit zeigte der nahe verwandte EMR1 im Westernblot

Banden unterschiedlicher Höhe. Mit rund 102 kDa wird der vollständige Rezeptor

vorhergesagt, sodass hier vermutlich sowohl ungespaltene als auch gespaltene Rezeptoren

dargestellt sind. Die autokatalytische Reaktion des cleavage kann laut Iguchi et. al. keine

100 % Effizienz aufweisen, wodurch gespaltene und ungespaltene Moleküle des Rezeptors in

der Zelle co-existieren (Iguchi et al., 2008).

Für den GPR114, welcher eine Gesamtlänge von nur 58 kDa besitzt, war im Westernblot eine

Bande auf Höhe von 200 kDa gefunden worden. Dies war vermutlich auf eine nicht

vollständige Membranlyse zurückzuführen und stellte keinen Beweis für autoproteolytische

Spaltung des GPR114 dar. Der GRP116 enthält im N-Terminus eine SEA-Box. Eine solche

SEA-Box, die auch in anderen Proteinen identifiziert worden ist, soll sich als zusätzliche

Spaltstelle im GPR116 darstellen (Fredriksson et al., 2002). Die SEA-vermittelte-Spaltung

soll dem Protein eine Funktion sowohl als Ligand als auch als Rezeptor erlauben (Wreschner

et al., 2002). Es konnte vermutet werden, dass die hier dargestellte Bande des GPR116 die

SEA-Domäne darstellt.

Für den BAI2 ist cleavage bereits publiziert worden (Okajima et al., 2010). Die Fähigkeit der

BAI-Subfamilie zur autoproteolytischen Spaltung scheint dabei zellspezifisch zu sein, BAI1

und BAI3 spalten in HEK293T-Zellen nicht (Stephenson et al., 2014).

Moriguchi et al. beschrieben den GPR126 als intrazellulär gespaltenen aGPCR. Für ihre

Untersuchungen generierte die Arbeitsgruppe Antikörper gegen carboxy-terminal

cytosolische Bereiche des GPR126. Damit gelang es ein 35 kDa großes Fragment als CTF zu

detektieren, der Gesamtrezeptor wird mit 170 kDa angegeben. Eine weitere Spaltungsstelle

wird zwischen Lysin467 und Arginin468 angegeben und konnte durch den Furininhibitor

Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-Chloromethylketon gehemmt werden (Moriguchi et al., 2004). In

den Untersuchungen dieser Arbeit konnte für den GPR126 kein einheitliches Ergebnis erlangt

werden, einige Westernblots wiesen eine Bande auf Höhe von 70 kDa auf. Da die

Furinspaltstelle N-terminal der cleavage site liegt und damit näher am von Antikörper

erkannten HA-tag, war es für den GPR126 nicht möglich, eine Aussage über die

Autoproteolyse an der GPS zu treffen.

Wie bereits erwähnt, ist eine vollständige Solubilisierung bei Membranproteinen wie den 7-

Transmembranrezeptoren nur selten zu erreichen. Eine elegante Lösung dieses Problems stellt

67

die Klonierung des Rezeptors in einen spezifischen Sekretions-Vektor dar. Der Säugetier-

Expressionsvektor pSecTag2 (life technologies, Invitrogen, Darmstadt, Deutschland)

beispielsweise enthält ein Sekretionssignal der V-J2-C-Region der murinen Ig-κ-Kette und

ermöglicht so eine effiziente Sekretion von Proteinen. Auf diese Weise werden potentiell

gespaltene NTF von aGPCR in das Zellkulturmedium sekretiert und lassen sich durch

Methanol/Chloroform Präzipitation konzentrieren (Wessel and Flügge, 1984; Prömel et al.,

2012b). Durch die artifizielle Sekretion ist keine Zelllyse nötig, wodurch diese Methode

definitive Aussagen eher ermöglicht.

Die Ergebnisse zum cleavage bestätigen zusammenfassend den Eindruck, dass zwar die

intrazelluläre Spaltung von aGPCR eine besondere Eigenschaft dieser GPCR-Klasse darstellt,

dass dieses Charakteristikum jedoch nicht allen Vertretern der aGPCR eigen ist.

