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Alloreaktivität vorhersagen

Dipl. Biol. Michaela Wolf

Transplantations- und Infektionsimmunologie, AG Prof. M. Sester, Campus Homburg

23. Jahrestagung des Arbeitskreises Nierentransplantation der Deutschen Gesellschaft für Urologie

13.11.2015

Abstoßungsreaktionen

• Hyperakut (innerhalb von Minuten)

• Akut (innerhalb von Tagen/Wochen)

• Chronisch (innerhalb von Monaten/Jahren)

Hyperakute Abstoßung bei Vorkommen von präformierten zytotoxischen Antikörpern

Kissmeyer-Nielsen et al. (1966) The Lancet

Präformierte HLA-Antikörper

Präformierte HLA-AK können entstehen durch immunisierende Ereignisse:

• Schwangerschaft

• Bluttransfusion

• Transplantation

Antikörper-vermittelte akute Abstoßung

Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

Präformierte Antikörper vorhersagen

• Humoral bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch Antikörper-Vorhersage mittels:

– Mikrolymphozytotoxische Tests

• CDC-Crossmatch

• Flow-Crossmatch

– Festphasen-Immunassays

• ELISA

• Luminex

Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch

Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

Serum vom Empfänger

Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min

C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe, Inkubation für 120 min

American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-

1051 (Platte)

Special Interview Article

Interview with Dr Paul Terasaki

J. Michael Cecka

Department of Pathology, UCLA Immunogenetics

Center,

1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,

USA,

[email protected]





C´ C´ C´

C´ C´


Lyse der Spender Lymphozyten positiv

Keine Lyse der Lymphozyten negativ

C´ C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-

1051 (Platte)

Special Interview Article

Interview with Dr Paul Terasaki

J. Michael Cecka

Department of Pathology, UCLA Immunogenetics

Center,

1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,

USA,

[email protected]





C´ C´ C´

C´ C´


DTT Behandlung

(30 min)

Negatives Testergebnis

IgM AK anwesend

Positives Testergebnis

IgG AK anwesend

C´ C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´

C´ Lyse der Spender

Lymphozyten positiv

Keine Lyse der Lymphozyten negativ

Fluoreszenzmikroskopische Auswertung – CDC-Crossmatch

http://www.mh-hannover.de/fileadmin/institute/transfusionsmedizin/downloads/Vorlesung_Immenschuh_Immungenetik_0209

positives Testergebnis lysierte Zellen

negatives Testergebnis intakte Zellen

C´

C´

C´

C´

C´ C´

C´

C´

C´

C´

Bewertung – CDC-Crossmatch

Anteil toter Zellen TERASAKI Score Bewertung

0-10% 1 negativ

11-20% 2 zweifelhaft positiv

21-50% 4 schwach positiv

51-80% 6 positiv

81-100% 8 stark positiv

0 nicht auswertbar

Altermann (2006) Histol Histopathol 21: 1115-1124

Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch



C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

+

CDC-Crossmatch





C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

+

CDC-Crossmatch


Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG




C´ C´ C´

C´ C´

Komplementzugabe

C´

C´

C´

C´

C´

Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG

+

CDC-Crossmatch

Flow-Crossmatch


Mikrolymphozytotoxischer Test

• B-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I + II Antikörpern

• T-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I Antikörpern

beide Crossmatches messen die humorale/Antikörper-vermittelte-Antwort

Festphasen Assay

• ELISA (eher historisch)

• Luminex (aktuell)

ELISA (eher historisch)

HLA Klasse I Ag


HLA Klasse I Ag

Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger

Non anti-HLA AK

Emp

fän

ger-

Seru

m

Donor AK im Empfängerserum


HLA Klasse I Ag

Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger

Non anti-HLA AK

Emp

fän

ger-

Seru

m

Donor AK im Empfängerserum

Enzymgekoppelter anti-human Ig AK

Substrat - Farbumschlag

Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie

• Anstelle von ELISA-Platte Mikropartikel (Beads mit 2-6 μm Durchmesser)

• Beads haben eigene Fluoreszenzen und sind mit gereinigten HLA-Antigenen beladen

• Nachweis: Quantifizierung der Mikropartikelbindung der Anti-HLA-AK des Testserums durch Fluorophor-markierte anti-human-IgG-Sekundärantikörper

• Luminex Messgerät hat zwei Laser: – der erste erkennt die farbkodierten Beads – der zweite die darauf gebundenen sekundären AK mit Fluorophor-Phycoerythrin

Mikro-Bead mit HLA-Antigenen

Detektions-AK

AK im zu unter-suchenden Serum Antigen

Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie

• Screening Test – verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der

Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind

– Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II

• Single Antigen-Test – erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK – Einsatz bei immunisierten Patienten – Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet.

Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.

Exemplarisches Ergebnis einer Luminex Analyse

Institut für Immunologie und Genetik, Labor Thiele, Kaiserslautern

Prinzip Luminex - Bewertungskriterien

A. Konvalinka and K. Tinckam (2015) J Am Soc Nephrol 26: 1489–1502

Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag

HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :

• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation

HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)




HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)

HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung

Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015)




HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatuses („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)

HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung

HLA-AK Testung nach Tx

– Gibt noch keinen optimalen Zeitpunkt zur AK Testung Im Median treten de novo Donor-spezifische HLA AK (dnDSA) 3,8-68 Monate nach Tx auf – Vorhandensein von dnDSA führt zu signifikant reduziertem Tx-Überleben

Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)

Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26

Wah

rsch

ein

lich

keit

de

s Tr

ansp

lan

tatü

ber

leb

ens

Jahre nach Transplantation

grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle

Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)

C´

Wah

rsch

ein

lich

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s Tr

ansp

lan

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ens

Jahre nach Transplantation

grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle

Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26

Vorhersage T Zell vermittelter Abstoßungen?

Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

präformierte T-Zellen vorhersagen

Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:

– Limiting-Dilution Analyse

– Proliferationsassay - CFSE

Langzeit-Assays

(Proliferation von mehreren Tagen)

präformierte T-Zellen vorhersagen

Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:

– Limiting-Dilution Analyse

– Proliferationsassay - CFSE

– ELISPOT

– AlloFlow

Langzeit-Assays

(Proliferation von mehreren Tagen)

Kurzzeit-Assays

(8-24h)

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Empfängerlymphozyten

Spenderlymphozyten mit Antigen

ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Sezerniertes IFNγ



ELISPOT

Anti-IFNγ AK

Enzymgekoppelter Sekundär-AK



Ergebnisse nach 16-24h

Sezerniertes IFNγ

Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

ELISPOT - Bewertung

Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

ELISPOT - Outcome

Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18: 1602–1606 Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363

AlloFlow – Vollblut-Assay

Wolf et al., unpublished

Vorteile:

Vollblut-Assay

Geringes Probenvolumen

8h Zeitdauer

Je 500µl Blut vom Empfänger und Spender

Spenderblut +

Empfängerblut

a-CD28 a-CD49d

Brefeldin A 1ml

Spender Empfänger

+ a-CD45 APC

500µl LiHep Blut 700µl LiHep Blut

Waschen Waschen

2h

4h

Durchflusszytometrische Analyse

AlloFlow – Vollblut-Assay

IFN-γ

CD

69

IFN-γ

CD

45

reaktive CD4 oder CD8 T-Zellen

Empfänger

Spender

IFN-γ

Wolf et al., unpublished

7.810 -0 3

0.03125

0.125

0.5

2

8

DL

29

66

67

84

114

124

183

462

466

191

63

106

115

470

472

71

82

83

90

47

110

31

37

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94

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57

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86

69

56

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172

85

96

113

44

61

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45

55

77

469

65

52

54

87

100

116

480

117

59

68

126

78

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73

64

22

70

81

7.810 -0 3

0.03125

0.125

0.5

2

8

DL

% a

llore

acti

ve C

D8 T

-cells

Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen

CD8

dialysis patients

hohe mediane Reaktivität

Moderate mediane Reaktivität

Keine mediane Reaktivität

% a

llore

akti

ver

CD

8 T

-Zel

len

Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten Wolf et al., unpublished

Überblick / Ausblick

• Methoden zur Vorhersage von präformierten AK vor einer Transplantation sind sehr gut geeignet, um antikörperdominierte Abstoßungsreaktionen zu verhindern

• Methoden zur Vorhersage der zellulären Alloreaktivität waren bisher aufwendig und daher ungeeignet für die klinische Routine • In 5-10% kommt es nach Tx zu T-zellulär vermittelten Abstoßungen

• Multicenter-Studie zu AlloFlow klinisches Outcome

Lieben Dank für Ihre Aufmerksamkeit

• http://www.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2F1.bp.blogspot.com%2F-vgGP_BMr4CI%2FVBdtNmY6vEI%2FAAAAAAAAA_c%2FwLNjS2v_SUk%2Fs1600%2FWhite_blood_cell_eating_germs_by_ShyDude28.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.worldaccordingtolupus.co.uk%2F&h=669&w=900&tbnid=Ea6od4Q2rL2QUM%3A&docid=nByax3ZG3quvNM&itg=1&ei=s9ZBVrbgNMzXUeOhgZAE&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=634&page=5&start=82&ndsp=22&ved=0CLsCEK0DMF5qFQoTCPaF6PLhhckCFcxrFAod41AAQg

Cynthia McKelvey (2015)

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