Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Andreas Pfeiffer
Dienstort: Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin
in Berlin-Steglitz
Deutsches Institut für Ernährungsforschung Bergholz-Rehbrücke
Herstellung und Etablierung von 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren PKCα-,
PKCβ1- und PKCδ-Fusionsproteinen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung eines Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt von
Suma Mary Plammootil
aus Frankfurt am Main
2003
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. A. Pfeiffer
Korreferent: Prof. Dr. med. W. Schmidt
Tag der Mündlichen Prüfung: 29.04.2004
Für meine beiden Großväter
K. T. George und P.C. Varkey
1
Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung
1.1. Signalkaskaden 6
1.2. Die Charakterisierung der Proteinkinase C 7
1.3. Die Struktur der Proteinkinase C 7
1.4. Die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)- Signalkaskade 8
1.5. Die klinische Bedeutung der Proteinkinase C 9
1.6. Der Östrogenrezeptor 10
1.7. Der mutierte Östrogenrezeptor 11
1.8. Ziel der Arbeit 12
2. Materialien 13
3. Experimentelle Methoden
3.1. Bakterienpräparation 15
3.1.1. Herstellung kompetenter Bakterien 15
3.1.2. Transformation kompetenter Bakterien 16
3.2. Plasmid-Präparation 16
3.2.1. Plasmid-Präparation im analytischen Maßstab 16
3.2.2. Plasmid-Präparation im großen Maßstab 17
3.3. Reaktionen zur Subklonierung von DNA-Fragmenten 18
3.3.1. Restriktion von DNA-Molekülen 18
3.3.2. Dephosphorylierung von DNA am 5`Ende 18
3.3.3. Partieller Verdau für die Restriktion der PKCα 19
3.3.4. Ligation 19
3.4. DNA-Sequenzierung im Prism Big-Dye Terminator 20
3.5. Elektrophorese von DNA-Molekülen in Agarosegelen 21
3.6. HEK293 Zellkultur 21
3.7. Quantifizierung von HEK293-Zellen mit der Neubauer-
Zählkammer und Subkultivierung für die Experimente 22
3.8. Durchführung einer PCR und Reinigung der Reaktionsprodukte 22
2
3.8.1. Polymerase-Kettenreaktion 22
3.8.2. Reinigung der PCR-Reaktionsprodukte 24
3.9. Proteinanalyse 24
3.9.1. Proteinextraktion aus Zellen der Zellkultur 24
3.9.2. Proteinbestimmung nach Stoschek 25
3.9.3. SDS Protein-Gelelektrophorese 25
3.9.4. Semitrockener Proteintransfer 27
3.9.5. Immunoblot-Analyse 27
5.1.1. Quantifizierung der Signalintensitäten von Immunoblot-
Analysen 28
3.10. Transfektion und PKC-Aktivitätsbestimmung 29
3.11. Untersuchung der intrazellulären Signaltransduktion mittels
des dualen Luciferase-Assays 31
3.12. Statistische Auswertung 32
4. Ergebnisse
4.1. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 33
4.1.1. Amplifikation der PKC-cDNA-Fragmente 34
4.1.2. Subklonierung des MER 36
4.1.3. Durchführung eines partiellen Verdaus für die PKCα 38
4.1.4. Subklonierung für das pcDNA/PKC-Konstrukt 39
4.1.5. Fusion der pcDNA/PKC-Konstrukte mit der MER-cDNA und 39
abschließende Restriktionsüberprüfung
5.1. Immunoblot-Analysen zum Nachweis der Expression der
PKC-Fusionsproteine 41
4.3. Nachweis der Aktivität der PKC-Fusionsproteine in vitro 43
5.1. Reportergen-Untersuchungen mit dem dualen Luciferase-Assay
zum Nachweis der Funktionalität der PKC-Fusionsproteine 46
4.4.1. Untersuchung von Elk1-abhängiger Luciferase-Genexpression
durch die PKC-Fusionsproteine 46
4.4.2. Einsatz der MEK-Inhibitoren PD98059 und U0126 50
5. Diskussion
3
5.1. Ziel der Arbeit 53
5.2. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 53
5.3. Nachweis der Expression der Fusionsproteine 54
5.4. Bedeutung von PKC-Bindeproteinen
55
5.5. Nachweis der Enzymaktivität der Fusionsproteine 55
5.6. Regulation der PKC durch Phosphorylierung 56
5.7. Regulation der PKC durch Proteasen 57
5.8. Untersuchung der Funktionalität der Fusionsproteine 58
5.9. PKC und der MAPK-Signaltransduktionsweg 59
5.10. Bedeutung von unterschiedlich hohen Aktivitäten von
PKC-Isoenzymen 61
5.11. Weitergehende Untersuchungsmöglichkeiten unter
Verwendung der etablierten Fusionsproteine 62
5.12. Klinische Bedeutung der PKC 63
5.13. Fazit 64
6. Zusammenfassung 65
7. Literaturverzeichnis 67
8. Danksagungen 80
9. Lebenslauf 81
4
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
abs. absolut
Ac Acetat
AKAP Proteinkinase A Ankerproteine
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
cDNA komplemetäre DNA
CIAP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
CMV Cytomegalievirus
cpm gezählte radioaktive Zerfälle pro Minute
CTP Cytidintriphosphat
DMEM Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Natriumsalz
EGTA Ethylen-Glykol-bis-(β-Amino-Ethyl-Ether)-N-N’-Tetraessigsäure
ER Östrogenrezeptor
ERK extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase
EtOH Ethanol
FKS fötales Kälberserum
g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
GTP Guanosintriphosphat
h / min / sec Stunde / Minute / Sekunde
kb Kilobasenpaare
KDa Kilodalton
LPS Lipopolysacharide
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MAPKK MAPK Kinase
5
MAPKKK MAPK Kinase Kinase
MEK MAPK/ERK Kinase
MEKK MEK Kinase
MER mutierter Östrogenrezeptor
NaAc Natriumacetat
nm / ng nanomolar / nanogramm
NTP Ribonukleotide (ATP, CTP, GTP, UTP)
4-OHT 4-Hydroxytamoxifen
PAA Polyacrylamid
PKC Proteinkinase C
PKM Ca2+/Phospholipid-unabhängige Form der PKC, die dem
katalytischen Fragment entspricht
RACK Rezeptor für akivierte Kinase
RICK Rezeptor für inaktivierte Kinase
RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
STICK PKC Substrate, die mit der PKC interagieren
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TAM 4-Hydroxy-Tamoxifen
TCA Trichloressigsäure
TE Tris-EDTA
TEMED N,N,N’,N’Tetramethylethylendiamin
TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Enzymeinheit
ü.N. über Nacht
UTP Uridintriphosphat
vs. versus
% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtsprozent
Zahl´ Anzahl in Minuten
Zahl´´ Anzahl in Sekunden
6
1. Einleitung
1.1. Signalkaskaden
Endokrine Erkrankungen hängen oft von veränderten Hormonspiegeln, oxidativen
und metabolischen Vorgängen sowie Veränderungen in der Lipidzusammensetzung
ab, die sich meist in Differenzierungs- und Wachstumsvorgängen sowie in der
Aktivität von Ionenkanälen zeigen (Huang, 1989). Extrazelluläre Signale werden
nach Aktivierung eines Rezeptors über unterschiedliche Signalkaskaden, meist über
sogenannte „second messenger“, zum Zytoplasma oder Zellkern weitergeleitet (Hug
und Sarre, 1993). Hydrophobe Liganden können dabei durch die Zellmembran
diffundieren und nach Bindung an einen intrazellulären Rezeptor direkt die
Transkription aktivieren. Hydrophile Liganden aktivieren meist zelluläre
Oberflächenrezeptoren, die dann ihrerseits entweder direkt oder über sogenannte
„Transducer“ (z.B. G-Proteine) einen Effektor stimulieren. Dieser kann dann über
Verteilungsveränderungen von „second messengern“ Zielproteine aktivieren, die als
solches oder über weitere Zielproteine die Genexpression auf der Ebene der
Transkription oder Translation verändern können (Hug und Sarre, 1993). Ein
wichtiger Signaltransduktionsweg läuft über den 7fach Transmembranrezeptortyp, an
den nach Bindung eines Liganden ein trimeres G-Protein des Subtyps q koppelt und
so die Phospholipase C-β aktiviert. Diese ist ein Phosphoinositid-spezifisches
Enzym, das zur Bildung der „second messenger“ sn-1,2-Diacylglycerin (DAG) und
1,4,5-myo-Inositoltriphosphat (IP3) aus zellulärem Phosphatidylinositol-4,5-
bisphosphat führt. Des weiteren kann DAG auch aus zellulärem Phosphatidylcholin
ohne IP3-Entstehung nach Aktivierung einer Phospholipase D und einer Phosphatase
entstehen (Huang, 1989). Durch IP3 wird Ca2+ aus dem endoplasmatischen
Retikulum freigesetzt und DAG führt zu Veränderungen der Genexpression im
Nukleus. In vielen Fällen ist die Proteinkinase C (PKC) das erste Zielprotein, das von
den „second messengern“ aktiviert wird und spielt deshalb eine zentrale Rolle bei der
Signalübertragung. Durch die Tatsache, dass sie ein direktes Rezeptor-Protein von
Phorbolestern darstellt, die bekannt dafür sind, dass sie eine Rolle bei der Förderung
der Proliferation und Differenzierung von onkogen transformierten Zellen in vivo
und in vitro spielt, wurde sie auch als ein Schlüsselenzym in der Signaltransduktion
bezeichnet (Niedel et al., 1983).
7
1.2. Charakterisierung der Proteinkinase C
Entdeckt wurde die PKC von Nishizuka als eine Histon-Proteinkinase aus
Rattenhirn, die durch limitierte Proteolyse (Inuoe et al., 1977), Ca2+ und (Phospho-)
Lipide (Takai et al., 1979) oder Phorbolester und Phospholipide (Castagna et al.,
1982) aktiviert werden konnte. Zu den Lipiden zählen DAG (physiologisch), aber
auch freie cis-ungesättige Fettsäuren, Lipoxan A oder Arachidonsäure (Hug and
Sarre, 1993). Weitere Untersuchungen zeigten, dass es sich bei der PKC um eine
Serin/Threonin-Kinase handelt, die zur Phosphorylierung von Zytoskelett- und
Kanalproteinen (Huang, 1989) und von Proteinen der Signaltransduktion (Kolch et
al., 1993) führt.
Die PKC umfasst eine Familie von 11 Mitgliedern, die in die drei Untergruppen der
klassischen, neuen und atypischen PKC-Isoenzyme eingeteilt werden können. Die
klassischen PKCs (cPKCs) α, βI, βII und γ benötigen für ihre Aktivierung negativ
geladene Phospholipide, DAG oder Phorbolester und Ca2+, die neuen PKCs (nPKCs)
δ, ε, θ, η/L (Maus/Mensch) und µ negativ geladene Phospholipide, DAG oder
Phorbolester, aber kein Ca2+ und die atypischen PKCs (aPKCs) λ/t (Maus/Mensch)
und ζ sind nur noch abhängig von negativ geladenen Phospholipiden (Hug und Sarre,
1993).
1.3. Struktur der Proteinkinase C
Vergleicht man nun die Aminosäure-Sequenzen der verschiedenen PKC-Isoenzyme
so fällt auf, dass bestimmt Sequenzen weitgehend konserviert sind, was auf eine
funktionsgebende Rolle hindeutet. So findet man in allen PKCs fünf variable
Regionen (V1-V5), die sich mit vier konstanten Regionen (C1-C4) abwechseln (Hug
and Sarre, 1993). Die C-terminale Region C3-V5 wird in allen PKCs als katalytische
Domäne bezeichnet, die durch die V3-Region („Hinge“-Region) von der
N-terminalen Regulationsdomäne getrennt wird. Zu Beginn der C1-Region befindet
sich die Konsensussequenz xRxxS/TsRs, die man auch in vielen
Phosphorylierungssubstraten der PKCs finden kann. Allerdings ist in der
Aminosäuresequenz der PKC-Isoenzyme das Serin oder Threonin durch ein Alanin
ersetzt, das nicht phosphoryliert werden kann, so dass eine Pseudosubstratsequenz
(fehlt bei PKC µ) entsteht, die vermutlich autoregulatorische Fähigkeiten durch
8
Blockade der Substratbinderegion besitzt (Hug and Sarre, 1993).
