1

Protein-Protein Bindungsstellen

Lennart Heinzerling

2

Worum geht es in den nächsten 45 Minuten?

Auffinden von Protein-Protein Komplexen aus einer großen Menge potentieller Komplexe z.B. für

-Interaction Networks-funktionelle/räumliche Zuordnung neuer Proteinedurch neue Erkenntnisse über BindungsstellenBisher Docking mit bekannten 3D Strukturen zum Auffinden von Komplexen. Nun:Proteinsequenzen Proteinkomplexe

3

Sequenz Komplex?

Kann man aus der Sequenz eines Proteins genug Informationen ziehen um Bindungsstellen und Komplexe zu finden?Wir werden sehen:ja!

4

Verschiedene Methoden, verschiedene Einsatzgebiete

In Silicio two Hybrid

Korrelierte Mutationen

Strukturelle Konservierung

5

Erste Methode

Korrelierte Mutationen und Bindungsstellen

6

Zeigen korrelierte Mutationen Bindungsstellen auf?

An Interaktionsstellen muss zwangsläufig Koevolution statt findenSind korrelierte Mutationen eindeutig mit Bindungsstellen verknüpft?Methode kann zur Unterstützung des Dockings eingesetzt werden oder zur Voraussage der Bindungsstelle aus der Sequenz

7

Methode zum Auffinden korrelierter Mutationen

Alignment der Sequenzen wird erstelltKorrelation wird für jede Position berechnetDie n am besten korrelierten Mutationen werden als Bindungsstellen – AS betrachtetXd Wert: Maß für den Anteil korrelierter Reste bei kleinem Abstand. Je höher desto besser

Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

8

Testmenge

Die Methode wurde hauptsächlich an inter-domain Kontakten getestetTest der Methode an zwei großen Mengen von Docking-LösungenZum Zeitpunkt der Untersuchung stand keine ausreichende Menge von Komplexen zur Verfügung„Echte“ Komplex-Tests daher nur an Hämoglobin und Hsc70

9

Sind sich korreliert mutierte AS näher?

Untersuchung der 21 zweidomänigen Proteine ergab eine klare Tendenz korrelierter Mutationen, sich räumlich nahe zu seinDies deutet darauf hin, dass korrelierte Mutationen Bindungsstellen aufzeigen können

Pazo

s, Helm

er-C

itterich

, Au

siello

, V

ale

ncia

, J.Mol.B

io 2

71

(19

97

)

10

Sind sich korrelierte AS unabhängig von Domänenstellung nahe?

Untersuchung an der geöffneten (3cln) und geschlossenen(2bbm) Form von CalmodulinEindeutig größere Nähe der korrelierten AS bei geschlossener FormErgebnis unterstreicht die Signifikanz von korrelierten AS als Indikator für Bindungsstellen

Pazo

s, Helm

er-C

itterich

, Au

siello

, V

ale

ncia

, J.Mol.B

io 2

71

(19

97

)

11

Anwendung: Unterstützung des Dockings

7440 mögliche Docking – Lösungen wurden für Proteine 2c2c und 3est generiertDie optimale Lösung hat einen Xd-Wert, der unter den besten 5% liegtAndere Lösungen mit hohem Xd-Wert sind der optimalen Lösung nahe

Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

12

Gute Resultate mit einem Hetero-Dimer?

Bisher nur Tests an Kontakten zwischen DomänenZum Zeitpunkt der Untersuchung gab es keine ausreichende Datenmenge von PP – KomplexenA1-b1 Monomere des Hämoglobin als TestproteineMehrere Docking-Lösungen werden generiertDer Xd Wert der optimale Lösung liegt in der Menge der 6% größten Xd-Werte

Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

13

Bindungsstellenvorhersage aus der Sequenz allein?

Test am zwei-Domänen-Protein Hsc70Domäne Nt – Struktur bekannt, Domäne Ct Struktur unbekanntErgebnisse deuten auf eine eindeutige Docking-Lösung hin, wurden jedoch nicht validiert

Pazo

s, Helm

er-C

itterich

, Au

siello

, V

ale

ncia

, J.Mol.B

io 2

71

(19

97

)

14

Zusammenfassung korrelierte Mutationen

Korreliert mutierte Aminosäuren deuten auf Bindungsstellen hinDie Auswahl der optimalen Docking-Lösung wird durch die Methode vereinfachtAnwendbarkeit außerhalb dieser Hilfsfunktion nicht hinreichend validiert, Testreihen zu klein

15

Nächste Methode

In Silicio two Hybrid

16

In Silicio Two Hybrid

Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und ihrer Interaktionsstellen Benötigt werden nur Sequenzen, keine 3D Strukturen

17

iS2H: So funktioniert esA: Alignment zweier Protein 1

und 2 mit mindestens 11 homologen Proteinen a,b,c...

