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Rechtliche
Molekulare Mechanismen der Chemorezeption trigeminaler Neurone von Säugetieren
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Jennifer Spehr
aus Essen
angefertigt am Lehrstuhl für Zellphysiologie,
Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt
Bochum, 2004
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG ................................................................................................................................................... 3
1.1 CHEMOSENSORIK - EIN ÜBERBLICK............................................................................................................... 3 1.2 TRIGEMINALES SYSTEM ................................................................................................................................ 5
1.2.1 Entwicklung und Anatomie ................................................................................................................... 5 1.2.2 Trigeminale Innervation der Nasenschleimhaut................................................................................... 8 1.2.2 Physiologische Funktion....................................................................................................................... 9
1.3 TRIGEMINAL-OLFAKTORISCHE INTERAKTION.............................................................................................. 12 1.4 BEREITS BESCHRIEBENE TRIGEMINALE REZEPTOREN .................................................................................. 14
1.4.1 TRP-Rezeptoren.................................................................................................................................. 14 1.4.2 Purinrezeptoren.................................................................................................................................. 15
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT .......................................................................................................................... 19
2. MATERIALIEN UND METHODEN ........................................................................................................... 20
2.1 VERWENDETE ZELLTYPEN .......................................................................................................................... 20 2.1.1 Primärkultur trigeminaler sensorischer Neurone .............................................................................. 20 2.1.2 Dissoziation olfaktorischer Rezeptorneurone..................................................................................... 21 2.1.3 Kultivierung von HEK293-Zellen ....................................................................................................... 21
2.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION DER HEK-ZELLEN NACH DER KALZIUMPHOSPHATMETHODE........................ 22 2.3 LÖSUNGEN UND PHARMAKA ....................................................................................................................... 23 2.4 PRINZIP DER „PATCH-CLAMP“-TECHNIK...................................................................................................... 25 2.5 VERSUCHSAUFBAU ZUR REGISTRIERUNG VON REZEPTORSTRÖMEN ........................................................... 29 2.6 BILDGEBENDE VERFAHREN......................................................................................................................... 31
2.6.1 Untersuchungen der intrazellulären Kalziumkonzentration
mittels des Fluoreszenzfarbstoffes Fura-2......................................................................................... 31 2.6.2 Untersuchungen der intrazellulären ATP-Konzentration
mittels des Fluoreszenzfarbstoffes Quinacrin.................................................................................... 33 2.6.3 Versuchsaufbau zur Detektion von intrazellulären Fluoreszenzänderungen ..................................... 34
2.7 APPLIKATION DER STIMULI ......................................................................................................................... 35 2.8 IMMUNHISTOCHEMIE................................................................................................................................... 37 2.9 ISOLIERUNG DER MRNA UND SYNTHESE DER CDNA.................................................................................. 39 2.10 POLYMERASEKETTENREAKTION................................................................................................................ 39
3 ERGEBNISSE .................................................................................................................................................. 40
3.1 KULTIVIERUNG TRIGEMINALER NEURONE .................................................................................................. 40 3.2 CHARAKTERISIERUNG DER KULTIVIERTEN TRIGEMINALEN NEURONE ANHAND IHRER P2X-REZEPTOR
EXPRESSION ................................................................................................................................................ 41 3.2.1 ATP induzierte Ströme........................................................................................................................ 41 3.2.2 Vergleich der elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronenpopulationen ............................. 45 3.2.3 Pharmakologische Charakterisierung der verschiedenen ATP-induzierten Ströme .......................... 47 3.2.4 Immunhistochemische P2X-Rezeptor Identifikation ........................................................................... 49
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2.5 Funktionelle dendritische P2X-Rezeptor Expression ......................................................................... 51 3.2.6 Vergleich nozizeptiver und nicht-nozizeptiver Neurone ..................................................................... 52
3.3 WIRKUNGEN VON DUFTSTOFFEN AUF TRIGEMINALE NEURONE .................................................................. 53 3.4 DER DUFTSTOFF BENZALDEHYD ALS TRIGEMINALER STIMULUS ................................................................ 54
3.4.1 Benzaldehyd Modulation purinerger Rezeptoren ............................................................................... 55 3.4.2 „Rezeptives Feld“ der P2X2-Rezeptor Modulation ............................................................................ 62
3.5 EINE MÖGLICHE ATP-QUELLE IM NASALEN EPITHEL.................................................................................. 65 3.6 DER DUFTSTOFF LINALOOL ALS TRIGEMINALER STIMULUS ........................................................................ 68
3.6.1 Spezifität des Linalool-Effektes........................................................................................................... 68 3.5.2 Vergleich der Linalool Aktivierbarkeit und der P2X-Rezeptor Expression........................................ 70 3.5.3 Charakterisierung der Linalool induzierten Antwort in trigeminalen Neuronen ............................... 70 3.5.3 TRPM8 als Linaloolrezeptor .............................................................................................................. 73 3.5.5 Pharmakologische Identifikation der trigeminalen Linaloolantwort ................................................. 75
4. DISKUSSION.................................................................................................................................................. 77
4.1 KULTIVIERUNG TRIGEMINALER NEURONE .................................................................................................. 77 4.2 KLASSIFIZIERUNG TRIGEMINALER NEURONE ANHAND IHRER P2X-REZEPTOR EXPRESSION ....................... 77
4.2.1 Elektrophysiologische Charakterisierung .......................................................................................... 77 4.2.2 Immunhistochemische Charakterisierung .......................................................................................... 80
4.3 PHYSIOLOGISCHE FUNKTION DER TRIGEMINALEN POPULATIONEN.............................................................. 81 4.3.1 Lokalisation der Purinrezeptoren....................................................................................................... 81 4.3.2 Nozizeptive Eigenschaften .................................................................................................................. 82 4.3.3 Modulation durch Duftstoffe............................................................................................................... 82
4.4 MÖGLICHE ATP-QUELLEN IM NASALEN EPITHEL ....................................................................................... 84 4.5 LINALOOL ALS TRIGEMINALER STIMULUS................................................................................................... 86
4.5.1 TRPM8 als Linaloolrezeptor .............................................................................................................. 87
5. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................................... 93
6. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................................................... 94
7. DANKSAGUNG............................................................................................................................................ 107
8. ANHANG....................................................................................................................................................... 108
8.1 LEBENSLAUF ............................................................................................................................................. 108 8.2 PUBLIKATIONEN........................................................................................................................................ 109
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
1. Einleitung
1.1 Chemosensorik - ein Überblick
Die erfolgreiche Anpassung eines Organismus an seine Umwelt hängt direkt von der
Entwicklung und Kapazität seiner sensorischen Systeme ab. Dabei leistet jede
Sinnesmodalität einen charakteristischen Beitrag zur Gesamtverarbeitung der sensorischen
Umweltinformation auf zentraler Ebene.
Chemosensorik umfasst bei Vertebraten den Geruchs-, den Geschmacks- und den allgemeinen
chemischen Sinn. Alle drei Systeme unterscheiden sich sowohl funktional als auch
anatomisch voneinander. Gemeinsam ist ihnen die Kopplung an chemische Substanzen als
stoffliche Überträger sowie die Weiterleitung der sensorische Information über bestimmte
Hirnnerven.
Der Geschmackssinn ist physiologisch gesehen der einfachste der chemischen Sinne, er lässt
sich auf fünf Basisqualitäten (süß, sauer, bitter, salzig und umami (Glutamatgeschmack))
reduzieren. „Schmecken“ im alltagssprachlichen Sinne ergibt sich meist aus der zeitgleichen
Aktivierung aller chemischen Sinne. Die Geschmackssinneszellen auf der Zunge sind
„knospenartig“ angeordnet und je 10 bis 50 individuelle Zellen bilden eine sogenannte
Geschmacksknospe. Diese Geschmacksknospen wiederum sind in den Geschmackspapillen,
die außerdem noch Stütz-, Versorgungs- und Basalzellen enthalten, lokalisiert. Die einzelnen
Sinneszellen können spezifisch für eine der genannten Qualitäten sein oder auch ein breites
sensorisches Spektrum aufweisen. Die chemischen Schlüsselreize der verschiedenen
Geschmacksqualitäten werden auf unterschiedliche Art in den Sinneszellen detektiert. Für die
Transduktion der Qualitäten „sauer“ und „salzig“ sind ionotrope Ionenkanälen, die direkt
Natriumionen (salzig) oder Protonen (sauer) leiten, verantwortlich. Hingegen aktivieren
Substanzen, die die Empfindungen „süß“, „bitter“ oder „Umami“ hervorrufen, spezifische
metabotrope Rezeptoren in den Sinneszellen. Bei den Geschmackssinneszellen handelt es sich
um sekundäre Sinneszellen, die hauptsächlich von den Hirnnerven N. glossopharyngeus und
N. facialis, teilweise auch vom N. vagus, innerviert werden.
Die Geruchswahrnehmung (Olfaktorik) erfolgt über primäre sensorische Neurone, die über
spezifische Rezeptorproteine flüchtige Duftmoleküle binden und somit detektieren können.
Die olfaktorischen Rezeptorneurone sind in hoher Dichte in einem sensorischen Epithel
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
(Regio olfactoria) lokalisiert, das speziesabhängig verschieden große Areale der Nasenhöhle
auskleidet. Die Axone dieser bipolaren Neurone bilden den ersten Hirnnerv, Nervus
olfactorius, und projizieren direkt in den olfaktorischen Bulbus. Die Sensitivität und
Diskriminationsfähigkeit des olfaktorischen Systems ist enorm. Sie versetzt Tiere in die Lage,
hunderttausende niedermolekulare, organische Substanzen zu identifizieren und einige
Tausend zu unterscheiden. Zum olfaktorischen Reizrepertoire gehören dabei u.a. aliphatische
und aromatische Moleküle geringen Molekulargewichts (< 400 Da) mit variablem
Kohlenstoffgerüst und diversen funktionellen Gruppen. Diese allgemein als Duftstoffe
bezeichneten Substanzen vermitteln biologisch relevante Umweltinformationen. So nutzen
Tiere den Geruchssinn u.a. zum Aufspüren ihrer Beute oder bei der Beurteilung der Qualität
potentieller Nahrung. Gleichzeitig können Düfte (Pheromone) auch der innerartlichen
Kommunikation dienen und das Verhalten bzw. den endokrinen Status (Hormonhaushalt)
eines Tieres beeinflussen.
Der allgemeine chemische Sinn wird vom fünften Hirnnerv, dem Nervus trigeminus gebildet.
Dieser Nerv innerviert den gesamten Gesichtsbereich und kann neben chemischen auch
mechanische, thermische und propriozeptive Stimuli detektieren. Primär dient trigeminale
Sensorik der Abwehr potentiell schädlicher Umwelteinflüsse. Trigeminal induzierte
Schutzreflexe sind z.B. Steigerung der Tränen-, Speichel- und/oder Nasenschleimsekretion,
Abnahme der Atemfrequenz bis zum Atemstillstand und der Lidschlussreflex. Trigeminale
Reize rufen Empfindungen wie kühl, frisch, brennend, warm, stechend, prickelnd oder süßlich
hervor. Für viele Säugetiere hat dieses System überlebenswichtige Funktionen, da es auch für
die taktile Umwelterkennung (Innervation der Schnurrhaare) sowie für die
Nahrungsaufnahme und die Lauterzeugung (motorische und propriozetive Innervation der
Kaumuskulatur) verantwortlich ist. Aufgrund seiner Chemosensitivität trägt das trigeminale
System außerdem zur Geschmacks- und Geruchsempfindung bei. Fast alle Duftstoffe besitzen
neben der olfaktorischen auch eine trigeminale Komponente, allerdings liegt die
Aktivierungsschwelle des trigeminalen Systems bei deutlich höheren
Duftstoffkonzentrationen.
Deshalb ist das trigeminale System in der Lage, bei pathologischen Störungen des
olfaktorischen Systems (Anosmien), ein reduziertes Riechvermögen aufrecht zu erhalten.
Die molekularen Mechanismen der Detektion chemischer Stimuli, vor allem die der
Duftstoffe, in den freien trigeminalen Nervenendigungen sind bislang weitgehend unbekannt.
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit den Mechanismen der Detektion von
Duftstoffen in trigeminalen Neuronen beschäftigt. Mit Hilfe elektrophysiologischer,
bildgebender und immunhistochemischer Verfahren konnten beteiligte Rezeptorproteine und
Signalwege identifiziert werden. Die Charakterisierung dieser Rezeptoren wurde in
kultivierten trigeminalen Neuronen und nach heterologer Expression in humanen
embryonalen Nierenzellen (HEK293) vorgenommen.
1.2 Trigeminales System
1.2.1 Entwicklung und Anatomie
Der Nervus trigeminus wird den Branchialnerven (auch: N. terminalis, N. facialis, N.
glossopharyngeus und N. vagus) zugeordnet. Seine Faserzusammensetzung gleicht der der
dorsalen Wurzeln der Spinalnerven: sie enthalten sensible wie auch motorische Fasern.
Allerdings sind die genannten Branchialnerven als kiemenversorgende Nerven entsprechend
der Metamerie der Kiemen segmental angeordnet. Bei den meisten Vertebraten spaltet sich
der N. trigeminus in drei Hauptäste auf (synonym „der Dreifache“). Nur bei niederen
Vertebraten ist der erste Ast, der N. ophthalmicus, noch ein eigenständiger Nerv, der eine
Kiemenspalte versorgte, die bei der Entwicklung der Kiefer bzw. bei der Vergrößerung der
Mundöffnung verloren ging. Bei höheren Vertebraten ist dieser Augenast dem N. trigeminus
angeschlossen und versorgt den oberen Gesichtsbereich. Er führt ausschließlich sensorische
Fasern. Der eigentliche N. trigeminus gliedert sich in zwei Hauptäste, den N. maxillaris
(Oberkieferast) und den N. mandibularis (Unterkieferast). Beide Äste waren ursprünglich der
zweiten Kiemenspalte zugeordnet, die ebenso wie die erste bei der Kieferbildung verloren
ging. Der N. maxillaris enthält ebenso wie der N. ophthalmicus ausschließlich sensorische
Fasern, der N. mandibularis hingegen führt sensorische und motorische Fasern (zur Übersicht
siehe Romer und Parsons, 1991, Vergleichende Anatomie der Wirbeltiere).
Entsprechend seiner Entwicklung sind die Strukturen, die sich von den ersten Kiemenbögen
ableiten, Zielgebiete trigeminaler Innervation. Afferente trigeminale Fasern liefern
sensorische Informationen von der Gesichtshaut, den Schnurrhaaren, von Teilen der Hirnhaut,
dem Trommelfell, den Lippen, dem Zahnfleisch, den Zähnen, dem Kiefergelenk sowie den
Schleimhäuten von Augen, Mund und Nase. Motorische trigeminale Fasern innervieren die
Kaumuskulatur, einige Muskeln des Gaumens, des Innenohrs, den Kieferzungenbeinmuskel
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
sowie den oberen Bauch des Unterkiefermuskels. In peripherer Richtung spalten sich die
trigeminalen Fasern wiederholt auf und bilden ein fein verzweigtes Netz. In den jeweiligen
Zielgebieten enden die trigeminalen Fasern als freie Nervenendigungen (Abb.1.1a).
Die pseudounipolaren Somata der meisten sensorischen Fasern sind im bilateralen Ganglion
gasseri (trigeminales Ganglion) lokalisiert. Die beiden Ganglien befindet sich in zwei
Schädelgruben (Cava Meckeli) am Boden des Schädels ventral der Pons. Eine ihnen
aufliegende Dura trennt sie vom zentralen Nervensystem. Die Somata der propriozeptiven
trigeminalen Neurone, die Informationen über die Kaumuskulatur liefern, befinden sich in
einem ausgelagerten Kerngebiet, dem Nucleus trigeminalis mesencephalis. Obwohl dieser
Nucleus im Mittelhirn zu finden ist, handelt es sich bei den Neuronen nicht um zentrale,
sondern vielmehr um ausgewanderte Neurone des trigeminalen Ganglions. Die
propriozeptiven Neurone kontaktieren trigeminale Motoneurone, deren Somata im Nucleus
trigeminalis motorius lokalisiert sind, und bilden einen monosynaptischen Reflexbogen zur
Kontrolle der Kieferbewegung.
Die erste synaptische Verschaltung der sensorischen Neurone, deren Somata im ipsilateralen
trigeminalen Ganglion lokalisiert sind, findet im spinalen (Nucleus spinalis nervi trigemini)
und im prinzipalen sensorischen Trigeminuskern (Nucleus sensorius principalis) statt. Die
topographische Ordnung der Peripherie bleibt in diesen trigeminalen Kerngebieten des
Stammhirns erhalten. Die Neurone zweiter Ordnung ziehen zum thalamischen Kerngebiet
Nucleus ventralis posteromedialis (VPM), die meisten Fasern kreuzen zur kontralateralen
Seite. Es gibt jedoch auch einige Fasern, die ähnlich dem olfaktorischen System (Doty et al.,
1997), zur ipsilateralen Seite ziehen (Barnett et al., 1995). Vom Thalamus werden die
Informationen zum primären somatosensorischen Kortex weitergeleitet (Abb.1.1b) (zur
Übersicht siehe Kandel, Schwartz, Jessell, 2000, Principles of Neural Science). Außerdem
existieren Hinweise, dass trigeminale Stimulation auch den sekundären somatosensorischen
Kortex aktiviert (Chudler et al., 1985; Huttunen et al., 1986). Außerdem führt trigeminale
Stimulation zu Aktivität im Inselkortex (Kettenmann et al., 1996) und dem ventralen orbitalen
Kortex (Snow et al, 1992; Hummel et al., 1997) mit stärkerer rechtsseitiger Aktivität bei
bilateraler Stimulation. Diese Gebiete sind auch bei der Verarbeitung olfaktorischer
Informationen involviert. Dabei ist ebenfalls die rechte Hirnhemisphäre stärker beteiligt
(Zatorre et al., 1992; Jones-Gotman et al., 1993; Hummel et al., 1995; Olsson et al., 1996;
Yousem et al., 1999).
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
a b
aus: Zilles und Rehkämper, 1998, Funktionelle Neuroanatomie
Abb.1.1: Anatomie des Nervus Trigeminus a: Schematische Darstellung der trigeminalen Innervation der Peripherie. Ausgehend von Ganglion gasseri am Boden des Schädels (gelb gefärbt), in dem die Somata der trigeminalen Neurone lokalisiert sind, ziehen die drei Hauptäste des fünften Hirnnervs in die Peripherie, in der sie sich wiederholt aufspalten und als freie Nervenendigungen terminieren. Blau eingefärbt sind die sensorischen Fasern, die orangenen Fasern stellen den Anteil der motorischen trigeminalen Fasern dar, deren Somata nicht im Ganglion gasseri zu finden sind. b: Schematische Darstellung der zentralen Verschaltung des trigeminalen Systems Blaue und rote Fasern sind sensorische Fasern, orange sind auch hier die motorischen trigeminalen Fasern, deren Somata im zentralen Nucleus motorius n.V. zu finden sind.
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
1.2.2 Trigeminale Innervation der Nasenschleimhaut
Im Focus der vorliegenden Arbeit steht die trigeminale Innervation der Nasenschleimhaut.
Sowohl das respiratorische als auch das olfaktorische Epithel werden von zwei Ästen des N.
trigeminus innerviert: N. ethmoidalis (von N. ophthalmicus) und N. nasopalatinus (von N.
maxillaris), wobei sowohl frühe psychophysische (von Skramlick, 1926), als auch aktuellere
elektrophysiologische (Hummel et al., 1996) Daten darauf hinweisen, dass eine erhöhte
trigeminale Chemosensitivität im anterioren Drittel der Nasenhöhle zu finden ist.
Das olfaktorische Epithel der Säugetiere ist sehr einfach strukturiert und wird hauptsächlich
von drei Zelltypen, olfaktorischen Rezeptorneuronen, Stützzellen und Basalzellen, gebildet.
Der unverzweigte apikale Dendrit der olfaktorischen Rezeptorneurone reicht bis an die
Epitheloberfläche heran und trägt terminal ca. 20 bis 30 feine Zilien, die in eine dünne, das
olfaktorische Epithel vollständig bedeckende Schleimschicht (Mucus) eingebettet sind
(Farbman, 2000). Die Zilien sind der Ort der Duft-Rezeptor-Interaktion und beherbergen alle
Komponenten der olfaktorischen Signaltransduktionsmaschinerie (Firestein, 2001). Der
Mucus wird von den Bowmann’schen Drüsen sezerniert und bei Säugetieren von den
Stützzellen in seiner Zusammensetzung modifiziert. Die Schleimschicht wird von der
interstitiellen Flüssigkeit des Epithels durch eine dichte „tight-junction“-Barriere getrennt.
Die intraepithelialen trigeminalen Fasern verlaufen parallel zur Basallamina und senden von
dort sich wiederholt aufspaltende Fortsätze in Richtung der Epitheloberfläche. Die Fortsätze
terminieren als freien Nervenendigungen einige Mikrometer unterhalb der Oberfläche im
Bereich der tight-junction Barriere. Damit reichen sie, im Gegensatz zu den olfaktorischen
Rezeptorneuronen, nicht in den Mucus hinein und haben keinen direkten Kontakt zur
Außenwelt. Innerhalb des Epithels sind trigeminale Fasern direkt neben olfaktorischen
Rezeptorneuronen, Stütz- und Basalzellen, aber auch nasalen Drüsen und Blutgefäßen
lokalisiert (Abb.1.2; Finger et al., 1990; Finger et al., 1993). Zudem wurden auch trigeminale
Kollaterale im olfaktorischen Nerv und im Bulbus olfaktorius, der ersten synaptischen
Verschaltungsstelle des olfaktorischen Systems, gefunden (Finger et al., 1993; Schaefer et al.,
2002). Einige dieser Nervenfasern entsenden sowohl Kollaterale in die Nasenschleimhaut als
auch in den Bulbus olfaktorius. Dieses Innervationsmuster bietet die anatomische Grundlage
für eine enge Interaktion zwischen dem trigeminalen und dem olfaktorischen System.
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
a bGangliongasseri
N. nasociliaris Nn. ciliaris longi
N. ethmoidalis
N. naso-palatinus
N. pala-tinus minor
N. lingualis
N.mandi-bularis N.
maxillaris
N. ophthalmicus
aus: Silver und Finger, 1991, The Trigeminal System, in Smell and Taste in Health and Disease, Getchell et al. (eds) Abb.1.2: Trigeminale Innervation des Nasenepithels a: Das nasale Epithel wird von zweien der drei Hauptästen des N. trigeminus innerviert. Der Ethmoidnerv gehört zum ophthalmischen Ast, der nasopalatine Nerv wird dem Mandibularast zugerechnet. b: Das Riechepithel wird durch sich wiederholt verzweigende trigeminale Fasern innerviert. Die freien Nervenendigungen enden nahe der olfaktorischen Rezeptorzellen, den Stützzellen, den Basalzellen, den nasalen Drüsen und den Blutgefäßen. Die gezeigte Faser zieht zentral über das Ganglion gasseri Richtung Hirnstamm, vorher zweigt noch eine Kollaterale Richtung Bulbus olfaktorius ab.
1.2.2 Physiologische Funktion
Die Hauptaufgabe des trigeminalen Systems besteht darin, potentiell schädliche
Umwelteinflüsse zu detektieren und den Organismus davor zu schützen. Typische trigeminal
vermittelte Reflexe sind z.B. die Steigerung der Nasenschleim- oder Tränenproduktion (etwa
durch scharfes Essen, Zwiebeln schneiden) und der kurzzeitige Abbruch der Atemtätigkeit
(z.B. durch einatmen von Essigsäure). Vielfach induzieren trigeminale Reizsubstanzen auch
Schmerzempfinden, das wiederum im Allgemeinen zur Vermeidung des Reizes dient.
Trigeminale Neurone sind zur Detektion dieser Umwelteinflüsse mit verschiedenen
Rezeptoren ausgestattet. Sie verfügen über Mechano- (inkl. Proprio-), Thermo-, und
Chemorezeptoren. Es scheint im trigeminalen System polymodale Neurone zu geben,
allerdings deuten viele experimentelle Hinweise auf trigeminale Subklassen mit
unterschiedlichen sensorischen Eigenschaften und Rezeptorausstattung hin (z.B. Sekizawa
und Tsubone, 1994; Liu und Simon, 1996; Liu et al., 1998; Caterina et al., 1997; Hummel et
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
al., 1998; Alimohammadi und Silver, 2000; McKemy et al., 2002). Unterscheidungsmerkmale
der trigeminalen Fasern sind ihr Durchmesser und ihre Myelinisierung. Im nasalen Epithel
wurden zwei verschiedene Fasertypen beschrieben, unmyelinisierte C-Fasern und
myelinisierte Aδ-Fasern (Anton und Peppel, 1991; Sekizawa und Tsubone, 1994). Allerdings
konnte bislang keine eindeutige Funktionszuordnung vorgenommen werden. C-Fasern
scheinen in die Vermittlung langanhaltender, brennender, schmerzhafter Empfindungen
involviert zu sein (Sinclair und Hinshaw, 1950; Mackenzie et al., 1975; Torebjörk und Hallin,
1973 und 1974), während Aδ-Fasern kurze, scharfe und stechende Empfindungen vermitteln
(Torebjörk und Hallin, 1973 und 1974; Mackenzie et al., 1975). Die unterschiedlichen
Empfindungen können jedoch konzentrationsabhängig auch von demselben Stimulus
hervorgerufen werden (Hummel und Kobal, 1992).
Die Fähigkeit des trigeminalen Systems chemische Stimuli detektieren zu können, schließt die
Perzeption der meisten Duftstoffe ein (Silver und Moulton, 1982). Als rein olfaktorische
Düfte ohne trigeminale Komponente werden nur Vanillin und H2S beschrieben. Zahlreiche
Versuche mit Tieren, deren olfaktorisches System lesioniert wurde, sowie mit anosmischen
Menschen, deren olfaktorisches System nicht funktionsfähig ist (angeboren oder erworben),
belegen die trigeminale Fähigkeit zur Duftdetektion und -diskrimination (z.B. Doty et al.,
1978; Mason und Silver, 1983; Walker et al., 1986; Silver et al., 1988; Cometto-Muniz et al.,
1997; Laska et al., 1997; Kendal-Reed et al., 1998). Darüber hinaus ist es möglich,
Reaktionen auf Duftstoffe vom respiratorischen Epithel, das zwar eine trigeminale
Innervation aber keine olfaktorischen Sinneszellen aufweist, abzuleiten (Kobal, 1981). Die
Untersuchungsobjekte sind in der Lage, aufgrund unterschiedlicher trigeminaler
Empfindungen grob zwischen verschiedenen Duftstoffklassen zu unterscheiden (Laska,
1997). Diese Beobachtung belegt, dass auch das trigeminale System über spezialisierte
Mechanismen zur Unterscheidung von Duftstoffen verfügt. Typische trigeminale
Empfindungen sind z.B. kühl, frisch, stechend, schmerzhaft, warm, brennend, prickelnd und
süßlich. Anhand der von Duftstoffen ausgelösten trigeminalen Empfindungen kann allerdings
gezeigt werden, dass das trigeminale System nicht die extrem hohe Diskriminationsfähigkeit
des olfaktorischen Systems aufweist.
Ein Merkmal wirksamer trigeminaler Stimuli ist deren Lipidlöslichkeit. Dies macht,
angesichts der Lage der trigeminalen Nervenendigungen im Epithel, ein Erreichen der
Terminalien erst möglich. Mit sinkender Lipidlöslichkeit nimmt auch die trigeminale
Wirksamkeit chemischer Stimuli ab (Cometto-Muniz et al., 1998a).
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Einige Strukturmerkmale trigeminaler Stimuli weisen auf spezifische Detektionsmechanismen
hin. Zyklische Strukturen erhöhen beispielsweise die trigeminale Wirksamkeit. Die Effizienz
trigeminaler Stimuli, die eine Kohlenstoffkette enthalten, nimmt mit steigender Länge dieser
Kohlenstoffkette zu. Allerdings kommt es bei Überschreiten einer gewissen Länge zu einem
abrupten Verlust der Wirksamkeit, einem sogenannten „cut-off“ (Silver et al., 1986; Cometto-
Muniz et al., 1998a).