Pseudosubstratpeptide können daher als effektive Inhibitoren der PKC-Isoenzyme
sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt werden (Eicholtz et al.,1990). Die
C1-Domäne, die als Phorbolester- und DAG-Binderegion bezeichnet wird, enthält
eine Cystein-reiche Region mit zwei Zinkfinger-Domänen (in den cPKCs und
nPKCs), die einem DNA-Bindemotiv entsprechen, dass man auch in
Transkriptionsfaktoren wie GAL4 (Pan und Coleman, 1990) wiederfindet. Die
aPKCs enthalten nur eine Zinkfingerdomäne, was zu einer fehlenden Aktivierbarkeit
durch DAG führt. Die C2-Region, eine Ca2+-Bindedomäne, findet sich nur bei den
cPKCs und fehlt bei den nPKCs und den aPKCs, was sie in ihrer Aktivierung
unabhängig von Ca2+ macht. Die V3- oder „Hinge“-Region trennt die regulatorische
von der katalytischen Domäne und ist zuständig für die proteolytische Spaltung
durch Trypsin oder die Ca2+-abhängigen neutralen Proteasen Calpain I und II, die zu
konstitutiv aktiven Kinasen führen (Kishimoto et al., 1989). Die C3-Region in der
katalytischen Domäne beinhaltet das ATP-Bindemotiv xGxG2Gx16Kx, das bei allen
PKCs erhalten ist, außer bei der PKC ζ, bei der ein Glycin durch ein Alanin ersetzt
ist. Die C4-Region besteht aus der Substrat-Bindestelle und der
Phosphat-Transferregion. Letztere ist bei allen PKCs gut konserviert und enthält die
Sequenz DFG (außer bei der PKC ζ, bei der das Phenylalanin durch ein Tyrosin
ersetzt ist). Der Asparagin-Rest wird für den Transfer der Phosphatgruppen auf das
Substrat postuliert. Bei allen PKCs wird die ATP-Binderegion von der
Phosphat-Transferregion durch einen konservierten Abstand an Aminosäuren
getrennt (Hug and Sarre, 1993).
1.4. Die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)- Signalkaskade
Die einzelnen PKC-Isoenzyme zeigen eine unterschiedliche Verteilung im Gewebe;
sie reagieren auf die vielen Lipidmetaboliten jeweils anders, interagieren mit
unterschiedlichen Proteinen und phosphorylieren verschiedene Substrate. Mitogen-
aktivierte Proteinkinase (MAPK)- oder extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase
(ERK)-Kaskaden finden sich in allen Eukaryonten und spielen eine Rolle bei fast
allen Signaltransduktionswegen, die von Rezeptoren an der Zellmembran ausgehen
(Wilsbacher et al., 1999). Der MAPK Weg wird durch eine Vielzahl von Faktoren
aktiviert. Dazu zählen unter anderem Wachstumsfaktoren, Zytokine,
9
Hitzeschockproteine, UV-Licht, Mitogene, Hyperosmolarität, LPS, Phorbolester,
Entzündungsmediatoren und Oxidantien (Denhardt, 1996; Wilsbacher et al., 1999;
Poynter et al., 1999). Diese führen durch Aktivierung zu einer gesteigerten
Transkription von Genen, die ihrerseits zu einer Phosphorylierung von nukleären und
zytoplasmatischen Proteinen führen. Hieraus resultieren verschiedene Effekte, die
wichtig sind für das (Über-) Leben der Zelle wie Proliferation, Differenzierung,
metabolische Regulationen, Wachstumshemmung, Vesikeltransport, Stress-
reaktionen, Mitose, Transformation, Apoptose und Entzündungsreaktionen
(Denhardt, 1996; Poynter et al., 1999). Zu der Superfamilie der MAPK-Kaskaden
gehört die extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase (ERK) (Gutkind, 2000). Die
klassische MAPK-Kaskade besteht aus einer Kinasen-Kaskade mit MAPK Kinase
Kinase (MAPKKK), MAPK Kinase (MAPKK) und MAPK (Vojtek und Cooper,
1995). Der ERK Weg wird über das GTP-Bindeprotein Ras aktiviert, das wiederum
die MAPKKK Raf aktiviert. Diese aktiviert die MAPKK MEK (MAPK/ERK
Kinase), die ihrerseits zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der MAPK ERK
führt. Diese transloziert in den Nukleus und transaktiviert Transkriptionsfaktoren, die
durch veränderte Genexpression zu den obengenannten Veränderungen führen
können (Tibbles and Woodgett, 1999). Die Rolle der PKC in Bezug auf den
MAPK-Weg liegt in ihrer Rolle als direkter Aktivator der Kaskade auf Ebene der
MAPKKK Raf und MEKK (Denhardt, 1996; Ijima et al., 2002).
1.5. Die klinische Bedeutung der Proteinkinase C
Im Verlauf der letzten Jahre wird auch die Rolle der PKC bei diabetischen
Folgeerkrankungen diskutiert. Am Modell von Mäusen wurde gezeigt, dass eine
Überexpression der PKCβ im Herzmuskel zu Herzinsuffizienz und Nekrose der
Zellen führt (Way, 2002). Auch die Aktivierung von PKCβ im Endothel diabetischer
Rattennieren wird postuliert, da sich durch Hemmung der PKCβ mit dem Hemmstoff
LY333531 die verschlechterte Filtrationsleistung der diabetischen Niere besserte
(Ishii et al., 1998). Der Einfluss der PKC bei der Retinopathie wird diskutiert, da die
Durchblutung im Auge auch PKCβ abhängig beeinflusst werden soll (Bursell, 1997;
Suzuma, 2002). Die genauere Funktion der einzelnen PKC-Isoenzme, ebenso die
Frage, welche Isoenzyme welchen Signalweg in der Zelle beeinflussen und so im
Zusammenhang mit den diabetischen Folgeveränderungen stehen, konnte bisher nur
10
teilweise geklärt werden. So ist beschrieben worden, dass die PKCα eine Rolle bei
Zell-zu-Zell-Kontakten und in der Suppression von Apoptose spielt, sowie zu einem
mehr oder weniger aggressiven Tumorphenotyp führte (Hofman, 1997). Eine
gesteigerte Expression der PKCβ1 zeigte eine Hemmung der Proliferation von
HT29-Koloncarcinomzellen und suppremierte die Tumorbildung (Goldstein et al.,
1995; Choi et al., 1990). Außerdem bewirkte die PKCβ1 den Verlust der
Bindungsabhängigkeit, steigert das Wachstum bezogen auf die Dichte und führt zu
einer Tumorformation von R6-Rattenfibroblasten in Nacktmäusen (Borner et al.,
1995). Auch eine Blockierung der Differenzierung und eine Verminderung der
Proliferation sind beschrieben (Sauma et al., 1996; Khuri et al., 1996). Die PKCδ
hingegen führt zu einer Verzögerung in der Entwicklung von präneoplastischen
Onkogenen (La Porta et al., 1995) und spielt im Zusammenhang mit Proteasen eine
Rolle bei der Induktion der Apoptose (Anantharam et al., 2003).
Zur weiteren Charakterisierung der zellulären Funktionen der PKC-Isoenzyme
wurden für diese Arbeit drei 4-OHT-induzierbare PKC-Fusionsproteine hergestellt,
die es ermöglichen sollen, jedes Isoenzym gezielt anschalten zu können, um so
Isoenzym-spezifische Wirkungen zu messen. Dafür wurden die cDNAs der
katalytischen Domäne der PKCα, PKCβ1 und der PKCδ mit der des mutierten
Östrogenrezeptors (MER) fusioniert.
1.6. Der Östrogenrezeptor
Der Östrogenrezeptor (ER) gehört zur Superfamilie der Steroidhormon-Rezeptoren.
Diese stellen intrazelluläre Transkriptionsfaktoren dar, die in einer inaktiven
Apoproteinform entweder im Zytoplasma oder im Nukleus vorhanden sind. Nach
Bindung an den jeweils zugehörigen Hormonliganden wird der Rezeptor aktiviert
und kann an ein DNA-Element (Hormone response element) binden und die
Transkription von cis-verbundenen Genen steuern. Steroidhormone können auch die
Genexpression durch Einflussnahme auf die mRNA-Stabilität und die
Translationseffizienz regulieren. Ein Steroidhormonrezeptor besteht aus 6
funktionalen Domänen. N-terminal liegt die variable A/B-Domäne, die für die
Transaktivierung und die Spezifität der Rezeptor-Isoformen, die das gleiche
Antwortelement erkennen, zuständig ist. Die C-Domäne enthält 2 Typ II Zinkfinger,
die für die DNA-Erkennung und Dimerisierung zuständig sind. Als nächstes folgt die
11
variable D-Domäne, die für Konformationsänderungen ausschlaggebend ist und
häufig die Signalsequenzen zur nukleären Lokalisation und eine Transaktivierungs-
Domäne enthält. Auf die D-Domäne folgt die E-Domäne oder auch
Hormonbindedomäne genannt, die aus einem funktionellen Komplex besteht. Sie
enthält meist wichtige Regionen für die Assoziation mit Hitzeschockproteinen,
Dimerisierung, nukleäre Lokalisation, Transaktivierung, „intermolecular silencing“,
„intermolecular repression“ und die Ligandenbindung. Abschließend folgt die F-
Domäne, der noch keine spezifischen Funktionen zugeordnet werden konnten (Tsai
and O’Malley, 1994).
Bisher konnten verschiedene Transkriptionsfaktoren und auch die Kinasen c-Abl und
Raf1 mit der Hormonbindedomäne des Östrogenrezeptors (ER) fusioniert werden.
Nach Ligandenbindung wird der inaktive Rezeptor, der u.a. einen Komplex mit
Hitzeschockproteinen bildet freigesetzt und kann zu Transaktivierung der
Fusionsproteine führen (Littlewood et al., 1995). Allerdings besitzt der ER eine
eigene Liganden-abhängige Transaktivierungsaktivität, das die gesamte
Transkriptionsaktivität eines ER-Fusionsproteins beeinflussen kann. Weiterhin
werden in den meisten in vitro Experimenten Zellmedien verwenden, die Phenolrot
enthalten, einen schwachen Agonisten des ER.
1.7. Der mutierte Östrogenrezeptor
Um diese Problematik zu umgehen haben Littlewood et al. (1995) einen mutierten
Östrogenrezeptor (MER) hergestellt. Für die Konstruktion des MER haben sie das c-
terminalen Ende des humanen c-Myc-Proteins mit der Hormonbindedomäne des
mutierten Östrogenrezeptors, bei dem an der Position 525 durch eine Punktmutation
die Aminosäure Glycin durch ein Arginin ersetzt wird, fusioniert. Der so
entstandenen 4-Hydroxytamoxifen-abhängige MER hat gegenüber dem Wildtyp ER
verschiedene Vorteile. Zum einen bindet er spezifisch 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)
im nanomolaren Bereich und ist für 17β-Östradiol um den Faktor 1000 insensitiver
(Littlewood et al., 1995). Östrogen in physiologischen Mengen aktiviert den MER
daher nicht. Desweiteren führt 4-OHT nicht zu einer Stimulation der
Transaktivierungsakivität im MER (Danielian et al., 1993). Außerdem können für
Zellkultur-Experimente normale Zellkulturmedien mit Kälberserum genutzt werden,
ohne mit einer Aktivierung des MER zu rechnen. Die 4-OHT-Bindung kann über
12
Konformationsveränderungen zur Aktivierung des entsprechenden PKC-Isoenzyms
führen. Auf diese Weise spezifisch aktiviert, können zelluläre Effekte der PKC
gemessen werden.
1.8. Ziel der Arbeit
Die Etablierung der 4-OHT-induzierbare PKC-Fusionsproteine, die eine Induktion
der PKC-Aktivität eines bereits exprimierten Enzyms erlauben, wird in dieser Arbeit
durch den Nachweis der Expression, die Messung der Enzymaktivität und die
Überprüfung der Funktionalität der Konstrukte dargestellt.
