Download - Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Andreas Pfeiffer · Enzym, das zur Bildung der „second messenger“ sn-1,2-Diacylglycerin (DAG) und 1,4,5-myo-Inositoltriphosphat (IP3) aus

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  • Ruhr-Universität Bochum

    Prof. Dr. med. Andreas Pfeiffer

    Dienstort: Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin

    in Berlin-Steglitz

    Deutsches Institut für Ernährungsforschung Bergholz-Rehbrücke

    Herstellung und Etablierung von 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren PKCα-,

    PKCβ1- und PKCδ-Fusionsproteinen

    Inaugural-Dissertation

    zur

    Erlangung eines Doktorgrades der Medizin

    einer

    Hohen Medizinischen Fakultät

    der Ruhr-Universität Bochum

    Vorgelegt von

    Suma Mary Plammootil

    aus Frankfurt am Main

    2003

  • Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

    Referent: Prof. Dr. med. A. Pfeiffer

    Korreferent: Prof. Dr. med. W. Schmidt

    Tag der Mündlichen Prüfung: 29.04.2004

  • Für meine beiden Großväter

    K. T. George und P.C. Varkey

  • 1

    Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung

    1.1. Signalkaskaden 6

    1.2. Die Charakterisierung der Proteinkinase C 7

    1.3. Die Struktur der Proteinkinase C 7

    1.4. Die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)- Signalkaskade 8

    1.5. Die klinische Bedeutung der Proteinkinase C 9

    1.6. Der Östrogenrezeptor 10

    1.7. Der mutierte Östrogenrezeptor 11

    1.8. Ziel der Arbeit 12

    2. Materialien 13

    3. Experimentelle Methoden

    3.1. Bakterienpräparation 15

    3.1.1. Herstellung kompetenter Bakterien 15

    3.1.2. Transformation kompetenter Bakterien 16

    3.2. Plasmid-Präparation 16

    3.2.1. Plasmid-Präparation im analytischen Maßstab 16

    3.2.2. Plasmid-Präparation im großen Maßstab 17

    3.3. Reaktionen zur Subklonierung von DNA-Fragmenten 18

    3.3.1. Restriktion von DNA-Molekülen 18

    3.3.2. Dephosphorylierung von DNA am 5`Ende 18

    3.3.3. Partieller Verdau für die Restriktion der PKCα 19

    3.3.4. Ligation 19

    3.4. DNA-Sequenzierung im Prism Big-Dye Terminator 20

    3.5. Elektrophorese von DNA-Molekülen in Agarosegelen 21

    3.6. HEK293 Zellkultur 21

    3.7. Quantifizierung von HEK293-Zellen mit der Neubauer-

    Zählkammer und Subkultivierung für die Experimente 22

    3.8. Durchführung einer PCR und Reinigung der Reaktionsprodukte 22

  • 2

    3.8.1. Polymerase-Kettenreaktion 22

    3.8.2. Reinigung der PCR-Reaktionsprodukte 24

    3.9. Proteinanalyse 24

    3.9.1. Proteinextraktion aus Zellen der Zellkultur 24

    3.9.2. Proteinbestimmung nach Stoschek 25

    3.9.3. SDS Protein-Gelelektrophorese 25

    3.9.4. Semitrockener Proteintransfer 27

    3.9.5. Immunoblot-Analyse 27

    5.1.1. Quantifizierung der Signalintensitäten von Immunoblot-

    Analysen 28

    3.10. Transfektion und PKC-Aktivitätsbestimmung 29

    3.11. Untersuchung der intrazellulären Signaltransduktion mittels

    des dualen Luciferase-Assays 31

    3.12. Statistische Auswertung 32

    4. Ergebnisse

    4.1. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 33

    4.1.1. Amplifikation der PKC-cDNA-Fragmente 34

    4.1.2. Subklonierung des MER 36

    4.1.3. Durchführung eines partiellen Verdaus für die PKCα 38

    4.1.4. Subklonierung für das pcDNA/PKC-Konstrukt 39

    4.1.5. Fusion der pcDNA/PKC-Konstrukte mit der MER-cDNA und 39

    abschließende Restriktionsüberprüfung

    5.1. Immunoblot-Analysen zum Nachweis der Expression der

    PKC-Fusionsproteine 41

    4.3. Nachweis der Aktivität der PKC-Fusionsproteine in vitro 43

    5.1. Reportergen-Untersuchungen mit dem dualen Luciferase-Assay

    zum Nachweis der Funktionalität der PKC-Fusionsproteine 46

    4.4.1. Untersuchung von Elk1-abhängiger Luciferase-Genexpression

    durch die PKC-Fusionsproteine 46

    4.4.2. Einsatz der MEK-Inhibitoren PD98059 und U0126 50

    5. Diskussion

  • 3

    5.1. Ziel der Arbeit 53

    5.2. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 53

    5.3. Nachweis der Expression der Fusionsproteine 54

    5.4. Bedeutung von PKC-Bindeproteinen

    55

    5.5. Nachweis der Enzymaktivität der Fusionsproteine 55

    5.6. Regulation der PKC durch Phosphorylierung 56

    5.7. Regulation der PKC durch Proteasen 57

    5.8. Untersuchung der Funktionalität der Fusionsproteine 58

    5.9. PKC und der MAPK-Signaltransduktionsweg 59

    5.10. Bedeutung von unterschiedlich hohen Aktivitäten von

    PKC-Isoenzymen 61

    5.11. Weitergehende Untersuchungsmöglichkeiten unter

    Verwendung der etablierten Fusionsproteine 62

    5.12. Klinische Bedeutung der PKC 63

    5.13. Fazit 64

    6. Zusammenfassung 65

    7. Literaturverzeichnis 67

    8. Danksagungen 80

    9. Lebenslauf 81

  • 4

    Abkürzungsverzeichnis

    Abb. Abbildung

    abs. absolut

    Ac Acetat

    AKAP Proteinkinase A Ankerproteine

    APS Ammoniumpersulfat

    ATP Adenosintriphosphat

    bp Basenpaare

    BSA Rinderserumalbumin

    cDNA komplemetäre DNA

    CIAP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

    CMV Cytomegalievirus

    cpm gezählte radioaktive Zerfälle pro Minute

    CTP Cytidintriphosphat

    DMEM Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

    DMSO Dimethylsulfoxid

    DNA Desoxyribonukleinsäure

    dNTP Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

    DTT Dithiothreitol

    EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Natriumsalz

    EGTA Ethylen-Glykol-bis-(β-Amino-Ethyl-Ether)-N-N’-Tetraessigsäure

    ER Östrogenrezeptor

    ERK extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase

    EtOH Ethanol

    FKS fötales Kälberserum

    g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

    GTP Guanosintriphosphat

    h / min / sec Stunde / Minute / Sekunde

    kb Kilobasenpaare

    KDa Kilodalton

    LPS Lipopolysacharide

    MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

    MAPKK MAPK Kinase

  • 5

    MAPKKK MAPK Kinase Kinase

    MEK MAPK/ERK Kinase

    MEKK MEK Kinase

    MER mutierter Östrogenrezeptor

    NaAc Natriumacetat

    nm / ng nanomolar / nanogramm

    NTP Ribonukleotide (ATP, CTP, GTP, UTP)

    4-OHT 4-Hydroxytamoxifen

    PAA Polyacrylamid

    PKC Proteinkinase C

    PKM Ca2+/Phospholipid-unabhängige Form der PKC, die dem

    katalytischen Fragment entspricht

    RACK Rezeptor für akivierte Kinase

    RICK Rezeptor für inaktivierte Kinase

    RNA Ribonukleinsäure

    RT Raumtemperatur

    SDS Natriumdodecylsulfat

    STICK PKC Substrate, die mit der PKC interagieren

    TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

    TAM 4-Hydroxy-Tamoxifen

    TCA Trichloressigsäure

    TE Tris-EDTA

    TEMED N,N,N’,N’Tetramethylethylendiamin

    TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat

    Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

    U Enzymeinheit

    ü.N. über Nacht

    UTP Uridintriphosphat

    vs. versus

    % (v/v) Volumenprozent

    % (w/v) Gewichtsprozent

    Zahl´ Anzahl in Minuten

    Zahl´´ Anzahl in Sekunden

  • 6

    1. Einleitung

    1.1. Signalkaskaden

    Endokrine Erkrankungen hängen oft von veränderten Hormonspiegeln, oxidativen

    und metabolischen Vorgängen sowie Veränderungen in der Lipidzusammensetzung

    ab, die sich meist in Differenzierungs- und Wachstumsvorgängen sowie in der

    Aktivität von Ionenkanälen zeigen (Huang, 1989). Extrazelluläre Signale werden

    nach Aktivierung eines Rezeptors über unterschiedliche Signalkaskaden, meist über

    sogenannte „second messenger“, zum Zytoplasma oder Zellkern weitergeleitet (Hug

    und Sarre, 1993). Hydrophobe Liganden können dabei durch die Zellmembran

    diffundieren und nach Bindung an einen intrazellulären Rezeptor direkt die

    Transkription aktivieren. Hydrophile Liganden aktivieren meist zelluläre

    Oberflächenrezeptoren, die dann ihrerseits entweder direkt oder über sogenannte

    „Transducer“ (z.B. G-Proteine) einen Effektor stimulieren. Dieser kann dann über

    Verteilungsveränderungen von „second messengern“ Zielproteine aktivieren, die als

    solches oder über weitere Zielproteine die Genexpression auf der Ebene der

    Transkription oder Translation verändern können (Hug und Sarre, 1993). Ein

    wichtiger Signaltransduktionsweg läuft über den 7fach Transmembranrezeptortyp, an

    den nach Bindung eines Liganden ein trimeres G-Protein des Subtyps q koppelt und

    so die Phospholipase C-β aktiviert. Diese ist ein Phosphoinositid-spezifisches

    Enzym, das zur Bildung der „second messenger“ sn-1,2-Diacylglycerin (DAG) und

    1,4,5-myo-Inositoltriphosphat (IP3) aus zellulärem Phosphatidylinositol-4,5-

    bisphosphat führt. Des weiteren kann DAG auch aus zellulärem Phosphatidylcholin

    ohne IP3-Entstehung nach Aktivierung einer Phospholipase D und einer Phosphatase

    entstehen (Huang, 1989). Durch IP3 wird Ca2+ aus dem endoplasmatischen

    Retikulum freigesetzt und DAG führt zu Veränderungen der Genexpression im

    Nukleus. In vielen Fällen ist die Proteinkinase C (PKC) das erste Zielprotein, das von

    den „second messengern“ aktiviert wird und spielt deshalb eine zentrale Rolle bei der

    Signalübertragung. Durch die Tatsache, dass sie ein direktes Rezeptor-Protein von

    Phorbolestern darstellt, die bekannt dafür sind, dass sie eine Rolle bei der Förderung

    der Proliferation und Differenzierung von onkogen transformierten Zellen in vivo

    und in vitro spielt, wurde sie auch als ein Schlüsselenzym in der Signaltransduktion

    bezeichnet (Niedel et al., 1983).

  • 7

    1.2. Charakterisierung der Proteinkinase C

    Entdeckt wurde die PKC von Nishizuka als eine Histon-Proteinkinase aus

    Rattenhirn, die durch limitierte Proteolyse (Inuoe et al., 1977), Ca2+ und (Phospho-)

    Lipide (Takai et al., 1979) oder Phorbolester und Phospholipide (Castagna et al.,

    1982) aktiviert werden konnte. Zu den Lipiden zählen DAG (physiologisch), aber

    auch freie cis-ungesättige Fettsäuren, Lipoxan A oder Arachidonsäure (Hug and

    Sarre, 1993). Weitere Untersuchungen zeigten, dass es sich bei der PKC um eine

    Serin/Threonin-Kinase handelt, die zur Phosphorylierung von Zytoskelett- und

    Kanalproteinen (Huang, 1989) und von Proteinen der Signaltransduktion (Kolch et

    al., 1993) führt.

    Die PKC umfasst eine Familie von 11 Mitgliedern, die in die drei Untergruppen der

    klassischen, neuen und atypischen PKC-Isoenzyme eingeteilt werden können. Die

    klassischen PKCs (cPKCs) α, βI, βII und γ benötigen für ihre Aktivierung negativ

    geladene Phospholipide, DAG oder Phorbolester und Ca2+, die neuen PKCs (nPKCs)

    δ, ε, θ, η/L (Maus/Mensch) und µ negativ geladene Phospholipide, DAG oder

    Phorbolester, aber kein Ca2+ und die atypischen PKCs (aPKCs) λ/t (Maus/Mensch)

    und ζ sind nur noch abhängig von negativ geladenen Phospholipiden (Hug und Sarre,

    1993).

