Aplicaciones del Real Time PCR en Veterinaria

(reproducción, producción y enfermedades hereditarias en animalesdomésticos)

Dra.PhD. Silvia Llambí

Prof. Agre. Gr 4 DT .Area Genética

Facultad de Veterinaria

Un método eficiente para caracterizar el genoma “Real time PCR”-Curso Posgrado.PEDECIBA-Subarea Genética-2009.

La PCR a tiempo reál combina un termociclador, un espectrofotómetro y un equipo informático con software y monitor.

El termociclador efectúa la PCR en muestras que contienen fluorocromo.

La fluorescencia emitida será proporcional a la cantidad de DNA, cantidad que dobla de ciclo en ciclo.

Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por una fibra óptica. La emisión fluorescente inducida es enviada al espectrofotómetro que la analiza a diferentes longitudes de onda.

El monitor indica, después de cada ciclo, las fluorescencias leídas dentro de la longitud de onda escogida para la muestra

PCR en tiempo Real (PCR cuantitativa)

PCR en tiempo Real (PCR cuantitativa)

Principio detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento específico durante la amplificación

Técnicas de realización de la PCR en tiempo real

UtilizaciUtilizacióón de n de moleculasmoleculas intercalantesintercalantes

moléculas fluorescentes SYBR® Green

UtilizaciUtilizacióón de la hibridacin de la hibridacióón con sondas internasn con sondas internas

Sonda marcada fluorescente con estructura secundaria en horquilla(“sondas Beacons”)

Sondas u oligonucleótidos marcados (Transferencia de energía Fluorescente, FRET)

Sondas Taqman®. Diseñadas por Applied Biosystems

http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/featuresbd/taqman.html

Técnicas con fluorescenciaSYBR GreenSYBR GreenTaqManTaqMan

R- reporter (FAM, 6-carboxifluoresceina) y VIC)

Q-”quencher” (TAMRA , 6, carboxi-tetramil-rodamina)

Especificidad

TaqManTaqMan

Alta Alta especificidadespecificidad inherenteinherente a a laslasCualidadesCualidades de lade la TaqTaq -- ManMan

SYBR GreenSYBR Green

Baja Baja especificidadespecificidad

SYBR Green I

ColoranteColorante se se uneune a la a la curvaturacurvaturaMenorMenor del ADNdel ADN

No No sondasonda; ; mmááss econeconóómicomico quequeTaqManTaqMan..

No multiplex.No multiplex.

SONDAS BEACONS

los pasos principales serían :

1.- desnaturalización del ADN 2.-hibridación de los cebadores y de la sonda interna3.-extensión y acción exonucleasa (5’-3’) (la sonda presenta un grupo fosfato en 3’).4.- degradación de la sonda con liberación del extremo 5’ y emisión de fluorescencia.

Real Time PCRmejor estandarización, cuantificación, automatización miniaturización de las experiencias con una reducción de tiempo y costo en el diagnóstico y un aumento en el número de muestras a analizar.

TaqManTaqMan

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE ESTA TÉCNICA

Principales ventajas

Se necesitan cantidades muy pequeñas de ADN

No se tiene que realizar ningún tipo de soporte (geles de agarosa o acrilamida) para obtener el resultado con lo cual se minimizan riesgos en el laboratorio al tener que manipular sustancias cancerígenas y/o mutagénicas como el bromuro de etidio y la acrilamida.

Los ensayos son fáciles y rápidos (PCR en tiempo real donde simultáneamente se va obteniendo el resultado ciclo a ciclo en el ordenador).

Una vez que el tubo se cierra y empieza la reacción de PCR a funcionar no se necesita abrir más el tubo obteniendo el resultado en forma directa con lo cual evitamos los riesgos consecuentes de contaminación del laboratorio y/o de las muestras con productos post-amplificación. Esta era una de las grandes problemáticas de falsos-positivos por contaminación que podían obtenerse con la PCR convencional y que esta nueva tecnología ha superado.

La experiencias son altamente reproducibles y automatizadas cuando se optimizan las temperaturas de hibridización y las concentraciones de ADN.

