Nanotoxikologie & NeoSino Testung
Medizinische Universität Graz
Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung (ZMF)
Prof. Dr. Eleonore Fröhlich
29.05.2010 Workshop NeoSino 2
Nanopartikel: Gebilde von <100 nm in einer Dimension
Nanotoxikologie beschreibt, dass sich die (schädlichen) Eigenschaften im Nano-Größenbereich von denen der entsprechenden Rohmaterialien unterscheiden
Allgemeines
29.05.2010 Workshop NeoSino 3
Kopierer/Drucker Beschichtungen/Klebstoffe/Lacke Autoreifen Kosmetik Sonnenschutz Nahrungsmittelzusätze Medizinprodukte (z.B. Medikamente,
Kontrastmittel, regenerative Medizin)
Nanopartikel - Applikationen
29.05.2010 Workshop NeoSino 4
Verbraucherprodukte
Kosmetik, Sonnenschutz – TiO2, ZnO, CeO2
Nahrungsmittelzusätze – SiO2 (Ketchup) Brillen – anorganisch/organische
Hybridpolymere Gewebe – organische Polymere Katalysatoren – Metalle und Metallhybride
29.05.2010 Workshop NeoSino 5
Medizinische Produkte
Applikation Produkt
Appetitzügler Megace ® ES
Zytostatika AbraxaneTM, Doxil ®, Emend ®
Cholesterinsenkung TriCor ®
Hormonersatz EstrasorbTM
Immunsuppressiva Rapamune ®
29.05.2010 Workshop NeoSino 6
Eigenschaften
Vorteile NachteileNP können Substanzen an Wirkungsorte bringen
NP können Zellbarrieren überwinden
NP schützen pharmakologische Wirkstoffe vor Abbau
Sie haben eine große Oberfläche und sind daher besonders reaktiv
NP verstärken die Wirkung von Therapien
Nanopartikel aggregieren gerne
29.05.2010 Workshop NeoSino 7
Feinstaub
29.05.2010 Workshop NeoSino 8
Inhalation > 10µg/m3 PM10 Mortalität
Insgesamt: + 300% Kardiovaskuläre Todesfälle: + 120%
Hospitalisierungen: COPD: + 250% Pneumonien: + 150% Asthma: + 170% Kardiovaskuläre Probleme: + 80%
Zusammenfassung aus >100 verschiedenen Studien
Feinstaub
29.05.2010 Workshop NeoSino 9
Hornhaut des Auges (Arbeitsplatz, Umwelt)
Lunge (Arbeitsplatz, Umwelt) Verdauungstrakt
(Nahrungsmittel, Medikamente, Zahnpasta)
Haut (Arbeitsplatz, Kosmetika)
Eintrittspforten
29.05.2010 Workshop NeoSino 10
Eintrittspforten
Die Lunge besitzt die dünnste Barriere des Körpers
29.05.2010 Workshop NeoSino 11
Zellschädigung: Mechanische Schädigung der Zellmembran Induktion des programmierten Zelltodes
(Apoptose)
Beeinflussung des Immunsystems: Bindung von Proteinen → Immunantwort Aktivierung von Makrophagen → Entzündung
Effekte der Nanopartikel
29.05.2010 Workshop NeoSino 12
Gewebezellen Vitalität, Zellfunktionen Organellenschädigung Chronische Effekte
Blut Erythrozytenintegrität Gerinnung Funktion der Immunzellen
Untersuchungen
29.05.2010 Workshop NeoSino 13
Toxikologische Parameter Effekte auf Zellteilung Zellschädigung Erythrozytenschädigung Unspezifische Aktivierung des Immunsystems
Testung ‚ŋeosino SMC tonicum Mineralkomplex Trinkampullen’ Nanopartikel suspendiert in Wasser Testbereich: empf. Maximaldosis wird zu 100%
aufgenommen und im Plasma verteilt
Neosino Testung
29.05.2010 Workshop NeoSino 14
Zellen besitzen bestimmte Enzyme Die Aktivität dieser Enzyme wird quantifiziert Ein Abfall der Gesamtaktivität lässt auf eine
Beeinträchtigung der Zellen schließen
Zelluläre Schädigung - Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 15
Anzüchten der Zellen Behandlung mit Testsubstanz 4h und 24h Mikroskopische Beurteilung der Zellen Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)
Zelluläre Schädigung
29.05.2010 Workshop NeoSino 16
EAhy926 mit 20 nm Carboxyl Polystyrolpartikeln
020406080
100120140
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
µg/ml
% of control
Eahy926 treated for 24 h with Neosino
020406080
100120140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
µl/ml
% of control
Zelluläre Schädigung
29.05.2010 Workshop NeoSino 17
Zellen besitzen in ihrem Zellinneren Enzyme Durch Schädigung der Zellmembran können
sie aus der Zelle heraus in den Überstand gelangen
Die Aktivität dieser Enzyme im Überstand wird quantifiziert
Ein Anstieg der Gesamtaktivität lässt auf eine Schädigung schließen
Membranschaden- Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 18