5.5 Konstitutive Aktivierung an konservierten Cysteinen

Spezifische Aminosäuresubstitutionen eines GPCR können den mutierten Rezeptor

befähigen, den entspannten, aktiven R*-Zustand zu favorisieren. Die strukturelle

Konformationsänderung - ausgelöst durch den Aminosäureaustausch - imitiert den unter

natürlichen Umständen durch Agonisten verursachten allosterischen Übergangszustand. Es ist

dabei möglich, dass es durch Mutagenese zu einer Favorisierung des aktiven oder aber auch

des inaktiven R-Zustandes kommt (Lefkowitz et al., 1993). Trotz weitreichender

Untersuchungen ist es bis heute nicht vorhersagbar, welche Substitutionen einen GPCR

konstitutiv aktivieren. In Rhodopsin-ähnlichen GPCR werden solche Mutationen häufig in der

Transmembranregion gefunden. Cöster et al. ersetzten dafür jede einzelne Aminosäure der

TM6 und TM7 des P2Y12 durch die verbliebenen 19 anderen Aminosäuren und beschrieben,

dass nur 1,7 % der 1254 generierten Mutationen konstitutive Aktivität aufwiesen (Cöster et

al., 2012). Für den purinergen Adenosin 2B Rezeptor (A2BR) konnten drei

Schwerpunktbereiche ausgemacht werden, an denen konstitutive Aktivierung des Rezeptors

durch Aminosäureaustausch erzeugt werden können: Neben jeweils einem Bereich in der

TM4 und TM5 stach eine Cystein-reiche Region innerhalb des extrazellulären Loops 2

(ECL2) hervor. Es konnte dargestellt werden, dass eine putative Disulfidbrücke zwischen

ECL 1 und ECL 2 wichtig für die Ribose-Agonist Bindung und Aktivierung ist (Peeters et al.,

2012). Der GABA1B-Rezeptor dagegen soll durch die Einführung zweier Cysteine, welche

68

untereinander eine Disulfidbrücke ausbilden, im aktiven Zustand blockiert werden (Kniazeff,

2004). Für die aGPCR waren bislang keine konstitutiv aktiven Rezeptorvarianten bekannt.

In dieser Arbeit konnten für die aGPCR vier Positionen identifiziert werden, an denen durch

Aminosäuresubstitution zuverlässig eine basal aktivere Rezeptormutante generiert werden

kann. Es handelt sich dabei um innerhalb der aGPCR-Familie hoch konservierte Cysteine

(Cys775, Cys794, Cys807 und Cys809 des GPR126), welche N-terminal der cleavage site

lokalisiert sind und deren Schwefelatome potentiell untereinander Disulfidbrückenbindungen

ausbilden. Disulfidbrücken formen und stabilisieren die dreidimensionale Tertiärstruktur

eines Proteins, vernetzen und verknüpfen Peptidketten. Durch Austausch der Cysteine durch

die polare Aminosäure Serin bedingte sich eine bis zu sechsfach gesteigerte cAMP-

Akkumulation bei leicht verminderter Oberflächenexpression der Mutanten. Die Positionen

waren dabei nicht für den GPR126 spezifisch, sondern waren auf den GPR133 übertragbar.

Als potentiell allgemeingültiger Aktivierungsmechanismus wird - wie bereits erwähnt - die

Abspaltung N-terminaler Bereiche an der cleavage site durch autoproteolytische Prozesse

diskutiert (Paavola and Hall, 2012). Interessanterweise wurden die konstitutiv aktiven

Mutationen an den Cysteinen des GPR126 bereits in einer früheren Untersuchung als

cleavage-defizient beschrieben (Moriguchi et al., 2004). Cleavage erschien zumindest für die

Aktivierung dieser Mutanten nicht notwendig zu sein.