13
2. Materialien
Herkunft verwendeter Chemikalien:
Arcrylamid Merck, Darmstadt
Agarose Invitrogen, Karlsruhe
Ammoniumperoxidsulfat Sigma, Taufkirchen
Ampicillin Sigma, Taufkirchen
Aprotinin Roche, Mannheim
Bactoagar Invitrogen, Karlsruhe
BCIP Sigma, Taufkirchen
Bisacrylamid Sigma, Taufkirchen
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
Caseinhydrolysat (Pepton Nr. 140) Invitrogen, Karlsruhe
Coomassie Brilliant Blue G-250 Serva, Heidelberg
Desoxynukleotide Roche, Mannheim
Didesoxynukleotide Pharmacia, Freiburg
DMSO Merck, Darmstadt
DTT Sigma, Taufkirchen
Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen
GF109203X Calbiochem, Bad Soden
Glutamin Sigma, Taufkirchen
Glycin Merck, Darmstadt
Hefe-Extrakt Invitrogen, Karlsruhe
8-Hydrochinolin Serva, Heidelberg
Leupeptin Roche, Mannheim
2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
Microcystin Calbiochem, Bad Soden
Nonidet-P-40 Sigma, Taufkirchen
PD 98059 Calbiochem, Bad Soden
Protein-Molekulargewichtstandard,
vorgefärbt Sigma, Taufkirchen
PVDF-Membran Millipore, Eschborn
Radioaktiv markierte Nukleotide NEN, Dreieich
14
Ribonukleotide Roche, Mannheim
Rinderserumalbumin, Fraktion V Sigma, Taufkirchen
Saccharose Merck, Darmstadt
TEMED Sigma, Taufkirchen
TPA Calbiochem, Bad Soden
U0126 Calbiochem, Bad Soden
Xylencyanol Merck, Darmstadt
Zellkulturmedien Invitrogen, Karlsruhe
Nicht gesondert aufgeführte Chemikalien stammten von der Firma Merck oder
Sigma, andernfalls ist die Firma im Text erwähnt.
Enzyme, Nukleinsäuren und Antikörper:
Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
(EC 3.1.3.1) Roche, Mannheim
PKCα-Antikörper Roche, Mannheim
PKCβ1-Antikörper Santa Cruz, USA
PKCδ-Antikörper Calbiochem, Bad Soden
DNA-Molekulargewichtsstandards Roche, Mannheim
Invitrogen, Karlsruhe
Lysozym (EC 3.2.1.17) Roche, Mannheim
Plasmid (pcDNA3.1HisB) Invitrogen, Karlsruhe
Restriktionsendonukleasen Roche, Mannheim
Pfu Turbo DNA Polymerase Stratagene, USA
T4-DNA-Ligase (EC 6.5.1.1) Roche, Mannheim
PathDetect Luciferase-Reportergensystem Stratagene, USA
PCR-Product Purification Kit Roche, Mannheim
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega, Mannheim
15
3. Experimentelle Methoden
3.1. Bakterienpräparation
Zur Transformation von Plasmid-DNA und ihrer Vermehrung wurde der
Bakterienstamm DH5α (Hanahan, 1983) verwendet, ein Derivat des Stammes E. coli
K12.
3.1.1. Herstellung kompetenter Bakterien mit der CaCl2-Methode
Zu Beginn der Herstellung kompetenter Bakterien (Sambrook, et al., 1989) wurden die
Gefäße gründlich gespült, um mögliche Detergenzienrückstände restlos zu entfernen.
Sämtliche Schritte erfolgten unter sterilen Bedingungen mit autoklaviertem Material.
Ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium wurde mit Bakterien beimpft, die zuvor bei
–70 °C in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glycerin aufbewahrt worden waren. Bei 37 °C
wuchsen die Bakterien ü.N. und dienten dem Animpfen von 500 ml LB-Medium. Nach
Erreichen einer optischen Dichte von 0,3 bis 0,5 bei 600 nm erfolgte eine weitere
Aufarbeitung der Bakteriensuspension auf Eis.
Nach Zentrifugation (4500·g, 10´) wurde das Bakteriensediment in der Hälfte des
Ausgangsvolumens (250 ml) der Bakteriensuspension einer kalten 100 mM CaCl2–
Lösung resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (4500·g, 10´) wurden die Bakterien
in 1/40 des Ausgangsvolumens einer 100 mM CaCl2–Lösung resuspendiert, 1 h auf Eis
gestellt und anschließend bis zu einer Endkonzentration von 15 % (v/v) mit Glycerin
versetzt. Aliquots von 200 µl wurden auf flüssigem Stickstoff schockgefroren und
konnte so bis zu mehreren Monaten bei –70 °C gelagert werden. Die so hergestellten
kompetenten Bakterien waren ausreichend für die Transformation von Plasmid-DNA
einer Ligation mit stumpfen und versetzten DNA-Enden.
LB-Medium
10 g/l Casein Hydrosylat mit NaOH pH 7 einstellen,
5 g/l Hefe-Extrakt 20´ autoklavieren
10 g/l NaCl
16
3.1.2. Transformation kompetenter Bakterien
Zur Transformation (Sambrook et al.,1989) wurden 200 µl auf Eis aufgetaute Bakterien
mit der Hälfte eines Ligationsansatzes 30´ auf Eis und danach 90´´ bei 42 °C inkubiert.
Es wurden 500 µl steriles LB-Medium hinzugegeben und die Bakterien wuchsen dann
bei 37 °C 15´ lang, um den Beginn der β-Laktamase-Produktion der Bakterien mit
aufgenommenem Resistenzplasmid zu sichern. Zum Schluss wurden 200 – 300 µl
dieser Bakterienlösung auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert. Entsprechend der
Resistenz der Bakterien enthielten die Platten Ampicillin und wurden bei 37° ü.N.
gelagert, bis Kolonien einzelner Bakterien entstanden sind.
3.2. Plasmid-Präparation
3.2.1. Plasmid-Präparation im analytischen Maßstab
Diese Methode diente zur Anreicherung von Plasmid-DNA für die Überprüfung eines
Subklons mittels einer Restriktion oder für eine Sequenzierungsreaktion und wurde
nach Birnboim und Doly durchgeführt (Birnboim und Doly 1979).
Mit einer Bakterienkolonie einer entsprechend selektiven LB-Ampicillin-Platte wurde 5
ml steriles LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin angeimpft und bei 37 °C und 180 rpm
mindestens 12 h im Warmluftschüttler inkubiert. 3 ml dieser Vorkultur wurden
sedimentiert (10000·g, 1´, RT), in 100 µl Lösung I sofort resuspendiert und in 200 µl
frisch angesetzter Lösung II vorsichtig homogenisiert, bis durch die vollständige
Bakterienlyse eine klare Lösung entstand. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde
das Gemisch kräftig geschüttelt und kam für 5´ auf Eis, so dass sich Kalium- und SDS-
Aggregationen bildeten, die den Großteil der bakteriellen Proteine und chromosomalen
DNA enthielt. Danach wurde zentrifugiert (12000·g, 8´, RT) und man erhielt einen
wässrigen Überstand, der mit Phenol-CHCl3 extrahiert, mit Ethanol abs. in 2,5-facher
Menge vermischt und 5´ bei RT gefällt wurde. Nach Zentrifugation (12000·g, 15´, RT)
und Waschen des Sediments in 75 % Ethanol wurde das Ethanol nach abschließender
Zentrifugation komplett verworfen, das Sediment 5´ an der Luft getrocknet und in 20 µl
H2O aufgenommen. Es wurde ca. 4 µg Plasmid-DNA gewonnen.
17
Lösung I Lösung II Lösung III
50 mM Glucose 0,2 N NaOH 3 M KAc, pH 5,5
25 mM Tris-HCL, pH 7,9 1 % SDS
10 mM EDTA
3.2.2. Plasmid-Präparation im großen Maßstab
Diese Methode diente der Subklonierung von DNA-Fragmenten, Transkriptionen in
vitro und Sequenzierungsreaktionen.
Hierzu wurde 500 ml steriles LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 ml der
gewünschten Bakterienkultur (Herstellung s. 3.1.1.) versetzt und ü.N. bei 37 °C im
Warmluftschüttler inkubiert. Analog zu 3.1.1 erfolgte eine Aufarbeitung der Bakterien.
Es wurde 10´ mit 10 ml Lösung I, 15´ mit 20 ml Lösung II und 15´ mit 40 ml Lösung III
inkubiert. Danach wurde 1 h bei –20 °C mit dem 0,6fachen Volumen der wässerigen
Phase mit 2-Propanol abs. gefällt. Nach anschließender Zentrifugation (10000·g, 20´,
4 °C) wurde das Sediment in 8 ml TE mit 2g festem NH4Ac gelöst. Es folgte eine
Inkubation von 20´ auf Eis, währenddessen ein Großteil der RNA und Proteine
ausfallen und danach abzentrifugiert (16300·g, 15´, 4 °C) werden konnten. Der
Überstand wurde mit dem 2,5-fachem Volumen Ethanol abs. versetzt und nach
Lagerung ü.N. bei –20 °C abzentrifugiert (12000·g, 15´, 4 °C). Das Sediment wurde mit
500 µl 70 %igem Ethanol versetzt und nach Zentrifugation getrocknet. Nach einer
CsCl2-Dichtegradientenzentrifugation ü.N. bei 100000·g bei 20 °C wurde die untere
Bande abgenommen und der Schritt wiederholt. Danach folgte eine Dialyse gegen
1x TE für 1 h. Zu 1/10 des TE-Volumens wurde 3M NaAc (pH: 5,2) und die 2,5-fache
Menge an Ethanol abs. hinzugegeben und ü.N. bei –20 °C gelagert. Nach Zentrifugation
(10000 rpm, 15´, 4 °C) wurde das Sediment mit 2 ml 70 % Ethanol versetzt, erneut
zentrifugiert, für 15´ getrocknet in 300 µl H2O aufgenommen und enthielt ca. 1000 µg
Plasmid-DNA.
18
3.3. Reaktionen zur Subklonierung von DNA-Fragmenten
3.3.1. Restriktion von DNA-Molekülen
Entsprechend der Angaben des jeweiligen Enzym-Herstellers wurden die Bedingungen
zur Plasmid-DNA-Restriktion gewählt. Dabei wurde darauf geachtet, die
Glycerinkonzentration im Restriktionsansatz nie höher als 10 % (v/v) und das
Ansatzvolumen nicht größer als 70 µl zu wählen. Die Inkubationszeit betrug in der
Regel 1 h bei 37 °C.
Die Analyse der restringierten DNA erfolgte entweder auf einem Agarosegel oder mit
der Phenol-CHCl3-Extraktion, um weitere Modifikationen der DNA vornehmen zu
können.
3.3.2. Dephosphorylierung von DNA am 5`Ende
Um nach einer Transfektion die Anzahl der Hintergrundkolonien durch Bakterien, die
nicht den gewünschten Vektor aufgenommen haben, zu reduzieren, wurde der
Restriktionsansatz mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIAP) behandelt
und so eine Religation drastisch vermindert. Die Ligation von DNA-Fragmenten mit
und ohne endständige Phosphatgruppen war jedoch weiterhin möglich. Die verwendete
Fragmentlänge musste nur größer als 150 bp sein. Die Dephosphorylierungsreaktion
wurde im mit Phosphatasepuffer aufgefüllten Restriktionsansatz oder mit in direkt in
Phosphatasepuffer aufgenommener DNA, die mit Phenol-CHCl3 extrahiert und gefällt
worden war, 1 h bei 37 °C durchgeführt. Abgeschlossen wurde die Reaktion durch
Auftrennung der Plasmid-DNA und Wiedergewinnung aus einem Agarosegel oder
durch dreimaliges Extrahieren mit Phenol- CHCl3.
Phosphatase-Puffer
50 mM Tris-HCl, pH 9,0
0,1 mM EDTA
19
3.3.3. Partieller Verdau für die Restriktion der PKCα
Da die PKCα für das Restriktionsenzym BamHI zwei Schnittstellen vorwies, mußte bei
der Restriktion ein partieller Verdau angewendet werden. Dafür wurde mit einem
BamHI-Gemisch gearbeitet. Die restringierten Proben wurden auf einem Agarosegel
auf ihre Länge hin überprüft. Da das benötigte Fragment eine Länge von 1409 bp
vorwies, wurde die längere der beiden Banden des 0,8 µl-BamHI-Gemisches aus dem
Agarosegel hinausgeschnitten und analog zu 3.8.2 mit Hilfe eines Reagenziensatzes zur
DNA-Reinigung aufbereitet.
