Molekularbiologische Untersuchungen zum Nachweis ... · 4.5 Quantifizierung mit der TaqMan®...

Lehrstuhl für Zellbiologie der Technischen Universität München

Wissenschaftszentrum Weihenstephan

Univ.-Prof. Dr. Bertold Hock

Molekularbiologische Untersuchungen

zum Nachweis arbuskulärer Mykorrhizapilze

bei Wildpflanzenpopulationen landwirtschaftlicher Nutzflächen

Holger Geue

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für

Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung

des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. J. Schnyder

Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. B. Hock

2. Priv.-Doz. Dr. P. Schröder

Die Dissertation wurde am 2. Juli 2002 bei der Technischen Universität München eingereicht

und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung

und Umwelt am 11. September 2002 angenommen.

II

„Die Wissenschaft fängt eigentlich erst dann an

interessant zu werden, wo sie aufhört.“

Justus von Liebig (1803-1873), deutscher Chemiker,

Begründer der Mineraldüngung in der Landwirtschaft

III

Meinem Lehrer

Karl Aldinger, *15. Juni 1952, U8. Mai 1996

IV

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung......................................................................................................................... 1

1.1 Arbuskuläre Mykorrhiza............................................................................................... 1

1.2 Identifizierung der arbuskulären Mykorrhizapilze ....................................................... 5

1.3 Molekularbiologische Untersuchungen bei arbuskulären Mykorrhizapilzen ............... 5

1.4 Zielsetzung.................................................................................................................... 6

2 Material und Methoden.................................................................................................. 7

2.1 Material ......................................................................................................................... 7

2.1.1 Versuchsflächen ..................................................................................................... 7

2.1.2 Probennahme im Freiland ...................................................................................... 9

2.1.3 Pflanzen................................................................................................................ 10

2.1.4 Arbuskuläre Mykorrhizapilze und sonstige Pilze ................................................ 11

2.1.5 Oligonukleotidprimer ........................................................................................... 12

2.1.6 Enzyme................................................................................................................. 12

2.1.7 Reagenzien ........................................................................................................... 13

2.1.8 Kits ....................................................................................................................... 14

2.1.9 Verbrauchsmaterial .............................................................................................. 15

2.1.10 Geräte ................................................................................................................... 16

2.1.11 Puffer und Färbelösungen .................................................................................... 17

2.2 Methoden .................................................................................................................... 21

2.2.1 Aufarbeitung der Proben ...................................................................................... 21

2.2.2 Produktion von Referenzkulturen ........................................................................ 22

2.2.3 Optimierung der DNA-Extraktion ....................................................................... 23

2.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration.................................................................. 27

2.2.5 Oligonukleotidprimer ........................................................................................... 28

2.2.6 Polymerase-Kettenreaktion .................................................................................. 30

2.2.6.1 Qualitative PCR-Analyse mit universellen Primern ......................................... 31

2.2.6.2 PCR-Analyse mit spezifischen Primern............................................................ 33

2.2.7 Gelelektrophorese................................................................................................. 34

2.2.8 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP-)Analyse........................ 35

2.2.9 Sequenzierung und Alignment ............................................................................. 36

2.2.10 Quantitativer Nachweis ........................................................................................ 36

2.2.11 Bestimmung der AMF anhand der Sporenmorphologie ...................................... 39

2.2.12 Färbung der intraradikalen Pilzstrukturen............................................................ 40

V

2.2.13 Bestimmung des Mykorrhizierungsgrades........................................................... 41

2.2.14 Phosphatbestimmung ........................................................................................... 42

3 Ergebnisse...................................................................................................................... 44

3.1 Optimierung der DNA-Extraktion aus Wurzelmaterial .............................................. 44

3.2 Untersuchung der Oligonukleotidprimer .................................................................... 45

3.2.1 Kontrolle der Amplifizierbarkeit.......................................................................... 49

3.2.2 Qualitativer Nachweis von A. longula mit spezifischen Primern ........................ 50

3.2.3 Qualitativer Nachweis von G. mosseae in Pflanzenwurzeln................................ 51

3.2.4 RFLP-Analyse der G. mosseae-Gruppe ............................................................... 52

3.2.5 Sequenzanalysen .................................................................................................. 54

3.3 Quantitativer Nachweis der AMF............................................................................... 59

3.3.1 Quantifizierung von A. longula mit der TaqMan® PCR ...................................... 59

3.3.2 Quantifizierung von G. mosseae mit der TaqMan® PCR..................................... 62

3.4 Zusammenfassung der molekularbiologischen und morphologischen Ergebnisse..... 65

3.5 Bestimmung der Mykorrhizapilze anhand der Sporenmorphologie ........................... 68

3.6 Bestimmung des Mykorrhizierungsgrades in Freilandproben .................................... 68

3.7 Phosphatgehalte .......................................................................................................... 74

3.8 Zusammenhang zwischen Mykorrhizierungsgrad und Phosphatgehalt...................... 79

4 Diskussion ...................................................................................................................... 82

4.1 DNA-Extraktion aus Wurzelmaterial.......................................................................... 82

4.2 Amplifizierbarkeit....................................................................................................... 83

4.3 Spezifische Primer ...................................................................................................... 84

4.4 Sequenzanalysen und RFLP........................................................................................ 86

4.5 Quantifizierung mit der TaqMan® real-time PCR ...................................................... 86

4.6 Identifikation der Mykorrhizapilze anhand der Sporenmorpholgie............................ 88

4.7 Mykorrhizierung und Phosphatgehalte ....................................................................... 89

4.8 Biodiversität: Arten und Individuen ........................................................................... 91

4.9 Fortpflanzung und Variabilität der AMF.................................................................... 93

4.10 Phylogenetische und Systematische Neuordnung der Morphospezies ....................... 95

4.11 Evolution und Artenzahl der AMF ............................................................................. 98

5 Zusammenfassung ...................................................................................................... 101

6 Literatur....................................................................................................................... 102

7 Anhang......................................................................................................................... 115

VI

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Stammbaum der Glomales nach morphologischen Kriterien........................................ 2

Abb. 2: Typische morphologische Merkmale einer Glomus-Art in Pflanzenwurzeln ............... 2

Abb. 3: Wiese W02 mit Transsekt und den Positionen I, II und III. ................................... 7

Abb. 4: Weide W21 mit Transsekt und den Positionen 1 bis 5. ................................................ 8

Abb. 5: Übersicht der F.A.M.-Versuchsstation Klostergut Scheyern ........................................ 8

Abb. 6: Plantago lanceolata. ................................................................................................... 11

Abb. 7: Trifolium repens.... ...................................................................................................... 11

Abb. 8: Holcus lanatus............................................................................................................. 11

Abb. 9: Schematische Darstellung der Probenaufarbeitung..................................................... 21

Abb. 10: Anordnung der rDNA-Einheiten ............................................................................... 29

Abb. 11: Hybridisierungspositionen der Oligonukleotidprimer............................................... 30

Abb. 12: DNA-Längenmarker GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus...................................... 35

Abb. 13: Schematische Darstellung des Prinzip der TaqMan® real time PCR........................ 37

Abb. 14: DNA-Extrakte mit verschiedenen Zelllyse-Techniken ............................................. 45

Abb. 15: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L (1) ......................................... 50

Abb. 16: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L (2) ......................................... 50

Abb. 17: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Aclong87For-Aclong400Rev ................ 51

Abb. 18: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Glmoss85For-Glmoss387Rev (1).......... 52

Abb. 19: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Glmoss85For-Glmoss387Rev (2).......... 52

Abb. 20: RFLP-Analyse von zehn PCR-Fragmenten der G. mosseae-Gruppe........................ 54

Abb. 21: Ergebnis der Sequenzanalyse im Bereich der Domäne D2....................................... 56

Abb. 22: Phylogenetischer Stammbaum der G. mosseae-Gruppe ........................................... 58

Abb. 23: Amplification-Plot von A. longula ............................................................................ 60

Abb. 24: Zusammenhang zwischen Kopienzahl und Ct-Wert der Kalibriergerade bei A.

longula. ...................................................................................................................... 60

Abb. 25: Kontrolle der Bindung des Primers P1 an die ermittelten Sequenzabschnitte. ......... 62

Abb. 26: Kontrolle der Bindung der Sonde F1 an die ermittelten Sequenzabschnitte............. 63

Abb. 27: Amplification-Plot von G. mosseae-Standards ......................................................... 63

Abb. 28: Zusammenhang zwischen den ermittelten Ct-Werten und der eingesetzten

Kopienzahl bei G. mosseae ........................................................................................ 64

Abb. 29: Sporenquetschpräparat von G. mosseae.................................................................... 69

Abb. 30: P. lanceolata-Wurzel nach Trypanblaufärbung ........................................................ 69

Abb. 31: Mykorrhizierungsraten nach Position (W02). ........................................................... 72

VII

Abb. 32: Mykorrhizierungsraten nach Pflanzen (W02) ........................................................... 72

Abb. 33: Mykorrhizierungsraten nach Probennahmeterminen (W02)..................................... 72

Abb. 34: Mykorrhizierungsraten nach Position (W21). ........................................................... 73

Abb. 35: Mykorrhizierungsraten nach Pflanzen (W21) ........................................................... 73

Abb. 36: Mykorrhizierungsraten nach Probenahmeterminen (W21)....................................... 73

Abb. 37: Kalibriergerade der Phosphatmessung. ..................................................................... 74

Abb. 38: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Position (W02).......................................... 76

Abb. 39: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Pflanze (W02)........................................... 76

Abb. 40: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Probennahmeterminen (W02)................... 76

Abb. 41: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Position (W21).......................................... 78

Abb. 42: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Pflanze (W21)........................................... 78

Abb. 43: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Probenahmeterminen (W21)..................... 78

Abb. 44: Hyphenkolonisierung in Abhängigkeit vom Phosphatgehalt des Bodens (W02) ..... 80

Abb. 45: Vesikelkolonisierung in Abhängigkeit vom Phosphatgehalt des Bodens (W02)...... 80

Abb. 46: Hyphenkolonisierung in Abhängigkeit vom Phosphatgehalt des Bodens (W21) ..... 81

Abb. 47: Vesikelkolonisierung in Abhängigkeit vom Phosphatgehalt des Bodens (W21)...... 81

Abb. 48: Stammbaum der Glomales nach MORTON & REDECKER (2001)............................... 96

Abb. 49: Stammbaum der Glomeromycota nach SCHWARZOTT et al. (2001). ........................ 98

Abb. 50: Zahl der neu beschriebenen AMF-Arten seit 1974. ................................................ 120

VIII

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Höhenlage der Beprobungspunkte. ................................................................................ 9

Tab. 2: Übersicht der Beprobungstermine auf der Wiese W02 und Weide W21. ..................... 9

Tab. 3: Schlag, Position und Pflanze der Ackerproben............................................................ 10

Tab. 4: Stämme und Herkunft der als Referenz verwendeten AMF. ....................................... 11

Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Primer....................................................................... 12

Tab. 6: DNA-Verdünnungsreihe für den PicoGreen®-Assay................................................... 27

Tab. 7: Theoretische Bindungsspezifität von Oligonukleotiden. ............................................. 28

Tab. 8: Standard PCR-Reaktionsgemisch ................................................................................ 31

Tab. 9: Zusammensetzung des Master Mix A.......................................................................... 32

Tab. 10: Temperaturprogramm 1 für die PCR mit den Primern A2R-B2L. ............................ 32

Tab. 11: Größe der unterschiedlichen PCR-Produkte .............................................................. 33

Tab. 12: Zusammensetzung des Master Mix B........................................................................ 33

Tab. 13: Temperaturprogramm 2 für die PCR mit spezifischen Primern. ............................... 34

Tab. 14: Zusammensetzung eines 1%-igen Agarose-Geles. .................................................... 34

Tab. 15: Endonukleasen und ihre Erkennungssequenz. Pfeile geben die Schnittstelle an....... 36

Tab. 16: Master Mix C für die TaqMan® PCR-Analyse. ......................................................... 37

Tab. 17: Plasmid-Anzahl in der verwendeten Standardreihe. .................................................. 38

Tab. 18: Temperaturprogramm 3 für die TaqMan® PCR......................................................... 39

Tab. 19: Pipettierschema der Kalibrierreihe zur Phosphatbestimmung. .................................. 43

Tab. 20: Vergleich der Sequenzen spezifischer Primer mit Datenbanksequenzen .................. 46

Tab. 21: Ergebnisse der „virtuellen“ PCR ............................................................................... 49

Tab. 22: Abkürzungen der untersuchten Sequenzen ................................................................ 53

Tab. 23: Übersicht über die Schnittstellen des Enzyms AluI ................................................... 54

Tab. 24: Sequenzhomologie mit nächstverwandten Arten....................................................... 55

Tab. 25: Zusammenstellung der Ct-Werte der eingesetzten Standard-Verdünnungsreihe bei

A. longula. .................................................................................................................. 61

Tab. 26: Anzahl der ermittelten Kopienzahlen bei A. longula ................................................. 61

Tab. 27: Zusammenstellung der Ct-Werte der eingesetzten Standard-Verdünnungsreihe bei

G. mosseae. ................................................................................................................ 63

Tab. 28: Anzahl der ermittelten Kopienzahlen bei G. mosseae. .............................................. 64

Tab. 29: Ergebnisübersicht der molekularbiologischen Untersuchungen................................ 66

Tab. 30: Ergebnis der morphologischen Sporenuntersuchung................................................. 68

Tab. 31: Mykorrhizierung der Pflanzen auf der Wiese (W02)................................................. 70

IX

Tab. 32: Mykorrhizierung der Pflanzen auf der Weide (W21) ................................................ 71

Tab. 33: Phosphatgehalte der Wiese W02................................................................................ 75

Tab. 34: Phosphatgehalte der Weide W21 ............................................................................... 77

X

Abkürzungen

A Adenin

Abb. Abbildung

AC Arbuskel-Kolonisierungsrate nach MCGONIGLE et al. (1990)

AGE Agarose-Gelelektrophorese

A. longula A. longula BEG 8

AM arbuskuläre Mykorrhiza

AMF arbuskuläre Mykorrhizapilze (arbuscular mycorrhizal fungi)

Aqua dest. destilliertes Wasser

BEG La Banque Européene des Glomales (European Bank of Glomales)

bp Basenpaar(e) (base pairs)

BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin)

C Cytosin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribonuleic acid)

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

dTTP Desoxythymidintriphosphat

dUTP Desoxyuridintriphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

FAA Formaldehyd-Aceto-Alkohol

F.A.M. Forschungsverbund Agrarökosysteme München

FAM 6-Carboxyfluorescein

FeEDTA Eisenethylendiamintetraacetat

FG Frischgewicht

G Guanin

h Stunde(n)

HC Hyphen-Kolonisierungsrate nach MCGONIGLE et al. (1990)

INVAM International Culture Collection of Arbuscular & Vesicular-

Arbuscular Mycorrhizal Fungi

LSU große Untereinheit (large subunit)

M molar, Molarität (mol/L)

mg Milligramm

XI

mL Milliliter

mM millimolar

min Minute(n)

mm Millimeter

µg Mikrogramm

µL Mikroliter

µM mikromolar

µm Mikrometer

N (bei Lösungen) normal, Normalität

N (in Sequenzen) Nukleosid (Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin)

NaOH Natriumhydroxid

NCBI National Center for Biotechnology Information

nm Nanometer

PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)

PVLG Polyvinyl-Lacto-Glycerin

PVP Polyvinylpyrrolidon

rDNA ribosomale DNA

RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

sp. Spezies

SSU kleine Untereinheit (small subunit)

T Thymin

Tab. Tabelle

TAMRA 6-Carboxyltetramethylrhodamin

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA

TE Tris-EDTA

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Unit(s)

v/v Volumen pro Volumen

VAM vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza

XII

VC Vesikel-Kolonisierungsrate nach MCGONIGLE et al. (1990)

w/v Masse pro Volumen (weight per volume)

1 Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Arbuskuläre Mykorrhiza

Geschichtliches

Im Jahr 1845 entdeckten TULASNE & TULASNE Sporen der arbuskulären Mykorrhizapilze

(AMF) und beschrieben die ersten beiden Arten der neu eingeführten Gattung Glomus:

G. microcarpum und G. macrocarpum. 1885 definierte FRANK eine „auf Wurzelsymbiose

beruhende Ernährung gewisser Bäume durch unterirdische Pilze“ als „Mykorrhiza“. Der

Name setzt sich aus den beiden altgriechischen Worten ìýêçò (Pilz) und ñßæá (Wurzel)

zusammen, also „Pilzwurzel“. Es handelte sich bei dieser Form um die sogenannte

Ektomykorrhiza, die bei Bäumen vorkommt. Daneben kennt man heute noch sechs weitere

Formen solcher symbiotischer Zusammenschlüsse zwischen Pilzen und Pflanzenwurzeln

(PETERSON & FARQUHAR, 1994). Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) ist der häufigste Typ, der

auch als vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza (VAM) bezeichnet wird. Erst seit den 70er Jahren

des 20. Jahrhunderts wird die AM intensiv erforscht. Seitdem erkannte man die Bedeutung

der AMF für viele Pflanzen und damit den potentiellen Nutzen, vor allem für die

Landwirtschaft.

Vorkommen

Sowohl Sporen dieser Pilze als auch mykorrhizierte Pflanzen wurden in allen Klimazonen

und Kontinenten unseres Planeten vorgefunden. Glomus antarcticum kommt sogar in der

Antarktis vor (CABELLO et al., 1994). Etwa 80% aller Landpflanzen sind zu dieser Symbiose

befähigt (SMITH & GIANINAZZI-PEARSON, 1988; BONFANTE & PEROTTO, 1995; SMITH &

READ, 1997). Neben Kräutern und Gräsern können auch Bäume (z.B. Fraxinus excelsior,

Acer pseudoplatanus, Betula und Salix; FIEDLER, 2001), Farne (PETERSON et al., 1981), Bär-

lappgewächse (SCHMID & OBERWINKLER, 1993) und alle Klassen der Moose (STAHL, 1949;

PARKE & LINDERMAN, 1980) mit den AMF vergesellschaftet sein. Dieser enormen Zahl an

Phytobionten steht eine nur geringe Zahl an Mykobionten gegenüber: bisher wurden etwa 160

verschiedene AMF-Arten anhand ihrer Sporenmorphologie beschrieben. Die zunächst der

Ordnung Endogonales zugerechneten AMF wurden 1990 von MORTON & BENNY in der

neuen Ordnung Glomales zusammengefasst (Abb. 1). Die modernen Methoden der

Molekularbiologie, die in den letzten Jahren bahnbrechende Erkenntnisse in vielen

naturwissenschaftlichen Disziplinen bescherten, wurden ebenso erfolgreich auf die AMF

angewandt. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse sind in Kapitel 4.9 zusammengefasst.

1 Einleitung 2

Abb. 1: Stammbaum der Glomales nach morphologischen Kriterien (MORTON & BENNY, 1990).

Abb. 2: Typische morphologische Merkmale einer Glomus-Art in Pflanzenwurzeln. A: Arbuskel,H: Hyphen, V: Vesikel. Quelle: BRUNDRETT et al. (1996).

1 Einleitung 3

Physiologie

Die Chlamydosporen dieser Pilze werden fast immer im Boden, selten auch in der Wurzel,

asexuell gebildet. Sie beinhalten meist sichtbare Lipidtröpfchen und andere Speicherstoffe.

Aus den Sporen keimen Hyphen, die, wenn sie nicht innerhalb weniger Tage auf die Wurzel

eines potentiellen Pflanzenpartners stoßen, wieder absterben. Ist Kontakt mit einem Phyto-

bionten hergestellt, so verdickt sich die Spitze der sogenannten runner hyphae und bildet an

der Wurzeloberfläche ein Appressorium aus (BONFANTE-FASOLO, 1984). Wie beim Eindrin-

gen eines pathogenen Pilzes reagiert die Pflanze zunächst mit Abwehrmaßnahmen (DUMAS-

GAUDOT et al., 1992; FRANKEN & GNADINGER, 1994; HARRISON & DIXON, 1994). Die ge-

nauen Abläufe der komplizierten Partnerfindung sind noch nicht bekannt (GIOVANETTI et al.,

1996). Offenbar erkennt die Pflanze jedoch sehr bald „ihren“ Pilz, so dass dieser ungehindert

eindringen kann. Die AMF bilden außerhalb der Wurzel ein feines weit verzweigtes extrara-

dikales Myzel aus, das zur Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen dient. Da-

neben bilden sie ein intraradikales Myzel im Bereich von Wurzelkortex und Epidermis aus

(BONFANTE-FASOLO, 1984; Abb. 2). Der Zentralzylinder sowie das Meristem werden jedoch

nie kolonisiert (GIANINAZZI, 1991).

Neben diesem interzellulären Wachstum penetrieren die Hyphen die Zellwand der

Pflanzenzellen und bilden intrazellulär bäumchenförmig verzweigte Strukturen, die

sogenannten Arbuskel. Diese allen Glomales-Arten gemeinsame Struktur war auch für den

Mykorrhiza-Typ namensgebend. Die Plasmamembran der Pflanzenzelle bleibt bei der

Ausbildung des Arbuskels unbeschädigt und legt sich über die fein verzweigten Hyphen,

wobei ein neues apoplasmatisches Kompartiment entsteht, das von BONFANTE & PEROTTO

(1995) als Interface-Kompartiment beschrieben wurde. Dies ist der Ort des Stoffaustausches:

der Pilz stellt der Pflanze Phosphat und andere Mineralstoffe zur Verfügung, während die

Pflanze ihn mit Kohlenhydraten versorgt. Die genauen Transportmechanismen sind noch

nicht aufgeklärt (SMITH & READ, 1997). Der Pilz baut die erhaltenen Assimilate in Form der

Glucose zunächst in das Disaccharid Trehalose (O-á-D-Glucopyranosyl-(1�1)-á-D-

Glucopyranosid) oder Glycogen um, so dass die intrazelluläre Glucose-Konzentration

abgepuffert wird (SHACHAR-HILL et al., 1995). Aus den Kohlenhydraten werden anschließend

Lipide synthetisiert und diese zum extraradikalen Myzel transportiert (PFEFFER et al., 1999).

In den Wurzeln von den Vertretern der Unterordnung Glomineae können neben den

Arbuskeln auch Vesikel gebildet werden, bläschenförmige Speicherorgane, in denen Lipide

gespeichert werden (AMIJEE, 1989). Die Gigasporineae-Arten bilden im Unterschied zu den

Glomineae extraradikale Hilfszellen aus (MORTON & BENNY, 1990). Die extraradikalen

1 Einleitung 4

Hyphen bilden ein verzweigtes dreidimensionales Netzwerk, mit dem die AMF ein weit grö-

ßeres Volumen schneller und dichter durchdringen können, als dies der Pflanzenwurzel mög-

lich ist. Zusätzlich verfügt der Pilz über ein abweichendes Enzymsystem, so dass er Mineral-

stoffe, insbesondere Phosphat mit Hilfe einer alkalischen Phosphatase (ALLEN et al., 1981),

sehr viel besser aufschließen, und diese der Pflanze zuführen kann (JAKOBSEN et al., 1994).

Nutzen für die Landwirtschaft

Aufgrund der verbesserten Nährstoffversorgung der Pflanze wurde den AMF in den letzten

Jahren immer größere Bedeutung für eine nachhaltige Landwirtschaft beigemessen (BAREA &

JEFFRIES, 1995). Neben den in zahlreichen Gewächshausversuchen demonstrierten positiven

Effekten auf Wachstum, Qualität und Gesundheit der mykorrhizierten Pflanzen durch die ef-

fizientere Nährstoffausnutzung (POWELL & DANIEL, 1978) konnten auch eine erhöhte

Schwermetalltoleranz (BERRECK & HASELWANDTER, 2001), Trockenresistenz (DAVIES et al.,

1993), eine erhöhte Resistenz gegen Phytopathogene (HOOKER et al., 1994) sowie ein Ein-

fluss auf die Zusammensetzung von Pflanzengesellschaften (VAN DER HEIJDEN, 1998a,

1998b) beobachtet werden. BETHLENFALVAY & SCHÜEPP (1994) zeigten positive Auswirkun-

gen auf die Stabilität von landwirtschaftlich genutzten Flächen. Der gezielte Einsatz dieser

Pilze in Landwirtschaft und Gartenbau liegt daher nahe, sei es zur Verringerung der Dünge-

gaben oder zur Erhöhung der Gesundheit der Pflanzen. Weitere Einsatzgebiete sind die Be-

grünung von ariden Gebieten, schwermetallbelasteten Flächen oder Abraumhalden, um nur

einige Beispiele zu nennen (DODD, International Institute of Biotechnology, University of

Kent, mündliche Mitteilung). Mittlerweile wurden einige Firmen gegründet, die Pilzinokulum

kommerziell vermarkten.

Diversität und Funktionalität

Sowohl das Ausmaß als auch die Effektivität der Symbiose sind vom Genotyp der beteiligten

Symbionten abhängig (JAKOBSEN 1995). Während man den AMF häufig ein unspezifisches

Kolonisierungspotential nachgesagt hat (BONFANTE-FASOLO, 1984), konnten signifikante

Unterschiede zwischen einzelnen Arten hinsichtlich ihrer Funktionalität aufzeigt werden

(STREITWOLF-ENGEL et al., 1997). Auf der anderen Seite scheinen die Pflanzen eine gewisse

Auswahl treffen zu können. Während die überwiegende Mehrzahl der Gräser und Kräuter und

auch einige Bäume eine AM ausbilden, wurde bei den Vertretern der Brassicaceae, Chenopo-

diaceae und Cyperaceae bisher keine AM nachgewiesen (WEISSENHORN & FELDMANN, 1999).

1 Einleitung 5

Untersuchung der AMF im Feld

Gewächshausversuche liefern einen wichtigen Beitrag zur Erforschung der unterschiedlichen

AMF-Arten oder -Stämme. Häufig ist jedoch ihre Anwendbarkeit auf Freilandsysteme frag-

lich, da sie niemals die natürlichen Umstände einer komplexen Pflanzen- (und Pilz-) gemein-

schaft erklären können. Auf der anderen Seite ist es natürlich schwierig, aus dem Zusammen-

spiel vieler verschiedener Arten und Individuen eine Funktionalität zu erkennen, die noch

dazu von vielen weiteren Faktoren, wie Bodenbeschaffenheit, Klima oder Pathogenvorkom-

men beeinflusst wird. Dennoch ist es wichtig, das Zusammenspiel dieser Ökosysteme zu er-

fassen, um daraus entscheidende Rückschlüsse ziehen zu können. Für eine Bestandsaufnahme

der AMF sind eindeutige Unterscheidungs- und Identifizierungsmerkmale grundlegend.

1.2 Identifizierung der arbuskulären Mykorrhizapilze

Die Bestimmung der Pilzarten anhand ihrer Sporenmorphologie ist bei Freilandproben

überaus schwierig und meist nur auf Gattungsebene festzustellen. Grundsätzlich muss jede

Einzelspore individuell betrachtet werden, besondere Entwicklungsstadien und weitere

wichtige Merkmale der Sporen können fehlen. Zudem sollte zur zweifelsfreien Bestimmung

Vergleichsmaterial zur Verfügung stehen. Eine Identifizierung der AMF in planta ist ebenso

wenig möglich (SCHÜßLER et al., 2001a).

1.3 Molekularbiologische Untersuchungen bei arbuskulären

Mykorrhizapilzen

Um das Problem der AMF-Identifizierung zu lösen, wurden molekularbiologische Methoden

entwickelt. So beschrieben ROSENDAHL & SEN (1992) eine Isozym-Analyse. HAHN et al.

(1993) entwickelten spezifische Antikörper gegen Oberflächenproteine der Sporen. Die von

MULLIS et al. (1986) entwickelte Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine in vitro-Methode,

die die enzymatische Amplifikation von DNA-Sequenzabschnitten ermöglicht, wurde bald

auch von zahlreichen Wissenschaftlern für die Erforschung der AMF genutzt. Ein aus dem

Bakterium Thermus aquaticus stammendes, thermostabiles Enzym, die Taq DNA

Polymerase, bindet dabei monomere Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP) komplementär zu

einer einzelsträngigen DNA-Matrix. Als Startpunkt fungieren an den aufgetrennten

Einzelsträngen Oligonukleotidprimer, die in 5‘�3‘-Richtung verlängert werden. Die

Reaktionen werden in einem Thermo-Cycler durchgeführt, wobei die Proben während 30-40

1 Einleitung 6

Zyklen bei jeweils drei verschiedenen Temperaturen inkubiert werden (Saiki, 1990). Die

PCR-Technik schaffte die Grundlage für zahlreiche Analysemethoden, die auch auf die AMF

übertragen wurden. LANFRANCO et al. (1995) publizierten eine RAPD-PCR und LONGATO &

BONFANTE (1997) untersuchten die Mikrosatellitenregionen mithilfe der PCR. Die

überwiegende Mehrheit konzentrierte sich jedoch auf die Entwicklung von Isolat- oder

Gruppen-spezifischen Primern für die PCR, und kombinierten diese Methode zum Teil mit

anderen Techniken wie der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP-)Analyse.

1.4 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, die neu gewonnenen molekularbiologischen Erkenntnisse „im Feld“

anzuwenden. Mithilfe von PCR-Techniken sollten die ansonsten nicht unterscheidbaren AMF

direkt in der Wurzel nachgewiesen und zugeordnet werden. Trotz der Schwierigkeiten bei der

Probenaufarbeitung und bei der Wahl geeigneter DNA-Sequenzen sollte es möglich sein, auf-

bauend auf der Arbeit von BÖHM (2000), mit spezifischen Oligonukleotiden einzelne Arten

und Gruppen dieser Symbionten zu identifizieren. Im Mittelpunkt dieser Studie steht die

Pilzart Acaulospora longula sowie eine Gruppe nahe verwandter Arten um Glomus mosseae.

Neben dem Nachweis dieser Arten wurden auch molekularbiologische und histologische

Quantifizierungsmethoden angewandt. Daneben wurde die Phosphatversorgung der Pflanzen

berücksichtigt.

Die Untersuchungen fanden im Rahmen des Teilprojekts DI 4 (Mykorrhiza) des For-

schungsverbundes Agrarökosysteme München (F.A.M.) statt. Der F.A.M. verfügt mit dem

ehemaligen Klostergut in Scheyern über eine einzigartige Versuchsfläche. Der Betrieb wurde

1990 übernommen und auf zwei unterschiedliche Bewirtschaftungsformen umgestellt: Inte-

grierter Pflanzenbau und ökologischer Landbau. In Abstimmung mit anderen Teilprojekten

wurden eine Wiese und eine Weidefläche für eine intensive Beprobung ausgewählt. Daneben

fanden auch Beprobungen im Ackerland statt. Da es sich bei den arbuskulären Mykorrhiza-

pilzen um obligate Symbionten handelt (AZCON-AGUILAR & BAREA, 1995; DELP et al.,

1998), konnte eine Vermehrung der Referenzstämme nur mithilfe geeigneter Wirtspflanzen

stattfinden.

2 Material und Methoden 7

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Versuchsflächen

Beim Schlag W02 handelt es sich um eine Wiese mit südöstlicher Hanglage (Abb. 3). Der

Schlag W21 dient als Weide für Rinder und weist eine westliche Hanglage auf (Abb. 4). Auf-

grund der Hanglagen war eine möglichst hohe Phosphatvarianz zu erwarten. Die Pflanzenge-

sellschaften wurden nach SCHUBERT et al. (2001) bestimmt. Es handelt sich bei W02 um eine

Glatthafer-Wiese (Arrhenatherion elatioris BRAUN), bei W21 um eine Weidelgras-Weide

(Cynosurion cristati-Lolietum perennis BRAUN-BLANQUET & DE LEEUW) mit hohem Anteil an

Alopecurus pratensis und Poa trivialis. In Abb. 5 sind die untersuchten Flächen und Bepro-

bungspunkte in einer Übersichtskarte des Versuchsguts in Scheyern dargestellt.

Abb. 3: Wiese W02 mit Transsekt und den Positionen I, II und III.


Abb. 4: Weide W21 mit Transsekt und den Positionen 1 bis 5.

Abb. 5: Übersicht der F.A.M.-Versuchsstation Klostergut Scheyern. Markiertsind die beiden untersuchten Grünlandflächen W02 und W21. Punktestellen die Probenahmestellen auf den Ackerflächen dar.


2.1.2 Probennahme im Freiland

Entlang der Hänge von W02 und W21 wurden Transsekte gelegt und auf diesen 3 bzw. 5 Be-

probungspunkte mit gleichmäßigem Abstand definiert (Tab. 1).