    1.3. Struktur der Proteinkinase C

    Vergleicht man nun die Aminosäure-Sequenzen der verschiedenen PKC-Isoenzyme

    so fällt auf, dass bestimmt Sequenzen weitgehend konserviert sind, was auf eine

    funktionsgebende Rolle hindeutet. So findet man in allen PKCs fünf variable

    Regionen (V1-V5), die sich mit vier konstanten Regionen (C1-C4) abwechseln (Hug

    and Sarre, 1993). Die C-terminale Region C3-V5 wird in allen PKCs als katalytische

    Domäne bezeichnet, die durch die V3-Region („Hinge“-Region) von der

    N-terminalen Regulationsdomäne getrennt wird. Zu Beginn der C1-Region befindet

    sich die Konsensussequenz xRxxS/TsRs, die man auch in vielen

    Phosphorylierungssubstraten der PKCs finden kann. Allerdings ist in der

    Aminosäuresequenz der PKC-Isoenzyme das Serin oder Threonin durch ein Alanin

    ersetzt, das nicht phosphoryliert werden kann, so dass eine Pseudosubstratsequenz

    (fehlt bei PKC µ) entsteht, die vermutlich autoregulatorische Fähigkeiten durch

  • 8

    Blockade der Substratbinderegion besitzt (Hug and Sarre, 1993).

    Pseudosubstratpeptide können daher als effektive Inhibitoren der PKC-Isoenzyme

    sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt werden (Eicholtz et al.,1990). Die

    C1-Domäne, die als Phorbolester- und DAG-Binderegion bezeichnet wird, enthält

    eine Cystein-reiche Region mit zwei Zinkfinger-Domänen (in den cPKCs und

    nPKCs), die einem DNA-Bindemotiv entsprechen, dass man auch in

    Transkriptionsfaktoren wie GAL4 (Pan und Coleman, 1990) wiederfindet. Die

    aPKCs enthalten nur eine Zinkfingerdomäne, was zu einer fehlenden Aktivierbarkeit

    durch DAG führt. Die C2-Region, eine Ca2+-Bindedomäne, findet sich nur bei den

    cPKCs und fehlt bei den nPKCs und den aPKCs, was sie in ihrer Aktivierung

    unabhängig von Ca2+ macht. Die V3- oder „Hinge“-Region trennt die regulatorische

    von der katalytischen Domäne und ist zuständig für die proteolytische Spaltung

    durch Trypsin oder die Ca2+-abhängigen neutralen Proteasen Calpain I und II, die zu

    konstitutiv aktiven Kinasen führen (Kishimoto et al., 1989). Die C3-Region in der

    katalytischen Domäne beinhaltet das ATP-Bindemotiv xGxG2Gx16Kx, das bei allen

    PKCs erhalten ist, außer bei der PKC ζ, bei der ein Glycin durch ein Alanin ersetzt

    ist. Die C4-Region besteht aus der Substrat-Bindestelle und der

    Phosphat-Transferregion. Letztere ist bei allen PKCs gut konserviert und enthält die

    Sequenz DFG (außer bei der PKC ζ, bei der das Phenylalanin durch ein Tyrosin

    ersetzt ist). Der Asparagin-Rest wird für den Transfer der Phosphatgruppen auf das

    Substrat postuliert. Bei allen PKCs wird die ATP-Binderegion von der

    Phosphat-Transferregion durch einen konservierten Abstand an Aminosäuren

    getrennt (Hug and Sarre, 1993).

    1.4. Die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)- Signalkaskade

    Die einzelnen PKC-Isoenzyme zeigen eine unterschiedliche Verteilung im Gewebe;

    sie reagieren auf die vielen Lipidmetaboliten jeweils anders, interagieren mit

    unterschiedlichen Proteinen und phosphorylieren verschiedene Substrate. Mitogen-

    aktivierte Proteinkinase (MAPK)- oder extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase

    (ERK)-Kaskaden finden sich in allen Eukaryonten und spielen eine Rolle bei fast

    allen Signaltransduktionswegen, die von Rezeptoren an der Zellmembran ausgehen

    (Wilsbacher et al., 1999). Der MAPK Weg wird durch eine Vielzahl von Faktoren

    aktiviert. Dazu zählen unter anderem Wachstumsfaktoren, Zytokine,

  • 9

    Hitzeschockproteine, UV-Licht, Mitogene, Hyperosmolarität, LPS, Phorbolester,

    Entzündungsmediatoren und Oxidantien (Denhardt, 1996; Wilsbacher et al., 1999;

    Poynter et al., 1999). Diese führen durch Aktivierung zu einer gesteigerten

    Transkription von Genen, die ihrerseits zu einer Phosphorylierung von nukleären und

    zytoplasmatischen Proteinen führen. Hieraus resultieren verschiedene Effekte, die

    wichtig sind für das (Über-) Leben der Zelle wie Proliferation, Differenzierung,

    metabolische Regulationen, Wachstumshemmung, Vesikeltransport, Stress-

    reaktionen, Mitose, Transformation, Apoptose und Entzündungsreaktionen

    (Denhardt, 1996; Poynter et al., 1999). Zu der Superfamilie der MAPK-Kaskaden

    gehört die extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase (ERK) (Gutkind, 2000). Die

    klassische MAPK-Kaskade besteht aus einer Kinasen-Kaskade mit MAPK Kinase

    Kinase (MAPKKK), MAPK Kinase (MAPKK) und MAPK (Vojtek und Cooper,

    1995). Der ERK Weg wird über das GTP-Bindeprotein Ras aktiviert, das wiederum

    die MAPKKK Raf aktiviert. Diese aktiviert die MAPKK MEK (MAPK/ERK

    Kinase), die ihrerseits zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der MAPK ERK

    führt. Diese transloziert in den Nukleus und transaktiviert Transkriptionsfaktoren, die

    durch veränderte Genexpression zu den obengenannten Veränderungen führen

    können (Tibbles and Woodgett, 1999). Die Rolle der PKC in Bezug auf den

    MAPK-Weg liegt in ihrer Rolle als direkter Aktivator der Kaskade auf Ebene der

    MAPKKK Raf und MEKK (Denhardt, 1996; Ijima et al., 2002).

    1.5. Die klinische Bedeutung der Proteinkinase C

    Im Verlauf der letzten Jahre wird auch die Rolle der PKC bei diabetischen

    Folgeerkrankungen diskutiert. Am Modell von Mäusen wurde gezeigt, dass eine

    Überexpression der PKCβ im Herzmuskel zu Herzinsuffizienz und Nekrose der

    Zellen führt (Way, 2002). Auch die Aktivierung von PKCβ im Endothel diabetischer

    Rattennieren wird postuliert, da sich durch Hemmung der PKCβ mit dem Hemmstoff

    LY333531 die verschlechterte Filtrationsleistung der diabetischen Niere besserte

    (Ishii et al., 1998). Der Einfluss der PKC bei der Retinopathie wird diskutiert, da die

    Durchblutung im Auge auch PKCβ abhängig beeinflusst werden soll (Bursell, 1997;

    Suzuma, 2002). Die genauere Funktion der einzelnen PKC-Isoenzme, ebenso die

    Frage, welche Isoenzyme welchen Signalweg in der Zelle beeinflussen und so im

    Zusammenhang mit den diabetischen Folgeveränderungen stehen, konnte bisher nur

  • 10

    teilweise geklärt werden. So ist beschrieben worden, dass die PKCα eine Rolle bei

    Zell-zu-Zell-Kontakten und in der Suppression von Apoptose spielt, sowie zu einem

    mehr oder weniger aggressiven Tumorphenotyp führte (Hofman, 1997). Eine

    gesteigerte Expression der PKCβ1 zeigte eine Hemmung der Proliferation von

    HT29-Koloncarcinomzellen und suppremierte die Tumorbildung (Goldstein et al.,

    1995; Choi et al., 1990). Außerdem bewirkte die PKCβ1 den Verlust der

    Bindungsabhängigkeit, steigert das Wachstum bezogen auf die Dichte und führt zu

    einer Tumorformation von R6-Rattenfibroblasten in Nacktmäusen (Borner et al.,

    1995). Auch eine Blockierung der Differenzierung und eine Verminderung der

    Proliferation sind beschrieben (Sauma et al., 1996; Khuri et al., 1996). Die PKCδ

    hingegen führt zu einer Verzögerung in der Entwicklung von präneoplastischen

    Onkogenen (La Porta et al., 1995) und spielt im Zusammenhang mit Proteasen eine

    Rolle bei der Induktion der Apoptose (Anantharam et al., 2003).

    Zur weiteren Charakterisierung der zellulären Funktionen der PKC-Isoenzyme

    wurden für diese Arbeit drei 4-OHT-induzierbare PKC-Fusionsproteine hergestellt,

    die es ermöglichen sollen, jedes Isoenzym gezielt anschalten zu können, um so

    Isoenzym-spezifische Wirkungen zu messen. Dafür wurden die cDNAs der

    katalytischen Domäne der PKCα, PKCβ1 und der PKCδ mit der des mutierten

    Östrogenrezeptors (MER) fusioniert.

    1.6. Der Östrogenrezeptor

    Der Östrogenrezeptor (ER) gehört zur Superfamilie der Steroidhormon-Rezeptoren.

    Diese stellen intrazelluläre Transkriptionsfaktoren dar, die in einer inaktiven

    Apoproteinform entweder im Zytoplasma oder im Nukleus vorhanden sind. Nach

    Bindung an den jeweils zugehörigen Hormonliganden wird der Rezeptor aktiviert

    und kann an ein DNA-Element (Hormone response element) binden und die

    Transkription von cis-verbundenen Genen steuern. Steroidhormone können auch die

    Genexpression durch Einflussnahme auf die mRNA-Stabilität und die

    Translationseffizienz regulieren. Ein Steroidhormonrezeptor besteht aus 6

    funktionalen Domänen. N-terminal liegt die variable A/B-Domäne, die für die

    Transaktivierung und die Spezifität der Rezeptor-Isoformen, die das gleiche

    Antwortelement erkennen, zuständig ist. Die C-Domäne enthält 2 Typ II Zinkfinger,

    die für die DNA-Erkennung und Dimerisierung zuständig sind. Als nächstes folgt die

  • 11

    variable D-Domäne, die für Konformationsänderungen ausschlaggebend ist und

    häufig die Signalsequenzen zur nukleären Lokalisation und eine Transaktivierungs-

    Domäne enthält. Auf die D-Domäne folgt die E-Domäne oder auch

    Hormonbindedomäne genannt, die aus einem funktionellen Komplex besteht. Sie

    enthält meist wichtige Regionen für die Assoziation mit Hitzeschockproteinen,

    Dimerisierung, nukleäre Lokalisation, Transaktivierung, „intermolecular silencing“,

    „intermolecular repression“ und die Ligandenbindung. Abschließend folgt die F-

    Domäne, der noch keine spezifischen Funktionen zugeordnet werden konnten (Tsai

    and O’Malley, 1994).

    Bisher konnten verschiedene Transkriptionsfaktoren und auch die Kinasen c-Abl und

    Raf1 mit der Hormonbindedomäne des Östrogenrezeptors (ER) fusioniert werden.

    Nach Ligandenbindung wird der inaktive Rezeptor, der u.a. einen Komplex mit

    Hitzeschockproteinen bildet freigesetzt und kann zu Transaktivierung der

    Fusionsproteine führen (Littlewood et al., 1995). Allerdings besitzt der ER eine

    eigene Liganden-abhängige Transaktivierungsaktivität, das die gesamte

    Transkriptionsaktivität eines ER-Fusionsproteins beeinflussen kann. Weiterhin

    werden in den meisten in vitro Experimenten Zellmedien verwenden, die Phenolrot

    enthalten, einen schwachen Agonisten des ER.

    1.7. Der mutierte Östrogenrezeptor

    Um diese Problematik zu umgehen haben Littlewood et al. (1995) einen mutierten

    Östrogenrezeptor (MER) hergestellt. Für die Konstruktion des MER haben sie das c-

    terminalen Ende des humanen c-Myc-Proteins mit der Hormonbindedomäne des

    mutierten Östrogenrezeptors, bei dem an der Position 525 durch eine Punktmutation

    die Aminosäure Glycin durch ein Arginin ersetzt wird, fusioniert. Der so

    entstandenen 4-Hydroxytamoxifen-abhängige MER hat gegenüber dem Wildtyp ER

    verschiedene Vorteile. Zum einen bindet er spezifisch 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)

    im nanomolaren Bereich und ist für 17β-Östradiol um den Faktor 1000 insensitiver

    (Littlewood et al., 1995). Östrogen in physiologischen Mengen aktiviert den MER

    daher nicht. Desweiteren führt 4-OHT nicht zu einer Stimulation der

    Transaktivierungsakivität im MER (Danielian et al., 1993). Außerdem können für

    Zellkultur-Experimente normale Zellkulturmedien mit Kälberserum genutzt werden,

    ohne mit einer Aktivierung des MER zu rechnen. Die 4-OHT-Bindung kann über

  • 12

    Konformationsveränderungen zur Aktivierung des entsprechenden PKC-Isoenzyms

    führen. Auf diese Weise spezifisch aktiviert, können zelluläre Effekte der PKC

    gemessen werden.