Die Sensitivität der trigeminalen Duftdetektion unterscheidet sich deutlich von der
olfaktorischen Duftwahrnehmung. Die Latenz trigeminaler Antworten ist immer deutlich
länger als die olfaktorischer Antworten (Cain, 1976). Ebenso liegt die trigeminale
Wahrnehmungsschwelle immer deutlich über der olfaktorischen (in elektrophysiologischen
Untersuchungen 5 bis 45-fach, Silver et al., 1988; zur Übersicht siehe Green et al., 1991).
Allerdings nimmt die empfundene Intensität bei steigender Reizkonzentration trigeminaler
Stimuli schneller zu als bei steigender Reizkonzentration olfaktorischer Stimuli (Cain et al.,
1976; Cain und Murphy, 1980; Cometto-Muniz et al., 1990). Außerdem kommt es zu einer
zeitlichen Summation der trigeminalen Reizintensität während des Einatmens, ein Phänomen,
das bei primär olfaktorischen Stimuli nicht beobachtet werden kann (Cometto-Muniz und
Cain, 1984). Die Intensität des wahrgenommenen trigeminalen Reizes steigt mit wiederholter
Stimulation (Cometto-Muniz und Cain, 1984) bei nur langsam eintretender Adaptation (Cain,
1974). Die beschriebenen Eigenschaften der trigeminalen Duftstoffperzeption unterscheiden
sie deutlich von der olfaktorischen Wahrnehmung. Auch in der Perzeption komplexer Stimuli
gibt es einen deutlichen Unterschied. Während die Intensität der olfaktorischen Komponente
eines binären Duftmixes hypoadditiv zu sein scheint (die empfundene Intensität ist geringer
als die Summe der Komponenten), ruft die trigeminale Komponente eine additive oder sogar
hyperadditive Empfindung hervor (Comett-Muniz et al., 1990). Während die Erforschung der
molekularen Mechanismen der Dufterkennung im olfaktorischen System in den letzten Jahren
weitreichende Erkenntnisse geliefert hat, sind die molekularen Grundlagen trigeminaler
Duftstoff Detektion bislang ungeklärt.
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Chemoperzeption trigeminaler Neurone
1.3 Trigeminal-olfaktorische Interaktion
Neben ihrer afferenten sensorischen Funktion können trigeminale Neurone auch als
Effektoren dienen (Holzer, 1988; Maggi und Meli, 1988). Capsaicin-sensitive trigeminale
Fasern enthalten Neuropeptide wie Substanz P, Tachikinin oder CGRP (calcitonin-gene-
related peptide), die bei Stimulation an vier möglichen Orten freigesetzt werden können:
direkt am Stimulationsort, an peripheren, kollateralen oder zentralen Terminalien (Maggi und
Meli, 1988). Die Freisetzung der Neuropeptide an peripheren oder kollateralen Terminalien
wird als Axonreflex bezeichnet. Die freigesetzten Neuropeptide können vielfältige Wirkungen
haben. Stimulation trigeminaler peptiderger Fasern im Auge führt über Freisetzung von
Substanz P zu einer Kontraktion der Pupille (Stjernschantz et al., 1981). CGRP-Freisetzung
hingegen erhöht den Augendruck und führt zum Zusammenbruch der Blut-Wasser-Schranke
(Wahlestedt et al., 1986; Unger et al., 1985). Eine efferente Rolle wird ebenfalls den
peptidergen, Capsaicin-sensitiven Fasern in der Nasenschleimhaut zugeschrieben (Silverman
und Kruger, 1989; Papka und Matulionis, 1983). Die räumliche Nähe der olfaktorischen
Sinneszellen und der trigeminalen Nervenendigungen führt zu Spekulationen über eine
mögliche Beeinflussung der Riechwahrnehmung durch von trigeminalen Fasern freigesetzten
Neuropeptide. Tatsächlich konnte psychophysisch eine inhibitorische Interaktion zwischen
beiden Systemen gezeigt werden. Dabei wird ein Duftstoff in bestimmter Konzentration als
weniger intensiv empfunden, wenn ein trigeminaler Stimulus direkt vor diesem Duft oder
gleichzeitig angeboten wird (Cain und Murphy, 1980; Kobal und Hummel, 1988).
Auf peripherer zellulärer Ebene ist eine Vielzahl potentieller Interaktionsmechanismen
zwischen trigeminalem und olfaktorischem System vorstellbar.
Die stimulationsabhängig freigesetzten Neuropeptide der trigeminalen Terminalien könnten
direkt die olfaktorischen Rezeptorneurone beeinflussen und ihre Aktivität modulieren (Lewis
et al., 1937; Holley et al., 1991; Raja et al., 1999). Applikation von Substanz P auf das
olfaktorische Epithel induziert transepitheliale und Einzelzellantworten, die eine Duft
induzierte Aktivität widerspiegeln (Bouvet et al., 1987; Bouvet et al., 1988; Getchell et al.,
1989). Interessanterweise wird die duftinduzierte Antwort olfaktorischer Rezeptorneurone
durch elektrische Stimulation des Nervus ophthalmicus oder lokale Substanz P Applikation
reduziert (Bouvet et al., 1988). Freigesetzte Neuropeptide könnten die Flimmerzellen zu einer
erhöhten ziliären Aktivität treiben, um somit den Mucus inklusive der Duftmoleküle schneller
abzutransportieren (Lindberg et al., 1987). Eine Beeinflussung der Drüsen und der
sezernierenden Zellen könnte die Produktion des Nasenschleims erhöhen und/oder die
12
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Zusammensetzung des Mucus verändern (Getchell et al., 1989). Das Turn-over oder die
Differenzierung der Basalzellen könnte durch die Neuropeptide verändert werden (Lindner
und Grosse, 1981). Auch die Durchblutung der Nasenschleimhaut und damit die
Luftdurchgängigkeit der Nase könnten direkt über die Blutgefäße oder indirekt über die
parasympathische Innervation der Nasenschleimhaut beeinflusst werden (Lundblad et al.,
1983). Eine weitere Möglichkeit der Interaktion von olfaktorischem und trigeminalem System
ergibt sich durch die trigeminalen Kollateralen, die mit dem Riechnerv in den Bulbus
olfaktorius ziehen. Somit könnte eine Aktivierung der trigeminalen Fasern in der
Riechschleimhaut ohne Zwischenverschaltung in höheren Hirnregionen die Aktivität im
Bulbus olfaktorius modulieren. Bereits 1969 wurde eine solche Modulation postuliert (Stone,
1969).
Neben den potentiellen Möglichkeiten der peripheren Interaktion, besteht auch die
Möglichkeit einer zentralen Interaktion beider Systeme (speziell vor dem Hintergrund der z.T.
überlappenden Projektionsgebiete). Beispielsweise führt eine Blockade des trigeminalen
Systems zu einer Steigerung der duftinduzierten Aktivität im Thalamus der Ratte (Inokuchi et
al., 1993).
Livermore und Mitarbeiter (1992) haben mit Hilfe dreier Stimuli die wohl ausführlichste
Interaktionsstudie durchgeführt. Mit CO2, H2S und Carvon untersuchten die Autoren einen
rein trigeminalen, einen rein olfaktorischen und einen Mischreiz. Die Studie zeigt, dass bei
gleicher Einzelintensität der Stimuli die Intensität des olfaktorischen Reizes bei gleichzeitiger
Gabe des trigeminalen Reizes vermindert wird. Bei gleichzeitiger Darbietung der Einzelreize
mit dem Mischreiz wird sowohl die empfundene Intensität des trigeminalen als auch des
olfaktorischen Reizes durch die Intensität des Mischreizes abgeschwächt. Dies belegt die
trigeminale Dominanz gegenüber dem olfaktorischen System. Auch wird eine gleichzeitige
Aktivierung beider Systeme stärker empfunden als die Aktivierung eines Einzelsystems.
Insgesamt wird deutlich, dass die trigeminal-olfaktorische Interaktionen keineswegs einfach,
linear und vorhersehbar sind und starken Einfluß auf die Duftwahrnehmung haben.
13
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
1.4 Bereits beschriebene trigeminale Rezeptoren
Obwohl bislang das Vorkommen von spezialisierten Duftstoffrezeptorproteinen, wie sie in
olfaktorischen Sinneszellen gefunden wurden, nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen
zahlreiche Untersuchungen, dass periphere trigeminale Neurone über eine Vielzahl von
anderen Chemorezeptoren verfügen. Einige der beschriebenen Rezeptoren sind typische
Transmitter-aktivierte Rezeptoren wie Acetylcholin- (Liu et al., 1993; Keiger und Walker,
2000), GABA- (Durkin et al., 1999) Serotonin- (Bonaventure et al., 1998), Glutamat- (Gu et
al., 1994; Ohishi et al., 1995) und Purinrezeptoren (Xiang et al., 1998), aber auch Opioid-
(Zhu et al., 1998), Interleukin- (Jelaso et al., 1998) und Prolactinrezeptoren (Royster et al.,
1995). In der vorliegenden Arbeit habe ich mich insbesondere mit der Duftstoffaktivierung
und -modulation von trigeminal exprimierten Purinrezeptoren sowie ebenfalls trigeminal
exprimierten TRP-Rezeptoren beschäftigt.
1.4.1 TRP-Rezeptoren
Besondere Aufmerksamkeit fanden in den letzten Jahren Mitglieder der sogenannten TRP-
Kanal Superfamilie (transient receptor potential), die in trigemalen Neuronen in bestimmten
Temperaturbereichen, und z. T. auch von chemischen Stimuli aktiviert werden können. Als
erstes wurde der TRPV1 (oder VR1, Vanilloid-Rezeptor-1) als Hitze- (> 43 ºC) und
Capsaicin-sensitiver Kanal beschrieben (Caterina et al., 1997). Capsaicin, ein Extrakt aus der
Chilischote, vermittelt über Aktivierung der TRPV1 Kanäle der trigeminalen Fasern in der
Mundschleimhaut die bekannte „Chili-Schärfe“ (engl. hot). Neue Erkenntnisse zeigen, dass
der häufig in der Zahnmedizin als Antiseptikum verwendete Duftstoff Eugenol (Nelkenöl)
ebenfalls den TRPV1-Rezeptor aktiviert (Yang et al., 2003). Der TRPV1-Rezeptor ist zudem
sensitiv gegenüber pH-Wert Änderungen. Eine Senkung des pH-Wertes, die eine
Entzündungsreaktion im Gewebe widerspiegelt, potenziert den Rezeptorstrom. Allerdings
werden auch die direkt von Protonen aktivierten sogenannten ASIC-Kanäle (acid sensing ion
channels) in trigeminalen Neuronen exprimiert (Lingueglia et al., 1997; Olson et al., 1998).
Ein weiterer temperatur- und chemosensitiver TRP-Kanal wurde kürzlich entdeckt (McKemy
et al., 2002; Peier et al., 2002). Der TRPM8 (oder CMR 1, cold and menthol receptor 1) wird
von einer Subpopulation trigeminaler Neurone exprimiert und in niedrigen
Temperaturbereichen (< 22 ºC) oder kühlend wirkende Substanzen wie Menthol aktiviert.
14
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Das erste Mitglied der TRP-Kanal Superfamilie wurde in den Photorezeptorzellen von
Drosophila identifiziert (Minke et al., 1975). Fliegen mit defektem trp-Gen fehlt bei
anhaltender Photooexposition die charakteristische Plateauphase der Lichtantwort.
Mittlerweile sind bei Säugetieren mehr als 20 Gene mit klarer Homologie zum trp-Gen von
D. melanogaster identifiziert worden (Clapham et al., 2001). Gemeinsam ist den Mitgliedern
der Säugetier TRP-Kanal Familie in erster Linie eine strukturelle Homologie der
Transmembrandomänen, die komplette Sequenz kann allerdings große Abweichungen
aufweisen. Gemeinsam sind ihnen auch die Topologie mit 6 α-helikalen, putativen
Transmembrandomänen, die wahrscheinlich porenbildende hydrophobe Schleife zwischen
den Transmembrandomänen 5 und 6 sowie die intrazellulär lokalisierten C- und N-termini.
Die TRP-Kanal Familie wird in drei Unterfamilien geteilt: TRPC (kurzer Typ), TRPV
(vanilloid Typ) und TRPM (langer Typ) (Clapham et al., 2001). Die N-terminale
cytoplasmatische Domäne der TRPC- und TRPV-Kanäle enthält wiederholte Ankyrin-
Domänen, während die C-Termini der TRPC- und der TRPM-Kanäle Prolinreiche Regionen
aufweisen. Interessanterweise gehören TRPV1 und TRPM8 trotz der funktionellen
Gemeinsamkeiten nicht derselben Unterfamilie an. Aktivierung induziert bei beiden TRP-
Ionenkanälen, wie in fast allen charakterisierten TRP-Kanälen, einen nichtselektiven
Kationenstrom mit einer Präferenz für Kalziumionen, der sich auswärtsgleichrichtend verhält.
1.4.2 Purinrezeptoren
Aktuelle Studien des olfaktorischen und trigeminalen Systems von Säugetieren verweisen auf
eine weitere interessante Rezeptorgruppe, die Purinrezeptoren. Deren ATP-abhängige
Aktivierung in olfaktorischen Rezeptorneuronen moduliert die Duft-Sensitivität dieser
Neurone (Hegg et al., 2003). Auch in trigeminalen Neuronen bestimmter Funktion konnten
schon zwei Typen ATP-induzierter Ströme mit spezifischer Desensitisierungkinetik gemessen
werden (Cook et al., 1997). In der zitierten Arbeit werden die untersuchten trigeminalen
Neurone als reine Schmerzfasern (nozizeptiv) eingestuft, da sie ausschließlich die Zähne
innervieren und dort alle Reizungen Schmerz induzieren. Ein potentiell funktioneller
Zusammenhang zwischen der Expression bestimmter P2X-Rezeptor Subtypen und den
nozizeptiven Eigenschaften der Neurone wird dadurch gestärkt, dass andere sensorische
trigeminale Neurone, die von den Autoren als nicht-nozizeptiv beschrieben werden, wiederum
andere P2X-Rezeptor Subtypen exprimieren. Bei dieser letzteren Unterklasse trigeminaler
Neurone handelt es sich höchstwahrscheinlich um propriozeptive Neurone, da nach
Farbinjektion in die Kaumuskulatur die gefärbten Neurone im mesencephalischen
15
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
trigeminalen Kerngebiet zu lokalisieren sind. Diese Experimente weisen darauf hin, dass die
Expression von P2X-Rezeptoren in direktem Zusammenhang mit den
Detektionseigenschaften der trigeminalen Neurone stehen könnte. Unklar ist bislang die
Expression von Purinrezeptoren in nicht-nozizeptiven Neuronen des trigeminalen Ganglions.
Ebenso wenig konnte bislang eine spezifische Rolle von ATP in der Duftwahrnehmung des
olfaktorischen und des trigeminalen Systems definiert werden.
Eine Rolle von ATP und trigeminalen Purinrezeptoren wird für die Signalübermittlung der
kürzlich beschriebenen „einzelnen chemosensitiven Zellen“ (engl. solitary chemosensory
cells) im respiratorischen Epithel der Nase diskutiert. Bei diesen Zellen handelt es sich
sekundäre Sinneszellen, die von trigeminalen Fasern innerviert werden. Eine Aktivierung der
der Sinneszellen durch Bittersubstanzen wie Quinine oder Cycloheximid wird von den
trigeminalen Fasern abgegriffen (Finger et al., 2003). Der dabei genutzte Transmitter ist
bislang unbekannt. Da aber diese chemosensitiven Zellen viele Moleküle der
Signaltransduktion, die auch in Bittergeschmackssinneszellen vorhanden sind, exprimieren,
könnten auch sie ATP als Transmitter nutzen wie es für die Geschmackszellen postuliert wird
(Bo et al., 1999).
Generell kann der Neurotransmitter bzw. Neuromodulator ATP metabotrope P2Y- oder
ionotrope P2X-Rezeptoren aktivieren. Bislang sind bei Säugetieren sieben verschiedene P2X-
Rezeptoruntereinheiten (P2X1-7) identifiziert, kloniert und funktional charakterisiert worden
(North und Barnard 1997; Ralevic und Burnstock 1998). P2X-Rezeptoren bilden homo- oder
heterooligomere Komplexe, deren Stöchiometrie bislang unklar ist. Wahrscheinlich setzen
sich aus drei (Nicke et al., 1998; Stoop et al., 1999) oder vier Untereinheiten zusammen (Kim
et al., 1997; Ding & Sachs 2000). Allen P2X-Untereinheiten gemeinsam sind zwei
Transmembrandomänen, intrazelluläre C- und N-Termini sowie eine große extrazelluläre
Schleife mit konservierten Cysteinresten. Wie auch die bereits beschriebenen TRP-Kanäle
TRPM8 und TRPV1 weisen P2X-Rezeptoren eine unspezifische Kationenleitfähigkeit auf
(Review siehe Dunn et al., 2001).
In verschiedenen Typen sensorischer Neurone (Neurone des Hinterwurzelganglions, des
Ganglions trigeminale und des Ganglions nodosum) wurden nur die Transkripte der
Untereinheiten 1-6 gefunden (Chen et al., 1995; Collo et al., 1996; Cook et al., 1997).
Immunhistochemische Studien zeigen eine deutliche Dominanz der Immunoreaktivität der
Untereinheit P2X3, die in sensorischen Neuronen gelegentlich mit Immunoreaktivität der
Untereinheit P2X2 kolokalisiert ist (Cook et al., 1997; Vulchanova et al., 1997; Bradbury et
16
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
al., 1998; Xiang et al., 1998). Aus dieser Kolokalisation ergeben sich verschiedene
Möglichkeiten der Rezeptorzusammensetzungen: zum einen entstehen potentiell
homooligomere Rezeptoren der Untereinheiten P2X2 oder P2X3, es besteht aber auch die
Möglichkeit der Bildung heterooligomerer Rezeptoren, die sich aus beiden Untereinheiten
zusammensetzen (P2X2/3) (Lewis et al., 1995; Thomas et al., 1998; Grubb & Evans, 1999).
Da homooligomere P2X3-Rezeptoren spezifisch von putativen nozizeptiven Neuronen
(gekennzeichnet durch Peripherin-Expression, Capsaicin-Sensitivität, TTX-Insensitivität)
exprimiert werden, scheint es einen Mechanismus für ATP-vermitteltes Schmerzempfinden
zu geben (Chen et al., 1995). Tatsächlich zeigen genmanipulierte Mäuse, denen das Gen für
die P2X3-Untereinheit fehlt, ein reduziertes Schmerzempfinden in verschiedenen
Versuchsansätzen (Cockayne et al., 2000; Souslova et al., 2000).
Eine pharmakologische Charakterisierung der Untereinheitenzusammensetzung der neuronal
exprimierten P2X-Rezeptoren wird durch die Verwendung Untereinheiten-spezifischer
Agonisten oder Antagonisten ermöglicht. Im Folgenden werden die Eigenschaften der
Agonisten bzw. Antagonisten beschrieben, die zur Identifikation von P2X2- und P2X3-
Untereinheiten und der Unterscheidung zwischen homo- und heteromeren Rezeptoren
verwendet werden können (siehe auch Tabelle 1.1).
Unterschiedliche P2X-Rezeptortypen unterscheiden sich in ihrer Sensitivität gegenüber dem
ATP-Analogon α,β Methylen ATP (α,β meATP). Während niedrige Konzentrationen dieses
Analogons ausreichen, um homomere P2X3- und heteromere P2X2/3-Rezeptoren zu aktivieren
(EC50 1 µM bzw. 9 µM) (Lewis et al., 1995; Robertson et al., 1996), können homomere P2X2-
Rezeptoren erst durch Konzentrationen über 100 µM aktiviert werden (Dunn et al., 2001).
Der Antagonist Diinosin-pentaphosphat (Ip5I) wirkt antagonistisch an homomeren P2X3-
Rezeptoren (IC50 3 µM), ist aber ineffektiv an heteromeren P2X2/3 und homomeren P2X2-
Rezeptoren (King et al., 1999; Dunn et al., 2000).
Cibacron Blue zeigt verschiedene Wirkungen an P2X-Rezeptoren. Eine ATP-induzierte
Aktivierung homomerer P2X2-Rezeptoren wird von dieser Substanz effektiv inhibiert (IC50 10
µM) (Zhong et al., 1998). Im Gegensatz dazu wird die Aktivierung homomerer P2X3-
Rezeptoren potenziert (Alexander et al., 1999). Der Effekt von Cibacron Blue auf heteromere
P2X2/3-Rezeptoren ändert sich konzentrationsabhängig. Bis zu 30 µM Cibacron Blue
verstärken die ATP-induzierte Stromantwort, während höhere Konzentrationen die
Aktivierung inhibieren (Jarvis et al., 2001).
17
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Tabelle 1.1: Pharmakologische Charakteristika von P2X2, P2X3 and P2X2/3-Rezeptoren (zur Übersicht siehe Dunn et al., 2001)
homomerer P2X2-
Rezeptor homomerer P2X3-
Rezeptor heteromeric P2X2/3-
Rezeptor
Agonist αβ-methylene ATP
EC50 > 100 µM EC50 1 µM EC50 9 µM
Antagonist Diinosine pentaphosphate (Ip5I)
kein Effekt IC50 3 µM kein Effekt
Cibacron blue IC50 10 µM EC50 10 µM < 30 µM Potenzierung > 30 µM Inhibition
18
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
1.5 Zielsetzung der Arbeit
Der V. Hirnnerv (N. trigeminus) innerviert den gesamten Gesichtsbereich einschliesslich der
Schleimhäute der Augen, der Mundhöhle und der Nase. Durch die Lokalisation der
trigeminalen Fasern im nasalen Epithel ist eine direkte Interaktion zwischen den trigeminalen
Nervenendigungen und eingeatmeten Duftstoffmolekülen möglich. Psychophysische und
elektrophysiologische Untersuchungen an anosmischen Menschen und Tieren konnten zeigen,
dass das trigeminale System Duftstoffe sowohl detektieren als auch diskriminieren kann. Die
molekularen und zellulären Mechanismen, die eine Detektion und Diskriminierung solcher
Duftstoffmoleküle in trigeminalen Nervenendigungen erlauben, sind bislang weitgehend
ungeklärt. Ziel dieser Arbeit ist deshalb die Charakterisierung molekularer Mechanismen der
Duftstoffdetektion trigeminaler Neurone.
Durch die experimentell schwer zugängliche Lage der trigeminalen Somata und Nervenfasern
ist die Charakterisierung neuronaler Signalverarbeitung auf Einzelzellniveau in vivo kaum
möglich. In dieser Arbeit soll daher ein Kultursystem dissoziierter trigeminaler Neurone der
Ratte etabliert werden. Mittels bildgebender Verfahren wird die akute Wirkung von
Duftstoffen, die bereits als trigeminal wirksam beschrieben wurden, auf die kultivierten
Neurone untersucht. Nach der Identifikation wirksamer Düfte soll überprüft werden, ob
klassifizierbare Subpopulationen trigeminaler Neurone unterschiedliche Dufterkennungs-
profile aufweisen.
Weiterhin soll die Interaktion der Duftstoffmoleküle mit einzelnen trigeminalen Neuronen
elektrophysiologisch analysiert werden. Potentiell an der Duftstoffdetektion beteiligte
Rezeptoren sollen pharmakologisch und immunhistochemisch identifiziert und charakterisiert
werden. Außerdem werden solche Rezeptoren mittels heterologer Expression in HEK-Zellen
isoliert betrachtet und bezüglich ihrer Bindungseigenschaften und ihrer Spezifität näher
untersucht.
19
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2. Materialien und Methoden
2.1 Verwendete Zelltypen
2.1.1 Primärkultur trigeminaler sensorischer Neurone
Um trigeminale sensorische Neurone zu kultivieren wurden neugeborene Wistar Ratten
(postnataler Tag 1-5) dekapitiert. Beide trigeminalen Ganglien wurden unter dem Binokular
entnommen. Die Ganglien wurden in eisgekühlter Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS,
Invitrogen) gewaschen und in ebenfalls eisgekühltem Leibovitz Medium (L15, Invitrogen)
gesammelt. Zur enzymatischen Dissoziation wurden die Ganglien in kleine Stücke
geschnitten und für 45 min in warmem Dulbecco’s Modified Essential Medium (DMEM,
Invitrogen) mit 0,025% Collagenase (Typ IA, Sigma) bei 37°C (95% Luft und 5% CO2)
inkubiert. Anschließend wurde das Gewebe mit Hilfe einer feuerpolierten Glaspipette
mechanisch dissoziiert. Die erhaltene Suspension wurde für 8 min bei 1000 r.p.m.
zentrifugiert (Viana et al., 2001).
Das erhaltene Pellet wurde in Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung resuspendiert:
DMEM/F-12 (1:1) mit Glutamax (Invitrogen) ergänzt durch 10% fötales Kälberserum
(Invitrogen), 100µg/ml Penicillin/Streptomycin und 100ng/ml NGF (Nervenwachstumsfaktor,
mouse-7s, Alomone labs).
Die vereinzelten Zellen wurden in poly-L-Lysin (0,01%, Sigma) beschichteten
Zellkulturschalen (Falcon, 140 µl Zellsuspension/Schale) ausplattiert und im Brutschrank
(37°C, 95% Luft, 5% CO2) kultiviert. Eine Stunde nach der Ausplattierung wurden zu jeder
Schale 2 ml Kulturmedium zugegeben. Vier Stunden nach der Ausplattierung konnten die
ersten Untersuchungen durchgeführt werden. Die Neurone ließen sich bis zu einer Woche
kultivieren und untersuchen.
Um vergleichbare Bedingungen zu erhalten, wurden kortikale Neurone auf dieselbe Art
dissoziiert und kultiviert wie trigeminale Neurone. Allerdings wurden die kortikalen Neurone
erst nach 10 Tagen in Kultur untersucht.
Die verwendeten Zellkulturschalen wurden zuvor für mindestens 12 Stunden mit poly-L-
Lysin (180 µl; 0,01 %; Sigma) beschichtet. Nach der Beschichtung wurden sie dreimal mit
destilliertem und autoklaviertem Wasser gewaschen. Vor der Ausbringung der Zellen mussten
die Schalen vollständig trocken sein.
Zur Erstellung der Explantatkulturen wurden die entnommenen Ganglien nicht dissoziiiert,
sondern in kleine Gewebestückchen zerschnitten. Diese Explantate wurden in beschichtete
20
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Kulturschalen ausgebracht. Etwa drei Tage nach der Ausbringung ließ sich bei angehafteten
Explantaten ein ausgeprägtes Wachstum langer Fortsätze von den Explantaten ausgehend in
die Peripherie beobachten. Diese Explantate wurden für die fokale Stimulation der
Faserendigungen verwendet.
2.1.2 Dissoziation olfaktorischer Rezeptorneurone
Zwei bis fünf Monate alten Ratten wurden durch Einatmen einer CO2 Atmosphäre getötet und
anschließend dekaptiert. Zur Entnahme des olfaktorischen Epithels wurde der
Schädelknochen der vorderen Kopfpartie freipräpariert. Zwei Mediansagitalschnitte, wenige
Millimeter rechts und links der Sutura sagitalis, legten das Septum frei. Mit einer Pinzette
wurde das olfaktorische Epithel beidseitig vom Septum und von den Turbinalien abgezogen.
Das Epithel wurde in Stücke zerteilt und 20 Minuten in Papain-haltiger (10 µl/ml, EC 3.4.22.2
von papaya latex), Kalzium-/Magnesium-freier Lösung inkubiert (enzymatische
Dissoziation).
Anschließend wurde das Gewebe in extrazelluläre Lösung überführt und durch Aufziehen in
einer abgebrochenen, polierten Pasteurpipette mit weiter Öffnung mechanisch dissoziiert. Mit
Hilfe von Zellsieben (Falcon 2350; 70 µm Nylon) wurden nicht vollständig dissoziierte
Zellverbände separiert. Die dissoziierten Zellen wurden in Concavalin A beschichtete
Zellkulturschalen ausgebracht und zur Anhaftung für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend konnten die olfaktorischen Rezeptorneurone aufgrund ihrer
charakteristischen Form optisch identifiziert und untersucht werden (Spehr et al., 2002).
Zur Beschichtung wurden jeweils 10 µl 1mM Concavalin A (in 50 mM ACES-Puffer) in
Kulturschälchen verteilt. Nach einer Trocknungszeit von etwa ein bis zwei Stunden wurden
die Schalen zunächst einmal mit 70 % Ethanol und anschließend einmal mit destilliertem
Wasser gewaschen. Nach erneuter Trocknung wurden die Schalen bis zur Verwendung im
Kühlschrank aufbewahrt.