Tab. 1: Höhenlage der Beprobungspunkte.

Position Wiese W02 Weide W21

oben 480 m 468 m

Mitte oben 464 m

Mitte 475 m 459 m

Mitte unten 456 m

unten 470 m 453 m

An den Beprobungspunkten wurden potenzielle Wirtspflanzen mit einem Spaten ausgesto-

chen. Dabei wurde die Pflanze samt einem würfelförmigen Wurzelballen von etwa 15 cm

Kantenlänge entnommen. Die Beprobungen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durchge-

führt. Jede Fläche wurde an fünf Terminen beprobt (Tab. 2).

Tab. 2: Übersicht der Beprobungstermine auf der Wiese W02 und Weide W21.

Termin Beprobung W02 Beprobung W21

05.05.1999 X

10.04.2000 X X

26.06.2000 X

01.08.2000 X

02.10.2000 X X

11.06.2001 X

22.08.2001 X X

Neben diesen beiden Grünlandflächen wurden am 27.08.2001 verschiedene Ackerflä-

chen stichprobenhaft beprobt um einen Vergleich zwischen Grünland und Ackerland treffen

zu können (Tab. 3). Die Lage der einzelnen Beprobungspunkte sind in Abb. 4 dargestellt.


Tab. 3: Schlag, Position und Pflanze der Ackerproben.

Schlag – Position Pflanze

A06 Südost Helianthus annuus

A15 West Zea mays

A15 Ost Zea mays

A16 West Triticum aestivum

A17 Nordwest Solanum tuberosum

A19 Nordwest Solanum tuberosum

A21 West Triticum aestivum

2.1.3 Pflanzen

Die AMF-Referenzkulturen wurden im Rahmen dieser Arbeit mit dem Spitzwegerich (Plan-

tago lanceolata, Blauetikett-Bornträger, Offstein) kultiviert. Dieser diente auch als Referenz

bei molekularbiologischen Untersuchungen: P. lanceolata lässt sich leicht mit einem Großteil

der Mykorrhizapilze kolonisieren und zeichnet sich durch seinen geringen Lichtbedarf und

seinen niederen Wuchs aus (WALKER und VESTBERG 1994). Außerdem ist er wenig anfällig

gegenüber pathogenen Pilzen. Um Inokulum lagerfähig zu machen, ist es sinnvoll, die AMF

durch „Trockenfallenlassen“ zur Sporulation anzuregen und dann die Mischung aus Substrat,

Sporen, Wurzel und Hyphen trocken und kühl aufzubewahren. Dazu wurde die Wasserzufuhr

eingestellt, das trockene oberirdische Pflanzenmaterial abgeschnitten und das Substrat für

6 bis 8 Wochen luftgetrocknet.

Bei den Probennahmen im Freiland wurde neben Spitzwegerich (Plantago lanceolata

L., Abb. 6) auch Weißklee (Trifolium repens L., Abb. 7) und Wolliges Honiggras (Holcus

lanatus L., Abb. 8) untersucht. Ein wichtiges Kriterium hierbei war das Vorkommen der

Wirtspflanze an allen Beprobungspunkten. Das Wollige Honiggras war auf W02 recht weit

verbreitet und aufgrund seiner Behaarung in jedem Wachstumsstadium leicht zu identifizie-

ren. Auf der Weide war die Verteilung der Grasarten sehr heterogen, so dass hier keine

Monokotyle beprobt wurde. Als stickstofffixierende Pflanze wurde Weißklee ausgewählt, der

ebenfalls weit verbreitet war. Allerdings musste bei der Entnahme darauf geachtet werden, die

Wurzeln zu treffen, da aufgrund von Stolonenbildung weiträumig Ausläufer entwickelt

wurden.


Abb. 6: Plantago lanceolata. Abb. 7: Trifolium repens. Abb. 8: Holcus lanatus.

2.1.4 Arbuskuläre Mykorrhizapilze und sonstige Pilze

Als Referenzmaterial wurden im Gewächshaus Kulturen verschiedener AMF herangezogen.

Für die Inokulation der Pflanzen wurden von Herrn Dr. Böhm in Tab. 4 aufgeführten AMF-

Stämme übernommen. Pilzkulturen mit BEG-Nummern sind in der Banque Européene des

Glomales (Dijon, Frankreich) registriert.

Tab. 4: Stämme und Herkunft der als Referenz verwendeten AMF.

Mykorrhizapilz Herkunft

Acaulospora longula SPAIN & SCHENCK (BEG 8) Walker, England

Entrophospora colombiana SPAIN & SCHENCK (BEG 39) Walker, England

Gigaspora margarita BECKER & HALL (BEG 34) Gianinazzi-Pearson, Frankreich

Gigaspora rosea NICOLSON & SCHENCK (BEG 9) Gianinazzi-Pearson, Frankreich

Glomus intraradices SCHENCK & SMITH (H3) von Alten, Deutschland

Glomus microaggregatum KOSKE, GEMMA & OLEXIA (BEG 56) Dodd, England

Glomus mosseae (NICOL. & GERD.) GERD. & TRAPPE (BEG 68) von Alten, Deutschland

Zur Untersuchung der Spezifität von Primern für die PCR fanden der Zuchtchampignon (Aga-

ricus bisporus (LANGE) IMBACH) und die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae MEYEN EX

E.C. HANSEN) aus dem Lebensmittelhandel Verwendung.


2.1.5 Oligonukleotidprimer

Zur Bestimmung der intraradikalen AM standen die unter Tab. 5 angegebenen Primer zur

Verfügung. Sämtliche Oligonukleotidprimer wurden von der Firma MWG-Biotech syntheti-

siert. Die Sonden wurden jeweils am 5'-Ende mit dem Reporterfarbstoff FAM (6-Carboxy-

Fluorescein) kovalent gebunden. Das 3'-Ende wurde mit dem Quencherfarbstoff TAMRA

(6-Carboxyl-Tetramethyl-Rhodamin) verknüpft und zusätzlich phosphoryliert um eine

Elongation durch die Polymerase zu verhindern.

Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Primer.

Primer Sequenz Referenz

VANS1 5'-GTCTAGTATAATCGTTATACAGG-3' SIMON et al., 1992

VAACAU 5'-TGATTCACCAATGGGAAACCCC-3' SIMON et al., 1993a

VAGIGA 5'-TCACCAAGGGAAACCCGAAGG-3' SIMON et al., 1993a

VAGLO 5'-CAAGGGAATCGGTTGCCCGAT-3' SIMON et al., 1993a

VALETC 5'-ATCACCAAGGTTTAGTTGGTTGC-3' SIMON et al., 1993a

A2R 5'-AGCGAACAAGTACCGTGAGGG-3' BÖHM, 2000

B2L 5'-TAGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3' BÖHM, 2000

Aclong87For 5'-AATCAACTTGATAGTATGCGGG-3' BÖHM, 2000

Aclong400Rev 5'-TATGATCACTCCAACATCTAGATA-3' BÖHM, 2000

Glmoss85For 5'-TTGAAGTCAGTCATACCAACGG-3' BÖHM, 2000

Glmoss387Rev 5'-ACCGTAATACCCTAACATCATAAGC-3' BÖHM, 2000

Aclong251For 5'-ACCATCAGAAGCCAGGTGACTAG-3' BÖHM, 2000

Aclong338Rev 5'-TGGCTTTTCTTCGGAAAAGTGT-3' BÖHM, 2000

AclongSonde FAM-5'-CAATCCTCAATCCCGGTCACCACATTT-3'-TAMRA BÖHM, 2000

P1 5'-TGCAACGGATACCCTTCAGG-3' BÖHM et al., 1999

P2 5'-AATTCGTTCTAACCTTTTGACCGTAAT-3' BÖHM et al., 1999

F1 FAM-5'-AGCAAGCTTTCAACATCAAGGCAACGTATCA-3'-TAMRA BÖHM et al., 1999

2.1.6 Enzyme

AluI Restriktionsendonuklease MBI Fermentas, ER0011

Chitinase, von Streptomyces griseus, 717 U/g Sigma, C-1525

HinfI Restriktionsendonuklease MBI Fermentas, ER0801

HpaII Restriktionsendonuklease MBI Fermentas, ER0511

Protease (Proteinase K), 18,5 U/mg Sigma, P-0390

RNase A QIAGEN, 19101

RsaI Restriktionsendonuklease MBI Fermentas, ER1121

Taq DNA Polymerase, nativ MBI Fermentas, EP0071


2.1.7 Reagenzien

Agarose NEEO Roth, 2267.2

Ammoniummolybdat-Tetrahydrat Sigma, A-7302

L-Ascorbinsäure, Natriumsalz Sigma, A-7631

Benzylchlorid Fluka, 13270

Borsäure Sigma, B-6768

Bromphenolblau Sigma-Aldrich, B-5525

Calciumacetat-Hydrat Merck, 1.09325

Calciumchlorid Fluka, 21101

Calciumlactat Fluka, 21175

Calciumnitrat Merck, 1.02121

Desoxynukleotide (dNTP Mix), je 10 mM MBI Fermentas, R0192

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, 1.02952

di-Natriumhydrogenphosphat Merck, 1.59323

1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich, D0632

DNA-Erase ICN, 821805

DNA-Längenmarker 20 bp DNA Ladder Biozym, 850320

DNA-Längenmarker GeneRuler™ 100bp DNA Ladder Plus MBI Fermentas, SM0321

Eisenethylendiamintetraacetat (FeEDTA) Riedel-de Haën, 03650

Essigsäure, 99-100%, reinst Sigma-Aldrich, 27221

Ethanol, absolut Sigma-Aldrich, 32205

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma, E-5134

Ethidiumbromid Roth, 2218

Formaldehyd, 37%, ACS, säurefrei Merck, 1.04003

Glycerin, 100% Merck, 1.04092

Glyceringelatine Merck, 1.09242

Hexadecyltrimethylammoniumbromid

(Cetyltrimethylammoniumbromid, CTAB) Sigma-Aldrich, H6269

Iod Merck, 1.59192

Kaliumchlorid Merck, 4936

Kaliumdihydrogencitrat Fluka, 60215

Kaliumdihydrogenphosphat Merck, 1.04873

Kaliumhydroxid Sigma-Aldrich, 60370

Kaliumiodid Merck, 1.05051


Kaliumnitrat Merck, 1.05063

Kupfersulfat-Pentahydrat Merck, 1.59153

Ladungspuffer Loading Dye Solution MBI Fermentas, R0611

Magnesiumsulfat Merck, 1.05886

Mangan(II)chlorid Merck, 1.05927

Methanol, ACS, absolut, acetonfrei Sigma-Aldrich, 65543

Milchsäure Amresco, 0349

Molybdän(VI)oxid Merck, 1.00403

Natriumchlorid Merck, 1.06404

Natriumethylendiamintetraacetat (Na2EDTA) Sigma-Aldrich, 27285

Nucleon PhytoPure-Harz (in Kit enthalten) Amersham, RPN 8510

Nukleosidtriphosphate (dNTP) MBI Fermentas, R0191

Polyvinylalkohol Sigma-Aldrich, 81384

2-Propanol Sigma-Aldrich, 59304

Reagent DX Qiagen, 1011008

Rinderserumalbumin (BSA) MBI Fermentas, B14

Salzsäure, 32% Merck, 1.00319

Sorbinsäure Fluka, 85510

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) J. T. Baker, 1414

Trypanblau Sigma, T-6146

Wasserstoffperoxid, 30% Merck, 1.08597

Zinksulfat Merck, 1.08883

2.1.8 Kits

DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN, 69104

PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit Molecular Probes, P11496

QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, 28704

TaqMan® Universal PCR Master Kit ABI, 4304447


2.1.9 Verbrauchsmaterial

Deckgläser 22x22 mm Roth, H874

Deckgläser 24x60 mm Roth, H878

Duran-Flaschen, 100 mL, autoklavierbar Fisher, 60762001

Faltenfilter 150 mm Roth, 4799.1

Filterpipettenspitzen Safeseal-Tips, 10µL, steril Biozym, 692150




Floranid NK BASF

Gartenvlies Dehner, 241257

Hyperphos LS Pflanzenernährung

Kunststofftöpfe (9 cm) Firma Meyer 750908

Lichtdurchlässige Plastikkulturbeutel Sun Bag, transparent,

44x20 cm, 24 mm, 0,02 µm Filter Sigma, B-7026

Kunstlichtfilme KODAK EPY 64T Dinkel, 3 7260

Küvetten ½-Mikro Heiland, 370 490

Mikropistillen Merck, 2112100

Mikrotiterplatten (F-Form) Greiner, 655201

Objektträger, 76x26 mm Peske, 611-710

PCR-Reaktionsgefäße Micro PCR-Tubes, flat cap, 0,2 mL Hybaid, HB-TC-6202N

PCR-Reaktionsplatte OmniPlate 96 Hybaid, HB-TR3-MT

PCR-Reaktionsplattenabdeckung OmniPlate Lid PCR Hybaid, HB-TR3-MTL

Probenbeutel Rotilabo, 20x30 cm Roth, P283.1

Quarzsand Dorsilit, 0,6-1,2 mm, Nr. 7 BayWa, 430882000/1

Radigen Terraflor

Reaktionsgefäße 1,5 mL, PP, Safe-Lock Peske, 120-086

Seramis® Masterfoods

Stericlin-Papierautoklavierbeutel Medipha, 42651210

Sterilisationsklebeband Heiland, 326 202

TaqMan® 96 well reaction plate ABI, N801-0560

TaqMan® optical caps ABI, N801-0935

Wolframcarbid-Kugeln, 3 mm QIAGEN, 69997


2.1.10 Geräte

Analysesiebe 38, 160, 300, 500 µm Haan

Autoklav, S-ECZ Keller Apparatebau

Autoklav, 3870ELV Tuttenauer

Electrophoresis Power Supply ECPS 3000/150 Pharmacia

Elektrophoresekammern GNA 100 und GNA 200 Pharmacia

Fluoreszenzphotometer Reader SPECTRAFluor Plus Tecan

Gefriertrocknungsanlage Hetosicc Pfeiffer

Inkubationsschüttler New Brunswick Scientific

Kamera Camag Reprostar Polaroid

Kamera Nikon F-801s Nikon

Mikroskop Zeiss Axioplan Zeiss

Mikroprozessor pH-Meter pH 535, MultiCal WTW

PCR-Cycler Primer Express Hybaid

PCR-Cycler PCR Sprint Hybaid

Photometer Ultrospec 4000 Pharmacia

Pipette Eppendorf Reference, 0,5-10 µL Eppendorf

Pipette Eppendorf Reference, 10-100 µL Eppendorf

Pipette Eppendorf Reference, 100-1000 µL Eppendorf

Quarzglas-Präzisionsküvette SUPRASIL®, 5 mm Schichtdicke Hellma

Schüttler, Vortex VF 2 Janke und Kunkel

Schwingmühle MM 2 Retsch

Schwingmühlen-Adapter für 5 Reaktionsgefäße Retsch

Stereomikroskop Zeiss

Sterilbank Clean Air CA/RE 4 Haan

Vakuumexsikator Fisher, 60462038

Wasserbad Thermostat 2761 Eppendorf

Zentrifuge Biofuge Heraeus

Zentrifuge 5403 Eppendorf


2.1.11 Puffer und Färbelösungen

• Ammoniummolybdatlösung

Ammoniumheptamolybdat (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O 2,50 g

Aqua dest. 40 mL

Bei ca. 50 °C lösen; nach dem Erkalten:

Aqua dest. ad 50 mL

Die Lösung ist mehrere Wochen haltbar.

• CAL-Vorratslösung (5x)

Calciumlactat 77 g

Calciumacetat 39,5 g

in 600 mL heißem Wasser gelöst; nach Abkühlen:

Essigsäure (ñ=1,06 g/mL) 89,5 mL

Aqua dest. ad 1000 mL

• Chitinase-Lösung (10 U/mL)

Kaliumdihydrogenphosphat 272 mg

Calciumchlorid 2,2 mg

Chitinase (717 U/g) 14 mg

Aqua dest. ad 1000 µL

mit KOH auf pH 6,0 einstellen.

• CTAB-Puffer (2x)

Tris-HCl 1,2 g

Natriumchlorid 8,2 g

EDTA 744 mg

Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) 2 g

DTT 200 mg


mit NaOH auf pH 8,0 einstellen.

• 0,5 M EDTA (pH 8,0)

EDTA 186,1 g


mit NaOH auf pH 8,0 einstellen.


• Extraktionspuffer (nach BAHNWEG et al., 1998)

CTAB-Puffer (2x) 100 mL

PVP 2 g

• FAA (Formaldehyd-Aceto-Alkohol) (KORMANIK & MCGRAW, 1984)

Formaldehyd (37%) 900 mL

Eisessig 50 mL

Ethanol (50%) 50 mL

• Hoagland-Nährlösung für die Pflanzenanzucht

(modifiziert nach SYLVIA & HUBELL, 1986)

Ca(NO3)2 · 4 H2O 246 mg

KNO3 152 mg

MgSO4 · 7 H2O 147 mg

FeEDTA 11 mg

NaCl 3 mg

H3BO3 0,86 mg

MnCl2 · 2 H2O 0,54 mg

ZnSO4 · 7 H2O 0,07 mg

CuSO4 · 5 H2O 0,02 mg

H2MoO4 · H2O 0,006 mg


mit H2SO4 auf pH 6,5 einstellen.

• Melzer's Reagenz für die Sporendiagnostik (KREISEL & SCHAUER, 1987)

Iod 1,5 g

Kaliumiodid 5 g


• PCR Puffer (10x) von MBI Fermentas

100 mM Tris-HCl (pH 8,8)

500 mM KCl

0,8% Nonidet P40


• Phosphat-Standardlösung

Kaliumdihydrogenphosphat 383 mg


Ein Milliliter entspricht 0,2 mg P4O10.

• Proteinase K-Stammlösung (10 U/mL)

Proteinase K (18,5 U/mg) 0,54 mg

Aqua dest. 1000 µL

• PVLG-Einbettungsmedium für Sporen (MORTON et al., 1993)

Milchsäure (90%) 10 mL

Glycerin 1 mL

Polyvinylalkohol 1,66 g

Aqua dest. 10 mL

KOH pH 7,5

Aqua dest., Milchsäure und Glycerin in einer dunklen Flasche mischen,

Polyvinylalkohol zugeben und im Wasserbad bei 70 - 80 °C lösen.

• Reduktionslösung für die Phosphatbestimmung

Ascorbinsäure 125 mg

Salzsäure (c = 10 mol/L) 5 mL

Aqua dest. ad 10 mL

Die Lösung ist täglich frisch herzustellen.

• Resuspensionspuffer für die CTAB-Chloroform-Extraktion

Ammoniumacetat 77 mg

EDTA 9,3 mg


• TBE-Puffer (5x) für die Gelelektrophorese (SAMBROOK et al., 1989)

Tris 54 g

Borsäure 27,5 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 mL



• TE-Puffer (20x)

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA

pH 7,5

• TE-Elutionspuffer (1x)

Tris 10,8 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 2 mL


• Trypanblau-Färbelösung (0,05 %, w/v)

(modifiziert nach KORMANIK & MCGRAW, 1984)

Trypanblau 0,5 g

Milchsäure 875 mL

Glycerin 63 mL


• Waschpuffer für die CTAB-Chloroform-Extraktion

Ammoniumacetat 77 mg

EtOH 76 mL



2.2 Methoden

2.2.1 Aufarbeitung der Proben

Die Aufarbeitung der Proben ist in Abb. 99 dargestellt. Von den Proben wurde zunächst im

Labor mit einem Löffel oder Spatel anhaftender Boden entnommen, in Glaspetrischalen ge-

geben und im Trockenschrank bei 40 °C etwa eine Woche getrocknet. Diese Bodenproben

dienten später der Phosphatmessung. Von einigen Pflanzen wurden Blattstückchen entnom-

men, um pilzfreies Referenzmaterial für die DNA-Extraktion zu erhalten. Bei Bedarf konnte

ein weiterer Teil des anhaftenden Bodens für eine Sporenbestimmung abgetrennt werden.

Abb. 9: Schematische Darstellung der Probenaufarbeitung.


Der Wurzelballen wurde in Bechergläsern mit Leitungswasser versetzt und die ineinan-

der verwachsenen Wurzeln der Versuchspflanze vorsichtig von anderen Wurzeln und anhaf-

tender Erde getrennt. Anschließend wurde mehrmals mit Leitungswasser gewaschen, bis

keine Trübung des Wassers mehr eintrat. Zuletzt wurden die Wurzeln in einem Becherglas

mit Aqua dest. im Ultraschallbad zweimal gereinigt, um eventuell noch anhaftende Humin-

stoffe zu entfernen, die bei der PCR stören würden. Die Wurzeln wurden anschließend mit

einem Zellstofftuch trockengetupft. Von den gewaschenen Wurzeln wurden mehrere kleine,

zufällig ausgewählte, ca. 1 cm lange Stücke abgeschnitten, mit flüssigem Stickstoff übergos-

sen und anschließend gefriergetrocknet. Aus ihnen wurde später DNA isoliert. Wie sich im

Lauf dieser Arbeit zeigte, musste die Aufarbeitung rasch erfolgen, da die DNA bereits nach

30 min durch Oxidationsprozesse degradiert sein konnte. Die restlichen Wurzeln wurden mit

Trypanblau gefärbt, um die Pilzstrukturen unter dem Mikroskop quantitativ zu bestimmen.

2.2.2 Produktion von Referenzkulturen

Zur methodischen Entwicklung und als Referenzen wurden verschiedene Stämme von AMF

kultiviert. Die Inokula wurden von Herrn Dr. Böhm zur Verfügung gestellt. Als Substrat

diente ein Gemisch aus Quarzsand (Körnung 0,6-1,2 mm, Dorsilit Nr. 7) und Seramis® (1:1,

v/v). Durch die Verwendung von Quarzsand lassen sich bei der Probenentnahme Wurzeln

und Pilzsporen leicht vom Substrat trennen; Seramis® erhöht als Tongranulat mit hohem

Feinporenanteil die Feuchtigkeit im Substrat und erleichtert dadurch die Kultur. 6,4 kg Sand

und 2 kg Seramis® wurden mit etwas Aqua dest. versetzt und gemeinsam bei 121 °C und 1,3

bar für 20 min autoklaviert, um Kontaminationen zu vermeiden. Je Liter Substrat wurden 760

mg Floranid NK, 110 mg Radigen und 1,5 g Gesteinsphosphat (Hyperphos) als Grunddün-

gung zugefügt und gut durchmischt. Kunststofftöpfe (MR9) wurden mit Gartenvlies ausgelegt

und zu etwa ¾ mit sterilem Substrat gefüllt. Darauf wurde 30 mL Inokulum (Substrat mit

AMF-Sporen und mykorrhizierten Wurzeln) gegeben und abschließend mit ca. 1 cm Quarz-

sand überschichtet. Samen von P. lanceolata wurden zur Oberflächensterilisation 20 min in

5%-ige Wasserstoffperoxidlösung gelegt und anschließend mehrmals mit Aqua dest. gewa-

schen. Zur Keimung wurden die Samen auf feuchte Filterpapierstücke in Petrischalen gelegt.

Nach etwa einer Woche wurden jeweils drei Keimlinge in die einzelnen Töpfe pikiert. Die

Töpfe wurden in Untersetzer gestellt und anschließend in Sunbags überführt und im Ge-

wächshaus bei ca. 22 °C kultiviert (WALKER & VESTBERG, 1994). Bei den Sunbags handelt es

sich um Kunststoffbeutel, die Kreuzkontaminationen verhindern, mittels eines integrierten


Mikrofilters Gasaustausch ermöglichen und die Luftfeuchtigkeit erhöhen. Die Pflanzen wur-

den zwei bis drei mal wöchentlich mit Aqua dest. gegossen. Zusätzlich wurde alle vier Wo-

chen mit einer modifizierten Hoagland-Nährlösung gedüngt, die bis auf Phosphat alle Makro-

und Mikronährstoffe enthält (SYLVIA & HUBBELL, 1986). Nach drei bis sechs Monaten

konnten die mykorrhizierten Wurzeln geerntet werden.

Zur Kontrolle der Spezifität von Primern wurden zur Gewinnung von DNA aus Blättern

und nicht-mykorrhiziertem Wurzelmaterial von Pflanzen deren oberflächen-sterilisierte Sa-

men in Petrischalen ausgesät, mit Aqua dest. feucht gehalten und nach etwa 5 Tagen aus den

entsprechenden Organen DNA extrahiert.

2.2.3 Optimierung der DNA-Extraktion

Um die DNA-Extraktion zu optimieren, wurden verschiedene Methoden und Protokolle gete-

stet. Mit den folgenden Schritten sollte die genomische DNA in möglichst reiner Form und in

hohen Ausbeuten aus der Zelle isoliert werden. Entscheidend war dabei die Abtrennung von

Polysacchariden, Polyphenolen und (bei Wurzeln und Bodenproben) Huminsäuren, die alle-

samt die folgende PCR stören konnten, ohne dabei die DNA-Ausbeute zu beeinträchtigen

(DEMEKE et al., 1992). Neben den gängigen Methoden zur DNA-Aufreinigung bei Tieren und

Mikroorganismen standen einige Modifikationen für Pflanzenmaterial sowie ein Kit der

Firma QIAGEN zur Isolierung von Pflanzen-DNA (aus Blättern, jedoch nicht aus Wurzeln)

zur Verfügung. BAHNWEG et al. (1998) und DOYLE & DOYLE (1987) beschäftigten sich spe-

ziell mit der Problematik der DNA-Extraktion aus Pflanzen.

Die vorgereinigten Wurzelstücke wurden in ein 2 mL-Reaktionsgefäß überführt, 1 mL

Aqua dest. hinzugefügt und etwa 1 min in ein Ultraschallbad gestellt, um möglicherweise

noch an der Oberfläche anhaftende Huminsäuren oder andere Stoffe zu entfernen. Anschlie-

ßend wurden die Wurzeln in ein weiteres Reaktionsgefäß überführt und der Vorgang so lange

wiederholt, bis keine Trübung mehr auftrat. Daraufhin wurden die Wurzeln auf Zellstoff ge-

trocknet und abgewogen. Es wurden jeweils zwischen 10 und 100 mg Frischgewicht bzw.

1 bis 20 mg Trockengewicht verwendet. Als Referenzen wurden auch Blattstücke von

Pflanzen oder Myzel von Pilzkulturen verwendet.


Der erste variable Schritt war der Aufschluss der Zellen, hierfür wurden verschiedene

Methoden angewandt:

• sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließende Gefriertrocknung –

Zellaufschluss als Lyophilisat

• sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff – Zellaufschluss in gefrorenem Zustand

• sofortiger Zellaufschluss in möglichst frischem Zustand

Das eigentliche Zerkleinern zu einem feinen Pulver erfolgte in 1,5 mL-Reaktionsgefäßen:

• Zermörsern der auf wenige Millimeter vorgeschnittenen Wurzelstückchen mittels

eines Mikropistills

• Zermahlen unter Zugabe von 2-4 Wolframcarbid-Kügelchen und Verwendung von

zwei Adaptoren für jeweils 5 Gefäße in einer Kugelschwingmühle MM2 für ca. 5 min

• Zelllyse mit einem Ultraschallstab

• Zellaufschluß mittels Ultra-Turrax

Um Verunreinigungen zu vermeiden, wurden alle Arbeitsflächen und Geräte mit 70%

Ethanol desinfiziert und autoklavierte Gefäße verwendet. Die Mikropistille wurden zunächst

2-3 h in 1 N Salzsäure auf 90 °C erhitzt und mit Aqua dest. gewaschen. Schließlich wurden

sie wie Scheren und Pinzetten mit DNA-Erase behandelt, welches sowohl DNA- als auch

RNA-Moleküle hydrolysiert. Anschließend wurde gründlich mit Aqua dest. gewaschen und

autoklaviert. Die Wolframcarbid-Kugeln besitzen aufgrund ihrer extremen Härte eine hohe

Durchschlagskraft. Außerdem konnten sie aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften leicht

aus den Ansätzen entfernt werden. Ihre Reinigung erfolgte durch fünfminütige Inkubation in

1 N HCl auf einem Magnetrührer und anschließendem Waschen in einem Sieb mit Aqua dest.

Zur Vermeidung von Aerosolen wurden ausschließlich Filterpipettenspitzen verwendet.

Extraktion mit dem DNeasy Plant Mini Kit von QIAGEN

Dieses kommerzielle System wurde entwickelt, um DNA aus oberirdischen Pflanzenteilen

oder Gewebekulturen zu isolieren. Garantiert wird dabei die sichere Abtrennung der meisten

PCR-Inhibitoren und die Gewinnung von qualitativ hochwertiger DNA. Das vom Hersteller

QIAGEN beigefügte Protokoll wurde mit geringen Modifikationen übernommen:

Zunächst wurden dem zerkleinerten Probenmaterial 400 µL Puffer AP1 und 4 µL

RNase beigefügt, mit einem Vortexer gemischt und 10 min im Wasserbad bei 65 °C inkubiert.

Bei der Verwendung von frischem Probenmaterial konnten alternativ Puffer AP1 und RNase


zusammen mit 1 µL Reagent DX (verhindert starkes Schäumen) bereits vor dem Mahlen mit

der Kugelschwingmühle zugefügt werden (Frau Dr. Boronowsky, Fa. QIAGEN, mündliche

Mitteilung). Der Puffer AP1 enthält EDTA, SDS, NaCl und Polyvinylpyrrolidon (PVP) in

wässriger Lösung. EDTA bindet Magnesiumionen und andere zweiwertige Kationen, die für

einige DNasen als Co-Faktoren fungieren (KOKILERA, 1995), und verhindert dadurch einen

enzymatischen DNA-Abbau. SDS denaturiert Proteine und trennt somit DNA-Protein-Kom-

plexe. NaCl hält SDS in Lösung. PVP begünstigt die Adsorption von Polyphenolen, die sonst

von Phenoloxidasen zu komplexbildenden Verbindungen oxidiert würden (SAUNDERS &

PARKES, 1999). Durch die RNase wird RNA verdaut, die in der PCR stören könnte. Um den

Zellaufschluss und damit die gewonnene DNA-Menge noch weiter zu steigern, wurden alter-

nativ zusätzlich jeweils 10 µL Chitinase- und Proteinase K-Lösung zugesetzt und vor der In-

kubation bei 65 °C zusätzlich 5 min bei RT bzw. 37 °C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden 130 µl Puffer AP2 hinzugegeben und 5 min auf Eis inku-

biert. Der Puffer AP2 enthält Kaliumacetat und Essigsäure in wässriger Lösung. Durch die

Erhöhung der Ionenkonzentration präzipitieren die Proteine.

Anschließend wurde die extrahierte DNA auf eine QIAshredder spin column aufgetra-

gen und durch Zentrifugieren (2 min bei 15.000 rpm) filtriert. Größere Zellbestandteile blie-

ben dabei in dem Filter zurück, Präzipitate sammelten sich als Rückstand am Grund des Re-

aktionsgefäßes. Der Überstand (ca. 450 µL) wurde in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß über-

führt.

Dem Überstand wurden 225 µL Puffer AP3 (enthält Guanidinium-Hydrochlorid) und

450 µL reiner Ethanol zugesetzt. Durch Zugabe eines monovalenten Salzes und Alkohol fällt

DNA spontan bei Raumtemperatur aus. Bei sehr kleinen DNA-Mengen unter 250 ng/µL (z.B.

Extraktion aus Sporen) wurde der Ansatz 30 min bis 24 h auf -20 °C in den Gefrierschrank

gestellt und zu Beginn der Extraktion 100 ng/µL tRNA (Poly-A) als Carrier hinzugegeben

(MÜLHARDT, 2000). Die Suspension wurde auf eine DNeasy mini spin column aufgetragen,

wobei die DNA an die Membran binden konnte und die restliche Flüssigkeit durch Zentrifu-

gieren (1 min bei 8.000 rpm) entfernt wurden.

Durch zweimaliges Waschen mit dem Puffer AW konnten störende Stoffe wie Polyphe-

nole oder noch vorhandene Salze des Puffer AP3 abgetrennt werden. Hierfür wurden 500 µL

Puffer AW auf die Säule aufgetragen und zunächst 1 min bei 8.000 rpm zentrifugiert. Beim

zweiten Waschschritt wurde die Membran durch 2 min Zentrifugieren bei 15.000 rpm ge-

trocknet. Der Puffer AW enthält NaCl, Tris-HCl und Ethanol.