Ansatz für den partiellen Verdau
4,9 µl PCR-PKCα
1,0 µl Puffer B
3,3 µl H2O
0,8 µl Asp718I
+ jeweils 0,8 µl/ 1,8 µl/ 2,8 µl/ 3,8 µl BamHI-Gemisch
ad 15 µl H2O -Puffer-Gemisch
BamHI-Gemisch H2O-Puffer B-Gemisch
1,5 µl BamHI (10 U/µl) 2 µl Puffer B
1,5 µl Puffer B 18 µl H2O
12 µl H2O
3.3.4. Ligation
Zur Ligation mit der T4 DNA-Ligase wurden 100 ng Vektor-DNA mit stumpfen oder
5’-überhängenden Enden in einem molaren Verhältnis von Vektor- zu Fragment-DNA
von ca. 1:2 oder 1:1 eingesetzt (Winnacker, 1985). Bei Restriktion mit zwei
verschiedenen Enzymen wurde das Verhältnis 1:2 gewählt, bei Einsatz des gleichen
Enzyms oder Fragmenten mit stumpfen Enden das Verhältnis 1:1. Die Ligation erfolgte
im 20 µl-Ansatz ü.N. bei 16 °C.
20
Ligationsansatz Ligationspuffer (10x)
~ 1:2/1:1 Vektor- :Fragment-DNA 660 mM Tris-HCl, pH 7,4
2 µl Ligationspuffer (10x) 50 mM MgCl2
1 µl T4 DNA-Ligase 100 mM DTT
ad 20 µl H2O 10 mM ATP
Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde direkt zur Transformation eingesetzt und der
übrige Ansatz bei –20 °C gelagert.
3.4. DNA-Sequenzierung im Prism Big-Dye Terminator
Für die DNA-Sequenzierungsreaktion wurden 8 µl Sequenzierungs-Mix mit 0,5 – 1 µg
zu analysierender DNA und 3,2 pmol des entsprechenden Oligonukleotides (Invitrogen,
Karlsruhe) versetzt und ad 20 µl mit A. bidest aufgefüllt. Es folgten 25 Zyklen einer
Inkubationsreaktion von 10´´ bei 96 °C, 5´´ bei 50 °C und 4´ bei 40 °C. Anschließend
wurden dem Gemisch 30 µl H2O, 5 µl 3 M NaAc (pH 5,2) und 125 µl EtOH abs.
hinzugefügt und es wurde bei RT für 15´ geschüttelt. Danach erfolgte eine
Zentrifugation mit 14000 rpm für 20´ bei RT. Der entstandene Überstand wurde
verworfen und das Sediment mit 250 µl 70 % EtOH gewaschen und 10´ bei 14000 rpm
bei RT zentrifugiert. Das Ethanol wurde verworfen und bis auf den letzten Tropfen
abgenommen und das Sediment für ca. 15´´ getrocknet, um es danach bei -20 °C zu
lagern.
Für die Sequenzanalyse wurde das Sediment in 20 µl Template Supression Reagenz
durch vortexen gut gelöst und anschließend bei 90 °C für 2´ inkubiert. Danach wurde
die Probe auf Eis abgekühlt, erneut gevortext, anzentrifugiert und bis zur Analyse auf
Eis gelagert. Für die Analyse wurden die Proben in 0,5 µl Sequenzierungs-
Eppendorfhütchen überführt, mit Septum verschlossen und in das Probentablett des
Sequenzierautomaten eingeordnet.
21
Verwendete Oligonukleotide:
1. ubeta266 5’ TGC CAC CAG AAG GAA GTG AG 3’
2. ubeta683 5’ TGT ATC ACA TCC AGC AAG TC 3’
3. ubeta1066 5’ AAC GTA GCC TAT CCC AAG TC 3’
4. lbeta771 5’ GGT AAA TGA TGC CCT TAC TC 3’
5. lbeta1145 5’ TTC AGG TCC ACA ACC CAG AC 3’
6. lMER1212 5’ CCA TCA TTG AGG CTT CAC TG 3’
3.5. Elektrophorese von DNA-Molekülen in Agarosegelen
Um ein DNA-Fragment zu gewinnen, die Fragmentlänge zu bestimmen oder zur
Überprüfung eines Restriktionsansatzes, wurde die DNA auf horizontalen Agarosegelen
aufgetrennt. Abhängig von der Länge des zu untersuchenden Fragmentes wurden 0,8 bis
2 % (w/v) Gele mit TAE (1x) als Laufpuffer gegossen und an eine Feldstärke von ca.
6 V/cm angeschlossen. Der Elektrophoresepuffer bestand aus TAE (1x) und 0,5 µg
Ethidiumbromid pro ml, damit die DNA-Banden unter UV-Licht sichtbar waren. Zur
Erhöhung der Lösungsdichte beim Auftragen in die Geltaschen wurden die DNA-
Proben mit DNA-Probenpuffer (1x) vermischt.
TAE-Puffer (50x) DNA-Probenpuffer (6x)
2 M Tris-Base 30 % (v/v) Glycerin
2 M Eisessig 0,25 % (w/v) Bromphenolblau
20 mM EDTA 0,25 % (w/v) Xylen-Cyanol
3.6. HEK293 Zellkultur
HEK293-Zellen dienten in dieser Arbeit zur Gewinnung von RNA und Proteinen.
HEK293-Zellen sind humane embryonale Nierenzellen. Sie lassen sich gut kultivieren,
zeigen ein schnelles und gleichmäßiges Wachstum und haben eine Transfektionsrate
von ca. 50 %.
Die Zellen wuchsen als Zellrasen in einer Zellkulturflasche bei 37 °C in einem
Wärmeschrank mit einer wassergesättigten Atmosphäre und 5 % (v/v) CO2 heran. Das
22
Medium bestand aus einer Mischung aus Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
(DMEM) und 10 % (v/v) fötalem Kälberserum, sowie Ampicillin und Streptomycin.
Bei 90prozentiger Konfluenz wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen in eine neue
Zellkulturflasche gesetzt. Dazu wurde das Medium verworfen und die Zellen mit
PBS (1x) mit 1 mM EDTA inkubiert bis sich die Zellen vom Boden ablösten. Die
Zellen wurden in wenigen ml Medium aufgenommen und einige Tropfen wurden in
eine neue Flasche mit 20 ml frischem Medium gegeben. Der Rest wurde verworfen.
3.7. Quantifizierung von HEK293-Zellen mit der Neubauer-Zählkammer und
Subkultivierung für die Experimente
Für den experimentellen Einsatz der HEK293-Zellen wurden analog zu 3.6. die Zellen
mit PBS (1x) mit 1 mM EDTA vom Boden der Zellkulturflaschen gelöst, in einigen
Millilitern Medium aufgenommen und in einem sterilen Gefäß sedimentiert (30·g, 3´,
RT). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 ml frischem Medium
aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer über
dem 4 mal 4 Quadrate umfassenden Feld ausgezählt. Die derart bestimmte Zellzahl
befand sich in einem Volumen von 0,1 µl, so dass die Gesamtzellzahl bestimmt werden
konnte.
Für die jeweiligen Experimente wurden Zellkulturplatten mit 6 Löchern verwendet, in
die pro Loch 500000 Zellen in einem Volumen von 1500 µl ausgesät wurden.
3.8. Durchführung einer PCR und Reinigung der Reaktionsprodukte
3.8.1. Polymerase-Kettenreaktion
Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden 10 pmol (für PKCα und β1) und 12,5
pmol (für PKCδ) 5´ und 3´ Oligonukleotide und 5 µl Pfu-Turbo-Taq-Polymerase (10x)
mit einer Zyklenzahl von 20 eingesetzt. Die Sequenz der verwendeten Oligonukleotide
(MWG-Biotech, Ebersberg) wurde mit dem Programm OLIGO 4.0 ausgewählt. Die
Länge der Oligonukleotide lag zwischen 18 und 22 Nukleotiden, die Hybridisierung
von 5’ mit 3’ Oligonukleotiden wurde auf höchstens 5 Nukleotide begrenzt, die
23
Differenz der Schmelztemperatur war nicht größer als 2 °C und die Schmelztemperatur
der Oligonukleotide überstieg 72 °C nicht. Die konstanten Bedingungen der
Reaktionszyklen waren wie folgt gewählt: Die Denaturierung erfolgte vor dem ersten
Zyklus 1´ lang bei 94 °C, dann immer 45´´ lang bei 94 °C. Die Hybridisierungsreaktion
fand 45´´ bei 50 °C und die Elongationsreaktion bei 72 °C und 3´ statt. Insgesamt
wurden 15 Zyklen wiederholt. Abschließend wurde die Reaktion 5´ bei 72 °C beendet.
Die Hybridisierungstemperatur und die Oligonukleotideigenschaften wurden mit Hilfe
des Programms OLIGO 4.0 ermittelt.
Von der so amplifizierten DNA wurden entweder 10 µl zur Überprüfung der Länge und
Qualität auf einem Agarosegel aufgetrennt und mittels eines PCR-Kits (s. unten)
gereinigt oder der Ansatz wurde mit Phenol-CHCl3 extrahiert, mit Ethanol gefällt und
gewaschen, in H2O aufgenommen und für eine Restriktion eingesetzt.
Ansatz einer PCR:
50 ng (PKCα und β1) bzw. 100 ng (PKCδ)
10 pmol (PKCα und β1) bzw. 12,5 pmol (PKCδ)
200 µM je dNTP (ATP, GTP, CTP, UTP)
5 µl Pfu-Turbo-Taq-10x-Puffer
0,5 µl Pfu-Turbo-Taq (10 U/ml)
ad 50 µl H2O
Oligonukleotide:
Für die PKCα:
5’ GCA GGT ACC CAA GAA TGA AAG CAA G 3’ 25mer
Asp718I PKC alpha
5’ TAA GGA TCC CGT ACT GCA CTC TGT AAG ATG GG 3’ 32mer
Bam HI PKC alpha
Für die PKCβ1:
5’ GCA GGT ACC CAA AAG TGA GAG CAA AC 3’ 26mer
Asp718I PKC beta 1
5’ TAA GGA TCC CGC ACA TTA ATG ACA AAC TCT GG 3’ 32mer
Bam HI PKC beta 1
24
Für die PKCδ:
5’ GCA GGT ACC CAT CAA CCA GAA GCT TTT G 3’ 28mer
Asp718I PKC delta
5’ TAA GGA TCC CGA TCT TCC AGG AGG TGC TC 3’ 29mer
BamHI PKC delta
3.8.2. Reinigung der PCR-Reaktionsprodukte
Die Reinigung erfolgte mit dem High Pure PCR-Product Purification Kit (Roche,
Mannheim). Pro 100 µl PCR-Reaktionsansatz wurden 500 µl Bindungspuffer
hinzugegeben und vermengt. Die Lösung wurde dann durch das in dem Auffanggefäß
eingesetzte Filtrationsgefäß pipettiert und bei 130000·g für 30´´ zentrifugiert. Der
Durchlauf wurde verworfen und zweimal mit Waschpuffer erneut bei 13000·g für 30´´
gewaschen (zuerst mit 500 µl, dann mit 200 µl). Nach Verwerfen des Auffanggefäßes
wurde das Filtrationsgefäß in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß eingesetzt und die
DNA mit 50 µl H2O eluiert. Nach Zentrifugation für 30´´ bei 13000·g wird der
Überstand in ein sauberes Eppendorfhütchen pipettiert und bei –20 °C gelagert.
3.9. Proteinanalyse
3.9.1. Proteinextraktion aus Zellen der Zellkultur
Zunächst wurde das Medium abgesaugt, kurz mit PBS (1x) gespült und mit einem
Schaber abgelöst. Die Zellen wurden pro Loch in 100 µl Homogenisationspuffer für die
zytosolische Fraktion aufgenommen, im Ultrazentrifugenröhrchen 2x 10´´ auf Eis mit
Ultraschall (25 W) zerkleinert und 30´ bei 100000·g und 4 °C zentrifugiert. Der
Überstand wurde in Eppendorfhütchen überführt und das Sediment mit 100 µl
Homogenisationspuffer für die Membranfraktion versetzt. Nach 10´´ Ultraschall bei 25
W auf Eis wurde der Rest in neue Eppendorfhütchen überführt.