2.1.3 Kultivierung von HEK293-Zellen
HEK293-Zellen sind primäre, menschliche, embryonale Nierentumorzellen, die mit
menschlichen Adenovirus Typ 5-DNA (Ad 5) transformiert und immortalisiert wurden
(Graham et al., 1977). Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen (45-55 ml, Sarstedt) im
Brutschrank (37 ºC, 95 % Luft, 5 % CO2) kultiviert. Das verwendete Medium M 10 setzt sich
aus MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen), 10 % fötalem Kälberserum, 23 mM L-
21
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Glutamin (Invitrogen), MEM-nicht-essentielle Aminosäure-Lösung (Invitrogen) sowie
100µg/ml Penicillin/Streptomycin (invitrogen) und 200 µg/ml Neomycin zusammen. Alle
zwei bis drei Tage wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Das Wachstum der Zellen wird
optisch kontrolliert. Bei einer Dichte des Zellrasens von etwa 80 % der Gesamtfläche der
Kulturflasche (80 % Konfluenz) wurden die Zellen gesplittet und neu ausgesät. Hierzu wurde
zunächst das Medium durch Absaugung und Waschen mit PBS-- entfernt. Zur Ablösung der
Zellen von der Kulturflasche wurden diese in 750 µl Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g/l Trypsin,
0,2 g/l Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA)•4Na in HBSS, Invitrogen) für 5 min im
Brutschrank (37ºC, 5 % CO2) inkubiert. Zu diesen abgelösten Zellen wurden 9,25 ml Medium
(M 10) zugegeben und die resultierende Zelllösung wurde in entsprechender Verdünnung in
sterilen Kulturflaschen ausgesät.
2.2 Transiente Transfektion der HEK-Zellen nach der Kalziumphosphatmethode
Die transiente Transfektion wurde nach der Kalziumphosphatmethode nach Gorman
durchgeführt (Gorman et al., 1990). Zwei Tage vor der Transfektion wurden die HEK-Zellen
in Zellkulturschalen (35 mm Durchmesser, Falcon) ausgesät, wobei die Dichte zwischen 0,7-
1,0 * 105 Zellen betrug. Die Konfluenz am Tag der Transfektion betrug dann 40-50 %. Für
den Tarnsfektionsansatz wurden eine definierte Menge der Plasmid-DNA (P2X2: 2 µg, P2X3:
10 µg, TRPM8: 8 µg), 25 µl Kalziumchloridlösung und 250 µl HBS (2x) zusammengegeben
und mit Wasser auf einen Gesamtansatz von 500 µl aufgefüllt. Alle Lösungen waren steril.
Nach vorsichtiger Mischung wurde der Transfektionsansatz fünf Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert und dann tropfenweise auf die HEK-Zellen verteilt (100 µl der
Transfektionslösung pro Zellkulturschale mit 1,3 ml Medium). Die Zellen werden für fünf
Stunden in den Brutschrank zurückgestellt. Anschließend wird die Transfektionslösung durch
zweimaliges Waschen mit PBS ++ entfernt und die Zellen erhalten frisches M 10 Medium.
Die Transfektionsrate für die verwendeten Rezeptoren lag zwischen 50 und 70 %, die Zellen
konnten bereits am nächsten Tag nach der Transfektion untersucht werden. Die cDNA Klone
der Ratten ATP-Rezeptoruntereinheiten P2X2 and P2X3 wurden freundlicherweise von Dr. R.
A. North (Universität Sheffield, UK), die cDNA Klone des Ratten TRPM8-Rezeptors
(CMR1) von Dr. D. Julius (Universität von California, San Francisco, USA) zur Verfügung
gestellt.
22
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.3 Lösungen und Pharmaka
Es wurden die im folgenden aufgeführten Lösungen und Medien verwendet. Sofern nicht
anders angegeben wurden alle Substanzen von Sigma bezogen.
Extrazelluläre Lösung Extrazelluläre Lösung
(trigeminale Neurone): (HEK-Zellen):
NaCl 140 mM NaCl 140 mM
KCl 5 mM KCl 5 mM
CaCl2 2 mM CaCl2 2 mM
MgCl 2 1 mM MgCl 2 1 mM
HEPES 20 mM Glukose 10 mM
pH: 7,4; eingestellt mit NaOH HEPES 20 mM
pH: 7,4; eingestellt mit NaOH
Kalziumfreie extrazelluläre Lösung:
NaCl 140 mM
KCl 5 mM
MgCl 2 1 mM
EGTA 5 mM
HEPES 20 mM
pH: 7,4; eingestellt mit NaOH
Intrazelluläre Lösung Intrazelluläre Lösung
(trigeminale Neurone): (HEK-Zellen):
KCl 140 mM KF 150 mM
CaCl2 0,1 mM KCl 30 mM
MgCl2 1 mM EGTA 10 mM
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
EGTA 5 mM pH: 7,4; eingestellt mit KOH
Na2ATP 2 mM
pH: 7,4; eingestellt mit KOH
23
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS):
PBS++ Dulbecco’s und PBS--Dulbecco’s (Invitrogen), PBS-- enthält keine divalenten Kationen
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), ohne Magnesium- und Kalziumionen (Invitrogen)
Kulturmedien:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen) •
•
•
DMEM/F-12 (1:1) mit Glutamaxx (Invitrogen)
+ Fötales Kälberserum 10 % (hitzeinaktiviert, Invitrogen)
+ Penicillin/Streptomycin 100 µg/ml
+ NGF 100 ng/ml (Alomone)
M10:
MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen)
+ fötales Kälberserum 10 % (hitzeinaktiviert, Invitrogen)
+ L-Glutamin 23 mM (Invitrogen)
+ MEM-nicht-essentielle Aminosäure-Lösung (Invitrogen)
+ Penicillin/Streptomycin 100µg/ml
+ Neomycin 200 µg/ml
24
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.4 Prinzip der „patch-clamp“-Technik
Die „patch-clamp“-Technik wie auch die konventionelle „voltage-clamp“-Technik stellen
Methoden dar, um die von Neuronen generierten Ionenströme unter potentiostaten
Bedingungen beobachten zu können. Die „patch-clamp“-Technik wurde von Bert Sakmann
und Erwin Neher zwischen 1973 und 1976 als Verfeinerung der „voltage-clamp“-Technik
entwickelt, wobei die Registrierung von Ionenströmen durch einzelne oder wenige
Ionenkanäle im Vordergrund stand (Hamill et al., 1981).
Bei der synaptischen Übertragung führt die durch präsynaptische Transmitterausschüttung
induzierte Aktivierung postsynaptischer Rezeptorkanäle zu Ionenströmen, die eine
Potentialänderung der postsynaptischen Zelle bewirken. Da Potentialänderungen
spannungsabhängige Ionenkanäle aktivieren, tritt neben einer transmitterinduzierten
postsynaptischen Stromkomponente auch eine spannungsabhänge Komponente auf, die zur
Auslösung eines Aktionspotentials führt. Eine selektive Registrierung der
transmitterinduzierten Ionenströme kann daher nur unter potentiostaten Bedingungen
erfolgen.
Um dies zu erreichen, müssen die zu registrierenden transmitterinduzierten Ströme durch
gleichgroße aber entgegengerichtete Ströme kompensiert werden. Es muß daher ein dem
Potentialunterschied zwischen Membranpotential und Sollpotential proportionaler Strom
„injiziert“ werden. Die konventionelle „voltage-clamp“-Technik bedient sich zu diesem
Zweck zweier Mikroelektroden (Spitzendurchmesser:< 1µm, Widerstand: 20-80MΩ), die
gleichzeitig in die Zelle eingestochen werden müssen. Eine dieser Elektroden dient der
Potentialmessung gegenüber der im Bad befindlichen Referenzelektrode. Über eine
Rückkopplungsverstärkerschaltung wird dann ein entsprechender zur Aufrechterhaltung des
Sollpotentials notwendiger Kompensationsstrom injiziert.
Die „patch-clamp“-Technik erlaubt aufgrund des direkten, sehr rauscharmen Zugangs zum
Zellinneren die Registrierung besonders kleiner Ionenströme. Die mit Elektrolyt gefüllte
Mikroelektrode (sogenannte Patchpipette, Spitzendurchmesser: 1-2µm) wird mit Hilfe
verschiedener Grobtriebe und Mikromanipulatoren in die Nähe einer Zelle bewegt und
schließlich auf die Zellmembran aufgesetzt, jedoch nicht eingestochen. Während dieses
Vorgangs wird ein leichter Überdruck auf die Flüssigkeitssäule in der Patchpipette gegeben,
der durch den konstanten Ausstrom von Elektrolytlösung ein „Verstopfen“ der Spitze
verhindert. Bei Annäherung an die Zelle führt der konstante Flüssigkkeitsstrom aus der
Pipette zu einer lokalen Einstülpung der Membran. Bei Aufheben des Unterdrucks reißt der
Flüssigkeitstrom ab, und die Zellmembran bewegt sich auf die Spitze der Patchpipette zu und
25
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
haftet an dieser. Im günstigsten Fall reicht diese Anhaftung der Membran bereits zur
Ausbildung einer hochohmigen (1-20 GΩ) Verbindung, des sogenannten „Gigaseals“, aus.
Andernfalls kann die Membran auch durch Anlegen eines leichten Unterdrucks weiter in die
Patchpipette eingesaugt werden. Ausgehend von dieser „cell-attached“-Konfiguration ergeben
sich verschiedene Möglichkeiten für die weitere Vorgehensweise (Abb.2.1.):
1. Legt man wiederum einen Unterdruck an, so kann das Membranstück unter der
Patchpipette zerreissen, so daß man einen direkten Zugang zum Zellinneren erhält. In diesem
Zustand können sogenannte Ganzzellableitungen („whole-cell-patch-clamp“) durchgeführt
werden. Bei genügend kleinen Zellen können auf diese Weise die über die gesamte
Zellmembran fließenden Ionenströme registriert werden.
2. Wird die Patchpipette aus der Ganzzellkonfiguration vorsichtig zurückgezogen, so bildet
sich zunächst ein Membranschlauch, der schließlich abreißt. Das abgerissene Ende des
Schlauches kann sich spontan an der Patchpipette schließen. In dieser Konfiguration bleibt die
relative Orientierung der integralen Membranproteine bezüglich des Extrazellulärraumes
erhalten, so daß man von einem sogenannten „outside-out-patch“ spricht. In dem
Membranstück können sich ein oder mehrere Ionenkanäle befinden, an denen Messungen
vorgenommen werden können.
3. Wird die Patchpipette aus der „Gigaseal“-Konfiguration heraus abgezogen, so wird das
Membranstück unter der Pipette aus der Zellmembran herausgerissen. Im Gegensatz zur
„outside-out“-Konfiguration ist nun jedoch die Ausrichtung der integralen Membranproteinen
bezüglich des Extrazellulärraumes invertiert. Daher spricht man in diesem Fall auch von einer
sogenannten „inside-out“-Konfiguration.
26
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Unterdruckaußen
innen Pipette
zurückziehen
Pipette
zurückziehen
cell-attached„Gigaseal“
Unterdruck
whole-cell inside-out
outside-out
Abb.2.1: Die verschiedenen Messkonfigurationen der patch-clamp Technik.
Dargestellt sind die Spitze der Patchpipette und ein Teil der Zellmembran.
Sowohl die „outside-out“ als auch die „inside-out“-Konfiguration erlauben die Registrierung
von Einzelkanalereignissen. Auch aus der „cell-attached“-Konfiguration heraus kann das
Öffnen und Schließen einzelner Kanäle beobachtet werden.
Die bei der „patch-clamp“-Technik verwendete Meßschaltung ermöglicht es, auf eine
zusätzliche Elektrode zur Potentialmessung zu verzichten. Der Operationsverstärker (OPV)
stellt das zentrale Bauelement der „patch-clamp“-Verstärker-Schaltung dar (Abb.2.2). Der
OPV, der aus mehreren Transistoren aufgebaut ist, ist als Strom-Spannungs-Wandler
verschaltet. Am „-“-Eingang des OPV liegt über die Patchpipette das Zellpotential an;
während zwischen „+“-Eingang und Erde die sogenannte Sollspannung (Vsoll) angeliegt, auf
die das Membranpotential „geklemmt“ werden soll. Der OPV stellt ein aktives Bauteil dar,
das bestrebt ist, durch Variation des am rekursiv verschalteten Ausgang erzeugten Potentials
die Potentialdifferenz zwischen „+“- und „-“-Eingang auszugleichen. Im Gleichgewicht liegt
daher auch am „-“-Eingang das Sollpotential an, so daß bei Vernachlässigung des
Pipettenwiderstandes über der Membran die Sollspannung anliegt.
27
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Der Ausgang des OPV ist über einen als Rückkoppelwiderstand (Rf) bezeichneten Widerstand
mit dem „-“-Eingang verbunden. Über der Membran auftretende Ströme (z.B. EPSCs) fließen
über die Patchpipette zum OPV hin ab, da über den Verstärker der Stromkreis geschlossen
wird. Aufgrund des sehr hohen Eingangswiderstands des OPV (ideal: unendlich groß; real:
1012Ω) fließt der Haupteil des Stroms über den Rückkoppelwiderstand (0,5 GΩ). Da am „+“-
Eingang des OPV im Gleichgewicht das Sollpotential anliegt, gilt für die am Ausgang des
OPV abgreifbare Spannung, wenn ein Strom Im über die Membran fließt: Vout = Vc + Im * Rf.
Ein Stromfluß über die Membran führt also bezüglich der Ausgangsspannung des OPV zu
einer der Stromstärke proportionalen Änderung von Vout. Daher kann Vout zur Registrierung
der über die Membran fließenden Ionenströme dienen. Um das Sollpotential Vc abzutrennen
und ein dem Stromfluß direkt proportionales Spannungssignal zu erhalten, ist der „patch-
clamp“-Schaltung meist ein Differenzverstärker nachgeschaltet.
Abb.2.2:
Vereinfachtes Schaltbild einer „patch-clamp“-Ableitung
Rf: Rückkoppelwiderstand; RS: Zugangswiderstand; Rm: Widerstand der Zellmembran; Cm: Kapazität der
Zellmembran bzw. des „patches“; Vi: Potentialdifferenz zwischen Zellinnerem und Bezugelektrode; Vsoll:
Kommandospannung; Vout: ausgegebene Spannung, Meßgröße
Der Ausgleich des Membranpotentials auf den Wert des Sollpotentials erfolgt im Gegensatz
zum idealen System nur mit endlicher Geschwindigkeit, da die dynamischen Eigenschaften
der Spannungsklemme durch die relativ langsame Umladungsgeschwindigkeit der
Zellmembran (und der Patchpipette) bestimmt werden. Daher folgt das Membranpotential
dem vorgegebenen Sollpotential nur mit einer gewissen Verzögerung, weshalb die meisten
Verstärker die Möglichkeit zur Kompensation der Zell- und Pipettenkapazität bieten.
28
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Für die Effizienz der Spannungsklemme ist allein die effektiv über der Membran anliegende
Klemmspannung von Bedeutung, die zur Umladung der Membran führt. Da der
Membranwiderstand mit dem Zugangswiderstand in Reihe geschaltet ist, fällt ein Teil der
Klemmspannung bereits über dem Zugangswiderstand ab, so daß das Verhältnis der beiden
Widerstände über die Wirksamkeit der Spannungsklemme entscheidet. Ist der
Membranwiderstand 50-100 mal größer als der Zugangswiderstand, so beträgt der Fehler
entsprechend 1 bis 2% und ist deshalb vernachlässigbar. Der Zugangswiderstand bzw.
Serienwiderstand hängt vom Widerstand der Pipetten ab, weshalb möglichst niederohmige
Patchpipetten benutzt werden sollten. Der Einfluß des Serienwiderstandes auf die
Eigenschaften der Spannungsklemme kann bei den meisten Verstärkern durch eine spezielle
Schaltung kompensiert werden.
Die Größe der mit der „patch-clamp“-Technik maximal meßbaren Ganzzellströme wird durch
die Wahl des Rückkoppelwiderstandes begrenzt:
Wegen Rf = Vout,max/Imax gilt Imax = Vout,max / Rf. Bei einer maximalen Ausgangsspannung von
10 V beträgt die maximal meßbare Stromstärke 5 nA, wenn mit einem Rückkoppelwiderstand
von 0,5 GΩ gearbeitet wird. In der Praxis wird allerdings der maximale Meßbereich auf ca. 2
nA beschränkt.
2.5 Versuchsaufbau zur Registrierung von Rezeptorströmen
Alle patch-clamp Daten wurden mit Hilfe eines folgendermaßen aufgebauten Messplatzes
ermittelt. Die gesamte Meßapparatur (Mikroskop, Patchpipettenhalterung, Vorverstärker,
Applikationssystem) war in einem Faradaykäfig untergebracht, der die Einstrahlung von
elektrischen Störfeldern weitgehend verhindern sollte. Das inverse Mikroskop (Zeiss Axiovert
32M) war mit einem Objektiv (Zeiss ACHROMAT 5x/0,12 ∞/-) mit 5facher Vergrößerung
und einem Phasenkontrastobjektiv (Zeiss ACHROSTIGMAT LD 32x/0,40 Ph1 ∞/0,5-1,5)
mit 32facher Vergrößerung ausgestattet. Zusammen mit der Vergrößerung der Okulare
ergaben sich daher Gesamtvergrößerungen von 50 bzw. 320fach.
Um Schwingungen der Patchpipette gegenüber dem Mikroskop zu vermeiden, war die über
Grob- und Feintriebe verfahrbare Halterung des Meßkopfes am Mikroskoptisch fixiert, so daß
sich eine starre Verbindung ergab. Das gesamte Mikroskop stand außerdem auf einem
schwingungsgedämpften Tisch.
Die Positionierung der Patchpipette erfolgte mit Hilfe eines Mikromanipulators (Narishige,
Japan) unter optischer Kontrolle.
29
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Die für die Versuche benötigten Glasmikropipetten („Patchpipetten“) wurden mit einem
elektronisch gesteuerten Elektroden-Ziehgerät (DMZ Universalpuller) hergestellt. Für die
Herstellung der Mikropipetten wurden 10 cm lange Borosilikat-Glasröhrchen (1,2 mm O.D. x
1,17 mm I.D., Harvard apparatus) verwendet. Der feuerpolierte Spitzendurchmesser der
verwendeten Patchpipetten betrug ca. 1µm, was einem Elektrodenwiderstand von 3-8 MΩ
entsprach. Vor jeder Messung wurden die Glasmikropipetten frisch hergestellt.
Die Registrierung der Ionenströme erfolgte mit einem HEKA EPC9 Verstärker bei
Raumtemperatur. Zur Kompensation der Kapazität und des Serienwiderstandes wurde der
interne Kompensationsalgorithmus des Verstärkers genutzt. Sofern nicht anders angegeben,
wurden die Messungen bei einem Haltepotential von – 60 mV durchgeführt. Daten wurden
mittels eines MacIntosh Centris 650 Computers mit der Pulse Software aufgezeichnet. Die
Datenanalyse wurde mit der Software Pulse, IgorPro (Wavemetrics), Sigma Plot (Jandel
Scientific) und Microsoft Excel durchgeführt.
In der statistischen Auswertung entspricht der bei quantitativen Aussagen angegebene Fehler
dem sogenannten „Standardfehler des Mittelwertes“ (S.E.M.) und bezeichnet die Streuung des
Mittelwertes. Signifikanzuntersuchungen erfolgten mit Hilfe des t-Testes nach Student, die
Signifikanzgrenze lag bei 5 % (*) bzw. 0,1 % (***).
30
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.6 Bildgebende Verfahren
2.6.1 Untersuchungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mittels des
Fluoreszenzfarbstoffes Fura-2
Um Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration untersuchen zu können, wurde der
Farbstoff Fura-2 verwendet. Fura-2 ist ein Fluoreszenzindikator, mit dem die freie
intrazelluläre Ca2+-Konzentration bestimmt werden kann. Erstmals beschrieben wurde er
1985 von Grynkiewicz und Mitarbeitern. Die Struktur weist dem bekannten
Kalziumselektiven Chelator EGTA ähnliche Bindungsstellen auf. Das Emissionsspektrum
von Fura-2 wird bei 510 nm gemessen, wobei die Intensität der Fluoreszenz von der
Kalziumkonzentration und von der Wellenlänge der UV-Anregung abhängig ist. Bei einer
Anregung mit 340 nm nimmt die Intensität der Fluoreszenz mit steigender
Kalziumkonzentration zu, bei einer Anregung mit 380 nm hingegen nimmt sie ab. Bei einer
Anregung mit 360 nm ist die Intensität von der vorhandenen Kalziumkonzentration
unabhängig. Um die Kalziumkonzentration zu bestimmen, wird das Verhältnis der
Emissionsintensitäten bei 340nm/380nm oder bei 360nm/380nm gebildet (Poenie und Tsien,
1986). Durch die Berechnung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten werden Faktoren
wie die Schichtdicke der Neurone und die intrazelluläre Fura-2 Konzentration eliminiert.
Fura-2 weist gegenüber anderen Fluoreszenzfarbstoffen wie Quin 2 und Indo-1 bessere
Absorptions- und Emissionseigenschaften auf, wodurch die Verwendung vergleichsweise
niedriger Konzentrationen von Fura-2 ermöglicht wird. Außerdem weist Fura-2 eine bessere
Photostabilität auf, wodurch der experimentelle Zeitrahmen der Fluoreszenzanalysen
verlängert wird.
Zur Beladung der Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff wurde die veresterte Form des Fura-2,
Fura-2/AM verwendet. Dieses Fura-2 Derivat weist fünf Acetomethylgruppen auf, die mit den
COO- Gruppen des Fura-2 verbunden sind. Das Derivat ist membrangängig, wobei Glukose
und Kälberserum in der Inkubationslösung die Aufnahme des Fura-2/AM in die Zellen
begünstigen. In den Zellen wird die veresterte Form von intrazellulären Esterasen zu dem
membranundurchlässigen Kalzium-bindenden Fura-2 hydrolysiert. Eine weitgehende
Hydrolyse des Esters ist wichtig, da auch diese Form stark fluoreszent aber Kalzium-
insensitiv ist. Um eine möglichst hohe Hydrolyserate zu erhalten, sollte sich zwischen der
Fura-2/AM Zugabe und der experimentellen Analyse der Zellen eine Zeitspanne von 20 bis
30 Minuten befinden. Da das auf diese Weise in die Zellen gelangte Fura-2 nach einiger Zeit
31
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
durch Exozytose wieder aus den Zellen hinausbefördert wird, ist der Zeitraum der
experimentellen Analyse auf etwa eine Stunde begrenzt.
Die Fura-2/AM Konzentration für ein optimales Beladen der Zellen mit dem
Fluoreszenzfarbstoff wurde empirisch ermittelt. Bei zu geringer Beladung ergab sich bei den
Messungen ein zu schwaches Signal, da zu wenig Fura-2 Moleküle intrazelluläres Kalzium
binden können. Bei einer Überladung hingegen würde die Fura-2 Konzentration höher sein als
die Konzentration der intrazellulären Kalzium-bindenden Proteine, die als intrazellulärer
Kalziumpuffer fungieren. Dies muß vermieden werden, da ein solches
Konzentrationsverhältnis die physiologische Kalziumpufferung verändern würde. In diesem
Fall würde die intrazelluläre Kalziumkonzentration von der Fura-2 Konzentration bestimmt
werden, wodurch eine Aussage über intrazelluläre Kalziumkonzentrationsänderungen nicht
mehr möglich ist. Bei einer Überladung der Zellen würde nur der absolute Kalziuminflux
bestimmt werden.
Für trigeminale Neurone stellte sich eine Konzentration von 6 µM Fura-2/AM als optimal
heraus. Zur Beladung mit Fura-2/AM wurde den Neuronen ein Milliliter des Mediums
entnommen und dies mit 6 µM Fura-2/AM versetzt. Das in der Kulturschale verbliebene
Medium wurde entfernt und durch das mit Fura-2/AM versetzte ersetzt, anschließend wurden
die Neurone im Brutschrank (37°C, 95 % Luft, 5 % CO2) etwa 45 - 60 min inkubiert. Nach
der Inkubationszeit wurde das Medium durch vorher angewärmte extrazelluläre Lösung
ersetzt. Die Messungen wurden nach fünfminütiger Wartezeit durchgeführt.
HEK-Zellen wurden mit 2 µM Fura-2/AM beladen. Allerdings wurde der Fluoreszenz-
farbstoff in extrazellulärer Lösung auf die Zellen gegeben. Die Inkubationszeit betrug 30 min
bei Raumtemperatur. Danach wurden die Zellen mit extrazellulärer Lösung gewaschen und
nach einer Wartezeit von etwa 15 min untersucht.
32
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.6.2 Untersuchungen der intrazellulären ATP-Konzentration mittels des
Fluoreszenzfarbstoffes Quinacrin
Die Substanz Quinacrin oder 3-Chloro-7-methoxy-9-(1-methyl-1-diethylaminobutylamino)-
acridin wurde hinsichtlich ihrer pharmakologischen Wirkungen weitreichend analysiert,
wobei der Hauptteil dieser Untersuchungen von der U.S. Armee durchgeführt wurde. Sie zeigt
eine gute Wirksamkeit in der Prophylaxe gegen und der Behandlung von Malaria und wurde
im zweiten Weltkrieg (wahrscheinlich aufgrund der Verfügbarkeit) eben zu diesem Zweck
eingesetzt (Chauhan und Srivastava, 2001). Außerdem wird Quinacrin eine anti-rheumatische
Wirkung zugeschrieben (Rynes, 1997) und auch ein Einsatz zur Sterilisation wird diskutiert
(Lippes, 2002).
In der vorliegenden Arbeit werden jedoch nicht die physiologischen Effekte dieser Substanz
betrachtet, sondern lediglich ihre hohe Bindungsaffinität zu Adenin Nukleotiden und
insbesondere zu ATP genutzt. Diese hohe Bindungsaffinität zu ATP machen das
fluoreszierende Quinacrin zu einem bevorzugten Marker für intrazelluläre ATP-Speicher
(Bodin und Burnstock, 2001a; Sorensen und Novak, 2001; Mitchell et al., 1998; White et al.,
1995). Zellen, die hohe intrazelluläre ATP-Konzentrationen aufweisen akkumulieren
Quinacrin. Diese Eigenschaften des Quinacrins erlauben Untersuchungen des zellulären ATP
Vorkommens auf Einzelzellniveau.
Die Untersuchung auf Einzelzellniveau hat große Vorteile gegenüber der gebräuchlichen
Methode, ATP-Freisetzung über die ATP Menge im Zellüberstand nach einer Stimulation zu
bestimmen. Mit der letzteren Methode ist es unmöglich, zwischen induzierter ATP-
Freisetzung und ATP-Freisetzung durch Zelllyse zu unterscheiden (Sorensen und Novak,
2001).
Die Quinacrin-gefärbten Zellen können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Stimulus-induziert ATP
freizusetzen, untersucht werden. Nimmt nach einer Stimulation die intrazelluläre Fluoreszenz
ab, kann dies als ATP-Freisetzung interpretiert werden (Bodin und Burnstock, 2001a;
Sorensen und Novak, 2001; Knight et al., 2002).
Um die olfaktorischen Rezeptorneurone mit Quinacrine zu färben, wurden sie für 15 min in 5
µM Quinacrin (in extrazellulärer Lösung) inkubiert. Die Quinacrin-Fluoreszenz wurde mit
demselben Versuchsaufbau, der auch für die Bestimmung der intrazellulären
Kalziumkonzentration verwendet wurde, untersucht.
33
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.6.3 Versuchsaufbau zur Detektion von intrazellulären Fluoreszenzänderungen
Der für die Analyse der Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mittels
Fura-2 bzw. der Freisetzung des Quinacrin-markierten, intrazellulären ATPs verwendete
Meßaufbau bestand aus einem inversen Mikroskop der Firma Zeiss (Axiovert 100) und einem
Monochromator der Firma T.I.L.L.Phototonics. Mit dem Monochromator wurden die
alternierenden monochromatischen Wellenlängen, welche in den Versuchen genutzt wurden,
erzeugt. Das Mikroskop war mit einem speziellen Objektiv der Firma Zeiss (Achroplan
40x/0,6 korr) ausgestattet, welches sich durch eine hohe UV-Transmission auszeichnet.