Abschließend wurde die gereinigte DNA mit 100 µL eines auf 65 °C vorgewärmten

Elutionspuffer AE (enthält Tris und EDTA) eluiert. Zur Kontrolle der verwendeten Lösungen

auf DNA-Verunreinigungen wurde bei jeder Extraktion eine Extraktionskontrolle mit Aqua

dest. verwendet und später in einer PCR mit Universalprimern überprüft. Der DNA-Extrakt

wurde bei –20 °C gelagert.

CTAB-Chloroform-Extraktion (modifiziert nach DOYLE & DOYLE 1987)

100 mg pulverisiertes Material wurde 30 min bei 60 °C mit 800 µL 2x CTAB Puffer inkubiert

und anschließend mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1, v/v) extrahiert. Nach 10-minütiger

Zentrifugation bei 10.000 rpm wurde die wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt, 500 µL

eisgekühlter 2-Propanol zugesetzt und vorsichtig gemischt. Die präzipitierte DNA wurde ab-

zentrifugiert und zweimal 10 min mit 1 mL Waschpuffer gereinigt. Anschließend wurde die

DNA abzentrifugiert, der Rückstand luftgetrocknet und danach in 100 µL

Resuspensionspuffer gelöst. Der gelösten DNA wurde 1 µL RNase A zugesetzt und 30 min

bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die DNA mit 100 µL Aqua dest. verdünnt, 100 µL

7,5 M-Ammoniumacetat zugegeben und mit 750 µL kaltem Ethanol gefällt. Nach 5-minütiger

Inkubation auf Eis wurde bei 13.000 rpm zentrifugiert, das DNA-Präzipitat luftgetrocknet und

schließlich mit 100 µL TE-Puffer resuspendiert.

Protokoll der DNA-Extraktion (modifiziert nach BAHNWEG 1998)

100 mg frisches Material wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und gemahlen. Hierzu

wurden 500 µL Methanol (50% v/v), 25 µL Calciumchlorid (20%, w/v) und 1 % (w/v) DTT

auf Eis pipettiert. Der Ansatz wurde 10 min bei 4 °C inkubiert und anschließend 10 min bei

4 °C und 13.000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen

und die Methanol-Calciumchlorid-Extraktion wiederholt. Danach wurde ein drittes Mal

extrahiert, diesmal mit 50% (v/v) Methanol und 1% DTT (ohne CaCl2). Zum Rückstand

wurden auf Eis (unter dem Abzug) 200 µL Benzylchlorid und 250 µL Extraktionspuffer

zugegeben. Der Ansatz wurde 10 min bei 4 °C geschüttelt. Anschließend wurden 150 µL

gekühltes Chloroform und 50 µL Nucleon PhytoPure-Harz hinzugefügt, weitere 5 min bei

4 °C geschüttelt und schließlich 10 min bei 4 °C und 2.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand

wurde in ein neues Gefäß überführt und hierzu 150 µL Chloroform und 50 µL Nucleon

PhytoPure-Harz pipettiert. Nach weiteren 5 min Inkubation bei 4 °C wurde abermals wie

zuvor zentrifugiert. Von dem Überstand wurden vorsichtig 200 µL in ein neues Gefäß auf Eis

überführt und 100 µL 2-Propanol addiert, durch vorsichtiges Drehen gemischt und weitere


10 min auf Eis inkubiert. Die DNA wurde 10 min bei 4 °C und 13.000 rpm abzentrifugiert

und der Überstand verworfen. Anschließend folgten verschiedene Waschschritte bei RT mit

1) 500 µL 70%-igem Ethanol/0,1 M Natriumacetat, 2) 500 µL 80%-igem Ethanol, 3) 500 µL

100%-igem Ethanol und 4) 500 µL Chloroform. Abschließend wurde die DNA 30 min bei RT

getrocknet und in 100 µL TE-Puffer gelöst.

2.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration

Um das Ergebnis der Extraktionen quantitativ zu überprüfen, wurde ein Kit der Firma Mole-

cular Probes verwendet, mit dem es möglich war, doppelsträngige DNA sehr exakt zu quanti-

fizieren. PicoGreen® ist ein Reagenz, das hochselektiv an doppelsträngige DNA bindet. Wird

es in dieser Bindung mit Licht der Wellenlänge 502 nm angeregt, so fluoresziert es mit einer

Emissionswellenlänge von 523 nm. Da Fluoreszenz im Gegensatz zur Absorption sehr viel

genauer gemessen werden kann, entfallen bei dieser Methode störende Faktoren wie Konta-

minationen mit RNA oder Proteinen (MÜLHARDT, 2000).

Zunächst wurde die PicoGreen®-Stammlösung 1:200 mit 1x TE-Puffer verdünnt. Für

die Erstellung einer Kalibrationskurve wurde von der mitgelieferten dsDNA mit TE-Puffer

eine Stammlösung hergestellt (2 µg/mL). Mit dieser Stammlösung wurde eine DNA-Verdün-

nungsreihe hergestellt (Tab. 6). Die Lösungen wurden in Kavitäten einer 96er-Platte pipet-

tiert, 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und anschließend mit einem Fluores-

zenzphotometer gemessen. Die DNA-Standards wurden jeweils dreifach gemessen, die DNA-

Proben doppelt bestimmt.

Die zu messenden DNA-Proben wurden mit 1x TE-Puffer auf 100 µL verdünnt. Hierzu

wurde jeweils 100 µL PicoGreen®-Lösung gegeben und weiter wie bei den Standards verfah-

ren.

Tab. 6: DNA-Verdünnungsreihe für den PicoGreen®-Assay.

Stammlösung 1x TE-Puffer PicoGreen®-Lösung DNA-Konzentration

100 µL 0 µL 100 µL 1000 ng/mL

10 µL 90 µL 100 µL 100 ng/mL

1 µL 99 µL 100 µL 10 ng/mL

0,1 µL 99,9 µL 100 µL 1 ng/mL

0 µL 100 µL 100 µL 0 ng/mL


2.2.5 Oligonukleotidprimer

Für eine PCR werden Oligonukleotide benötigt, die den „Rahmen“ des zu amplifizierenden

Genabschnitts bilden. Jedes dieser Oligonukleotide oder „Primer“ besteht aus etwa 20 Nu-

kleotiden und bildet den Startpunkt für das Enzym DNA Polymerase. Da die DNA doppel-

strängig ist, verwendet man einen Forward-Primer, dessen Basensequenz der des codogenen

Stranges entspricht, und einen Reverse-Primer, dessen Basensequenz komplementär zum co-

dogenen Strang ist. Je nach Sequenz kann man zwischen universellen Primern unterscheiden,

die für ein bestimmtes Zielgen bei möglichst vielen Organismen passen, und spezifischen

Primern, die diese Zielregionen nur bei einer bestimmten Gruppe von Organismen erkennt.

Da in jedem Genom konservierte und variable Bereiche vorkommen, kann man die unter-

schiedlichen Primer entsprechend modellieren. Grundsätzlich gilt: je länger der Primer, desto

spezifischer kann er sein (Tab. 7). Eine besondere Art von Primern sind die DNA-Sonden, die

bis zu 30 Basen lang sein können und nicht als Startpunkt in einer PCR zum Einsatz kommen,

sondern hochspezifisch eine ganz bestimmte Zielregion erkennen sollen. Diese Sonden sind

meist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und können in einer quantitativen PCR einge-

setzt werden.

Tab. 7: Theoretische Bindungsspezifität von Oligonukleotiden.

Oligonukleotid TypischeBasenzahl

Theoretische Spezifität

Primer 20 1 : 420 = 1 : 1,1 ·1012

Sonde 25 1 : 425 = 1 : 1,1 ·1015

Universelle Primer dienten in dieser Arbeit zum einen zur Kontrolle der Amplifizier-

barkeit der extrahierten DNA (Vermeidung von falsch-negativen Ergebnissen) und zum ande-

ren in sogenannten nested PCRs (s. Kap. 2.2.6.2). Optimal für diese Arbeit wäre ein spezifi-

sches Primerpaar gewesen, das alle Arten der Ordnung Glomales und ausschließlich diese

amplifiziert. Ein solches Primerpaar war allerdings nicht gegeben. Des weiteren wurden

Primerkombinationen verwendet, die nur bestimmte Arten oder Gruppen der Glomales erken-

nen konnten. Weiterhin fanden spezifische DNA-Sonden Verwendung, die hochspezifisch

eingesetzt werden konnten, um die Verteilung einzelner Arten zu untersuchen.

Da von einigen Autoren bei der Entwicklung ihrer Primer nur sehr wenig Sequenzdaten zur

Verfügung standen, wurde die Qualität einzelner oder kombinierter Primer hinsichtlich ihrer

Spezifität mit den seither neu ermittelten Sequenzen untersucht:


• Mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des National Center for Bio-

technology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) wurden einzelne

Primersequenzen eingegeben und von dem Programm mit sämtlichen verfügbaren Se-

quenzdaten der Datenbank verglichen.

• Mit den Sequenzen eines Primerpaares sowie der zu erwartenden Fragmentlänge (bis

1000 bp) konnte mit dem Programm FastM der Fa. Genomatix (www.genomatix.de)

eine „virtuelle PCR“ durchgeführt werden. Auch hier verglich der Computer die vor-

handenen Sequenzen der Datenbank mit den eingegebenen Daten und führte eine PCR

in silico durch. Die Ergebnisse konnten später auch dazu genutzt werden, um anhand

der Fragmentlänge die PCR-Produkte zu überprüfen.

Zielregion der verwendeten Primer war die ribosomale DNA (rDNA). Diese kodiert für

die RNA der Ribosomen (rRNA): die große Unterheinheit (large subunit, LSU, bei Pilzen

meist als 25S rRNA angegeben), die kleine Untereinheit (small subunit, SSU oder 18S rRNA)

sowie die 5.8S rRNA. Diese drei kodierenden Genabschnitte sind durch hochvariable Introns,

die internal transcribed spacer (ITS1 und ITS2) voneinander getrennt. In Abb. 10 sind die

konservierten Bereiche der ribosomalen DNA mit den variablen Spacer-Regionen (ITS1 und

ITS2) dargestellt. Eine Übersicht der Bindungsorte einzelner Primer findet sich in Abb. 11.

Die rDNA wird sehr häufig für phylogenetische Studien verwendet (WHITE et al., 1990), da

sie einige Vorteile besitzt. An den Ribosomen findet die Proteinbiosynthese statt, deshalb

muss die rDNA in allen Lebewesen vorhanden sein. Außerdem handelt es sich bei der rDNA

um ein high copy gene; die einzelnen identischen rDNA-Einheiten sind zu Hunderten tandem-

förmig aneinandergereiht (ARNHEIM, 1983). Dies ist vor allem dann von Vorteil, wenn nur

sehr wenig DNA des Zielorganismus für die Analyse vorhanden ist.

Abb. 10: Anordnung der rDNA-Einheiten. IGS: Intergenic spacer, ITS1: Internal transcribed spacer 1;ITS2: Internal transcribed spacer 2; SSU: small subunit; LSU: large subunit; 5.8S: 5.8S-Untereinheit.


Abb. 11: Hybridisierungspositionen der Oligonukleotidprimer. IGS: Intergenic spacer; ITS1: Internaltranscribed spacer 1; ITS2: Internal transcribed Spacer 2; LSU: large subunit; SSU: smallsubunit.

2.2.6 Polymerase-Kettenreaktion

Zur Untersuchung der AMF wurden in einer PCR DNA-Fragmente der rDNA amplifiziert.

Eine PCR besteht aus folgenden Einzelschritten:

Denaturierung (95 °C)

Die doppelsträngige DNA wird dabei zunächst durch eine Erwärmung auf 95 °C aufge-

trennt.

Annealing (ca. 50 bis 60 °C)

Nach einer Temperaturabsenkung hybridisieren die Primer mit den komplementären

Matrixsträngen. Die Annealing-Temperatur hängt dabei von der Länge und dem GC-

Gehalt der Oligonukleotide ab (je kürzer die Primer und je niedriger ihr GC-Gehalt, de-

sto niedriger ist die optimale Hybridisierungstemperatur). Eine Absenkung der Tempe-

ratur kann zu einer erhöhten Produktausbeute führen, da die Primer leichter binden, al-

lerdings können dabei durch unspezifische Bindungen unerwünschte Nebenprodukte

entstehen.

Elongation (72 °C)

Bei 72 °C synthetisiert die DNA Polymerase den DNA-Doppelstrang. Danach beginnt

der Zyklus von neuem.


Die entstehenden Fragmente werden exponentiell vermehrt: aus einer einzigen Startko-

pie könnten nach 30 Zyklen rein rechnerisch 230, also über eine Milliarde identische Kopien

entstehen. In der Regel ebbt die Reaktion jedoch z.B. wegen Substratmangels ab (MÜLHARDT,

2000).

2.2.6.1 Qualitative PCR-Analyse mit universellen Primern

Optimierung der Reaktionsbedingungen

Für die Optimierung der PCR wurde meist ein Standard PCR-Protokoll (INNIS & GELFAND

1990) als Ausgangspunkt gewählt (Tab. 8). Variiert wurden die Konzentrationen,

Polymerasen, Reaktionstemperaturen und –zeiten sowie Additiva (BSA, DMSO, Gelatine;

POWELL, 1995). Hierfür wurde hauptsächlich mit Agaricus bisporus gearbeitet, da diese Pilz-

DNA relativ leicht zu gewinnen war und in ausreichenden Mengen zur Verfügung stand.

Tab. 8: Standard PCR-Reaktionsgemisch (INNIS & GELFAND, 1990).

Stammlösung Endkonzentration

Aqua dest. - -

Puffer 10x 1x

MgCl2 25 mM 1 – 4 mM

dNTPs je 1 mM je 20 – 200 µM

Forward Primer 1 µM 0,1 – 0,5 µM

Reverse Primer 1 µM 0,1 – 0,5 µM

BSA 20 mg/mL 0,1 mg/mL

Taq DNA Polymerase 5 U/µL 1 – 2,5 U/100 µL

Template-DNA variabel 0,1 – 1 µg/100 µL

genomische DNA

Kontrolle der Amplifizierbarkeit

Neben der PCR-Optimierung konnte auch die Qualität der extrahierten DNA untersucht wer-

den. Die extrahierten DNA-Proben wurden zur Kontrolle ihrer Amplifizierbarkeit in einer

PCR mit unspezifischen Primern eingesetzt. Diese konnte gleichzeitig als erste PCR für eine

nested PCR dienen. Bei der Kontrolle mit den universellen Primern A2R und B2L wurde ein

Bereich der eukaryotischen 25S rDNA amplifiziert (BÖHM 2000). Zwar war die Präsenz von


Pilz-DNA in diesem Stadium noch ungewiss, doch musste die sicher vorhandene Pflanzen-

DNA ein positives Ergebnis liefern. War kein Produkt erkennbar, so wurde die extrahierte

DNA als nicht amplifizierbar gewertet. Umgekehrt wurde die Probe bei Erscheinen einer

Pflanzen-Bande in weiteren PCRs eingesetzt.

Die Reaktionen wurden mit jeweils 1 µL Matrizen-DNA (ca. 10 ng) in einem Reak-

tionsvolumen von 25 µL durchgeführt. Um identische Konzentrationen für alle Proben zu

gewährleisten, wurde optimierter Standard Master Mix A (Tab. 9) pipettiert und danach zu

den einzelnen Proben gegeben. Das Temperaturprogramm 1 ist in Tab. 10 wiedergegeben.

Tab. 9: Zusammensetzung des Master Mix A.

Stammlösung Endkonzentration Volumen je

25 µL-Ansatz

Wasser 17,63 µL

Puffer 10x 1x 2,5 µL

MgCl2 25 mM 2,5 mM 2,5 µL

dNTPs 10 mM 0,25 mM 0,65 µL

Forward Primer A2R 100 µM 1 µM 0,25 µL

Reverse Primer B2L 100 µM 1 µM 0,25 µL

Taq Polymerase 5 U/µL 2 U/100 µL 0,1 µL

BSA 20 mg/mL 0,1 mg/mL 0,125 µL

Master Mix A 24 µL

Template DNA variabel variabel 1 µL

Tab. 10: Temperaturprogramm 1 für die PCR mit den Primern A2R-B2L.

Temperatur Zeit Zyklenzahl

Initialdenaturierung 95 °C 2 min 1 x

Denaturierung 95 °C 60 s

Annealing 55 °C 50 s

Elongation 72 °C 60 s

35 x

Finale Elongation 72 °C 5 min 1 x


2.2.6.2 PCR-Analyse mit spezifischen Primern

Die mit den universellen Primern positiv getesteten DNA-Extrakte (genomische DNA) wur-

den anschließend mit den spezifischen Primerpaaren Glmoss85For-Glmoss387Rev und

Aclong87For-Aclong400Rev analysiert. Zusätzlich wurden dabei die Produkte der ersten

PCR (A2R-B2L-Fragmente) 1:100 verdünnt in einer nested PCR verwendet. Der Vorteil einer

solchen nested PCR liegt darin, dass in der zweiten PCR die Matrix-DNA bereits in größeren

Mengen vorliegt, und mögliche inhibierende Stoffe stark verdünnt werden. Die Längen der

Amplikons sind in Tab. 11 dargestellt. Für die spezifische PCR-Analyse wurde der Master

Mix B (Tab. 12) verwendet. Er enthält im Gegensatz zum Mastermix A geringere MgCl2- und

Primerkonzentrationen, wodurch die Spezifität der PCR-Reaktion erhöht wurde. Das verwen-

dete Temperaturprogramm 2 ist in Tab. 13 wiedergegeben.

Tab. 11: Größe der unterschiedlichen PCR-Produkte (BÖHM, 2000).

A. longula G. mosseae Pflanzen

A2R-B2L 448 bp 485 bp ca. 320 bp

Glmoss85For-Glmoss387Rev - 317 bp -

Aclong87For-Aclong400Rev 273 bp - -

Tab. 12: Zusammensetzung des Master Mix B.


25 µL-Ansatz

Wasser 17,98 µL

Puffer 10x 1x 2,5 µL

MgCl2 25 mM 2,3 mM 2,3 µL

dNTPs 10 mM 0,25 mM 0,65 µL

Forward Primer 100 µM 0,7 µM 0,175 µL

Reverse Primer 100 µM 0,7 µM 0,175 µL

Taq Polymerase 5 U/µL 2 U/100 µL 0,1 µL

BSA 20 mg/mL 0,1 mg/mL 0,125 µL

Master Mix B 24 µL

Template DNA variabel variabel 1 µL


Tab. 13: Temperaturprogramm 2 für die PCR mit spezifischen Primern.


Initiale Denaturierung 95 °C 2 min 1 x


Annealing 56 °C 60 s

Elongation 72 °C 45 s

35 x

Finale Elongation 72 °C 5 min 1 x

2.2.7 Gelelektrophorese

Elektrophoretische Auftrennung

Die Aufreinigung der PCR-Produkte und die Analyse der Fragmente erfolgte mittels hori-

zontaler Agarose-Gelelektrophorese (AGE). Zu diesem Zweck wurden 1%-ige Agarose-Gele

hergestellt (Tab. 14). Die Agarose wurde dabei im Puffer aufgeschwemmt und in der Mikro-

welle so lange erhitzt, bis sie sich vollständig gelöst hatte. Nach dem Abkühlen auf ca. 40 bis

50 °C wurde Ethidiumbromid hinzugefügt und die Lösung in die Gelschlitten gegossen. Jeder

wurde mit einem Kamm für die späteren Probentaschen versehen. Die Proben wurden vor

dem Auftragen 5:1 mit Probenpuffer (0,2 % Bromphenolblau, 0,2 % Xylencyanol, 60% Gly-

cerin, 60 mM EDTA) versetzt, und jeweils 10 µL in die Probentaschen pipettiert.

Tab. 14: Zusammensetzung eines 1%-igen Agarose-Geles.

Reagenz Kleines Gel Großes Gel

(20 cm x 20 cm)

Agarose 0,5 g 2,5 g

5x TBE-Puffer 10 mL 50 mL

Aqua dest. 40 mL 200 mL

Ethidiumbromid (10 mg/mL) 4 µL 20 µL

Die Elektrophorese erfolgte 45 min bei 120 V und maximaler Stromstärke in 1x TBE-

Puffer. Die negativ geladenen DNA-Fragmente wanderten dabei zur Anode. Die Auftrennung

erfolgte nach ihrer Masse. Als Molekulargewichtsstandard wurde ein kommerzieller DNA-

Längenmarker zugegeben (Abb. 12). Nach dem Lauf wurden die DNA-Fragmente mithilfe


des Ethidiumkations detektiert, welches zwischen zwei benachbarte Basenpaare interkaliert

(KNIPPERS, 2001) und in diesem Zustand unter Anregung mit UV-Licht (366 nm) fluoresziert.

Die sichtbaren Banden wurden mit einer Polaroid-Kamera dokumentiert.

Abb. 12: DNA-Längenmarker GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas).

Isolierung aufgereinigter DNA-Fragmente

Die aufgereinigten DNA-Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten, und

mithilfe des QIAquick Gel Extraction Kits isoliert. Hierzu wurden die abgewogenen Gel-

stückchen mit dem dreifachen Volumen Puffer QG versetzt und die Gelstruktur durch 10 mi-

nütige Inkubation bei 50 °C aufgelöst. Anschließend wurden die herausgelösten DNA-Frag-

mente durch Zugabe von 2-Propanol gefällt, in eine QIAquick spin column überführt und bei

13.000 rpm 1 min zentrifugiert. Die DNA band dabei an die Säule und wurde mit 750 µL

Puffer PE gewaschen, der ebenfalls abzentrifugiert wurde. Anschließend wurden die DNA-

Fragmente mit 50 µL Puffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8,5) eluiert.

2.2.8 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP-)Analyse

Da das Primerpaar Glmoss85For-Glomoss387Rev nicht G. mosseae-spezifisch ist, sondern

theoretisch auch nahe verwandte Arten amplifizieren könnte, wurden die mit diesem Primer-

paar erhaltenen PCR-Produkte mit verschiedenen Restriktionsenzymen (Endonukleasen) un-

tersucht (Tab. 15). Dazu wurden zu jeweils 10 µL PCR-Produkt 2 µL Puffer Y+/Tango

(wurde mit dem Enzym geliefert), 1µL Enzym (1:10 verdünnt) und 7 µL Aqua dest. gegeben,


1 h inkubiert und anschließend über eine AGE analysiert (s. Kap. 2.2.7). Je nach Vorhanden-

sein einer bestimmten Schnittstelle ergeben sich daraus spezifische Bandenmuster.

Tab. 15: Endonukleasen und ihre Erkennungssequenz.Pfeile geben die Schnittstelle an.

Restriktionsenzym Erkennungsstelle

AluI AG�CT

Hin6I G�CGC

HpaII C�CGG

RsaI GT�AC

2.2.9 Sequenzierung und Alignment

Die Sequenzanalysen der DNA-Fragmente wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg)

durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzdaten wurden mit verschiedenen bekannten Sequenzen

einer Datenbank (NCBI) mithilfe des Programms BioEdit verglichen und ihre phylogeneti-

sche Verwandtschaft analysiert.

2.2.10 Quantitativer Nachweis

Die real-time PCR (HEID et al., 1996) dient der quantitativen Analyse bestimmter Genab-

schnitte, die auf dem Prinzip der 5’-Nuklease-Aktivität (HOLLAND et al., 1991) einiger DNA

Polymerasen beruht. Bei der TaqMan® PCR wird neben den beiden Primern eine spezifische

Sonde eingesetzt, bestehend aus einem Oligonukleotid (gewöhnlich aus 15 bis 30 Basen),

einem fluorogenen Reporter-Farbstoff (Fluorescein-Derivat) am 5’-Ende und einem Quen-

cher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) am 3’-Ende, das zusätzlich durch einen Phosphatrest

blockiert ist (LEE et al., 1993). Während der Reaktion wird bei jedem Zyklus die Fluoreszenz

durch Anregungen mit Licht der Wellenlänge von 488 nm gemessen. Bei der intakten Sonde

wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes durch einen Energie-Transfer zum räumlich

nahegelegenen Quencher-Farbstoff verhindert (Abb. 13). Ist ein amplifizierbares Target vor-

handen, so hybridisiert die Sonde mit dem komplementären Matrizenstrang und wird während

der Extensionsphase durch die 5’�3’-Ex onukleaseaktivität der DNA Polymerase abgebaut.

Da durch diese Hydrolyse Reporter und Quencher räumlich voneinander getrennt werden,

steigt die Fluoreszenz entsprechend an und wird von einer CCD-Kamera in ein digitales

Signal umgesetzt.


Abb. 13: Schematische Darstellung des Prinzip der TaqMan® real time PCR. Die Sonde wird durch die5’�3’-Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase abgebaut. Der dabei freiwerdendeReporterfarbstoff (R) emittiert ein Fluoreszenzsignal. Quelle: HEID et al. 1996

Für G. mosseae und Acaulspora longula wurden die Primer P1 und P2 (BÖHM et al.,

1999) bzw. Aclog251For und Aclong338Rev (BÖHM, 2000) eingesetzt, die eine möglichst

geringe Amplikonlänge gewährleisten (SNIDER, 1999). Als Sonden wurden die Oligonukleo-

tide AclongSonde und F1 eingesetzt (BÖHM, 2000; BÖHM et al., 1999).

Tab. 16: Master Mix C für die TaqMan® PCR-Analyse.


50 µL-Ansatz

TaqMan® Universal Master Mix 2x 1x 25 µL

Sonde 2 µM 200 nM 5 µL

Forward Primer 3 µM 300 nM 5 µL

Reverse Primer 3 µM 300 nM 5 µL

Master Mix C 3 µM 300 nM 40 µL

Template-DNA /

Standards /

No Template Controll (NTC)

variabel variabel 10 µL


Die TaqMan® PCR wurde in einem ABI Prism 7700 Sequence Detector durchgeführt. In

einer 96er-Reaktionsplatte wurden jeweils 10 µL Probe, Standard oder no template control

(NTC) pipettiert und 40 µL Master Mix C (Tab. 16) zugesetzt. Die Proben (genomische

DNA) wurden 1:10 mit Aqua dest. verdünnt. Als NTC wurde Aqua dest. verwendet. Der

Standard wurde von Frau Dr. Lux-Endrich zur Verfügung gestellt. Dabei handelte es sich um

mit dem Primerpaar A2R-B2L amplifizierte PCR-Produkte von G. mosseae und A. longula,

die in den Vektor pT7Blue kloniert und mit dem QIAGEN Plasmid Extraction Kit extrahiert

wurden. Die Stammlösungen enthielten 1,7·109 (G. mosseae) und 2·108 (A. longula) Plasmide

je µL. Für eine Kalibrationsgerade wurde von der Stammlösung eine Verdünnungsreihe her-

gestellt (Tab. 17), um daraus die unbekannte DNA-Menge der Proben bestimmen zu können.

Zur Kontrolle wurden jeweils zwei Wiederholungen pipettiert. Die Kavitäten wurden mit op-

tischen Deckeln verschlossen.

Tab. 17: Plasmid-Anzahl in der verwendeten Standardreihe.

Verdünnung Kopien-Anzahl (G. mosseae) Kopien-Anzahl (A. longula)

1:102 1,7·108 2·107

1:103 1,7·107 2·106

1:104 1,7·106 2·105

1:105 1,7·105 2·104

1:106 1,7·104 2·103

1:107 1,7·103 2·102

Der TaqMan® Universal PCR Master Mix von Applied Biosystems enthält die Ampli-

Taq Gold Polymerase, Uracil DNA-Glycosylase (AmpErase UNG), Nukleotide (wobei dTTP

durch dUTP ersetzt ist) und ROX als passiven Referenzfarbstoff, mit dem die Variabilität in

der Fluoreszenz zwischen den einzelnen Reaktionen ausgeglichen werden (SCHILD, 1996).

Zunächst wurde bei 50 °C inkubiert, wobei mögliche carry-over-Kontaminationen durch die

Uracil DNA-Glycosylase abgebaut werden (weshalb dUTP statt dTTP verwendet wird). Am-

pliTaq Gold Polymerase ist bei Zimmertemperatur inaktiv und wird erst durch 10-minütige

Inkubation bei 95 °C aktiviert. Sie besitzt dann dieselben Eigenschaften wie die Taq DNA Po-

lymerase. Da die AmpliTaq Gold-Polymerase schon bei 60 °C aktiv ist, können der Annea-

ling- und Syntheseschritt zusammengefasst werden und die quantitative Bestimmung in einer

Zwei-Schritt-PCR durchgeführt werden (Tab. 18). Einerseits bewirkt die erhöhte Annealing-


temperatur eine höhere Spezifität, zum anderen erfolgt die Hydrolyse der Sonde bei 60 °C

effektiver als bei 72 °C (SCHILD, 1996).

Tab. 18: Temperaturprogramm 3 für die TaqMan® PCR.


Carry-over-Verdau 50 °C 2 min 1 x

Denaturierung und

Polymerase-Aktivierung

95 °C 10 min 1 x


Annealing und Elongation 60 °C 60 s

40 x

Entscheidend für die Quantifizierung ist der jeweilige Ct-Wert einer Probe. Dieser Wert gibt

die Zykluszahl an, bei der das Fluoreszenz-Signal erstmals einen bestimmten Schwellenwert

signifikant überschreitet. Je höher die Startkopienzahl, desto geringer der Ct-Wert. Aus den

Ct-Werten der Standardreihe wurde eine Quantifizierungskurve erstellt und daraus durch In-

terpolation die jeweilige Startkopienzahl der Proben ermittelt.

Die Effizienz der PCR läßt sich ebenfalls über die Ct-Werte der Standardreihe ermitteln.

Hierzu werden die Kopienzahlen halblogarithmisch gegen ihre Ct-Werte aufgetragen und die

Steigung m ermittelt. Die Effizienz kann mit folgender Gleichung errechnet werden (HIGUCHI

& WATSON, 1999):

Effizienz = 10-1/m-1; m: Steigung der Geraden

Da sich die Kopienzahl je Zyklus theoretisch verdoppelt müsste bei zehnfacher Kopien-

zahl und 100%-iger Effizienz der Ct-Wert um 3,322 niedriger sein.

2.2.11 Bestimmung der arbuskulären Mykorrhizapilze anhand der

Sporenmorphologie

Mithilfe der Sporenmorphologie kann eine Charakterisierung der AMF vorgenommen wer-

den. Dieses Kriterium wurde ursprünglich zur Arteneinteilung benutzt. In der Regel werden

dabei mehrere Dutzend Sporen einer Pilzkultur untersucht, da wichtige Merkmale wie Größe

oder Farbe variieren können. Diese Methode wurde angewandt, um die Referenzkulturen zu


kontrollieren. Außerdem wurden in einem Vorversuch Bodenproben auf Sporen untersucht,

wobei jede Spore individuell bewertet wurde.

Für die Isolierung der Sporen wurden 2-3 Teelöffel Substrat bzw. Bodenprobe entnom-

men und in einem Becherglas mit Aqua dest. aufgeschwemmt. Nach der Nass-Siebmethode

(GERDEMANN & NICOLSON, 1963) wurden die Proben dann unter einem Wasserstrahl über

Siebe mit unterschiedlichen Porengrößen (5 mm, 500 µm und 38 µm) in einzelne Fraktionen

aufgeteilt. Die Sporen befanden sich zusammen mit Wurzelbruchstücken, Steinchen und an-

derem Material im Sieb mit der geringsten Maschenweite. Um die stark mit Fremdmaterial

durchmischten Sporen der Bodenproben weiter aufzureinigen wurden diese mit Aqua dest.

zentrifugiert (10 min, 2.000 rpm), der Überstand verworfen, der Rückstand mit 45% (w/v)

Saccharoselösung aufgeschlemmt und nochmals 2 min bei 1500 rpm zentrifugiert (DANIELS &

SKIPPER, 1984). Die Sporen blieben dabei aufgrund ihrer Dichte in der Saccharoselösung.