B: Für alle Proteine: Konkatenation des Alignments. Danach Berechnung der Korrelation zwischen den Spalten

C: Verteilung der Korrelationsstärken innerhalb der Proteinen(P11,P22) und zwischen Proteinen(P12). Eingeteilt in 10 Korrelationsklassen

Pazos, Valencia, PROTEINS 47(2002)

18

iS2H: Anwendung auf Testmengen

Tests an verschiedenen Mengen bekannter Proteinkomplexe lieferten positive ResultateDaher dürfte Anwendung auf 67.238 potentielle Paare in E.Coli neue Erkenntnisse bringen

19

iS2H gegen 67.238 mögliche E.Coli PP – Paare. Ergebnisse:

Mögliche Interaktionen des hypothetischen Proteins YABK_ECOLI

Interaction Index Scores für die Suche in 67.238 potentiellen E.Coli Protein Paaren

Pazo

s, Vale

ncia

, PR

OTEIN

S 4

7(2

00

2)

20

iS2H Zusammenfassung

Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und deren BindungsstellenTests deuten auf gute Anwendbarkeit als Indikator für Interaktionen hin. Ergebnisse müssen verifiziert werdenErgebnisse komplementär zu Untersuchungen von Genfusionen Methoden ergänzen sich

21

Nächste Methode

Strukturell konservierte Aminosäuren und Bindungsstellen

22

Strukturell konservierte AS und Bindungsstellen

Betrachte bekannte Proteinoberflächen: Unterscheiden strukturell konservierte

AS zwischen Oberfläche und Bindungsstellen?Ziel: Z.B. - Erleichterte Vorhersage von Protein-

Protein Interaktionen- Erleichtertes Drug Design durch

Erkennen der Bindungsstelle am Target oder Design der Bindungsstelle

als Pharmakophor

23

Auf der Suche nach strukturell konservierten Resten

Zu Grunde liegender Datensatz von 1629 Proteinen mit bekannter Schnittstelle aus der PDB wird in 10 Familien eingeteiltEinteilung erfolgt nach Ähnlichkeit der SequenzenDanach Multiples Strukturelles Alignment innerhalb der Familien M

a, E

lkayam

, Wolfso

n, N

ussin

ov,

PN

AS 1

00

(20

03

)

24

Multiples Strukturelles Alignment - MUSTA

Alignment der Koordinaten der C-alpha AtomeEs werden Koordinaten als Ausgangspunkte gewählt, die einander nahe sindRotation und Translationen werden berechnet und bewertet

25

Ergebnisse: An Bindungsstellen bevorzugte AS

Trp weist hohen

Konservierungsgrad an Bindungsstellen auf.Weniger Eindeutig: Methionin, Phenylalanin

Allgemein: Hydrophobe Reste dominieren Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov,

PNAS 100(2003)

26

Warum Trp, Met, Phe?

Trp ist besonders groß -> hydrophobe WW starkTrp formt mit Ala Vertiefungen in der StrukturPhe und Trp stabilisieren evtl. polare Bindungen und damit die KomplexeMethionin: Rolle unbekannt

27

Energetische Hot-Spots

Die freie Bindungsenergie an Bindungsstellen ist nicht gleichverteilt. Es gibt Punkte hoher Bindungsenergie, die zumeist polar sind

Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

28

Sind Hot-Spots konserviert?

Zwischen den konservierten AS und den bekannten Hot-Spots besteht eine hohe KorrelationUnterstreicht wichtige Rolle der Hot-Spots und die Signifikanz der Anwesenheit strukturell konservierter Reste

Ma, E

lkayam

, Wolfso

n, N

ussin

ov,

PN

AS 1

00

(20

03

)

29

Was, wenn nicht genügend Strukturen bekannt sind?

Bisher: Strukturelles Alignment(MUSTA)identifikation struktureller KonservierungenNur eine Struktur bekannt und mehrere homologe Sequenzen hybrides Alignment: Zuordnung der Sequenzen auf die Struktur

Ma, E

lkayam

, Wolfso

n, N

ussin

ov,

PN

AS 1

00

(20

03

)

30

Zusammenfassung: Strukturell konservierte Reste

Durch Alignment werden strukturell konservierte Reste aufgedecktEnergetisch hochwertige Bindungsteile sind stark konserviertBestimmte AS deuten auf Bindungsstelle hin

31

Gesamtzusammenfassung

Aus Struktur, Konservierung und Sequenz lassen sich Informationen bzgl. Bindungsstellen ziehenVoraussage von Bindungsstellen ist auch ohne 3D Struktur möglichiS2H: Vielversprechend beim Auffinden neuer ProteinkomplexeKorrelierte Mutationen: Als Unterstützung des Dockings gut geeignetStrukturell konservierte Reste: Beim Drug Design oder zur Identifizierung der Bindungsstellen in einem Komplex