Die Messung der Fluoreszenz erfolgte über eine CCD-Kamera (PXL 37) der Firma
Photometrics. Das Bild der Zellen wurde auf einen CCD-Chip (charged-coupled device)
abgebildet und dort auf einem Array mit einer Pixel-Matrix elektronisch vermessen. Die Pixel
des CCD-Array wurden gruppiert (Binning), was zwar die Auflösung verringert, aber die
Empfindlichkeit der Kamera wesentlich steigert. Zur Reduzierung der anfallenden
Datenmenge und zur Geschwindigkeitssteigerung ist es möglich, frei definierbare Bereiche,
sogenannte ROI (Regions of interest), des Chips auszulesen. Die Meßergebnisse dieser
Bereiche wurden während der Aufnahme direkt auf dem Bildschirm angezeigt und auf der
Festplatte des angeschlossenen Computers gespeichert.
Die mit Fura-2 beladenen Zellen wurden alternierend für je 150 ms mit 340 nm und 380 nm
angeregt, wobei alle 1000 ms ein neues Bildpaar aufgenommen wurde. Die Steuerung der
Kamera, sowie die Aufnahme der Daten wurde mit dem Programm Vision 3.3 von
T.I.L.L.Photonics durchgeführt. Während der Messungen wurde die Hintergrundfluoreszenz
bestimmt und bei der Bestimmung des Intensitätsverhältnisses (f340/f380) von den Meßwerten
subtrahiert. Auf eine Umrechnung der Intensitätsverhältnisse (f340/f380) in eine absolute
Kalziumkonzentration wurde verzichtet, da absolute Werte der [Ca2+]i sehr schwierig zu
bestimmen sind. Die Bestimmung des Wertes der für die Berechnung der
Kalziumkonzentration benötigten Kalziumdissoziationskonstanten von Fura-2 ist unter den
Bedingungen des intrazellulären Milieus sehr aufwendig. Daher wurde im Rahmen dieser
Arbeit die absolute Kalziumkonzentration nicht berechnet, sondern nur die
Kalziumkonzentrationsänderung betrachtet.
Derselbe Versuchsaufbau wurde auch zur Untersuchung der Quinacrin-Fluoreszenz
verwendet. Hierbei wurden zur Anregung der Fluoreszenz 150 ms lange Lichtpulse mit einer
Wellenlänge von 468 nm emitiert. Zur Detektion wurde ein BP 490-540 nm Filter verwendet.
Alle 2000 ms wurde ein neues Bildpaar aufgenommen.
34
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
In der statistischen Auswertung entspricht der bei quantitativen Aussagen angegebene Fehler
dem sogenannten „Standardfehler des Mittelwertes“ (S.E.M.) und bezeichnet die Streuung des
Mittelwertes. Signifikanzuntersuchungen erfolgten mit Hilfe des t-Testes nach Student, die
Signifikanzgrenze lag bei 5 % (*) bzw. 0,1 % (***).
2.7 Applikation der Stimuli
Die Applikation der Stimuli erfolgte über ein schnelles Superfusionssystem (Spehr et al.,
2002; Abb.2.3), das sowohl in patch-clamp als auch in Ca-Imaging Untersuchungen
verwendet wurde.
Die Superfusion bestand im wesentlich aus einem mit Hilfe von drei Grobtrieben justierbaren
Applikationskopf mit fünf oder sechs Superfusionskanülen (∅: 0,4 mm). Die Kanülen waren
über Schläuche mit Vorratsbehältern verbunden. Über Magnetventile (The Lee Company)
konnten die Zulaufschläuche einzeln verschlossen und geöffnet werden. Die Steuerung der
Magnetventile konnte manuell oder über den Computer erfolgen. Die Applikation erfolgte
mittels eines mit Luftdruck betriebenen Systems. Durch Variation des angelegten Drucks
konnte die Ausflußgeschwindigkeit kontinuierlich reguliert werden. Die applizierte Lösung
wurde durch eine im Superfusionkopf integrierte, den Applikationskanülen
gegenüberliegende Absaugung (∅: 0,9 mm) wieder entfernt, so daß die Applikation auf das
Gebiet zwischen den Kanülen begrenzt blieb. Die Absaugung sicherte außerdem eine
komplette Entfernung der applizierten Substanzen und verhinderte so eine Verunreinigung der
Badlösung. Die Latenz der Applikation betrug weniger als 0,5 s. Der Flüssigkeitsspiegel in
der Kulturschale wurde während der Durchführung des Experimentes über einen zusätzlichen
Badzulauf (extrazelluläre Lösung) sowie eine Badabsaugung konstant gehalten.
Bedingt durch die experimentellen Bedingungen befand sich das Applikationssystem ständig
in der extrazellulären Badlösung, so daß trotz geschlossener Ventile eine leichte Diffusion der
Applikationslösungen in das Bad denkbar wäre. Um Adaptationsprozesse zu vermeiden,
wurde deshalb während der Experimentabschnitte, in denen keine Stimuli appliziert wurden,
über eine Kanüle extrazelluläre Lösung appliziert. Dies führt zum einen zu einer starken
Verdünnung der möglicherweise diffundierenden Substanzen und außerdem zu einer
schnellen Entfernung derselben mit der applizierten extrazellulären Lösung über die
Applikationsabsaugung.
Mit Ausnahme der Duftstoffe wurden alle Substanzen in extrazellulärer Lösung gelöst. Die
Duftstoffe Benzaldehyd, Citral, Toluene, 3-Phenylpropionaldehyd, 5-Phenylvaleraldehyd,
35
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Cyclohexanon, Furfural, Pyridine, Menthol und Linalool wurden aufgrund ihrer schlechten
Wasserlöslichkeit in Ethanol gelöst und anschließend in extrazellulärer Lösung bis auf die
Endkonzentration verdünnt. Die sich dabei ergebenden Endkonzentrationen von Ethanol hatte
keinen Effekt auf die Zellen.
Der Stimulus Icilin wurde zunächst in DMSO gelöst und anschließend in extrazellulärer
Lösung verdünnt. Die resultierenden DMSO-Konzentrationen hatten keinen Effekt auf die
Zellen.
In einigen Experimenten wurde die Generation von AP durch QX-314 (2 nM, Tocris), einem
Blocker der spannungsgesteuerten Natriumkanäle, in der intrazellulären Lösung verhindert.
Um die Sensitivität der trigeminalen Neurone gegenüber TTX (Tetrodotoxin, Alomone) zu
untersuchen, wurde die Fähigkeit, AP zu generieren, vor und während der Applikation von 1
µM TTX getestet.
Superfusions-kanülen
Absaugkanüle
Abb. 2.3
Die Skizze zeigt den prinzipiellen Aufbau der Superfusionsapparatur, aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden
nur drei Superfusionskanülen eingezeichnet.
36
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.8 Immunhistochemie
Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden kultivierte trigeminale Neurone
einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit Paraformaldehyd (4 % in PBS, 60 °C; 20
min) fixiert. Die 4 %ige Paraformaldehylösung wurde unter Erhitzung des Paraformaldehyd-
PBS-Gemisches bis auf 60 °C hergestellt. Der trüber Lösung wurde tropfenbweise 1 N NaOH
zugegeben, bis die Lösung aufklarte. Diese 60 °C heiße Paraformaldehydlösung wurde auf die
Zellen gegeben. Nach der Fixierung wurden die Zellen wiederum mit PBS gewaschen
(dreimal, je fünf Minuten Wartezeit), um das Paraformaldhyd, dessen Rückstände zur
Denaturierung der Antikörper führen konnten, vollständig zu entfernen. Unspezifische
Bindungen der verwendeten Antikörper wurden durch Inkubation in einer Blocklösung
vermieden. Die Blocklösung enthielt bei NST-Färbungen 10 % Pferdeserum und 0,2 % Triton
X-100 (in PBS), während sie bei P2X-Färbungen 10 % Ziegenserum und 0,2 % Triton (in
PBS) beinhaltete. Triton gewährleistet die Permeabilität der Zellmembran. Die
Inkubationszeit betrug bei beiden Ansätzen 60 min bei 37 °C. Diesem Absättigungsschritt
folgte die Inkubation mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C. Anschließend
wurden die Zellen gewaschen (PBS, fünfmal, je fünf Minuten Wartezeit) und mit den
sekundären Antikörpern bei 37 °C inkubiert (vier Stunden bei der NST-Färbung, 30 Minuten
bei der P2X-Färbung). Alle Antikörper wurden in PBS mit 0,2 % Triton verdünnt. Vor der
Untersuchung der Imuunofluoreszenz wurden die Zellen wiederum in PBS gewaschen
(fünfmal, je fünf Minuten Wartezeit).
Für die Immunofärbung gegen Neuronen spezifisches Tubulin (NST) wurde ein monoklonaler
Antikörper aus der Maus für Neuronen spezifisches beta III Tubulin (1:250, Abcam)
verwendet. Der gegen den ersten Antikörper gerichtete, TRITC (Tetramethylrhodamin-5-
(und-6-)Isothiocyanat) konjugierte zweite Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:500
eingesetzt. Kontrollfärbungen wurden ohne Verwendung des ersten Antikörpers durchgeführt
und zeigten keine Immunofluoreszenz.
Die Immunofärbungen gegen die P2X-Rezeptoruntereinheiten 2 und 3 wurden mit folgenden
primären Antikörpern durchgeführt: (i) anti-P2X2 (1:800), ein polyklonaler Antikörper aus
dem Kaninchen gegen die Aminosäuren 457-472 des Ratten P2X2-Rezeptors (Alomone) und
(ii) anti-P2X3 (1:500), ein polyklonaler Antikörper aus dem Meerschweinchen gegen die
Aminosäuren 383-397 des Ratten P2X3-Rezeptors (Neuromics). Als zweite Antikörper
wurden IgGAlexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (P2X2-Färbung) und Alexa Fluor® 546
goat anti-guinea pig (P2X3-Färbung) (je 1:1000, Molecular Probes) verwendet.
37
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Als Kontrolle wurden die Zellen mit pimären Antikörpern inkubiert, die zuvor eine Stunde
lang mit den jeweiligen spezifischen Blockpeptiden präabsorbiert wurden. Nach der
Präabsorbtion wurden keine immunopositiven Zellen gefunden.
Um die NST Immunofluoreszenz nachzuweisen, wurden die Kulturen unter einem Mikroskop
(Axioskop 2, Zeiss), das mit einer 75 W Xenon Lampe ausgestattet war, betrachtet. Die
Fluoreszenz des sekundären Antikörpers wurde mit einem LP 590 nm Filter bei einer
Anregungswellenlänge von > 546 nm (BP 546 nm Filter) detektiert. Mit Hilfe einer digitalen
Kamera (Axiocam, Zeiss) und des Computerprogrammes Axiovision wurden die Ergebnisse
festgehalten und analysiert.
Aufnahmen der Immunofärbung gegen die P2X-Rezeptoruntereinheiten wurde mit Hilfe eines
Laser Scanning konfokalen Mikroskopes (Axioskop 2 und LSM 510, Zeiss) gemacht. Um die
individuellen Neurone inklusive ihrer Fortsätze rekonstruieren zu können, wurde ein
Achroplan 40x/0,8W Objektiv verwendet. Der Alexa 546 Fluoreszenzfarbstoff wurde mit
einer Wellenlänge von 543 nm angeregt, die von einem Argon-Laser emittiert wurde. Zur
Detektion wurde ein LP 560 nm Emmissionsfilter verwendet. Der Alexa 488 Farbstoff wurde
mit 488 nm angeregt (ebenfalls vom Argon-Laser emittiert) und mit einem BP 500-530 nm
Emissionsfilter detektiert. Mittels des Zeiss LSM Aufnahmeprogrammes wurden Z-Serien
Projektionen aufgenommen. Alle gezeigten Abbildungen (inklusive der Kontrollabbildungen)
wurden mit identischen Kameraeinstellungen erstellt. Die Anzahl der Neurone, die eine
spezifische Immunoreaktivität zeigen, wurde durch Auszählen in jeweils vier definierten
Bereichen zweier Kulturschalen bestimmt.
Das trigeminale Explantat, das auf dem repräsentativen Bild dargestellt ist, wurde aus einer
Maus mit ubiquitärer eGFP (enhanced green fluorescent protein) Expression erstellt
(Hadjantonakis et al., 1998). Die Aufnahmen wurden mittels des konfokalen Mikroskopes
gemacht. Als Anregungswellenlänge für das GFP wurde der 488 nm Laser (Argon) genutzt,
die Fluoreszenz wurde mit einem LP 505 nm Emissionsfilter detektiert.
38
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
2.9 Isolierung der mRNA und Synthese der cDNA
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus dem trigeminalen Ganglion und dem olfaktorischen
Epithel wurde das TRIZOL Reagenz (Invitrogen) eingesetzt. Es wurden die trigemalen
Ganglien und olfaktorisches Epithel dreier adulter Ratten verwendet. Um
Degenerationsprozesse zu vermeiden, wurden die Gewebestücke bis kurz vor der RNA-
Extraktion bei -70 °C gelagert. Die RNA-Präparation erfolgte nach Vorschriften des
Herstellers. Nach dem Verdau der DNA mit DNaseI wurde die mRNA mittels Oligo-dT
beschichteten paramagnetischen Partikeln (oligo-dT coated paramagnetic particles, Dynal,
Norwegen) isoliert. Für die Synthese der cDNA wurden Reverse Transkriptase (Moloney
murine leukemia virus reverse transcriptase, Invitrogen) und Oligo(dT12-18) Primer verwendet.
2.10 Polymerasekettenreaktion
In der vorliegenden Arbeit wurde der Nachweis olfaktorischer Rezeptor kodierender mRNAs
in Form von cDNA mit der PCR-Methode (polymerase chain reaction) durchgeführt. Ein Paar
Sequenz-degenerierter PCR Primer (P1: ATGGCITA(TC)GA(TC)(AC)GITA(TC)GTIGCIA
TITG, P2: CCIATG(CT)TIAA(CT)CC(GC)TT(TC)ATITA, I = Inositol) wurde anhand hoch
konservierter Regionen der olfaktorischen Rezeptoren erstellt (Buck und Axel, 1991).
Die PCR Amplifikation wurde für 40 Zyklen (94 °C 1 min, 50 °C 1 min, 72 °C 1 min und 2.5
Einheiten der Taq-Polymerase) mit 100 pmol der Primer P1 und P2 sowie ~ 1 ng cDNA
durchgeführt (entsprechend der Empfehlung des Herstellers, Invitrogen).
Zur Überprüfung der cDNA Synthese wurden außerdem zwei Primer für die Detektion der
GAPDH cDNA (Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase) verwendet (P3:
AGGGGCCATCCACAGTCTTCTG and P4: CATCACCATCTTCCAGGAGCGA). Die
Amplifikation wurde mit je 30 pmol der Primer und 30 Zyklen (94 °C 1 min, 60 °C 1 min, 72
°C 1 min, 2.5 Einheiten der Taq-Polymerase).
Die entstandenen PCR-Produkte wurden über 1 % Agarosegele (Invitrogen) in TBE-
Laufpuffer bei RT für 60 bis 65 min bei 100 V in einer Gelkammer (Sambrook und Russel,
2001) aufgetrennt. Dem Agarosegel wurde Ethidiumbromid (10 mg/ml, Invitrogen)
zugegeben, ein interkalierender DNA-Farbstoff, der unter UV-Licht fluoresziert. Nach
Beendigung der Elektrophorese wurde das Muster der Moleküle auf dem Gel mit einer
Kamera und nachgeschalteter Bildverarbeitung dokumentiert. Um die jeweilige Größe der
PCR-Produkte abschätzen zu können, wurde DNA-Marker (100 bp ladder, Invitrogen)
verwendet.
39
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3 Ergebnisse
3.1 Kultivierung trigeminaler Neurone
Um die Untersuchung trigeminaler Chemoperzeption auf Einzelzellniveau zu ermöglichen,
wurde ein Kultursystem für dissoziierte trigeminale Neurone aus dem Ganglion gasseri der
Ratte etabliert. In diesem Kultursystem überlebten die vereinzelten neuronalen Zellen bis zu
einer Woche. Neurone wurden zunächst durch eine positive Immunfärbung mit einem
Antikörper gegen Neuronen-spezifisches Tubulin (NST) identifiziert (Abb.3.1). In den
folgenden Experimenten wurden die Neurone anhand ihrer charakteristischen Morphologie
(große runde Somata mit einem Durchmesser von durchschnittlich 45 µm) und
elektrophysiologisch anhand ihrer Fähigkeit, Aktionspotentiale (AP) zu generieren, von
ebenfalls kultivierten Gliazellen unterschieden. Kennzeichnend für kultivierte trigeminale
Neurone war ihr schnelles Neuritenwachstum. Vier Stunden nach der Dissoziation konnten
bereits neugebildete Neurite beobachtet werden (Abb.3.1a). In den folgenden
Kultivierungstagen entwickelte sich ein dichtes Netzwerk von Neuriten (Abb.3.1b,c). Das
Verhältnis von nicht-neuronalen zu neuronalen Zellen betrug etwa 100:1, eine Relation
vergleichbar humaner trigeminaler Ganglien (LaGuardia et al., 2000).
a b c
Abb.3.1: Immunhistochemische Färbung trigeminaler Neurone mit einem Antikörper gegen Neuronen-spezifisches Tubulin (NST) a: Neurone vier Stunden nach der Dissoziation b: Neurone einen Tag nach der Dissoziation, ein Tag in vitro (1 DIV) c: Neurone zwei Tage nach der Dissoziation, (2 DIV) Hier wird das schnelle Wachstum der Neurite während der Kultivierung deutlich. Die Balken zeigen jeweils 50 µm.
40
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2 Charakterisierung der kultivierten trigeminalen Neurone anhand ihrer P2X-Rezeptor
Expression
Wie bereits beschrieben, können trigeminale Neurone eine Vielzahl verschiedener Stimuli
detektieren. Bislang ist allerdings unklar, ob es sich um polymodale Neurone handelt oder ob
spezialisierte Neurone existieren, die nur über spezifische Detektionsmechanismen verfügen.
Verschiedene Untersuchungen belegen, dass unterschiedliche Stimuli von separaten
Neuronengruppen wahrgenommen werden (Sekizawa und Tsubone, 1994; Liu und Simon,
1996; Liu et al., 1998; Caterina et al., 1997; Hummel et al., 1998; Alimohammadi und Silver,
2000; McKemy et al., 2002). Cook und Mitarbeiter klassifizierten trigeminale Neurone,
indem sie Subgruppen bestimmter Funktion durch anterogerade Färbetechniken identifizierten
und bezüglich ihrer P2X-Rezeptor Expression untersuchten. Ihre Ergebnisse weisen darauf
hin, dass ein Zusammenhang zwischen der Expression von Purinrezeptoren und den
Detektionseigenschaften trigeminaler Neurone besteht. Daher habe ich in der vorliegenden
Arbeit zunächst eine Charakterisierung der Purinrezeptor-Expression der kultivierten Neurone
des trigeminalen Ganglions vorgenommen.
3.2.1 ATP induzierte Ströme
Mit Hilfe schneller Applikation verschiedener ATP Konzentrationen wurde eine
elektrophysiologische Charakterisierung der Purinrezeptor-Expression trigeminaler Neurone
mittels der „patch-clamp“ Technik in der Ganzzell-Konfiguration („whole-cell“)
vorgenommen.
98% aller untersuchten Neurone (230/234) waren ATP sensitiv. Die verwendete ATP
Konzentration (30 µM) entspricht physiologischen Bedingungen, da extrazelluläres ATP in
vivo schnell abgebaut wird und so die intrazellulär auftretenden hohen ATP Konzentrationen
von einigen Millimolar im extrazelulären Milieu nicht erhalten bleiben (Cook et al., 1997).
Anhand der charakteristischen Kinetik der ATP-induzierten Stromantworten konnten drei
verschiedene neuronale Populationen unterschieden werden.
Eine große Gruppe von Neuronen (57%, 130/230) zeigte einen langsam aktivierenden
Einwärtsstrom (Anstiegszeit: 84 ± 7 ms (Zeit von 10% bis 90% der Maximalamplitude)), der
während der ATP Applikation (30 µM) von einer Sekunde nur schwach desensitisiert
(„persistenter Strom“, Abb.3.2a). Die Amplitude lag am Ende der ATP Applikation bei 83 ±
3% der Maximalamplitude (n = 33). Die ermittelten Maximalamplituden in unterschiedlichen
41
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Zellen waren sehr variabel und reichten von 30 pA bis 1079 pA (Mittelwert: 383 ± 52 pA)
(siehe Tabelle 3.1).
Der zweite Neuronentyp (18 %, 42/230) zeigte phasische Einwärtsströme, die sich durch
schnelle Anstiegszeiten (33 ± 7 ms), und eine rapide Desensitisierung mit biexponentieller
Kinetik (τ1 = 48 ± 10 ms, τ2 = 231 ± 59 ms) auszeichneten. Diese Ströme desensitisierten
während der ATP Applikation von einer Sekunde fast vollständig auf 4 ± 1 % der
Maximalamplitude (n = 17) („transienter Strom“, Abb.3.2b). Die Anstiegszeit und die
Desensitisierungsrate der ATP-induzierten Ströme der ersten und der zweiten
Neuronenpopulation unterschieden sich signifikant voneinander (p ≤ 0,001). Die
Maximalamplituden der zweiten Neuronenpopulation wiesen ebenfalls eine enorme
Variabilität von 94 pA bis 605 pA auf (Mittelwert: 315 ± 37 pA).
Die Neurone der dritten Subpopulation (25 %, 58/230) zeigten zwei Komponenten ATP-
induzierter Antworten. Dem ersten schnell ansteigenden und rapide desensitisierenden
Einwärtsstrom folgte eine zweite Stromkomponente, die in Gegenwart von ATP einen
andauernden Strom zeigt (gemischter Strom, Abb.3.2c). Applikation von 30 µM ATP
induziert in diesen Neuronen Ströme mit Maximalamplituden von 107 pA bis 620 pA
(Mittelwert: 335 ± 32 pA). Die Anstiegszeit betrug 51 ± 11 ms. Die Amplitude der nicht-
desensitisierenden Komponente betrug am Ende der ATP Applikation von einer Sekunde 52 ±
5% der Maximalamplitude (n = 25). Entsprechend unterschied sich die Desensitisierungsrate
dieser Neurone signifikant von denen der anderen beiden Populationen (p ≤ 0,001 für beide).
Darüber hinaus waren die Anstiegszeiten der gemischten Ströme dieser dritten Population und
der persistenten Ströme der ersten Population signifikant verschieden (p ≤ 0,05). Zwischen
den Anstiegszeiten der gemischten Ströme und der transienten Ströme der zweiten Population
bestand kein signifikanter Unterschied.
Tabelle 3.1: Eigenschaften der Ströme, die von 30 µM ATP induziert werden (Haltepotential: -60 mV) (Mittelwerte ± S.E.M., * p≤ 0.05; *** p≤ 0,001) Anstiegszeit
(ms)
Desensitisierungsrate
(%) nach 1 s
Maximalamplitude
(pA)
persistente Ströme 84 ± 7
***
17 ± 3
***
383 ± 52
(von 30 bis 1079)
transiente Ströme 33 ± 7 * 96 ± 1 *
*
315 ± 37
(von 94 bis 605)
gemischte Ströme 51 ± 11 52 ± 5 335 ± 35
(von 107 bis 620)
42
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Diese drei beschriebenen Neuronenpopulationen konnten auch bei Messungen im „current-
clamp“ Modus identifiziert werden. Die Applikation von ATP für die Dauer von einer
Sekunde induzierte in einer bestimmten Gruppe trigeminaler Neurone eine anhaltende
Depolarisation und eine gleichmäßige Folge von AP (Abb.3.2d). Dieses Phänomen stand in
direktem Zusammenhang mit dem im „voltage-camp“ Modus gemessenen, nicht-
desensitisierenden Einwärtsstrom. Im Gegensatz zu Neuronen der ersten Population
generieren Neurone der zweiten Population im current-clamp nur zu Beginn der Applikation
einige wenige AP und das Membranpotential kehrt noch während der ATP Applikation auf
den Ruhewert zurück (Abb.3.2e). Diese Eigenschaften spiegeln den transienten
Einwärtsstrom im voltage-clamp wider. Current-clamp Messungen der dritten
Neuronenpopulation stellten, ebenso wie die voltage-clamp Messungen, eine Mischung aus
den zuvor beschriebenen ATP-induzierten Antworten dar. Diese Neurone generierten zu
Beginn der ATP Applikation einige AP und zeigten dann eine anhaltende Depolarisation, die
bis zum Ende der Applikation bestehen blieb (Abb.3.2f).
Abb.3.2: Verschiedene ATP Antworten kultivierter trigeminaler Neurone auf ATP Applikation 30 µM ATP wurde für 1s appliziert a/c/e: whole cell voltage clamp Aufnahmen, holding potential: -60 mV b/d/f: whole cell current clamp Aufnahmen, es wurde kein Strom injiziert, das Ruhemembranpotential ist angezeigt a, b: persistenter Strom; c, d: transienter Strom; e, f: gemischter Strom
43
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Die drei Populationen zeigten keine Unterschiede bezüglich ihrer ATP Sensitivität und
wurden daher für die Bestimmung der Dosis-Wirkungsbeziehung zusammengefasst. Anhand
des ermittelten ATP Dosis-Wirkungsverhältnisses ließ sich eine halbmaximale
Aktivierungskonzentration (EC50) von 30 ± 5,5 µM ATP und ein Hill-Koeffizient von 0,8
bestimmen (Abb.3.3). Da nicht alle ATP Konzentrationen an derselben Zelle getestet werden
konnten, ergibt sich die Dosis-Wirkungskurve aus 74 Experimenten mit einen Minimum von
7 unabhängigen Messungen für jede Konzentration.
Abb.3.3: ATP Dosis-Wirkungsbeziehung kultivierter trigeminaler Neurone a: Die schwarzen Kreise zeigen die ATP Dosis-Wirkungsbeziehung persistenter Ströme, die weißen Quadrate die gemischter Ströme und die grauen Dreiecke die transienter Ströme. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen den Strömen verschiedener Kinetik festgestellt werden. Die daher zusammengefassten Daten wurden mit Hilfe einer Hill Gleichung gefittet. Es ergab sich ein EC50 von 30 µM ATP und ein Hill-Koeffizient von 0,8. b-d: Beispielströme, induziert von verschiedenen ATP Konzentrationen obere Spuren: 1 µM ATP (1 s), mittlere Spuren: 10 µM ATP (1 s), untere Spuren: 100 µM ATP (1 s) b: gemischte Ströme c: transiente Ströme, in der unteren Spur überlagerten Natriumströme (grau) den ATP- induzierten Strom, dieser wird daher durch eine eingezeichnete schwarze Linie gekennzeichnet d: persistente Ströme
44
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2.2 Vergleich der elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronenpopulationen
Um die Neurone des Ganglion gasseri weiter zu klassifizieren, habe ich die grundlegenden
biophysikalischen Eigenschaften der Neuronenpopulationen verglichen, die unterschiedliche
Antworten auf ATP-Applikation zeigen (Tabelle 3.2).
Das Ruhemembranpotential der drei Neuronenpopulationen unterschied sich nicht signifikant
voneinander. Das mittlere Ruhepotential lag bei -51 ± 7 mV (n = 71). Die Membrankapazität
wies ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf (Mittelwert 19 ± 1 pF).
Einzelne Neurone konnten jedoch anhand der Form ihrer AP klassifiziert werden. Bei
manchen Neuronen fiel eine „Beule“ („hump“) während der Repolarisationsphase der AP auf.
Diese verlangsamte Repolarisation kommt durch einen von Kalzium-Ionen getragenen
Stromanteil zustande (Gallego, 1983). Andere Neuronen wiesen diese Stromkomponente
nicht auf, die Repolarisation zeigt keinen „hump“.
Im Folgenden wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Art der generierten AP
und der ATP-Rezeptor-Expression besteht. Neurone, die mit einem persistenten Strom auf
ATP-Applikation antworteten, generierten 37 % der Neurone AP mit hump in der
Repolarisationsphase (14/37). 60 % der Neurone, bei denen ATP einen transienten Strom
induzierte, wiesen AP mit hump auf (6/10). Etwa die Hälfte aller Neurone, die mit
gemischtem Strom auf ATP-Applikation antworteten, bildeten AP mit hump in der
Repolarisationsphase aus (46 %, 11/24). Demnach ließ sich keiner der drei Populationen eine
Präferenz hinsichtlich der AP Form zuweisen.
