Alloreaktivität vorhersagen

Dipl. Biol. Michaela Wolf

Transplantations- und Infektionsimmunologie, AG Prof. M. Sester, Campus Homburg

23. Jahrestagung des Arbeitskreises Nierentransplantation der Deutschen Gesellschaft für Urologie

13.11.2015

Abstoßungsreaktionen

• Hyperakut (innerhalb von Minuten)

• Akut (innerhalb von Tagen/Wochen)

• Chronisch (innerhalb von Monaten/Jahren)

Hyperakute Abstoßung bei Vorkommen von präformierten zytotoxischen Antikörpern

Kissmeyer-Nielsen et al. (1966) The Lancet

Präformierte HLA-Antikörper

Präformierte HLA-AK können entstehen durch immunisierende Ereignisse:

• Schwangerschaft

• Bluttransfusion

• Transplantation

Antikörper-vermittelte akute Abstoßung

Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

Präformierte Antikörper vorhersagen

• Humoral bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch Antikörper-Vorhersage mittels:

– Mikrolymphozytotoxische Tests

• CDC-Crossmatch

• Flow-Crossmatch

– Festphasen-Immunassays

• ELISA

• Luminex

Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe, Inkubation für 120 min

American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-

1051 (Platte)

Special Interview Article

Interview with Dr Paul Terasaki

J. Michael Cecka

Department of Pathology, UCLA Immunogenetics

Center,

1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,

USA,

mcecka@ucla.edu

Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe, Inkubation für 120 min

Lyse der Spender Lymphozyten positiv

Keine Lyse der Lymphozyten negativ

C´ C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-

1051 (Platte)

Special Interview Article

Interview with Dr Paul Terasaki

J. Michael Cecka

Department of Pathology, UCLA Immunogenetics

Center,

1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,

USA,

mcecka@ucla.edu

Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe, Inkubation für 120 min

DTT Behandlung

(30 min)

Negatives Testergebnis

IgM AK anwesend

Positives Testergebnis

IgG AK anwesend

C´ C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´ Lyse der Spender

Lymphozyten positiv

Keine Lyse der Lymphozyten negativ

Fluoreszenzmikroskopische Auswertung – CDC-Crossmatch

http://www.mh-hannover.de/fileadmin/institute/transfusionsmedizin/downloads/Vorlesung_Immenschuh_Immungenetik_0209

positives Testergebnis lysierte Zellen

negatives Testergebnis intakte Zellen

C´

C´

C´

C´

C´ C´

C´

C´

C´

C´

Bewertung – CDC-Crossmatch

Anteil toter Zellen TERASAKI Score Bewertung

0-10% 1 negativ

11-20% 2 zweifelhaft positiv

21-50% 4 schwach positiv

51-80% 6 positiv

81-100% 8 stark positiv

0 nicht auswertbar

Altermann (2006) Histol Histopathol 21: 1115-1124

Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

+

CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

+

CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG

Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG

+

CDC-Crossmatch

Flow-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Mikrolymphozytotoxischer Test

• B-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I + II Antikörpern

• T-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I Antikörpern

beide Crossmatches messen die humorale/Antikörper-vermittelte-Antwort

Festphasen Assay

• ELISA (eher historisch)

• Luminex (aktuell)

ELISA (eher historisch)

HLA Klasse I Ag

ELISA (eher historisch)

HLA Klasse I Ag

Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger

Non anti-HLA AK

Emp

fän

ger-

Seru

m

Donor AK im Empfängerserum

ELISA (eher historisch)

HLA Klasse I Ag

Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger

Non anti-HLA AK

Emp

fän

ger-

Seru

m

Donor AK im Empfängerserum

Enzymgekoppelter anti-human Ig AK

Substrat - Farbumschlag

Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie

• Anstelle von ELISA-Platte Mikropartikel (Beads mit 2-6 μm Durchmesser)

• Beads haben eigene Fluoreszenzen und sind mit gereinigten HLA-Antigenen beladen

• Nachweis: Quantifizierung der Mikropartikelbindung der Anti-HLA-AK des Testserums durch Fluorophor-markierte anti-human-IgG-Sekundärantikörper

• Luminex Messgerät hat zwei Laser: – der erste erkennt die farbkodierten Beads – der zweite die darauf gebundenen sekundären AK mit Fluorophor-Phycoerythrin

Mikro-Bead mit HLA-Antigenen

Detektions-AK

AK im zu unter-suchenden Serum Antigen

Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie

• Screening Test – verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der

Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind

– Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II

• Single Antigen-Test – erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK – Einsatz bei immunisierten Patienten – Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet.

Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.

Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie

• Screening Test – verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der

Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind

– Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II

• Single Antigen-Test – erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK – Einsatz bei immunisierten Patienten – Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet.

Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.