Während Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen bereits die Schlussfolgerung zuließen, dass

die Neuformation einer Disulfidbrücke einen generellen Mechanismus für die

Aktivitätsregulation von 7TM-Rezeptoren darstellt (Storjohann et al., 2008), demonstrieren

diese Ergebnisse, dass auch die Zerstörung einer solchen Bindung in Rezeptoraktivierung der

aGPCR resultiert. Das in dieser Arbeit postulierte Aktivierungsmodel der aGPCR geht davon

aus, dass der intramolekulare agonistische Bereich, also die Stachel-Sequenz, durch

Konformationsänderungen in der ECD freigelegt und damit befähigt wird, 7TM-vermittelte

G-Protein-Kaskaden zu initialisieren. Strukturelle Änderungen in der GPS - hier durch

Zerstörung einer Disulfidbrückenbindung - aktivieren folglich in Analogie zur Stachel-

Sequenz die Signaltransduktion eines aGPCR.

5.6 Ausblick

Diese Arbeit umfasst die molekularbiologische Charakterisierung von 11 Vertretern der

aGPCR (Tab. 5) sowie die Identifikation eines gebundenen Agonisten im N-Terminus als

69

Aktivierungsmechanismus dieser Rezeptorfamilie. Es bleiben jedoch noch einige Fragen

offen. So wurde bis heute für die Rezeptoren der Gruppe V der aGPCR, welche die Cadherin

EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptors CELSR1, CELSR2 und CELSR3 umfasst, noch

keine G-Protein-Kopplung gezeigt. Aber auch für BAI3, EMR3-4, GPR112, GPR113,

GPR125, GPR144 und VLGR steht eine Untersuchung auf putative G-Protein-Interaktion

noch aus. Dabei ist zu erwarten, dass auch diese Rezeptoren intrazellulär auf second

messenger wie cAMP oder Phosphatidylinositol wirken. Für möglichen therapeutischen oder

diagnostischen Einsatz sind jedoch genauere Kenntnisse von Nöten.

Ziel wird es sein, alle Rezeptoren der Adhesion-Familie umfassend zu charakterisieren. Dabei

sollte auch der G12/13-Signalweg, dessen Untersuchung nicht Bestandteil dieser Arbeit war, in

zukünftigen Studien einbezogen werden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit soll dafür ein

Grundstein gelegt sein.

Das Vorhandensein eines gebundenen Agonisten im N-Terminus der aGPCR wurde bislang

nur für den GPR126 und GPR133 gezeigt. Trotz Einordnung dieser beiden Rezeptoren in

unterschiedliche Untergruppen innerhalb der aGPCR-Klasse bleibt die Frage, ob sich alle

aGPCR-Vertreter durch denselben Mechanismus aktivieren lassen. Gerade im Hinblick auf

die große Heterogenität dieser Gruppe müssen sich noch weitere Untersuchungen

anschließen. Interessant sind dabei Rezeptoren wie der GPR111 und GPR115, welche eine

modifizierte cleavage-Sequenz aufweisen (Abb. 20). Aber auch der GPR123, dem die GPS-

Domäne vollständig fehlt, wird in weiterführenden Experimenten aufschlussreiche

Erkenntnisse mit sich bringen. Der GPR114 (Isoform 1) zeichnete sich als konstitutiv aktiver

Rezeptor aus. Es stellt sich hier die Frage, ob dieser Rezeptor durch Peptide noch stärker

aktiviert oder ein anderer Mechanismus identifiziert werden kann.

Die als Agonisten wirkenden Peptide p16 und p13 bestehen aus 16 bzw. 13 Aminosäuren.

Obwohl bereits mit dem Alaninscan des p16 begonnen wurde, steht die genaue Lokalisierung

der agonistischen Kernsequenz noch aus. Zukünftig müssen neben pharmakodynamischen

auch pharmakokinetische Gesichtspunkte untersucht werden, um Aspekte der Resorption,

Distribution, Metabolisierung und Exkretion im Organismus für die Peptidagonisten

einschätzen zu können. Nicht nur für diese Themenstellung sind in vivo-Untersuchungen

anzustreben. Der Aktivierungsmechanismus wurde für die humanen aGPCR-Konstrukte des

GPR126 und GPR133 aufgedeckt. Ob die Peptide p16 und p13 auch agonistische Effekte auf

andere Orthologe besitzen und damit ein evolutionär konservierter Mechanismus vorherrscht,

kann beispielsweise in zukünftigen Maus- oder Zebrafischstudien nachgegangen werden.