Ein Vergleich der AP Maximalamplituden der unterschiedlich ATP-sensitiven
Neuronenpopulationen zeigte keine Unterschiede. Daher wurden die Daten zusammengefasst
und hinsichtlich der Ausbildung oder der Nichtausbildung eines humps verglichen. Dabei
waren die Maximalamplituden der AP mit hump signifikant größer als jene ohne hump (Tab.
3.2).
Zusätzlich wurde die Dauer der AP bei 30% und bei 50 % der Maximalamplitude bestimmt,
wobei für keinen der beiden Werte ein signifikanter Unterschied im Vergleich der
Neuronenpopulationen mit unterschiedlichen ATP-Antworten oder mit unterschiedlichen AP
Formen gezeigt werden konnte (Mittelwerte: 2 ± 0,1 ms bei 50 % der Maximalamplitude; 4 ±
0,2 ms bei 30 % der Maximalamplitude). Auch die Amplitude der Hyperpolarisation
unterschied sich in keiner Gruppe signifikant (Mittelwert: 17 ± 7 mV).
45
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Tabelle 3.2: Eigenschaften der Aktionspotentiale (gemessen am Ruhemembranpotential; AP wurden durch Strominjektionen, die den Schwellenwert überschritten, induziert; die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M., * p≤ 0.05) ATP induzierte Ströme
AP-Form Maximal-amplitude
(pA)
AHP Ampl. (pA)
Dauer (50%) (ms)
Dauer (30%) (ms)
hump 103 ± 5 18 ± 1 2.3 ± 0.2 3.9 ± 0.4
Persistent ohne hump 89 ± 5 17 ± 1 2.5 ± 0.2 4.2 ± 0.5
hump 115 ± 5 16 ± 3 2.1 ± 0.3 3.9 ± 0.6
Transient ohne hump 98 ± 23 18 ± 4 2.1 ± 0.4 3.4 ± 1.1
hump 117 ± 3 15 ± 1 2.0 ± 0.6 4.5 ± 0.5
Gemischt ohne hump 92 ± 5 17 ± 2 1.6 ± 0.2 3.2 ± 0.9
hump 112 ± 3 * 17 ± 1 2.1 ± 0.2 4.1 ± 0.2
alle Neurone ohne hump 100 ± 3 17 ± 1 2.2 ± 0.1 4.0 ± 0.2
46
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2.3 Pharmakologische Charakterisierung der verschiedenen ATP-induzierten Ströme
Um die Purinrezeptor-Expression der drei identifizierten Populationen kultivierter
trigeminaler Neurone näher zu charakterisieren, wurden verschiedene Pharmaka, die als
Untereinheiten-spezifische Agonisten bzw. Antagonisten von P2X-Rezeptoren fungieren,
verwendet (zur Übersicht siehe Einleitung). Die Experimente wurden mit einem Interstimulus
Intervall von mindestens 90 Sekunden durchgeführt. Diese Zeitspanne reichte bei allen
Neuronen aus, um eine mögliche Desensitisierung aufzuheben. Bei wiederholter ATP-
Applikation traten keine signifikanten Unterschiede in der Kinetik der induzierten Ströme auf.
Die Messungen ergaben, dass sich trigeminale Neurone, die einen persistenten ATP-
induzierten Strom aufwiesen, nicht durch α,β meATP in niedriger Konzentration (15 µM)
aktivieren ließen (n = 31). Applikation von Ip5I (50 µM, 60 s vor und während der ATP-
Applikation) hatte keinen Effekt auf den Strom, Applikation von Cibacron Blue (20 µM, 120
s vor und während der ATP-Applikation) hingegen inhibierte den persistenten Einwärtsstrom
(Abb.3.4a). Niedrigere Konzentrationen von Cibacron Blue (10 µM) führten zu einer
partiellen Inhibition des Stromes. Dieses pharmakologische Profil entspricht der Expression
homomerer P2X2-Rezeptoren.
Die ATP-induzierten transienten Einwärtsströme der zweiten Neuronenpopulation ließen sich
durch α,β meATP (15 µM) aktivieren und durch den Antagonisten Ip5I (50 µM) blockieren (n
= 8) (Abb.3.4b). Dieses pharmakologische Profil deutet auf die Expression homomerer P2X3-
Rezeptoren hin.
Das pharmakologische Profil der dritten Population wies interessante Eigenschaften auf. α,β
meATP in niedrigen Konzentrationen aktivierte in diesen Neuronen ausschließlich die schnell
ansteigende und schnell desensitisierende Stromkomponente, währende Ip5I genau diese
Stromkomponente inhibierte (n = 12) (Abb.3.4c). Diese Eigenschaften stimmen nicht mit den
beschriebenen pharmakologischen Eigenschaften heteromerer P2X2/3-Rezeptoren überein,
sondern weisen vielmehr auf die Expression zweier separater Rezeptorpopulationen, nämlich
homomerer P2X2- und P2X3-Rezeptoren, hin, die unabhängig voneinander aktiviert und
inhibiert werden können.
47
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.4: Pharmakologische Identifikation der P2X Untereinheitenzusammensetzung der nativen P2X-Rezeptoren Applikationen waren 30 µM ATP, 15 µM meATP, 50 µM Ip5I + ATP und 20 µM Cibacron blue + ATP, jeweils für 1 s * 60 s Präinkubation mit Ip5I vor der Applikation von ATP + Ip5I (a,b,c) ** 120 s Präinkubation mit Cibacron blue vor der Applikation von ATP + Cibacron blue (a) a: ATP-induzierter persistenter Strom, kein Effekt von meATP or Ip5I, aber effektiver Block durch Cibacron blue → pharmakologisches Profil homomerer P2X2-Rezeptoren b: ATP induzierter transienter Strom, meATP induziert den transienten Strom, Ip5I blockt den transienten Strom → pharmakologisches Profil homomerer P2X3-Rezeptoren c: ATP induzierter gemischter Strom, meATP induziert ausschließlich die transiente Komponente des gemischten Stromes, Ip5I blockt ausschließlich die transiente Komponente → pharmakologisches Profil homomerer P2X2- und homomerer P2X3-Rezeptoren
48
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2.4 Immunhistochemische P2X-Rezeptor Identifikation
Zusätzlich zur elektrophysiologischen und pharmakologischen Charakterisierung der P2X-
Rezeptor-Expression in trigeminalen Neuronen, habe ich die Lokalisation der Rezeptoren
mittels immunhistochemischer Methoden untersucht. Dazu wurden spezifische Antikörper
gegen die P2X-Rezeptorproteine der Untereinheiten 2 (P2X2) und 3 (P2X3) verwendet. Ein
Teil der kultivierten trigeminalen Neurone (22 %, 11/50) zeigte eine exklusiv positive
Immunreaktion gegen P2X3-Rezeptoruntereinheiten sowohl auf den Somata als auch auf den
Neuriten der Neurone (rote Färbung, Abb.3.5a). 36 % (18/50) der Neurone waren
immunopositiv sowohl für P2X2- und für P2X3-Rezeptoruntereinheiten, was sich in einer
roten und grünen bzw. gelben (Bildüberlagerung) Färbung der Somata widerspiegelte. Die
Färbung der Neuriten zeigte, dass beide Rezeptoruntereinheiten (P2X2 und P2X3) auch auf
den Ausläufern lokalisiert sind (Abb.3.5b). Die übrigen Neurone (42 %, 21/50) waren
ausschließlich grün gefärbt, d.h. sie zeigten nur eine positive Immunreaktion gegen P2X2-
Rezeptoruntereinheiten (Abb.3.5c). P2X3-Rezeptoruntereinheiten waren auf diesen Neuronen
nicht nachweisbar. Diese immunhistochemischen Befunde stimmen sowohl qualitativ als auch
quantitativ mit den Ergebnissen der elektrophysiologischen Untersuchungen überein. Jede der
drei pharmakologisch identifizierten Subpopulationen lässt sich mittels der spezifischen
Immunfärbungen nachweisen.
49
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
a b c
d e f
g h i
j k l
**** **
* *
* *
Abb.3.5: Immunhistochemische Färbung kultivierter trigeminaler Neurone (2 DIV) mit spezifischen Antikörpern gegen P2X2- und P2X3-Rezeptoruntereinheiten a, d, g, j: Färbung gegen P2X2-Rezeptoruntereinehiten mit Alexa dye 546 (grün) b, e, h, k, : Färbung gegen P2X3-Rezeptoruntereinheiten mit Alexa dye 488 (rot) c, f, i, l: Cofärbung gegen P2X2- und P2X3-Rezeptoruntereinheiten (rot und grün) a-c zeigen ein Neuron, das nur P2X3-Rezeptoruntereinheiten exprimiert, es sind sowohl Soma als auch Neurite gefärbt. d-f zeigen zwei Neurone, die P2X2- und P2X3-Rezeptoruntereinheiten exprimieren, dies resultiert in einer rot/grün oder gelben Färbung. Der Ausläufer des einen Neurons ist rot und grün gefärbt, der Ausläufer des anderen Neurons ist nur grün gefärbt. g-i zeigen Neurone, die ausschließlich P2X2-Rezeptoruntereinheiten exprimieren (drei Neurone nebeneinander). j-l: Kontrollfärbung, die primären Antikörper wurden mittels spezifischer Blockpeptide präabsorbiert. Der Skalierungsbalken ist für alle Bilder identisch und zeigt 50 µm. Die Cofärbung belegte die Existenz drei verschiedener Neuronentypen. Besonders zu beachten ist die Färbung der Neuriten (gekennzeichnet durch *).
50
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.2.5 Funktionelle dendritische P2X-Rezeptor Expression
Die räumliche Verteilung der P2X-Rezeptoren auf den trigeminalen Neuronen ist von großer
Bedeutung für ihre physiologische Funktion. Eine Beteiligung der P2X-Rezeptoren an der
Chemoperzeption trigeminaler Neurone würde deren Lokalisation in der Peripherie erfordern.
Die immunhistochemischen Ergebnisse belegen, dass beide Rezeptoruntereinheiten sowohl
auf den Somata als auch auf den Neuriten der Neurone exprimiert werden, allerdings bleibt
ihre periphere Funktionalität ungeklärt. Zur Untersuchung dieses Aspekts habe ich eine
Kultivierungsmethode verwendet, in der kleine undissoziierte Gewebeexplantate in einer
Kulturschale ausgebracht wurden. Ausgehend von diesen Gewebestücken bildeten die
Neurone bis zu einige Millimeter lange Fortsätze, die in die Peripherie zogen. Mit Hilfe der
druckluftgesteuerten Applikationsapparatur und direkter Absaugung war es möglich,
ausschließlich die Enden dieser Neuriten und damit die peripher lokalisierten P2X-Rezeptoren
mit ATP zu aktivieren (Abb.3.6a,b). Diese fokale ATP Stimulierung der distalen Endbereiche
der Neurite führte zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration in einigen Somata, die im
Gewebeexplantat lokalisiert waren (Abb.3.6c). Dieser Anstieg der intrazellulären
Kalziumkonzentration, der mittels der „Calcium-Imaging“ Technik unter Verwendung eines
Kalzium-sensitiven Farbstoffes (fura-2) gemessen wurde, kommt wahrscheinlich durch die
Fortleitung der ATP-induzierten Membrandepolarisation von den Neuriten zum Soma
zustande.
Dieser Befund ist ein deutlicher Hinweis auf die funktionale P2X-Rezeptor-Lokalisation in
den Endbereichen der vom Explantat auswachsenden Neurite.
51
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
500 µm 50 µm
a b
80µM ATP (100µM)
0.02
10 s
c
f340/f380
Abb.3.6: Stimulation trigeminaler Nervenfasern mit ATP a: Bild eines kultiverten trigeminalen Explantates, von dem aus lange Ausläufer in die Peripherie ziehen (siehe kleine Pfeile), die dunkle Färbung in der oberen rechten Ecke des Bildes zeigt gefärbte ATP Lösung, die nur die Ausläufer in der Peripherie und nicht die Zellsomata im Explantat überspült. Die Ellipsen markieren die Regionen (“regions of interest”), in denen lokale Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration detektiert werden. b: 3d Rekonstruktion (Projektion eines Z-Stapels) eines trigeminalen Explantates einer GFP-Maus. Lange Ausläufer ziehen in verschiedenen Ebenen vom Explanat ausgehend in die Peripherie. Nur die Enden dieser Ausläufer befinden sich am Boden. Bei den kleinen Zellen, die an den Fasern zu hängen scheinen, handelt es sich wahrscheinlich um Gliazellen. Mit Hilfe dieses konfokalen Bildes soll lediglich der Aufbau der Explantatkultur deutlich gemacht werden; die Experimente wurden an Rattenexplantaten mit Hilfe des Ca-Imaging System durchgeführt (siehe Methoden). c: Kinetik der relativen Änderung der Kalziumkonzentration im Explantat induziert durch ATP Stimulation der Neurite. Bei den Daten handelt es sich um den f340/f380 Quotienten, der gegen die Zeit aufgetragen ist.
3.2.6 Vergleich nozizeptiver und nicht-nozizeptiver Neurone
Wie einleitend erwähnt, scheint die Expression bestimmter P2X-Rezeptoruntereinheiten mit
der Funktion der Neurone zu korrelieren (Cook et al., 1997). Daher habe ich die
unterschiedlichen trigeminalen Neuronenpopulationen bezüglich der Merkmale nozizeptiver
Neurone untersucht. Die Expression TTX-insensitiver Natriumkanäle ist ein anerkanntes
Merkmal solcher Schmerzfasern (Pearce und Duchen, 1994; Djouhri et al., 1998; Lopez di
Armentia et al., 2000).
Untersuchungen im „Current-clamp“ Modus (Whole-cell patch clamp) zeigten, dass bei 67 %
(69/103) der kultivierten dissoziierten Neurone eine Strominjektion auch während der
Inkubation mit Tetrodotoxin (TTX, 1 µM) zur Generation von AP führte. Die übrigen
Neurone waren auch bei erhöhter Strominjektion nicht in der Lage, in Gegenwart von TTX
AP zu generieren (Abb.3.7). Der Hauptteil der TTX-insensitiven Neurone (87 %, 60/69)
antwortete auf ATP-Applikation mit transienten oder gemischten Strömen. Entsprechend der
pharmakologischen Charakterisierung exprimierten diese Neurone ausschließlich P2X3-
(transienter Strom) oder P2X3- in Kombination mit P2X2-Rezeptoruntereinheiten (gemischter
Strom) (Abb.3.7a). Im Gegensatz dazu zeigten fast alle Neurone, in denen ATP einen
persistenten Strom induzierte und die entsprechend nur P2X2-Rezeptoruntereinheiten
exprimierten, eine TTX-Sensitivität (91%, 31/34) (Abb.3.7b). Da dieser letzteren Population
52
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
zwei typische Eigenschaften nozizeptiver Neurone (TTX-Insensitivtät und P2X3-
Rezeptoruntereinheiten Expression) fehlen, ist es wahrscheinlich, dass diese Neurone eine
nicht-nozizeptive Funktion aufweisen.
Abb.3.7: TTX-Sensitivität trigeminaler Neurone mit unterschiedlichem ATP Antwortverhalten Die Fähigkeit der Neurone, AP zu generieren, wurde in „current-clamp“ Experimenten untersucht. Die Neurone wurden schrittweise depolarisiert bis sie AP generierten, dasselbe Experiment wurde während der Anwesenheit von 1 µM TTX wiederholt. a: TTX-insensitive Neurons zeigten alle drei Formen ATP-induzierter Ströme, aber die Mehrzahl der Neurone antwortete mit transienten oder gemischten Strömen (60/69) und exprimieren daher wahrscheinlich P2X3-Rezeptoruntereinheiten. b: TTX-sensitive Neurone antworteten fast ausschließlich mit persistenten Strömen (31/34), höchstwahrscheinlich induziert durch Aktivierung homomerer P2X2-Rezeptoren.
3.3 Wirkungen von Duftstoffen auf trigeminale Neurone
Die Entdeckung der bislang nicht beschriebenen, nicht-nozizeptiven, P2X2-Rezeptor
exprimierenden Population trigeminaler Neurone führt zu Spekulationen über ihre
physiologische Funktion. Möglicherweise spielen diese Neurone eine besondere Rolle in der
trigeminalen Detektion von Duftstoffen, die neben dem olfaktorischen auch das trigeminale
System stimulieren. Daher habe ich Neurone dieser Population auf spezifische Sensitivität
gegenüber solchen trigeminalen chemischen Stimuli untersucht.
53
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.4 Der Duftstoff Benzaldehyd als trigeminaler Stimulus
Ein potentieller Stimulus ist Benzaldehyd, eine bei Raumtemperatur farblose Flüssigkeit mit
bittermandelartigem, an Marzipan erinnernden Geruch. Mehrere Studien belegen, dass
Benzaldehyd vom trigeminalen System wahrgenommen werden kann (Doty et al., 1978;
Bryant and Silver, 2000; Hummel et al., 2003). Die Expression typischer „olfaktorischer
Rezeptorproteine“ (Buck und Axel, 1991), zu denen auch ein Benzaldehyd-sensitiver
Rezeptor gehört (Bozza et al., 2002), wurde im trigeminalen Ganglion mittels RT-PCR
untersucht. Dabei wurde ein Primerpaar degenerierter Sequenz, die hoch konservierten
Regionen der olfaktorischen Rezeptorgenfamilie entspricht (Buck und Axel, 1991),
verwendet. Die PCR mit diesem Primerpaar ergab kein detektierbares PCR-Produkt aus
cDNA des Ganglion gasseri, aber eine starke Bande aus cDNA des olfaktorischen Epithels
(Abb.3.8). In trigeminalen Neuronen werden diese spezialisierten Rezeptorproteine nicht
exprimiert und sind demnach auch nicht in die Mechanismen trigeminaler Duftstoffdetektion
involviert.
Im Gegensatz zu den oben genannten Studien, die Benzaldehyd als wirksamen trigeminalen
Stimulus beschreiben, konnte ich keine direkte Aktivierung trigeminaler Neurone der drei
Populationen durch Benzaldehyd feststellen. Die Applikation von Benzaldehyd (2.25 mM)
führte weder zu einer Induktion von Ionenströmen oder Änderungen des Membranpotentials
(elektrophysiologische Untersuchungen, n = 15) noch zu einer Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration (Calcium-Imaging Experimente, n = 16).
olf. Rezeptoren GAPDH
250 bp -
500 bp -
500 bp -
750 bp -Gg OE Ktr Gg OE Ktr
Abb.3.8: PCR Detektion der Expression olfaktorischer Rezeptorneurone im trigeminalen Ganglion und im olfaktorischen Epithel PCR mit einem Paar sequenz-degenerierter Primer, die anhand konservierter Regionen olfaktorischer Rezeptorproteine erstellt wurden, detektierte Transkripte in der RNA des olfaktorischen Epithels, aber nicht in der RNA des trigeminalen Ganglions der Ratte. Die Qualität der cDNA Synthese wurde durch die Detektion von GADPH cDNA (Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase) kontrolliert. (Gg: Ganglion gasseri, OE olfaktorisches Epithel, Ktr: Kontrolle mit Wasser)
54
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.4.1 Benzaldehyd Modulation purinerger Rezeptoren
Offen bleibt, wie trigeminale Neurone den chemischen Stimulus Benzaldehyd detektieren
können. Interessanterweise führte gleichzeitige Applikation von Benzaldehyd und ATP auf
trigeminale Neurone zu einer Modulation der ATP-induzierten Stromantwort. Die
Untersuchungen belegten, dass dieser Effekt von Benzaldehyd spezifisch für
nichtdesensitisierende P2X2-Rezeptor vermittelte Ströme ist. Die Koapplikation von
Benzaldehyd (2,25 mM) und ATP (10 µM) reduzierte die Maximalamplitude signifikant (p ≤
0,05; n = 10) auf 63 ± 11 % der von ATP allein induzierten Antwort (Abb.3.9a,d). Die
Anstiegszeit (Zeit von 10 % bis 90 % der Maximalamplitude) und die Antwortzeit (Zeit vom
Start der Applikation bis 50 % der Maximalamplitude) des ATP-induzierten Stromes wurden
durch gleichzeitige Benzaldehydgabe ebenfalls moduliert. Beide Eigenschaften nahmen
signifikant um 193 ± 71 % bzw. 157 ± 37 % zu (p ≤ 0,05; n = 10 für beide) (Abb.3.9b,c,d).
Zudem wurden mögliche Auswirkungen einer Präinkubation mit Benzaldehyd auf die eben
beschriebenen Effekte untersucht. Eine 30 sekündige Präinkubation der trigeminalen Neurone
mit Benzaldehyd und anschließender Koapplikation von Benzaldehyd und ATP führte zu
einer weiteren signifikanten Reduktion der Maximalamplitude des ATP-induzierten Stromes
auf 34 ± 8 % (p ≤ 0,001; n = 10) und erhöhte die Anstiegszeit signifikant um 285 ± 88 % (p ≤
0,05; n = 10). Die Antwortzeit nahm durch die Präinkubation nicht signifikant weiter zu. Eine
Verlängerung der Präinkubationzeit auf 90 Sekunden führte zu keiner weiteren
signifikantenVeränderung der drei Effekte (Abb.3.9a,b,c,d).
Im Gegensatz zu den persistenten P2X2-Rezeptor vermittelten Strömen wurden transiente
P2X3-Rezeptor vermittelte Ströme nicht von einer Benzaldehyd (2,25 mM)-ATP (10 µM)
Koapplikation verändert (Abb.3.9e). Auch die Aktivierung des Rezeptors durch seinen
spezifischen Agonisten α,β meATP (10 µM) blieb unbeeinflusst durch Benzaldehyd
Koapplikation. Präinkubation mit Benzaldehyd war ebenso wirkungslos.
55
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.9: Benzaldehydmodulation ATP-induzierter Ströme in trigeminalen Neuronen a-c: Modulation ATP-induzierter persistenter Ströme; Maximalamplitude, Anstiegszeit und Antwortzeit des induzierten Stromes wurden jeweils auf die ursprüngliche (erste) ATP Antwort normiert (Mittelwerte ± SEM, * zeigt Signifikanz p ≤ 0.05; *** p ≤ 0.001). a: Koapplikation mit 2,25 mM Benzaldehyd führte zu einer signifikanten Reduktion der Amplitude, Benzaldehyd-Präinkubation für 30 s bzw. 90 s reduzierte die Amplitude noch stärker. b: Die Anstiegszeit wurde durch Benzaldehyd Koapplikation signifikant erhöht, Präinkubation verstärkte auch diesen Effekt. c: Die Antwortzeit der Ströme wurde durch Benzaldehyd ebenfalls erhöht, allerdings konnte keine signifikante Verstärkung durch Präinkubation ermittelt werden. d-e: Vergleich der Benzaldehydmodulation ATP-induzierter Ströme verschiedener Kinetik in trigeminalen Neuronen d: ATP (10 µM) induzierte einen persistenten Strom, Benzaldehyd allein (2,25 mM) hatte keinen Effekt. Die Koapplikation führte zu einer Reduktion der Maximalamplitude sowie zu einer Verlängerung der Anstiegs- und der Antwortzeit. Die Modulation der Maximalamplitude und der Anstiegszeit wurden durch Präinkubation verstärkt. e: ATP (10 µM) induzierte einen transienten Strom, auch auf Neurone dieses Typs hatte Benzaldehyd allein keinen Effekt. Im Gegensatz zu den persistenten Strömen veränderte eine Koapplikation den ATP-induzierten transienten Strom bezüglich keiner der untersuchten Parameter.
56
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Um einen möglichen direkten Effekt von Benzaldehyd auf den P2X2-Rezeptor
charakterisieren zu können, ist es wichtig, den Rezeptor außerhalb des nativen trigeminalen
Systems zu untersuchen. Daher wurde dieser Rezeptor in einem heterologen System (HEK
293 Zellen) rekombinant exprimiert. Auch in diesem System induzierte Benzaldehyd allein
(in Konzentrationen bis zu 4,5 mM) keine nachweisbaren Zellantworten in patch-clamp
Experimenten (Haltepotential: -60 mV, n = 10). Koapplikation von Benzaldehyd (2.25 mM)
und ATP (10 µM) führte zu Modulationen der ATP-induzierten Ströme ähnlich den in
trigeminalen Neuronen beschriebenen Effekten (Abb.3.10a). Die verwendete ATP
Konzentration von 10 µM entspricht dem EC50 Literaturwert für heterolog in HEK Zellen
exprimierte P2X2-Rezeptoren (Spelta et al., 2003). Benzaldehyd reduzierte die
Maximalamplitude der P2X2-vermittelten Ströme auf 70 ± 6 % und verlängerte die
Anstiegszeit auf 213 ± 19 % (p ≤ 0,001; jeweils n = 8). Die Antwortzeit der Stromantwort
wurde ebenfalls signifikant auf 211 ± 15 % verlängert (p ≤ 0,001; n = 8). Nach einer
Auswaschperiode (90 s) konnten wieder ATP-Ströme der usprünglichen Größenordnung
(Kontrolle) detektiert werden.
Um die Spezifität der Benzaldehydmodulation zu überprüfen, wurden auch heterolog
exprimierte P2X3-Rezeptoren untersucht. ATP-induzierte P2X3-Ströme wurden durch
Koapplikation von Benzaldehyd (2,25 mM) nicht signifikant beeinflusst (Abb.3.10a). Die
Spezifität der Benzaldehydmodulation an P2X2-Rezeptoren wurde durch ein weiteres
Experiment unterstrichen. Auch der ebenfalls heterolog exprimierte TRPM8-Rezeptor, ein
weiterer ionotroper Ionenkanal trigeminaler Neurone, der durch 100 µM Menthol aktiviert
wurde (McKemy et al., 2002), ließ sich durch Benzaldehyd nicht modulieren (Abb.3.10b).
57
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.10: Spezifität des Benzaldehydeffektes a: Vergleich der Benzaldehydmodulation P2X2- und P2X3-Rezeptor vermittelter Ströme (heterologe Rezeptorexpression in HEK 293 Zellen). Die Maximalamplitude, die Anstiegszeit und die Antwortzeit wurden auf die ATP-induzierte Antwort des jeweiligen Rezeptortyps unter Kontrollbedingungen normiert. Bei P2X2-Rezeptor vermittelten Strömen wurde jede der drei Eigenschaften durch ATP und Benzaldehyd Koapplikation signifikant verändert. Keine signifikante Veränderung konnte bei P2X3-Rezeptor vermittelten Strömen beobachtet werden. (Mittelwerte ± SEM, *** zeigt Signifikanz p ≤ 0.001). Im unteren Teil sind representative P2X2-Rezeptor bzw. P2X3-Rezeptor vermittelte Ströme dargestellt. Diese zeigen, dass P2X2-Rezeptor vermittelte Ströme durch Benzaldehyd moduliert werden, während P2X3-Rezeptor vermittelte Ströme unbeeinflusst bleiben („whole-cell“ Ableitungen, Haltepotential –60 mV). b: Benzaldehydeffekt auf TRPM8-Rezeptoren Um die Spezifität des Benzaldehydeffektes zu untersuchen, wurde ein weiterer trigeminaler ionotroper Rezeptor heterolog exprimiert: der Menthol- und Kälterezeptor TRPM8. Eine Koapplikation des Agonisten Menthol mit Benzaldehyd zeigte, dass der Menthol-induzierte Strom durch Benzaldehyd nicht moduliert wird. Die Maximalamplitude, die Anstiegszeit und die Antwortzeit wurden auf den Menthol-induzierten Strom normiert (Mittelwerte ± SEM).
58
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Die Untersuchung der Dosis-Wirkungsbeziehung des inhibitorischen Benzaldehydeffektes auf
heterolog exprimierte P2X2-Rezeptoren zeigte eine steile Konzentrationsabhängigkeit: die
Maximalamplitude und Antwortzeit des ATP-induzierten Stromes blieben unbeeinflusst von
0,5 mM Benzaldehyd, wurden aber durch Konzentrationen von 2,25 mM maximal verändert.
Der Effekt auf die Anstiegszeit zeigte eine noch steilere Dosisabhängigkeit, 1 mM
Benzaldehyd hatte keinen Effekt, während der maximale Effekt bei 2,25 mM auftrat
(Abb.3.11, Tabelle 3.3a).