    1.8. Ziel der Arbeit

    Die Etablierung der 4-OHT-induzierbare PKC-Fusionsproteine, die eine Induktion

    der PKC-Aktivität eines bereits exprimierten Enzyms erlauben, wird in dieser Arbeit

    durch den Nachweis der Expression, die Messung der Enzymaktivität und die

    Überprüfung der Funktionalität der Konstrukte dargestellt.

  • 13

    2. Materialien

    Herkunft verwendeter Chemikalien:

    Arcrylamid Merck, Darmstadt

    Agarose Invitrogen, Karlsruhe

    Ammoniumperoxidsulfat Sigma, Taufkirchen

    Ampicillin Sigma, Taufkirchen

    Aprotinin Roche, Mannheim

    Bactoagar Invitrogen, Karlsruhe

    BCIP Sigma, Taufkirchen

    Bisacrylamid Sigma, Taufkirchen

    Bromphenolblau Merck, Darmstadt

    Caseinhydrolysat (Pepton Nr. 140) Invitrogen, Karlsruhe

    Coomassie Brilliant Blue G-250 Serva, Heidelberg

    Desoxynukleotide Roche, Mannheim

    Didesoxynukleotide Pharmacia, Freiburg

    DMSO Merck, Darmstadt

    DTT Sigma, Taufkirchen

    Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen

    GF109203X Calbiochem, Bad Soden

    Glutamin Sigma, Taufkirchen

    Glycin Merck, Darmstadt

    Hefe-Extrakt Invitrogen, Karlsruhe

    8-Hydrochinolin Serva, Heidelberg

    Leupeptin Roche, Mannheim

    2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

    Microcystin Calbiochem, Bad Soden

    Nonidet-P-40 Sigma, Taufkirchen

    PD 98059 Calbiochem, Bad Soden

    Protein-Molekulargewichtstandard,

    vorgefärbt Sigma, Taufkirchen

    PVDF-Membran Millipore, Eschborn

    Radioaktiv markierte Nukleotide NEN, Dreieich

  • 14

    Ribonukleotide Roche, Mannheim

    Rinderserumalbumin, Fraktion V Sigma, Taufkirchen

    Saccharose Merck, Darmstadt

    TEMED Sigma, Taufkirchen

    TPA Calbiochem, Bad Soden

    U0126 Calbiochem, Bad Soden

    Xylencyanol Merck, Darmstadt

    Zellkulturmedien Invitrogen, Karlsruhe

    Nicht gesondert aufgeführte Chemikalien stammten von der Firma Merck oder

    Sigma, andernfalls ist die Firma im Text erwähnt.

    Enzyme, Nukleinsäuren und Antikörper:

    Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

    (EC 3.1.3.1) Roche, Mannheim

    PKCα-Antikörper Roche, Mannheim

    PKCβ1-Antikörper Santa Cruz, USA

    PKCδ-Antikörper Calbiochem, Bad Soden

    DNA-Molekulargewichtsstandards Roche, Mannheim

    Invitrogen, Karlsruhe

    Lysozym (EC 3.2.1.17) Roche, Mannheim

    Plasmid (pcDNA3.1HisB) Invitrogen, Karlsruhe

    Restriktionsendonukleasen Roche, Mannheim

    Pfu Turbo DNA Polymerase Stratagene, USA

    T4-DNA-Ligase (EC 6.5.1.1) Roche, Mannheim

    PathDetect Luciferase-Reportergensystem Stratagene, USA

    PCR-Product Purification Kit Roche, Mannheim

    Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega, Mannheim

  • 15

    3. Experimentelle Methoden

    3.1. Bakterienpräparation

    Zur Transformation von Plasmid-DNA und ihrer Vermehrung wurde der

    Bakterienstamm DH5α (Hanahan, 1983) verwendet, ein Derivat des Stammes E. coli

    K12.

    3.1.1. Herstellung kompetenter Bakterien mit der CaCl2-Methode

    Zu Beginn der Herstellung kompetenter Bakterien (Sambrook, et al., 1989) wurden die

    Gefäße gründlich gespült, um mögliche Detergenzienrückstände restlos zu entfernen.

    Sämtliche Schritte erfolgten unter sterilen Bedingungen mit autoklaviertem Material.

    Ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium wurde mit Bakterien beimpft, die zuvor bei

    –70 °C in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glycerin aufbewahrt worden waren. Bei 37 °C

    wuchsen die Bakterien ü.N. und dienten dem Animpfen von 500 ml LB-Medium. Nach

    Erreichen einer optischen Dichte von 0,3 bis 0,5 bei 600 nm erfolgte eine weitere

    Aufarbeitung der Bakteriensuspension auf Eis.

    Nach Zentrifugation (4500·g, 10´) wurde das Bakteriensediment in der Hälfte des

    Ausgangsvolumens (250 ml) der Bakteriensuspension einer kalten 100 mM CaCl2–

    Lösung resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (4500·g, 10´) wurden die Bakterien

    in 1/40 des Ausgangsvolumens einer 100 mM CaCl2–Lösung resuspendiert, 1 h auf Eis

    gestellt und anschließend bis zu einer Endkonzentration von 15 % (v/v) mit Glycerin

    versetzt. Aliquots von 200 µl wurden auf flüssigem Stickstoff schockgefroren und

    konnte so bis zu mehreren Monaten bei –70 °C gelagert werden. Die so hergestellten

    kompetenten Bakterien waren ausreichend für die Transformation von Plasmid-DNA

    einer Ligation mit stumpfen und versetzten DNA-Enden.

    LB-Medium

    10 g/l Casein Hydrosylat mit NaOH pH 7 einstellen,

    5 g/l Hefe-Extrakt 20´ autoklavieren

    10 g/l NaCl

  • 16

    3.1.2. Transformation kompetenter Bakterien

    Zur Transformation (Sambrook et al.,1989) wurden 200 µl auf Eis aufgetaute Bakterien

    mit der Hälfte eines Ligationsansatzes 30´ auf Eis und danach 90´´ bei 42 °C inkubiert.

    Es wurden 500 µl steriles LB-Medium hinzugegeben und die Bakterien wuchsen dann

    bei 37 °C 15´ lang, um den Beginn der β-Laktamase-Produktion der Bakterien mit

    aufgenommenem Resistenzplasmid zu sichern. Zum Schluss wurden 200 – 300 µl

    dieser Bakterienlösung auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert. Entsprechend der

    Resistenz der Bakterien enthielten die Platten Ampicillin und wurden bei 37° ü.N.

    gelagert, bis Kolonien einzelner Bakterien entstanden sind.

    3.2. Plasmid-Präparation

    3.2.1. Plasmid-Präparation im analytischen Maßstab

    Diese Methode diente zur Anreicherung von Plasmid-DNA für die Überprüfung eines

    Subklons mittels einer Restriktion oder für eine Sequenzierungsreaktion und wurde

    nach Birnboim und Doly durchgeführt (Birnboim und Doly 1979).

    Mit einer Bakterienkolonie einer entsprechend selektiven LB-Ampicillin-Platte wurde 5

    ml steriles LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin angeimpft und bei 37 °C und 180 rpm

    mindestens 12 h im Warmluftschüttler inkubiert. 3 ml dieser Vorkultur wurden

    sedimentiert (10000·g, 1´, RT), in 100 µl Lösung I sofort resuspendiert und in 200 µl

    frisch angesetzter Lösung II vorsichtig homogenisiert, bis durch die vollständige

    Bakterienlyse eine klare Lösung entstand. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde

    das Gemisch kräftig geschüttelt und kam für 5´ auf Eis, so dass sich Kalium- und SDS-

    Aggregationen bildeten, die den Großteil der bakteriellen Proteine und chromosomalen

    DNA enthielt. Danach wurde zentrifugiert (12000·g, 8´, RT) und man erhielt einen

    wässrigen Überstand, der mit Phenol-CHCl3 extrahiert, mit Ethanol abs. in 2,5-facher

    Menge vermischt und 5´ bei RT gefällt wurde. Nach Zentrifugation (12000·g, 15´, RT)

    und Waschen des Sediments in 75 % Ethanol wurde das Ethanol nach abschließender

    Zentrifugation komplett verworfen, das Sediment 5´ an der Luft getrocknet und in 20 µl

    H2O aufgenommen. Es wurde ca. 4 µg Plasmid-DNA gewonnen.

  • 17

    Lösung I Lösung II Lösung III

    50 mM Glucose 0,2 N NaOH 3 M KAc, pH 5,5

    25 mM Tris-HCL, pH 7,9 1 % SDS

    10 mM EDTA

    3.2.2. Plasmid-Präparation im großen Maßstab

    Diese Methode diente der Subklonierung von DNA-Fragmenten, Transkriptionen in

    vitro und Sequenzierungsreaktionen.

    Hierzu wurde 500 ml steriles LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 ml der

    gewünschten Bakterienkultur (Herstellung s. 3.1.1.) versetzt und ü.N. bei 37 °C im

    Warmluftschüttler inkubiert. Analog zu 3.1.1 erfolgte eine Aufarbeitung der Bakterien.

    Es wurde 10´ mit 10 ml Lösung I, 15´ mit 20 ml Lösung II und 15´ mit 40 ml Lösung III

    inkubiert. Danach wurde 1 h bei –20 °C mit dem 0,6fachen Volumen der wässerigen

    Phase mit 2-Propanol abs. gefällt. Nach anschließender Zentrifugation (10000·g, 20´,

    4 °C) wurde das Sediment in 8 ml TE mit 2g festem NH4Ac gelöst. Es folgte eine

    Inkubation von 20´ auf Eis, währenddessen ein Großteil der RNA und Proteine

    ausfallen und danach abzentrifugiert (16300·g, 15´, 4 °C) werden konnten. Der

    Überstand wurde mit dem 2,5-fachem Volumen Ethanol abs. versetzt und nach

    Lagerung ü.N. bei –20 °C abzentrifugiert (12000·g, 15´, 4 °C). Das Sediment wurde mit

    500 µl 70 %igem Ethanol versetzt und nach Zentrifugation getrocknet. Nach einer

    CsCl2-Dichtegradientenzentrifugation ü.N. bei 100000·g bei 20 °C wurde die untere

    Bande abgenommen und der Schritt wiederholt. Danach folgte eine Dialyse gegen

    1x TE für 1 h. Zu 1/10 des TE-Volumens wurde 3M NaAc (pH: 5,2) und die 2,5-fache

    Menge an Ethanol abs. hinzugegeben und ü.N. bei –20 °C gelagert. Nach Zentrifugation

    (10000 rpm, 15´, 4 °C) wurde das Sediment mit 2 ml 70 % Ethanol versetzt, erneut

    zentrifugiert, für 15´ getrocknet in 300 µl H2O aufgenommen und enthielt ca. 1000 µg

    Plasmid-DNA.

  • 18

    3.3. Reaktionen zur Subklonierung von DNA-Fragmenten

    3.3.1. Restriktion von DNA-Molekülen

    Entsprechend der Angaben des jeweiligen Enzym-Herstellers wurden die Bedingungen

    zur Plasmid-DNA-Restriktion gewählt. Dabei wurde darauf geachtet, die

    Glycerinkonzentration im Restriktionsansatz nie höher als 10 % (v/v) und das

    Ansatzvolumen nicht größer als 70 µl zu wählen. Die Inkubationszeit betrug in der

    Regel 1 h bei 37 °C.

    Die Analyse der restringierten DNA erfolgte entweder auf einem Agarosegel oder mit

    der Phenol-CHCl3-Extraktion, um weitere Modifikationen der DNA vornehmen zu

    können.

    3.3.2. Dephosphorylierung von DNA am 5`Ende

    Um nach einer Transfektion die Anzahl der Hintergrundkolonien durch Bakterien, die

    nicht den gewünschten Vektor aufgenommen haben, zu reduzieren, wurde der

    Restriktionsansatz mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIAP) behandelt

    und so eine Religation drastisch vermindert. Die Ligation von DNA-Fragmenten mit

    und ohne endständige Phosphatgruppen war jedoch weiterhin möglich. Die verwendete

    Fragmentlänge musste nur größer als 150 bp sein. Die Dephosphorylierungsreaktion

    wurde im mit Phosphatasepuffer aufgefüllten Restriktionsansatz oder mit in direkt in

    Phosphatasepuffer aufgenommener DNA, die mit Phenol-CHCl3 extrahiert und gefällt

    worden war, 1 h bei 37 °C durchgeführt. Abgeschlossen wurde die Reaktion durch

    Auftrennung der Plasmid-DNA und Wiedergewinnung aus einem Agarosegel oder

    durch dreimaliges Extrahieren mit Phenol- CHCl3.