25
Homogenisationspuffer (Zytosol) Homogenisationspuffer (Membran)
0,3 M Aprotinin (Sigma)
1 M PMSF in DMSO
100 µM Leupeptin
100 µM Pyrophosphat
0,1 % 2-Mercaptoethanol
0,5 mM DTT analog
+ 0,8 % (v/v) Nonidet-P-40
für 1 ml ad 1000 µl mit Basislösung auffüllen
Basislösung
20 mM Tris-HCl, pH:7,5; 0,23 M Saccharose; 10 mM EGTA; 2 mM EDTA
3.9.2. Proteinbestimmung nach Stoschek
Für die Proteinbestimmung wurde 1 µl der zu bestimmenden Proteinlösung der Zytosol-
oder der Membranfraktion (Stoschek, 1990) mit einem Reagenz aus 7 µl 10 M NaOH
mit 1 ml Coomassie Brilliant Blue G vermischt. Nach einer Inkubationszeit von
mindestens 5´ und maximal 15´ bei RT wurde die Extinktion in einer 2fach-
Bestimmung bei 595 nm bestimmt. Der Leerwert des Färbereagenz und des
Homogenisationspuffers (2fach-Bestimmung) wurde automatisch durch das Photometer
von den jeweiligen Messwerten abgezogen und diese dann mit einer Standardkurve
(3fach-Bestimmung) aus der Extinktion von 1 bis 20 µg bovinem Serumalbumin (BSA)
korreliert.
Coomassie Brilliant Blue G Reagenz
10 mg Coomassie Blue G
4,75 ml Ethanol abs.
ad 100 ml mit H2O auffüllen
3.9.3. SDS Protein-Gelelektrophorese
Für die Auftrennung der Proteinextrakte wurde unter denaturierenden Bedingungen ein
Acrylamid-Gel nach Laemmli (Laemmli, 1970) verwendet. Dieses bestand aus einem
26
Sammelgel, das eine genaue Konzentrierung der Proteine ermöglichte, und aus einem
Trenngel, das zu einer Auftrennung der Proteine proportional zum Logarithmus ihres
Molekulargewichts führte. Zur Abdichtung des Gelsystems wurde auf dem Boden
zwischen den Glas- und Aluminiumplatten ein Stopfgel und darüber dann luftblasenfrei
das Trenngel bis 7 mm unterhalb der Geltaschen gegossen und sofort mit 300 µl
Butanol (H2O gesättigt) überschichtet, so dass sich eine glatte Oberkante bilden konnte.
Nach Polymerisation wurde das Butanol durch Spülen mit Wasser verworfen und das
Sammelgel über das Trenngel gegossen und der Kamm eingeführt. Zur
Proteinauftrennung wurden bis zu 10 µl Extrakt auf Eis mit der gleichen Menge
Proteinprobenpuffer versetzt und nach einer Denaturierung bei 95 °C für 5´ neben 5 µl
eines vorgefärbten Proteingrößenstandards zur Bestimmung der Laufstrecke der
Proteine in die 5 mm x 7 mm großen Taschen des 0,75 mm dicken Gels gefüllt. Die
Proteine wurden in einem Glycerin und SDS-haltigen Proteingel-Laufpuffer bei 25 mA
für 1,5 h aufgetrennt.
Acrylamid-Stammlösung Protein-Probenpuffer (2x)
29,2 % (w/v) Acrylamid 7 M Harnstoff
0,8 % (w/v) Bisacrylamid 10 % (v/v) β-Mercaptoethanol
5 % (w/v) SDS
0,004% (w/v) Bromphenolblau
Proteingel-Laufpuffer (10x) Trenngel-Lösung
72 g Glycerin 2,25 ml H2O
15 g Tris-Base 2,50 ml 1,5 M Tris-HCl,pH:8,8
5 g SDS 2,67 ml Acrylamidstammlösung
ad 500 ml H2O pH: 8,6 50 µl 10 % (w/v) SDS
100 µl 10 % (w/v) APS
15 µl TEMED
Sammelgel-Lösung
2,78 ml H2O
1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, pH: 6,8
0,87 ml Acrylamidstammlösung
50 µl 10 % (w/v) SDS
50 µl 10 % (w/v) APS
10 µl TEMED
27
3.9.4. Semitrockener Proteintransfer
Nach der Elektrophorese in einem Acrylamidgel erfolgte der Transfer der Proteine nach
einem halbtrockenen Verfahren auf eine PVDF-Membran (Burnette, 1981). Durch eine
Methanolbehandlung für 5´´ wurde die PVDF-Membran aktiviert und anschließend 5´
lang gewässert. Der Transferaufbau setzte sich zusammen aus fünf Lagen in
Kathodenpuffer getränktem Whatmann 3 MM Papier, das auf eine Kohleplatte als
Kathode gelegt wurde. Das Whatmann Papier war an jeder Seite etwa 1 cm größer als
das Trenngel. Zunächst wurde die Laufstrecke des Größenstandards ausgemessen und
das Sammel- und Stopfgel abgetrennt. Nach Ablösen des Trenngels mit einem
trockenen Whatmann Papier von der Aluminiumplatte, wurde das Gel kurz in den
Kathodenpuffer und anschließend luftblasenfrei auf den vorbereiteten Papierstapel
gelegt. Die in Anodenpuffer 2 äquilibrierte PVDF-Membran wurde exakt auf das
Trenngel gelegt, so dass die Oberkanten miteinander abschlossen. Darüber geschichtet
wurden vier in Anodenpuffer 2 und zwei in Anodenpuffer 1 getränkte Lagen aus
Whatmann Papier und abschließend die Kohleplatte der Anode aufgelegt. Pro Gel
wurde der Proteintransfer bei einer Stromstärke von 100 mA für 30´ durchgeführt.
Danach konnte die PVDF-Membran für Immunoblot-Analysen verwendet werden.
Kathodenpuffer Anodenpuffer 1 Anodenpuffer 2
0,1 M Arginin 0,3 M Tris-Base 0,025 M Tris-Base
20 % Methanol 20 % Methanol
3.9.5. Immunoblot-Analyse
Die PVDF-Membran mit transferiertem Protein (s. 3.8.4.) wurde durch Inkubation in
Inkubationspuffer mit 1 % fettarmem Milchpulver für 30´ blockiert. Für die Antikörper
der PKCβ1 und PKCδ wurde ein Inkubationspuffer aus TBS mit 10 mM Tris (pH 8,0)
und für die Antikörper der PKCα wurde ein Inkubationspuffer aus TBS mit 50 mM Tris
(pH 7,5) verwendet. Die Blockierungslösung wurde einmal mit der Inkubationslösung
gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation der Antikörper der PKCβ1 und PKCδ
für 1,5 h bei Raumtemperatur und für die PKCα ü.N. bei 4 °C in 4 ml Inkubationspuffer
mit 0,5 % (w/v) fettarmem Milchpulver. Von dem PKCβ1-Antikörper wurde mit
0,23 µg pro ml Inkubationsansatz verwendet, das Antiserum der PKCδ auf 1:150
28
verdünnt und der PKCα-Antikörper wurde in einer Konzentration von 16 µg pro ml
eingesetzt. Anschließend wurde dreimal kurz mit Inkubationspuffer ohne Milchpulver
gespült und viermal 5´ lang gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit einer
Verdünnung von 1:5000 des mit Alkalischer Phosphatase gekoppelten Proteins A für
45´ bei Raumtemperatur in 10 ml des jeweils für den primären Antikörper geeigneten
Antikörper-Inkubationspuffers ohne Milchpulver. Nach dreimaligem kurzem Spülen
und viermaligem Waschen für 5´ erfolgte für jede Membran die Färbereaktion für die
Chemiluminiszenz der PKC-Banden mit Hilfe von Meerrettich-Peroxidase und ECL-
Reagenz (Amersham, Freiburg).
Antikörper-Inkubationspuffer Antikörper-Inkubationspuffer
für PKCβ1 und PKCδ für PKCα
10 mM Tris-HCl, pH 8,0 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
150 mM NaCl 150 mM NaCl
0,05 % (v/v) Tween 0,05 % (v/v) Tween
0,5 % (w/v) fettarmes Milchpulver 0,5 % (w/v) fettarmes Milchpulver
3.9.6. Quantifizierung der Signalintensität von Immunoblot-Analysen
Für die Quantifizierung der Signalintensität der Immunoblots (s. 3.8.5.) wurde ein
Laserdensitometer verwendet.
Durch die Intergration der Signalintensität über die Fläche der spezifischen Banden
erfolgte dann die Quantifizierung. Von diesem Messwert wurde der Wert für eine gleich
große Fläche außerhalb der Banden in derselben Analysespur als Hintergrund
abgezogen. Die zu vergleichenden PKC-Signale lagen immer auf derselben Membran.
Durch diese Methode wurde eine Linerarität von Proteinmengen zwischen 10 und 40 µg
zytosolischem oder aus der Membranfraktion extrahierten Proteine erreicht. Die
Sensitivität lag abhängig vom verwendeten Antikörper ca. zwischen 4 und 10 ng PKC-
Protein.
29
3.10. Transfektion und PKC-Aktivitätsbestimmung
Die Transfektion der Zellen erfolgte mit einer Transfektionslösung, bestehend aus dem
zu untersuchenden PKC-Konstrukt bzw. der pcDNA/MER-Kontrolle, die in 20 µl TE
(pH: 7,4) mit 50 µl 2,5 M CaCl2 und 450 µl H2O aufgefüllt wurden. Abschließend
wurden 500 µl 2x-BBS tropfenweise dazugegeben und durch Sprudeln vermischt. Nach
10´ wurde die Lösung auf Zellkulturplatten aufgetropft (s. 3.6.) und diese dann bei 37
°C im Wärmeschrank bei 3 % (v/v) Co2 ü.N. kultiviert.
Am nächsten Morgen wurde das Medium abgesaugt und die Löcher mit je 1,5 ml
3 %igem (v/v) DMEM mit je 0,02 % Ethanol bzw. 200 µmol/l 4-OHT aufgefüllt und
die Zellkulturplatten in den 5 % (v/v) CO2-haltigen Wärmeschrank gestellt. Nach ca. 5 h
erfolgte eine Behandlung der Zellen analog zu 3.9.1. zur Vorbereitung der
Proteinbestimmung nach Stoschek (s. 3.9.2.). Nach der Konzentrationsbestimmung
wurden die Proben der Zytosolfraktion (PKC bzw. Kontrolle, jeweils mit EtOH oder
OHT) auf 4 mit Z1-Z4 und 4 mit Z1´-Z4´ beschrifteten Eppendorfhütchen verteilt und
analog dazu die Proben der Membranfraktion mit M1-M4 bzw. M1´-M4´. Die mit Z1´-
Z4´und M1´-M4´ beschrifteten Hütchen wurden mit 2 mM 1:10 verdünnten
GF109203X vorinkubiert.
Als nächstes wurden der Kinasepuffer, der H-Puffer für das Zytosol und die Membran,
die Ac-MBP4-14-, GF109203X-, ATP-, PtdS- und PtdS/DAG-Lösungen hergestellt.
PtdS (Konzentration im Assay: 25 µg/µl) und PtdS/DAG (Konzentration im Assay: 2,5
µg/µl) wurden in Eppendorfhütchen pipettiert und unter wenig Druck mit Stickstoff
verdampft. Nach Auffüllen mit 400 µl Kinasepuffer erfolgte auf Eis eine Behandlung
mit Ultraschall für 30´´ (2x). Es zeigte sich eine Trübung der Lösung.
Anhand des Pipettierplans wurden nacheinander je 10 µl der einzelnen Lösungen
(Ac-MBP4-14, PtdS, PtdS/DAG, GF109203X und Kinase-Puffer) in Eppendorfhütchen
pipettiert. Die vorgegebene Eluatmenge wurde ad 10 µl mit Homogenisationspuffer
aufgefüllt. Zum Schluss wurde die berechnete Menge radioaktiven ATPs zum ATP-
Stock gegeben, jeweils 10 µl zu den Ansätzen gegeben und die Proben noch einmal
kurz anzentrifugiert.
Jeweils 20 Ansätze wurden im Thermomixer bei 30 °C kurz vorgewärmt und dann in
15´´ Abständen durch Zugabe von 0,5 µg-3 µg Eluat je nach Experiment gestartet. Nach
genau 5´ Inkubationszeit pro Ansatz wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 µl TCA
(25 %) gestoppt und die Ansätze wieder auf Eis gestellt.