Der zugrunde liegende Mechanismus der Benzaldehydmodulation konnte durch
Koapplikation verschiedener ATP-Konzentrationen in Anwesenheit einer sättigenden
Benzaldehydkonzentration (2,25 mM) untersucht werden (Abb.3.12, Tabelle 3.3b). Die
modulierenden Effekte von Benzaldehyd auf die Maximalamplitude, die Anstiegszeit und die
Antwortzeit nahmen bei ansteigender ATP Konzentration ab. Signifikante Modulationen
konnten bei ATP Konzentrationen von 10 µM und 30 µM festgestellt werden (p ≤ 0,001 bzw.
p ≤ 0,05). Stimulation durch ATP Konzentrationen höher als 70 µM, die als sättigende
Konzentrationen an heterolog exprimierten P2X2-Rezeptoren angegeben werden (Spelta et al.,
2003), hoben den Benzaldehydeffekt komplett auf. Diese Aufhebung des
Benzaldehydeffektes durch Erhöhung der ATP Konzentrationen legt eine Kompetition von
Benzaldehyd und ATP um dieselbe Bindestelle des P2X2-Rezeptors nahe.
59
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.11: Abhängigkeit der Modulation P2X2-Rezeptor vermittelter Ströme von der Benzaldehydkonzentration a-c: Die Rezeptoren wurden jeweils durch 10 µM ATP aktiviert. Die Konzentrationsabhängigkeit des Benzaldehydeffektes wurde durch Koapplikation verschiedener Benzaldehydkonzentrationen untersucht. Die Maximalamplitude und die Antwortzeit wurden durch Benzaldehydkonzentrationen von 1 mM und höher moduliert, die Anstiegszeit wurde nur durch Konzentrationen von 2,25 mM oder höher beeinflusst (Mittelwert ± SEM, * zeigt Signifikanz p ≤ 0.05, *** p ≤ 0,001). d: Beispiele für ATP-induzierte Ströme oben: ATP (10 µM) allein appliziert, mittig: ATP koappliziert mit einer nicht wirksamen Benzaldehydkonzentration (0,5 mM), unten: ATP koappliziert mit einer effektiven Benzaldehydkonzentration (2,25 mM).
60
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.12: Abhängigkeit der Benzaldehydmodulation P2X2-Rezeptor vermittelter Ströme von der ATP-Konzentration a-c: Die Rezeptoren wurden mit verschiedenen ATP-Konzentrationen aktiviert. Benzaldehyd wurde in einer maximal wirksamen Konzentration von 2,25 mM koappliziert, die Daten wurden auf die jeweilige ATP-Konzentration normiert. Die modulatorischen Effekte von Benzaldehyd auf die Maximalamplitude (a), die Anstiegszeit (b) und die Antwortzeit (c) konnten durch Koapplikation mit ATP-Konzentrationen von oder höher als 70 µM aufgehoben werden. (Mittelwert ± SEM, * zeigt Signifikanz p ≤ 0.05, *** p ≤ 0,001). d: Beispiele für Benzaldehydmodulation (2,25 mM) an ATP-induzierten Strömen oben: 10 µM ATP + 2,25 Benzaldehyd, starke Modulation mittig: 30 mM ATP + 2,25 mM Benzaldehyd, mittlere Modulation unten: 100 µM ATP + 2,25 mM Benzaldehyd, keine Modulation
61
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Tabelle 3.3: Benzaldehyde moduliert P2X2-Rezeptor vermittelte Ströme Die Daten wurden jeweils auf die ATP-induzierte Antwort normiert, dabei wurden verschiedene Benzaldehyd (a) und verschiedene ATP Konzentrationen (b) untersucht. (Mittelwert ± SEM, * zeigt Signifikanz p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001 gegenüber der ATP-induzierten Antwort). a
10 µM ATP
+
0.5 mM
Benzal. n = 8
1.0mM
Benzal. n = 11
2.25mM
Benzal. n = 36
4.5 mM
Benzal. n =13
Max.amp. 89 ± 8 % 75 ± 5 %*** 70 ± 6 %*** 77 ± 2 %***
Anstiegszeit 86 ± 9 % 132 ± 30 % 213 ± 19 %*** 215 ± 18 %***
Antwortzeit 88 ± 20 % 173 ± 15 %*** 211 ± 15 %*** 197 ± 14%***
b
2.25 mM Benzaldehyde
+
10 µM ATP
n = 36
30 µM ATP
n = 8
70 µM ATP
n = 9
100 µM ATP
n = 7
Max.amp. 70 ± 6 %*** 82 ± 5 %* 100 ± 7 % 103 ± 13 %
Anstiegszeit 213 ± 19 %*** 178 ± 17 %* 83 ± 7 % 109 ± 16 %
Antwortzeit 211 ± 5%*** 189 ± 23 %* 76 ± 8 % 97 ± 19 %
3.4.2 „Rezeptives Feld“ der P2X2-Rezeptor Modulation
In weiteren Experimenten wurde an rekombinant exprimierten P2X2-Rezeptoren die
potentielle Wirksamkeit chemischer trigeminaler und olfaktorischer Stimuli mit struktureller
Ähnlichkeit zu Benzaldehyd untersucht, um so ein „rezeptives Feld“ zu ermitteln.
Benzaldehyd selbst weist eine aromatische Ringstruktur und eine daran gebundene
Aldehydgruppe auf. Die strukturell verwandten Stimuli (Struktur siehe Abb.3.13) wurden wie
zuvor Benzaldehyd gemeinsam mit ATP appliziert und die resultierenden Ströme bezüglich
ihrer Maximalamplitude (Abb.3.13a), ihrer Anstiegszeit (Abb.3.13b) und ihrer Antwortzeit
(Abb.3.13c) charakterisiert und mit den ATP-induzierten Strömen verglichen. Das Ersetzen
der funktionellen Aldehydgruppe durch eine Methylgruppe wurde toleriert. Der Stimulus
Toluen (2 mM) zeigte einen ähnlichen Effekt wie Benzaldehyd (n = 17). Durch Anfügen einer
Methylgruppe an die Aldehydseitenkette wird aus dem Aldehyd ein Keton. Dieses
Acetophenon (2 mM) war ebenfalls wirksam (n = 17). Mögliche Einflüsse der Länge der
Kohlenstoffseitenkette wurden zusätzlich untersucht. Eine Aldehydgruppe mit einer
Verbindungskette aus drei Kohlenstoffatomen zum aromatischen Ring (3-
62
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Phenylpropionaldehyd (3-PPA), 2 mM) zeigte einen Benzaldehyd vergleichbaren Effekt (n =
9), während eine weitere Verlängerung der Seitenkette zu fünf Kohlenstoffatomen (5-
Phenylvaleraldehyd oder 5-PVA, 3 mM) zum Verlust der Effektivität am P2X2-Rezeptor
führte (n = 12). Dies zeigt, dass geringe Veränderungen der Seitenkette der
Benzaldehydstruktur vom Rezeptor toleriert werden, wenn das Gesamtmolekül dadurch nicht
zu groß wird. Die entsprechenden Moleküle zeigen eine ähnliche Inhibition des P2X2-
Rezeptor vermittelten Stromes wie Benzaldehyd. Weder Toluen, noch Acetophenon oder 3-
PPA zeigten einen direkten Effekt auf trigeminale Neurone. Analog vorheriger Experimente
wurde eine mögliche Strominduktion oder eine Membrandepolarisation in patch-clamp
Experimenten (n = 10) sowie eine mögliche Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration in Calcium-Imaging Experimenten (n = 14) untersucht.
Weitere Experimente konnten zeigen, dass Veränderungen der Ringstruktur nicht toleriert
werden. Citral (3 mM), ein als trigeminaler Stimulus beschriebenes Aldehyd ohne
Ringstruktur hatte keinen Effekt auf den ATP-induzierten Strom (n = 7). Dies belegt die
Wichtigkeit der aromatischen Ringstruktur. Durch Substitution eines Kohlenstoffatoms der
Ringstruktur durch ein Stickstoffatom entsteht Pyridin, das keinen Benzaldehyd-ähnlichen
Effekt mehr aufwies (3 mM, n = 7). Das nicht aromatische Keton Cyclohexanon hatte
ebenfalls keinen Effekt (2,5 mM; n = 15). Die gleiche Ineffektivität konnte bei Furfural
beobachtet werden (2,5 mM; n = 7). Bei diesem Molekül handelt es sich um eine cyclische
Struktur aus fünf Atomen (vier Kohlenstoffatome und 1 Sauerstoffatom) mit einer
Aldehydseitenkette. Alle getesteten Moleküle sind wie Benzaldehyd als chemische Stimuli
des trigeminalen Systems beschrieben worden. Die Ergebnisse belegten, dass eine kleine
Gruppe strukturell verwandter chemischer Stimuli den gleichen inhibitorischen Effekt auf
P2X2-Rezeptor vermittelte Ströme und damit auf die Aktivtität der diesen Rezeptor
exprimierenden Neurone hat.
63
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.13: Rezeptives Feld des Benzaldehydeffektes a: Maximalamplitude, b: Anstiegszeit, c: Antwortzeit der induzierten Ströme Die durch Koapplikation von ATP und verschiedenen Duftstoffen induzierten Ströme wurden auf die ATP-induzierten Antworten normiert (Mittelwerte ± SEM, * zeigt Signifikanz p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001). Die aromatische Ringstruktur des Benzaldehyds scheint als struktureller Bindungspartner am P2X2-Rezeptor essentiell zu sein. Moleküle, bei denen die Ringstruktur erhalten ist und lediglich die Seitenkette leicht verändert wird, zeigen einen Benzaldehyd analogen Effekt. Ab einer kritischen Seitenkettelänge tritt der Effekt nicht mehr auf. Strukturelle Modulationen innerhalb der aromatischen Ringstruktur heben den Effekt immer auf.
64
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.5 Eine mögliche ATP-Quelle im nasalen Epithel
Für den oben beschrieben modulatorische Effekt von Benzaldehyd und strukturell ähnlichen
Stimuli auf trigeminale Neurone ist eine zeitgleiche Freisetzung von ATP in direkter
Umgebung der trigeminalen Fasern zwingende Vorraussetzung. Es ist etabliert, dass ATP von
vielen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen freigesetzt werden kann (zur Übersicht siehe
Bodin und Burnstock, 2001b). Das Vorkommen extrazellulären ATPs im nasalen Epithel wird
postuliert (Hegg et al., 2003), jedoch ist weder bekannt welche Zellen ATP freisetzen, noch
wie die Freisetzung induziert wird.
Zur Überprüfung der Hypothese einer potentiellen Duft-induzierten ATP-Freisetzung durch
aktivierte ORN, wurde hier das fluoreszierende Acridine-Derivate Quinacrine verwendet.
Seine hohe Bindungsaffinität zu Adenin Nukleotiden im Allgemeinen und besonders zu ATP
macht diese Substanz zu einem bevorzugten Marker für intrazelluläre ATP Speicher (Bodin
und Burnstock, 2001a; Sorensen und Novak, 2001; Mitchell et al., 1998; White et al., 1995).
Quinacrine markiert putativ purinerge zentrale und periphere Neurone, die den Farbstoff
wahrscheinlich aufgrund ihres hohen vesikulären ATP Gehaltes akkumulieren. Diese
Eigenschaften des Quinacrins erlauben Untersuchungen des zellulären ATP Vorkommens auf
Einzelzellniveau.
Frisch dissoziierte ORN akkumulierten Quinacrine schnell, was sich in einer grünen
Fluoreszenz widerspiegelte (Abb.3.14b). Diese Fluoreszenz war in unstimulierten ORN über
den gesamten Meßzeitraum von fünf Minuten stabil (Abb.3.14a, graue Linie). Bereits 1978
konnte gezeigt werden, dass durch hohe extrazelluläre Kaliumkonzentrationen induzierte
Membrandepolarisationen in Neuronen zu einer ATP Freisetzung führt (White et al., 1978).
Daher wurde in diesen Experimenten eine hochkonzentrierte Kaliumlösung (50 mM K+) als
Referenzstimulus verwendet. Außerdem wurden die ORN mit einer equimolaren Mischung
aus 50 verschiedenen Duftstoffen (Henkel 50, 1:5000 verdünnt) stimuliert. Um eine
Duftstimulation der ORN zu imitieren, wurde zudem der spezifische Adenylatzyklase
Aktivator Forskolin (50 µM) verwendet (Spehr et al., 2002; Ma und Shepherd, 2003).
In allen untersuchten ORN (n = 15) führte eine Stimulation mit der hochmolaren
Kaliumlösung zu einer starken Abnahme der Fluoreszenzintensität (Abb.3.14),
wahrscheinlich aufgrund von vesikulärer ATP Freisetzung. Diese robuste
Fluoreszenzabnahme jedes Neurons wurde als Standardwert (100%) für die Normalisierung
genutzt. Forskolin induzierte ebenfalls in allen getesteten Neuronen einen signifikanten
Verlust der Fluoreszenzintensität (57 ± 22 % der Kalium induzierten Reduktion, n = 10). Wie
erwartet, führte eine Stimulation der ORN mit dem Duftstoffgemisch nur in einem Teil der
65
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Neurone zu einer Reduktion der Fluoreszenzintensität, da jedes Neuron nur einen spezifischen
Duftrezeptor exprimiert (Nef et al., 1992; Ressler et al., 1993; Vasar et al., 1993) und die
Stimulation mit 50 verschiedenen Duftstoffen nur einen Teil der Rezeptoren aktiveren kann
(Malnic et al., 1999). 8 von 15 Neurone antworteten auf die Duftstoffstimulation mit einer
signifikanten Abnahme der Fluoreszenzintensität, die 34 ± 22 % der Kaliuminduzierten
Reduktion erreichte. In den übrigen 7 Neuronen blieb die Fluoreszenzintensität bei
Duftapplikation unverändert. Die generelle Antwortfähigkeit dieser Neurone zeigte sich
jedoch durch die Kalium- bzw. Forskolin induzierte Abnahme der Fluoreszenz. Dies weist
eindeutig auf die Aktivtätsabhängigkeit der Abnahme der Fluoreszenzintensität hin.
Ob diese als ATP-Freisetzung wertbare Fluoreszenzabnahme durch vesikuläre
Freisetzungsmechanismen zustande kommt, wurde mit Hilfe bestimmter Blocker untersucht.
Tetanustoxin (TeTx) verhindert die Exocytose von Vesikeln durch die Blockade des für die
Anbindung des Vesikels an die präysnaptische Membran benötigten Synaptobrevins (Ahnert-
Hilger und Bigalke, 1995). N-Ethylmaleimid (NEM) ist ebenfalls als Blocker vesikulärer
Exozytose beschrieben (Bodin und Burnstock, 2001a; Chakravarty, 1980). Bei dem N-
Ethylmaleimid sensitiven Faktor (NSF) handelt es sich um ein Peptid, dem eine wichtige
Rolle in der Vesikelverschmelzung zugeschrieben wird (Brunger und DeLaBarre, 2003).
Weder TeTx (0,5 µM; 90 min Inkubation; n = 10) noch NEM (10 µM; 15 min Inkubation; n =
5) konnten die Aktivitäts-induzierte Fluoreszenzabnahme und damit die ATP-Freisetzung
verhindern.
66
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.14: Aktivitätsinduzierte ATP Freisetzung von olfaktorischen Rezeptorneuronen a, b: representative Aufnahmen von zwei unterschiedlichen ORN Die Fluoreszenzabnahme kann sowohl in der Kinetik der Fluoreszenz (life kinetik) (a) als auch in den Fluoreszenzbildern (b) beobachtet werden. In einem Neuron (Zelle1) wurde die Fluoreszenz nach jeder Stimulation reduziert, während in dem anderen Neuron (Zelle 2) keine Fluoreszenzänderung bei Duftapplikation erkennbar war. c: Vergleich der Fluoreszenzabnahme nach den unterschiedlichen Stimulationen Die Daten wurden auf die Fluoreszenzabnahme nach Kaliumstimulation normiert (Mittelwerte ± SEM, *** zeigt Signifikanz p ≤ 0.001).
67
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.6 Der Duftstoff Linalool als trigeminaler Stimulus
3.6.1 Spezifität des Linalool-Effektes
Neben den zuvor beschriebenen Duftstoffen wurden noch weitere Düfte hinsichtlich ihres
Aktivierungspotentials an trigeminalen Neuronen überprüft. Calcium-Imaging
Untersuchungen zeigten, dass einer der getesteten Duftstoffe, Linalool (3 mM), in 28 %
(25/89) der trigeminalen Neurone zu einer Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration führte (Abb.3.15a). Linalool ist ein tertiärer Alkohol mit offener
Kohlenstoffkette, dessen Duft an Maiglöckchen erinnert und der als „blumig-frisch“
klassifiziert wird.
Dieselben Neurone, die durch Linalool aktiviert wurden, zeigten auch einen Anstieg der
intrazellulären Kalziumkonzentration bei Applikation der strukturverwandten Duftstoffe
Geraniol, Citral (jeweils n = 20) und Citronellal (n = 12) die ebenfalls der Duftklasse
„blumig-frisch“ zugeordnet werden können.
Um eine unspezifische Wirkung von Linalool ausschließen zu können, wurden auch andere
Zelltypen untersucht. Weder dissoziierte kortikale Neurone, noch untransfizierte HEK-Zellen
zeigten eine Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration bei Applikation von bis
zu 6 mM Linalool (Abb.3.15b,c). Die generelle Antwortfähigkeit der Zellen wurde durch
Kontrollstimulation mit hochkonzentrierte Kaliumlösung (kortikale Neurone) bzw. ATP
(HEK Zellen) überprüft.
68
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.15: Spezifität des Linalool Effektes Ca-Imaging Untersuchungen an verschiedenen Zelltypen, Linalool wurde in verschiedenen Konzentrationen appliziert. Dargestellt ist die Änderung des Fluoreszenzquotienten (f340/f380) in Abhängigkeit von der Zeit. b: Eines von drei trigeminalen Neuronen ließ sich konzentrationsabhängig von Linalool aktivieren. ATP wurde als Kontrollstimulus genutzt, um die Antwortfähigkeit der Neurone zu überprüfen. b: Untransfizierte HEK 293 Zellen lassen sich nicht von Linalool aktivieren. Auch hier wurde als Kontrollstimulus ATP verwendet. c: Dissoziierte kortikale Neurone lassen sich ebenfalls nicht von Linalool aktivieren. Als Kontrollstimulus wurde eine hochmolare Kaliumlösung (30 mM) verwendet.
69
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.5.2 Vergleich der Linalool Aktivierbarkeit und der P2X-Rezeptor Expression
Da sich die trigeminalen Neurone entsprechend ihrer P2X-Rezeptor Expression in Subklassen
unterteilen lassen, wurde in patch-clamp Experimenten ein Zusammenhang zwischen der
Expression bestimmter Purinrezeptoren und der Aktivierbarkeit durch Linalool untersucht.
Ein modulierender Effekt auf ATP-induzierte Ströme wie zuvor für Benzaldehyd beschrieben
konnte bei Linalool nicht festgestellt werden (n = 10).
In voltage-clamp Experimenten induzierte Linalool (5 mM) bei negativem Haltepotential von
-60 mV einen Einstrom. Die Antworthäufigkeit entsprach mit 24 % (15/62) der in Calcium-
Imaging ermittelten Aktivierbarkeit. Die trigeminalen Neurone, die sich durch Linalool
aktivieren ließen, konnten keiner der zuvor identifizierten Subklassen zugeordnet werden.
Von den auf Linalool antwortenden Neuronen exprimierten 35 % (6/15) homomere P2X3-
Rezeptoren und 18 % (3/15) homomere P2X3- und P2X2-Rezeptoren. Somit handelt es sich
bei etwa der Hälfte (53 %) der Linalool sensitiven Neurone um potentiell nozizeptive
Neurone. Die übrigen 47 % (8/15) der Neurone exprimierten homomere P2X2-Rezeptoren
und können der nicht-nozizeptiven Subklasse zugerechnet werden.
3.5.3 Charakterisierung der Linalool induzierten Antwort in trigeminalen Neuronen
Um den Linalool induzierten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zu
charakterisieren, wurde zunächst dessen Dosis-Wirkungsabhängigkeit untersucht. Dabei
zeigte sich eine Konzentrationsabhängigkeit des Effektes (n = 7, Abb.3.16). Der
Kalziumanstieg nahm ab einer Konzentration von 1 mM Linalool kontinuierlich zu. Aufgrund
der geringen Wasserlöslichkeit des Linalools konnten allerdings keine Konzentrationen über
10 mM getestet werden, so dass keine sättigende Konzentration und somit auch kein EC50-
Wert bestimmt werden konnte.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Linalool 0.5mM
Linalool 1mM
Linalool 2.5mM
Linalool 5mM
Linalool 10mM
norm
iert
e A
ntw
ort
70
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.16: Linalool Dosis-Wirkungbeziehung in trigeminalen Neuronen Es ist eine deutliche Abhängigkeit des induzierten Kalziumanstieges von der applizierten Linaloolkonzentration erkennbar. Eine maximal wirksame Konzentration konnte aufgrund der schlechten Löslichkeit von Linalool nicht bestimmt werden. In weiteren Experimenten wurde die Quelle der Kalziumionen bestimmt. Prinzipiell gibt es
zwei Wege, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führen können.
Zum einen kann durch Öffnen von Kalziumleitfähigkeiten in der äußeren Zellmembran ein
Einstrom extrazellulärer Kalziumionen entlang ihres Konzentrationsgradienten erfolgen, zum
anderen kann Kalzium intrazellulär aus Speichern (z.B. endoplasmatisches Retikulum,
Mitochondrien) freigesetzt werden.
Um die Beteiligung intrazellulärer Kalziumspeicher an der Linalool induzierten Antwort der
trigeminalen Neurone zu untersuchen, wurden diese Neurone mit Thapsigargin behandelt.
Diese Substanz führt durch Blockade der Ca2+-ATPasen am glatten endoplasmatischen
Retikulums zu einer Entleerung dieser Speicher und verhindert somit eine erneute
Kalziumfreisetzung. Nach der Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher durch
Thapsigargin konnte Linalool in trigeminalen Neurone immer noch einen Kalziumanstieg
induzieren (Abb.3.17a). Wurden hingegen die Kalziumionen aus der extrazellulären Lösung
entfernt, so war Linalool nicht mehr in der Lage, einen Anstieg der Kalziumkonzentration
hervorzurufen (Abb.3.17b,c). Dies zeigte eindeutig, dass Linalool einen Einstrom
extrazellulärer Kalziumionen über die Plasmamembran induziert.
Um eine Beteiligung anderer Ionen an der Linalool induzierten Antwort zu untersuchen,
wurden patch-clamp Experimente durchgeführt (Abb.3.17d). Messungen mit Kalziumfreier
extrazellulärer Lösung zeigten, dass auch der Linalool induzierte Strom signifikant auf 34 ±
13 % der ursprünglichen Linaloolantwort reduziert wird (n = 9; p ≤ 0,001). Der Reststrom,
der hier im Gegensatz zu den Calcium-Imaging Messungen noch detektierbar ist, wird
höchstwahrscheinlich von anderen Ionen getragen.
71
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.17: Kalziumabhängigkeit des Linalooleffektes a-c: Ca-Imaging Untersuchungen zur Entstehung der Kalzium-getragenen Linaloolantwort in trigeminalen Neuronen a: Nach der Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher induzierte Linalool immer noch einen vergleichbaren Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in den Neuronen. b: Wird Kalzium hingegen aus der extrazellulären Lösung entfernt, konnte Linalool keinen Kalziumanstieg mehr induzieren. c: Beispielbilder Fura-2 beladener trigeminaler Neurone im Ruhezustand, während Linaloolstimulation, während Linaloolstimulation in Kalzium-freier extrazellulärer Lösung und während ATP Stimulation. Der Anstieg der Kalziumkonzentration wird durch Falschfarben kodiert, der Farbbalken zeigt den Farbverlauf für ansteigende Kalziumkonzentrationen (blau: niedrige Konzentration, rot hohe Konzentration). d: patch-clamp Untersuchungen mit Kalziumfreier extrazellulärer Lösung In whole cell voltag clamp Messungen wurde die Amplitude der Linalool-induzierten Ströme auf etwa 40 % reduziert, wenn die extrazelluläre Lösung keine Kalziumionen enthielt (Haltepotential -60 mV). Dies zeigt, dass die von Linalool geöffnete Leitfähigkeit außer für Kalziumionen auch für andere Ionen permeabel ist.
72
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.5.3 TRPM8 als Linaloolrezeptor
Da Linalool neben der Empfindung „blumig“ auch die Empfindung „frisch“ hervorruft, wäre
es möglich, daß dieser Duftstoff denselben Rezeptor aktiviert, an den auch Menthol bindet,
das als „kühl“ und „frisch“ beschrieben wird. Der Kälte- und Mentholrezeptor TRPM8 wird
auch von einem Teil trigeminaler Neurone exprimiert (McKemy et al., 2002; Nealen et al.,
2003).
Um diese Wirkungsmöglichkeit zu überprüfen, wurden zunächst rekombinante TRPM8-
Rezeptoren in HEK293-Zellen heterolog exprimiert und auf ihre Aktivierbarkeit durch
Linalool überprüft.
Die rekombinanten TRPM8-Rezeptoren zeigten ebenfalls eine dosisabhängige Aktivierung
durch Linalool, allerdings reagierten sie erst bei höheren Konzentrationen. Bis zu einer
Konzentration von 2,5 mM Linalool zeigten die Rezeptoren keine Aktivierung, aufgrund der
eingeschränkten Löslichkeit konnten erneut keine Konzentrationen über 10 mM getestet
werden (n = 53, Abb.3.18a).
Um das Bindungsverhalten am TRPM8-Rezeptor zu studieren, wurden die Agonisten
Linalool und Icilin (McKemy et al., 2002) koappliziert. Interessanterweise reduziert eine
nicht-aktiverende Linaloolkonzentration von 2,5 mM die Icilin (500 nM) induzierte TRPM8
Antwort in patch-clamp (n = 5) und in Calcium-Imaging Experimenten (n = 41). Beide
Methoden zeigten eine vergleichbare signifikante Reduktion des Icilin-Signals auf 31 ± 7 %
(patch-clamp) bzw. 35 ± 3 % (Calcium-Imaging) (p ≤ 0,001 für beide). Durch die Erhöhung
der Icilinkonzentration konnte der reduzierende Effekt von Linalool immer weiter aufgehoben
werden (Abb.3.18b). Eine Aktivierung der TRPM8-Rezeptoren von 100 µM Icilin wurde
nicht mehr durch Linalool beeinflußt. Diese Untersuchung weist auf einen kompetitiven
Wirkmechanismus von Linalool und Icilin an derselben Bindestelle des TRPM8-Rezeptors
hin.
73
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.18: Linalooleffekte an heterolog exprimierten TRPM8-Rezeptoren a: Linalool Dosis-Wirkungsbeziehung an TRPM8-Rezeptoren in HEK 293 Zellen Es ließ sich eine konzentrationsabhängige Aktivierung des Rezeptors in Ca-Imaging Experimenten beobachten. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von Linalool konnte keine maximal wirksame Konzentration bestimmt werden. b: Icilin-Linalool Wechselwirkungen am TRPM8-Rezeptor Hier wurde der Effekte einer Linalool-Icilin Koapplikation im Ca-Imaging-Verfahren untersucht. Linalool wurde in nicht aktivierender Konzentration (2,5 mM) eingesetzt, die Konzentration von Icilin wurde variiert. Die Antworten wurden auf die jeweilige Icilinantwort normiert. In Abhängigkeit von der Icilinkonzentration reduzierte Linalool den Icilin-induzierten Kalziumanstieg. Diese inhibitorische Wirkung wurde mit steigender Icilinkonzentration kleiner und konnte durch eine Icilinkonzentration von 100 µM völlig aufgehoben werden (Mittelwerte ± SEM; ** zeigt Signifikanz p ≤ 0,001).