    Phosphatase-Puffer

    50 mM Tris-HCl, pH 9,0

    0,1 mM EDTA

  • 19

    3.3.3. Partieller Verdau für die Restriktion der PKCα

    Da die PKCα für das Restriktionsenzym BamHI zwei Schnittstellen vorwies, mußte bei

    der Restriktion ein partieller Verdau angewendet werden. Dafür wurde mit einem

    BamHI-Gemisch gearbeitet. Die restringierten Proben wurden auf einem Agarosegel

    auf ihre Länge hin überprüft. Da das benötigte Fragment eine Länge von 1409 bp

    vorwies, wurde die längere der beiden Banden des 0,8 µl-BamHI-Gemisches aus dem

    Agarosegel hinausgeschnitten und analog zu 3.8.2 mit Hilfe eines Reagenziensatzes zur

    DNA-Reinigung aufbereitet.

    Ansatz für den partiellen Verdau

    4,9 µl PCR-PKCα

    1,0 µl Puffer B

    3,3 µl H2O

    0,8 µl Asp718I

    + jeweils 0,8 µl/ 1,8 µl/ 2,8 µl/ 3,8 µl BamHI-Gemisch

    ad 15 µl H2O -Puffer-Gemisch

    BamHI-Gemisch H2O-Puffer B-Gemisch

    1,5 µl BamHI (10 U/µl) 2 µl Puffer B

    1,5 µl Puffer B 18 µl H2O

    12 µl H2O

    3.3.4. Ligation

    Zur Ligation mit der T4 DNA-Ligase wurden 100 ng Vektor-DNA mit stumpfen oder

    5’-überhängenden Enden in einem molaren Verhältnis von Vektor- zu Fragment-DNA

    von ca. 1:2 oder 1:1 eingesetzt (Winnacker, 1985). Bei Restriktion mit zwei

    verschiedenen Enzymen wurde das Verhältnis 1:2 gewählt, bei Einsatz des gleichen

    Enzyms oder Fragmenten mit stumpfen Enden das Verhältnis 1:1. Die Ligation erfolgte

    im 20 µl-Ansatz ü.N. bei 16 °C.

  • 20

    Ligationsansatz Ligationspuffer (10x)

    ~ 1:2/1:1 Vektor- :Fragment-DNA 660 mM Tris-HCl, pH 7,4

    2 µl Ligationspuffer (10x) 50 mM MgCl2

    1 µl T4 DNA-Ligase 100 mM DTT

    ad 20 µl H2O 10 mM ATP

    Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde direkt zur Transformation eingesetzt und der

    übrige Ansatz bei –20 °C gelagert.

    3.4. DNA-Sequenzierung im Prism Big-Dye Terminator

    Für die DNA-Sequenzierungsreaktion wurden 8 µl Sequenzierungs-Mix mit 0,5 – 1 µg

    zu analysierender DNA und 3,2 pmol des entsprechenden Oligonukleotides (Invitrogen,

    Karlsruhe) versetzt und ad 20 µl mit A. bidest aufgefüllt. Es folgten 25 Zyklen einer

    Inkubationsreaktion von 10´´ bei 96 °C, 5´´ bei 50 °C und 4´ bei 40 °C. Anschließend

    wurden dem Gemisch 30 µl H2O, 5 µl 3 M NaAc (pH 5,2) und 125 µl EtOH abs.

    hinzugefügt und es wurde bei RT für 15´ geschüttelt. Danach erfolgte eine

    Zentrifugation mit 14000 rpm für 20´ bei RT. Der entstandene Überstand wurde

    verworfen und das Sediment mit 250 µl 70 % EtOH gewaschen und 10´ bei 14000 rpm

    bei RT zentrifugiert. Das Ethanol wurde verworfen und bis auf den letzten Tropfen

    abgenommen und das Sediment für ca. 15´´ getrocknet, um es danach bei -20 °C zu

    lagern.

    Für die Sequenzanalyse wurde das Sediment in 20 µl Template Supression Reagenz

    durch vortexen gut gelöst und anschließend bei 90 °C für 2´ inkubiert. Danach wurde

    die Probe auf Eis abgekühlt, erneut gevortext, anzentrifugiert und bis zur Analyse auf

    Eis gelagert. Für die Analyse wurden die Proben in 0,5 µl Sequenzierungs-

    Eppendorfhütchen überführt, mit Septum verschlossen und in das Probentablett des

    Sequenzierautomaten eingeordnet.

  • 21

    Verwendete Oligonukleotide:

    1. ubeta266 5’ TGC CAC CAG AAG GAA GTG AG 3’

    2. ubeta683 5’ TGT ATC ACA TCC AGC AAG TC 3’

    3. ubeta1066 5’ AAC GTA GCC TAT CCC AAG TC 3’

    4. lbeta771 5’ GGT AAA TGA TGC CCT TAC TC 3’

    5. lbeta1145 5’ TTC AGG TCC ACA ACC CAG AC 3’

    6. lMER1212 5’ CCA TCA TTG AGG CTT CAC TG 3’

    3.5. Elektrophorese von DNA-Molekülen in Agarosegelen

    Um ein DNA-Fragment zu gewinnen, die Fragmentlänge zu bestimmen oder zur

    Überprüfung eines Restriktionsansatzes, wurde die DNA auf horizontalen Agarosegelen

    aufgetrennt. Abhängig von der Länge des zu untersuchenden Fragmentes wurden 0,8 bis

    2 % (w/v) Gele mit TAE (1x) als Laufpuffer gegossen und an eine Feldstärke von ca.

    6 V/cm angeschlossen. Der Elektrophoresepuffer bestand aus TAE (1x) und 0,5 µg

    Ethidiumbromid pro ml, damit die DNA-Banden unter UV-Licht sichtbar waren. Zur

    Erhöhung der Lösungsdichte beim Auftragen in die Geltaschen wurden die DNA-

    Proben mit DNA-Probenpuffer (1x) vermischt.

    TAE-Puffer (50x) DNA-Probenpuffer (6x)

    2 M Tris-Base 30 % (v/v) Glycerin

    2 M Eisessig 0,25 % (w/v) Bromphenolblau

    20 mM EDTA 0,25 % (w/v) Xylen-Cyanol

    3.6. HEK293 Zellkultur

    HEK293-Zellen dienten in dieser Arbeit zur Gewinnung von RNA und Proteinen.

    HEK293-Zellen sind humane embryonale Nierenzellen. Sie lassen sich gut kultivieren,

    zeigen ein schnelles und gleichmäßiges Wachstum und haben eine Transfektionsrate

    von ca. 50 %.

    Die Zellen wuchsen als Zellrasen in einer Zellkulturflasche bei 37 °C in einem

    Wärmeschrank mit einer wassergesättigten Atmosphäre und 5 % (v/v) CO2 heran. Das

  • 22

    Medium bestand aus einer Mischung aus Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

    (DMEM) und 10 % (v/v) fötalem Kälberserum, sowie Ampicillin und Streptomycin.

    Bei 90prozentiger Konfluenz wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen in eine neue

    Zellkulturflasche gesetzt. Dazu wurde das Medium verworfen und die Zellen mit

    PBS (1x) mit 1 mM EDTA inkubiert bis sich die Zellen vom Boden ablösten. Die

    Zellen wurden in wenigen ml Medium aufgenommen und einige Tropfen wurden in

    eine neue Flasche mit 20 ml frischem Medium gegeben. Der Rest wurde verworfen.

    3.7. Quantifizierung von HEK293-Zellen mit der Neubauer-Zählkammer und

    Subkultivierung für die Experimente

    Für den experimentellen Einsatz der HEK293-Zellen wurden analog zu 3.6. die Zellen

    mit PBS (1x) mit 1 mM EDTA vom Boden der Zellkulturflaschen gelöst, in einigen

    Millilitern Medium aufgenommen und in einem sterilen Gefäß sedimentiert (30·g, 3´,

    RT). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 ml frischem Medium

    aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer über

    dem 4 mal 4 Quadrate umfassenden Feld ausgezählt. Die derart bestimmte Zellzahl

    befand sich in einem Volumen von 0,1 µl, so dass die Gesamtzellzahl bestimmt werden

    konnte.

    Für die jeweiligen Experimente wurden Zellkulturplatten mit 6 Löchern verwendet, in

    die pro Loch 500000 Zellen in einem Volumen von 1500 µl ausgesät wurden.

    3.8. Durchführung einer PCR und Reinigung der Reaktionsprodukte

    3.8.1. Polymerase-Kettenreaktion

    Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden 10 pmol (für PKCα und β1) und 12,5

    pmol (für PKCδ) 5´ und 3´ Oligonukleotide und 5 µl Pfu-Turbo-Taq-Polymerase (10x)

    mit einer Zyklenzahl von 20 eingesetzt. Die Sequenz der verwendeten Oligonukleotide

    (MWG-Biotech, Ebersberg) wurde mit dem Programm OLIGO 4.0 ausgewählt. Die

    Länge der Oligonukleotide lag zwischen 18 und 22 Nukleotiden, die Hybridisierung

    von 5’ mit 3’ Oligonukleotiden wurde auf höchstens 5 Nukleotide begrenzt, die

  • 23

    Differenz der Schmelztemperatur war nicht größer als 2 °C und die Schmelztemperatur

    der Oligonukleotide überstieg 72 °C nicht. Die konstanten Bedingungen der

    Reaktionszyklen waren wie folgt gewählt: Die Denaturierung erfolgte vor dem ersten

    Zyklus 1´ lang bei 94 °C, dann immer 45´´ lang bei 94 °C. Die Hybridisierungsreaktion

    fand 45´´ bei 50 °C und die Elongationsreaktion bei 72 °C und 3´ statt. Insgesamt

    wurden 15 Zyklen wiederholt. Abschließend wurde die Reaktion 5´ bei 72 °C beendet.

    Die Hybridisierungstemperatur und die Oligonukleotideigenschaften wurden mit Hilfe

    des Programms OLIGO 4.0 ermittelt.

    Von der so amplifizierten DNA wurden entweder 10 µl zur Überprüfung der Länge und

    Qualität auf einem Agarosegel aufgetrennt und mittels eines PCR-Kits (s. unten)

    gereinigt oder der Ansatz wurde mit Phenol-CHCl3 extrahiert, mit Ethanol gefällt und

    gewaschen, in H2O aufgenommen und für eine Restriktion eingesetzt.

    Ansatz einer PCR:

    50 ng (PKCα und β1) bzw. 100 ng (PKCδ)

    10 pmol (PKCα und β1) bzw. 12,5 pmol (PKCδ)

    200 µM je dNTP (ATP, GTP, CTP, UTP)

    5 µl Pfu-Turbo-Taq-10x-Puffer

    0,5 µl Pfu-Turbo-Taq (10 U/ml)

    ad 50 µl H2O

    Oligonukleotide:

    Für die PKCα:

    5’ GCA GGT ACC CAA GAA TGA AAG CAA G 3’ 25mer

    Asp718I PKC alpha

    5’ TAA GGA TCC CGT ACT GCA CTC TGT AAG ATG GG 3’ 32mer

    Bam HI PKC alpha

    Für die PKCβ1:

    5’ GCA GGT ACC CAA AAG TGA GAG CAA AC 3’ 26mer

    Asp718I PKC beta 1

    5’ TAA GGA TCC CGC ACA TTA ATG ACA AAC TCT GG 3’ 32mer

    Bam HI PKC beta 1

  • 24

    Für die PKCδ:

    5’ GCA GGT ACC CAT CAA CCA GAA GCT TTT G 3’ 28mer

    Asp718I PKC delta

    5’ TAA GGA TCC CGA TCT TCC AGG AGG TGC TC 3’ 29mer

    BamHI PKC delta

    3.8.2. Reinigung der PCR-Reaktionsprodukte

    Die Reinigung erfolgte mit dem High Pure PCR-Product Purification Kit (Roche,

    Mannheim). Pro 100 µl PCR-Reaktionsansatz wurden 500 µl Bindungspuffer

    hinzugegeben und vermengt. Die Lösung wurde dann durch das in dem Auffanggefäß

    eingesetzte Filtrationsgefäß pipettiert und bei 130000·g für 30´´ zentrifugiert. Der

    Durchlauf wurde verworfen und zweimal mit Waschpuffer erneut bei 13000·g für 30´´

    gewaschen (zuerst mit 500 µl, dann mit 200 µl). Nach Verwerfen des Auffanggefäßes

    wurde das Filtrationsgefäß in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß eingesetzt und die

    DNA mit 50 µl H2O eluiert. Nach Zentrifugation für 30´´ bei 13000·g wird der

    Überstand in ein sauberes Eppendorfhütchen pipettiert und bei –20 °C gelagert.