30
Anschließend wurden 40 µl der Ansätze auf vorbereitete P81-Papierchen pipettiert und
nach mindestens 1´ in 75 mM H2PO4 getränkt und 5 x 5´ damit gewaschen. Die
Auswertung der Cerenkov-Strahlung erfolgte im Szintilationszähler.
Ac-MBP4-14 für 1 Ansatz in µl
1 mM MBP 1:6,66 1,5
4 % BSA 1:10 7,5
Kinasepuffer 7,5
Konzentration im Assay: 30 µM
GF109203X für 1 Ansatz in µl
2 mM GFX 1:5 vorverdünnt 0,125
0,4 mM GF109203X 1:80 9,875
Kinasepuffer
Konzentration im Assay: 2,5 µM
ATP für 1 Ansatz in µl
0,02 M ATP 1:40 0,25
32 gamma-ATP 1E6 cpm abhängig von Aktivität
Kinasepuffer ad 800 µl
Konzentration im Assay: 100 µM
Homogenisationspuffer
0,3 M Aprotinin (Sigma)
1 M PMSF in DMSO
100 µM Leupeptin
100 µM Pyrophosphat
0,1 % 2-Mercaptoethanol
0,5 mM DTT
3 µM Microcystin
200 µM Sodium-Ortho-Vanadat
31
Kinasepuffer
20 mM Tris-HCl (pH:7,5)
20 mM MgCl2
75 mM H2PO4
5,1 ml 80 % H2PO4
ad 1000 ml H2O
25 % TCA
3.11. Untersuchung der intrazellulären Signaltransduktion mittels des dualen
Luciferase- Assays
Analog zu 3.6. wurden die Zellen in die Zellkulturplatten ausgesät. Nach ca. 5 h wurden
die verschiedenen Transfektionslösungen für die PathDetect Reportergen-
Untersuchungen aufgetropft (s. unten) und die Zellen ü.N. im 3 % CO2 Wärmeschrank
kultiviert. Am nächsten Morgen erfolgte analog zu 3.10. der Mediumwechsel mit
0,02 % Ethanol und 200 nmol/l 4-OHT. Bei einigen Versuchen wurden auch die
Hemmstoffe PD98059 und U0126 in einer Konzentration von 10 µmol/l pro Loch
verwendet. Nach ca. 5 h wurde das Medium abgenommen, kurz mit 1x PBS gespült und
die Zellen pro Loch mit 400 µl Passive Lysis Puffer (Komponente des dualen
Luciferase-Assays; Promega, Mannheim) lysiert und nach 15´bei RT in
Eppendorfhütchen überführt. Nach Zentrifugation (14000 rpm, 5´, 4 °C) wurden 20 µl
des Überstands in die Luminometerrörchen vorgelegt. Die Herstellung und Lagerung
der einzelnen, für den dualen Luciferase-Assay notwendigen Lösungen und Reagenzien
wurden laut Versuchsanleitung durchgeführt. Der durchgeführte duale Luciferase-Assay
(Promega, Mannheim) ermöglichte es, eine gekoppelte Messung sowohl der Elk1-
abhängigen Genexpression mittels der Leuchtkäfer-Luciferase als auch der
Transfektionseffizienz durch Kotransfektion des Vektors pRL-TK mit
Renilla reniformis Luciferase in einem Versuchsdurchlauf ohne Änderungen der
Versuchsbedingungen durchzuführen (s. 3.11.). Es wurden jeweils Doppel-
bestimmungen für den dualen Luciferase-Assay durchgeführt. Die
Luciferaseaktivitätsmessung wurde in einem Luminometer (Berthold, Bad Wildbach)
zur quantitativen Bestimmung einzelner während der chemischen Reaktion von
32
Leuchtkäfer- bzw. Renilla-Luciferase durchgeführt. Hierzu wurde das Luminometer mit
40x 100 µl H2O und dann 12x mit 100 µl der zwei Messlösungen aus dem dualen
Luciferase-Assay System (Luciferase-Assay-Reaganz-II (LARII-Lösung) und Stop &
Glow-Reagenz) gespült. Die Luminometer-Röhrchen mit dem Zell-Lysat wurden in das
Gerät gestellt. Pro Röhrchen wurden automatisch 100 µl LARII-Lösung an Position –1
hinzugefügt und für 10´´ erfolgte dann eine Messung der Leuchtkäfer-Luciferase.
Anschließend wurde automatisch 100 µl Stop & Glow-Reagenz an Position 0
hinzugefügt und mit 2´´ Verzögerung für 10´´ die Renilla-Luciferase vermessen.
Transfektionslösungen pro Loch einer 6-well-Platte
MER PKC´s MEK1 dbd
in ng
pcDNA/MER 100
PKC/MER-Konstrukte 3-1000 3-100
pFR/Luc(Reporter-
Luciferase) 333,3 333,3 333,3 333,3
pRL TK (Renilla-Plasmid) 16,6 16,6 16,6 16,6
pFA2/Elk1 (Fusionstrans-
aktivator-Plasmid) 16,6 16,6 16,6
pFC/MEK1 (Positivkontrolle) 100
pFC2/dbd (Negativkontrolle) 100
KS Bluescript ad 3000 dito dito dito
3.12. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 10.0 mit dem nicht parametrischen
Wilcoxen-Test zum Vergleich zweier abhängiger Stichproben. Nach Büning und
Trenkler (1994) ist es möglich den Test bereits ab einer Beobachtungsanzahl von vier
Beobachtungen anzuwenden. Für alle Ergebnisse wurde die Standardabweichung
angegeben.
33
4. Ergebnisse
4.1. Herstellung der PKC-Fusionsproteine
Zur Herstellung von Fusionsproteinen von PKC-Fragmenten mit mutiertem
Östrogenrezeptor (MER) wurden cDNAs unterschiedlicher Forschungsgruppen
verwendet. Dazu ist die cDNA der PKCα (Finkenzeller, Freiburg), der PKCβ1 (A.
Ullrich, Martinsried) und der PKCδ (D. Burns, Durham) mit der
Polymerasekettenreaktion (PCR, s. 3.8.1.) amplifiziert worden. Verwendet wurde die
Pfu Turbo DNA-Polymerase (Stratagene), da ihre Fehlerrate im Vergleich zu der Taq
Polymerase, die keine 3´- 5´Exonukleaseaktivität besitzt, etwa 6- bis 100fach
niedriger ist. Andere DNA-Polymerasen mit 3´- 5´Exonukleaseaktivität zeigen
trotzdem eine 2- bis 60fach höhere Fehlerrate als die Pfu Turbo DNA Polymerase
(Hogrefe, et. al., 1997 and 2002). Von der PKC wurde die katalytische Domäne mit
einem 5’ liegenden Anteil regulatorischer Domäne amplifiziert, der die Sequenz für
den Rezeptor der aktivierten C-Kinase (RACK) codiert. Damit ist die
Pseudosubstratregion (und die DAG Bindedomäne) entfernt worden, um eine
Steuerung der Aktivierung des Fusionsproteins durch das MER zu ermöglichen (s.
Abb. 1).
Abb. 1: Darstellung der Herstellung der mit 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren
Fusionsproteine der PKCα, PKCβ1 und PKCδ.
34
4.1.1. Amplifikation der PKC-cDNA-Fragmente
Zur Herstellung der mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) induzierbaren PKC-
Isoenzyme in pcDNA3.1/HisB wurden verschiedene Oligonukleotide (MWG-
Biotech, Ebersberg) verwendet. Die PKC-cDNA-Fragmente wurden jeweils mit den
Oligonukleotiden amplifiziert, die im 5’-Oligonukleotid eine Asp718I- und im
3’-Oligonukleotid eine BamHI-Restriktions-Schnittstelle trugen. Die in den
Restriktionskarten (Abb. 2a-c) angegebenen Schnittstellen beziehen sich auf die
cDNA der jeweiligen PKC (PKCα: 637, 769, 1953 und 2046 bp; PKCβ1: 746, 1480
und 2149 bp; PKCδ: 901, 1443 und 2086 bp). Weiterhin sind die Schnittstellen in der
MER-cDNA (1031, 1136, ca. 1800, 1903 und 2061 bp) und in der pcDNA3.1/HisB
(1012, 1021, 1040, 1045 und 2402 bp) angegeben.
Für die pcDNA3.1/HisB (pcDNA) mit einer Länge von 5516 bp liegen die
Schnittstellen der Restriktionsenzyme für Asp718I an Position 1012 bp, für BamHI
an Position 1021 bp und für EcoRI an Position 1040 bp.
Die mit den Oligonukleotiden eingefügten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme
in der DNA-Sequenz für die PKCα mit einer Länge von 1409 bp liegen für Asp718I
an Position 637 bp und für BamHI an Position 2046 bp des PKCα-Gens (Abb. 2a).
Eine interne BamHI-Schnittstelle in der PKCα-cDNA an Position 796 bp machte für
die Subklonierung des PKCα-cDNA-Fragmentes einen partiellen Verdau mit BamHI
erforderlich (s. 3.3.3.).
pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040
1953 2046 bp
Bam HI
EcoRI
PST I
MER 1031 1136 1903 2061 bpca.1800
PVU II
PVU II
PST I
PST I
Asp718
Bam HI
PVU II
Asp718I
PVU II
EcoRI
PKCalpha 637 1233 769
HIPVU II
PVU II
1045
PST I
2402
PST I
Abb.2a: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das
pcDNA/PKCα/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;
zusätzliche BamHI-Schnittstelle in der PKCα-cDNA ist fettgedruckt
(dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCα-cDNA-; weiß: MER-cDNA)
35
Die Schnittstellen im amplifizierten cDNA-Fragment für die PKCβ1 mit einer Länge
von 1403 bp liegen für Asp718I an Position 746 bp und für BamHI an Position
2149 bp des PKCβ1-Gens (Abb. 2b).
pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040
746 1480 2149 bp
Bam HI
EcoRI
PST I
PKCbeta1
MER 1031 1136 1903 2061 bp ca.1800
PVU II
PVU II
PST I
PST I
Asp718
Bam HI
PST I
PVU II
Asp718I
PVU II
EcoRI
1045
PST I
2402
PST I
Abb. 2b: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das
pcDNA/PKCβ1/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;
(dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCβ1-cDNA-; weiß: MER-cDNA)
Die Schnittstellen im amplifizierten cDNA-Fragment für die PKCδ mit einer Länge
von 1185 bp liegen für Asp718I an Position 901 bp und für BamHI an Position
2086 bp des PKC δ–Gens (Abb. 2c).
pcDNA3.1/HisB1 5516 bp1012 1021 1040 1045 2402
Bam HI
EcoRI
PST I
MER 1031 1136 1903 2061 bpca.1800
PVU II
PVU II
PST I
PST I
Asp718
Bam HI
PST I
PVU II
PVU II
EcoRI
PST I
PST I
2086 bp 901 1443PKCdelta
Abb. 2c: Schematische Darstellung der Restriktionskarte für das
pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein mit ausgewählten Restriktionsschnittstellen;
(dunkelgrau:pcDNA3.1/HisB; grau: PKCδ-cDNA-; weiß: MER-cDNA)
Es wurden die Bedingungen der PCR optimiert, um effizient die PKC-cDNA-
Fragmente mit geringer Wahrscheinlichkeit für Mutationen zu amplifizieren (s.
3.8.1.). Die Amplifikation wurde daher nach 15 Zyklen beendet und die PCR-
36
Produkte auf einem Agarosegel analysiert (s. 3.5.). Anhand des parallel
aufgetragenen DNA-Größenstandards ließ sich die Länge der Fragmente bestimmen.
Die Auftrennung der amplifizierten PKC-cDNA entsprach der berechneten
Fragmentlänge von 1409 bp für die PKCα, von 1403 bp für die PKCβ1 und von
1185 bp für die PKCδ (s. Abb. 3a und 3b).