Principales desventajas

Se necesita datos de la secuencia de ADN o de ADNcopiapara la construcción de los cebadores y de la sonda.Para esto se recurre a los bancos de secuencias de ácidos nucleicos como el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) o al European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, http://www.ebi.ac.uk/embl/).

Real Time PCR System 7300 Applied BiosystemsLaboratorio de Citogenética y Genética MolecularFacultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza

APLICACIONES EN VETERINARIA

Genotipado por discriminación alélica (detección de mutaciones puntuales, estudio de polimorfismos de un solo nucleótido o SNP).

1.- Se diseñan 2 sondas (específica alelo salvaje y específica alelo mutante).

2.- se marcan con dos fluorocromos distintos.

3.- evaluación de la hibridización

VENTAJAS FRENTE A TÉCNICA CONVENCIONAL

No necesitamos evaluar la amplificación primaria en gel de agarosa.

No necesitamos analizar el RFLP utilizando enzimas de restricción y evaluación del tamaño de los fragmentos en gel de agarosa.

DISCRIMINACIÓN ALÉLICA EN ENFERMEDADES HEREDITARIAS

EN ANIMALES DOMÉSTICOS POR MUTACIÓN PUNTUAL

IdentificaciIdentificacióón mediante marcadores n mediante marcadores moleculares de ADN de la moleculares de ADN de la Enfermedad Renal Enfermedad Renal PoliquPoliquíísticastica AutosAutosóómicamica DominanteDominante en gatos en gatos

domdoméésticos (sticos (FelisFelis catuscatus) del Uruguay) del Uruguay

Dra. Mónica MartínezOrientadora: Dra. Silvia Llambí

Proyecto de maestría aprobado en Facultad de Veterinaria-UdelaR

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES

Enfermedades renales quísticas:

Forman parte de un Síndrome caracterizado por la formación de quistes con localización renal y extrarrenal (hígado, bazo, páncreas)

Pueden o no tener base hereditaria

Enfermedades renales quísticas hereditarias afectan varias especies (eg. humano, felino, perro, ratón)

Ejemplos:

Enfermedad sp gen

• Enf.renal poliquística autosómica recesiva humano PKHD1

• Enf.renal poliquística autosómica dominante humano PKD1(ADPKD) PKD2

PKD3?

felino PKD1

ADPKD….. humanos y felinos

• Alteración genética mas importante

• Mecanismo de herencia y presentación clínica similar

• Causa: mutaciones en gen PKD1

Ambas sp:

Comparten mas de 30 enfermedades hereditarias homólogas

FELINO modelo ideal para estudio PKD humano

Características de la enfermedad en felinos:

• Adultos ( 3 -10 años; media de 7)

• Quistes renales varían en tamaño y número

• Ocasionalmente quistes en hígado, páncreas, bazo

• Desarrollo gradual de falla renal y muerte

• Razas mas afectadas:

Prevalencia: 37-49% (USA y UK)

Exótico Himalayo Persa

Mediante técnicas moleculares basadas en la PCR se identificó la mutación responsable de la enfermedad en el felino (2004):C A

Gen involucrado PKD1

Evolución estudio por Técnicas moleculares:

• MS ligados al gen (PCR)

• Mutación puntual (PCR-RFLP; Real Time PCR)

Felino Humano

• 53 kb , 46 exones

•Cromosoma E3 felino(homólogo a HSA 7,13 y 16)

Características Gen PKD1

Mecanismo de producción de los quistes

• Policistina 1: diferenciación células epiteliales (función normal)

• Mutación gen PKD1: Proteína alterada, Diferenciación celular incompleta

• Inadecuada cantidad de proteínas transportadoras de electrolitos

• Aumento secreción de solutos con acumulación de fluídos (quistes)

Aspecto macroscópico riñón poliquístico

Riñón poliquístico de 30 cm diámetro.