70

Peptide werden natürlicherweise durch zirkulierende Enzyme degradiert, sodass kurze

Halbwertszeiten von 2-30 Minuten keine Seltenheit darstellen. Auch die Aufnahme eines

solch großen Peptids in die Blutbahn stellt eine Herausforderung dar. Daher sind

möglicherweise biotechnologische Weiterentwicklungen der Peptide nötig, um

Schwierigkeiten für den therapeutischen Einsatz entgegenzuwirken.

*

Abb. 20 Alignment der cleavage site von aGPCR

Die Proteinsequenzen der in dieser Arbeit untersuchten aGPCR wurden in BioEdit mithilfe des ClustalW

Algorithmus analysiert. Da der GPR123 keine GPS enthält, sind die Sequenzen für diesen Rezeptor hier nicht

aufgeführt. Farbig unterlegt sind die Aminosäuren, die >90 % Konservierung unter den Sequenzen aufweisen.

Die potentielle cleavage site ist mit * markiert.

Tab. 5 Übersicht der molekularen Charakterisierung von ausgewählten aGPCR

Dargestellt sind arithmetische Mittel im Oberflächen-ELISA als (+++) 80-100%, (++) 40-79%, (+) 10-39%,

(-) 0-9% der Positivkontrolle P2Y12, im cAMP-und IP-Assay anhand des Signifikanzniveaus als (+++) <0,001,

(++) <0,01, (+) <0,05. Cleavage ist in Westernblots dieser Arbeit als (+) vorhanden bzw. (-) nicht vorhanden

angegeben. Das klassische cleavage Motiv HL↓T/S nach (Lin et al., 2004) ist erkennbar (+) oder nicht

vorhanden (-).

Oberflächen- Signaltransduktion klassisches

Rezeptor expression Gs Gq Gi cleavage cleavage Motiv

Maus BAI2 + - +

Maus EMR1 ++ + +++ + -

Maus GPR64 Iso 4 ++ + + - +

Maus GPR97 + + + +

Maus GPR111 - + - -

Maus GPR114 Iso 1 ++ ++ - +

Maus GPR115 ++ +++ + ++ - -

Maus GPR116 +++ + ++ ++ (+) +

Maus GPR123 +++ ++ - -

Maus GPR124 ++ ++ - -

Human GPR126 +++ +++ ++ (+) -

Maus GPR128 - +++ +++ ++ - -

Human GPR133 +++ +++ + ++ + +

Maus BAI2 - - T T D P H C A S W D Y S R A D T N S G D W N T E S C Q T L E T - - - Q A A H T R C Q C Q H - - - L ~ ~ ~ S T F A V L A Q P P K D L T L E L A - - - -

Maus EMR1 - - - - R P I C V S W N T D V E D - - - G R W T P S G C E I V E A - - - S E T H T V C S C N R - - - M ~ ~ ~ A N L A I I M A S G - - - - - E L - - - - -

Maus GPR64 - - - - T V K C V F W D L G R N G - G K G G W S S D G C S V K - D - - K R M N E T I C T C S H - - - L ~ ~ ~ T S F G I L L D L S R T - - - - - - - - - -

Maus GPR97 P P N V I L T C V F W D M A - - K - G D - - W D S H G C S T V - P - - G D - G R T V C R C D H - - - L ~ ~ ~ T F F A L L L R P I - L D L A T A Q - - - -

Maus GPR111 S G E R K S Q C V G W H S - - - - - L E S R W D W R A C K T I Q E - - - N S R Q A V C R C R P N K L Y ~ ~ ~ T S F S I L M S P N T L E S P - - - - - - -

Maus GPR114 Iso1 L E G Y T V S C V F W K E G A S K S S W G A W S P E G C Y T E Q P - - - S A T Q V L C H C N H - - - L ~ ~ ~ T Y F A V L M Q L S G D P V P A E L Q - - -

Maus GPR115 S Q S T S S Q C V S W D P - - - - - A T G Q W D E S P C T V M S D - - - I N S T V K C R C R H T K A V ~ ~ ~ T S F S I L M S S K P V K N T - - - - - - -