Exemplarisches Ergebnis einer Luminex Analyse

Institut für Immunologie und Genetik, Labor Thiele, Kaiserslautern

Prinzip Luminex - Bewertungskriterien

A. Konvalinka and K. Tinckam (2015) J Am Soc Nephrol 26: 1489–1502

Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag

HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :

• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation

HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)

Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag

HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :

• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation

HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)

HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung

Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015)

Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015)

Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag

HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :

• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation

HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatuses („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)

HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung

HLA-AK Testung nach Tx

– Gibt noch keinen optimalen Zeitpunkt zur AK Testung Im Median treten de novo Donor-spezifische HLA AK (dnDSA) 3,8-68 Monate nach Tx auf – Vorhandensein von dnDSA führt zu signifikant reduziertem Tx-Überleben

Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)

Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26

Wah

rsch

ein

lich

keit

de

s Tr

ansp

lan

tatü

ber

leb

ens

Jahre nach Transplantation

grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle

Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)

C´

Wah

rsch

ein

lich

keit

de

s Tr

ansp

lan

tatü

ber

leb

ens

Jahre nach Transplantation

grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle

Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26

Vorhersage T Zell vermittelter Abstoßungen?

Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

präformierte T-Zellen vorhersagen

Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:

– Limiting-Dilution Analyse

– Proliferationsassay - CFSE

Langzeit-Assays

(Proliferation von mehreren Tagen)

präformierte T-Zellen vorhersagen

Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:

– Limiting-Dilution Analyse

– Proliferationsassay - CFSE

– ELISPOT

– AlloFlow

Langzeit-Assays

(Proliferation von mehreren Tagen)

Kurzzeit-Assays

(8-24h)

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Empfängerlymphozyten

Spenderlymphozyten mit Antigen

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Sezerniertes IFNγ

Empfängerlymphozyten

Spenderlymphozyten mit Antigen

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Enzymgekoppelter Sekundär-AK

Empfängerlymphozyten

Spenderlymphozyten mit Antigen

Ergebnisse nach 16-24h

Sezerniertes IFNγ

Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

ELISPOT - Bewertung

Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

ELISPOT - Outcome

Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18: 1602–1606 Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

AlloFlow – Vollblut-Assay

Wolf et al., unpublished

Vorteile:

Vollblut-Assay

Geringes Probenvolumen

8h Zeitdauer

Je 500µl Blut vom Empfänger und Spender

Spenderblut +

Empfängerblut

a-CD28 a-CD49d

Brefeldin A 1ml

Spender Empfänger

+ a-CD45 APC

500µl LiHep Blut 700µl LiHep Blut

Waschen Waschen

2h

4h

Durchflusszytometrische Analyse

AlloFlow – Vollblut-Assay

IFN-γ

CD

69

IFN-γ

CD

45

reaktive CD4 oder CD8 T-Zellen

Empfänger

Spender

IFN-γ

Wolf et al., unpublished

7.810 -0 3

0.03125

0.125

0.5

2

8

DL

29

66

67

84

114

124

183

462

466

191

63

106

115

470

472

71

82

83

90

47

110

31

37

24

128

94

473

57

35

86

69

56

98

172

85

96

113

44

61

89

45

55

77

469

65

52

54

87

100

116

480

117

59

68

126

78

62

73

64

22

70

81

7.810 -0 3

0.03125

0.125

0.5

2

8

DL

% a

llore

acti

ve C

D8 T

-cells

Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen

CD8

dialysis patients

hohe mediane Reaktivität

Moderate mediane Reaktivität

Keine mediane Reaktivität

% a

llore

akti

ver

CD

8 T

-Zel

len

Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten Wolf et al., unpublished

Überblick / Ausblick

• Methoden zur Vorhersage von präformierten AK vor einer Transplantation sind sehr gut geeignet, um antikörperdominierte Abstoßungsreaktionen zu verhindern

• Methoden zur Vorhersage der zellulären Alloreaktivität waren bisher aufwendig und daher ungeeignet für die klinische Routine • In 5-10% kommt es nach Tx zu T-zellulär vermittelten Abstoßungen

• Multicenter-Studie zu AlloFlow klinisches Outcome

Lieben Dank für Ihre Aufmerksamkeit

• http://www.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2F1.bp.blogspot.com%2F-vgGP_BMr4CI%2FVBdtNmY6vEI%2FAAAAAAAAA_c%2FwLNjS2v_SUk%2Fs1600%2FWhite_blood_cell_eating_germs_by_ShyDude28.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.worldaccordingtolupus.co.uk%2F&h=669&w=900&tbnid=Ea6od4Q2rL2QUM%3A&docid=nByax3ZG3quvNM&itg=1&ei=s9ZBVrbgNMzXUeOhgZAE&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=634&page=5&start=82&ndsp=22&ved=0CLsCEK0DMF5qFQoTCPaF6PLhhckCFcxrFAod41AAQg

Cynthia McKelvey (2015)