Membranschaden
EAhy926 treated with Carboxyl polysytene particles
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
µg/ml
% of control
EAhy 926 treated for 24h with Neosino
0
10
20
30
40
50
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
ml/ml
% of control
29.05.2010 Workshop NeoSino 19
Erythrozyten enthalten den roten Blutfarbstoff Hämoglobin
Durch Schädigung der Membranen tritt Hämoglobin aus
Ein Anstieg der Färbung im Überstand lässt auf eine Schädigung schließen
Hemolyse - Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 20
Isolieren der Erythrozyten (Blutbank) Behandlung mit Testsubstanz Bestimmung der Hämoglobinkonzentration
im Überstand
Hemolyse
29.05.2010 Workshop NeoSino 21
Hemolyse
Hämolyse mit NeoSino
0
20
40
60
80
100
120
Triton X (1%) Neosino(4µl/ml)
Neosino(2µl/ml)
Neosino(1µl/ml)
Neosino(0,5µl/ml)
Neosino(0,25µl/ml)
Wasser(4µl/ml)
Hemolyse (%)
29.05.2010 Workshop NeoSino 22
T-Lymphozyten gehören zur zellulären Abwehr des erlernten Immunsystem
Sie vermehren sich, wenn sie mit einem als ‚fremd‘ erkannten Signal in Kontakt kommen, um dieses besser bekämpfen zu können
Eine erhöhte Zellzahl weist auf eine Stimulation der zellulären Abwehr hin
Lymphozytenaktivierung - Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 23
Isolieren der Leukozyten (Blutbank) Anreicherung der Lymphozyten Kultivierung mit der Testsubstanz Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)
Lymphozytenaktivierung
Blut
Ficoll
Plasma + Plättchen
Lymphozyten
Granulozyten + Erythrozyten
29.05.2010 Workshop NeoSino 24
Lymphozytenaktivierung
Lymphozytenstimulation mit NeoSino
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
unstimuliert CD3/ 28 stim. CP 26nm NeoSino 2µl NeoSino 1,5µl NeoSino 1µl
Relative Lumineszence Units
29.05.2010 Workshop NeoSino 25
Makrophagen gehören zum angeborenen Immunsystem
Sie wandern auf einen Reiz hin und locken dann andere Immunzellen an, um eine Entzündungsreaktion einzuleiten
Eine vermehrte Wanderung auf die Testsubstanz weist auf eine Stimulation der unspezifischen Immunabwehr hin
Makrophagenaktivierung- Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 26
Zugabe der Zellen im oberen Teil des durch einen Filter getrennten Kulturgefäßes
Zugabe der Testsubstanz in den unteren Teil
Inkubation - Zellen wandern
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung) in der unteren Kammer
Makrophagenaktivierung
29.05.2010 Workshop NeoSino 27
Makrophagenaktivierung
Chemotaxis NeoSino
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
N P 50ng/ml NeoSino 2µl NeoSino 1,5µl NeoSino 1µl
Relative Luminescence Units
29.05.2010 Workshop NeoSino 28
Zellen werden angezüchtet und mit Wasserstoffperoxid geschädigt
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung) in An- und Abwesenheit der Testsubstanz
Anstieg der Zellzahl weist auf schützende Wirkung der Testsubstanz hin
Ox. Stress Schutz - Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 29
NeoSino bei Zellschädigung
EAhy926 treated for 24 h with 100 µM H2O2 and Neosino
0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
µl/ml
% of control
29.05.2010 Workshop NeoSino 30
Zellen werden für 5 Tage in Mangelmedium (2% statt 10% fötales Rinderserum) kultiviert
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung) in An- und Abwesenheit der Testsubstanz
Anstieg der Zellzahl weist auf schützende Wirkung hin
Bessere Zellfunktion - Testprinzip
29.05.2010 Workshop NeoSino 31
NeoSino in Mangelmedium
EAhy (2% FBS, Neosino for 5 days)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
untreated Mito-damage
0,5µl/ml 1µl/ml 2µl/ml
% of control
31.03.2010
11.05.2010
29.05.2010 Workshop NeoSino 32
Neosino zeigt in den etablierten Testverfahren keinen toxischen Effekt
Bei nicht optimalen Wachstumsbedingungen zeigt Neosino einen geringen, aber nachweisbaren, schützenden Effekt
Zusammenfassung
29.05.2010 Workshop NeoSino 33
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