10000
8000
3000
2000
1500
1000750
500
250
10000
6000
4000
3000
2000
1500
1000
750 1 M in bp 1 2 M in bp
Abb. 3a: PCR-Produkt PKCα mit Abb. 3b: PCR-Produkte PKCβ1 mit 1403 bp
1409 bp in Spur 1 (Spur 1) und PKCδ mit 1185 bp (Spur 2)
(1 kb DNA-Größenstandard in Spur M)
Die Reinigung der PCR-Produkte der PKC-cDNA-Fragmente erfolgte mittels eines
Glasvlies mit dem PCR-Reagenziensatz von Roche (s. 3.8.2). Die DNA wurde mit
60 µl H2O eluiert und nach einer semiquantitativen Konzentrationsbestimmung bei –
20 °C aufbewahrt.
4.1.2. Subklonierung des MER
Zur Vorbereitung der Subklonierung des MER wurde der Vektor BxB/MER
(U. Rapp, Würzburg), der die cDNA für den MER enhält, mit den
Restriktionsenzymen BamHI (Schnittstelle an Position 1031 bp) und EcoRI
(Schnittstelle an Position 2061 bp) geschnitten (s. Abb. 2a-c), um das MER cDNA-
Fragment zu gewinnen (s. 3.3.1.). Nach Subklonierung ergab eine Sequenzierung,
37
dass im MER-Fragment eine stumme Mutation vorhanden war. Eine Anfrage bei U.
Rapp (Würzburg) ergab, dass die Mutation dort vorbeschrieben war und zu einer
Erkennenungssequenz für Asp718I im MER führte (s. Abb. 4). In Spur 1 ist die
Restriktion des Vektors BxB/MER mit EcoRI und BamHI zu sehen, in Spur 2 die
Restriktion mit Asp718I, EcoRI und BamHI, die zu einer ca. 250 bp großen Bande
führte.
1 2 M in bp
Abb. 4: Darstellung der 250 bp Bande (Spur 2) bei der Restriktion des BxB-Vektors
mit EcoRI, BamHI und Asp718I, die durch die zusätzliche Erkennungssequenz für
Asp718I im MER entstanden ist. In Spur1 die Restriktion mit EcoRI und BamHI, in
Spur M der 1 kb DNA-Größenstandard.
Aufgrund der zusätzlichen Schnittstelle für Asp718I im Vektor BxB/MER musste
der ursprüngliche Klonierungsplan verworfen werden und in das Expressionsplasmid
pcDNA3.1/HisB zunächst das jeweilige PKC-cDNA-Fragment subkloniert werden.
Dazu wurden die DNAs der PKCs nach der Reinigung aus dem Agarosegel mit den
Restriktionsenzymen Asp718I und BamHI restringiert.
38
4.1.3. Durchführung eines partiellen Verdaus für die PKCα
Da die PKCα zwei BamHI-Schnittstellen enthielt, ist ein partieller Verdau
durchgeführt worden (s. 3.3.3.). Es wurde mit vier unterschiedlichen BamHI-
Konzentrationen gearbeitet, um eine Konzentration zu ermitteln, bei der zum einen
Teil beide BamHI-Schnittstellen im 3’-Oligonukleotid und in der PKCα-cDNA-
Sequenz von dem Restriktionsenzym geschnitten wurden und zum anderen Teil
einzig die Schnittstelle im 3’-Oligonukleotid. Die Restriktions-Produkte wurden
dann auf einem Agarosegel aufgetragen. Es zeigte sich zum einem eine kürzere
Bande mit einer Länge von 1277 bp und eine längere Bande mit 1409 bp. Die
längere der beiden Banden mit dem für die weitere Klonierung benötigten Fragment
wurde mit Hilfe eines Reagenziensatzes zur DNA-Reinigung eluiert (s. Abb. 5). In
Spur 1 findet sich das PCR-PKCα-Produkt ungeschnitten, in Spur M der 1 kb DNA-
Größenstandard, in Spur 2 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit Asp718I und dem
BamHI-Gemisch 0,8 µl, in Spur 3 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit Asp718I
und dem BamHI-Gemisch 1,8 µl, in Spur 4 das PCR-PKCα-Produkt restringiert mit
Asp718I und dem BamHI-Gemisch 2,8 µl und in Spur 5 das PCR-PKCα-Produkt
restringiert mit Asp718I und BamHI-Gemisch 3,8 µl. Eluiert wurde die 1409 bp
Bande aus der Spur 2.
12771409
1 M 2 3 4 5 in bp
Abb. 5: Darstellung des partiellen Verdaus der PKCα mit verschiedenen BamHI-
Gemischen (Erklärung s. o.). Eluiert wurde die 1409 bp Bande aus der Spur 2.
39
4.1.4. Subklonierung für das pcDNA/PKC-Konstrukt
Um das pcDNA/PKC-Konstrukt herzustellen, wurde für die weitere Subklonierung
die pcDNA3.1/HisB ebenfalls mit den Restriktionsenzymen BamHI und Asp718
restringiert und jeweils die PKCα-, PKCβ1- und PKCδ-cDNA-Fragmente subkloniert
(s. 3.3.). Die so gewonnenen pcDNA/PKC-Plasmide wurden in einem
Restriktionsansatz auf einem Agarosegel überprüft (o. Abb.). Für die PKCα wurde
PVU II, für PKCβ1 und PKCδ Pst I verwendet (s. Abb. 2a-c). Anhand des
Restriktionsergebnisses wurde für jede PKC ein Klon ausgewählt und davon analog
zu 3.2.2. eine Plasmid-Präparation im großen Maßstab durchgeführt. Um einen
hohen Reinheitsgrad der DNA zu erreichen, wurde die CsCl-
Dichtegradientenzentrifugation zweimal ü.N. durchgeführt. Die entstandenen
Konstrukte pcDNA/PKCα, pcDNA/PKCβ1 und pcDNA/PKCδ enthielten verkürzte
PKC-cDNAs, die zur Expression einer konstitutiv aktiven PKC führen sollten. Die
gewonnene DNA wurde nach einer Konzentrationsbestimmung bei –20 °C
aufbewahrt.
4.1.5. Fusion der pcDNA/PKC-Konstrukte mit der MER-cDNA und abschließende
Restriktionsüberprüfung
Als nächstes folgte die Fusion der MER-cDNA mit der cDNA der jeweiligen PKC-
Isoenzym-Fragmente. Sowohl die MER-cDNA also auch die drei pcDNA/PKC-
Konstrukte wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI restringiert. Bei
dem pcDNA/PKCα-Konstrukt wurde erneut ein partieller Verdau durchgeführt. Nach
der Ligation der pcDNA/PKC-Konstrukte mit dem MER konnten die fusionierten
Expressionsplasmide transformiert und nach Überprüfung in der Plasmid-Präparation
im kleinen Maßstab (s. 3.2.1.) mit der Plasmid-Präparation im großen Maßstab (s.
3.2.2.) reproduziert werden. Die Expressionsplasmide mit den Genkonstrukten
wurden zweimal mit der CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (s. 3.2.2.) gereinigt.
Abschließend wurde eine Restriktionsüberprüfung der fusionierten cDNAs auf einem
Agarosegel durchgeführt (Abb. 6a und 6b). In Abbildung 6a ist die Restriktion des
pcDNA/PKCα-MER-Konstruktes dargestellt (zum besseren Verständnis siehe auch
Abb. 2a). In Spur 1 findet sich nach Restriktion mit BamHI das um etwa 130 bp
40
verkürzte PKCα-DNA-Insert (1409 bp), dass durch die zusätzliche Schnittstelle für
BamHI in der PKCα entsteht. In Spur 2 findet sich nach Restriktion mit BamHI und
EcoRI erneut das verkürzte PKC-DNA-Insert (1409 bp), sowie das MER-DNA-
Insert (1030 bp) und das um 130 bp verkürzte zusammenhängende PKCα-MER-
Insert (2437 bp). In Spur 3 befindet sich das unrestringierte Fusionsprotein, in Spur
M1 der 1 kb- und in Spur M2 der 100 bp DNA-Größenstandard.
10301409
2439
in bp 1 2 M1 M2 3
Abb. 6a: Restriktionsüberprüfung des pcDNA/PKCα/MER-Konstruktes mit BamHI
(Spur 1) und EcoRI und BamHI (Spur 2), weitere Erklärung im Text.
In Abbildung 6b ist die Restriktion des pcDNA/PKCδ/MER-Konstruktes (Spur
1,3,5,7) und des pcDNA/PKCβ1-MER-Konstruktes (Spur 2,4,6,8) dargestellt (zum
besseren Verständnis siehe auch Abb. 2b und 2c). In Spur M befindet sich der 1 kb-
DNA-Größenstandard. Spur 1 und 2 zeigt die ungeschnittene DNA. In Spur 3 und 4
erfolgte eine Restriktion mit EcoRI und BamHI. Die um 1000 bp sichtbare Bande
enthält somit den MER-Abschnitt des Konstruktes. In Spur 5 und 6 erfolgte die
Restriktion mit Asp718I und EcoRI. Die um 2000 bp sichtbaren Banden enthalten
somit das PKCδ/MER-Fragment bzw. PKCβ1/MER-Fragment, dass um ca. 250 bp
verkürzt ist. Die um 250 bp sichtbare Bande entsteht durch die bereits unter 4.1.2.
beschriebene 2. Schnittstelle für Asp718 im MER. In Spur 7 und Spur 8 wurde mit
BamHI und Asp718I restringiert. Die um 1200 bp bzw. um 1500 bp sichtbaren
Banden enthalten die PKCδ bzw. PKCβ1. Die zusätzliche Bande um 750 bp entsteht
erneut aufgrund der unter 4.1.2. beschriebenen 2. Schnittstelle für Asp718I im MER-
Fragment.
41
10000
3000
2000
1000750
250
in bp M 1 2 3 4 5 6 7 8
Abb. 6b: Restriktionsüberprüfung des pcDNA/PKCδ/ MER-Konstruktes (Spur 1, 3,
5, 7) und des pcDNA/PKCβ-MER-Konstruktes (Spur 2, 4, 6, 8) mit BamHI und
EcoRI (3 und 4), mit Asp718I und EcoRI (5 und 6), mit BamHI und Asp718I (7 und
8), weitere Erklärung im Text.
4.2. Immunoblot-Analysen zum Nachweis der Expression der PKC-Fusionsproteine
Zur Überprüfung der Expression der Fusionsproteine wurden die jeweiligen
Expressionsplasmide in humane embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen)
transfiziert (s. 3.6.). HEK293-Zellen lassen sich gut kultivieren, zeigen ein schnelles
und gleichmäßiges Wachstum und haben eine Transfektionseffizienz von ca. 50 %.
Die Transfektion erfolgte erst ü.N. bei 35 °C und 3 % CO2 (v/v) und dann nach
einem Mediumwechsel mit DMEM (mit 3 % (v/v) FKS) bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) für 4 h mit den cDNAs von PKCα, PKCβ1 und PKCδ.
Von gleichen Proteinmengen wurde in Immunoblot-Analysen (s. 3.9.5.) die
Expression der Fusionsproteine mit Hilfe isoenzymspezifischer polyklonaler
Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit für die PKCδ betrug ca. 15’’, für
PKCα und PKCβ1 ca. 5’. Dabei zeigte sich, dass jeweils in der Zytosol- und
42
Membran-Fraktion außer der endogenen PKC in den mit dem pcDNA/PKC/MER-
Fusionsprotein transfizierten Zellen eine zusätzliche Bande zu sehen war, die dem
PKC-Fusionsprotein entsprach, was mit einer Kompetition mit dem
Immunisierungspeptid des jeweiligen isoenzymspezfischen Antikörper der PKC
gezeigt werden konnte (s. Abb. 7 und Abb. 8). Für das pcDNA/PKCδ/MER-
Fusionsprotein zeigte sich bei der Kompetition eine Spezifität aller dargestellten
Banden, weshalb auf die Abbildung der Kompetition verzichtet wurde. Die im
Immunoblot dargestellten Banden entsprachen dem erwarteten Molekulargewicht der
Proteine, das bei etwa 89 kD für PKCα und PKC β1 und für PKCδ bei etwa 81 kD
lag. Die besonders deutliche Bande bei dem pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein
zeigt, dass es in wesentlich höherer Menge in Zellen vorhanden war als das
pcDNA/PKCα/MER-Fusionsprotein und das pcDNA/PKCβ/MER-Fusionsprotein.
Das verkürzte Fragment (konst. Fragment, Abb. 8) konnte nur für das
pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein nachgewiesen werden.