Maus GPR116 S G G - K P Q C V F W N F S L A N - N T G G W D S S G C S V E D D G R D N R D R V F C K C N H - - - L ~ ~ ~ T S F S I L M S P D S P D P G S L L K I - -

Maus GPR124 - - - A D P M A A WW N Q D - - - - G P G G W S S E G C R L R Y S - - - Q P N V S S L Y C Q H - - - L ~ ~ ~ G N V A V L M E L N A F P R E A G G S G - -

Human GPR126 - E V H H P I C A F W D L N K N K - S F G G W N T S G C V A H R D - - S D A S E T V C L C N H - - - F ~ ~ ~ T H F G V L M D L P R S A S - Q L D A R N -

Maus GPR128 - - - - S Y A C V Y W N F - - - - - L I N D W D T Q G C Q K T G N - - - T T E F L R C N C S H T - - - ~ ~ ~ T N F A V L M S F K - - K D - - - - - - - -

Human GPR133 S N R V F V Y C A F L D F S - - S - G E G V W S N H G C A L T - R - - G N L T Y S V C R C T H - - - L ~ ~ ~ T N F A I L M Q V V P L E L A R G H Q - - -

71

6. Zusammenfassung der Arbeit

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

Titel: Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von

Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

eingereicht von Julia Schön

angefertigt am Institut für Biochemie

Abteilung Molekulare Biochemie

Medizinische Fakultät

Universität Leipzig

betreut von Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg

Juli 2014

Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) umfasst die

zweitgrößte Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Trotz vermehrter Hinweise auf

physiologische und pathophysiologische Relevanz dieser Rezeptorgruppe in genomweiten

Assoziationsstudien und ersten in vivo-Untersuchungen, bleiben bis heute alle 33 humanen

Vertreter dieser Gruppe orphan. Dies bedeutet, dass weder die Funktion noch der endogene

Agonist eines Rezeptors hinreichend bekannt sind.

In dieser Arbeit wurden 11 orphane aGPCR hinsichtlich ihrer G-Protein-Kopplung,

Expression und autoproteolytischen Spaltung untersucht. Durch ortsgerichtete Mutagenese

und Testung synthetisierter Peptide wurde ein genereller Aktivierungsmechanismus der

aGPCR aufgedeckt. Bei diesen Untersuchungen wurden die folgenden wesentlichen

Ergebnisse erzielt:

Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten aGPCR tatsächlich an ihre

namensgebenden G-Proteine binden. Alle untersuchten Rezeptoren koppelten dabei an

Gs-Proteine.

72

Promiskuität in der G-Protein-Kopplung konnte für die aGPCR als ein relativ häufig

auftretendes Merkmal ausgemacht werden. Fünf von 11 untersuchten Rezeptoren binden

an mehr als nur eine G-Proteinfamilie. GPR115, GPR116 und GPR128 interagieren sogar

jeweils mit Gs-, Gq- und Gi-Proteinen.

Die in früheren Arbeiten diskutierte Hypothese eines gebundenen inversen Agonisten im

N-Terminus der aGPCR konnte in dieser Arbeit dank zahlreicher Mutagenesestudien in

vitro widerlegt werden. Stattdessen wird ein gebundener Agonist (sogenannte Stachel-

Sequenz) postuliert, welcher sich im N-Terminus des Rezeptors nach dem konservierten

Spaltungsmotiv befindet.

Es konnten Peptide analog der Aminosäuresequenz des vermuteten agonistischen

Bereiches der aGPCR synthetisiert und getestet werden. Dabei stellte sich heraus, dass

Peptid p16 spezifisch den GPR126 und dass Peptid p13 spezifisch den GPR133

aktivieren können. Die Hypothese des gebundenen Agonisten ist dadurch bestätigt

worden.