Diese wurde in das 38 µm-Sieb geschüttet und mit Aqua dest. nachgespült. Anschließend

wurden die Sporen mit einem kleinen Volumen Aqua dest. in eine Glas-Petrischale gespült

und unter einem Stereomikroskop aussortiert. Mit einer Pipette wurden die Sporen auf einen

Objektträger überführt und mit einem Deckglas fixiert. Zur Identifizierung wurden sie in Po-

lyvinylalkohol-Lacto-Glycerin (PVLG) und PVLG/Melzer’s Reagenz (1:1, v/v) eingebettet

(KREISEL & SCHAUER, 1987; MORTON, 1995). Durch leichten Druck auf das Deckglas wur-

den die Sporen aufgebrochen, um die Sporenwanddicke und den Sporenwandaufbau im Mi-

kroskop untersuchen zu können. Weiterhin wurde ihre Form, Größe, Farbe und Färbung

durch Melzer’s Reagenz bonitiert und mit Bestimmungshilfen (SCHENCK & PÉREZ, 1990;

INVAM) eine Kontrolle bzw. Artbestimmung durchgeführt.

2.2.12 Färbung der intraradikalen Pilzstrukturen

Um den Umfang der Kolonisierung der Pflanzenwurzeln durch AMF festzustellen, wurden

die intraradikalen Pilzstrukturen in den gereinigten Wurzeln mit Trypanblau angefärbt (modi-

fiziert nach KORMANIK & MCGRAW, 1984). Da die Wurzeln der drei untersuchten Pflanzen

unterschiedlich empfindlich gegenüber Kochen und Bleichen reagierten, musste das Protokoll

je nach Pflanze geändert werden.

Die Wurzeln wurden zunächst zur leichteren Handhabung in ein Vlies eingewickelt und

an den beiden Enden mit Büroklammern zugeheftet. Die Proben wurden einzeln in Flaschen

mit 10%iger Kaliumhydroxid-Lösung überführt und in einem Tischautoklaven auf 121 °C

erhitzt (H. lanatus nur auf 80 °C, da sich sonst die Cortexzellen ablösen). Durch das Kochen


in KOH wurde das Cytoplasma entfärbt. Nach Erreichen der Temperatur wurde langsam ab-

gekühlt und anschließend die gelblich gefärbte Lauge zweimal durch jeweils einminütiges

Waschen mit Aqua dest. entfernt.

Um eine bessere Färbung zu erzielen, wurde 3 min in einer 1%igen HCl-Lösung ange-

säuert. Anschließend wurden die Probenpäckchen in Trypanblau-Färbelösung überführt und

erneut für 5 min auf 121 °C erhitzt (H. lanatus 5 min auf 80 °C). Nach dem Abkühlen wurden

die Probenpäckchen mehrmals mit Leitungswasser gewaschen, bis keine Blaufärbung mehr

auftrat. Danach wurden die Klammern an den Seiten abgeschnitten und die Wurzeln aus dem

Vlies befreit. Die Wurzeln wurden dann auf Objektträger aufgezogen, in Kaisers Glyceringe-

latine eingebettet und mit einem Deckglas unter leichtem Druck fixiert.

2.2.13 Bestimmung des Mykorrhizierungsgrades

Die Auswertung wurde mit einem Lichtmikroskop (Zeiss Axioplan) bei 400-facher Vergröße-

rung durchgeführt. Die Dokumentation erfolgte über einen Fotoaufsatz mit einer Spiegelre-

flexkamera (Nikon F-801s). Für die Analyse der Mykorrhizierung wurden verschiedenste

Protokolle entwickelt. In dieser Arbeit wurde die Magnified Intersection-Methode angewandt

(MCGONIGLE et al., 1990).

Hierbei wurden die einzelnen Objektträger bei 200-facher Vergrößerung schlangenlini-

enförmig bewegt: zunächst an einem Ende beginnend vertikal; war das Ende erreicht, so

konnten die Objektträger anhand der Skala auf dem Objektträgertisch um 0,5 cm horizontal

verschoben werden und vertikal in entgegengesetzter Richtung abgesucht werden. War das

Ende abermals erreicht, so wurde wieder um 0,5 cm horizontal verschoben und vertikal abge-

sucht, so lange bis das horizontale Ende erreicht war. Wurde dabei mit dem Fadenkreuz des

Okulars ein Wurzelabschnitt getroffen, so wurde notiert, ob dieser Hyphen, Vesikel oder Ar-

buskel enthielt. Pro Stichprobe wurden durchschnittlich etwa fünfzig solcher Schnittpunkte

bewertet. Wurzeln ohne Cortex wurden nicht bonitiert. Durch Bildung der Summe von

Schnittpunkten mit Arbuskeln, Vesikeln, Hyphen und nicht-mykorrhizierten Wurzelab-

schnitten konnte die Hyphen-Kolonisierungsrate HC, Kolonisierungsrate mit Arbuskeln (AC)

und Koloniesierungsrate mit Vesikeln (VC) berechnet werden:


∑∑=

hnitteWurzelabsc

ArbuskelAC

∑∑=

hnitteWurzelabsc

VesikelVC

∑∑=

hnitteWurzelabsc

HyphenHC

Allerdings wiesen bereits MCGONIGLE et al. (1990) darauf hin, dass durch Trypanblau

auch Hyphen phytopathogener Pilze gefärbt sein können. Ein wichtiges Unterscheidungs-

merkmal sind hierbei die unseptierten Hyphen der arbuskulären Mykorrhizapilze.

2.2.14 Phosphatbestimmung

Für die Bestimmung des Phosphatgehalts in Bodenproben existieren zahlreiche Protokolle.

Hier wurde die CAL-Methode verwendet, bei der ein saurer, auf pH 4,1 gepufferter Calcium-

Acetat-Lactat (CAL)-Auszug hergestellt und anschließend photometrisch bestimmt wird. Die

CAL-Methode wird als Maß für die „pflanzenverfügbare Phosphatmenge“ definiert. Von den

im Boden zahlreichen Phosphatverbindungen werden hierbei diejenigen berücksichtigt, die

entweder leicht wasserlöslich sind, oder durch die Enzyme der Pflanzen zusätzlich aufge-

schlossen werden können. Im Unterschied zum Gesamtphosphatgehalt werden die – auch für

Pflanzen - schwerlöslichen Phosphate nicht berücksichtigt (Hoffmann, 1991). Das Protokoll

wurde auf Mikromaßstab reduziert, sowie die gemessene Wellenlänge auf das Absorptions-

maximum festgelegt.

Die getrockneten Bodenproben wurden mit einem Löffel durch ein feines Metallsieb

(Maschenweite 2 mm) gedrückt und eventuell beigemischtes Pflanzenmaterial entfernt. Von

dem homogenen Pulver wurde ca. 1000 mg genau eingewogen, in einem 100 mL Erlenmeyer-

Kolben mit 20 mL CAL-Gebrauchslösung versetzt, und 90 min auf einem Horizontalschüttler

mit 140 rpm geschüttelt. Anschließend wurde filtriert und dabei die ersten 1-2 mL des Filtrats

verworfen.

Für die Messung wurden ein UV/VIS-Photometer sowie 10 mm-Kunststoffküvetten

verwendet. Als Reagenzienblindwert wurden 500 µL CAL-Gebrauchslösung, 750 µL Wasser,

50 µL Molybdatreagenz und 50 µL Reduktionslösung in eine Küvette pipettiert und der


Blindwert am Photometer eingestellt. Mithilfe eines Phosphatstandards wurde eine Kalibrier-

reihe aufgestellt (Tab. 19).

Phosphationen bilden im Sauren mit Ammoniumheptamolybdat gelbe Phosphormo-

lybdänsäure H3P(Mo3O10)4, die anschließend durch Ascorbinsäure zu Molybdänblau reduziert

wird. Unter Molybdänblau versteht man Molybdän-Mischoxide der Wertigkeit Mo(IV) und

Mo(VI) (HOLLEMANN & WIBERG, 1985). Zunächst wurde eine Absorptionskurve aufgenom-

men. Die Messung erfolgte dann bei 850 nm, dem Absorptionsmaximum von Molybdänblau,

mit Dreifach- oder später Doppelbestimmungen.

Von den Filtraten der einzelnen Bodenproben wurden jeweils 500 µL mit 750 µL Aqua

dest., 50 µL Molybdatlösung und 50 µL Reduktionslösung in eine 10 mm-Küvette pipettiert,

gemischt und nach ca. 10 min bei 850 nm gegen den Reagenzienblindwert gemessen. Alle

Proben wurden mindestens doppelt bestimmt. Lag der Absorptionswert über 1, wurde ent-

sprechend verdünnt. Die Gehalte werden gewöhnlich in Phosphor (mg P/kg Boden), Phosphat

(mg PO43-/100 g Boden) oder wie in dieser Arbeit als Phosphor(V)-Oxid1 angegeben

(mg P4O10/100 g Boden).

Tab. 19: Pipettierschema der Kalibrierreihe zur Phosphatbestimmung.

Standard

(mg P4O10/100 g Boden)

0 0,8 2 4 8 12 16 20 24 28

Phosphatstandardlösung (µL) 0 1 2,5 5 10 15 20 25 30 35

CAL-Gebrauchslösung (µL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500

Molybdatreagenz (µL) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Reduktionslösung (µL) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Aqua dest. (µL) 750 749 748 745 740 735 730 725 720 715

1 Phosphor(V)-Oxid wird häufig als P2O5 angegeben (FINCK, 1991). Hier wird die korrekte Form P4O10 benutzt.

3 Ergebnisse 44

3 Ergebnisse

Die Bonitierung der AMF in radix mit molekularbiologischen und „klassischen“

Experimenten hatte zum Ziel, die Verteilung und Häufigkeit einzelner AMF-Arten bei

bestimmten Pflanzen im Freiland zu bestimmen. Neben dem qualitativen Nachweis einzelner

Arten wurden zusätzliche quantifizierende Analysen durchgeführt, die Aufschluss über die

Rolle der AMF bei der Versorgung der Pflanzen mit Nährstoffen geben sollten.

3.1 Optimierung der DNA-Extraktion aus Wurzelmaterial

Zunächst war es nicht möglich gewesen, trotz scheinbar ausreichender Mengen an DNA und

diverser Optimierungsversuche, reproduzierbare PCR-Ergebnisse zu erhalten. Die Vermutung

lag nahe, dass das Problem an der DNA-Extraktion liegen könnte. Verdünnungsreihen, die

zum Ziel hatten, inhibierende Substanzen wie Polysaccharide soweit zu verdünnen, dass sie

keine negativen Effekte mehr auf das Ergebnis gehabt hätten, scheiterten ebenfalls. Polyphe-

nole können bei einer Zerstörung der Zelle, zum Beispiel durch Austrocknung, in kürzester

Zeit durch Phenoloxidasen und Peroxidasen oxidiert werden, dabei Radikale bilden und im

schlimmsten Fall an die DNA binden (ABU AL-SOUD & RADSTRÖM, 1988). Diese wäre dann

in der PCR von der Polymerase nicht mehr „lesbar“. Das Ziel der Extraktionsoptimierung war

daher, die DNA so schnell wie möglich zu isolieren, bevor sie durch Radikale angegriffen

wurde. Hierzu wurden drei verschiedene Methoden getestet. Die Extraktion nach DOYLE &

DOYLE (1987) war für DNA aus Pflanzenmaterial entwickelt worden. BAHNWEG (1998) hatte

eine Methode für schwieriges Material, wie Wurzeln entwickelt. Daneben stand der DNeasy

Plant Mini Kit zur Verfügung, der ebenfalls für Pflanzenmaterial entwickelt worden war.

Darüber hinaus wurden verschiedene Möglichkeiten der Zelllyse variiert (Abb. 14). Die

Extrakte wurden mithilfe eines Agarose-Gels analysiert und ihr DNA-Gehalt mit dem Pico-

Green® Assay bestimmt. Dabei zeigte sich, dass bei der Methode mit dem Ultraschallstab

zwar relativ viel DNA gewonnen werden konnte (über 60 µg/mL, Abb. 14, Spuren 1 und 2),

die DNA jedoch durch die starken Scherkräfte fragmentiert wurde. Das Zermösern mit einem

Micropistill brachte sehr geringe Ausbeuten (8 µg/mL, Spur 6), ebenso der Aufschluss mit

einem Ultra-Turrax (6 µg/mL, Spur 7). Die Extraktion mit dem QIAGEN-Kit in Kombination

mit der Schwingmühle brachte die besten Ergebnisse: relativ hohe Ausbeuten (40 µg/mL,

Spur 3) bei geringer Degradation. Noch höhere Ausbeuten ließen sich durch Inkubation mit

Protease und Chitinase bei 25 °C bzw. 37 °C erzielen (62 und 71 µg/mL, Spuren 4 und 5).

Allerdings wurde die DNA durch die erhöhte Temperatur etwas stärker degradiert.

3 Ergebnisse 45

Abb. 14: DNA-Extrakte mit verschiedenen Zelllyse-Techniken in 1%-Agarose-Gel.Zelllyse mit: 1 - Ultraschallstab, 2 - Ultraschallstab und Poly-A (als Träger-DNA), 3 - Schwingmühle, 4 - Schwingmühle und Inkubation mit Proteaseund Chitinase bei 25 °C, 5 - Schwingmühle und Inkubation mit Protease undChitinase bei 37 °C, 6 - Micropistill, 7 - Ultra-Turrax, 8 - Negativkontrolle(Aqua dest.) mit Schwingmühle; M: 100bp DNA Ladder Plus, m: 20 bp DNALadder. Darunter zum Vergleich die mit PicoGreen® ermittelten DNA-Kon-zentrationen der Extrakte.

3.2 Untersuchung der Oligonukleotidprimer

Um die Spezifität verschiedener Primer zu testen, wurden ihre Sequenzen mithilfe der

BLAST-Software analysiert (ALTSCHUL et al. 1997). Die eingesandten Sequenzen wurden mit

der Datenbank auf Übereinstimmungen überprüft. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in zwei

Richtungen untersucht: 1) passte die spezifische Primersequenz zu allen Stämmen einer

Art/Gruppe und 2) schloss sie alle anderen Arten aus? Die Ergebnisse dieser Spezifitäts-Un-

tersuchung sind in (Tab. 20) dargestellt. Die Zahlen drücken die Basenhomologie aus.

Der von SIMON et al. (1992) beschriebene „Glomales-spezifische“ Primer VANS1 passt

nur bei einigen AM-Pilzarten 100%-ig. Zahlreiche Sequenzen hingegen, z.B. von Glomus

etunicatum, Acaulospora- und Scutellospora-Arten stimmten zum Teil nur mit 16 von 23 Ba-

sen mit der Primersequenz überein und wiesen mehrere Abweichungen auf.

3 Ergebnisse 46

Tab. 20: Vergleich der Sequenzen spezifischer Primer mit Datenbanksequenzen. Die Zahlen in derSpalte Basenhomologie geben die übereinstimmenden Basen an. Zahlen in Klammern ge-ben die Anzahl der Sequenzen einer Art an. Die Autoren sind in Tab. 1 aufgeführt.A.: Acaulospora, Ar.: Archaeospora, E.: Entrophospora, G.: Glomus, Gi.: Gigaspora, P.:Paraglomus, S.: Scutellospora.

Primer Länge

(Basen)

Spezifität

laut Autor(en)

Basenhomologie

VANS1 23 Glomales 23: G. intraradices, Gi. rosea, Gi. margarita,“Endophyte”

22: G. etunicatum

21: S. dipapillosa, S. pellucida, Gi. albida,G. vesiculiferum

19: G. etunicatum

17: A. rugosa

16: A. spinosa

ITS1F 22 Pilze 22: zahlreiche Glomales-Arten und andere Pilze,Chaetosphaeridium globosum (Grünalge)

ACAU1660 17 Acaulosporaceae 17: A. scrobiculata, A. longula, A. laevis, A. rugosa,A. morrowiae, E. colombiana

14: A. spinosa, Ar. leptoticha

ARCH1311 19 Paraglomaceae 19: P. occultum, P. brasilianum; 8 Pilzsequenzen(Rhynchostoma minutum, Acrospermum spp.,…)

GLOM1310 20 Glomaceae 20: G. caledonium, G. fasciculatum, G. intraradices,G. manihotis, G. sinuosum, G. vesiculiferum

19: G. caledonium, G. clarum, G. coremioides,G. coronatum, G. fragilistratum, G. mosseae,G. proliferum, G. verruculosum

LETC1670 18 G. etunicatum-Gruppe

18: G. claroideum, G. etunicatum, G. lamellosum,G. luteum, G. sp. S329, G. sp. W3234

17: Bensingtonia musae & ingoldii

GIGA5.8R 19 Gigasporaceae 19: Gigaspora (5 Arten), Scutellospora (4 Arten)

GLOM5.8R 19 Glomaceae 19: G. caledonium, G. clarum, G. dimorphicum,G. geosporum, G. intraradices, G. monosporum,G. mosseae

Aclong87For 22 A. longula 22: A. longula

Aclong251For 23 A. longula 23: A. longula

AclongSonde 27 A. longula 27: A. longula

3 Ergebnisse 47

Tab. 20 (Fortsetzung)

Primer Länge

(Basen)

Spezifität

laut Autor(en)

Annealing

Aclong338Rev 22 A. longula 22: A. longula

21: Blastobotrys capitolata

Aclong400Rev 24 A. longula 24: A. longula

19: A. tuberculata, A. spinosa

Glmoss85For 22 G. mosseae 22: G. mosseae, G. constrictum, G. coronatum,G. geosporum, E. infrequens

Glmoss387Rev 25 G. mosseae 25: G. mosseae, G. caledonium, G. constrictum,G. coronatum, G. geosporum, E. infrequens

P1 20 G. mosseae 20: G. mosseae

18: G. coronatum, E. infrequens

F1 31 G. mosseae 31: G. mosseae (18)

30: G. mosseae (6), G. constrictum, G. coronatum,E. infrequens

P2 27 G. mosseae 27: G. mosseae (19)

25: G. mosseae (1)

23: G. mosseae (5), G. geosporum, G. constrictum,G. coronatum

Der Primer ITS1F wurde als pilzspezifisch beschrieben (GARDES & BRUNS, 1993). Tat-

sächlich wurden zahlreiche Glomales-Arten mit übereinstimmender Sequenz gefunden. Aller-

dings „erkennt“ der Primer auch Chaetosphaeridium globosum, eine Grünalge.

Der von REDECKER (2000) publizierte Primer ACAU1660 ist für einige Arten der

Acaulosporaceae spezifisch. Allerdings diskriminiert er Acaulospora spinosa. ARCH1311

passt zu den beiden Paraglomus-Arten. Es wurden jedoch noch mindestens 8 weitere Pilzar-

ten gefunden, die 100%-ige Homologie besitzen. Bei dem Glomaceae-spezifischen Primer

GLOM1310 besaßen 7 Glomus-Arten eine Übereinstimmung in allen 20 Basen, 8 weitere

Glomus-Arten eine Übereinstimmung in 19 der 20 Basen. LETC1670 wurde als spezifisch für

die „Glomus etunicatum-Gruppe“ beschrieben. Es konnte völlige Übereinstimmung mit

Glomus etunicatum und fünf weiteren Glomus-Arten gefunden werden. Allerdings traf die

Sequenz auch mit 17 der 18 Basen auf zwei Bensingtonia-Arten zu. Bei den Primern

3 Ergebnisse 48

GIGA5.8R und GLOM5.8R wurden zahlreiche Arten der Gigasporaceae bzw. Glomaceae mit

völliger Übereinstimmung gefunden.

Die von BÖHM (2000) entwickelten Primer für A. longula (Aclong87For,

Aclong251For, AclongSonde, Aclong338Rev und Aclong400Rev) stimmten alle mit den in

der Datenbank vorhandenen Sequenzdaten von A. longula überein. Bei Aclong338Rev ergab

sich eine hohe Übereinstimmung von 21 der 22 Basen mit Blastobotrys capitolata. Die

G. mosseae-spezifischen Primer (Glmoss85For und Glmoss387Rev) stimmten zu 100% mit

Sequenzen von G. mosseae, G. caledonium, G. constrictum, G. coronatum, G. geosporum und

Entrophospora infrequens überein. P1 war identisch mit der G. mosseae-Sequenz. Allerdings

passten 18 von 20 Basen bei G. coronatum und E. infrequens. Bei P2 waren 19 von insgesamt

25 Datenbanksequenzen von G. mosseae mit dem Primer identisch. Die restlichen sechs Se-

quenzen differierten um bis zu vier Basen.

Im zweiten Schritt wurden die Primern in einer „virtuellen PCR“ getestet. Hierbei wur-

den die Primerpaare via Internet mithilfe der Software der Fa. Genomatix

(www.genomatix.de) mit Datenbanksequenzen verglichen. Zusätzlich zur Primersequenz

konnte die erwartete Produktlänge in Basenpaaren angegeben werden. Die Software ermittelte

solche Sequenzen, bei denen sowohl Fragmentlänge als auch die Bindungsstellen der beiden

Primer übereintrafen (Tab. 21).

Das Primerpaar VANS1-NS21 (SIMON et al. 1992) erbrachte ganze drei Sequenzen.

Dieses Ergebnis bestätigte die Tatsache, dass viele Glomales-Arten von VANS1 nicht erfasst

werden. Mit dem Primerpaar A2R-B2L wurden zahlreiche Sequenzen von Pilzen, Pflanzen

und Invertebraten gefunden. Damit war die universelle Bindungseigenschaft der beiden Oli-

gonukleotide bestätigt. Aclong87For und Aclong400Rev passten nur auf drei Sequenzen von

A. longula. Das Primerpaar ist also – bezogen auf bisher bekannte Sequenzen – spezifisch für

diese Art. Dem Ergebnis der in silico PCR mit den Primern Glmoss85For und Glmoss387Rev

zufolge, wurden neben G. mosseae mehrere, offenbar nah verwandte Arten, darunter

G. coronatum, G. constrictum, G. geosporum, G. caledonium, G. fragilistratum amplifiziert.

Die Spezifität dieses Primerpaares muß also auf eine G. mosseae-Gruppe ausgeweitet werden.

3 Ergebnisse 49

Tab. 21: Ergebnisse der „virtuellen“ PCR. Angaben in Klammern zeigen die Anzahl der gefundenenSequenzen. A.: Acaulospora, G.: Glomus, Gi.: Gigaspora.

ForwardPrimer

ReversePrimer

GesuchteAmplifikat-Länge

Ergebnisse (100% Übereinstimmung) MittlereAmplifikat-Länge dervirtuellen PCR

VANS1 NS21 300-800 bp G. intraradices, Gi. margarita, G. sp. 548 bp

A2R B2L 250-750 bp Pilze (>100), Pflanzen (>100), Invertebraten(>100)

338 bp

Aclong87For

Aclong400Rev

100-600 bp A. longula (3) 273 bp

Glmoss85For

Glmoss387Rev

100-600 bp G. mosseae (4), G. coronatum (8),G. constrictum (1), G. geosporum (3),G. caledonium (2), G. fragilistratum (1), G. sp. (7)

317 bp

3.2.1 Kontrolle der Amplifizierbarkeit

Alle eingesetzten Proben wurden zunächst mit dem allgemeinen Primerpaar A2R-B2L auf

Amplifizierbarkeit der genomischen DNA untersucht. Das Primerpaar A2R-B2L amplifiziert

einen Teilabschnitt der LSU rDNA, die Domäne D2. Die Größen der Amplikons von Pflanzen

und AMF sind unterschiedlich. Das Vorhandensein zumindest einer Pflanzenbande

(ca. 320 bp) bei dem universellen Primerpaar beweist die Amplifizierbarkeit des DNA-

Extrakts. Abb. 15 zeigt das Ergebnis einer PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L. In der Probe

1 wurde DNA aus G. mosseae-Sporen eingesetzt. Das Ergebnis ist eine diskrete Bande bei

ca. 500 bp. In den Proben 2 und 4 war Pflanzen-DNA, die ein Produkt bei ca. 330 bp lieferte.

Probe 3 war eine Mischprobe (P. lanceolata-Wurzel mit G. mosseae mykorrhiziert). Neben

der pflanzenspezifischen Bande bei ca. 330 bp ist noch eine weitere schwache Bande bei ca.

500 bp zu erkennen. In Probe 5 wurde zur Kontrolle Wasser eingesetzt.

Auf diese Weise wurden alle DNA-Extrakte auf ihre Amplifizierbarkeit untersucht.

Dies war notwendig, um falsch-negative Ergebnisse in den folgenden Experimenten mit spe-

zifischen Primerpaaren auszuschließen. Abb. 16 zeigt ein typisches Gel mit PCR-Produkten

der universellen Primer. 87% der Extrakte konnten dabei amplifiziert werden. Die Ergebnisse

sind in einer Übersicht in Kapitel 3.4 zusammengefaßt.

3 Ergebnisse 50

Abb. 15: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L in 1% Agarose-Gel. 1: G. mosseae(Sporen), 2: P. lanceolata (Blatt), 3: P. lanceolata (Wurzel) mit G. mosseae mykorrhiziert, 4:P. lanceolata (Wurzel), nicht mykorrhiziert, 5: Kontrolle (Aqua dest.), M: 100bp DNA LadderPlus.

Abb. 16: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L in 1% Agarose-Gel. M:100bp DNA Ladder Plus, P: Freilandproben, K: Kontrolle (Aqua dest.).

3.2.2 Qualitativer Nachweis von A. longula mit spezifischen Primern

Zum Nachweis des AMF A. longula wurden in PCR-Analysen genomische DNA aus Wur-

zelmaterial und 1:100-verdünnte PCR-Produkte der Amplifikation mit dem Primerpaar A2R-

B2L eingesetzt und mit dem Primerpaar Aclong87For-Aclong400Rev amplifiziert. Dabei lie-

ferte die PCR mit genomischer DNA in den meisten Fällen keine positiven Ergebnisse. Mit-

hilfe einer nested PCR konnten jedoch gute Ergebnisse erzielt werden (Abb. 17). Die PCR-

Ansätze, die zur Kontrolle der Amplifizierbarkeit durchgeführt worden waren, wurden dabei

mit Aqua dest 1:100 verdünnt und als Template DNA eingesetzt. Dies war möglich, da sich

die Primerbindungsstellen innerhalb des Fragments der PCR mit A2R und B2L befanden

(Abb. 11). Als Positivkontrollen wurde DNA-Extrakt einer Gewächshauskultur von

A. longula BEG8 verwendet. Als Negativkontrollen diente DNA von P. lanceolata,

ca. 330 bp

ca. 500 bp

ca. 330 bp

3 Ergebnisse 51

A. bisporus, verschiedene AM-Pilzarten, Aqua dest. und Proben, die in der PCR mit

unspezifischen Primern keine positiven Ergebnisse geliefert hatten.

Von den Kontrollen lieferte nur die Positivkontrolle mit A. longula BEG8 ein PCR-

Produkt. Die Länge des Amplikons entsprach der zu erwartenden Länge von 273 bp. Bei allen

anderen Kontrollen zeigte sich kein Signal. Bei den eingesetzten DNA-Proben waren fünf

Banden mit einer Amplifikatlänge von 273 bp zu erkennen. Bei weiteren acht Proben waren

sehr schwache Banden derselben Größe zu erkennen.

Abb. 17: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Aclong87For-Aclong400Rev in 1% Agarose-Gel. M: 100bp DNA Ladder Plus,P: Freilandproben, +: Positivkontrolle (P. lanceolata-Wurzel mitA. longula mykorrhiziert), -: Negativkontrolle (P. lanceolata-Blatt).

3.2.3 Qualitativer Nachweis von G. mosseae in Pflanzenwurzeln

Zum Nachweis einer Gruppe nah verwandter AM-Arten um G. mosseae wurden in PCR-

Analysen genomische DNA aus Wurzelmaterial und 1:100-verdünnte PCR-Produkte der Am-

plifikation mit dem Primerpaar A2R-B2L eingesetzt und mit dem Primerpaar Glmoss85For-

Glmoss387Rev amplifiziert. Wie schon beim Nachweis von A. longula lieferte auch hier die

PCR mit genomischer DNA kaum positiven Ergebnisse. Mit der nested PCR wurden jedoch

Produkte detektiert. Die Produkte der ersten PCR mit dem Primerpaar A2R-B2L wurden

1:100 verdünnt und als Template DNA eingesetzt. Als Positivkontrollen wurde DNA-Extrakt

einer Topfkultur von G. mosseae BEG68 verwendet. Als Negativkontrollen diente DNA von

P. lanceolata, A. bisporus, verschiedene AM-Pilzarten, Aqua dest. und Proben, die in der

PCR mit unspezifischen Primern keine positiven Ergebnisse geliefert hatten.

273 bp

3 Ergebnisse 52

Von den Kontrollen lieferte nur die Positivkontrolle mit G. mosseae BEG68 ein PCR-

Produkt. Die Länge des Amplikons entsprach der zu erwartenden Länge von 317 bp. Bei allen

anderen Kontrollen zeigte sich kein Signal. Bei den eingesetzten DNA-Proben lieferten 9 po-

sitive Ergebnisse (Abb. 18). Da bereits BÖHM (2000) die Artspezifität des Primerpaares in

Frage stellte und die Möglichkeit einer Kreuzreaktivität mit G. caledonium, G. coronatum,

G. constrictum, G. fragilistratum und G. geosporum vermutete, wurden die positiven Proben

nochmals unmittelbar nebeneinander nach ihrer Größe untersucht (Abb. 19). In dem Agarose-

Gel konnten keine Größenunterschiede bei den positiven Proben festgestellt werden. Alle

Banden besaßen eine Fragmentgröße von ca. 317 bp. Die Banden wurden ausgeschnitten, um

später sequenziert zu werden.

Abb. 18: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Glmoss85For-Glmoss387Rev in 1% Agaro-segel. M: 100bp DNA Ladder Plus, m: 20 bp DNA Ladder, a1-c6: Proben, c7:Negativkontrolle (P. lanceolata-Blatt), c8: Positivkontrolle (P. lanceolata-Wurzel mit G.mosseae mykorrhiziert).

Abb. 19: Amplifikate der PCR mit dem Primerpaar Glmoss85For-Glmoss387Revin 1% Agarose-Gel. Vergleich der PCR-Produkte. M: 100bp DNALadder Plus, 1: Negativkontrolle (P. lanceolata-Blatt), 2-10: Proben.

3.2.4 RFLP-Analyse der G. mosseae-Gruppe

Die Produkte der PCR mit den Primern Glmoss85For und Glmoss387Rev wurden mit vier

verschiedenen Restriktionsendonukleasen inkubiert und anschließend mithilfe der AGE ana-

lysiert. Bei dem Verdau der DNA-Fragmente mit HinfI, HpaII und RsaI traten keine Unter-

schiede auf. Bei AluI zeigten sich jedoch zwei unterschiedliche fingerprints (Abb. 20): Bei

drei Proben war eine Bande von ca. 270 bp Länge zu erkennen, bei den übrigen eine Bande

317 bp

317 bp

3 Ergebnisse 53

von ca. 130 bp. Anhand der Sequenzinformation (Kapitel 3.2.5) konnten mögliche Schnitt-

stellen des Enzyms AluI lokalisiert werden (Tab. 23). Bei den drei ungeschnittenen Fragmen-

ten (Pla5-004, HolIII-008 und ZeaA15) konnten auch in den Sequenzdaten keine Schnittstel-

len gefunden werden. Bei den restlichen Proben waren zwei Schnittstellen vorhanden, woraus

sich drei Fragmente mit 17, 121 und 128 bp ergaben. Diese Fragmentlängen stimmen mit de-

nen des Gels überein, unter der Voraussetzung, dass ein 17 bp-Fragment unter den gegebenen

Bedingungen im Gel nicht nachweisbar war und die beiden größeren Fragmente sich nicht

voneinander trennen ließen, also als eine Bande erschienen. Bei TraA21 fehlte die erste

Schnittstelle, so dass das zweite, größere Fragment eine Länge von 149 bp statt 121 bp besaß.

Bei HelA06 konnte über die erste Schnittstelle keine Aussage getroffen werden, da entspre-

chende Sequenzdaten fehlten. Hier waren auch im Gel keine eindeutigen Banden zu erkennen.

Tab. 22: Abkürzungen der untersuchten Sequenzen. Auf der linken Seite sind die Abkürzungen fürdie Sequenzen der Freiland-Isolate zusammengefaßt; auf der rechten Seite die verwendetenDatenbanksequenzen.