    3.9. Proteinanalyse

    3.9.1. Proteinextraktion aus Zellen der Zellkultur

    Zunächst wurde das Medium abgesaugt, kurz mit PBS (1x) gespült und mit einem

    Schaber abgelöst. Die Zellen wurden pro Loch in 100 µl Homogenisationspuffer für die

    zytosolische Fraktion aufgenommen, im Ultrazentrifugenröhrchen 2x 10´´ auf Eis mit

    Ultraschall (25 W) zerkleinert und 30´ bei 100000·g und 4 °C zentrifugiert. Der

    Überstand wurde in Eppendorfhütchen überführt und das Sediment mit 100 µl

    Homogenisationspuffer für die Membranfraktion versetzt. Nach 10´´ Ultraschall bei 25

    W auf Eis wurde der Rest in neue Eppendorfhütchen überführt.

  • 25

    Homogenisationspuffer (Zytosol) Homogenisationspuffer (Membran)

    0,3 M Aprotinin (Sigma)

    1 M PMSF in DMSO

    100 µM Leupeptin

    100 µM Pyrophosphat

    0,1 % 2-Mercaptoethanol

    0,5 mM DTT analog

    + 0,8 % (v/v) Nonidet-P-40

    für 1 ml ad 1000 µl mit Basislösung auffüllen

    Basislösung

    20 mM Tris-HCl, pH:7,5; 0,23 M Saccharose; 10 mM EGTA; 2 mM EDTA

    3.9.2. Proteinbestimmung nach Stoschek

    Für die Proteinbestimmung wurde 1 µl der zu bestimmenden Proteinlösung der Zytosol-

    oder der Membranfraktion (Stoschek, 1990) mit einem Reagenz aus 7 µl 10 M NaOH

    mit 1 ml Coomassie Brilliant Blue G vermischt. Nach einer Inkubationszeit von

    mindestens 5´ und maximal 15´ bei RT wurde die Extinktion in einer 2fach-

    Bestimmung bei 595 nm bestimmt. Der Leerwert des Färbereagenz und des

    Homogenisationspuffers (2fach-Bestimmung) wurde automatisch durch das Photometer

    von den jeweiligen Messwerten abgezogen und diese dann mit einer Standardkurve

    (3fach-Bestimmung) aus der Extinktion von 1 bis 20 µg bovinem Serumalbumin (BSA)

    korreliert.

    Coomassie Brilliant Blue G Reagenz

    10 mg Coomassie Blue G

    4,75 ml Ethanol abs.

    ad 100 ml mit H2O auffüllen

    3.9.3. SDS Protein-Gelelektrophorese

    Für die Auftrennung der Proteinextrakte wurde unter denaturierenden Bedingungen ein

    Acrylamid-Gel nach Laemmli (Laemmli, 1970) verwendet. Dieses bestand aus einem

  • 26

    Sammelgel, das eine genaue Konzentrierung der Proteine ermöglichte, und aus einem

    Trenngel, das zu einer Auftrennung der Proteine proportional zum Logarithmus ihres

    Molekulargewichts führte. Zur Abdichtung des Gelsystems wurde auf dem Boden

    zwischen den Glas- und Aluminiumplatten ein Stopfgel und darüber dann luftblasenfrei

    das Trenngel bis 7 mm unterhalb der Geltaschen gegossen und sofort mit 300 µl

    Butanol (H2O gesättigt) überschichtet, so dass sich eine glatte Oberkante bilden konnte.

    Nach Polymerisation wurde das Butanol durch Spülen mit Wasser verworfen und das

    Sammelgel über das Trenngel gegossen und der Kamm eingeführt. Zur

    Proteinauftrennung wurden bis zu 10 µl Extrakt auf Eis mit der gleichen Menge

    Proteinprobenpuffer versetzt und nach einer Denaturierung bei 95 °C für 5´ neben 5 µl

    eines vorgefärbten Proteingrößenstandards zur Bestimmung der Laufstrecke der

    Proteine in die 5 mm x 7 mm großen Taschen des 0,75 mm dicken Gels gefüllt. Die

    Proteine wurden in einem Glycerin und SDS-haltigen Proteingel-Laufpuffer bei 25 mA

    für 1,5 h aufgetrennt.

    Acrylamid-Stammlösung Protein-Probenpuffer (2x)

    29,2 % (w/v) Acrylamid 7 M Harnstoff

    0,8 % (w/v) Bisacrylamid 10 % (v/v) β-Mercaptoethanol

    5 % (w/v) SDS

    0,004% (w/v) Bromphenolblau

    Proteingel-Laufpuffer (10x) Trenngel-Lösung

    72 g Glycerin 2,25 ml H2O

    15 g Tris-Base 2,50 ml 1,5 M Tris-HCl,pH:8,8

    5 g SDS 2,67 ml Acrylamidstammlösung

    ad 500 ml H2O pH: 8,6 50 µl 10 % (w/v) SDS

    100 µl 10 % (w/v) APS

    15 µl TEMED

    Sammelgel-Lösung

    2,78 ml H2O

    1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, pH: 6,8

    0,87 ml Acrylamidstammlösung

    50 µl 10 % (w/v) SDS

    50 µl 10 % (w/v) APS

    10 µl TEMED

  • 27

    3.9.4. Semitrockener Proteintransfer

    Nach der Elektrophorese in einem Acrylamidgel erfolgte der Transfer der Proteine nach

    einem halbtrockenen Verfahren auf eine PVDF-Membran (Burnette, 1981). Durch eine

    Methanolbehandlung für 5´´ wurde die PVDF-Membran aktiviert und anschließend 5´

    lang gewässert. Der Transferaufbau setzte sich zusammen aus fünf Lagen in

    Kathodenpuffer getränktem Whatmann 3 MM Papier, das auf eine Kohleplatte als

    Kathode gelegt wurde. Das Whatmann Papier war an jeder Seite etwa 1 cm größer als

    das Trenngel. Zunächst wurde die Laufstrecke des Größenstandards ausgemessen und

    das Sammel- und Stopfgel abgetrennt. Nach Ablösen des Trenngels mit einem

    trockenen Whatmann Papier von der Aluminiumplatte, wurde das Gel kurz in den

    Kathodenpuffer und anschließend luftblasenfrei auf den vorbereiteten Papierstapel

    gelegt. Die in Anodenpuffer 2 äquilibrierte PVDF-Membran wurde exakt auf das

    Trenngel gelegt, so dass die Oberkanten miteinander abschlossen. Darüber geschichtet

    wurden vier in Anodenpuffer 2 und zwei in Anodenpuffer 1 getränkte Lagen aus

    Whatmann Papier und abschließend die Kohleplatte der Anode aufgelegt. Pro Gel

    wurde der Proteintransfer bei einer Stromstärke von 100 mA für 30´ durchgeführt.

    Danach konnte die PVDF-Membran für Immunoblot-Analysen verwendet werden.

    Kathodenpuffer Anodenpuffer 1 Anodenpuffer 2

    0,1 M Arginin 0,3 M Tris-Base 0,025 M Tris-Base

    20 % Methanol 20 % Methanol

    3.9.5. Immunoblot-Analyse

    Die PVDF-Membran mit transferiertem Protein (s. 3.8.4.) wurde durch Inkubation in

    Inkubationspuffer mit 1 % fettarmem Milchpulver für 30´ blockiert. Für die Antikörper

    der PKCβ1 und PKCδ wurde ein Inkubationspuffer aus TBS mit 10 mM Tris (pH 8,0)

    und für die Antikörper der PKCα wurde ein Inkubationspuffer aus TBS mit 50 mM Tris

    (pH 7,5) verwendet. Die Blockierungslösung wurde einmal mit der Inkubationslösung

    gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation der Antikörper der PKCβ1 und PKCδ

    für 1,5 h bei Raumtemperatur und für die PKCα ü.N. bei 4 °C in 4 ml Inkubationspuffer

    mit 0,5 % (w/v) fettarmem Milchpulver. Von dem PKCβ1-Antikörper wurde mit

    0,23 µg pro ml Inkubationsansatz verwendet, das Antiserum der PKCδ auf 1:150

  • 28

    verdünnt und der PKCα-Antikörper wurde in einer Konzentration von 16 µg pro ml

    eingesetzt. Anschließend wurde dreimal kurz mit Inkubationspuffer ohne Milchpulver

    gespült und viermal 5´ lang gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit einer

    Verdünnung von 1:5000 des mit Alkalischer Phosphatase gekoppelten Proteins A für

    45´ bei Raumtemperatur in 10 ml des jeweils für den primären Antikörper geeigneten

    Antikörper-Inkubationspuffers ohne Milchpulver. Nach dreimaligem kurzem Spülen

    und viermaligem Waschen für 5´ erfolgte für jede Membran die Färbereaktion für die

    Chemiluminiszenz der PKC-Banden mit Hilfe von Meerrettich-Peroxidase und ECL-

    Reagenz (Amersham, Freiburg).

    Antikörper-Inkubationspuffer Antikörper-Inkubationspuffer

    für PKCβ1 und PKCδ für PKCα

    10 mM Tris-HCl, pH 8,0 50 mM Tris-HCl, pH 7,5

    150 mM NaCl 150 mM NaCl

    0,05 % (v/v) Tween 0,05 % (v/v) Tween

    0,5 % (w/v) fettarmes Milchpulver 0,5 % (w/v) fettarmes Milchpulver

    3.9.6. Quantifizierung der Signalintensität von Immunoblot-Analysen

    Für die Quantifizierung der Signalintensität der Immunoblots (s. 3.8.5.) wurde ein

    Laserdensitometer verwendet.

    Durch die Intergration der Signalintensität über die Fläche der spezifischen Banden

    erfolgte dann die Quantifizierung. Von diesem Messwert wurde der Wert für eine gleich

    große Fläche außerhalb der Banden in derselben Analysespur als Hintergrund

    abgezogen. Die zu vergleichenden PKC-Signale lagen immer auf derselben Membran.

    Durch diese Methode wurde eine Linerarität von Proteinmengen zwischen 10 und 40 µg

    zytosolischem oder aus der Membranfraktion extrahierten Proteine erreicht. Die

    Sensitivität lag abhängig vom verwendeten Antikörper ca. zwischen 4 und 10 ng PKC-

    Protein.

  • 29

    3.10. Transfektion und PKC-Aktivitätsbestimmung

    Die Transfektion der Zellen erfolgte mit einer Transfektionslösung, bestehend aus dem

    zu untersuchenden PKC-Konstrukt bzw. der pcDNA/MER-Kontrolle, die in 20 µl TE

    (pH: 7,4) mit 50 µl 2,5 M CaCl2 und 450 µl H2O aufgefüllt wurden. Abschließend

    wurden 500 µl 2x-BBS tropfenweise dazugegeben und durch Sprudeln vermischt. Nach

    10´ wurde die Lösung auf Zellkulturplatten aufgetropft (s. 3.6.) und diese dann bei 37

    °C im Wärmeschrank bei 3 % (v/v) Co2 ü.N. kultiviert.

    Am nächsten Morgen wurde das Medium abgesaugt und die Löcher mit je 1,5 ml

    3 %igem (v/v) DMEM mit je 0,02 % Ethanol bzw. 200 µmol/l 4-OHT aufgefüllt und

    die Zellkulturplatten in den 5 % (v/v) CO2-haltigen Wärmeschrank gestellt. Nach ca. 5 h

    erfolgte eine Behandlung der Zellen analog zu 3.9.1. zur Vorbereitung der

    Proteinbestimmung nach Stoschek (s. 3.9.2.). Nach der Konzentrationsbestimmung

    wurden die Proben der Zytosolfraktion (PKC bzw. Kontrolle, jeweils mit EtOH oder

    OHT) auf 4 mit Z1-Z4 und 4 mit Z1´-Z4´ beschrifteten Eppendorfhütchen verteilt und

    analog dazu die Proben der Membranfraktion mit M1-M4 bzw. M1´-M4´. Die mit Z1´-

    Z4´und M1´-M4´ beschrifteten Hütchen wurden mit 2 mM 1:10 verdünnten

    GF109203X vorinkubiert.

    Als nächstes wurden der Kinasepuffer, der H-Puffer für das Zytosol und die Membran,

    die Ac-MBP4-14-, GF109203X-, ATP-, PtdS- und PtdS/DAG-Lösungen hergestellt.

    PtdS (Konzentration im Assay: 25 µg/µl) und PtdS/DAG (Konzentration im Assay: 2,5

    µg/µl) wurden in Eppendorfhütchen pipettiert und unter wenig Druck mit Stickstoff

    verdampft. Nach Auffüllen mit 400 µl Kinasepuffer erfolgte auf Eis eine Behandlung

    mit Ultraschall für 30´´ (2x). Es zeigte sich eine Trübung der Lösung.

    Anhand des Pipettierplans wurden nacheinander je 10 µl der einzelnen Lösungen

    (Ac-MBP4-14, PtdS, PtdS/DAG, GF109203X und Kinase-Puffer) in Eppendorfhütchen

    pipettiert. Die vorgegebene Eluatmenge wurde ad 10 µl mit Homogenisationspuffer

    aufgefüllt. Zum Schluss wurde die berechnete Menge radioaktiven ATPs zum ATP-

    Stock gegeben, jeweils 10 µl zu den Ansätzen gegeben und die Proben noch einmal

    kurz anzentrifugiert.