74
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
3.5.5 Pharmakologische Identifikation der trigeminalen Linaloolantwort
An heterolog exprimierten TRPM8-Rezeptoren konnte gezeigt werde, dass Linalool als
Agonist für diesen Rezeptor fungieren kann. Trigeminale Neurone exprimieren TRPM8-
Rezeptoren, so dass eine Aktivierung dieser Rezeptoren durch Linalool möglich wäre. Zur
Überprüfung dieser Annahme sind allerdings weitere Untersuchungen nötig. Bislang gibt es
keinen spezifischen Antagonisten für den TRPM8-Rezeptor. Allerdings gibt es Hinweise
darauf, dass ein kürzlich beschriebener Antagonist (BCTC, N-(4-Tertiarybutylphenyl)-4-(3-
cholorphyridin-2-yl)tetrahydro-pyrazine-1(2H)-carbox-amide) eines anderen TRP-Rezeptors
(TRPV1) (Valenzano et al., 2003), ebenfalls antagonistische Wirkung am TRPM8-Rezeptor
zeigt (H.-J. Behrend, persönliche Mitteilung). Dieses BCTC musste in ersten Experimenten
für eine wirksame Inhibition des TRPM8-Rezeptors in deutlich höherer Konzentration
eingesetzt werden als für die Inhibition des TRPV1.
Der geschilderte Befund wurde mittels patch-clamp Untersuchungen an heterolog
exprimierten TRPM8-Rezeptoren überprüft. Eine hohe Konzentration des Antagonisten
BCTC (10 µM) reduzierte den Linalool (5 mM) induzierten Strom signifikant auf 19 ± 4 % (p
≤ 0,001; Abb3.19). Da dieser Antagonist auch an TRPV1-Rezeptoren wirksam ist und
trigeminale Neurone diese Rezeptoren ebenfalls exprimieren, musste sichergestellt werden,
dass TRPV1-Rezeptoren nicht durch Linalool aktiviert werden. Aus diesem Grund wurden
auch TRPV1-Rezeptoren heterolog in HEK293 Zellen exprimiert. Die funktionelle
Expression wurde durch Aktivierung mit dem beschriebenen hochwirksamen Agonisten
Capsaicin (10 µM) überprüft. Die TRPV1-Rezeptoren konnten in keiner Zelle durch Linalool
(5 mM) aktiviert werden (n = 8). Daraus folgt, dass eine Blockade der Linalool induzierten
Antwort trigeminaler Neurone durch BCTC als Beweis für die Aktivierung trigeminaler
TRPM8-Rezeptoren gewertet werden kann.
Diese Hypothese wurde in patch-clamp und in Calcium-Imaging Experimenten überprüft. Es
zeigte sich eine signifikante Reduktion der Linaloolantwort (2,5 mM) durch BCTC (10 µM).
Allerdings wurde der induzierte Strom ebenso wie der induzierte Anstieg der intrazellulären
Kalziumkonzentration nur auf etwa die Hälfte reduziert (Strom: 52 ± 7 %, n = 4, p ≤ 0,05;
Kalziumanstieg: 47 ± 9 %, n = 10, p ≤ 0,001). Dies zeigt, dass zumindest ein Anteil der
Linalool induzierten Antwort trigeminaler Neurone von TRPM8-Rezeptoren vermittelt wird.
75
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Abb.3.19: Pharmakologische Charakterisierung der Linalool-induzierten Antwort a: patch-clamp Untersuchungen zur inhibitorischen Wirkung von BCTC Aktivierung heterolog exprimierter TRPM8-Rezeptor durch Linalool wurde von BCTC signifikant reduziert, der Strom betrug nur noch etwa 20 % des ursprünglichen Linalool Stromes. Die Linalool-induzierte Antwort trigeminaler Neurone wurde von BCTC ebenfalls signifikant, allerdings nur auf etwa 50 % des Ausgangswertes reduziert. b: Eine entsprechende Reduktionsrate ließ sich auch in Ca-Imaging Experimenten beobachten.
76
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
4. Diskussion
4.1 Kultivierung trigeminaler Neurone
Aufgrund ihrer experimentell unzugänglichen Lage in vivo, wurde zur Untersuchung
trigeminaler Neurone ein Kultursystem für dissoziierte Zellen des Ganglion gasseri
neonataler Ratten etabliert. Die dabei zu beobachtende Geschwindigkeit der Regeneration der
Fortsätze nach der Dissoziation ist bemerkenswert. Im Gegensatz zu trigeminalen Neuronen
sind bei zentralen Neuronen erst nach einer Woche in vitro Fortsätze, die allerdings immer
kürzer sind als die trigeminaler Neurone, zu erkennen (Paul et al., 2001; Werner et al., 1998).
Das Verhältnis der neuronalen zu den nicht-neuronalen (Glia-) Zellen in den trigeminalen
Primärkulturen ist mit etwa 1 zu 100 vergleichbar mit dem beschriebenen Verhältnis bei
humanen trigeminalen Ganglien in vivo (LaGuardia et al., 2000). Somit spiegelt das
entwickelte Kultursystem eine natürliche Zellverteilung wider.
4.2 Klassifizierung trigeminaler Neurone anhand ihrer P2X-Rezeptor Expression
4.2.1 Elektrophysiologische Charakterisierung
Da das trigeminale System vielfältige physiologische Funktionen (Mechano-, Thermo-,
Chemoperzeption, Nozizeption) erfüllt, wurde zunächst eine Klassifizierung kultivierter
Neurone des gesamten Ganglion gasseri vorgenommen. Für eine Einteilung in bestimmte
Populationen wurde in der vorliegenden Arbeit die funktionale Expression ionotroper
Purinrezeptoren mittels elektrophysiologischer, immunhistochemischer und bildgebender
Methoden untersucht, da es in der Literatur Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der
physiologischen Funktion und der P2X-Rezeptor Expression gibt (Cook et al., 1997; Ueno et
al., 1999). Basierend auf der Kinetik der ATP-induzierten zell-spezifischen Ströme ließen sich
in vitro drei verschiedene Neuronenpopulationen unterscheiden.
Eine der Populationen zeigte bei ATP-Applikation schnell desensitisierende Ströme. Das
pharmakologische Profil dieser transienten Ströme weist darauf hin, dass es sich
wahrscheinlich um P2X3-Rezeptor vermittelte Ströme handelt. Zudem zeigen Ströme
heterolog exprimierter homomerer P2X3-Rezeptoren eine ähnliche Kinetik (Cook et al.,
1998). Allerdings berichteten King und Mitarbeiter (1999), dass P2X1-Rezeptor vermittelte
Ströme eine sehr ähnliche Kinetik und auch ein vergleichbares pharmakologisches Profil
aufweisen. Die beiden Rezeptortypen unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihres
77
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Desensitisierungsverhaltens. P2X1-Rezeptor-Ströme zeigen eine monoexponentielle (Collo et
al., 1996), während P2X3-Rezeptor vermittelte Ströme eine biexponentielle
Desensitisierungskinetik aufweisen (Lewis et al., 1995). Demnach werden die hier
charakterisierten Ströme aufgrund ihrer biexponentiellen Desensitisierungskinetik von
homomeren P2X3-Rezeptoren vermittelt. Zudem ist funktionale Expression homomerer P2X1-
Rezeptoren in trigeminalen Neuronen unwahrscheinlich, da nur sehr niedrige mRNA Mengen
(im Vergleich zu P2X3 mRNA) mittels PCR nachgewiesen und keine Immunreaktivität für
P2X1-Untereinheiten gefunden wurde (Xiang et al., 1998; Cook et al., 1997; Collo et al.,
1996).
Die zweite Population der kultivierten trigeminalen Neurone antwortete auf ATP-Applikation
mit persistierenden Strömen. Das ermittelte pharmakologische Profil ergab, dass diese Ströme
von homomeren P2X2-Rezeptoren getragen werden.
In der dritten Neuronenpopulation induzierte ATP-Applikation einen gemischten Strom, der
sich aus einer transienten und einer persistenten Komponente zusammensetzte. Die transiente
Komponente zeigte dieselben pharmakologischen Eigenschaften wie P2X3-Rezeptor
vermittelte Ströme. Das pharmakologische Profil der persistenten Komponente glich dem
homomerer P2X2-Rezeptoren. Dies weist darauf hin, dass diese Neurone sowohl homomere
P2X2-Rezeptoren als auch homomere P2X3-Rezeptoren und keine heteromeren P2X2/3-
Rezeptoren exprimieren. Eine solche Expression unterschiedlicher P2X-Untereinheiten bei
Bildung verschiedener homomerer Rezeptoren in derselben Zelle sowie ein daraus
resultierender gemischter Strom bei gleichzeitiger Aktivierung der homomeren Rezeptoren
wurde sowohl in DRG-Neuronen als auch in heterologen Expressionssystemen beschrieben
(Liu et al., 2001; Dunn et al., 2000; Burgard et al, 1999; Grubb und Evans, 1999).
Keines der kultivierten trigeminalen Neurone zeigte das pharmakologische Profil heteromerer
P2X2/3-Rezeptoren, obwohl es Hinweise auf deren Vorkommen in nozizeptiven, die Zähne
innervierenden trigeminalen Fasern gibt (Cook et al., 1997). Der Grund für diese Diskrepanz
könnte die geringe Zahl dieser Neurone im trigeminalen Ganglion sein. Cook und Mitarbeiter
(1997) berichten, dass sie bei der Dissoziation zweier Ganglien unter mehreren Tausend
Neuronen nur etwa 50 retrograd gefärbte, die Zähne innervierende Neurone finden. Von
diesen 50 gefärbten Neuronen zeigen nur 8 Neurone (16 %) Ströme, die putativ von
heteromeren P2X2/3-Rezeptoren getragen werden. Durchschnittlich 27000 Neurone befinden
sich in einem trigeminalen Ganglion des Menschen (LaGuardia et al., 2000). Selbst wenn die
trigeminalen Ganglien der Ratten aufgrund der geringeren Größe nur aus einigen tausend
Neuronen aufgebaut wären, läge der Anteil der Neurone, die potentiell P2X2/3-Rezeptor
78
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
getragene Ströme zeigen, immer noch unter 1 %. Es ist nicht auszuschließen, dass diese
Zellen in der vorliegenden Arbeit aufgrund der zufälligen Auswahl einzelner Neurone aus
einer kompletten Ganglienpräparation nicht in die Untersuchung eingingen.
In meinen Forschungsarbeiten zeigen die drei Neuronenpopulationen denselben EC50-Wert
für ATP. In der Literatur hingegen wurden unterschiedliche EC50 Werte für P2X2- (48 µM in
C6BU-1 Zellen (heterolog), 23,7 µM in DRG Neuronen (nativ), 4,3 µM in Oocyten
(heterolog)) und P2X3-Rezeptoren (1,6 µM in C6BU-1 Zellen (heterolog), 5,6 µM in DRG
Neuronen (nativ), 1,4 µM in Oocyten (heterolog)) beschrieben (Ueno et al., 1998 und 1999;
Liu et al., 2001). Besonders der ermittelte EC50-Wert der homomeren P2X3-Rezeptoren ist
höher als in der Literatur angegeben. Möglicherweise werden die Rezeptoren durch die hier
angewendeten Kultivierungsbedingungen beeinflußt. Auch das in dieser Arbeit angegebene
Interstimulus-Intervall von 90 Sekunden, das zur vollständigen Resensitisierung der
Rezeptoren ausreicht, steht im Gegensatz zu den Literaturangaben. Für die vollständige
Aufhebung der Desensitisierung werden für P2X3-Rezeptoren Interstimulus-Intervalle von bis
zu 20 Minuten beschrieben (Lewis et al., 1995; Cook et al., 1998). Der Grund für die
Unterschiede in den berechneten EC50-Werten und den Interstimulus-Intervalllängen könnte
auch im hier verwendeten Applikationssystem liegen. Das System ermöglicht eine sofortige
Absaugung der applizierten ATP-Lösung und stellt sicher, dass keine Verunreinigung der
Badlösung auftritt. Dadurch wird der benötigte Interstimulus-Intervall verkürzt, da zur
Aktivierbarkeit aller Rezeptoren, also der Wiederherstellung der Ausgangsbedingungen (erste
ATP-Applikation) ATP vollständig aus der Badlösung entfernt werden muß. Es ist denkbar,
dass in anderen Applikationsystemen Restmengen von ATP in der Badlösung verbleiben, die
zur Desensitisierung eines Teils der Rezeptorpopulation führen kann. In diesem Fall würde
die zu erreichbare Maximalamplitude und damit der berechnete EC50-Wert gesenkt.
Weiterhin scheint der jeweilige Zelltyp, in dem die Rezeptoren exprimiert werden, großen
Einfluss auf die Sensitivität der P2X-Rezeptoren zu haben. Einige EC50-Literaturwerte für
P2X2-Rezeptoren, die von anderen Neuronentypen exprimiert werden, sind deutlich höher als
die in dieser Arbeit ermittelten Daten (siehe oben und Ganglion coeliacum Ratte: 86 µM,
Ganglion coeliacum Maus: 64 µM, Ganglia pelvica Ratte: 59 µM, Ganglia pelvica Maus: 123
µM (s.o.; Zhong et al., 1998 und 2000).
Durch Charakterisierung der Aktionspotentiale (Form, Dauer, Amplitude) der verschiedenen
Populationen sollte eine Zuordnung der Fasertypen vorgenommen werden. Wie einleitend
beschrieben bilden myelinisierte Aδ-Fasern und nicht-myelinisierte C-Fasern das trigeminale
Netzwerk. Lopez de Armentia und Mitarbeiter (2000) berichten über spezifische
79
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
elektrophysiologische Eigenschaften der jeweiligen Fasertypen. So ist bei Neuronen mit C-
Fasern die Membrankapazität niedriger, die AP-Dauer ist länger und die Maximalamplitude
ist größer. Die Hyperpolarisation ist länger und weist eine größere Amplitude auf als bei
Neuronen mit Aδ-Fasern. Außerdem zeigen die meisten C-Faser-Neurone AP mit hump in der
Repolarisationsphase, während 50 % der Aδ-Fasern AP ohne hump generieren. Entsprechend
dieser Befunde wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften der trigeminalen
Neuronenpopulationen unterschiedlicher P2X-Rezeptor-Expression untersucht. Jedoch
konnten keine Unterschiede in den genannten Eigenschaften zwischen diesen
Subpopulationen ausgemacht werden. Dies weist darauf hin, dass die Expression
unterschiedlicher P2X-Rezeptoruntereinheiten nicht mit den genannten Fasertypen der
trigeminalen Neurone korreliert.
4.2.2 Immunhistochemische Charakterisierung
Die Ergebnisse der elektrophysiologischen Charakterisierung wurden durch die
immunhistochemischen Färbungen mit spezifischen Antikörpern gegen P2X2- und P2X3-
Rezeptoruntereinheiten bestätigt. Die drei beschriebenen Populationen ließen sich anhand
ihrer spezifischen Immunreaktivität klar unterscheiden. Ein kleiner Teil der Neurone (22 %)
zeigte nur positive Färbungen gegen P2X3-Rezeptoruntereinheiten auf Soma und Neuriten.
Diese Neurone exprimieren keine oder eine nicht detektierbare Menge P2X2-
Rezeptoruntereinheiten. Dieses Ergebnis stimmt mit den Daten anderer Arbeitsgruppen
überein, die in Schnittpräparaten des trigeminalen Ganglions ebenfalls Immunreaktivität
gegen P2X3-Rezeptoruntereinheiten nachweisen konnten (Llewellyn-Smith und Burnstock,
1998; Cook et al., 1997). Diese Autoren beschreiben ebenfalls die Lokalisation der
Rezeptoren auf den Zellsomata und deren Fortsätzen. Dies weist darauf hin, dass die
Verteilung der Rezeptoren in vivo und in vitro vergleichbar ist.
Die zweite Population der kultivierten trigeminalen Neurone (36 %) wird durch P2X2- wie
P2X3-Antikörper angefärbt, es befinden sich also beide Rezeptoruntereinheiten auf den
Somata und den Fortsätzen dieser Neurone. Aufgrund der räumlichen Nähe der exprimierten
Rezeptoruntereinheiten erlauben diese Studien allerdings keine Aussage über die resultierende
homo- oder heteromere Rezeptorzusammensetzung.
Interessanterweise zeigte eine dritte Population (42 %) ausschließlich Immunreaktivität gegen
P2X2-Rezeptoruntereinheiten. Dies unterstützt die vorausgegangene pharmakologische
Charakterisierung dieser bislang nicht beschriebenen Gruppe trigeminaler Neurone, die
exklusiv homomere P2X2-Rezeptoren exprimieren.
80
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
In einer aktuellen Arbeit konnte mittels RT-PCR Analyse das Vorkommen von P2X2-
Rezeptoruntereinheiten mRNA im olfaktorischen Epithel gezeigt werden (Hegg et al., 2003).
Die Autoren konnten in Schnittpräparaten des olfaktorischen Epithels keine P2X2-
Immunreaktivität feststellen, allerdings fanden sie eine punktierte Färbung an den
Blutgefäßen unterhalb des Epithels. Die Probleme bei der Detektion von P2X2-
Immunreaktivität im Epithel könnten auf den sehr kleinen Durchmesser der feinen
trigeminalen Nervenendigungen innerhalb des Epithels (0,25 Micrometer, Finger et al., 2003)
zurückzuführen sein. Zudem werden möglicherweise nur wenige Rezeptorproteine auf den
Endigungen exprimiert. Die punktierte Färbung an den Blutgefäßen könnte trigeminalen
Ursprungs sein, denn diese Fasern innervieren auch die Blutgefäße unterhalb des
olfaktorischen Epithels (Silver und Finger, 1991).
4.3 Physiologische Funktion der trigeminalen Populationen
4.3.1 Lokalisation der Purinrezeptoren
Die Expression beider P2X-Rezeptoruntereinheiten sowohl auf den Somata als auch auf den
Fortsätzen der trigeminalen Neurone konnte mittels der immunhistochemischen Daten gezeigt
werden. Um zu überprüfen, ob die P2X-Rezeptoren in der Peripherie der Ausläufer auch
funktional sind, wurden eben diese Ausläufer fokal mit ATP stimuliert. Die hier
durchgeführten Ca2+-Imaging Experimente zeigen klar, dass die fokale ATP-Stimulation der
distalen Enden trigeminaler Fortsätze in Kultur zu einer Aktivierung der Neurone führt. Der
Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in den Somata der Neurone ist eine Folge
der P2X-Rezeptor vermittelten Depolarisation der Ausläufer. Dieses Signal gelangt,
wahrscheinlich über AP Fortleitung (Gover et al., 2003) bis zu den Somata der Neurone und
aktiviert dort spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die den Einstrom extrazellulärer
Kalziumionen erlauben. Mit diesem Experiment konnte die Funktionalität der peripher
exprimierten P2X-Rezeptoren trigeminaler Ausläufer in Kultur belegt werden. Eine
physiologische Funktion trigeminaler P2X-Rezeptoren in der Peripherie erscheint demnach
durchaus vorstellbar.
Zusammengefasst konnte mittels elektrophysiologischer, immunhistochemischer sowie
bildgebender Verfahren eine neue, bislang nicht beschriebene Population trigeminaler Fasern
identifiziert werden. Die ATP Sensitivität dieser Neuronenpopulation wird von homomeren
P2X2-Rezeptoren vermittelt, die auf Somata und Fortsätzen lokalisiert sind.
81
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
4.3.2 Nozizeptive Eigenschaften
Wie einleitend beschrieben könnte die Expression bestimmter P2X-Rezeptortypen einen
Hinweis auf die physiologische Funktion der Neurone geben. Die Arbeit von Cook und
Mitarbeiter (1997) liefert Hinweise darauf, dass ATP-induzierte Ströme in nozizeptiven
trigeminalen Neuronen von homomeren P2X3- oder heteromeren P2X2/3-Rezeptoren
vermittelt werden. Daher wurden in dieser Arbeit die Neurone auf ein beschriebenes Merkmal
nozizeptiver Neurone (TTX-Insensitivität, Lopez de Armentia et al., 2000; Djouhri et al.,
1998; Pearce und Duchen, 1994) untersucht. In Übereinstimmung mit Cook und Mitarbeitern
scheinen fast alle TTX-insensitiven trigeminalen Neurone P2X3-Rezeptoruntereinheiten zu
exprimieren (ausschließlich oder zusammen mit P2X2-Rezeptoruntereinheiten). Im Gegensatz
dazu sind nahezu alle Neurone, die ausschließlich P2X2-Rezeptor vermittelte Ströme zeigen,
TTX-sensitiv. Da diesen Neuronen zwei Merkmale nozizeptiver Neurone (Expression von
P2X3-Rezeptoruntereinheiten, TTX-Insensitivität) fehlen, könnten sie eine andere
physiologische Funktion als reine Nozizeption haben. Dies wurde auch schon für Neurone des
Hinterwurzelganglions diskutiert. Hier sollen Neurone, die P2X2-Rezeptoruntereinheiten
exprimieren, in keiner Beziehung zur Schmerzwahrnehmung stehen (Ueno et al., 1999).
4.3.3 Modulation durch Duftstoffe
In dieser Arbeit konnte eine mögliche Beteiligung der P2X2-Rezeptor exprimierenden
trigeminalen Neurone an der Detektion einer bestimmten Gruppe trigeminaler und
olfaktorischer Stimuli gezeigt werden. Durch Koapplikation mit ATP modulieren
Benzaldehyd und strukturverwandte Chemikalien spezifisch P2X2-Rezeptor vermittelte
Ströme. Die gleichzeitige Abnahme der Maximalamplitude und die Verlangsamung der
Anstiegszeit sowie der Antwortzeit der induzierten Stromantwort führen zu einer allgemeinen
Reduktion des Signals. Ein solcher Mechanismus kann die neuronale Antwort auf kurze ATP-
Signale substantiell verringern oder sogar inhibieren und somit als Tiefpassfilter fungieren.
Die Modulation ist abhängig von den eingesetzten Konzentrationen der Substanzen. Die
eingesetzten ATP- und Duftstoffkonzentrationen (10 µM ATP und zwei bis drei mM
Duftstoff) entsprechen physiologischen Bedingungen. Extrazelluläres ATP wird durch
Ektonukleotidasen auf der Zellmembran rasch abgebaut. Daher ist die Konzentration viel
niedriger als im Zellinnern, wo ATP als zellulärer Enegieträger in millimolaren
Konzentrationen vorkommt (Sperlagh und Vizi, 1996; Cook et al., 1997). Die psychometrisch
ermittelte Detektionsschwelle des humanen trigeminalen Systems für Duftstoffe wie
82
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Benzaldehyd ist deutlich höher als die des olfaktorischen Systems (Cometto-Muniz et al.,
1997; 1998a; 1998b; 1998c). Um eine Detektion mit dem trigeminalen System zu
ermöglichen, müssen daher Stimuluskonzentrationen im millimolaren Bereich verwendet
werden (Hummel et al., 1992). Wurden in der vorliegenden Arbeit niedrigere
Duftstoffkonzentrationen eingesetzt, trat die Modulation der P2X2-Rezeptoren nicht mehr auf.
Möglicherweise definiert der beschriebene P2X2-Rezeptor-abhängige Mechanismus die
relativ hohe trigeminale Detektionsschwelle in vivo.
Der modulatorische Effekt von Benzaldehyd ist zudem von der koapplizierten ATP-
Konzentration abhängig. Die Aufhebung der Modulation durch Erhöhung der ATP-
Konzentration in Kombination mit der erhöhten Anstiegszeit des modulierten Stromes legt
eine Kompetition um die ATP-Bindestelle des P2X2-Rezeptors nahe (Clements und
Westbrook, 1994). Dieser kompetitive Antagonismus ist Untereinheiten-spezifisch, da P2X3-
Rezeptor vermittelte Ströme nicht inhibiert werden. Durch dieses Fehlen des Benzaldehyd-
Effektes an P2X3-Rezeptoren kann auch eine direkte chemische Interaktion der Duftstoffe mit
ATP ausgeschlossen werden. Die Spezifität des Benzaldehyd Effektes konnte durch
Untersuchungen an heterolog exprimierten TRPM8-Rezeptoren, die auch von trigeminalen
Neuronen exprimiert werden, unterstrichen werden. Von diesen Rezeptoren vermittelte
Ströme werden nicht durch Benzaldehyd moduliert.
Die Untersuchung der Effekte strukturverwandter Substanzen belegt, dass der gefundene
Modulationsmechanismus spezifisch für eine bestimmte Gruppe von trigeminalen Stimuli ist.
Eine grundlegende strukturelle Voraussetzung scheint die aromatische Ringstruktur zu sein,
während leichte Veränderungen der Seitenkette toleriert werden. Da es sich auch bei den nicht
modulatorisch wirksamen Stimuli mit struktureller Ähnlichkeit zu Benzaldehyd um
trigeminale Stimuli handelt, scheint es für diese Stimuli einen anderen, bisher noch
ungeklärten Detektionsmechanismus zu geben.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein potentieller molekularer Mechanismus zur
trigeminalen Detektion des Duftstoffes Benzaldehyd und strukturell-verwandter Stimuli
beschrieben. Durch die Reduktion der ATP-induzierten Ströme könnte das Aktivitätsmuster
der trigeminalen Fasern verändert werden. Diese Veränderung könnte zu der zentralen
Erkennung dieser Gruppe trigeminaler und olfaktorischer Stimuli beitragen. Das Fehlen
olfaktorischer Rezeptorproteine sowie der Mangel eines direkten detektierbaren Effektes von
Benzaldehyd, Toluen, Acetophenon oder 3-PPA auf trigeminale Neurone unterstreicht die
Signifikanz des beschriebenen modulatorischen Mechanismus.
83
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
4.4 Mögliche ATP-Quellen im nasalen Epithel
Wenn die Modulation der P2X2-Rezeptor vermittelten Ströme durch Benzaldehyd oder
strukturverwandte Stimuli Anteil an der trigeminalen Duftdetektion hat, ist eine ATP-
Freisetzung in der Nähe der trigeminalen Fasern eine wichtige Vorraussetzung. Eine solche
ATP-Freisetzung kann mit Hilfe des fluoreszierenden Farbstoffes Quinacrin, einem Acridin-
Derivat, das ATP bindet, untersucht werden. Durch spezifische Bindung des Quinacrin
können intrazelluläre ATP-Akkumulationen z.B. in Vesikeln detektiert werden (Bodin und
Burnstock, 2001a). Nimmt nach einer Stimulation die intrazelluläre Fluoreszenz ab, kann dies
als ATP-Freisetzung interpretiert werden (Bodin und Burnstock, 2001a; Sorensen und Novak,
2001; Knight et al., 2002). Der Vorteil dieser Methode ist, dass die ATP-Freisetzung auf
Einzelzellniveau studiert werden kann.
Die allgemein akzeptierte Luziferin-Luziferase-Methode erlaubt die Bestimmung der ATP-
Freisetzung auf Einzelzellniveau nicht und wird daher in dieser Arbeit nicht angewendet. Bei
dieser Methode wird die ATP Menge im Zellüberstand nach einer Stimulation bestimmt.
Dabei katalysiert Luziferase eine Reaktion zwischen freigesetztem ATP und Luziferin in der
extrazellulären Lösung. Diese Reaktion kann über die entstehende Lumineszenz
nachgewiesen werden. Es ist dabei unmöglich, zwischen induzierter ATP-Freisetzung und
ATP-Freisetzung durch Zelllyse zu unterscheiden (Sorensen und Novak, 2001).
Aufgrund der beschriebenen räumlichen Nähe zwischen trigeminalen Fasern und ORN
(Silverman und Krüger, 1989; Biffo et al., 1990; Silver und Finger, 1991), wurde in dieser
Arbeit untersucht, ob ORN eine mögliche ATP-Quelle im olfaktorischen Epithel darstellen.
Die Ergebnisse belegen einen Stimulus-induzierten Fluoreszenzverlust in ORN, der als ATP-
Freisetzung gewertet werden kann. Nur acht von fünfzehn Neuronen zeigen eine solche
Reaktion nach Stimulation mit einem Duftstoffgemisch. Hingegen zeigen alle getesteten
Neurone eine Reduktion der Fluoreszenz, wenn die Rezeptoraktivierung umgangen und eine
Aktivierung der Signalkaskade durch Forskolin vorgenommen wird. Der Fluoreszenzverlust
ist also abhängig von der Aktivierung der Neurone. Wie erwartet können einige Neurone von
keinem Duft im Gemisch aktiviert werden, obwohl sie über eine intakte Signalkaskade
verfügen (aktivierbar durch Forskolin). Jedes ORN exprimiert nur einen von 1000 möglichen
Rezeptortypen, d.h. es kann auch nur von einer bestimmten Duftstoffgruppe aktiviert werden
(Nef et al., 1992; Ressler et al., 1993; Vasar et al., 1993; Malnic et al., 1999). Entsprechend
beinhaltet ein Duftstoffgemisch aus 50 verschiedenen Duftstoffen nicht für jeden Rezeptor
bzw. für jedes Rezeptorneuron einen passenden Liganden.