Ermittelte Sequenzen Datenbanksequenzen

Abkürzung Sequenz Abkürzung Sequenz

Glmoss68W G. mosseae BEG68 (Kontrolle)

Hel-A06 G. mosseae von H. annuus, A06,Juni 2000

HolI-108 G. mosseae von H. lanatus, W02-oben, August 2001

HolIII-008 G. caledonium von H. lanatus,W02-unten, August 2000

PlaIII-004 G. mosseae von P. lanceolata,W02-unten, April 2000

PlaIII-108 G. mosseae von P. lanceolata,W02-unten, August 2001

Pla4-004 G. mosseae von P. lanceolata,W21-unten Mitte, April 2000

Pla5-004 G. geosporum von P. lanceolata,W21-unten, April 2000

TraA21 G. mosseae von T. aestivum, A21,August 2001

ZeaA15 G. caledonium von Z. mays, A15,August 2001

EninfrMS05

GlcaleRMC

GlcaleRWZ

Glcoro28

Glcoro28K

Glfrag05

Glgeos11

Glgeos90

Glgeos106

Glmoss25

Glmoss68/2

Glmoss68/4

Glmoss68/6

Glmoss68/7

Entrophospora infrequens MS05

Glomus caledonium RMC658

Glomus caledonium RWZ658

Glomus coronatum BEG28

Glomus coronatum BEG28K

Glomus fragilistratum BEG05

Glomus geosporum BEG11



G. mosseae BEG25

G. mosseae BEG68 Klon 2



G. mosseae BEG68 Klon7

3 Ergebnisse 54

Abb. 20: RFLP-Analyse von zehn PCR-Fragmenten der G. mosseae-Gruppe mit dem Enzym AluI in1% Agarose-Gel. M: 100bp DNA Ladder Plus, 1: Gmoss68W, 2: Pla5-004, 3: Pla4-004, 4:PlaIII-004, 5: HelA06, 6: HolIII-008, 7: ZeaA15, 8: HolI-108, 9: TraA21, 10: PlaIII-108.Abkürzungen siehe Tab. 22.

Tab. 23: Übersicht über die Schnittstellen des Enzyms AluI. Abweichende Basen sind unterlegt.Schnittstellen sind mit Pfeilen (�) markiert, nicht geschnittene Positionen durch Striche (-),ungewisse Positionen durch ein Fragezeichen (?). Den Basen sind die Größen der Frag-mente angegeben. Abkürzungen siehe Tab. 22.

Position: 16-19 150-153 Fragmentlängen

AluI AG�CT AG�CT || || || ||Gmoss68W TAG�CTC GAG�CTT 17 – 128 - 121PlaIII-004 TAG�CTC GAG�CTT 17 – 128 - 121Pla4-004 TAG�CTC GAG�CTT 17 – 128 - 121HelA06 NNN?NNN GAG�CTT 17?- 128?- 121HolI-108 TAG�CTC GAG�CTT 17 – 128 - 121PlaIII-108 TAG�CTC GAG�CTT 17 – 129 - 121TraA21 TAG-TTC GAG�CTT 146 - 121HolIII-008 TAG-TTT GGG-CTT 267ZeaA15 TAG-TTT GGG-CTT 267Pla5-004 TAG-TTT GGG-CTT 267

3.2.5 Sequenzanalysen

Von der PCR mit den Primern Glmoss85For und Glmoss387Rev wurden zehn Amplikons

aufgereinigt und sequenziert, darunter neun Freilandproben und ein mit P. lanceolata kulti-

vierter Stamm von G. mosseae BEG68 (Glmoss68W) als Kontrolle. Von den erhaltenen Se-

quenzdaten wurden zunächst in der NCBI-Datenbank mithilfe des Programmes BLAST die

Sequenzen mit der größten Homologie ermittelt (Tab. 24). Mit diesen Datenbanksequenzen

und den sequenzierten Fragmenten von Glmoss85For und Glmoss387Rev wurde ein Annea-

ling durchgeführt. Zur Untersuchung der Sequenzhomologie wurde das Programm BioEdit

verwendet (HALL, 1999). Die Länge der sequenzierten Fragmente lag zwischen 265 und 270

Basenpaaren (Abb. 21). Die ersten 44 Nukleotide des Isolats HelA06 konnten bei der Sequen-

zierung nicht bestimmt werden. Sechs der neun sequenzierten Freiland-Stämme sowie die

Kontrolle G. mosseae BEG68 waren identisch oder unterschieden sich in nur einer Base

(0,4%) von G. mosseae-Stämmen aus der Datenbank. Diese sechs Isolate konnten folglich als

ca. 270 bpca. 130 bp

3 Ergebnisse 55

G. mosseae identifiziert werden. Eine weitere Untergruppe konnte aus Sequenzen von Glomus

fragilistratum und Glomus caledonium gebildet werden. Dieser Untergruppe konnten zwei

weitere Freiland-Isolate zugeordnet werden. Eines davon (HolIII-008) war identisch mit

G. caledonium RWZ658, das zweite (ZeaA15) wies eine hohe Homologie mit ihr auf

(99,3%). Die neunte Sequenz (Pla5-004) konnte als Glomus geosporum identifiziert werden.

Abb. 22 zeigt einen phylogenetischen Stammbaum der sequenzierten Freilandstämme sowie

ihrer ermittelten nächsten Verwandten aus der NCBI-Datenbank. Die Abkürzungen sind in

Tab. 22 angegeben.

Tab. 24: Sequenzhomologie mit nächstverwandten Arten. Abkürzungen siehe Tab. 22.

Sequenz(en) Homologie Nächstverwandte Spezies/Stamm Accession-Nr.

G. mosseae BEG68WTraA21

99,6% G. mosseae BEG68 Klon 6 AF389013

PlaIII-004Pla4-004

100% G. mosseae BEG68 Klon 4G. mosseae BEG25

AF389011AF304985

PlaIII-108HolI-108

100% G. mosseae BEG68 Klon 7 AF389014

ZeaA15 99,2% Glomus caledonium RWZ658 AF396789

Pla5-004 99,6% Glomus geosporum BEG90Glomus geosporum BEG106

AF145742AF145743

HolIII-008 100% Glomus caledonium RWZ658 AF396789

HelA06 99,6% G. mosseae BEG68 Klon 4G. mosseae BEG25

AF389011AF304985

3 Ergebnisse 56

10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|CONSENSUS 5‘ GAAATCAACCTTTTGAGCTTGGTCTCGTGGGTTTCGAAGAG---TTT-CAAAGCCTTCGGGlmoss68/4 5‘ ...................C..............T......---...-............Glmoss25 5‘ ...................C..............T......---...-............PlaIII-004 5‘ ...N...N...........C..............T......---...-............Pla4-004 5‘ ...NN..N...........C..............T......---...-............HelA06 5‘ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN---NNN-....N......NGlmoss68/7 5‘ ...................C..............T......---...-............HolI-108 5‘ ...NN..N...........C..............T......---...-............PlaIII-108 5‘ ..NNN..N...........C..............T......---...-............Glmoss68W 5‘ ...NN..N...........C..............T......---...-............TraA21 5‘ ...NN..N.........T.C.........N....T......---...-............Glmoss68/2 5‘ .................T.C..............T......---...-............Glmoss68/6 5‘ .................T.C..............T......---...-............Glfrag05 5‘ .................T................T......---...-............GlcaleRMC 5‘ ...........C.....T.......................TAG...T............GlcaleRWZ 5‘ ...........C.....T.......................---...T............HolIII-008 5‘ ...NN..N...C.....T.......................---...T............ZeaA15 5‘ ...NN..N...C.....T.......................---...T............Glgeos106 5‘ .................T...T...T...............---...-............Glgeos90 5‘ .................T...T...T...............---...-............Pla5-004 5‘ ..NNN..N.........T...T...T..NN...........---...-............Glgeos11 5‘ .................T.C.T...T...............---...-............Glcoro28K 5‘ .................T.C.T...T...............---...-............Glcoro28 5‘ ....................T............-.......---...-...C........EninfrMS05 5‘ ....................T............-.......---...-...C........

70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|CONSENSUS -ATTCGC-GAGATTGGGATCTTTTGGTGTACTTTCTCGTACGGTTAGTCAACATCGGTTTGlmoss68/4 -......-.G...........C....C.......T.........................Glmoss25 -......-.G...........C....C.......T.........................PlaIII-004 -......-.G...........C....C.......T.........................Pla4-004 -......-.G...........C....C.......T.........................HelA06 -......-.G.N....N.N..C....C.......T...C.....................Glmoss68/7 -......-.G..........AC....C.......T.........................HolI-108 -......-.G..........AC....C.......T.........................PlaIII-108 -......-.G..........AC....C.......T....N....................Glmoss68W C......-.G...........C....C.......T.........................TraA21 C......-.G...........C....C.......T.........................Glmoss68/2 -......-.G...........C....C.......T.........................Glmoss68/6 -......-.G...........C....C.......T.........................Glfrag05 -...TT.-.........T....C.....................................GlcaleRMC -...TT.-.........C....C.....................................GlcaleRWZ -...TT.-.........C....C.....................................HolIII-008 -...TT.-.........C....C.....................................ZeaA15 -...TT.-.........C....C...G.................................Glgeos106 -...T..TAG.......C..........................................Glgeos90 -...T..TAG.......C..........................................Pla5-004 -...T..TAG.......C..........................................Glgeos11 -...T..TAG.......C..........................................Glcoro28K -...T..TAG.......C..........................................Glcoro28 -G.....-....................................................EninfrMS05 -G.....-....................................................

Abb. 21: Ergebnis der Sequenzanalyse im Bereich der Domäne D2 in der G. mosseae-Gruppe.Dargestellt sind die Sequenzen ohne flankierende Primerbindungsstellen. Punkte bedeutenÜbereinstimmung mit der ermittelten Consensus-Sequenz; abweichende Nukleotide sindangegeben. Die in Klammern angegebenen Werte beziehen sich auf die Länge des Se-quenzabschnittes. A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, N = Nucleosid (unbestimmt), T =Thymidin. Sequenzierte Freilandproben sind fett gedruckt. Abkürzungen siehe Tab. 22.

3 Ergebnisse 57

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|CONSENSUS TGAATGTCATAAAATGACTGGAGGAATGTAGCTTCGATCTCGTATTGAAGTGTTATAGCCGlmoss68/4 ............................................................Glmoss25 ............................................................PlaIII-004 ............................................................Pla4-004 ............................................................HelA06 ........N...................................................Glmoss68/7 ............................................................HolI-108 ............................................................PlaIII-108 ............................................................Glmoss68W ............................................................TraA21 ............................................................Glmoss68/2 ............................................................Glmoss68/6 ............................................................Glfrag05 .............................G..............................GlcaleRMC .............................G..............................GlcaleRWZ .............................G..............................HolIII-008 .............................G..............................ZeaA15 .............................G..............................Glgeos106 .............................G............C..C...........A..Glgeos90 .............................G............C..C...........A..Pla5-004 .............................G...............C...........A..Glgeos11 .................T...........G...............C...........A..Glcoro28K .................T...........G...............C...........A..Glcoro28 .............................................C..............EninfrMS05 .............................................C..............

190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|CONSENSUS TTTGGTAGATGTGATGTTTGAGACCGAGGATTGCAACGGATACCCTTCA-GGGCTATTCGGlmoss68/4 .................................................-..........Glmoss25 .................................................-..........PlaIII-004 .................................................-..........Pla4-004 .................................................-..........HelA06 .....N...........................................-..........Glmoss68/7 .................................................-..........HolI-108 .................................................-..........PlaIII-108 .....N...........................................-..N.......Glmoss68W .................................................-..........TraA21 .................................................-..........Glmoss68/2 .................................................-..........Glmoss68/6 .................................................-..........Glfrag05 ..................C.............................T-..........GlcaleRMC ................................................T-..........GlcaleRWZ .......................T........................T-..........HolIII-008 .......................T........................T-..........ZeaA15 ................................................T-..........Glgeos106 ..................C.........................T...T-..........Glgeos90 ..................C.........................T...T-..........Pla5-004 ..................C.........................T...T-..........Glgeos11 ..................C.........................T...T-..........Glcoro28K ..................C.........................-...CA..........Glcoro28 ...............................................T.-..........EninfrMS05 .................................................T..........

Abb. 21 (Fortsetzung)

3 Ergebnisse 58

250 260 270 ....|....|....|....|....|....|...CONSENSUS TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘ (266 bp)Glmoss68/4 ................................. 3‘ (266 bp)Glmoss25 ................................. 3‘ (266 bp)PlaIII-004 ................................. 3‘ (266 bp)Pla4-004 ................................. 3‘ (266 bp)HelA06 ................................. 3‘ (266 bp)Glmoss68/7 ................................. 3‘ (266 bp)HolI-108 ................................. 3‘ (266 bp)PlaIII-108 .............................N... 3‘ (266 bp)Glmoss68W ................................. 3‘ (267 bp)TraA21 ................................. 3‘ (267 bp)Glmoss68/2 ................................. 3‘ (266 bp)Glmoss68/6 ................................. 3‘ (266 bp)Glfrag05 ............A...............C.... 3‘ (266 bp)GlcaleRMC ............A...............C.... 3‘ (270 bp)GlcaleRWZ ............A...............C.... 3‘ (267 bp)HolIII-008 ............A...............C.... 3‘ (267 bp)ZeaA15 ............A...............C.... 3‘ (267 bp)Glgeos106 ............................C.... 3‘ (267 bp)Glgeos90 ............................C.... 3‘ (267 bp)Pla5-004 ............................C.... 3‘ (267 bp)Glgeos11 ............................C.... 3‘ (267 bp)Glcoro28K ............................C.... 3‘ (266 bp)Glcoro28 ................................. 3‘ (265 bp)EninfrMS05 ................................. 3‘ (266 bp)

Abb. 21: (Fortsetzung)

� Glomus coronatum BEG28 �� Entrophospora infrequens MS05 � � � G. mosseae BEG68/2 + BEG68/6 � �� TraA21 � �� G. mosseae BEG68W � � G. mosseae BEG68/7, HolI-108, PlaIII-108 �� G. mosseae BEG25+BEG68/4,PlaIII-004,Pla4-004, �� HelA06�� Glomus geosporum BEG90 + BEG106 � �� Pla5-004 � � �� Glomus geosporum BEG11 �� Glomus coronatum BEG28K � �� Glomus fragilistratum BEG05 �� Glomus caledonium RMC658 �� ZeaA15 �� Glomus caledonium RWZ658, HolIII-008

Abb. 22: Phylogenetischer Stammbaum der G. mosseae-Gruppe. Grundlage bildete der Vergleich dersequenzierten Amplikons (fett abgebildet) mit Datenbanksequenzen. (�) entspricht einerSubstitution bei einer Gesamtlänge der Fragments von ca. 266 Nukleotiden. Abkürzungensiehe Tab. 22.

3 Ergebnisse 59

3.3 Quantitativer Nachweis der AMF

Für die Bestimmung der Kopienzahl wurde bei jedem Experiment eine Kalibrierkurve ange-

legt. Hierfür wurden Plasmide verwendet, die das mit dem Primerpaar A2R-B2L amplifizierte

Fragment der LSU rDNA von A. longula bzw. G. mosseae enthielten. Von den Plasmiden

wurden Verdünnungsreihen mit Aqua dest. hergestellt, die zur Berechnung einer Kalibrierge-

raden dienten. Die Plasmidverdünnungen, Proben und Kontrollen wurden in einer TaqMan®

96 well reaction plate vorgelegt. Hierzu wurde der Mastermix C pipettiert und die Kavitäten

mit TaqMan® optical caps verschlossen. Anschließend wurden in einem Abi Prism 7700

sequence detector 40 PCR-Zyklen durchgeführt und die dabei emittierte Fluoreszenz gemes-

sen. Die Software von Applied Biosystems errechnete automatisch für jeden Standard den Ct-

Wert, also diejenige Zykluszahl, bei dem das Fluoreszenz-Signal des Reporterfarbstoff erst-

malig über ein Hintergrundrauschen hinausragte. Die ermittelten Ct-Werte wurden

halblogarithmisch gegen die Kopienzahl der Standards aufgetragen. Die Stärke des Fluores-

zenz-Signals und damit der Ct-Wert waren abhängig von der eingesetzten Kopienzahl der

Ziel-DNA. Die in den Proben vorhandenen Kopienzahlen wurden durch Interpolation berech-

net. Da die Kopienzahl exponentiell zum Ct-Wert abnimmt, wurde das geometrische Mittel

der beiden Doppelbestimmungen ermittelt. Hieraus wurde auf die Kopienzahl je mg Pflan-

zenwurzel zurückgerechnet.

3.3.1 Quantifizierung von A. longula mit der TaqMan® PCR

Für die quantitative spezifische Bestimmung der Kopienzahl von A. longula-rDNA wurden

die beiden Primer Aclong251For und Aclong338Rev sowie die Sonde AclongSonde einge-

setzt. Die Länge des Amplikons betrug 92 bp. Für die Standardreihe wurde eine Verdün-

nungsreihe von klonierter A. longula-DNA hergestellt und mithilfe der ermittelten Ct-Werte

eine Standardkurve angefertigt. Abb. 23 zeigt den Verlauf der TaqMan® PCR mit den einge-

setzten A. longula-Standards. Der Rn-Wert entspricht dem Quotienten aus Emissionsintensität

des Reporterfarbstoffs und Emissionsintensität des passiven Referenzfarbstoffs. ÄRn

enstpricht dem Rn-Wert abzüglich dem Hintergrundsignal der ersten PCR-Zyklen. Die erhal-

tenen Werte sind in Tab. 25 zusammengefaßt und in Abb. 24 aufgetragen. Aus der Standard-

kurve ist der lineare Zusammenhang zwischen eingesetzter Kopienzahl und Signalstärke (Ct-

Wert) klar erkennbar. Mit der Steigung m der Korrelationsgeraden von -3,710 ergab sich eine

Effizienz der TaqMan® PCR von 86%. Der Korrelationskoeffizient der Standardkurve betrug

0,973.

3 Ergebnisse 60

Abb. 23: Amplification-Plot mit sechs DNA-Standards und Aqua dest. (jeweils Doppelbestimmungen).Die ÄRn-Werte der sechs A. longula-Standards wurden über der Zyklenzahl aufgetragen.Startkopienzahl: siehe Tab. 25.

Die Proben, die in dem Experiment mit den A. longula-spezifischen Primern Aclong87For

und Aclong400Rev positive Ergebnisse geliefert hatten, wurden daraufhin in der TaqMan®

PCR eingesetzt. Proben, bei denen beide Messungen erst nach dem 35. Zyklus ein Signal lie-

ferten wurden dabei aus folgenden Gründen nicht gewertet: 1) Nach dem 35. Zyklus nahm die

Linearität der Standardkurve ab und die Standardabweichung stark zu; 2) in diesem Bereich

können auch Negativkontrollen Signale liefern und 3) da es sich bei der rRNA um ein high

copy gene handelt, wobei die Kopien tandemförmig aneinandergereiht sind, erschien eine

Kopienzahl von weniger als 100 als unwahrscheinlich. Als Kontrolle wurden G. mosseae und

Aqua dest. verwendet.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08

Kopienzahl

Ct-

Wer

t

Abb. 24: Zusammenhang zwischen Kopienzahl und Ct-Wert der Kalibriergerade bei A. longula.

3 Ergebnisse 61

Die Ergebnisse sind in Tab. 26 zusammengefaßt. Bei A. longula BEG8 und sieben Proben

wurden Werte ermittelt, die eine Quantifizierung zuließen. Demnach befanden sich in der

Positivkontrolle 1889 Kopien je µL, die Proben enthielten zwischen 266 und 5926 Ko-

pien/µL.

Tab. 25: Zusammenstellung der Ct-Werte der eingesetzten Standard-Verdünnungsreihe bei A. longula.

Kopienzahl Ct-Wert 1 Ct-Wert 2 Mittelwert (n=2)

2 · 107 19,01 19,37 19,19

2 · 106 22,30 23,29 22,80

2 · 105 26,29 26,17 26,23

2 · 104 29,64 29,43 29,54

2 · 103 32,82 33,59 33,20

2 · 102 37,35 39,15 38,25

Tab. 26: Anzahl der ermittelten Kopienzahlen bei A. longula, geometrische Mittelwerte (n = 2) je µLDNA-Extrakt und Kopienzahl je mg Wurzel (FG).

Probe Kopienzahl A Kopienzahl B Mittelwert

je µL DNA-Ext.

Kopienzahl

je mg Wurzel

A. longula BEG8 1569 2274 1889 94450

PlaI-008 0 0 0 0

Pla3-004 2899 1283 1929 3445

Pla4-004 0 0 0 0

Pla5-004 775 790 782 3910

TriII-004 583 339 445 2967

TriII-008 0 0 0 0

Tri3-004 309 229 266 13300

Tri4-004 771 676 721 5150

Tri5-004 676 1074 852 5680

Tri5-106 0 0 0 0

HolIII-106 9221 3808 5926 4489

HelA06 0 0 0 0

SolA17 0 0 0 0

Aqua dest. 0 0 0

3 Ergebnisse 62

3.3.2 Quantifizierung von G. mosseae mit der TaqMan® PCR

Für die quantitative spezifische Bestimmung der Kopienzahl von G. mosseae-rDNA wurden

die beiden Primer P1 und P2 sowie die Sonde F1 verwendet. Die Länge des Amplikons betrug

109 bp. Da mit dem Primerpaar Glmoss85For und Glmoss387Rev nicht nur G. mosseae, son-

dern auch nah verwandte Arten amplifiziert wurden, musste zunächst die Bindung der

TaqMan®-Primer und –Sonde überprüft werden. Hierzu wurden die entsprechenden Sequenz-

abschnitte herangezogen und mit dem Primer P1 (Abb. 25) und der Sonde F1 (Abb. 26) ver-

glichen. Der Primer P2 lag außerhalb des sequenzierten Bereichs, so dass über seine Bin-

dungskapazität bei den unterschiedlichen Proben keine Aussage getroffen werden kann. Bei

denjenigen Proben mit AMF-Stämmen, die als G. caledonium (HolIII-008, ZeaA15) bzw.

G. geosporum (Pla5-004) identifiziert wurden, war aufgrund der Abweichungen in der Basen-

paarung eine verminderte Bindung der Primer und Sonden zu erwarten. Dennoch ist eine

Kreuzreaktivität nicht ausgeschlossen. Jedoch dürfte die PCR bei diesen Proben mit stark ver-

ringerter Effizienz abgelaufen sein. Somit kann die ermittelte Kopienzahl nicht als tatsächli-

che G. mosseae-Menge gewertet werden, sondern als Bruchteil der G. geosporum- bzw.

G. caledonium-Kopienzahl bezogen auf G. mosseae.

P1 3‘ ACGTTGCCTATGGGAAGTCC 5‘ ||||||||||||||||||||Gmoss68W 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘PlaIII-004 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘Pla4-004 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘HelA06 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘HolI-108 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘PlaIII-108 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘TraA21 5‘ TGCAACGGATACCCTTCAGG 3‘HolIII-008 5‘ TGCAACGGATACCCTTCTGG 3‘ZeaA15 5‘ TGCAACGGATACCCTTCTGG 3‘Pla5-004 5‘ TGCAACGGATACCTTTCTGG 3‘

Abb. 25: Kontrolle der Bindung des Primers P1 an die ermittelten Sequenz-abschnitte. Abweichende Basen sind unterlegt.

Für die Standardreihe wurde eine Verdünnungsreihe von klonierter G. mosseae-DNA herge-

stellt und mithilfe der ermittelten Ct-Werte eine Standardkurve angefertigt. Abb. 27 zeigt den

Verlauf der TaqMan® PCR mit den eingesetzten Standards. Die erhaltenen Werte sind in Tab.

27 zusammengefaßt und in Abb. 28 aufgetragen. Mit der Steigung m der Korrelationsgeraden

von -3,513 ergab sich eine Effizienz der TaqMan® PCR von 93%. Der Korrelationskoeffizient

der Standardkurve betrug 0,979.

3 Ergebnisse 63

F1 3‘ AGACTAGAGACTATGCAACGGAACTACAACTTT 5‘ |||||||||||||||||||||||||||||||||Gmoss68W 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘PlaIII-004 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘Pla4-004 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘HelA06 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘HolI-108 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘PlaIII-108 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTNAAA 3‘TraA21 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTTGAAA 3‘HolIII-008 5‘ TCTGATCTCTGAAACGTTGCCTTGATGTCGAAA 3‘ZeaA15 5‘ TCTGATCTCTGAAACGTTGCCTTGATGTCGAAA 3‘Pla5-004 5‘ TCTGATCTCTGATACGTTGCCTTGATGTCGAAA 3‘

Abb. 26: Kontrolle der Bindung der Sonde F1 an die ermittelten Sequenzabschnitte.Abweichende Basen sind unterlegt.

Abb. 27: Amplification-Plot mit sechs DNA-Standards und Aqua dest. (jeweils Doppelbestimmungen).Die ÄRn-Werte der sechs G. mosseae-Standards wurden über der Zyklenzahl aufgetragen.Startkopienzahl: siehe Tab 27.

Tab. 27: Zusammenstellung der Ct-Werte der eingesetzten Standard-Verdün-nungsreihe bei G. mosseae.

Kopienzahl Ct-Wert 1 Ct-Wert 2 Mittelwert (n=2)

1,7 · 108 16,89 16,67 16,78

1,7 · 107 19,08 18,29 18,69

1,7 · 106 22,33 23,04 22,69

1,7 · 105 26,13 27,85 26,99

1,7 · 104 30,21 30,18 30,20

Die ermittelten Kopienzahlen der Proben mit G. mosseae lagen zwischen 203 und 7984 Ko-

pien/µL (Tab. 28). Bei den beiden Proben mit G. caledonium (HolIII-008 und ZeaA15) betrug

3 Ergebnisse 64

die mittlere Kopienzahl je µL 336 bzw. 592. In der Probe mit G. geosporum (Pla5-004)

konnten keine Kopien ermittelt werden. Daraus ergaben sich bis zu 64750 Kopien je mg Wur-

zel (Frischgewicht).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09

Kopienzahl

Ct-

Wer

t

Abb. 28: Zusammenhang zwischen den ermittelten Ct-Werten und der eingesetzten Kopienzahlbei G. mosseae. r = 0,979.

Tab. 28: Anzahl der ermittelten Kopienzahlen bei G. mosseae, geometrische Mittelwerte (n = 2) je µLDNA-Extrakt und Kopienzahl je mg Wurzel (FG).

Probe Kopienzahl A Kopienzahl B Mittelwert

je µL DNA-Ext.

Kopienzahl je

mg Wurzel (FG)

Gmoss68W 159 259 203 1450

PlaIII-004 2739 715 1399 9327

PlaIII-108 2821 2378 2590 64750

Pla4-004 5499 4915 5199 37136

Pla5-004 0 0 0 0

HolIII-008 314 1117 592 2960

HolI-108 4045 4787 4400 4783

HelA06 14378 4434 7984 1094

TraA21 912 460 648 661

ZeaA15 248 454 336 381

Aqua dest. 0 0 0 -

3 Ergebnisse 65

3.4 Zusammenfassung der molekularbiologischen und morphologischen

Ergebnisse

Aus 65 Proben von Pflanzenwurzeln wurde DNA extrahiert (Tab. 29). Von diesen DNA-Ex-

trakten konnten 56 in einer PCR mit unspezifischen Primern amplifiziert werden. In einer

PCR mit A. longula-spezifischen Primern ergaben fünf dieser positiv getesteten Proben (9%)

eine starke Bande, bei weiteren acht Proben (14%) waren schwache Banden erkennbar. Eine

quantitative PCR ergab zwischen 3910 und 13300 Kopien je mg Wurzelmasse bei den starken

Signalen und bis zu 5680 Kopien je mg bei den schwächeren Signalen. Allerdings konnten bei

sechs der acht Proben mit schwachen Signalen keine Kopien nachgewiesen werden.

In neun (16%) der Proben konnte mit den spezifischen Primern Glmoss85For und

Glmoss387Rev ein Produkt erhalten werden. Diese Produkte wurden sequenziert und durch

den Vergleich mit der Datenbank konnten sechs als G. mosseae, zwei als G. caledonium und

eines als G. geosporum identifiziert werden. Mit einer quantitativen PCR wurde die Kopien-

zahl je mg Wurzelmasse bestimmt. Bei den G. mosseae-Proben wurden zwischen 661 und

64750 Kopien/mg nachgewiesen, bei den beiden G. caledonium-Proben zwischen 381 und

2960 (G. mosseae-Äquivalente). Bei der G. caledonium-Probe konnten keine Kopien gemes-

sen werden.

3 Ergebnisse 66

Tab. 29: Ergebnisübersicht der molekularbiologischen Untersuchungen. Zum Vergleich ist dieHyphen-Kolonisierungsrate angegeben (siehe Kapitel 3.6). Aclong: A. longula, Ampli:Amplifikationsfähigkeit, Gca: G. caledonium, Gge: G. geosporum, Glmoss: G. mosseae-Gruppe, Gmo: G. mosseae, HC: Hyphen-Kolonisierungsrate, Hol: H. lanatus, KopAl: KopienA. longula/mg Wurzel, KopGm: Kopien G. mosseae(-Gruppe)/mg Wurzel, n.d.: nichtuntersucht, Pla: P. lanceolata, SeqTyp: Sequenztyp, Tri: T. repens.

Pflanze Punkt Ampli Glmoss SeqTyp KopGm Aclong KopAl HC

10.04.2000

Pla I + - n.d. n.d. - n.d. 64%

Pla II - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 70%

Pla III + ++ Gmo 9327 - n.d. 66%

Pla 1 - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 47%

Pla 2 ++ - n.d. n.d. - n.d. 50%

Pla 3 ++ - n.d. n.d. ++ 4489 67%

Pla 4 ++ + Gmo 37136 (+) 0 66%

Pla 5 ++ + Gge 0 + 3910 67%

Tri I ++ - n.d. n.d. - n.d. 19%

Tri II + - n.d. n.d. (+) 2967 56%

Tri III ++ - n.d. n.d. - n.d. 39%

Tri 1 ++ - n.d. n.d. n.d. n.d. 20%

Tri 2 ++ - n.d. n.d. - n.d. 40%

Tri 3 ++ - n.d. n.d. ++ 13300 21%

Tri 4 ++ - n.d. n.d. + 5150 17%

Tri 5 ++ - n.d. n.d. (+) 5680 40%

Hol I - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 14%

Hol II - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 41%

Hol III + - n.d. n.d. - n.d. 6%

01.08.2000

Pla I ++ - n.d. n.d. (+) 0 36%

Pla II ++ - n.d. n.d. - n.d. 53%

Pla III ++ - n.d. n.d. - n.d. 68%

Tri I ++ - n.d. n.d. - n.d. 60%

Tri II + - n.d. n.d. (+) 0 31%

Tri III ++ - n.d. n.d. - n.d. 82%

Hol I - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 4%

Hol II ++ - n.d. n.d. - n.d. 17%

Hol III + + Gca 2960 - n.d. 3%

3 Ergebnisse 67

Tab. 29: (Fortsetzung)

11.06.2001

Pla I + - n.d. n.d. - n.d. 33%

Pla II + - n.d. n.d. - n.d. 11%

Pla III - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 6%

Tri I + - n.d. n.d. - n.d. 29%

Tri II - - n.d. n.d. - n.d. 10%

Tri III ++ - n.d. n.d. - n.d. 36%

Hol I + - n.d. n.d. - n.d. 18%

Hol II + - n.d. n.d. - n.d. 11%

Hol III + - n.d. n.d. ++ 4489 20%

22.08.2001

Pla I + - n.d. n.d. - n.d. 32%

Pla II + n.d. n.d. n.d. - n.d. 37%

Pla III + ++ Gmo 64750 - n.d. 56%

Pla 1 + - n.d. n.d. - n.d. 5%

Pla 2 ++ - n.d. n.d. - n.d. 17%

Pla 3 + - n.d. n.d. - n.d. 24%

Pla 4 + - n.d. n.d. - n.d. 38%

Pla 5 ++ - n.d. n.d. - n.d. 26%

Tri I ++ - n.d. n.d. - n.d. 27%

Tri II ++ - n.d. n.d. - n.d. 19%

Tri III + - n.d. n.d. - n.d. 17%

Tri 1 ++ - n.d. n.d. - n.d. 23%

Tri 2 + - n.d. n.d. - n.d. 26%

Tri 3 ++ - n.d. n.d. - n.d. 13%

Tri 4 ++ - n.d. n.d. - n.d. 27%

Tri 5 ++ - n.d. n.d. (+) 0 23%

Hol I + + Gmo 4783 - n.d. 0%

Hol II + - n.d. n.d. - n.d. 7%

Hol III ++ - n.d. n.d. - n.d. 16%

27.08.2001

Zea A15 + ++ Gca 381 - n.d. 4%

Sol A19 ++ - n.d. n.d. - n.d. 9%

Sol A17 ++ - n.d. n.d. (+) 0 13%

Hel A06 ++ ++ Gmo 1094 - n.d. 31%

Hel A06 ++ - n.d. n.d. (+) 0 12%

Tra A21 - + Gmo 661 n.d. n.d. 50%

Tra A16 (+) - n.d. n.d. n.d. n.d. 17%

Zea A15 (+) - n.d. n.d. n.d. n.d. 6%

3 Ergebnisse 68

3.5 Bestimmung der Mykorrhizapilze anhand der Sporenmorphologie

Neben der Überprüfung der Referenzkulturen aufgrund der Sporenbildung wurden auch Frei-

landproben von W02 und W21 stichprobenhaft auf vorhandene Sporen untersucht. Die iso-

lierten Sporen wurden zunächst nach ihrer Färbung in helle, bräunliche und dunkle Sporen

getrennt. Anschließend erfolgte die Untersuchung der Sporenwände. Die Ergebnisse der mor-

phologischen Bestimmung sind in Tab. 30 wiedergegeben. Demnach konnten 6 verschiedene

Sporentypen nachgewiesen werden. Eine exakte Artbestimmung war jedoch nicht möglich

(s. Kapitel 2.2.11). Die überwiegende Mehrzahl der gefundenen Sporen (ca. 70 %) gehörten

zu G. mosseae (Abb. 29) oder waren dieser Art sehr ähnlich. Gigaspora-Sporen konnten nicht

direkt nachgewiesen werden, jedoch fanden sich mehrere Hilfszellen.