    Jeweils 20 Ansätze wurden im Thermomixer bei 30 °C kurz vorgewärmt und dann in

    15´´ Abständen durch Zugabe von 0,5 µg-3 µg Eluat je nach Experiment gestartet. Nach

    genau 5´ Inkubationszeit pro Ansatz wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 µl TCA

    (25 %) gestoppt und die Ansätze wieder auf Eis gestellt.

  • 30

    Anschließend wurden 40 µl der Ansätze auf vorbereitete P81-Papierchen pipettiert und

    nach mindestens 1´ in 75 mM H2PO4 getränkt und 5 x 5´ damit gewaschen. Die

    Auswertung der Cerenkov-Strahlung erfolgte im Szintilationszähler.

    Ac-MBP4-14 für 1 Ansatz in µl

    1 mM MBP 1:6,66 1,5

    4 % BSA 1:10 7,5

    Kinasepuffer 7,5

    Konzentration im Assay: 30 µM

    GF109203X für 1 Ansatz in µl

    2 mM GFX 1:5 vorverdünnt 0,125

    0,4 mM GF109203X 1:80 9,875

    Kinasepuffer

    Konzentration im Assay: 2,5 µM

    ATP für 1 Ansatz in µl

    0,02 M ATP 1:40 0,25

    32 gamma-ATP 1E6 cpm abhängig von Aktivität

    Kinasepuffer ad 800 µl

    Konzentration im Assay: 100 µM

    Homogenisationspuffer

    0,3 M Aprotinin (Sigma)

    1 M PMSF in DMSO

    100 µM Leupeptin

    100 µM Pyrophosphat

    0,1 % 2-Mercaptoethanol

    0,5 mM DTT

    3 µM Microcystin

    200 µM Sodium-Ortho-Vanadat

  • 31

    Kinasepuffer

    20 mM Tris-HCl (pH:7,5)

    20 mM MgCl2

    75 mM H2PO4

    5,1 ml 80 % H2PO4

    ad 1000 ml H2O

    25 % TCA

    3.11. Untersuchung der intrazellulären Signaltransduktion mittels des dualen

    Luciferase- Assays

    Analog zu 3.6. wurden die Zellen in die Zellkulturplatten ausgesät. Nach ca. 5 h wurden

    die verschiedenen Transfektionslösungen für die PathDetect Reportergen-

    Untersuchungen aufgetropft (s. unten) und die Zellen ü.N. im 3 % CO2 Wärmeschrank

    kultiviert. Am nächsten Morgen erfolgte analog zu 3.10. der Mediumwechsel mit

    0,02 % Ethanol und 200 nmol/l 4-OHT. Bei einigen Versuchen wurden auch die

    Hemmstoffe PD98059 und U0126 in einer Konzentration von 10 µmol/l pro Loch

    verwendet. Nach ca. 5 h wurde das Medium abgenommen, kurz mit 1x PBS gespült und

    die Zellen pro Loch mit 400 µl Passive Lysis Puffer (Komponente des dualen

    Luciferase-Assays; Promega, Mannheim) lysiert und nach 15´bei RT in

    Eppendorfhütchen überführt. Nach Zentrifugation (14000 rpm, 5´, 4 °C) wurden 20 µl

    des Überstands in die Luminometerrörchen vorgelegt. Die Herstellung und Lagerung

    der einzelnen, für den dualen Luciferase-Assay notwendigen Lösungen und Reagenzien

    wurden laut Versuchsanleitung durchgeführt. Der durchgeführte duale Luciferase-Assay

    (Promega, Mannheim) ermöglichte es, eine gekoppelte Messung sowohl der Elk1-

    abhängigen Genexpression mittels der Leuchtkäfer-Luciferase als auch der

    Transfektionseffizienz durch Kotransfektion des Vektors pRL-TK mit

    Renilla reniformis Luciferase in einem Versuchsdurchlauf ohne Änderungen der

    Versuchsbedingungen durchzuführen (s. 3.11.). Es wurden jeweils Doppel-

    bestimmungen für den dualen Luciferase-Assay durchgeführt. Die

    Luciferaseaktivitätsmessung wurde in einem Luminometer (Berthold, Bad Wildbach)

    zur quantitativen Bestimmung einzelner während der chemischen Reaktion von

  • 32

    Leuchtkäfer- bzw. Renilla-Luciferase durchgeführt. Hierzu wurde das Luminometer mit

    40x 100 µl H2O und dann 12x mit 100 µl der zwei Messlösungen aus dem dualen

    Luciferase-Assay System (Luciferase-Assay-Reaganz-II (LARII-Lösung) und Stop &

    Glow-Reagenz) gespült. Die Luminometer-Röhrchen mit dem Zell-Lysat wurden in das

    Gerät gestellt. Pro Röhrchen wurden automatisch 100 µl LARII-Lösung an Position –1

    hinzugefügt und für 10´´ erfolgte dann eine Messung der Leuchtkäfer-Luciferase.

    Anschließend wurde automatisch 100 µl Stop & Glow-Reagenz an Position 0

    hinzugefügt und mit 2´´ Verzögerung für 10´´ die Renilla-Luciferase vermessen.

    Transfektionslösungen pro Loch einer 6-well-Platte

    MER PKC´s MEK1 dbd

    in ng

    pcDNA/MER 100

    PKC/MER-Konstrukte 3-1000 3-100

    pFR/Luc(Reporter-

    Luciferase) 333,3 333,3 333,3 333,3

    pRL TK (Renilla-Plasmid) 16,6 16,6 16,6 16,6

    pFA2/Elk1 (Fusionstrans-

    aktivator-Plasmid) 16,6 16,6 16,6

    pFC/MEK1 (Positivkontrolle) 100

    pFC2/dbd (Negativkontrolle) 100

    KS Bluescript ad 3000 dito dito dito

    3.12. Statistische Auswertung

    Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 10.0 mit dem nicht parametrischen

    Wilcoxen-Test zum Vergleich zweier abhängiger Stichproben. Nach Büning und

    Trenkler (1994) ist es möglich den Test bereits ab einer Beobachtungsanzahl von vier

    Beobachtungen anzuwenden. Für alle Ergebnisse wurde die Standardabweichung

    angegeben.

  • 33

    4. Ergebnisse

    4.1. Herstellung der PKC-Fusionsproteine

    Zur Herstellung von Fusionsproteinen von PKC-Fragmenten mit mutiertem

    Östrogenrezeptor (MER) wurden cDNAs unterschiedlicher Forschungsgruppen

    verwendet. Dazu ist die cDNA der PKCα (Finkenzeller, Freiburg), der PKCβ1 (A.

    Ullrich, Martinsried) und der PKCδ (D. Burns, Durham) mit der

    Polymerasekettenreaktion (PCR, s. 3.8.1.) amplifiziert worden. Verwendet wurde die

    Pfu Turbo DNA-Polymerase (Stratagene), da ihre Fehlerrate im Vergleich zu der Taq

    Polymerase, die keine 3´- 5´Exonukleaseaktivität besitzt, etwa 6- bis 100fach

    niedriger ist. Andere DNA-Polymerasen mit 3´- 5´Exonukleaseaktivität zeigen

    trotzdem eine 2- bis 60fach höhere Fehlerrate als die Pfu Turbo DNA Polymerase

    (Hogrefe, et. al., 1997 and 2002). Von der PKC wurde die katalytische Domäne mit

    einem 5’ liegenden Anteil regulatorischer Domäne amplifiziert, der die Sequenz für

    den Rezeptor der aktivierten C-Kinase (RACK) codiert. Damit ist die

    Pseudosubstratregion (und die DAG Bindedomäne) entfernt worden, um eine

    Steuerung der Aktivierung des Fusionsproteins durch das MER zu ermöglichen (s.

    Abb. 1).

    Abb. 1: Darstellung der Herstellung der mit 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren

    Fusionsproteine der PKCα, PKCβ1 und PKCδ.

  • 34

    4.1.1. Amplifikation der PKC-cDNA-Fragmente

    Zur Herstellung der mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) induzierbaren PKC-

    Isoenzyme in pcDNA3.1/HisB wurden verschiedene Oligonukleotide (MWG-

    Biotech, Ebersberg) verwendet. Die PKC-cDNA-Fragmente wurden jeweils mit den

    Oligonukleotiden amplifiziert, die im 5’-Oligonukleotid eine Asp718I- und im

    3’-Oligonukleotid eine BamHI-Restriktions-Schnittstelle trugen. Die in den

    Restriktionskarten (Abb. 2a-c) angegebenen Schnittstellen beziehen sich auf die

    cDNA der jeweiligen PKC (PKCα: 637, 769, 1953 und 2046 bp; PKCβ1: 746, 1480

    und 2149 bp; PKCδ: 901, 1443 und 2086 bp). Weiterhin sind die Schnittstellen in der

    MER-cDNA (1031, 1136, ca. 1800, 1903 und 2061 bp) und in der pcDNA3.1/HisB

    (1012, 1021, 1040, 1045 und 2402 bp) angegeben.

    Für die pcDNA3.1/HisB (pcDNA) mit einer Länge von 5516 bp liegen die

    Schnittstellen der Restriktionsenzyme für Asp718I an Position 1012 bp, für BamHI

    an Position 1021 bp und für EcoRI an Position 1040 bp.

    Die mit den Oligonukleotiden eingefügten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme

    in der DNA-Sequenz für die PKCα mit einer Länge von 1409 bp liegen für Asp718I

    an Position 637 bp und für BamHI an Position 2046 bp des PKCα-Gens (Abb. 2a).

    Eine interne BamHI-Schnittstelle in der PKCα-cDNA an Position 796 bp machte für

    die Subklonierung des PKCα-cDNA-Fragmentes einen partiellen Verdau mit BamHI

    erforderlich (s. 3.3.3.).

    pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040

    1953 2046 bp

    Bam HI

    EcoRI

    PST I

    MER 1031 1136 1903 2061 bpca.1800

    PVU II

    PVU II

    PST I

    PST I

    Asp718

    Bam HI

    PVU II

    Asp718I

    PVU II

    EcoRI

    PKCalpha 637 1233 769

    HIPVU II

    PVU II

    1045

    PST I

    2402

    PST I

    Abb.2a: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das

    pcDNA/PKCα/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;

    zusätzliche BamHI-Schnittstelle in der PKCα-cDNA ist fettgedruckt

    (dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCα-cDNA-; weiß: MER-cDNA)

  • 35

    Die Schnittstellen im amplifizierten cDNA-Fragment für die PKCβ1 mit einer Länge

    von 1403 bp liegen für Asp718I an Position 746 bp und für BamHI an Position

    2149 bp des PKCβ1-Gens (Abb. 2b).

    pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040

    746 1480 2149 bp

    Bam HI

    EcoRI

    PST I

    PKCbeta1

    MER 1031 1136 1903 2061 bp ca.1800

    PVU II

    PVU II

    PST I

    PST I

    Asp718

    Bam HI

    PST I

    PVU II

    Asp718I

    PVU II

    EcoRI

    1045

    PST I

    2402

    PST I

    Abb. 2b: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das

    pcDNA/PKCβ1/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;

    (dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCβ1-cDNA-; weiß: MER-cDNA)

    Die Schnittstellen im amplifizierten cDNA-Fragment für die PKCδ mit einer Länge

    von 1185 bp liegen für Asp718I an Position 901 bp und für BamHI an Position

    2086 bp des PKC δ–Gens (Abb. 2c).

    pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040 1045 2402

    Bam HI

    EcoRI

    PST I

    MER 1031 1136 1903 2061 bpca.1800

    PVU II

    PVU II

    PST I

    PST I

    Asp718

    Bam HI

    PST I

    PVU II

    PVU II

    EcoRI

    PST I

    PST I

    2086 bp 901 1443PKCdelta

    Abb. 2c: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das

    pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;

    (dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCδ-cDNA-; weiß: MER-cDNA)

    Es wurden die Bedingungen der PCR optimiert, um effizient die PKC-cDNA-

    Fragmente mit geringer Wahrscheinlichkeit für Mutationen zu amplifizieren (s.

    3.8.1.). Die Amplifikation wurde daher nach 15 Zyklen beendet und die PCR-

  • 36

    Produkte auf einem Agarosegel analysiert (s. 3.5.). Anhand des parallel

    aufgetragenen DNA-Größenstandards ließ sich die Länge der Fragmente bestimmen.

    Die Auftrennung der amplifizierten PKC-cDNA entsprach der berechneten

    Fragmentlänge von 1409 bp für die PKCα, von 1403 bp für die PKCβ1 und von

    1185 bp für die PKCδ (s. Abb. 3a und 3b).