Mit einem Alaninscan wurde begonnen, die agonistische Kernsequenz des 16-

Aminosäurerest-langen Peptids p16 zu identifizieren. Während die erste Position im p16

bei erhaltener Rezeptoraktivierung gegen Alanin ausgetauscht werden konnte, schienen

die spezifischen Aminosäuren an den Positionen +2 bis +7 essentiell für die Funktion zu

sein. Es kann daher vermutet werden, dass die Positionen +2 bis +7 einen Teil der

agonistischen Kernsequenz darstellen.

EMR1, GPR97, GPR116, GPR126 sowie GPR133 zeigten das charakteristische cleavage

der aGPCR-Klasse. Für die acht weiteren untersuchten aGPCR konnte keine

autoproteolytische Spaltung nachgewiesen werden.

Es konnten übertragbare Positionen in der GPS-Domäne des GPR126 und GPR133

identifizieren werden, welche durch PCR-basierte Mutagenese der spezifischen

Aminosäure konstitutive Aktivität des Rezeptors bedingen. Es handelte sich dabei um

den Austausch hoch konservierter Cysteine gegen Serin. Die generierten

Rezeptormutanten versechsfachten das basale second messenger-Signal des Wildtyp-

Rezeptors bei leicht verminderter Oberflächenexpression.

Mit dieser Arbeit ist ein entscheidender Schritt in Richtung Deorphanisierung der aGPCR

erreicht worden. Die physiologische Bedeutung dieser Rezeptorgruppe ist jedoch bis heute

nur unvollständig verstanden. Weiterführende Untersuchungen sollten sich daher der

Bestätigung der agonistischen Stachel-Sequenz in vivo sowie der Identifizierung der Relevanz

der aGPCR im Organismus widmen.

73

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Genet 11, 96.

81

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfe

oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass

Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten

haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass

die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde zum Zwecke einer Promotion oder eines anderen

Prüfungsverfahren vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen

übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug

genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen

genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

……………………………… ……………………………..

Datum Unterschrift

82

Anlagen

Tab. S1 Zusammenstellung der zur Klonierung eingesetzten Accession numbers, Geweben und Primern