Tab. 30: Ergebnis der morphologischen Sporenuntersuchung.

Häufigkeit Sporentyp

ca. 70 % Glomus mosseae-ähnlich

ca. 10 % Glomus geosporum-ähnlich

ca. 5 % Glomus pubescens- bzw. G. arborense-ähnlich

ca. 5 % Archaeospora leptoticha (Glomus leptotichum)-ähnlich

ca. 5 % Acaulospora delicata-ähnlich

ca. 5 % Gigaspora sp. (kein Sporennachweis aber Vorkommen von Hilfszellen)

3.6 Bestimmung des Mykorrhizierungsgrades in Freilandproben

Abb. 30 zeigt mit Trypanblau gefärbte Pilzhyphen, mehrere Arbuskel sowie ein Vesikel. Im

Hintergrund sind ungefärbte Pflanzenzellen zu erkennen. Die Bonitierung erfolgte je Probe an

ca. 30 bis 100 Stellen (n) für die Flächen W02 (Tab. 31) und W21 (Tab. 32). Während Pilz-

hyphen und Vesikel leicht zu erkennen waren, kann die Erfassung der Arbuskel unter Um-

ständen unvollständig gewesen sein, da ihre Identifizierung vor allem in dickeren Wurzelbe-

reichen, wo sie häufig nur als diffuse „Wolke“ zu erkennen waren, Probleme bereitete. Insge-

samt ist die mikroskopische Bonitierung der Mykorrhizierung gefärbter Präparate subjektiv

und nur bedingt aussagekräftig, was sich auch in den hohen Standardabweichungen wider-

spiegelt. Aus diesem Grund wurde auf eine statistische Auswertung verzichtet.

3 Ergebnisse 69

Abb. 29: Sporenquetschpräparat von G. mosseae. A: Hyphenan-satzstelle, B: Bruchstelle der Sporenwand, H: Hyphe, W:Sporenwand.

Abb. 30: P. lanceolata-Wurzel nach Trypanblaufärbung. A: Arbuskel, H: Pilzhyphen, V: Vesikel, Z:Pflanzenzellwände.

3 Ergebnisse 70

Auf der Wiese (W02) steigt demnach die Kolonisierung mit Hyphen von oben (HC = 42%)

nach unten (HC = 47%) durchschnittlich leicht an (Abb. 31). Bei den untersuchten Pflanzen

zeigt sich ein deutlicheres Bild: P. lanceolata besitzt die höchsten Kolonisierungsraten (HC =

48%, VC = 16%, AC = 5%), gefolgt von T. repens (HC = 44%, VC = 6%, AC = 1%) und

zuletzt H. lanatus (HC = 40%, VC = 4%, AC = 1%). Vor allem die relativ zahlreichen Vesi-

kel und Arbuskel fallen bei P. lanceolata auf. H. lanatus besitzt eine sehr variable Hyphen-

Kolonisierungrate, was sich in der hohen Standardabweichung niederschlägt (Abb. 32). Im

Laufe eines Jahres zeigt sich eine deutliche Zunahme der Hyphenkolonisierung (Abb. 33). So

stieg sie im Jahr 2000 von durchschnittlich 36% (April) über 59% (Anfang August) auf bis zu

77% (Oktober). Im folgenden Jahr wiederholt sich diese Entwicklung, wenn auch abge-

schwächt, von 16% (Juni) auf 23% (August). Eine gegensätzliche Entwicklung zeigt sich

jedoch bei der Vesikelkolonisierung. Diese nimmt im Jahr 2000 kontinuierlich von durch-

schnittlich 15% (April) über 11% (Anfang August) auf nur noch 5% ab (Anfang Oktober). Im

Jahr 2001 sinkt VC ebenfalls von 11% (Juni) auf 2% im August.

Tab. 31: Mykorrhizierung der Pflanzen auf der Wiese (W02). Kolonisierungsrate mit Hyphen (HC),Vesikeln (VC) und Arbuskeln (AC), n: untersuchte Stellen.

P. lanceolata T. repens H. lanatusPosition

HC VC AC n HC VC AC n HC VC AC n

10. April 2000

oben

Mitte

unten

64%

70%

66%

25%

33%

31%

5%

23%

16%

81

40

102

19%

56%

39%

10%

13%

3%

0%

5%

2%

62

223

94

14%

41%

6%

3%

12%

1%

0%

0%

0%

107

34

77

1. August 2000

oben

Mitte

unten

36%

53%

68%

18%

7%

26%

0%

0%

3%

11

30

31

60%

31%

82%

0%

0%

23%

0%

0%

0%

25

13

22

58%

67%

75%

4%

17%

3%

0%

0%

0%

24

18

33

2. Oktober 2000

oben

Mitte

unten

63%

88%

37%

29%

8%

3%

17%

0%

0%

24

26

30

92%

72%

85%

4%

0%

0%

0%

0%

0%

26

18

20

90%

96%

84%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

20

24

32

11. Juni 2001

oben

Mitte

unten

33%

11%

6%

20%

19%

7%

0%

9%

0%

40

54

54

29%

10%

36%

15%

7%

15%

3%

7%

0%

34

30

47

18%

11%

20%

4%

7%

5%

0%

5%

5%

67

57

61

22. August 2001

oben

Mitte

unten

32%

37%

56%

4%

0%

6%

0%

0%

0%

68

73

131

27%

19%

17%

0%

2%

5%

1%

0%

1%

180

223

132

0%

7%

16%

0%

0%

1%

0%

0%

0%

98

91

82

3 Ergebnisse 71

Tab. 32: Mykorrhizierung der Pflanzen auf der Weide (W21). Kolonisierungsrate mit Hyphen (HC),Vesikeln (VC) und Arbuskeln (AC), n: untersuchte Stellen.

P. lanceolata T. repensPosition

HC VC AC n HC VC AC n

5. Mai 1999

oben

Mitte

unten

90%

95%

94%

33%

11%

6%

0%

5%

0%

21

19

66

43%

97%

58%

5%

0%

3%

0%

0%

0%

60

32

40

10. April 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

47%

50%

67%

66%

67%

11%

0%

36%

19%

7%

4%

0%

0%

4%

5%

73

4

42

116

61

20%

40%

21%

17%

40%

2%

12%

4%

0%

4%

4%

0%

0%

0%

12%

49

99

57

36

137

29. Juni 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

73%

70%

39%

70%

30%

15%

26%

24%

13%

4%

0%

17%

3%

3%

0%

33

23

38

32

27

63%

61%

80%

88%

69%

13%

6%

20%

12%

0%

0%

11%

0%

6%

0%

8

18

20

17

14

2. Oktober 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

69%

50%

79%

97%

95%

0%

0%

24%

43%

14%

3%

7%

10%

8%

0%

36

28

29

36

22

64%

55%

13%

65%

55%

0%

5%

0%

0%

5%

0%

0%

6%

0%

0%

25

22

16

20

20

22. August 2001

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

5%

17%

24%

38%

26%

0%

8%

1%

5%

6%

0%

1%

0%

3%

0%

37

75

135

76

80

23%

26%

13%

27%

23%

1%

7%

1%

6%

8%

1%

0%

1%

1%

1%

75

76

84

101

88

3 Ergebnisse 72

0

1020

3040506070

80

oben Mitte unten

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)

Arbuskel Vesikel Hyphen

Abb. 31: Mykorrhizierungsraten nach Position (W02). Standardabweichung: Balken = 1s.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Pla Tri Hol

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)


Abb. 32: Mykorrhizierungsraten nach Pflanzen (W02). Standardabweichung: Balken = 1s.Hol: H. lanatus, Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens.

0102030405060708090

100

10.04.2000 01.08.2000 02.10.2000 11.06.2001 22.08.2001

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)


Abb. 33: Mykorrhizierungsraten nach Probennahmeterminen (W02). Standardabweichung:Balken = 1s.

3 Ergebnisse 73

0102030405060708090

100

oben Mitte oben Mitte Mitteunten

unten

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)


Abb. 34: Mykorrhizierungsraten nach Position (W21). Standardabweichung: Balken = 1s.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pla Tri

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)


Abb. 35: Mykorrhizierungsraten nach Pflanzen (W21). Standardabweichung: Balken = 1s.Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens.

0102030405060708090

100

05.05.1999 10.04.2000 29.06.2000 02.10.2000 22.08.2001

Myk

orr

hiz

ieru

ng

(%

)


Abb. 36: Mykorrhizierungsraten nach Probenahmeterminen (W21). Standardabweichung:Balken = 1s.

3 Ergebnisse 74

Auf der Weide (W21) betrug die Hyphenkolonisierung an allen Probenahmepunkten etwa

50% (von oben nach unten sinkt sie zunächst etwas auf 47%, steigt wieder auf 58% an und

beträgt schließlich unten 56%. Bei den Vesikeln zeigt sich ein ähnliches Bild, nur die Arbus-

kelkolonisierung ist mit 5% Mitte oben (Position 2) am höchsten (Abb. 34). Bei den unter-

suchten Pflanzen wiederholt sich ein ähnliches Bild wie schon auf der Wiese: P. lanceolata

besitzt mit Kolonisierungsraten von HC = 59%, VC = 13% und AC = 3% höhere Werte als

T. repens mit 56%, 5% und 2%. (Abb. 35). Der Einfluss der Jahreszeiten ist schwierig zu

interpretieren. Die drei Beprobungsterminen des Jahres 2000 für sich genommen zeigen auf

der Wiese eine durchschnittliche Zunahme der Hyphenkolonisierung von 41% (April) auf

60% (Juni) bzw. 61% im Oktober. Jahresspezifische Einflüsse könnten hierbei ebenfalls eine

Rolle spielen (Abb. 36).

3.7 Phosphatgehalte

Um die Sensitivität und Nachweisgrenze der gewählten Messmethode zu bestimmen, wurde

zunächst eine Kalibrierung mithilfe eines Phosphatstandards vorgenommen, wobei jeder Wert

fünffach bestimmt wurde (Abb. 37). Der gemessene Farbstoff Molybdänblau wies einen

linearen Messbereich bis etwa 1,4 Absorptionseinheiten auf, was einer Phosphatkonzentration

von ca. 10 mg/L PO43- entspricht. Bei höheren Konzentrationen flacht die Extinktionskurve

allmählich ab. Als Nachweisgrenze wurde der Wert bei 0,1 Absorptionseinheiten herangezo-

gen und auf 0,6 mg/L PO43- festgelegt. Bodenproben mit mehr als 40 mg P4O10 je 100 g Bo-

den mussten verdünnt gemessen werden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12

mg P4O10/L

Ab

sorp

tio

n (

850

nm

)

Abb. 37: Kalibriergerade der Phosphatmessung. Standardabweichung: Balken = ±1s.

3 Ergebnisse 75

Die P4O10-Werte der Bodenproben von W02 (Wiese) lagen im Bereich zwischen 0,97 bis 4,24

mit einem Mittelwert bei 2,14 mg/100 g Boden (Tab. 33). Zwischen den unterschiedlichen

Positionen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (Abb. 38). Die durchschnittlichen

Phosphatgehalte bei P. lanceolata und H. lanatus waren mit 2,35 bzw. 2,23 mg/100 g Boden

fast identisch (Abb. 39). Nur bei T. repens lagen diese mit 1,84 mg/100 g Boden etwas niedri-

ger. Dagegen nahmen die Gehalte von April 1999 (2,64 mg/100 g Boden) bis Oktober 2000

(1,53 mg/100 g Boden) etwas ab, während sie bis August 2001 (2,50 mg/100 g Boden) wieder

anstiegen (Abb. 40).

Tab. 33: Phosphatgehalte der Wiese W02. Mittelwerte mit Standardabweichung in mg P4O10/100 mgBoden.

Position P. lanceolata T. repens H. lanatus

10. April 2000

oben

Mitte

unten

3,30 ± 0,07

3,58 ± 0,07

2,08 ± 0,03

3,33 ± 0,04

2,73 ± 0,86

1,35 ± 0,03

2,96 ± 0,07

2,37 ± 0,04

2,08 ± 0,03

1. August 2000

oben

Mitte

unten

1,79 ± 0,06

2,06 ± 0,06

1,56 ± 0,00

2,42 ± 0,19

1,92 ± 0,00

1,74 ± 0,00

2,06 ± 0,19

4,05 ± 0,06

1,38 ± 0,00

2. Oktober 2000

oben

Mitte

unten

1,78 ± 0,00

1,63 ± 0,08

1,58 ± 0,00

1,28 ± 0,00

1,28 ± 0,00

1,92 ± 0,38

1,87 ± 0,00

1,18 ± 0,00

1,28 ± 0,00

11. Juni 2001

oben

Mitte

unten

2,11 ± 0,07

1,24 ± 0,00

4,24 ± 0,99

1,91 ± 0,00

0,97 ± 0,17

1,47 ± 0,10

1,50 ± 0,00

1,61 ± 0,03

2,15 ± 0,04

22. August 2001

oben

Mitte

unten

2,46 ± 0,04

2,82 ± 0,15

2,98 ± 0,08

1,99 ± 0,01

1,82 ± 0,03

1,54 ± 0,17

3,07 ± 0,01

3,44 ± 0,04

2,41 ± 0,13

3 Ergebnisse 76

2,26 2,18 1,980

1

1

2

2

3

3

4

oben Mitte unten

mg

P4O

10/1

00 g

Bo

den

Abb. 38: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Position (W02). Standardabweichung:Balken = 1s.

2,35 1,84 2,230

1

1

2

2

3

3

4

Pla Tri Hol

mg

P4O

10/1

00g

Bo

den

Abb. 39: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Pflanze (W02). Pla: P. lanceolata,Tri: T. repens, Hol: H. lanatus. Standardabweichung: Balken = 1s.

2,64 2,11 1,53 1,91 2,500

1

1

2

2

3

3

4

4

10.04.1999 01.08.2000 02.10.2000 11.06.2001 22.08.2001

mg

P4O

10/1

00 g

Bo

den

Abb. 40: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Probennahmeterminen (W02).Standardabweichung: Balken = 1s.

3 Ergebnisse 77

Tab. 34: Phosphatgehalte der Weide W21. Mittelwerte mit Standardabweichung inmg P4O10/100 mg Boden.

Position P. lanceolata T. repens

5. Mai 1999

oben

Mitte

unten

8,60 ± 0,26

19,10 ± 0,26

19,28 ± 0,00

9,69 ± 0,26

20,92 ± 0,26

45,45 ± 0,51

10. April 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

11,34 ± 0,70

4,15 ± 0,00

2,37 ± 0,04

3,47 ± 0,07

> 16

7,09 ± 0,15

3,67 ± 0,11

2,93 ± 0,04

4,43 ± 0,07

9,18 ± 0,23

29. Juni 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

32,77 ± 0,34

5,94 ± 0,23

6,51 ± 2,16

3,95 ± 0,39

31,02 ± 2,24

15,49 ± 0,63

5,98 ± 0,28

3,13 ± 0,50

4,80 ± 0,23

25,45 ± 0,23

2. Oktober 2000

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

28,94 ± 0,59

14,87 ± 0,89

10,08 ± 0,30

11,28 ± 0,30

52,84 ± 0,58

34,91 1,18

10,88 0,30

11,68 0,30

16,86 0,29

38,90 0,00

22. August 2001

oben

Mitte oben

Mitte

Mitte unten

unten

10,02 ± 0,15

3,07 ± 0,03

2,26 ± 0,04

14,07 ± 0,16

12,39 ± 0,02

13,75 ± 0,02

5,28 ± 0,05

4,48 ± 0,11

13,60 ± 0,14

8,51 ± 0,04

3 Ergebnisse 78

17,26 6,73 8,35 9,06 25,9005

1015202530354045

oben Mitteoben

Mitte Mitteunten

unten

mg

P4O

10/1

00 g

Bo

den

Abb. 41: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Position (W21). Standardabweichung: Balken = 1s.

14,10 13,790

5

10

15

20

25

30

Pla Tri

mg

P4O

10/1

00g

Bo

den

Abb. 42: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Pflanze (W21). Pla: P. lanceolata,Tri: T. repens. Standardabweichung: Balken = 1s.

20,51 6,46 13,50 23,12 8,740

5

10

15

20

25

30

35

40

05.05.1999 10.04.2000 26.06.2000 02.10.2000 27.08.2001

mg

P4O

10/1

00 g

Bo

den

Abb. 43: Durchschnittlicher Phosphatgehalt nach Probenahmeterminen (W21). Standardabweichung:Balken = 1s.

3 Ergebnisse 79

Die P4O10-Werte der Bodenproben von W21 (Weide) lagen breit gestreut im Bereich zwi-

schen 2,26 und 52,84 mg/100 g Boden mit einem Mittelwert von 13,94 mg/100 g Boden

(Tab. 34). Bei den unterschiedlichen Positionen zeigte sich, dass die flacheren Standorte

(„oben“ mit durchschnittlich 17,26 und „unten“ mit 25,90 mg/100 g Boden deutlich höhere

Werte besaßen, als die steileren „mittleren“ Standorte mit Werten zwischen 6,73 und

9,06 mg/100 g Boden (Abb. 41). Die durchschnittlichen Phosphatgehalte bei P. lanceolata

und T. repens waren mit 14,10 bzw. 13,79 mg/100 g Boden nahezu identisch (Abb. 42). Im

jahreszeitlichen Ablauf zeigte sich jeweils eine Abnahme über den Winter, sowie eine

deutliche Zunahme von April (6,46 mg/100 g Boden) über August (13,50 mg/100 g Boden)

bis Oktober (23,12 mg/100 g Boden; Abb. 43).

3.8 Zusammenhang zwischen Mykorrhizierungsgrad und Phosphatgehalt

Die einzelnen Mykorrhizierungswerte wurden für jede Pflanze mit den entsprechenden

Phosphatwerten korreliert. Die Hyphen- (HC) und Vesikel-Kolonisierungsraten (VC) wurden

getrennt dargestellt. Die Arbuskel-Kolonisierung (AC) wurde nicht berücksichtigt, da der

Nachweis von Arbuskeln relativ schwierig ist und nur geringe Kolonisierungsraten gefunden

wurden.

Auf der Wiese W02 zeigt sich bei P. lanceolata und T. repens praktisch kein direkter

Zusammenhang zwischen Hyphenkolonisierung HC und dem verfügbaren Phosphatgehalt des

anhaftenden Bodens (r = -0,139 bzw. –0,091; Abb. 44). Bei H. lanatus hingegen läßt sich bei

steigendem Phosphatgehalt eine Abnahme der Hyphenkolonisierung erkennen (r = - 0,389).

Auch bei der Vesikelkolonisierungsrate läßt sich bei P. lanceolata und T. repens kein direkter

Zusammenhang mit dem Phosphatgehalt feststellen (r = -0,066 bzw. 0,128). Bei H. lanatus

wiederum deutet sich ein Vesikel-Zunahme bei steigendem Phosphatgehalt an (r = 0,414;

Abb. 45).

Auch auf der Weide W21 ist keine direkte Korrelation zwischen Mykorrhizierung und

Phosphatgehalt bei P. lanceolata und T. repens erkennbar (Abb. 46 und Abb. 47). Selbst ver-

gleichsweise sehr hohe Phosphatwerte konnten mit starker Hyphenkolonisierung einhergehen.

3 Ergebnisse 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5

mg P4O10/100 g Boden

HC

(%)

Pla Tri Hol

Abb. 44: Hyphenkolonisierung in Abhängigkeit vom CAL-Phosphatgehalt des Bodens (W02).Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens, Hol: H. lanatus.

Abb. 45: Vesikelkolonisierung in Abhängigkeit vom CAL-Phosphatgehalt des Bodens (W02).Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens, Hol: H. lanatus.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4 5


VC

(%)

Pla Tri Hol

3 Ergebnisse 81

Abb. 46: Hyphenkolonisierung in Abhängigkeit vom CAL-Phosphatgehalt des Bodens (W21).Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens.

Abb. 47: Vesikelkolonisierung in Abhängigkeit vom CAL-Phosphatgehalt des Bodens (W21).Pla: P. lanceolata, Tri: T. repens.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60


HC

(%)

Pla Tri

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 10 20 30 40 50 60


VC

(%)

Pla Tri

4 Diskussion 82

4 Diskussion

Parallel zum wachsenden Interesse an der arbusukären Mykorrhiza fand in den letzten Jahren

ein Umdenken in der Landwirtschaft hin zu einer nachhaltigen Landnutzung statt. Die For-

schungsergebnisse, die aus Gewächshausversuchen gewonnen werden konnten, versprechen

vielfache Anwendungsmöglichkeiten der AMF, so bei der Reduktion von Dünger, dem

Schutz vor Pathogenen und der Begrünung erodierter oder desertifizierter Flächen. Dennoch

ist bislang relativ wenig über sie bekannt und vor allem ihre biologische Funktion im Freiland

bietet noch zahlreiche Forschungsoptionen, z.B. die Einflüsse unterschiedlichen Arten auf die

Nährstoffversorgung der Pflanzen. Der artspezifische Nachweis einzelner AMF-Arten in ihrer

natürlichen Umgebung ist das zentrale Thema dieser Arbeit. Hierzu mußten die vorhandenen

Erkenntnisse der AMF-Forschung für eine Anwendung bei Freilandproben optimiert werden.

4.1 DNA-Extraktion aus Wurzelmaterial

Die Methode nach Doyle & Doyle (1987) brachte in der vorliegenden Arbeit nur wenig am-

plifizierbares Material. Die Methode nach BAHNWEG et al. (1998) führte zu guten Ergebnis-

sen. Allerdings nicht mit „frischestem Material“ (BAHNWEG, Institut für Biochemische Pflan-

zenpathologie, GSF-Forschungszentrum, mündliche Mitteilung), sondern mit gefriergetrock-

neten Proben. Der Vorteil dieser Extraktion ist, dass die Mengen beliebig variiert werden

können. Bei Benzylchlorid handelt es sich jedoch um ein starkes Reizgas, das ebenso wie

Chloroform und 2-Mercaptoethanol gesundheitlich bedenklich ist, so dass unter einem Abzug

gearbeitet werden muss. Die besten Ergebnisse wurden mit dem modifizierten QIAGEN

DNeasy Plant Mini Kit erzielt, wobei entscheidend war, dass die frischen Wurzeln

unverzüglich mit flüssigem Stickstoff schockgefroren wurden. Die Zelllyse der gefrierge-

trockneten Proben fand mit einer Kugelmühle in der Kältekammer statt. Die DNA-Extraktion

aus Wurzeln mit kochender Natronlauge und anschließender salzsaurer Neutralisation nach

REDECKER et al. (1997) konnte nicht reproduziert werden.

Auf den ersten Blick erscheint die Analyse von Sporen der beste und einfachste Weg,

um die Diversität und Verbreitung von AMF zu untersuchen. So entwickelten z.B. REDECKER

et al. (1997) eine PCR-RFLP-Methode zur Identifizierung einzelner Glomales-Arten. Die aus

Sporen gewonnene DNA ist jedoch keinesfalls frei von Fremd-DNA (s. Kap. 4.6). Auch spie-

gelt die Verteilung von Sporen nicht die tatsächliche Mykorrhizierung in einer Wurzel wider.

Sporen können ein Reservoir potentieller Mykobionten darstellen. Um die tatsächliche

Situation in den kolonisierten Wurzeln zu beschreiben, muß jedoch die Wurzel-DNA unter-

4 Diskussion 83

sucht werden. Die extrahierte DNA lieferte zunächst keine positiven Ergebnisse in der PCR,

deshalb wurde nach Gründen für die schlechte Amplifizierbarkeit gesucht. Es war bereits be-

kannt, dass sowohl Pflanzenmaterial, als auch Bodenproben viele Substanzen enthalten, wel-

che die DNA degradieren oder anderweitig die Polymerase-Kettenreaktion inhibieren können

(ABU AL-SOUD & RADSTRÖM, 1988). Zu diesen unerwünschten Reagenzien gehören neben

Polyphenolen und Polysacchariden in der Pflanze auch Huminstoffe im Boden. Polysaccha-

ride und Tannine stellen ein großes Problem bei der PCR dar. Sie sind bei DNA-Extraktion

nur schwer von der DNA abzutrennen und können DNA Polymerasen und Nukleasen inhibie-

ren oder zu unspezifischen Produkten führen. Polyphenolische Substanzen können durch

Phenoloxidasen und Peroxidasen, die bei Verletzung Wurzel oder deren Austrocknung freige-

setzt werden, zu freien Radikalen oxidiert werden. In dieser reaktiven Form können sie irre-

versibel an die DNA binden (ROWLAND & NGUYEN, 1993), die dadurch für die DNA Polyme-

rase unlesbar wird. Auch Huminsäuren besitzen eine inhibierende Wirkung auf die DNA Po-

lymerasen (TEBBE & VAJHEN, 1993). Allerdings haften diese in der Regel außen an der Wur-

zel und können durch eine gründliche Reinigung entfernt werden. Zunächst mußte also nach

einer geeigneten DNA-Extraktionsmethode gesucht werden.

Mithilfe von CTAB kann jedoch die DNA präzipitiert werden, während die Polysaccha-

ride in Lösung bleiben (MURRAY & THOMPSON, 1980). GEHRIG et al. (1998) extrahierten

DNA aus Blättern von Kalanchoe-Arten mittels der CTAB-Methode (DOYLE & DOYLE,

1987). Bei 40% der Extrakte konnte in einer PCR kein Amplifikat erhalten werden. Die glei-

che Extraktion mit sechs verschiedenen kommerziellen Kits führte zu noch geringeren Er-

folgsquoten. BOITEUX et al. (1999) untersuchten sieben verschiedene Extraktionsmethoden an

Daucus carota-Wurzeln und erzielten ebenfalls mit der CTAB-Methode die „besten Ergeb-

nisse“. BOBOWSKI et al. (1999) verwendeten ebendiese Methode zur Extraktion von DNA aus

Pflanzenblättern und –wurzeln. Dabei erhielten sie allerdings in nur 25% (Blätter) bzw. 3%

(Wurzeln) der Fälle amplifizierbares Material. LINDER et al. (2000) stellen schließlich sehr

treffend fest „that extraction and purification of DNA from roots can be challenging“.

4.2 Amplifizierbarkeit

Nach anfänglichen Schwierigkeiten konnten durch die optimierte DNA-Extraktion mit den

universellen Primern A2R und B2L die meisten DNA-Proben (etwa 90%) amplifiziert wer-

den. Das Zielgen der PCR, die rDNA, besitzt den Vorteil, dass es als high copy gene mit meh-

reren tausend Kopien innerhalb eines Genoms vorkommt (BUCHANAN et al., 2000). ROGERS

4 Diskussion 84

& BENDICH (1987) geben 200 bis 22.000 rDNA-Kopien je Pflanzengenom an. Da das rRNA-

Gen zudem in allen Organismen vorkommt, wird es gerne für phylogenetische Studien heran-

gezogen. Bei den AMF kann die geringe DNA-Menge und der hohe Anteil an Pflanzen-DNA

durch die hohe Kopienzahl der rDNA relativiert werden. TOTH et al. (1991) schätzten die

Pilz-Biomasse bei Allium cepa-Wurzeln, die zu 76% kolonisiert waren, auf nur 4,3%.

MALDONADO-MENDOZA et al. (2002) berechneten den Anteil von AMF-RNA auf 5-12% in

den am meisten kolonisierten Wurzeln, so dass wohl optimistisch betrachtet von einem Anteil

an Pilz-DNA von maximal 5% ausgegangen werden kann.

4.3 Spezifische Primer

Obwohl die SSU intensiver erforscht ist und zahlreiche Sequenzdaten zur Verfügung stehen,

birgt die LSU rDNA vielleicht die bessere Information. Die variable Domäne D2 bietet Ziel-

sequenzen für spezifische Primer und Endonukleasen (BÖHM, 2000). Außerdem konnte bisher

keine Polymorphie innerhalb einzelner Sporen wie bei der ITS-Region nachgewiesen werden

(Kap. 4.9). Mit den Primern Aclong87For und Aclong400Rev wurde bei fünf der amplifizier-

baren Proben (9%) ein positives Signal erhalten. Bei weiteren acht Extrakten (15%) waren

schwache Banden zu erkennen. Dabei könnte es sich um nahe Verwandte von A. longula han-

deln, bei denen die PCR weniger effizient ablief, oder um Proben mit sehr wenig A. longula-

DNA. Mit dem Primerpaar Glmoss85For und Glmoss387Rev wurden neun positive Signale

erhalten (17%), die entweder G. mosseae oder einer nah verwandten Art zuzuordnen sind.

Eine „Pilzspezifität“ der Primer reicht zum Nachweis der AMF in Wurzeln nicht aus,

denn neben Pflanzen- und AMF-DNA können die Wurzelproben durch Fremd-DNA konta-

miniert sein. So mussten bei fast allen Proben von H. lanatus und anderen Gräsern bei mikro-

skopischen Untersuchungen ein Befall mit Polymyxa graminis festgestellt werden.

VANDENKOORNHUYSE et al. (2002) untersuchten Wurzeln von Arrhenatherum elatius und

amplifizierten dabei Abschnitte der SSU rDNA mit pilzspezifischen Primern. Von den daraus

erhaltenen 49 Sequenztypen ließen sich nur drei den AMF zuordnen. Die restlichen 46 ge-

hörten zu den Basidiomycota, Ascomycota oder Zygomycota. Neben zahlreichen phytopatho-

genen Pilzen, die in Wurzeln vorkommen, können auch die AMF-Sporen selbst von Parasiten

befallen sein. So konnten REDECKER et al. (1999) nachweisen, dass einige Sequenzen aus

Scutellospora castanea-Sporen von Ascomyceten stammten. Daneben belegten WALLEY &

GERMIDA (1996) Sporenwand-assoziierte Bakterien.

4 Diskussion 85

Da es sich bei den AMF um obligate Symbionten handelt, ist die Kultur nicht kontami-

nierter Stämme unmöglich (Redecker et al., 1999). Versuche, axenische AMF-Kulturen zu

etablieren, sind bislang gescheitert. Zwar ist es möglich, Sporen zum Keimen zu bringen,

doch die Hyphen sterben spätestens nach zwei Wochen ab, wenn sie auf keine Wirtswurzel

stoßen und alle möglichen untersuchten Kombinationen von Kohlenstoff-Substraten konnten

den Pilz bisher nicht zur Vollendung seines Lebenszyklus anregen (Bago, 2000).

SIMON et al. (1992) veröffentlichten den ersten „Glomales-spezifischen“ Primer, nach-

dem sie die SSU rDNA-Sequenzen dreier Glomales-Arten miteinander verglichen hatten, die

damals zur Verfügung standen. Zahlreiche Autoren haben darauf hingewiesen, dass VANS1

„Probleme bei der PCR“ verursachte (CLAPP et al., 1995 und 1999; REDECKER, 1999) oder

nur „schwache Amplifikationsprodukte“ lieferte (GEHRIG et al. 1996). CLAPP et al. (1999)

zeigten, dass die Annealing site von VANS1 innerhalb der Glomales nicht konserviert ist.

Einige Arten wurden von diesem Primer überhaupt nicht erkannt (REDECKER, 2000).