    10000

    8000

    3000

    2000

    1500

    1000750

    500

    250

    10000

    6000

    4000

    3000

    2000

    1500

    1000

    750 1 M in bp 1 2 M in bp

    Abb. 3a: PCR-Produkt PKCα mit Abb. 3b: PCR-Produkte PKCβ1 mit 1403 bp

    1409 bp in Spur 1 (Spur 1) und PKCδ mit 1185 bp (Spur 2)

    (1 kb DNA-Größenstandard in Spur M)

    Die Reinigung der PCR-Produkte der PKC-cDNA-Fragmente erfolgte mittels eines

    Glasvlies mit dem PCR-Reagenziensatz von Roche (s. 3.8.2). Die DNA wurde mit

    60 µl H2O eluiert und nach einer semiquantitativen Konzentrationsbestimmung bei –

    20 °C aufbewahrt.

    4.1.2. Subklonierung des MER

    Zur Vorbereitung der Subklonierung des MER wurde der Vektor BxB/MER

    (U. Rapp, Würzburg), der die cDNA für den MER enhält, mit den

    Restriktionsenzymen BamHI (Schnittstelle an Position 1031 bp) und EcoRI

    (Schnittstelle an Position 2061 bp) geschnitten (s. Abb. 2a-c), um das MER cDNA-

    Fragment zu gewinnen (s. 3.3.1.). Nach Subklonierung ergab eine Sequenzierung,

  • 37

    dass im MER-Fragment eine stumme Mutation vorhanden war. Eine Anfrage bei U.

    Rapp (Würzburg) ergab, dass die Mutation dort vorbeschrieben war und zu einer

    Erkennenungssequenz für Asp718I im MER führte (s. Abb. 4). In Spur 1 ist die

    Restriktion des Vektors BxB/MER mit EcoRI und BamHI zu sehen, in Spur 2 die

    Restriktion mit Asp718I, EcoRI und BamHI, die zu einer ca. 250 bp großen Bande

    führte.

    1 2 M in bp

    Abb. 4: Darstellung der 250 bp Bande (Spur 2) bei der Restriktion des BxB-Vektors

    mit EcoRI, BamHI und Asp718I, die durch die zusätzliche Erkennungssequenz für

    Asp718I im MER entstanden ist. In Spur1 die Restriktion mit EcoRI und BamHI, in

    Spur M der 1 kb DNA-Größenstandard.

    Aufgrund der zusätzlichen Schnittstelle für Asp718I im Vektor BxB/MER musste

    der ursprüngliche Klonierungsplan verworfen werden und in das Expressionsplasmid

    pcDNA3.1/HisB zunächst das jeweilige PKC-cDNA-Fragment subkloniert werden.

    Dazu wurden die DNAs der PKCs nach der Reinigung aus dem Agarosegel mit den

    Restriktionsenzymen Asp718I und BamHI restringiert.

  • 38

    4.1.3. Durchführung eines partiellen Verdaus für die PKCα

    Da die PKCα zwei BamHI-Schnittstellen enthielt, ist ein partieller Verdau

    durchgeführt worden (s. 3.3.3.). Es wurde mit vier unterschiedlichen BamHI-

    Konzentrationen gearbeitet, um eine Konzentration zu ermitteln, bei der zum einen

    Teil beide BamHI-Schnittstellen im 3’-Oligonukleotid und in der PKCα-cDNA-

    Sequenz von dem Restriktionsenzym geschnitten wurden und zum anderen Teil

    einzig die Schnittstelle im 3’-Oligonukleotid. Die Restriktions-Produkte wurden

    dann auf einem Agarosegel aufgetragen. Es zeigte sich zum einem eine kürzere

    Bande mit einer Länge von 1277 bp und eine längere Bande mit 1409 bp. Die

    längere der beiden Banden mit dem für die weitere Klonierung benötigten Fragment

    wurde mit Hilfe eines Reagenziensatzes zur DNA-Reinigung eluiert (s. Abb. 5). In

    Spur 1 findet sich das PCR-PKCα-Produkt ungeschnitten, in Spur M der 1 kb DNA-

    Größenstandard, in Spur 2 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit Asp718I und dem

    BamHI-Gemisch 0,8 µl, in Spur 3 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit Asp718I

    und dem BamHI-Gemisch 1,8 µl, in Spur 4 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit

    Asp718I und dem BamHI-Gemisch 2,8 µl und in Spur 5 das PCR-PKCα-Produkt

    restringiert mit Asp718I und BamHI-Gemisch 3,8 µl. Eluiert wurde die 1409 bp

    Bande aus der Spur 2.

    12771409

    1 M 2 3 4 5 in bp

    Abb. 5: Darstellung des partiellen Verdaus der PKCα mit verschiedenen BamHI-

    Gemischen (Erklärung s. o.). Eluiert wurde die 1409 bp Bande aus der Spur 2.

  • 39

    4.1.4. Subklonierung für das pcDNA/PKC-Konstrukt

    Um das pcDNA/PKC-Konstrukt herzustellen, wurde für die weitere Subklonierung

    die pcDNA3.1/HisB ebenfalls mit den Restriktionsenzymen BamHI und Asp718

    restringiert und jeweils die PKCα-, PKCβ1- und PKCδ-cDNA-Fragmente subkloniert

    (s. 3.3.). Die so gewonnenen pcDNA/PKC-Plasmide wurden in einem

    Restriktionsansatz auf einem Agarosegel überprüft (o. Abb.). Für die PKCα wurde

    PVU II, für PKCβ1 und PKCδ Pst I verwendet (s. Abb. 2a-c). Anhand des

    Restriktionsergebnisses wurde für jede PKC ein Klon ausgewählt und davon analog

    zu 3.2.2. eine Plasmid-Präparation im großen Maßstab durchgeführt. Um einen

    hohen Reinheitsgrad der DNA zu erreichen, wurde die CsCl-

    Dichtegradientenzentrifugation zweimal ü.N. durchgeführt. Die entstandenen

    Konstrukte pcDNA/PKCα, pcDNA/PKCβ1 und pcDNA/PKCδ enthielten verkürzte

    PKC-cDNAs, die zur Expression einer konstitutiv aktiven PKC führen sollten. Die

    gewonnene DNA wurde nach einer Konzentrationsbestimmung bei –20 °C

    aufbewahrt.

    4.1.5. Fusion der pcDNA/PKC-Konstrukte mit der MER-cDNA und abschließende

    Restriktionsüberprüfung

    Als nächstes folgte die Fusion der MER-cDNA mit der cDNA der jeweiligen PKC-

    Isoenzym-Fragmente. Sowohl die MER-cDNA also auch die drei pcDNA/PKC-

    Konstrukte wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI restringiert. Bei

    dem pcDNA/PKCα-Konstrukt wurde erneut ein partieller Verdau durchgeführt. Nach

    der Ligation der pcDNA/PKC-Konstrukte mit dem MER konnten die fusionierten

    Expressionsplasmide transformiert und nach Überprüfung in der Plasmid-Präparation

    im kleinen Maßstab (s. 3.2.1.) mit der Plasmid-Präparation im großen Maßstab (s.

    3.2.2.) reproduziert werden. Die Expressionsplasmide mit den Genkonstrukten

    wurden zweimal mit der CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (s. 3.2.2.) gereinigt.

    Abschließend wurde eine Restriktionsüberprüfung der fusionierten cDNAs auf einem

    Agarosegel durchgeführt (Abb. 6a und 6b). In Abbildung 6a ist die Restriktion des

    pcDNA/PKCα-MER-Konstruktes dargestellt (zum besseren Verständnis siehe auch

    Abb. 2a). In Spur 1 findet sich nach Restriktion mit BamHI das um etwa 130 bp

  • 40

    verkürzte PKCα-DNA-Insert (1409 bp), dass durch die zusätzliche Schnittstelle für

    BamHI in der PKCα entsteht. In Spur 2 findet sich nach Restriktion mit BamHI und

    EcoRI erneut das verkürzte PKC-DNA-Insert (1409 bp), sowie das MER-DNA-

    Insert (1030 bp) und das um 130 bp verkürzte zusammenhängende PKCα-MER-

    Insert (2437 bp). In Spur 3 befindet sich das unrestringierte Fusionsprotein, in Spur

    M1 der 1 kb- und in Spur M2 der 100 bp DNA-Größenstandard.

    10301409

    2439

    in bp 1 2 M1 M2 3

    Abb. 6a: Restriktionsüberprüfung des pcDNA/PKCα/MER-Konstruktes mit BamHI

    (Spur 1) und EcoRI und BamHI (Spur 2), weitere Erklärung im Text.

    In Abbildung 6b ist die Restriktion des pcDNA/PKCδ/MER-Konstruktes (Spur

    1,3,5,7) und des pcDNA/PKCβ1-MER-Konstruktes (Spur 2,4,6,8) dargestellt (zum

    besseren Verständnis siehe auch Abb. 2b und 2c). In Spur M befindet sich der 1 kb-

    DNA-Größenstandard. Spur 1 und 2 zeigt die ungeschnittene DNA. In Spur 3 und 4

    erfolgte eine Restriktion mit EcoRI und BamHI. Die um 1000 bp sichtbare Bande

    enthält somit den MER-Abschnitt des Konstruktes. In Spur 5 und 6 erfolgte die

    Restriktion mit Asp718I und EcoRI. Die um 2000 bp sichtbaren Banden enthalten

    somit das PKCδ/MER-Fragment bzw. PKCβ1/MER-Fragment, dass um ca. 250 bp

    verkürzt ist. Die um 250 bp sichtbare Bande entsteht durch die bereits unter 4.1.2.

    beschriebene 2. Schnittstelle für Asp718 im MER. In Spur 7 und Spur 8 wurde mit

    BamHI und Asp718I restringiert. Die um 1200 bp bzw. um 1500 bp sichtbaren

    Banden enthalten die PKCδ bzw. PKCβ1. Die zusätzliche Bande um 750 bp entsteht

    erneut aufgrund der unter 4.1.2. beschriebenen 2. Schnittstelle für Asp718I im MER-

    Fragment.

  • 41

    10000

    3000

    2000

    1000750

    250

    in bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

    Abb. 6b: Restriktionsüberprüfung des pcDNA/PKCδ/ MER-Konstruktes (Spur 1, 3,

    5, 7) und des pcDNA/PKCβ-MER-Konstruktes (Spur 2, 4, 6, 8) mit BamHI und

    EcoRI (3 und 4), mit Asp718I und EcoRI (5 und 6), mit BamHI und Asp718I (7 und

    8), weitere Erklärung im Text.

    4.2. Immunoblot-Analysen zum Nachweis der Expression der PKC-Fusionsproteine

    Zur Überprüfung der Expression der Fusionsproteine wurden die jeweiligen

    Expressionsplasmide in humane embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen)

    transfiziert (s. 3.6.). HEK293-Zellen lassen sich gut kultivieren, zeigen ein schnelles

    und gleichmäßiges Wachstum und haben eine Transfektionseffizienz von ca. 50 %.

    Die Transfektion erfolgte erst ü.N. bei 35 °C und 3 % CO2 (v/v) und dann nach

    einem Mediumwechsel mit DMEM (mit 3 % (v/v) FKS) bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) für 4 h mit den cDNAs von PKCα, PKCβ1 und PKCδ.

    Von gleichen Proteinmengen wurde in Immunoblot-Analysen (s. 3.9.5.) die

    Expression der Fusionsproteine mit Hilfe isoenzymspezifischer polyklonaler

    Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit für die PKCδ betrug ca. 15’’, für

    PKCα und PKCβ1 ca. 5’. Dabei zeigte sich, dass jeweils in der Zytosol- und

  • 42

    Membran-Fraktion außer der endogenen PKC in den mit dem pcDNA/PKC/MER-

    Fusionsprotein transfizierten Zellen eine zusätzliche Bande zu sehen war, die dem

    PKC-Fusionsprotein entsprach, was mit einer Kompetition mit dem

    Immunisierungspeptid des jeweiligen isoenzymspezfischen Antikörper der PKC

    gezeigt werden konnte (s. Abb. 7 und Abb. 8). Für das pcDNA/PKCδ/MER-

    Fusionsprotein zeigte sich bei der Kompetition eine Spezifität aller dargestellten

    Banden, weshalb auf die Abbildung der Kompetition verzichtet wurde. Die im

    Immunoblot dargestellten Banden entsprachen dem erwarteten Molekulargewicht der

    Proteine, das bei etwa 89 kD für PKCα und PKC β1 und für PKCδ bei etwa 81 kD

    lag. Die besonders deutliche Bande bei dem pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein

    zeigt, dass es in wesentlich höherer Menge in Zellen vorhanden war als das

    pcDNA/PKCα/MER-Fusionsprotein und das pcDNA/PKCβ/MER-Fusionsprotein.

    Das verkürzte Fragment (konst. Fragment, Abb. 8) konnte nur für das

    pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein nachgewiesen werden.