84
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Der exakte Mechanismus, über den Duftstimulation zu einer ATP-Freisetzung aus den
Somata der ORN führt, bleibt unklar. Bislang wurden verschiedene Möglichkeiten der
Freisetzung intrazellulären ATPs beschrieben (vesikuläre Freisetzung, Transporter vermittelte
Freisetzung über ABC-Proteine (ATP-binding cassete proteins) oder Zelllyse), allerdings sind
die exakten Mechanismen noch Gegenstand intensiver Diskussion (zur Übersicht siehe Bodin
und Burnstock, 2001b). In dieser Arbeit wurde versucht, eine vesikuläre ATP-Freisetzung in
ORN durch spezifische Pharmaka (TeTX, NEM) nachzuweisen, allerdings konnte die
Reduktion der Quinacrine-Fluoreszenz durch keine der beiden verwendeten Substanzen
verhindert werden. Dies könnte bedeuten, dass ATP über einen anderen, nicht vesikulären
Mechanismus freigesetzt wird. Andererseits sind auch Tetanustoxin-insensitive vesikuläre
Freisetzungsprozesse beschrieben worden (Fassio et al., 1999; Bonanno et al., 2000).
Darüberhinaus inhibiert auch NEM möglicherweise nicht alle Mechanismen der vesikulären
Freisetzung, so dass auch ATP-Ausschüttung durch sekretorische Vesikel nicht vollständig
ausgeschlossen werden kann.
Neben der hier untersuchten Möglichkeit der Duft-induzierten ATP-Freisetzung durch ORN
sind noch einige andere ATP Quellen im olfaktorischen Epithel denkbar. Hegg und
Mitarbeiter (2003) postulieren einen konstanten niedrigen ATP-Spiegel im Riechepithel.
Dieser könnte zu einer tonischen Stimulation der trigeminalen Endigungen führen. Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass Stimulation sympathischer Nervenfasern, die das nasale Epithel
ebenfalls innervieren, zu einer Koausschüttung von Acetylcholin und ATP und damit auch zu
einer Erhöhung der extrazellulären ATP Konzentration führt (Liang und Vizi, 1996). Eine
weitere Möglichkeit wäre ein autokriner Aktivierungsmechanismus der Purinrezeptoren, denn
auch für trigeminale Fasern selbst wird eine Stimulus-induzierte ATP-Freisetzung diskutiert
(Finger et al.,1990; Getchell und Getchell, 1992). Weiterhin könnten die einleitend
beschriebenen, einzelnen chemosensorischen Zellen des respiratorischen Epithels (Finger et
al., 2003) ATP als Transmitter nutzen und so die sie innervierenden trigeminalen Neurone
aktivieren.
85
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
4.5 Linalool als trigeminaler Stimulus
Ein weiterer Schwerpunkt meiner Forschungsarbeit war die Untersuchung weiterer Duftstoffe
auf ihre Effektivität an kultivierten trigeminalen Neuronen untersucht. Ein interessanter
Kandidat war Linalool, der vom trigeminalen System erkannt werden kann (Cometto-Muniz
et al., 1998b,c; Frasnelli et al., 2003). Anders als die zuvor beschriebene Duftstoffgruppe um
Benzaldehyd und einige Strukturverwandte, führt Linalool zu einer direkten Aktivierung
trigeminaler Neurone. Sowohl der niedrige Anteil (30 %) der responsiven Neurone als auch
die Ineffektivität des Duftstoffes an anderen Zelltypen (HEK-Zellen, kortikale Neurone)
zeigen, dass eine trigeminale Population über spezifische Detektionsmechanismen für dieses
Molekül verfügen muss. Die Neurone, die zu dieser neu identifizierten, Linalool-sensitiven
Population gehören, lassen sich jedoch keiner der zuvor beschriebenen Populationen
unterschiedlicher Purinrezeptor-Expression zuordnen. Sowohl potentielle nozizeptive
Neurone (P2X3- bzw. P2X3 und P2X2-Rezeptoruntereinheiten-Expression) als auch
potentielle nicht-nozizeptive Neurone (P2X2-Rezeptoruntereinheiten-Expression) sind z.T.
sensitiv gegenüber Linalool. Die Spezialisierung der P2X2-Rezeptor exprimierenden
trigeminalen Neurone auf die Detektion von Duftstoffen scheint demnach für die
Duftstoffgruppe um Benzaldehyd und strukturverwandte Stimuli, nicht aber für den Duftstoff
Linalool zuzutreffen. Linalool, das einen anderen Detektionsmechanismus nutzt, kann auch
von P2X3-Rezeptor exprimierenden Neuronen erkannt werden.
Die Untersuchung der Dosis-Wirkungsbeziehung zeigte, dass Konzentrationen von
mindestens 1mM Linalool nötig sind, um die trigeminalen Neurone in vitro zu aktivieren. Da
die psychometrisch ermittelte Detektionsschwelle des humanen trigeminalen Systems für
Duftstoffe deutlich höher ist als die des olfaktorischen Systems (Cometto-Muniz et al., 1997;
1998a; 1998b; 1998c), liegen die wirksamen Linalool Konzentrationen im physiologischen
Bereich. Dies wird durch extrazelluläre Ableitungen vom nasalen Epithel unterstützt, die
zeigen, dass Stimuli in millimolaren Konzentrationen eingesetzt werden müssen, um
trigeminale Neurone zu aktivieren (Hummel et al., 1992). Die Bestimmung einer
vollständigen Dosis-Wirkungsbeziehung wird durch die geringe Wasserlöslichkeit des
Linalools limitiert. Bei einer Konzentration von mehr als 10 mM Linalool kommt es zur
Mizellenbildung, so dass die Applikation definierter Konzentrationen unmöglich wird. Da die
Wirksamkeit der getesteten Linalool-Lösungen mit steigender Konzentration immer weiter
zunimmt und im Grenzbereich der Löslichkeit noch keine Saturierung erreicht ist, konnte eine
86
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Bestimmung der halbmaximal wirksamen Konzentration (EC50) sowie des Hillkoeffizienten
nicht vorgenommen werden.
Die Ca2+-Imaging Untersuchungen belegen, dass Linalool eine Kalziumleitfähigkeit in der
Membran trigeminaler Neurone öffnet. Der gemessene Anstieg der intrazellulären
Kalziumkonzentration ist ausschließlich auf den Einstrom extrazellulärer Kalziumionen
zurückzuführen. Intrazelluläre Kalziumspeicher sind primär an der Entstehung des Linalool-
induzierten Signals nicht beteiligt. Eine sekundäre, signalverstärkende Freisetzung nach
Einstrom extrazellulären Kalziums kann anhand der vorliegenden Daten nicht völlig
ausgeschlossen werde, ist aber sehr unwahrscheinlich, da das Kalziumsignal nach der
Entleerung der intrazellulären Speicher durch Tapsigargin nicht reduziert ist. Die
elektrophysiologischen Daten zeigen, dass der Linalool-induzierte Strom nicht ausschließlich
von Kalziumionen, sondern auch noch von anderen Kationen getragen wird. Möglich wäre
der Einstrom extrazellulärer Natriumionen entlang ihres Konzentrationsgradienten. Es würde
sich dann bei den Linalool-aktivierten Leitfähigkeiten um unspezische Kationenkanäle
handeln.
4.5.1 TRPM8 als Linaloolrezeptor
Meine Untersuchungen heterolog exprimierter TRPM8-Rezeptoren zeigen, dass diese
Rezeptoren nicht nur, wie zuvor beschrieben, von den Duftstoffen Menthol und Eukalyptol
(McKemy et al., 2002), sondern auch von Linalool aktiviert werden können. Die Aktivierung
des Rezeptors durch Linalool gleicht eher der durch Eukalyptol als der durch Menthol.
Sowohl für Eukalyptol (McKemy et al., 2002) als auch für Linalool liegt die
Aktvierungschwelle bei > 2,5 mM. Hingegen werden die Rezeptoren bereits durch ≥ 30 µM
Menthol aktiviert (McKemy et al., 2002). Linalool ist also wie Eukalyptol ein schwacher
Agonist des TRPM8-Rezeptors. Um das Bindeverhalten am TRPM8-Rezeptor zu
untersuchen, wurde der schwache Agonist Linalool mit Icilin koappliziert. Icilin (oder AG-3-
5) wurde bereits 1983 als eine Kälteempfindung hervorrufende Substanz beschrieben (Wei
und Seid, 1983). McKemy und Mitarbeiter (2002) konnten zeigen, dass diese Substanz ein
potenter Agonist für den TRPM8-Rezeptor ist. Sein EC50-Wert liegt deutlich unter dem von
Menthol (400 nM vs. 70 µM). Interessanterweise reduziert eine niedrige
Linaloolkonzentration, die den Rezeptor selbst nicht aktivieren konnte, den Icilin-induzierten
Strom bzw. Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Diese relativ hohe Affinität
87
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
zum Rezeptor bei gleichzeitiger geringer Effektivität der Aktivierung charakterisiert Linalool
als partiellen Agonisten (Colquhoun und Sakmann, 1985) des TRPM8-Rezeptors.
Die Reduktion nimmt mit steigender Icilinkonzentration ab und ist ab einer Konzentration
von 100 micromolar Icilin nicht mehr zu beobachten. Eine solche „Verdrängung“ deutet
darauf, dass beide Agonisten um dieselbe(n) Bindestelle(n) des Rezeptors konkurrieren.
Auch trigeminale Neurone exprimieren TRPM8-Rezeptoren (McKemy et al., 2002). Die in
dieser Arbeit beschriebenen Eigenschaften der Linalool-induzierten Aktivierung trigeminaler
Neurone stimmen weitgehend mit den beschriebenen Eigenschaften der TRPM8-Rezeptoren
überein.
TRPM8-Rezeptoren sind ionotrope Rezeptorkanalkomplexe, d.h. eine Aktivierung induziert
direkt einen Ionenstrom. Sie leiten sowohl monovalente als auch divalente Kationen mit einer
Präferenz für Kalziumionen (McKemy et al., 2002; Peier et al., 2002). Entsprechend wäre der
Reststrom, der nach Entfernung der Kalziumionen aus der extrazellulären Lösung bei patch-
clamp Untersuchungen zu beobachten ist, ein Einstrom von Natriumionen. Auch die
Beobachtung, dass sowohl potentielle nozizeptive und nicht-nozizeptive Neurone Linalool
detektieren können, lässt sich mit dem postulierten TRPM8-Rezeptor Expressionsmuster
vereinbaren. Es konnte gezeigt werden, dass etwa 50 % der Kälte- und Menthol-sensitiven
trigeminalen Neurone ebenfalls Capsaicin-sensitiv sind und damit den nozizeptiven Neuronen
zugeordnet werden (McKemy et al., 2002; Reid et al., 2002). Dieser Befund steht im Einklang
mit den Ergebnissen meiner Arbeit, die 53 % der Linalool-sensitiven Neurone als putativ
nozizeptiv charakterisieren. Auch andere Arbeiten charakterisieren TRPM8-Rezeptor
exprimierende Neurone als nozizeptiv (trkA-Rezeptor Expression), allerdings finden sie keine
Koexpression mit TRPV1 (Capsaicin-Rezeptor) oder typischen Markern Capsaicin-sensitiver
Neurone (IB4 oder CGRP) (Peier et al., 2002; Nealen et al., 2003). Der Grund hierfür
scheinen unterschiedliche Kultivierungsbedingungen zu sein. Eine Kultivierung der Neurone
mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) (McKemy et al., 2002; Reid et al., 2002) beeinflußt die
Expression des TRPV1-Rezeptors (Winston et al., 2001; Chuang et al., 2001; Ji et al., 2002)
und scheint daher für eine Koexpression von TRPV1 und TRPM8 verantwortlich zu sein
(Story et al., 2003).
Einzig der in dieser Arbeit bestimmte Gesamtanteil Linalool-sensitiver trigeminaler Neurone
stimmt nicht mit dem in der Literatur beschriebenen Anteil Menthol-sensitiver Neurone
überein. Menthol induzierte in 13-15 % der trigeminalen Neurone eine Kalziumerhöhung
(McKemy et al., 2002; Nealen et al., 2003), während Linalool etwa 25 % der Neurone
aktiviert. Auch unter denselben Kulturbedingungen, die in diser Arbeit verwendet wurden,
88
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
aktiviert Menthol nur 15,9% der trigeminalen Neurone (N. Damann, persönliches Gespräch).
Dies könnte ein erster Hinweis darauf sein, dass trigeminale Neurone neben TRPM8-
Rezeptoren noch über (einen) andere(n) Linalool-sensitive Detektionsmechanismen verfügen.
Um die potentielle Beteiligung von TRPM8-Rezeptoren an der Linalool-induzierten
Aktiverung trigeminaler Neurone zu untersuchen, wurde der Blocker BCTC verwendet. Da
diese Substanz nicht nur den TRPM8-Rezeptor, sondern auch den TRPV1-Rezeptor blockiert,
wurde zuvor eine Linalool-induzierte Aktivierung des TRPV1-Rezeptors im heterologen
System ausgeschlossen. Die BCTC-induzierte Blockade der Linalool-induzierten Aktivierung
trigeminaler Neurone zeigt daher, dass diese Aktivität von TRPM8-Rezeptoren vermittelt
wird. Allerdings konnte BCTC die Linalool-induzierte Aktivität nur auf die Hälfte reduzieren,
während Aktivierung des heterolog exprimierten TRPM8-Rezeptors durch Linalool auf 20 %
vermindert wurde. Diese Differenz weist ebenfalls auf einen oder mehrere weitere(n)
Detektionsmechanismen trigeminaler Neurone für den Duftstoff Linalool hin. Diese
Hypothese wird durch den höheren Prozentsatz Linalool-sensitiver Neurone im Vergleich zu
Menthol-sensitiven Neuronen gestärkt.
Zudem konnte kürzlich gezeigt werden, dass nur 27 % der Menthol-sensitiven trigeminalen
Neurone TRPM8-Rezeptoren exprimieren (Nealen et al., 2003). Es scheint also auch für
Menthol weitere Detektionsmechanismen zu geben. Beispielsweise berichten Swandulla und
Mitarbeiter (1987), dass Kalziumkanäle hoher und niedriger Aktivierungsschwelle auf
unterschiedliche Art von Menthol moduliert werden.
Da sowohl Menthol als auch Linalool als kühl und frisch empfunden werden, ist auch eine
zusätzliche Detektion durch weitere Kälte-sensitive Ionenkanäle denkbar. So wird der
epitheliale Natriumkanal (ENaC) ebenfalls durch Kältereize aktiviert (Askwith et al., 2001).
Der mechano- und chemosensitive Kanal TREK-1, ein zwei-Poren-Domänen Kaliumkanal,
schließt bei Kältereiz und induziert damit eine neuronale Depolarisation (Maingret et al.,
2000). Zudem wurde kürzlich ein weiterer Kälte-sensitiver TRP-Kanal (ANKTM1)
identifiziert, der auch durch Icilin, aber nicht durch Menthol aktiviert werden kann (Story et
al., 2003). Möglicherweise ist dieser ANKTM1 auch sensitiv gegenüber Linalool.
Die Tatsache, dass in allen von mir untersuchten Neuronen die Linalool-induzierte
Aktivierung durch BCTC teilreduziert wird, weist auf die Koexistenz von TRPM8-
Rezeptoren und anderen Linalool-sensitiven Strukturen in denselben Neuronen hin. Auch
konnte keine distinkte Linalool-sensitive, aber BCTC-insensitive Population identifiziert
werden. Die wahrscheinliche Komplexizität der Signaltransduktion von Kälte oder
89
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
Kälteempfindung-imitierender Substanzen wie Menthol und Linalool wird durch eine kürzlich
erschienene Arbeit unterstrichen. Thut und Mitarbeiter (2003) sehen die Kälte-Transduktion
als einen komplexen Prozess, an dem die Aktivierung und die Inhibition verschiedener
Ionenkanäle beteiligt sind.
90
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
5. Zusammenfassung
Die Chemosensitivität des trigeminalen Systems erlaubt die Detektion und Unterscheidung
vieler Duftmoleküle, unabhängig vom olfaktorischen System. Die zugrunde liegenden
molekularen Mechanismen sind bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt
werden, dass trigeminale Neurone nicht über die spezifischen Duftrezeptorproteine des
olfaktorischen Systems verfügen. Stattdessen wurden erstmalig alternative molekulare
Detektionsmechanismen für die trigeminal wirksamen Dufstoffe Benzaldehyd (und
Strukturverwandte) und Linalool beschrieben.
Nahezu alle kultivierten trigeminalen Neurone (98 %) wiesen ATP-sensitive ionotrope
Rezeptorkanalkomplexe (P2X-Rezeptoren) auf. Da es Hinweise auf einen Zusammenhang
zwischen der physiologischen Funktion der Neurone und der Expression verschiedener P2X-
Rezeptortypen gibt, wurde zunächst eine Klassifizierung der Neurone des gesamten Ganglion
gasseri anhand ihrer P2X-Rezeptor-Expression vorgenommen. Mittels elektrophysiologischer
und immunhistochemischer Methoden konnte eine bislang nicht beschriebene Population
trigeminaler Neurone identifiziert werden, die wahrscheinlich keine Rolle in der trigeminalen
Schmerzvermittlung spielt, da den Neuronen typische Charakteristika nozizeptiver
Nervenzellen (TTX-Insensitivität, P2X3-Rezeptor-Expression) fehlen. Diesen Neuronen
könnte eine besondere Bedeutung in der Detektion spezifischer Duftstoffe zuzukommen. Nur
Neurone dieser Population exprimieren ausschließlich homomere P2X2-Rezeptoren, deren
Aktivierung zu einem anhaltenden Ionenstrom bzw. einer Folge von Aktionspotentialen führt.
Diese Aktivierung wird durch Benzaldehyd und einige strukturverwandte Duftmoleküle
deutlich reduziert. Die resultierende Modulation der Aktionpotentialfrequenz kann zentral
analysiert werden und so zur Perzeption dieser spezifische Duftstoffgruppe beitragen.
Zwingende Vorraussetzung für diese Modulation ist die zeitgleiche Präsenz extrazellulären
ATPs. Die vorliegende Arbeit zeigt auch erstmalig eine aktivierungsabhängige ATP-
Freisetzung aus olfaktorischen Rezeptorneuronen und diskutiert andere ATP-Quellen im
nasalen Epithel.
Die Bedeutung des beschriebenen modulatorischen Effektes wird durch mehrere
experimentelle Befunde unterstützt. Zum einen ist die Modulation, aufgrund der strukturellen
Anforderungen an wirksame Moleküle (rezeptives Feld), sehr spezifisch für bestimmte
Duftstoffe. Außerdem werden trigeminale Neurone, die aufgrund ihrer P2X3-Rezeptor-
Ausstattung einer anderen Population zugeordnet werden können, nicht moduliert. Ein
91
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
direkter Effekt von Benzaldehyd oder strukturverwandten Molekülen an trigeminalen
Neuronen wurde nicht gefunden.
Anders als Benzaldehyd führt der Duftstoff Linalool zu einer direkten Aktivierung
trigeminaler Neurone und induziert einen Einstrom extrazellulärer Kalziumionen. Die
pharmakologischen Untersuchungen zeigen, dass zumindest ein Teil dieses Stromes von
TRPM8-Rezeptoren vermittelt wird. Dieser Rezeptor ist als Kälte- und Menthol-sensitiv
beschrieben (McKemy et al., 2002; Peier et al., 2002). Darüberhinaus weisen die vorliegenden
Daten darauf hin, dass der Duftstoff Linalool als partieller Agonist dieses Rezeptors fungiert
und mit dem bekannten TRPM8-Agonisten Icilin um dieselbe Bindestelle konkurriert.
Zusätzlich existieren Hinweise auf weitere Linalool-sensitive Detektionsprozesse in
trigeminalen Neuronen, deren Vorkommen in weiteren Untersuchungen geklärt werden muss.
Diese Arbeit zeigt, dass trigeminale Neurone wahrscheinlich keine Rezeptoren exprimieren,
die auschließlich der Duftstoffdetektion dienen. Vielmehr werden zur Detektion spezifischer
Duftstoffgruppen Rezeptoren wie TRPM8 oder P2X2 genutzt, die auch andere Reize wie
Kälte oder extrazelluläres ATP detektieren. Der Befund, dass TRPV1-Rezeptoren auch als
Rezeptoren für den Duftstoff Eugenol fungieren (Yang et al., 2003), unterstreicht diese
Hypothese. Die unterschiedliche Duftstoff-Modulation trigeminaler Rezeptoren in z.T.
polymodalen Fasern macht deutlich, dass das trigeminale System über komplexe
Verarbeitungsmechanismen verfügt, die entscheidend zur Dufterkennung in zentralen
Neuronen genutzt werden können.
92
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
5. Abkürzungsverzeichnis αβ meATP α,β- MethylenATP AP Aktionspotential ASIC „acid-sensing ion-channel“, Protonen-aktivierter Ionenkanal ATP Adenosintriphosphat cDNA zyklische Desoxyribonukleinsäure CGRP „calcitonin-gene-related peptide“ DMEM Dulbecco’s modifiziertes Eagle Medium EC50 halbmaximale Aktivierungskonzentration eGFP „enhanced“ grün fluoreszierendes Protein GADPH Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase Gg Ganglion gasseri HBSS „Hank’s buffered salt solution“ DIV „days in vitro“, Tage in Kultur EDTA Ethylendinitroloessigsäure EGTA Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraessigsäure G-Protein Guanosinnukleotid-abhängiges Protein HEK „human embryonic kidney cells“, humane embryonale Nierenzellen VPM Nucleus ventralis posteromedialis HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N‘-2-ethansulfonsäure Ip5I Diinosinpentaphosphat mRNA „messenger“ Ribonukleinsäure MEM „minimal essential medium“ NEM N-ethylmaleimid NGF „nerve growth factor“, Nervenwachstumsfaktor NST Neuronen-spezifisches Tubulin OE olfaktorisches Epithel OPV Operationsverstärker ORN olfaktorische Rezeptorneurone PBS „phosphate-buffered saltsolution“ PCR „polymerase chain reaction“, Polymerasekettenreaktion Rf Rückkoppelwiderstand S.E.M. Standardfehler des Mittelwertes TeTX Tetanustoxin TRITC Tetramethylrhodamin 5-(und-6-)Isothiocyanat TRP „transient receptor potential“ Kanal TTX Tetrodotoxin
93
Chemoperzeption trigeminaler Neurone
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7. Danksagung Abschließend möchte ich mich bei allen bedanken, die direkt oder indirekt zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes, die wissenschaftliche Betreuung und Förderung sowie für die kontinuierliche Unterstützung und offene Diskussionsbereitschaft während der alltäglichen kleineren und größeren Probleme. Herrn PD Dr. M. Schmidt danke ich für das Interesse an dieser Arbeit und für die Übernahme des Koreferates. Der Studienstiftung des deutschen Volkes danke ich für das dreijährige Stipendium und das Vertrauen in meine Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. E. Kalisch für seine hervorragende Betreuung in schwierigen Situationen, ohne die ich diese Arbeit wahrscheinlich nicht beendet hätte. Bei Herrn HD Dr. Christian H. Wetzel möchte ich mich für seine ständige Hilfsbereitschaft und die konstruktive Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit, sowie für viele interessante Gespräche abseits der rein wissenschaftlichen Thematik bedanken. Herrn Harald Bartel danke ich für den Aufbau meiner Meßapparatur sowie seine schnelle und unkomplizierte Hilfe bei allen technischen Fragen. Herrn Dr. G. Gisselmann danke ich für seine Hilfe bei allen Fragen der Molekularbiologie. Ein großes Dankeschön allen Mitarbeitern am Lehrstuhl für Zellphysiologie, allen ehemaligen Kolleginnen und Kollegen, sowie allen Mitgliedern der Caipi-Runde, die zu der guten Atmosphäre während und oft auch nach der Arbeit beigetragen haben. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir die Ausbildung ermöglicht und mich bei meinen ersten Schritten ins Berufsleben immer unterstützt haben, meiner Familie und meinen Freunden, die mir Rückhalt geben und auf die ich mich immer verlassen kann. Meinem Mann und Kollegen Marc danke ich für seine großartige Unterstützung sowohl in fachlichen als auch in emotionalen Situationen, seine unendliche Geduld und seine Liebe. Danke, dass wir einen gemeinsamen Lebensweg gefunden haben!
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8. Anhang
8.1 Lebenslauf
Name: Jennifer Spehr, geb. Paul Geburtsdatum und -ort: 24.11.1975, Essen Nationalität: deutsch Geschlecht: weiblich Familienstand: verheiratet Adresse: Duisburger Weg 16 59439 Holzwickede Deutschland Arbeitsplatz: Lehrstuhl für Zellphysiologie, ND 4 Universitätsstraße 150 44780 Bochum Deutschland Telefon: +49 234 3226718 Fax: +49 234 3214129 E-mail: [email protected] Ausbildung und beruflicher Werdegang 1995 Abschluß der gymnasialen Schullaufbahn
(B.M.V.Schule Essen) mit Erreichen der Allgemeinen Hochschulreife (Abitur-Durchschnittsnote 1,6)
1995 – 2000 Studium der Biologie an der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum (Abschluß mit der Diplomnote 1,1)
2000 – 2004 Promotion am Lehrstuhl für Zellphysiologie an der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum
Arbeitserfahrung Methodische Kenntnisse Elektrophysiologie: Patch-clamp und EOG Aufnahmen, bildgebende Verfahren: Calcium imaging, Immunohistology, Experimentelle Tierhaltung (Maus und Ratte), Zellkultur, heterologe Proteinexpression, Präparation neuronaler Zellen und Dissoziationstechniken. Computerkenntnisse Hard- und Softwarekenntnisse (PC und Mac) inkl. Word, Exel, Power Point, Corel Draw, etc. Sprachkenntnisse Deutsch: Muttersprache Englisch: fließend in Wort und Schrift Französisch: Grundkenntnisse
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8.2 Publikationen
Veröffentlichte Artikel Jennifer Paul, Kurt Gottmann and Volkmar Lessmann, NT-3 regulates BDNF-induced modulation of synaptic transmission in cultured hippocampal neurons. Neuroreport. 2001 Aug 28;12(12):2635-9. eingereichte Artikel Jennifer Spehr, Marc Spehr, Hanns Hatt, Christian H. Wetzel Subunit-specific P2X-receptor expression defines chemosensory properties of trigeminal neurons. European Journal of Neuoscience Kongressbeiträge Paul J., Hatt H., Wetzel C.H. Electrophysiological and chemosensory properties of cultured trigeminal neurons. XXIIIrd annual meeting of the Association for Chemoreception Sciences, 2001. Sarasota, Florida Paul J., Hatt H., Wetzel C.H. Electrophysiological and chemosensory properties of cultured trigeminal neurons. 12th neurobiological PhD students‘ workshop, Stuttgart-Hohenheim, Germany, 2001 Paul J., Hatt H., Wetzel C.H. Electrophysiological investigations on cultured rat trigeminal neurons. 4th meeting of the German Neuroscience Society, 2001; 28th Göttingen Neurobiology Conference, Germany 2001 Paul J., Wetzel C.H., Hatt H. Electrophysiological characterization of P2X-receptors in cultured trigeminal neurons. XXIVth annual meeting of the Association for Chemoreception Sciences, 2002. Sarasota, Florida Paul J., Wetzel C.H., Hatt H. Electrophysiological characterization of P2X-receptors in cultured trigeminal neurons. 15th European Chemoreception Research Organisation Congress, 2002. Erlangen, Germany Paul J., Spehr M., Hatt H., Wetzel C.H. Expression of different P2X-receptors in cultured trigeminal neurons. 82nd Annual meeting Deutsche Physiologische Gesellschaft 2003, Bochum, Germany Paul J., Spehr M., Hatt H., Wetzel C.H. Identification of trigeminal subpopulations differing in their P2X-receptor expression. XXVth annual meeting of the Association for Chemoreception Sciences, 2003. Sarasota, Florida Spehr J., Spehr M., Hatt H., Wetzel C.H. Trigeminal expression of P2X-receptors and their contribution to chemosensation. Olfactory Bioresponse Meeting III, 2003. Dresden, Germany
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