SCHÜßLER et al. (2001a) bestätigten, dass VANS1 weder für die AMF im allgemeinen, noch

für eine ihrer taxonomischen oder phylogenetischen Gruppen spezifisch ist. Die Autoren

konnten auch belegen, dass die „familienspezifischen“ Primer VAACAU, VAGLO, VALETC

und VAGIGA (SIMON, 1993a) keine Spezifität für die Familien der Acaulosporaceae,

Glomaceae und Gigasporaceae besitzen.

Ein ähnliches Resultat fand sich bei dem pilzspezifischen Primer AM1 (HELGASON et

al., 1998), der zwar erfolgreich Pflanzen diskriminiert (bei Zea mays differieren 8 von 20 Ba-

sen), jedoch ebenso Geosiphon pyriforme, Archaeospora gerdemannii, Archaeospora trappei

(3/20) und Paraglomus occultum (4/20). Der Versuch, alle Vertreter der arbuskulären

Mykorrhizapilze durch geeignete Primer zu erfassen, muß bis heute als gescheitert betrachtet

werden, da nach wie vor im besten Fall Untergruppen amplifiziert werden können (SCHÜßLER

et al., 2001a).

REDECKER (2000) veröffentlichte Primer mit spezifischen Bindungseigenschaften für

eine G. mosseae/intraradices- (GLOM1310, GLOM5.8R), G. etunicatum/claroideum-

(LETC1670) und A. gerdemanni/trappei/G. occultum/brasilianum-Gruppe (ARCH1311) so-

wie für Acaulosporaceae (ACAU1660) und Gigasporaceae (GIGA5.8R). All diese Primer

amplifizieren jedoch die ITS1-Region, die durch ihre Hypervariabilität (s. Kap. 4.9) eine er-

höhte Diversität vortäuschen kann und ihre Anwendung bei Freilandproben deshalb in Frage

gestellt werden muß. Außerdem können auch mit diesen Primern nicht alle AMF-Arten (wie

z.B. G. versiforme) erfasst werden. Redeckers Analyse der Amplifikate mittels RFLP brachte

zwar „weitgehend übereinstimmende“, aber keine eindeutigen Ergebnisse. So konnten die

4 Diskussion 86

Gigaspora-Arten überhaupt nicht voneinander unterschieden werden. Eine vorgeschlagene

Sequenzierung der DNA-Fragmente ist bei hoher Probenzahl aufwändig und teuer.

4.4 Sequenzanalysen und RFLP

Die Sequenzanalysen im Bereich des mit dem Primerpaar Glmoss85For und Glmoss387Rev

amplifizierten Teilstückes zeigte eine Sequenzhomologie von insgesamt 87%. Alle Sequenzen

waren bis auf wenige Positionen innerhalb der ersten zehn Basen eindeutig. Nur bei HelA06

konnten die ersten 44 Nukleotide nicht ermittelt werden. Alle Sequenzen konnten im Ver-

gleich mit Datenbanksequenzen einer Art zugeordnet. Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde

phylogenetischer Stammbaum erstellt. Es handelte sich dabei um sechs G. mosseae-, eine

G. geosporum- und zwei G. caledonium-Sequenzen. Außerdem konnten für die einzelnen

Arten charakteristische Substitutionsmuster identifiziert werden: Für G. mosseae 20>C,

70>G, 82>C, 87>C, 95>T, G. caledonium 12>C, 48>T, G. fragilistratum 78>T und

G. geosporum 225>T.

4.5 Quantifizierung mit der TaqMan® real-time PCR

BÖHM et al. (1999) entwickelten die real-time PCR für G. mosseae. Dabei wurden die Start-

kopien des G. mosseae templates (Bereich der LSU rDNA) von 11 bzw. 100 Sporen quantifi-

ziert, und zwischen 100.000 bis 350.000 Kopien je Spore gefunden. Das entspricht bei einer

angenommenen Kopienzahl von etwa 100 rDNA-Einheiten je Genom ca. 1000 bis 3500

Nuklei je Spore. Die real-time PCR hat gegenüber der kompetitiven PCR mit internen Stan-

dards den Vorteil, dass über einen großen DNA-Konzentrationsbereich gemessen werden

kann. Die Messung fand in 96er-Platten statt, dabei konnten maximal 40 Proben bestimmt

werden, da jede Probe mindestens doppelt bestimmt wurde und Standards und Kontrollen

mindestens 16 Kavitäten beanspruchten. Der Nachteil dieser Analysemethode sind die relativ

hohen Kosten.

Bei der Quantifizierung von A. longula betrug die Effizienz der PCR 86%. Der Korre-

lationskoeffizient betrug 0,973. Die Standardwerte lagen also bis zu 97,3% auf der Korrela-

tionsgeraden. Durchschnittlich ergeben sich zwischen 4489 und 94450 Kopien je mg Wurzel.

Dabei konnten bei sechs der acht schwachen Banden aus der PCR mit den A. longula-spezifi-

schen Primern keine Kopien ermittelt werden. Womöglich handelte es sich dabei um

A. longula-Varianten oder nah verwandte Arten, die an den entsprechenden Positionen der

4 Diskussion 87

Primer- und Sondenbindungsstellen Basensubstitutionen aufwiesen. Als Richtwert für eine

gewöhnliche PCR geben INNIS & GELFAND (1990) 3·105 Startkopien an.

Bei der Quantifizierung von G. mosseae betrug die Effizienz der PCR 93%. Der Korre-

lationskoeffizient betrug 0,979. Die Standardwerte lagen also bis zu 97,9% auf der Korrela-

tionsgeraden. Die Mittelwerte der gemessenen Kopienzahlen lagen zwischen 381 und 64750

Kopien je mg Wurzel. Allerdings ist zu beachten, dass es sich hierbei um „G. mosseae-Äqui-

valente“ handelt. Ein Vergleich der Probensequenzen mit denen des Primers P1 und der

Sonde F1 hatte gezeigt, dass bei den ermittelten G. caledonium und G. geosporum-Proben

jeweils eine bzw. zwei Basen abwichen. Dies könnte der Grund für eine verringerte PCR-

Effizienz gewesen sein und würde erklären, weshalb bei der G. geosporum-Probe von

P. lanceolata Pla5-004 keine Kopien ermittelt wurden. Weiterhin ist zu beachten, dass es sich

bei der rDNA um ein high copy gene handelt, so dass etwa 100 Startkopien je Genom vorla-

gen. Da diese fest miteinander auf einem Strang verbunden waren, wurden sie nur „paket-

weise“ pipettiert. Die Konsequenz ist eine umso höhere Standardabweichung bei geringerer

Kopienzahl.

Aus dem Ergebnis dieser Analyse lässt sich somit auf die Zahl der Genome oder Kerne

je mg Wurzel schließen. Da die Hyphen der AMF nicht septiert sind, ist eine Gleichsetzung

der Kernzahl mit der Zellzahl nicht möglich und eine Massenbestimmung schwierig. Über die

Zahl der Kerne in Sporen wurden einige Untersuchungen durchgeführt, die jedoch sehr

unterschiedlich ausgefallen sind, so untersuchten BIANCIOTTO & BONFANTE (1992)

cytofluorometrisch die Genomgröße zweier AMF-Arten. Sie errechneten dabei durch-

schnittlich 0,26 pg je Nukleus für G. versiforme und ca. 0,75 pg je Nukleus bei G. margarita.

Die Anzahl der Nuklei je Spore geben sie mit 9.000 für G. caledonium, 20.000 bei

G. margarita und 35.000 bei G. decipiens an. Allerdings beschreiben HOSNY et al. (1998)

lediglich 800 Nuklei und 0,88 pg DNA für S. castanea-Sporen und 1167 Nuklei bei

G. margarita. BURGGRAAF & BERINGER (1989) hingegen errechneten 20.000 Kerne pro

G. margarita-Spore und BÉCARD & PFEFFER (1993) geben 2400 Kerne an. BAHNWEG et al.

(1998) gehen bei Pilzen von einer haploiden Genomgröße von 2·107 bp und einer Kopienzahl

von 300 rDNA-Einheiten pro Genom und 9,1·108 bp je pg DNA aus. HOSNY et al. (1999) un-

tersuchten die rDNA von S. castanea und fanden eine Kopienzahl von 75 (40 bis 400) je

haploidem Genom. Sie stellten außerdem eine Größe des Genoms von 108 bis 109 bp fest,

verglichen sie mit anderen Pilzarten (1,4 bis 5·107 bp). Bei angenommenen 100 rDNA-Ein-

heiten je Genom und 0,5 pg je Nukleus ergibt dies ungefähr 45 bis 945 Kerne (22,5 bis 472 pg

4 Diskussion 88

AMF-DNA) je mg Wurzel bei A. longula und zwischen 4 und 648 Kerne (2 bis 324 pg AMF-

DNA) je mg Wurzel bei G. mosseae.

4.6 Identifikation der Mykorrhizapilze anhand der Sporenmorpholgie

Bei der Identifizierung der AMF mithilfe der Sporenmorphologie konnten sechs verschiede-

nen Typen unterschieden werden. Sporen vom Typ G. mosseae stellten dabei mit einem An-

teil von etwa 70% den größten Anteil. Dieses Ergebnis stimmt recht gut mit den Angaben

anderer Autoren überein (Kap. 4.8).

Die klassischen Studien zur Identifizierung der AMF-Arten beruhen auf der

Untersuchung der Sporenmorphologie. SCHENK & PÉREZ (1990) veröffentlichten hierzu einen

Bestimmungsschlüssel. Dieser basiert auf den Veröffentlichungen neu beschriebener Arten

und ist daher sehr uneinheitlich, so dass einzelne Beschreibungen nicht ohne weiteres

miteinander verglichen werden können. Während die Identifizierung auf Gattungsebene noch

relativ einfach ist, können bei der Bestimmung einzelner Arten vielerlei Probleme auftreten.

Charakteristika wie Größe oder Färbung sind abhängig vom Alter und Zustand der Sporen

sowie ihrer Umgebung (Substrat). Außerdem kann die sichere Identifizierung der Sporen

durch Parasitenbefall unmöglich werden. Bei der Bestimmung von Freiland-Sporen müssen

die meist einzeln isolierten Sporen individuell analysiert werden. Dadurch können einige

wichtige Unterscheidungsmerkmale nur bedingt berücksichtigt werden. Untersucht man die

Sporengröße an hunderten Sporen einer Einzelsporkultur, so erkennt man, dass diese einer

Gauß’schen Normalverteilungskurve entspricht. Außerdem sind junge Sporen in der Regel

kleiner als ältere. Die phänotypische Größe einer isolierten Freilandspore unbekannten Alters

ist daher kein sicheres Merkmal. Auch die Farbe einer Spore ist von ihrem Alter abhängig, so

sind jüngere heller. Außerdem können sie je nach Boden unterschiedlich getönt sein, so dass

Freilandsporen meist dunkler sind als Sporen aus Topfkulturen (KRAMADIBRATA et al. 2000).

Desgleichen kann die Sporen-Ontogenese aus entwickelten Sporen nicht mehr als Unterschei-

dungsmerkmal dienen. Mit der klassischen Methode werden „Morphotypen“ (MORTON &

BENNY, 1990; WALKER, 1992) beschrieben, wobei minimale Differenzen im Aufbau der

Sporenwand zur Unterscheidung von Arten ausreichen. Dass diese „Morphotypen“ jedoch

nicht synonym mit dem Begriff „Arten“ behandelt werden dürfen zeigt folgendes Beispiel:

A. gerdemannii und G. leptotichum wurden aufgrund ihres Sporenphänotyps beschrieben.

Nachdem SAWAKI et al. (1998) zeigen konnten, dass sie genotypisch identisch sind, wurden

beide als Archaeospora leptoticha zusammengefasst (s. Kap. 4.11).

4 Diskussion 89

Die Identifikation von Sporen wurde in dieser Arbeit bewusst nur dazu angewandt, um

einen ersten Überblick über das Vorhandensein bestimmter Typen zu erhalten. Sie sagt weder

etwas über die tatsächlichen Mykorrhizierungsverhältnisse in den Pflanzen aus, noch über das

Mykorrhizerungspotential, da viele AMF nur wenige, unregelmäßige oder gar keine Sporen

produzieren, oder diese sich in den Pflanzenwurzeln (z.B. G. intraradices) statt im Boden

befinden (SCHÜßLER et al. 2001a). Letztlich stellt die Sporenanalyse ein „Sporenbildungs-

potential“ fest (FITTER, Department of Biology, University of York, persönliche Mitteilung).

Auf eine intensivere Untersuchung der Sporen wurde deshalb zugunsten der

molekularbiologischen Methoden verzichtet.

4.7 Mykorrhizierung und Phosphatgehalte

Die angewandte Magnified Intersections-Methode nach MCGONIGLE et al. (1990) besitzt ge-

genüber der häufig verwendeten Grid-line Intersect-Methode (GIOVANETTI & MOSSE, 1980,

TROUVELOT et al., 1986) den Vorteil, dass einzelne kleine Bereiche keine höhere Kolonisie-

rungsrate vortäuschen wie kompakte, dichte Bereiche. GANGE et al. (1999) fanden heraus,

dass verschiedene Färbemethoden die Pilzhyphen unterschiedliche stark färben konnten. Die

Mykorrhizierung der einzelnen Pflanzen wies insgesamt starke Schwankungen auf, so dass

eine eindeutige Interpretation schwierig war. Bei der Hyphen-Kolonisierungsrate konnte

keine Abhängigkeit vom Standort oder der Pflanze festgestellt werden. Es sind lediglich Indi-

zien für eine jahreszeitliche Zunahme vorhanden. SANDERS & FITTER (1992) untersuchten die

Mykorrhizierung bei sechs verschiedenen Grasland-Pflanzenarten. Sie stellten bei

P. lanceolata und Rumex acetosa eine starke jahreszeitliche Schwankung fest. Bei Festuca

rubra, H. lanatus, Lathyrus pratensis und Trifolium pratense verlief die Kolonisierung

gleichmäßiger. Bei der Vesikel-Kolonisierungsrate zeigt sich ein differenzierteres Bild. So

deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Vesikeldichte zum Herbst hin abnimmt. Dies

könnte dergestalt interpretiert werden, dass die Assimilate zunächst in der Pflanzenwurzel,

also den Vesikeln gespeichert und im späteren Verlauf des Jahres während der Bildung von

Sporen in diese verlagert werden. FITTER et al. (1998) stellten eine Korrelation fest zwischen

dem C-Transfer und der Vesikelzahl in der korrespondierenden Pflanzenwurzel fest. Es ist

daher anzunehmen, dass der Anstieg der Vesikel-Kolonisierungsrate mit der hohen Assimi-

latproduktion der Pflanzen im Sommer zusammenfällt. Im Herbst dagegen nimmt die Assi-

milatproduktion wieder ab. Aus diesem Grund und in Kombination mit dem Temperaturabfall

und/oder zunehmender Trockenheit (bei Gewächshauskulturen wird der Pilz durch Einstellen

4 Diskussion 90

des Gießens zur Sporulation angeregt) könnten die AMF ihre Reservestoffe von den intrara-

dikalen Vesikeln in die neu gebildeten Sporen verlagern.

Die Phosphatgehalte fielen auf der Wiese W02 mit durchschnittlich 2 mg P4O10 je 100 g

Boden sehr gering aus. Auf der Weide lagen die Werte generell höher und erreichten in den

flacheren oberen und unteren Lagen Spitzenwerte im Gegensatz zu den steileren Mittellagen.

Dies deckt sich mit der Beobachtung, dass die Rinder die flachen Stellen bevorzugt zum Wie-

derkäuen aussuchten, was im Phosphateintrag durch Kot deutlich wird. Die jahreszeitliche

Zunahme auf der Weide könnte ebenfalls auf die Beweidung durch die Rinder und den damit

verbundenen P-Eintrag zurückzuführen sein. Den Winter über wurden sie im Stall gehalten,

so dass der P-Gehalt wieder abgenommen hat. Von dem geringen natürlichen, aus der Ver-

witterung von Mineralien entstandenen, Phosphatgehalt von 0,01-0,1% (davon ca. 60% in

anorganischer, ca. 40% in organischer Form) stehen den Pflanzen nur etwa 0,02-0,1 mg P/kg

zur Verfügung (BLUME, 1992). Düngerphosphate werden durch Umsetzungsprozesse langsam

an Eisenoxide absorbiert oder zu schwer löslichen Calciumphosphaten umgesetzt. Dadurch

steht es den Pflanzen nicht mehr zur Verfügung, so dass von einem Ausnutzunggrad von 10

bis 25% im ersten Jahr ausgegangen wird, allerdings tritt ein Depoteffekt ein. Bei

Flüssigdünger (Gülle) wird ein Großteil des Phosphats in tiefere Schichten gespült und kann

unter Umständen, wenn es in Gewässer gelangt zu deren Eutrophierung beitragen. Wenn hohe

Phosphatdüngegaben zu einer Hemmung der Mykorrhiza führen (BLUME, 1992), so kann eine

verringerte Düngung die Mykorrhiza fördern und womöglich die Phosphatausbeute (mit

gezielter Beimpfung durch geeignete Stämme) erhöhen.

Ein Zusammenhang zwischen Phosphatverfügbarkeit und Mykorrhizierung lässt sich

nur bei der Hyphenkonzentration von H. lanatus auf der Wiese feststellen. In Gewächshaus-

versuchen wurde bei Erhöhung des Nährstoffangebots für die Pflanze durch Düngung ein

Rückgang der Mykorrhiza beobachtet (FIEDLER, 2001). Diese Erkenntnis impliziert, dass im

umgekehrten Fall bei einer Verringerung der Düngemenge die Mykorrhizierung ansteigen

würde und dadurch ein Nährstoffmangel ausgeglichen werden könnte. Durch gezielte

Inokulierung (bei genauer Kenntnis der Funktionalität der AMF) landwirtschaftlicher

Nutzflächen könnte ein Wandel von einer high-input- in eine low-input-Landwirtschaft

durchaus denkbar sein (GALVEZ et al. 1995). Im Gegensatz zu den Gewächshausversuchen

mit kontrollierbaren Parametern können im Freiland sehr viele Faktoren eine Rolle spielen.

Da Grünflächen keine Monokulturen darstellen, stehen die einzelnen Pflanzen in Konkurrenz

und Phytopathogene können zusätzlich eine Mykorrhizierung begünstigen. Es mag

widersprüchlich erscheinen, dass eine Pflanze in einer mineralien- und wasserreichen

4 Diskussion 91

Umgebung auf die AMF angewiesen ist. Doch ein hohes Ressourcenangebot führt zu starkem

Pflanzenwachstum und –produktivität und damit zu einem Verdrängungswettbewerb

zwischen den Pflanzen (ALLEN & ALLEN, 1990). EOM et al. (2001) untersuchten den Einfluß

von Huftieren auf die Zusammensetzung von AMF-Arten (in diesem Fall Sporen-

Morphotypen) im Weideland. Sie fanden heraus, dass durch die Beweidung sowohl die

Wurzelkolonisierung mit AMF-Hyphen als auch die Diversität der AMF-Arten zunahm. Un-

einigkeit besteht über Möglichkeit des Assimilattransports zwischen verschiedenen Pflanzen

über ein AMF-Netz. WATKINS et al. (1996) berichteten vom Transport von bis zu 10% 13C-

markierter Verbindungen von einer anderen Pflanzen in eine AM-Wurzel. FITTER et al.

(1998) konnten jedoch belegen, dass die Assimilate ausschließlich in der Wurzel, nicht aber

in der übrigen „Empfänger-Pflanze“ zu finden waren. Die Autoren vermuten, dass die

Kohlenstoff-Verbindungen zwar über das Myzel verteilt werden und womöglich in Vesikeln

einer benachbarten Pflanzenwurzel deponiert werden, schließen aber einen Rücktransfer Pilz-

Pflanze aus.

4.8 Biodiversität: Arten und Individuen

Die Biodiversität setzt sich aus der Artenzahl und Artenverteilung zusammen. Bei den AMF

kann weder der Begriff Art genau definiert, noch eine Individuenzahl angegeben werden.

Eine klassische Definition des Artbegriffes setzt die fruchtbare Nachkommenschaft voraus

(ROSENDAHL, 1996). Bei den AMF handelt es sich jedoch um Lebewesen, die sich vegetativ

fortpflanzen. Eine Einteilung nach Sporenmerkmalen liefert bestenfalls „Morphotypen“.

Genetische Einteilungen liefern keine schlüssigeren Kriterien, da immer wieder von Polymor-

phien berichtet wurde (s. Kap. 4.9). Selbst wenn man sich auf „Karyotypen“ beschränkt, ist

eine Artabgrenzung problematisch. Auch die Suche nach einem „AMF-Individuum“ ist

schwierig, da nicht einmal einzelne Zellen innerhalb der unseptierten Hyphen zu definieren

sind. Die Sporen sind heteropolykaryotisch, so dass auch in diesem Fall die einzelnen Kerne

als kleinste (individuelle) Einheit anzusehen sind. Im Rahmen dieser Arbeit können deshalb

nur bedingt Aussagen über die Biodiversität der AMF getroffen werden. Einerseits konnten

mit den verfügbaren Mitteln nur einzelne Gruppen der AMF nachgewiesen, andererseits ist

eine Arteinteilung bei Haplonten naturgemäß problematisch. Eine Häufigkeit in Form von

Individuenzahlen kann ebensowenig angegeben werden. Die ermittelten Kopienzahlen stellen

in dieser Hinsicht einen Näherungswert dar, wobei jedoch bisher die Zusammenhänge

zwischen Kopien-, Kern- und Individuenzahl nur unzureichend erforscht sind.

4 Diskussion 92

MERRYWEATHER & FITTER (1998) untersuchten die Morphologie von AMF in Wurzeln

von Hyacinthoides non-scripta und ihre Sporen in der Wurzelzone. Sie fanden dabei in den

Wurzeln sechs Morphotypen (1 Scutellospora, 1 Acaulospora, 3 Glomus, 1 „Endophyt“) und

acht Sporentypen: hauptsächlich S. dipurpurascens und Acaulospora koskei neben Glomus

rubiforme und fünf Acaulospora-Arten. HELGASON et al. (1998) verglichen die AMF-Vertei-

lung in Wald und Ackerland. Sie sequenzierten einen Bereich der SSU rDNA von mykorrhi-

zierten Wurzeln, die mit den Primern AM1 und NS31 amplifiziert worden waren und stellten

signifikante Unterschiede zwischen Wald und Ackerland fest. Von 100 Acker-Sequenzen

ließen sich 92 G. mosseae zuordnen. Daneben fanden sie sechs weiter Glomus-, eine

Acaulospora- und eine Scutellospora-Sequenz. Diese Dominanz von G. mosseae und nah

verwandten Arten wurde in der Folgezeit durch verschiedene Autoren bestätigt. KJØLLER &

ROSENDAHL (2001) untersuchten dänische Ackerflächen, auf denen Erbsen angebaut waren.

Anhand der Sporenmorphologie konnten sie neben G. mosseae, G. geosporum, G. caledonium

und G. claroideum eine Scutellospora-Art feststellen. Die Sequenzierung von 39 Amplifika-

ten einer nested PCR erbrachte zwölf G. intrardices, sieben G. geosporum, achtzehn

G. caledonium und zwei G. fragilistratum-ähnliche Isolate. In drei Fällen konnte jeweils

G. intraradices und G. caledonium gemeinsam in einer Wurzelprobe festgestellt werden. Die

Abwesenheit von G. mosseae-Sequenzen erklären die Autoren mit einer Kolonisierung durch

diesen Pilz zu einem früheren Zeitpunkt. VANDENKOORNHUYSE et al. (2002) fanden bei der

Untersuchung von Arrhenatherum elatius-Wurzeln mit pilzspezifischen Primern (SSU rDNA)

drei AMF-Sequenztypen. Einer davon ließ sich der Gattung Glomus zuordnen, die beiden

anderen wiesen keine nähere Verwandschaft mit irgendeiner bekannten AMF-Art auf.

Aufgrund dieser Erkenntnisse lässt sich eine Artenzahl von bis zu 10 AMF in einem

Ökosystem vorhersagen, wobei auf landwirtschaftlichen Nutzflächen G. mosseae-verwandte

Arten dominant auftreten können. Die vorliegende Arbeit bestätigt diesen Befund: die Anzahl

von sechs verschiedenen Morphotypen stimmt sehr gut mit den Angaben der anderen Autoren

überein. Die Dominanz von G. mosseae im Grünland findet sich ebenfalls bestätigt: etwa 70%

der Sporen konnten als G. mosseae identifiziert werden, weitere 10% wurden der nah

verwandten Art G. geosporum zugeordnet. Auch die molekulargenetischen Untersuchen

ergaben ein verbreitetes Vorkommen von G. mosseae und verwandten Arten bei 17% der

untersuchten Pflanzen.

4 Diskussion 93

4.9 Fortpflanzung und Variabilität der AMF

Bei der langen Entwicklungszeit von über 400 Millionen Jahren und ihrer weltweiten Ver-

breitung hätten sich bei einer rein vegetativen Fortpflanzung weit mehr als die bekannten

166 AMF-Arten entwickeln können, da die divergierenden Genotypen keine Möglichkeit der

Rekombination besitzen. Die hohe genetische Diversität innerhalb einzelner AMF-Sporen ist

seit längerer Zeit bekannt und durch zahlreiche Publikationen belegt. Die spannende Frage, ob

sich die variablen rDNA Sequenzen innerhalb eines Kerns oder unter verschiedenen Nuklei

einer Spore befinden, bleibt ein offenes Rätsel (Redecker et al., 1999).

LLOYD-MACGILP et al. (1996) analysierten verschiedene Klone der ITS-Region aus

Sporen von G. mosseae, G. coronatum, G. fasciculatum und G. dimorphicum. Dabei konnten

sie Unterschiede von bis zu 6% innerhalb eines Isolats oder gar einer Spore feststellen.

Interessanterweise war die Variabilität zwischen Isolaten einer geographischen Region nicht

kleiner als zwischen Isolaten, die von verschiedenen Kontinenten stammten. HIJRI et al.

(1999) sequenzierten Klone von PCR-Produkten der ITS-Region einzelner Sporen. Sie kon-

struierten einen Stammbaum und konnten eine hohe Divergenz dieser Sequenzen feststellen.

REDECKER et al. (1999) konnten zwar anhand von Untersuchungen der 5.8S rDNA nachwei-

sen, dass einige Sequenzen von S. castanea, die sich nicht innerhalb der Glomales einordnen

ließen, zu den Ascomyceten gerechnet werden müssen (Phoma und Leptosphaeria). Sie

schlossen daraus, dass Ascomyceten entweder an der Sporenoberfläche leben, innerhalb der

Sporen als Parasiten vorkommen oder diese Sequenzen tatsächlich Teil des Genoms der AMF

sind. Allerdings wurde die Polymorphie unter den AMF nicht in Frage gestellt. ANTONIOLLI

et al. (2000) analysierten die Variabilität der ITS-Region bei Glomus mosseae und Gigaspora

margarita von einer Weidefläche in Australien. Dabei zeigte sich, dass aus einer einzelnen

Spore bis zu zwölf verschiedene Sequenzen mit einer mittleren Abweichung von 5,6 Substi-

tutionen je 100 Nukleotide (G. mosseae) bzw. neun verschiedenen Sequenzen mit 3,6 Substi-

tutionen (G. margarita) erhalten werden konnten. Datenbankvergleiche der einzelnen

Sequenzen erbrachten hohe Identitätsraten mit Isolaten rund um den Globus (u.a. Finnland,

Indonesien, Venezuela).

Bei den in dieser Arbeit untersuchten Sequenzen konnte keine nennenswerte

Variabilität innerhalb einzelner Isolate festgestellt werden. Obwohl die PCR-Produkte nicht

kloniert worden waren, verliefen die Sequenzierungen ohne Probleme. Nur einzelne Basen

konnten nicht eindeutig identifiziert werden. Diese unbestimmten Basen lagen jedoch nicht in

Bereichen, in denen sich einzelne Stämme voneinander unterschieden, so dass eine mögliche

Heterokaryose für diesen analysierten Bereich der LSU rDNA ausgeschlossen werden kann.

4 Diskussion 94

Die verwendeten spezifischen Primer sind aufgrund des hohen Konservierungsgrades der

LSU rDNA gegenüber der hochvariablen ITS-Region für diese Art der Untersuchung von

Vorteil. Einzelne Isolate von G. mosseae unterschieden sich in einigen wenigen Basen, so

dass unterschiedliche Stämme in allen untersuchten Flächen vorgefunden werden konnten.

VANDENKOORNHUYSE et al. (2001) untersuchten die genetische Diversität zweier

Glomus-Arten mit Hilfe von Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) fingerprint. Dabei wurden

Elektrophoresetypen von einzelnen Sporen erstellt und diese miteinander verglichen. Die

hohe Zahl unterschiedlicher Elektrophorese-Profile und polymorpher Loci innerhalb der

beiden Arten ließ sie schlussfolgern, dass Mutationen alleine durch homologe Re-

kombinationen oder ein Kernaustausch durch Anastomose stattgefunden haben muß. Bereits

SANDERS et al. (1996) vermuteten als Grund für die heterokaryotische Natur der AMF den

Austausch von Nuklei durch die Fusion von Hyphen. Giovannetti et al. (1999) konnten tat-

sächlich eine Anastomose bei G. mosseae, G. caledonium und G. intraradices nachweisen.

Dabei fanden Fusionen von Hyphenwänden sowie ein Cytoplasma-Austausch zwischen

Hyphen statt, die aus einer einzigen Spore und mehreren Sporen eines Isolats gewachsen wa-

ren. Es konnten jedoch keine intergenerischen oder interspezifischen Fusionen beobachtet

werden. Bei den ebenfalls untersuchten Arten G. rosea und S. castanea konnte keine

Anastomose dokumentiert werden.

Anastomose ermöglicht den Austausch von genetischem Material. Diese als

Parasexualität bezeichnete Form der Rekombination ohne Meiose und Gameten

(PONTECORVO et al., 1953) würde einerseits die hohe Diversität innerhalb einzelner Sporen

und das Vorhandensein identischer Genotypen in verschiedenen Stämmen erklären, es könnte

aber auch der Grund für die geringe Artenzahl sein. Die sexuelle Fortpflanzung diploider

Organismen kann als „Motor der Evolution“ bezeichnet werden kann, da durch Meiose,

Crossing over und Rekombination immer neue Formen entstehen. Hingegen könnte die

Parasexualität als „Bremse der Evolution“, im Sinne einer geringen Artenzahl, fungiert haben.

Durch die Rekombination einzelner Kerne kann zwar eine hohe Anpassungsfähigkeit erzielt

werden, es entstehen jedoch dadurch keine neuen „Arten“, sondern der mögliche

Formenreichtum wird immer wieder durch eine Durchmischung von Kernen relativiert. Die

phänotypischen Eigenschaften der heteropolykaryotischen haploiden AMF würden demnach

durch Anzahl und Verhältnis der einzelnen Kerntypen beeinflusst. Bei der „normalen“

Sexualität diploider Organismen kann es dagegen vermutlich leichter und schneller zu

Fortpflanzungsbarrieren und damit zur Bildung neuer Arten kommen. Dies könnte auch die

geringe Wirtsspezifität der AMF erklären. Wenn ein Myzel mit einem heterogenen

4 Diskussion 95

Kernrepertoir neue Sporen ausbildet, werden diese zufällig mit Kernen unterschiedlichen

Genotyps ausgestattet. Da die Sporen tausende von Kernen enthalten können, besitzen

wahrscheinlich keine zwei Sporen eine exakt identische Kernzusammensetzung. Entspre-

chend ihrer Umweltbedingungen würden einzelne Sporen einen Vorteil erhalten und be-

stimmte Kerntypen begünstigt werden. Ändern sich die Umweltbedingungen, so könnte durch

Anastomose ein Genfluß stattfinden und die Karyotypen-Population mit „frischem Blut“

(= Kerne) aufgestockt werden.

Eine interessante These stellen RODRIGUEZ et al. (2001) auf. Auch sie hatten unter-

schiedliche Sequenzen bei Einzelsporen von Entrophospora infrequens gefunden, welche sich

zum Teil verschiedenen Glomus-Arten zuordnen ließen. E. infrequens gilt neben

G. globiferum, E. baltica, S. spinosissima und S. projecturata als nicht kultivierbar,

d.h. Einzelsporkulturen schlugen bisher stets fehl. Die Autoren vermuten deshalb, es könnte

sich hierbei um eine Hybrid-Form handeln, bei der genetisches Material (Nuklei)

verschiedener Arten durch Anastomose vermischt wurde. Bisher konnten jedoch nur

Anastomosen zwischen Isolaten einzelner Glomus-Arten dokumentiert werden.