    Kompetition

    kDa

    190

    80

    40

    190

    80

    40

    Zelluläre PKCalpha

    PKCbeta1/MERZelluläre PKCbeta1

    z m z m z m z m z m z m Transfektion

    Abb. 7: Immunoblot-Analysen zur Darstellung des katalytischen Fragmentes der

    PKCα und PKCβ1 (katal. PKC) in HEK293-Zellen und der jeweiligen PKC-

    Fusionsproteine (PKC/MER) im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen (- -) in der

    Zytosol- (z) und der Membranfraktion (m), sowie die Kompetition

  • 43

    PKCdelta/MERZelluläre PKCdelta

    Konst. PKCdelta

    80

    190

    40

    kDa

    Transfektion katal.PKC

    PKC/ - - MER

    Abb. 8: Immunoblot-Analysen zur Darstellung des katalytischen Fragmentes der

    PKCδ (katal. PKC) in HEK293-Zellen und der jeweiligen PKC-Fusionsproteine

    (PKC/MER) im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen (- -) in der Zytosol- (z) und

    der Membranfraktion (m), sowie die Kompetition

    4.3. Nachweis der Aktivität der PKC-Fusionsproteine in vitro

    Die Enzymaktivität der Fusionsprotein wurde in vitro getestet. Dazu erfolgte die

    Transfektion der pcDNA/PKC/MER-Konstrukte in HEK293-Zellen, die eine

    Transfektions-effizienz von ca. 50 % erreichen (s. 3.6.). Nach einem Mediumwechsel

    (DMEM mit 3 % (v/v) FKS) wurden die Zellen dann bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) 2

    h mit 200 nmol/l 4-OHT oder mit 0,02 % Ethanol (Lösungsmittelkontrolle)

    behandelt.

    Nach der Gewinnung von Proteinhomogenaten und der Konzentrationsbestimmung

    wurde die Enzymaktivität durch den Einbau von 32P in das PKC-spezifische

    phosphataseresistente Phosphorylierungssubstrat Ac-MBP4-14 (s. 3.10.) bestimmt.

    Für das pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein zeigte sich die stärkste Aktivität.

    Besonders in der Zytosolfraktion war auch ohne 4-OHT-Behandlung eine

    Grundaktivität messbar, die zum größten Teil vom Fusionsprotein stammte, wie der

    Vergleich der Aktivität mit Zellhomogenaten ohne überexprimierte PKC deutlich

  • 44

    machte (Abb. 9: zyt/- bzw. mem/-). Mit 4-OHT-Behandlung erfolgte eine Steigerung

    in beiden Fraktionen. Diese war in der Zytosolfraktion 3,6-fach (Abb. 9: 0,5 µg

    zyt/PKC + EtOH vs. 0,5 µg zyt/PKC + 4-OHT) und in der Membranfraktion 6,7-fach

    (Abb. 9: 0,5 µg mem/PKC + EtOH vs. 0,5 µg mem/PKC + 4-OHT) gegenüber der

    jeweiligen Inkubation mit Ethanol Eine Erklärung für die geringere Gesamtaktivität

    in der Membranfraktion kann die Verwendung des nicht-ionischen Detergenz (Non-

    idet) in der Membranfraktion sein, dass die Phosphorylierungsaktivität wesentlich

    absenkte (persönliche Mitteilung).

    0

    1000

    2000

    3000

    4000

    0.5 µgzyt/PKC+0.02%

    EtOH

    0.5 µgzyt/PKC

    +200 nmol/l 4-OHT

    0.5 µgmem/PKC+0.02 %

    EtOH

    0.5 µgmem/PKC

    +200 nmol/l 4-OHT

    1.5 µg zyt/- + 0.02 %

    EtOH

    1.5 µg mem/- +

    0.02 % EtOH

    cpm

    *

    *

    Abb. 9: Darstellung der Aktivität des PKCδ/MER-Konstruktes in der Zytosol (zyt)-

    und Membranfraktion (mem);

    *: p

  • 45

    050

    100150200

    3 µgzyt/PKC +0.02 %

    EtOH

    3 µgzyt/PKC

    +200nmol/l 4-

    OHT

    3 µgmem/PKC+0.02 %

    EtOH

    3 µgmem/PKC

    +200nmol/l 4-

    OHT

    3 µg zyt/- + 0.02 %

    EtOH

    3 µg mem/- + 0.02 %

    EtOH

    cpm

    *

    *

    Abb. 10: Darstellung der Aktivität des PKCα/MER-Konstruktes im radioaktiven

    Phosphorylierungsassay bezogen auf die Zytosol (zyt)- und Membranfraktion (mem).

    *: p

  • 46

    1020 1040

    1) h PKCbeta1 plus MER GGGAAGTCCGTGGATTGGTGG 2) PKCbetau266 GGGAAG_CCGTGGATTGGTGG 3) PKCbetau683 GGGAAGNCCGTGGATTGGTGG 4) PKCbetalo1145revers GGGAAGCCCGTGGATTGGTGG

    Abb. 11: Sequenzanalyse des pcDNA/PKCβ1/MER-Fusionsproteins mit der

    Punktmutation (fettgedruckt) an Position 1026 bp, was im humanen PKCβ1-Gen der

    Position 1697 bp entspricht.

    4.4. Reportergen-Untersuchungen mit dem dualen Luciferase-Assay zum Nachweis

    der Funktionalität der PKC-Fusionsproteine

    4.4.1. Untersuchung von Elk1-abhängiger Luciferase-Genexpression durch die PKC-

    Fusionsproteine

    Nachdem die Expression und die Enzymaktivität der pcDNA/PKC/MER-Konstrukte

    untersucht worden war, sollte abschließend ihre Funktionalität in der Zelle anhand

    von Reportergen-Untersuchungen gezeigt werden. Dazu wurde die Elk1 abhängige

    Luciferase-Genexpression mit dem Path Detect-System (Stratagene, USA) in

    HEK293-Zellen im dualen Luciferase-Assay (Promega, Mannheim) gemessen (s.

    3.11.). Zur Aktivierung der Genexpression wird ein Expressionsplasmid für ein

    Fusionsprotein eingesetzt, das für eine GAL4-DNA-Bindedomäne (dbd in Abb. 4)

    und der Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors Elk1 codiert. Die

    Transaktivierungsdomäne von Elk1 kann durch MAPK oder vom zu untersuchenden

    Konstrukt phosphoryliert und aktiviert werden und so durch Bindung an die GAL4-

    DNA-Bindedomäne des Reportergens zu einer Aktivierung der Transkription der

    Luciferase führen.

    Als Negativkontrolle werden zwei Plasmide co-transfiziert. Ein Plasmid codiert für

    ein Protein bestehend aus der GAL4-DNA-Bindedomäne ohne

    Transaktivierungsdomäne, ein weiteres ist das Reporterplasmid mit Luciferasegen,

    das unter der Kontrolle eines GAL4-DNA-Promotor-Elementes steht. Da dem

  • 47

    GAL4-Bindeprotein die Transaktivator-Domäne fehlt, die die Ausbildung eines

    aktiven RNA-Polymerase-Komplexes ermöglicht, ist die Luciferase-Aktiviät dieses

    Ansatzes gering. Das zu Kontrollzwecken als drittes Plasmid co-transfizierte

    pcDNA/PKC/MER-Konstrukt zeigte in diesem Ansatz keine Wirkung.

    Die PKC-abhängige Stimulation der Luciferase-Aktivität durch 4-OHT, wurde mit

    drei Plasmiden durchgeführt. Dazu wurden das Luciferase-Reportergen mit dem

    GAL4-DNA-Promotorelement, das Expressionsplasmid für das jeweilige

    pcDNA/PKC/MER-Konstrukt und ein Expressionsplasmid für das Fusionsprotein

    bestehend aus GAL4-DNA-Bindedomäne und der Transaktivatordomäne des

    Transkriptionsfaktors Elk1 co-transfiziert. Da in diesem Ansatz im Gegensatz zu der

    Negativkontrolle die Transaktivator-Domäne vorhanden war, konnte diese nach

    Phosphorylierung durch die pcDNA/PKC/MER-Konstrukte an die Promotorregion

    des Reportergens binden und so zur Transkription vom Luciferasegen führen (s. Abb.

    12).

    TATATA LuciferaseGAL4UAS

    Po42-

    ERK1/ERK2

    dbd

    ELK-1

    RNA-Polymerase-komplex

    U0126PD98059

    Abb. 12: Analyse von pcDNA/PKC/MER-abhängiger MAPK-Aktivierung

    (ausführliche Beschreibung siehe Text)

    Die Transfektionen erfolgten in DMEM mit 10 % FKS bei 35 °C und 3 % CO2 (v/v)

    ü.N.. Nach einem Mediumwechsel (DMEM mit 3 % FKS) wurden die Zellen dann

    bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) für 5 h mit 200 nmol/l 4-OHT und mit 0,02 % Ethanol

  • 48

    behandelt (s. 3.11.). Es wurde ein dualer Luciferase-Assay (Promega, Mannheim)

    durchgeführt, der es ermöglichte, eine gekoppelte Messung sowohl der Elk1-

    abhängigen Genexpression mittles der Leuchtkäfer-Luciferase als auch der

    Transfektionseffizienz durch Kotransfektion des Vektors pRL-TK mit Renilla

    reniformis Luciferase in einem Versuchsdurchlauf durchzuführen (s. 3.11.). Es

    wurden jeweils Doppelbestimmungen für den dualen Luciferase-Assay durchgeführt.

    Die Ergebnisse des cotransfizierten Renilla-Plasmides (pRL-TK) wurden auf die

    Elk1-abhängigen Luciferase-Ergebnisse bezogen, um Schwankungen in der

    Transfektionseffizienz zu korrigieren.

    In Abb. 13 ist die pcDNA/PKCδ/MER abhängige Aktivierung des

    Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach

    Transfektion in HEK293-Zellen dargestellt.

    0,00E+00

    2,00E+05

    4,00E+05

    6,00E+05

    8,00E+05

    1,00E+06

    1,20E+06

    pcD

    NA

    /ME

    R

    PK

    Cd+

    EtO

    H,

    10 n

    g

    PK

    Cd+

    4-O

    HT,

    10

    ng

    PK

    Cd+

    EtO

    H,

    3

    ng

    PK

    Cd+

    4-O

    HT,

    3

    ng

    ME

    K1-

    Pos

    itivk

    ontro

    lle

    dbd-

    Neg

    ativ

    kont

    rolle

    Luci

    fera

    se-A

    ktiv

    ität i

    n w

    illkü

    rlich

    en E

    inhe

    iten *

    *

    Abb. 13: pcDNA/PKCδ/MER (PKCd) abhängige Aktivierung des

    Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach

    Transfektion in HEK293 Zellen.

    *: p

  • 49

    (Abb. 13: PKCd + EtOH, 10 ng vs. PKCd + 4-OHT, 10 ng). Nach Transfektion von

    3 ng des PKCδ-Fusionsproteins zeigte sich eine Elk1-abhängige Genexpression, die

    mit 4-OHT auf das 1,5-fache gegenüber den mit Ethanol behandelten Zellen

    gesteigert werden konnte (Abb. 13: PKCd + EtOH, 3 ng vs. PKCd + 4-OHT, 3 ng).

    Insgesamt lässt sich damit eine Elk1-abhängige Aktivierung der Genexpression

    durch das pcDNA/PKCδ/MER- Fusionsprotein nachweisen (s. Abb. 13).

    In Abb. 14 ist die pcDNA/PKCα/MER abhängige Aktivierung des

    Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach

    Transfektion in HEK293 Zellen dargestellt. Bei dem pcDNA/PKCα/MER-Konstrukt

    konnte ebenfalls eine 4-OHT-abhängige Steigerung der Genexpression beobachtet

    werden, deren Gesamtaktivität jedoch deutlich geringer als bei dem

    pcDNA/PKCδ/MER-Konstrukt war.

    0,00E+00

    5,00E+04

    1,00E+05

    1,50E+05

    2,00E+05

    2,50E+05

    3,00E+05

    3,50E+05

    4,00E+05

    pcD

    NA

    /ME

    R

    PK

    Ca+

    EtO

    H,

    100

    ng

    PKC

    a+4-

    OH

    T,10

    0 ng

    PK

    Ca+

    EtO

    H,

    1000

    ng

    PKC

    a+4-

    OH

    T,10

    00 n

    g

    MEK

    1

    dbd

    Luci

    fera

    se-A

    ktiv

    ität i

    n w

    illkü

    rlich

    en E

    inhe

    iten

    * *

    Abb. 14: pcDNA/PKCα/MER (PKCa) abhängige Aktivierung des

    Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach

    Transfektion in HEK293 Zellen

    *: p< 0,05; n = 6

    Für den Einsatz von 100 ng ließ sich durch 4-OHT eine Steigerung um den Faktor

    2,5 gegenüb