Análisis RFLP

• Enzima de restricción Mly I

• Evaluación: geles agarosa 2% teñidos con BrEt, visualizados bajo luz UV

• Control positivo

Fragmentos (pb)

•Portadores 559, 316 y 243(Aa)

•Sanos 559(aa)

En definitiva.En definitiva.…….aplicar el.aplicar el C O N S E J O G E N E T I C O

Concepto análisis del riesgo de defectos genéticos en una población así como la presentación de opciones disponibles para evitar o reducir los riesgos posibles.

Profesional

•Contar con información genética relacionada a la enfermedad hereditaria.

•Distinguir características de base genética de las de base ambiental

•Tomar medidas tendientes a eliminar el problema o disminuir su frecuencia.

•Considerar limitaciones a estas medidas.

Sonda (alelo salvaje) FAM

Sonda (AD-PKD) HEX

Resultados: RT-PCR en 90 min

PCR-RFLP en 5 hrs

Hembra canina raza cimarróncon problemas reproductivos

ESTUDIO DE INTERSEXOS EN ANIMALES DOMÉSTICOS

ZT27 / DBU : 1962

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999TABAPUA LOS ROBLES

Sí4145

ZT 31 / DBU : PR:ZT31

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999CALAGUALA LOS ROBLES

No1811

ZT 30 / DBU : PR:ZT30

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999KAI LOS ROBLES

No1810

ZT 29 / DBU : PR:ZT29

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999CARANDAY LOS ROBLES

No1809

ZT 28 / DBU : PR:ZT28

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999AGUAI LOS ROBLES

No1808

ZT 27 / DBU : PR:ZT27

TANA LOS ROBLES

56ZAPICAN LOS ROBLES

43410/06/1999TAPUA LOS ROBLES

Si1807

TattooIDmadres.RegNameDamIDpadres.Reg

NameSireIDDOBOriginal.RegNameSexMaleDogID

Consulta Original

78, XY/ 77, XOCitogenética

X

Y

CA macho hembra CA CA Macho hembra macho

Sangre sang sang M Neg Chelex Chelex chelex chelex sangre

sangre Pelo pelo pelo

SRY CANINO

Laboratorio Técnicas Nucleares –Facultad de Veterinaria

Cuantificación

Real-Time PCR

No. Colour Name Genotype Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 1 CI44 74,2 86,3 90,8 92,5

3 CI4 77,8 81,8 86,8 91,7

4 CA´intersexo 86,0

5 CAintersexo 86,0

6 CI36macho 73,5 81,5 85,5 91,5

7 CI2macho 78,5 86,0 90,7

8 CAchelexintersex 81,5 85,5

10,Gain Green

The Run Signature is valid.Run Signature

Rotor-Gene 1.7.75Run On Software Version

Notes

Operator

03/06/2009 19:13:36Run Finish

03/06/2009 17:32:47Run Start

SRY_Three Step with Melt 2009-06-03 (1)

Run Name

Estos datos experimentales se realizaron con la colaboración de la Lic. Paula Nicolini

Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005

Aplicaciones para la caracterización de especies

Detección de SNPs

(información de genes de otras especies aviares)

Diseño de cebadores y PCR en muestras de perdiz (roja y chukar)

Secuenciación de los fragmentos. 1) RFLP (si el SNP forma parte de sitiode reconocimiento de una E.R)

2) RT-PCR (si SNP no forma parte de sitioDe reconocimiento de una E:R).

GENOTIPADO POR RT-PCR

Diseño de cebadores convencionales con las secuencias consenso de PerdizDiseño de sonda (específica para el SNP que diferencia a perdiz roja de chukar)

SONDA Taqman reporter “FAM” (Perdíz roja) y “VIC” (P. chukar).

Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005

Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005

Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005

Extraído de “Determinación de la pureza genética en poblaciones de perdiz roja (Alectoris rufa,L).Mediante estudios moleculares y análisis citogenético comparativo. tesis doctoral .Dra. Cristina García. Universidad de Zaragoza. 2005

Perdices silvestres: 10 híbridas de un total de 201 analizadas (4.98%)

Perdices de granja: 1482 híbridas de un total de 7241 analizadas (20.47%)

Resultados obtenidos aplicando técnicas moleculares para identificaciónde híbridos Vs perdiz roja.

Muchas Gracias por su tiempo

silvia.llambi@gmail.com