Rezeptor Accession number Gewebe Primer forward Primer reverse

Maus BAI2 IMAGE-ID:5705854 Gehirn ggcaagggacataggatgac ctggctcctggtagttccaa

Maus EMR1 NM_010130.4 Lunge gactccaccccttttcttcc tcctggagtttggttccatc

Maus GPR64

Isoform 4 NM_001079848.1 Hoden cacacggagtttcctcccta tcctttcgaggttgctgaat

Maus GPR97 NM_173036.3 Lunge gcaggaagaaggtcagttgg agaagacagtggagcccaga

Maus GPR111 NM_001033493.2 Gehirn caaagggaccagctgatgtt gccagcctgggatacataag

Maus GPR114

Isoform 1 NM_001145972.1 Gehirn ccatctcgagacagcagtga ccatgggctgttggaaatag

Maus GPR115 NM_030067.1 Herz ctatcactgaagggggctga ctcctggctggaagaagatg

Maus GPR116 NM_001081178.1 Herz aggacacgggttgtcagttc gcagagagagcacgttaccc

Maus GPR123 NM_177469.3 Lunge gagagaagaaccgaggctga tgttcttcccatgggttctt

Maus GPR124 NM_054044.2 Niere atgccggtgcctcccgcgcgtttg acagtaggggcaagcatctg

Human

GPR126 NM_001032395.2 Monozyt atgatgtttcgctcagatcgaatg ttaaaactttgtgctgtggctg

Maus GPR128 NM_172825.3 Lunge ctgttcgtgcagtgttttgg ggcacttgattttgcttggt

Human

GPR133 NM_198827 Monozyt acttggctccgagctttgac caaaggtggggcatttcatt

Tab S2 Primer zum Nachweis des GPR126 in COS-7 Zellen

Rezeptor Primer forward Primer reverse

GPR126 atcagagttgccgtgtcctt ggaaccacagcttaggttgc

ß-Aktin cgagaagatgacccagatcatg ggactccatgcccaggaag

83

Tab. S3 Zusammenstellung der untersuchten Rezeptormutationen

Konstrukt Deletierte

Aminosäuren

P2Y12 Aminosäurereste im

Konstrukt Andere Modifikationen

Human GPR133 (WT: 874 AS) - - -

Maus GPR133 (WT: 903 AS) - - -

Human GPR126 (WT: 1222 AS) - - -

Human GPR126 CS I - - C775S

Human GPR126 CS II - - C794S

Human GPR126 CS III - - C807S

Human GPR126 CS IV - - C809S

Maus GPR133 CS I - - C507S

Maus GPR133 CS II - - C524S

Maus GPR133 CS III - - C536S

Maus GPR133 CS IV - - C538S

Human GPR126-CTF 38-812 - -

Human GPR133-CTF 26-544 - -

Human GPR126 P2Y12-CTF 1-812 1-34 -

Human GPR133 P2Y12-CTF 1-544 1-34 -

Human GPR126 ΔGPS-CTF 38-824 - -

Human GPR133 ΔGPS-CTF 26-556 - -

Human GPR126 P2Y12-ΔGPS-CTF 1-824 1-34 -

Human GPR133 P2Y12-ΔGPS-CTF 1-556 1-34 -

Human GPR126 P2Y12-CTF-T 1-813 1-34 -

Human GPR126 P2Y12-CTF-TH 1-814 1-34 -

Human GPR126 P2Y12-CTF-THF 1-815 1-34 -

Human GPR126 P2Y12-CTF-THFG 1-816 1-34 -

Human GPR126 P2Y12-CTF-THFGV 1-817 1-34 -

Human GPR126 CTF-T813A 38-812 - T813A

Human GPR126 P2Y12-CTF-T813A 1-812 1-34 T813A

Human GPR126 CTF-H814A 38-812 H814A

Human GPR126 P2Y12-CTF-H814A 1-812 1-34 H814A

Human GPR126 CTF-F815A 38-812 - F815A

Human GPR126 P2Y12-CTF-F815A 1-812 1-34 F815A

Human GPR126 CTF-L818A 38-812 - L818A

Human GPR126 P2Y12-CTF-L818A 1-812 1-34 L818A

Human GPR126 CTF-M819A 38-812 - M819A

Human GPR126 P2Y12-CTF-M819A 1-812 1-34 M819A

Human GPR126 CTF-P822A 38-812 - P822A

Human GPR126 P2Y12-CTF-P822A 1-812 1-34 P822A

Human GPR133 CTF-T545A 26-544 - T545A

84

Human GPR133 P2Y12-CTF-T545A 1-544 1-34 T545A

Human GPR133 CTF-N546A 26-544 - N546A

Human GPR133 P2Y12-CTF-N546A 1-544 1-34 N546A

Human GPR133 CTF-F547A 26-544 - F547A

Human GPR133 P2Y12-CTF-F547A 1-544 1-34 F547A

Human GPR133 CTF-L550A 26-544 - L550A

Human GPR133 P2Y12-CTF-L550A 1-544 1-34 L550A

Human GPR133 CTF-M551A 26-544 - M551A

Human GPR133 P2Y12-CTF-M551A 1-544 1-34 M551A

Human GPR133 CTF-V554A 26-544 - V554A

Human GPR133 P2Y12-CTF-V554A 1-544 1-34 V554A

85

Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Julia Schön

Wohnort: Nonnenstraße 7

04229 Leipzig

E-Mail: julia_schoen@t-online.de

Telefon: 0170/5245680

Geburtsdatum: 03. September 1989

Geburtsort: Aschersleben

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulische Bildung:

2002 bis 2008 Gymnasium am Markt in Hettstedt,

Abschluss: Abitur (1,0)

2000 bis 2002 Sekundarschule „Einetal-Vorharz“ in

Welbsleben

1996 bis 2000 Grundschule „Einetal-Vorharz“ in Welbsleben

Hochschulbildung:

Seit 2011 Experimentelle Dissertation an der Universität

Leipzig, Institut für Biochemie inklusive 2

Freisemester (WS 2011/12 und SS 2012)

September 2010 Erfolgreiche Teilnahme am ersten Abschnitt

der Ärztlichen Prüfung (sehr gut (1,5))

Seit WS 2008/2009 Universität Leipzig

Studium der Humanmedizin

Sprachkenntnisse:

Englisch 8 Jahre Schulenglisch

Französisch 6 Jahre Schulfranzösisch

Latein Großes Latinum

86

Weitere medizinisch relevante Erfahrungen:

08.-09.2013 Famulatur Urologische Facharztpraxis Dr. Stefan Schmidt, Leipzig

07.-09.2012 Famulatur Universitätsklinikum Gondar, Äthiopien (Gynäkologische

Station)

07.-08.2011 Famulatur Herzzentrum Leipzig (Kardiologische Intensivstation)

06.-07.2009 Krankenpflegepraktikum St. Elisabeth Krankenhaus (Urologisch-

chirurgische Station)

02.-03.2009 Krankenpflegepraktikum Herzzentrum Leipzig (Chirurgische Station)

Seit 2010 staatlich anerkannte Ausbilderin für Erste-Hilfe und Mitglied der AG

EH-MED e.V. (studentische Arbeitsgemeinschaft für Erste Hilfe und

Notfallkunde für Medizinstudierende, gemeinnütziger Verein)

Stipendien:

2013 MD Pro 2 IFB Adipositas Erkrankungen (eigenes Forschungsprojekt)

2011 Promotionsstipendium der Universität Leipzig

87

Veröffentlichungen

Originalarbeiten

Ines Liebscher and Julia Schön, Liane Fischer, Sarah C. Petersen, Maxi Cöster, Kay-Uwe

Simon, Sven Rothemund, Kelly R. Monk and Torsten Schöneberg (2014). A Tethered

Agonist within the N Terminus Activates the Adhesion G protein-coupled Receptors GPR126

and GPR133 (under revision)

Poster

Julia Schön, Torsten Schöneberg and Ines Liebscher (2013) G protein-coupling of adhesion

GPCR Gordon Conference New Opportunities with G-protein Coupled Receptors: From

Single Molecules and Signaling Complexes to Physiology and Therapeutic Interventions.

April 28 - May 3, 2013, Lucca (Barga), Italy

Julia Schön and Liane Fischer, Franziska Rößler, Jens Bohnekamp, Torsten Schöneberg and

Ines Liebscher. G protein-coupling of Adhesion receptors. 11. Research Festival Leipzig

2012. December 14, 2012,

88

Danksagung

Auf dem Weg zur Promotion haben mich eine Vielzahl von Menschen begleitet und

unterstützt. Dafür möchte ich mich ich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für

Biochemie herzlichst bedanken.

Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg für stetig kritisches Hinterfragen,

wertvolle Hinweise und konstruktive Kritik, die Anlass und Ansporn für neue Experimente

waren.

Ein besonderes Wort des Dankes möchte ich an meine Betreuerin Frau Dr. med. Ines

Liebscher richten, die stets ein offenes Ohr für Ideen, Probleme und Anregungen hatte und

maßgeblich am Gelingen dieser Arbeit beteiligt war. Vielen Dank für die vielen für mich

geopferten Abende und Nächte, um Daten zu diskutieren sowie Schriftstücke und Poster zu

kontrollieren.

Ich möchte Kay-Uwe Simon und Susann Lautenschläger für ihren fachlichen Rat, die stets

aufmunternden Worte und die angenehme Arbeitsatmosphäre im Labor danken.

Weiterhin möchte ich mich bei Liane Fischer für ihre Unterstützung und Hilfe bei der

Ausführung von Experimenten und während des Schreibprozesses bedanken. Ich danke Felix

Kretschmer für seine Unterstützung in der statistischen Auswertung.

Ich danke Martin Buchold und Caroline Wilde für das gründliche und kritische Gegenlesen

dieser Arbeit.

Für die finanzielle Unterstützung während meiner Doktorarbeit möchte ich mich bei der

Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem IFB Adipositas Erkrankungen

Leipzig bedanken.

Und nicht zuletzt danke ich meinen Eltern, die in jeglicher Hinsicht die Grundsteine für

meinen Weg gelegt haben, stets an die Beendigung meiner Dissertation geglaubt haben und in

schwierigen Situationen mit den richtigen Worten für neue Hoffnung sorgten.