Kompetition
kDa
190
80
40
190
80
40
Zelluläre PKCalpha
PKCbeta1/MERZelluläre PKCbeta1
z m z m z m z m z m z m Transfektion
Abb. 7: Immunoblot-Analysen zur Darstellung des katalytischen Fragmentes der
PKCα und PKCβ1 (katal. PKC) in HEK293-Zellen und der jeweiligen PKC-
Fusionsproteine (PKC/MER) im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen (- -) in der
Zytosol- (z) und der Membranfraktion (m), sowie die Kompetition
43
PKCdelta/MERZelluläre PKCdelta
Konst. PKCdelta
80
190
40
kDa
Transfektion katal.PKC
PKC/ - - MER
Abb. 8: Immunoblot-Analysen zur Darstellung des katalytischen Fragmentes der
PKCδ (katal. PKC) in HEK293-Zellen und der jeweiligen PKC-Fusionsproteine
(PKC/MER) im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen (- -) in der Zytosol- (z) und
der Membranfraktion (m), sowie die Kompetition
4.3. Nachweis der Aktivität der PKC-Fusionsproteine in vitro
Die Enzymaktivität der Fusionsprotein wurde in vitro getestet. Dazu erfolgte die
Transfektion der pcDNA/PKC/MER-Konstrukte in HEK293-Zellen, die eine
Transfektions-effizienz von ca. 50 % erreichen (s. 3.6.). Nach einem Mediumwechsel
(DMEM mit 3 % (v/v) FKS) wurden die Zellen dann bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) 2
h mit 200 nmol/l 4-OHT oder mit 0,02 % Ethanol (Lösungsmittelkontrolle)
behandelt.
Nach der Gewinnung von Proteinhomogenaten und der Konzentrationsbestimmung
wurde die Enzymaktivität durch den Einbau von 32P in das PKC-spezifische
phosphataseresistente Phosphorylierungssubstrat Ac-MBP4-14 (s. 3.10.) bestimmt.
Für das pcDNA/PKCδ/MER-Fusionsprotein zeigte sich die stärkste Aktivität.
Besonders in der Zytosolfraktion war auch ohne 4-OHT-Behandlung eine
Grundaktivität messbar, die zum größten Teil vom Fusionsprotein stammte, wie der
Vergleich der Aktivität mit Zellhomogenaten ohne überexprimierte PKC deutlich
44
machte (Abb. 9: zyt/- bzw. mem/-). Mit 4-OHT-Behandlung erfolgte eine Steigerung
in beiden Fraktionen. Diese war in der Zytosolfraktion 3,6-fach (Abb. 9: 0,5 µg
zyt/PKC + EtOH vs. 0,5 µg zyt/PKC + 4-OHT) und in der Membranfraktion 6,7-fach
(Abb. 9: 0,5 µg mem/PKC + EtOH vs. 0,5 µg mem/PKC + 4-OHT) gegenüber der
jeweiligen Inkubation mit Ethanol Eine Erklärung für die geringere Gesamtaktivität
in der Membranfraktion kann die Verwendung des nicht-ionischen Detergenz (Non-
idet) in der Membranfraktion sein, dass die Phosphorylierungsaktivität wesentlich
absenkte (persönliche Mitteilung).
0
1000
2000
3000
4000
0.5 µgzyt/PKC+0.02%
EtOH
0.5 µgzyt/PKC
+200 nmol/l 4-OHT
0.5 µgmem/PKC+0.02 %
EtOH
0.5 µgmem/PKC
+200 nmol/l 4-OHT
1.5 µg zyt/- + 0.02 %
EtOH
1.5 µg mem/- +
0.02 % EtOH
cpm
*
*
Abb. 9: Darstellung der Aktivität des PKCδ/MER-Konstruktes in der Zytosol (zyt)-
und Membranfraktion (mem);
*: p
45
050
100150200
3 µgzyt/PKC +0.02 %
EtOH
3 µgzyt/PKC
+200nmol/l 4-
OHT
3 µgmem/PKC+0.02 %
EtOH
3 µgmem/PKC
+200nmol/l 4-
OHT
3 µg zyt/- + 0.02 %
EtOH
3 µg mem/- + 0.02 %
EtOH
cpm
*
*
Abb. 10: Darstellung der Aktivität des PKCα/MER-Konstruktes im radioaktiven
Phosphorylierungsassay bezogen auf die Zytosol (zyt)- und Membranfraktion (mem).
*: p
46
1020 1040
1) h PKCbeta1 plus MER GGGAAGTCCGTGGATTGGTGG 2) PKCbetau266 GGGAAG_CCGTGGATTGGTGG 3) PKCbetau683 GGGAAGNCCGTGGATTGGTGG 4) PKCbetalo1145revers GGGAAGCCCGTGGATTGGTGG
Abb. 11: Sequenzanalyse des pcDNA/PKCβ1/MER-Fusionsproteins mit der
Punktmutation (fettgedruckt) an Position 1026 bp, was im humanen PKCβ1-Gen der
Position 1697 bp entspricht.
4.4. Reportergen-Untersuchungen mit dem dualen Luciferase-Assay zum Nachweis
der Funktionalität der PKC-Fusionsproteine
4.4.1. Untersuchung von Elk1-abhängiger Luciferase-Genexpression durch die PKC-
Fusionsproteine
Nachdem die Expression und die Enzymaktivität der pcDNA/PKC/MER-Konstrukte
untersucht worden war, sollte abschließend ihre Funktionalität in der Zelle anhand
von Reportergen-Untersuchungen gezeigt werden. Dazu wurde die Elk1 abhängige
Luciferase-Genexpression mit dem Path Detect-System (Stratagene, USA) in
HEK293-Zellen im dualen Luciferase-Assay (Promega, Mannheim) gemessen (s.
3.11.). Zur Aktivierung der Genexpression wird ein Expressionsplasmid für ein
Fusionsprotein eingesetzt, das für eine GAL4-DNA-Bindedomäne (dbd in Abb. 4)
und der Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors Elk1 codiert. Die
Transaktivierungsdomäne von Elk1 kann durch MAPK oder vom zu untersuchenden
Konstrukt phosphoryliert und aktiviert werden und so durch Bindung an die GAL4-
DNA-Bindedomäne des Reportergens zu einer Aktivierung der Transkription der
Luciferase führen.
Als Negativkontrolle werden zwei Plasmide co-transfiziert. Ein Plasmid codiert für
ein Protein bestehend aus der GAL4-DNA-Bindedomäne ohne
Transaktivierungsdomäne, ein weiteres ist das Reporterplasmid mit Luciferasegen,
das unter der Kontrolle eines GAL4-DNA-Promotor-Elementes steht. Da dem
47
GAL4-Bindeprotein die Transaktivator-Domäne fehlt, die die Ausbildung eines
aktiven RNA-Polymerase-Komplexes ermöglicht, ist die Luciferase-Aktiviät dieses
Ansatzes gering. Das zu Kontrollzwecken als drittes Plasmid co-transfizierte
pcDNA/PKC/MER-Konstrukt zeigte in diesem Ansatz keine Wirkung.
Die PKC-abhängige Stimulation der Luciferase-Aktivität durch 4-OHT, wurde mit
drei Plasmiden durchgeführt. Dazu wurden das Luciferase-Reportergen mit dem
GAL4-DNA-Promotorelement, das Expressionsplasmid für das jeweilige
pcDNA/PKC/MER-Konstrukt und ein Expressionsplasmid für das Fusionsprotein
bestehend aus GAL4-DNA-Bindedomäne und der Transaktivatordomäne des
Transkriptionsfaktors Elk1 co-transfiziert. Da in diesem Ansatz im Gegensatz zu der
Negativkontrolle die Transaktivator-Domäne vorhanden war, konnte diese nach
Phosphorylierung durch die pcDNA/PKC/MER-Konstrukte an die Promotorregion
des Reportergens binden und so zur Transkription vom Luciferasegen führen (s. Abb.
12).
TATATA LuciferaseGAL4UAS
Po42-
ERK1/ERK2
dbd
ELK-1
RNA-Polymerase-komplex
U0126PD98059
Abb. 12: Analyse von pcDNA/PKC/MER-abhängiger MAPK-Aktivierung
(ausführliche Beschreibung siehe Text)
Die Transfektionen erfolgten in DMEM mit 10 % FKS bei 35 °C und 3 % CO2 (v/v)
ü.N.. Nach einem Mediumwechsel (DMEM mit 3 % FKS) wurden die Zellen dann
bei 37 °C und 5 % CO2 (v/v) für 5 h mit 200 nmol/l 4-OHT und mit 0,02 % Ethanol
48
behandelt (s. 3.11.). Es wurde ein dualer Luciferase-Assay (Promega, Mannheim)
durchgeführt, der es ermöglichte, eine gekoppelte Messung sowohl der Elk1-
abhängigen Genexpression mittles der Leuchtkäfer-Luciferase als auch der
Transfektionseffizienz durch Kotransfektion des Vektors pRL-TK mit Renilla
reniformis Luciferase in einem Versuchsdurchlauf durchzuführen (s. 3.11.). Es
wurden jeweils Doppelbestimmungen für den dualen Luciferase-Assay durchgeführt.
Die Ergebnisse des cotransfizierten Renilla-Plasmides (pRL-TK) wurden auf die
Elk1-abhängigen Luciferase-Ergebnisse bezogen, um Schwankungen in der
Transfektionseffizienz zu korrigieren.
In Abb. 13 ist die pcDNA/PKCδ/MER abhängige Aktivierung des
Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach
Transfektion in HEK293-Zellen dargestellt.
0,00E+00
2,00E+05
4,00E+05
6,00E+05
8,00E+05
1,00E+06
1,20E+06
pcD
NA
/ME
R
PK
Cd+
EtO
H,
10 n
g
PK
Cd+
4-O
HT,
10
ng
PK
Cd+
EtO
H,
3
ng
PK
Cd+
4-O
HT,
3
ng
ME
K1-
Pos
itivk
ontro
lle
dbd-
Neg
ativ
kont
rolle
Luci
fera
se-A
ktiv
ität i
n w
illkü
rlich
en E
inhe
iten *
*
Abb. 13: pcDNA/PKCδ/MER (PKCd) abhängige Aktivierung des
Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach
Transfektion in HEK293 Zellen.
*: p
49
(Abb. 13: PKCd + EtOH, 10 ng vs. PKCd + 4-OHT, 10 ng). Nach Transfektion von
3 ng des PKCδ-Fusionsproteins zeigte sich eine Elk1-abhängige Genexpression, die
mit 4-OHT auf das 1,5-fache gegenüber den mit Ethanol behandelten Zellen
gesteigert werden konnte (Abb. 13: PKCd + EtOH, 3 ng vs. PKCd + 4-OHT, 3 ng).
Insgesamt lässt sich damit eine Elk1-abhängige Aktivierung der Genexpression
durch das pcDNA/PKCδ/MER- Fusionsprotein nachweisen (s. Abb. 13).
In Abb. 14 ist die pcDNA/PKCα/MER abhängige Aktivierung des
Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach
Transfektion in HEK293 Zellen dargestellt. Bei dem pcDNA/PKCα/MER-Konstrukt
konnte ebenfalls eine 4-OHT-abhängige Steigerung der Genexpression beobachtet
werden, deren Gesamtaktivität jedoch deutlich geringer als bei dem
pcDNA/PKCδ/MER-Konstrukt war.
0,00E+00
5,00E+04
1,00E+05
1,50E+05
2,00E+05
2,50E+05
3,00E+05
3,50E+05
4,00E+05
pcD
NA
/ME
R
PK
Ca+
EtO
H,
100
ng
PKC
a+4-
OH
T,10
0 ng
PK
Ca+
EtO
H,
1000
ng
PKC
a+4-
OH
T,10
00 n
g
MEK
1
dbd
Luci
fera
se-A
ktiv
ität i
n w
illkü
rlich
en E
inhe
iten
* *
Abb. 14: pcDNA/PKCα/MER (PKCa) abhängige Aktivierung des
Transkriptionsfaktors Elk1 in Luciferase-Reportergenuntersuchungen nach
Transfektion in HEK293 Zellen
*: p< 0,05; n = 6
Für den Einsatz von 100 ng ließ sich durch 4-OHT eine Steigerung um den Faktor
2,5 gegenüb
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