4.10 Phylogenetische und Systematische Neuordnung der Morphospezies

Die ursprüngliche Zuordnung der AMF zur Ordnung Endogonales innerhalb der

Zygomyceten, war aufgrund der Sporokarpienbildung bei Endogone (sexuell) und Glomus

(asexuell) erfolgt. MORTON & BENNY (1990) fassten alle AMF in einer neuen Ordnung

Glomales zusammen, der sechs Gattungen angehörten. ALMEIDA & SCHENCK (1990) nahmen

aufgrund der Sporenposition in den Sporokarpien eine Neuordnung der 13 Sclerocystis-Arten

vor. Sie überführten fünf Arten in die Gattung Glomus und fassten die restlichen zur Art

S. coremioides zusammen. SIMON (1996) fand bei der Untersuchung der SSU rDNA eine

starke Abweichung zwischen Sequenzen von G. etunicatum einerseits, sowie G. mosseae,

G. intraradices, G. vesiculiferum und G. manihotis andererseits. REDECKER et al. (2000a)

kamen zu dem Schluß, dass die letzte verbliebene Sclerocystis-Art, S. coremioides, der

Gattung Glomus zuzuordnen sei. MORTON & REDECKER (2001) gliederten einige Arten der

Acaulosporaceae und Glomaceae aufgrund ihrer genetischen Abweichungen aus und grup-

pierten sie in zwei neu beschriebenen Familien (Archaeosporaceae und Paraglomaceae) mit

jeweils einer neuen Gattung (Archaeospora und Paraglomus; Abb. 48).

4 Diskussion 96

Abb. 48: Stammbaum der Glomales nach MORTON & REDECKER (2001).

SCHWARZOTT et al. (2001) stellten anhand von Untersuchungen der SSU rDNA von

30 Isolaten fest, dass die Gattung Glomus nicht monophyletisch ist. Neben den Familien

Archaesporaceae und Paraglomaceae konnten sie die restlichen Glomus-Vertreter in drei

Gruppen einteilen. Ihre Glomus mosseae-Gruppe (GlGrA) umfaßt in einer Untergruppe

(GlGrAa) u.a. die Arten G. caledonium, G. coronatum, G. fragilistratum, G. geosporum,

G. mosseae und G. verruculosum. Dies entspricht denjenigen Arten, die mit den Primern

Glom85For und Glom387Rev amplifiziert werden konnten. Eine weitere Untergruppe

(GlGrAb) besteht aus den Arten G. clarum, G. coremioides, G. fasciculatum, G. intraradices,

G. manihotis, G. proliferum, G. sinuosum und G. vesiculiferum und die Untergruppe GlGrAc

enthält das Isolat G. sp. W3347. Ihrer Glomus etunicatum-Gruppe (GlGrB) ordnen die Auto-

ren die Arten G. claroideum, G. etunicatum, G. lamellosum, G. luteum, G. manihotis

(clarum), G. microaggregatum und G. viscosum zu. Eine weitere Gruppe (GlGrC), bestehend

aus G. versiforme, G. spurcum und G. etunicatum, steht interessanterweise den

Acaulosporaceae näher als den beiden anderen Glomus-Gruppen. Ungeklärt bleibt dabei die

Stellung von G. manihotis und G. clarum, die sich sehr ähneln und sowohl in GlGrAa als

auch in GlGrB auftauchen. Ebenso finden sich Stämme von G. etunicatum in den Gruppen

GlGrC und GlGrB. Die Autoren schlagen für ihre Glomus-Gruppe C einen neuen Familien-

4 Diskussion 97

namen Diversisporaceae vor. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass Geosiphon

pyriforme (Kap. 4.11) innerhalb der Archaeosporaceae näher mit A. leptotichum verwandt ist

als mit A. trappei. Die Paraglomaceae weisen die größten genetischen Abweichungen im

Vergleich zu allen anderen Familien auf und repräsentieren vermutlich die ursprünglichsten

Vertreter der AMF.

Aus den phylogenetischen Befunden lassen sich verschiedene Schlussfolgerungen zie-

hen: Jedes Isolat, weist es auch eine noch so große morphologische Ähnlichkeit zu anderen

Arten auf, ist primär unbedingt als eigener Stamm bzw. Isolat zu behandeln. Die beiden

Unterordnungen Glominaeae und Gigasporineae sind in dieser Form nicht mehr haltbar. Die

erwogene Paraphylie der Glomales ist durch die neuesten phylogenetischen Erkenntnisse

widerlegt (SCHWARZOTT et al. 2001), so dass nunmehr alle AMF-Arten (inklusive

G. pyriforme) sicher einem gemeinsamen Vorfahren entstammen. Durch die Gruppierung von

G. pyriforme innerhalb der (dadurch paraphyletischen) Archaeosporaceae ergeben sich drei

Möglichkeiten: die Umbenennung G. pyriforme zu Archaeospora pyriforme, eine Zwei-

Familien-Lösung mit einer gemeinsamen Familie (oder Gattung) aus G. pyriforme und

A. leptotichum oder eine Drei-Familien-Lösung mit G. pyriforme, A. leptotichum und

A. trappei in drei Familien (oder Gattungen). Insgesamt sind die molekularbiologischen

Analysemethoden noch nicht erschöpft, so dass umfassende systematische und taxonomische

Änderungen zu erwarten sind. SCHÜßLER et al. (2001b) korrigierten den Ordnungsnamen

Glomales nach den Regeln des International Code of Botanical Nomenclature (GREUTER et

al., 2000) in Glomerales (Glomaceae in Glomeraceae, Paraglomaceae in Paraglomeraceae).

Außerdem erhoben sie die AMF zum neuen Phylum Glomeramycota (mit drei neuen

Ordnungen), das näher mit den Ascomycota und Basidiomycota verwandt ist als mit den

verbleibenden Gruppen der Zygomycota (Abb. 49). Die Diversisporales umfassen die

Gigasporaceae, Acaulosporaceae sowie die vorgeschlagene Familie Diversisporaceae

(Glomus-Gruppe C). Die Archaeosporaceae und Geosiphonaceae bilden die Archaeosporales

und die verbleibenden Paraglomaceae die Paraglomerales. Demnach enthält die Ordnung

Glomerales nur noch die beiden Glomus-Gruppen A und B, die in noch zu benennende

Familien einzuteilen sind. Die Neuordnung der verbliebenen Glomus-Arten in

möglicherweise zwei Familien (GrGlA und GrGlB) mit drei neuen Gattungen (GrGlA-

Untergruppen a bis c) scheitert bisher noch an der Tatsache, dass Untersuchungen der

Typusart G. microcarpum fehlen.

4 Diskussion 98

Abb. 49: Stammbaum der Glomeromycota nach SCHWARZOTT et al. (2001).

4.11 Evolution und Artenzahl der AMF

Die frühesten Fossilfunde der AMF werden auf 400 Millionen Jahre datiert. In fossilen

Aglaophyton major-Wurzeln hatten TAYLOR et al. (1995) Pilzstrukturen gefunden, die iden-

tisch mit heutigen Arbuskeln und Hyphen waren. Die Pilzart wurde als Glomites rhyniensis

beschrieben. REDECKER et al. (2000b) fanden Fossilien von unseptierten Hyphen und Sporen,

die denen der AMF sehr ähnlich waren, mit einem Alter von etwa 460 Millionen Jahren.

Simon et al. (1993b) bezifferten das Alter der Glomaceae, Gigasporaceae und

Acaulosporaceae mit ca. 355 Mio. Jahren. Die Autoren führten jedoch ein sehr viel früheres

Alter für die AMF an, gestützt auf phylogenetische Untersuchungen, das mit dem Erscheinen

der ersten Landpflanzen vor 475 Millionen Jahren zusammenfällt. Während dieser langen

Entwicklungszeit scheinen es manche Pflanzengruppen „vorgezogen“ zu haben, ihren Sym-

biose-Partner „aufzukündigen“ und eine Nährstoffversorgung ohne Mykobionten zu gewähr-

leisten (Trappe, 1987). Nachdem MORTON & BENNY (1990) die AMF in der Ordnung

Glomales zusammenfaßten bürgerte sich allmählich ein, die beiden Begriffe synonym zu

verwenden. GEHRIG et al. (1996) konnten jedoch zeigen, dass Geosiphon pyriforme zu dieser

Ordnung zählt. Dies ist die einzige bekannte Art, die Cyanobakterien (der Gattung Nostoc) als

Endosymbionten besitzt. Sie erinnert damit eher an Pflanzen, deren Chloroplasten ja ur-

sprünglich auch Cyanobakterien waren, oder Flechten als welche sie ursprünglich beschrieben

4 Diskussion 99

wurde. Ob es sich bei G. pyriforme um die ursprüngliche Symbioseform handelt, woraus sich

dann durch Koevolution arbuskuläre Mykorrhizen zwischen AMF und höheren Pflanzen mit

den typischen Arbuskeln entwickeln konnten, oder ob die Symbiose mit Cyanobakterien sich

erst später entwickelte, ist noch nicht geklärt. Da es sich bei AMF um obligate Symbionten

handelt, wäre eine Entwicklung von saprophytischen oder parasitischen Vorläufern über die

Zwischenform der Symbiose mit Cyanobakterien durchaus plausibel. Damit wäre

G. pyriforme der einzige noch existierende Vertreter dieser speziellen Form der Symbiose.

PIROZYNSKI & MALLOCH (1975) sehen das Zusammenspiel einer Alge und eines Oomyzeten

als Vorläufer der AM. Sporen vom Typ Glomus scheinen die ursprüngliche Form darzustel-

len, von der sich im Lauf der Evolution mehrere Seitenzweige mit modifizierter Morpologie

abgezweigt haben. Allerdings müsste dann der Acaulospora-Sporentyp mindestens zweimal

durch Konvergenz entstanden sein, da er sich bei Acaulospora und Archaeospora findet. Eine

andere Möglichkeit wäre, dass ursprünglich acauloide und glomoide Sporen gebildet wurden

– wie heute noch bei Archaospora leptoticha als „lebendem Fossil“ - und der eine oder andere

Sporentyp bei den anderen Arten später verloren ging (Redecker et al. 2000c).

Wie viele AMF-Arten konnten sich im Lauf dieser mehr als 400 Millionen Jahren ent-

wickeln? HAWKSWORTH (2001) schätzt die Zahl der Endogonales- und Glomales-Arten welt-

weit auf 1000. Wenn man diese Zahl entsprechend der derzeit beschriebenen Arten auf die

beiden Gruppen aufteilt, so kann man mit 800 bis 1000 AMF-Arten rechnen. Vor 1974 waren

acht Arten von arbuskuläre Mykorrhizapilzen beschrieben worden. Seitdem kamen ca. 158

hinzu (Anhang B), so dass heute etwa 167 Arten zu den Glomeromycota gezählt werden kön-

nen (inklusive Geosiphon pyriforme). Eine Übersicht der derzeit allgemein anerkannten Arten

findet sich in Anhang A. Während zwischen 1974 und 1989 die Zahl der Arten noch stark

zunahm, sind die Neubeschreibungen in den letzten zehn Jahren auf durchschnittlich drei pro

Jahr gesunken. Neben der Beschreibung neuer Spezies aus dem Freiland, führt auch die

Überprüfung kultivierter Arten zu Neufunden. So wurden z. B. die Arten G. eburneum und

G. luteum von G. spurcum ausgegliedert (KENNEDY et al., 1999). Andererseits wurden einige

Arten als Synonyme entlarvt. SCHWARZOTT et al. (2001) stellten fest, dass sich G. manihotis

und G. clarum genetisch kaum unterscheiden und wohl als eine Art anzusehen sind.

MERRYWEATHER & FITTER (1998) stellten eine hohe genetische Verwandschaft zwischen

S. dipurpurascens und S. calospora fest. Eine enge Verwandtschaft von A. rugosa, A. longula

und A. morrowiae wird ebenfalls diskutiert (INVAM). Die Artenzahlen wurden häufig auf-

grund von Pilz/Pflanzen-Raten und der Wirtsspezifität hochgerechnet. Da die AMF-Arten als

wirtsunspezifisch gelten (SANDERS, 1993) und viele Arten weltweit verbreitet sind (WALKER,

4 Diskussion 100

1992), läßt sich dieses Rechenmodell wohl nicht auf sie übertragen. Ob tatsächlich 1000 Ar-

ten existieren oder jemals beschrieben werden können bleibt ungewiß. Vielleicht wird aber

auch eines Tages der Artbegriff bei den AMF, Prokaryoten und anderen Haplonten

vollständig aufgegeben, zugunsten einer Klassifizierung nach Stämmen. Die hohen

Erwartungen jedenfalls, die in die molekularbiologischen Untersuchungsmethoden zur

Definition von Arten gesetzt wurden, konnten bisher ebensowenig erfüllt werden, wie bei der

klassischen Einteilung anhand der Sporenmorphologie.

5 Zusammenfassung 101

5 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF) in

landwirtschaftlichen Nutzflächen bei Plantago lanceolata, Trifolium repens, Holcus lanatus

und anderen Pflanzen mit spezifischen Primer in einer nested PCR nachgewiesen. Neben

Acaulospora longula wurde eine Gruppe nah verwandter Arten um Glomus mosseae erfasst,

die als dominant auf landwirtschaftlichen Flächen betrachtet werden kann. Die Isolate dieser

Gruppe konnten a posteriori durch Sequenzvergleiche als G. mosseae, G. caledonium und

G. geosporum identifiziert werden. Als Zielregion für die PCR diente die große Untereinheit

der ribosomalen DNA (LSU rDNA). Um die Pilze in planta nachweisen zu können, mussten

bestehende DNA-Extraktionsmethoden weiterentwickelt werden. 56 DNA-Extrakte aus

Wurzeln wurden mit universellen Primern als amplifizierbar getestet. A. longula konnte in

mindestens fünf Wurzelproben bei allen drei Grünland-Pflanzen nachgewiesen werden. Außer

in diesen Pflanzen wurde G. mosseae auch in Helianthus annuus und Triticum aestivum

gefunden. Die G. caledonium-Sequenzen stammten aus H. lanatus und Zea mays sowie G.

geosporum aus P. lanceolata. Aufgrund dieser Verbreitung konnte keine Wirtsspezifität der

untersuchten AMF festgestellt werden. Die PCR-Produkte der G. mosseae-Gruppe wurden

mit Endonukleasen behandelt, um Restriktionsmuster zu erhalten. Mit dem Enzym AluI

konnte G. mosseae von den übrigen Arten unterschieden werden. Von den gewonnenen

Sequenzdaten konnte unter Einbeziehung von Datenbank-Sequenzen ein phylogenetischer

Stammbaum erstellt werden. Mithilfe der quantitativen Taqman® real-time PCR wurde die

Kopienzahl der Mykorrhizapilze bestimmt. Von A. longula konnten bis zu 13.300 Kopien und

von G. mosseae bis zu 64.750 Kopien je mg Wurzel nachgewiesen werden.

Die Pilze wurden in der Wurzel mit Trypanblau gefärbt, die Kolonisierungsraten

mikroskopisch bonitiert und mit den pflanzenverfügbaren Phosphatgehalten der Rhizosphäre

korreliert. Aufgrund der hohen Standardabweichungen konnte kein signifikanter

Zusammenhang zwischen Mykorrhizierung und Standort, Jahreszeit, Pflanze oder

Phosphatverfügbarkeit festgestellt werden. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass die

Kolonisierung mit Hyphen im Jahresverlauf zunimmt, während die Vesikelzahl abzunehmen

scheint. Vermutlich werden die Speicherstoffe der Vesikel gegen Ende des Jahres zur Bildung

von Sporen extraradikal verlagert. P. lanceolata wies generell die höchste Hyphen-

Kolonisierungsrate auf und bei H. lanatus scheint es einen indirekten Zusammenhang

zwischen Hyphendichte und Phosphatkonzentration zu geben. Außerdem wurde eine

Sporenbestimmung vorgenommen, bei der sechs verschiedene Sporentypen unterschieden

werden konnten. Der häufigste Sporentyp ähnelte dabei G. mosseae.

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7 Anhang 115

7 Anhang

A. Übersicht der AMF-Arten

In der folgenden Übersicht sind sämtliche AMF-Arten (inklusive Geosiphon pyriforme) und

noch gebräuchliche Synonyme mit Autoren und Jahr der Beschreibung aufgeführt. Die

Gliederung entspricht dem neuesten Stand (SCHÜßLER et al., 2001b). Die Unterteilung der

Glomus-Arten ist bereits – soweit möglich – berücksichtigt. Glomus-Arten, die aufgrund

mangelnder Sequenzdaten bisher keiner der drei Gruppen zugeteilt werden konnten, werden

weiterhin in der Gattung Glomus geführt. Die Bezeichnungen entsprechen den Korrekturen

von WALKER & TRAPPE (1993) und SCHÜßLER et al. (2001b). Arten, von denen genetische

Informationen in der NCBI-Datenbank vorliegt, sind mit einem § gekennzeichnet.

STAMM GLOMEROMYCOTA WALKER & SCHÜßLER 2001

KLASSE GLOMEROMYCETES CAVALIER-SMITH 1998

ORDNUNG GLOMERALES (MORTON & BENNY 1990) WALKER & SCHÜßLER 2001

Familie Glomeraceae PIROZYNSKI & DALPÉ 1989

Gattung Glomus TULASNE & TULASNE 1845

Glomus mosseae-Gruppe (GlGrA)

Untergruppe a (GlGrAa)

§ G. caledonium (NICOLSON & GERDEMANN) TRAPPE & GERDEMANN 1974§ G. coronatum GIOVANNETTI, AVIO & SALUTINI 1991§ G. fragilistratum SKOU & JAKOBSEN 1989§ G. geosporum (NICOLSON & GERDEMANN) WALKER 1982§ G. mosseae (NICOLSON & GERDEMANN) GERDEMANN & TRAPPE 1974§ G. verruculosum BLASZKOWSKI 1997

Untergruppe b (GlGrAb)

§ G. clarum NICOLSON & SCHENCK 1979§ G. coremioides (BERK. & BROOME) REDECKER & MORTON 2000

= Sc. coccogena (PATOUILLARD) VON HÖHNEL 1910= Sc. coremioides BERKELEY & BROOME 1873= Sc. dussii (PATOUILLARD) VON HÖHNEL 1910

§ G. fasciculatum (THAXTER) GERDEMANN & TRAPPE emend. WALKER & KOSKE 1987§ G. intraradices SCHENCK & SMITH 1982 (G. intraradix)§ G. manihotis HOWELER, SIEVERDING & SCHENCK 1984 (G. manihot) = G. clarum? (oder

GlGrB?)§ G. sinuosum (GERDEMANN & BAKSHI) ALMEIDA & SCHENCK 1990

= Sc. pakistanica IQBAL & BUSHRA 1980= Sc. sinuosa GERDEMANN & BAKSHI 1976

§ G. vesiculiferum (THAXTER) GERDEMANN & TRAPPE 1974

7 Anhang 116

Glomus etunicatum-Gruppe (GlGrB)

§ G. claroideum (SCHENCK & SMITH 1982) WALKER & VERSTBERG 1998 (G. claroides)§ G. etunicatum BECKER & GERDEMANN 1977 (oder Diversisporales?)§ G. lamellosum DALPÉ, KOSKE & TEWS 1992§ G. luteum Kennedy, STUTZ & MORTON 1999§ G. manihotis HOWELER, SIEVERDING & SCHENCK 1984 (G. manihot) = G. clarum? (oder

GlGrAb?)§ G. microaggregatum KOSKE, GEMMA & OLEXIA 1986 (GlGrB)§ G. viscosum WALKER et al. 1995

Noch nicht zugeordnete Arten

G. aggregatum (SCHENCK & SMITH) KOSKE 1985G. albidum WALKER & RHODES 1981G. ambisporum SMITH & SCHENCK 1985G. antarticum CABELLO 1994G. arborense MCGEE 1986G. arenarium BLASZKOWSKI, TADYCH & MADEJ 2001G. australe (BERKELEY) BERCH 1983G. boreale (THAXTER) TRAPPE & GERDEMANN 1922G. botryoides ROTHWELL & VICTOR 1984G. callosum SIEVERDING 1988G. canadense (THAXTER) TRAPPE & GERDEMANN 1922G. cerebriforme MCGEE 1986G. chimonobambusae WU & LIU 1995G. citricola TANG & ZANG 1984= G. fistulosum SKOU & JAKOBSEN 1989= G. maculosum MILLER & WALKER 1986= G. multisubstensum MUKERJI, BHATTACHARJEE & TEWARI 1983G. clavisporum (TRAPPE) ALMEIDA & SCHENCK 1990= Sc. clavispora TRAPPE 1977= Sc. microcarpa IQBAL & BUSHRA 1980

§ G. constrictum TRAPPE 1977G. convolutum GERDEMANN & TRAPPE 1974G. corymbiforme BLASZKOWSKI 1995G. delhiense MUKERJI, BHATTACHARJEE & TEWARI 1983G. deserticola TRAPPE, BLOSS & MENGE 1984G. diaphanum MORTON & WALKER 1984

§ G. dimorphicum BOYETCHKO & TEWARI 1986G. dominikii BLASZKOWSKI 1988G. eburneum KENNEDY, STUTZ & MORTON 1999G. flavisporum (LANGE & LUND) TRAPPE & GERDEMANN 1964G. formosanum WU & CHEN 1986G. fragile (BERK. & BROOME) TRAPPE & GERDEMANN 1974G. fuegianum (SPEGAZZINI) TRAPPE & GERDEMANN 1922G. fulvum (BERK. & BROOME) TRAPPE & GERDEMANN 1922G. gibbosum BLASZKOWSKI 1997G. globiferum KOSKE & WALKER 1986G. glomerulatum SIEVERDING 1987(G. hadleyi ined.)G. halonatum ROSE & TRAPPE 1980 (G. halon, G. halonatus)G. heterosporum SMITH & SCHENCK 1985

7 Anhang 117

§ G. hoi Berch & TRAPPE 1985(G. hyalinum ined.)G. invermaium HALL 1977 (G. invermayanum)G. laccatum BLASZKOWSKI

G. lacteum ROSE & TRAPPE 1980G. liquidambaris (WU & CHEN) ALMEIDA & SCHENCK 1990= Sc. cunninghamia HU 1988= Sc. liquidambaris WU & CHEN 1987G. macrocarpum TULASNE & TULASNE 1845G. magnicaule HALL 1977G. melanosporum GERDEMANN & TRAPPE 1974G. microcarpum TULASNE & TULASNE 1845 => TypusartG. minutum BLASZKOWSKI, TADYCH & MADAJ 2000(G. mirificum ined.)

§ G. monosporum GERDEMANN & TRAPPE 1974G. mortonii BENTIVENGA & HETRICK 1991G. multicaule GERDEMANN & BAKSHI 1976G. multiforum TADYCH & BLASZKOWSKI 1997G. nanolumen KOSKE & GEMMA 1989G. pallidum HALL 1977G. pansihalos BERCH & KOSKE 1986G. przelewicensis BLASZKOWSKI 1988 = G. albidum?G. pubescens (SACCARDO & ELLIS) TRAPPE & GERDEMANN 1974G. pulvinatum (HENNINGS) TRAPPE & GERDEMANN 1975G. pustulatum KOSKE, FRIESE, WALKER & DALPÉ 1986G. radiatum (THAXTER) TRAPPE & GERDEMANN 1974G. reticulatum BHATTACHARJEE & MUKERJI 1980G. rubiforme (GERDEMANN & TRAPPE) ALMEIDA & SCHENCK 1990= Sc. indica BHATTACHARJEE & MUKERJI 1980= Sc. pachycaulis WU & CHEN 1986= Sc. rubiformis GERDEMANN & TRAPPE 1974G. scintillans ROSE & TRAPPE 1980G. segmentatum TRAPPE, SPOONER & IVORY 1979G. sterilum MEHROTRA & BAIJAL

G. taiwananse (WU & CHEN) ALMEIDA & SCHENCK 1990= Sc. taiwanensis WU & CHEN 1987G. tenebrosum (THAXTER) BERCH 1983G. tenerum TANDY emend. MCGEE 1986G. tenue (GREENHALL) HALL 1977G. tortuosum SCHENCK & SMITH 1982G. trimurales KOSKE & HALVORSON 1989G. tubiforme TANDY 1975 (G. tubaeforme)G. warcupii MCGEE 1986

(Gattung Sclerocystis Berkeley & Broome 1873) s. Glomus

7 Anhang 118

ORDNUNG DIVERSISPORALES WALKER & SCHÜßLER 2001

Familie Acaulosporaceae MORTON & BENNY 1990

Gattung Acaulospora (GERDEMANN & TRAPPE) emend. BERCH 1985

A. bireticulata ROTHWELL & TRAPPE 1979A. capsicula BLASZKOWSKI 1991A. cavernata BLASZKOWSKI 1989

§ A. colossica SCHULTZ, BEVER & MORTON 1999A. delicata WALKER, PFEIFFER & BLOSS 1986

§ A. denticulata SIEVERDING & TORO 1987A. dilatata MORTON 1986A. elegans TRAPPE & GERDEMANN 1974A. excavata INGLEBY & WALKER 1994A. foveata TRAPPE & JANOS 1982A. gedanensis BLASZKOWSKI 1988 (A. gdanskensis)

§ A. koskei BLASZKOWSKI 1995§ A. lacunosa MORTON 1986§ A. laevis GERDEMANN & TRAPPE 1974§ A. longula SPAIN & SCHENCK 1984 = A. morrowiae?§ A. mellea SPAIN & SCHENCK 1984§ A. morrowiae SPAIN & SCHENCK 1984

A. myriocarpa SPAIN, SIEVERDING & SCHENCK 1986A. nicolsonii WALKER, REED & SANDERS 1984A. paulineae BLASZKOWSKI Jahr?A. polonica BLASZKOWSKI 1988A. rehmii SIEVERDING & TORO 1987

§ A. rugosa MORTON 1986 = A. morrowiae?§ A. scrobiculata TRAPPE 1977§ A. spinosa WALKER & TRAPPE 1981

A. splendida SIEVERDING, CHAVERRI & ROJAS 1988A. sporocarpia BERCH 1985 (A. sporocarpa)A. taiwania HU 1988A. thomii BLASZKOWSKI 1988

§ A. tuberculata JANOS & TRAPPE 1982A. undulata SIEVERDING 1988A. walkeri KRAMADIBRATA & HEDGER 1990

Gattung Entrophospora AMES & SCHNEIDER 1979

E. baltica BLASZKOWSKI & TADYCH 1998§ E. colombiana SPAIN & SCHENCK 1984§ (E. contigua ined.)§ E. infrequens (HALL) AMES & SCHNEIDER 1979

E. kentinensis WU & LIU 1995E. schenckii SIEVERDING & TORO 1987

Familie Gigasporaceae MORTON & BENNY 1990

Gattung Gigaspora (GERDEMANN & TRAPPE) WALKER & SANDERS 1986

§ Gi. albida SCHENCK & SMITH 1982

7 Anhang 119

§ Gi. decipiens HALL & ABBOTT 1984§ Gi. gigantea (NICOLSON & GERDEMANN) GERDEMANN & TRAPPE 1974§ Gi. margarita BECKER & HALL 1976

= Gi. ramisporophora SPAIN, SIEVERDING & SCHENCK 1989§ Gi. rosea NICOLSON & SCHENCK 1979

= Gi. candida BHATTACHARJEE, MUKERJI, TEWARII & SKOROPAD 1982

Gattung Scutellospora WALKER & SANDERS 1986

S. alborosea (FERRER & HERRERA) WALKER & SANDERS 1980S. arenicola KOSKE & HALVORSON 1989S. armeniaca BLASZKOWSKI 1992

§ S. aurigloba (HALL) WALKER & SANDERS 1977 (S. auriglobosa)S. biornata SPAIN, SIEVERDING & TORO 1989

§ S. calospora (NICOLSON & GERDEMANN) WALKER & SANDERS 1986§ S. castanea WALKER 1993 = S. persica?§ S. cerradensis SPAIN & MIRANDA 1997§ S. coralloidea (TRAPPE, GERDEM. & HO) WALKER & SANDERS 1985 (S. coralloides)

S. crenulata HERRERA-PERAZA, CUENCA & WALKER 2001§ S. dipapillosa (WALKER & KOSKE) WALKER & SANDERS 1985§ S. dipurpurascens MORTON & KOSKE 1988§ S. erythropa (KOSKE & WALKER) WALKER & SANDERS 1984§ S. fulgida KOSKE & WALKER 1986§ S. gilmorei (TRAPPE & HERD.) WALKER & SANDERS 1974

S. gregaria (SCHENCK & NICOLSON) WALKER & SANDERS 1985S. hawaiiensis KOSKE & GEMMA 1995

§ S. heterogama (NICOLSON & GERDEMANN) WALKER & SANDERS 1985S. minuta (FERRER & HERRERA) WALKER & SANDERS 1980S. nigra (REDHEAD) WALKER & SANDERS 1979

§ S. nodosa BLASZKOWSKI 1991§ S. pellucida (NICOLSON & SCHENCK) WALKER & SANDERS 1986§ S. persica (KOSKE & WALKER) WALKER & SANDERS 1985

= Gi. tuberculata NEERAJ, MUKERJI, SHARMA & VARMA 1993§ S. projecturata KRAMADIBRATA & WALKER 2000

S. reticulata (KOSKE, MILLER & WALKER) WALKER & SANDERS 1983S. rubra STÜRMER & MORTON 1999S. savannicola (FERRER & HERRERA) Walker & Sanders 1980S. scutata WALKER & DIEDERICHS 1989S. spinosissima WALKER, CUENCA & SANCHEZ 1998S. tricalypta (HERRERA & FERRER) WALKER & SANDERS 1980S. verrucosa (KOSKE & WALKER) WALKER & SANDERS 1985S. weresubiae KOSKE & WALKER 1986

Familie Diversisporaceae fam. ined.

§ G. etunicatum BECKER & GERDEMANN 1977 (oder Glomus GlGrB?)§ G. spurcum (PFEIFFER, WALKER & BLOSS 1996) KENNEDY, STUTZ & MORTON 1999§ G. versiforme (KARSTEN) BERCH 1983

= G. epigaeum DANIELS & TRAPPE 1979

7 Anhang 120

ORDNUNG ARCHAEOSPORALES WALKER & SCHÜßLER 2001

Familie Archaeosporaceae MORTON & REDECKER 2001

Gattung Archaeospora MORTON & REDECKER 2001

§ Ar. gerdemannii (ROSE, DANIELS & TRAPPE) MORTON & REDECKER 2001= G. gerdemannii ROSE, DANIELS & TRAPPE 1979

§ Ar. leptoticha (SCHENCK & SMITH) MORTON & REDECKER 2001= A. appendicula SPAIN, SIEVERDING & SCHENCK 1984= A. gerdemannii NICOLSON & SCHENCK 1979= G. fecundisporum SCHENCK & SMITH 1982= G. leptotichum SCHENCK & SMITH 1982

§ Ar. trappei (AMES & LINDERMAN) MORTON & REDECKER 2001= A. trappei AMES & LINDERMAN 1976

Familie Geosiphonaceae

Gattung Geosiphon (KÜTZ.) V. WETTSTEIN 1915

§ Geo. pyriforme (KÜTZ.) V. WETTSTEIN 1915

ORDNUNG PARAGLOMERALES WALKER & SCHÜßLER 2001

Familie Paraglomeraceae MORTON & REDECKER 2001

Gattung Paraglomus MORTON & REDECKER 2001

§ P. brasilianum (SPAIN & MIRANDA) MORTON & REDECKER 2001= G. brasilianum SPAIN & MIRANDA 1996

§ P. occultum (WALKER) MORTON & REDECKER 2001= G. occultum WALKER 1982

B. Neubeschreibung von Arten

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Abb. 50: Zahl der neu beschriebenen AMF-Arten seit 1974.

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Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hock für die Überlassung des Themas und die

fachliche Unterstützung während meiner Arbeit an seinem Lehrstuhl.

Herrn Dr. Böhm möchte ich besonders für die von ihm geleistete Vorarbeit auf diesem Ge-

biet, die Überlassung von Pilzmaterial und seine konstruktive Kritik danken.

Für die gute Zusammenarbeit am Lehrstuhl für Zellbiologie bedanke ich mich bei allen übri-

gen Mitarbeitern, insbesondere bei Frau Dr. Lux-Endrich (Mykorrhiza) und Frau Rothe

(Computer-Problemchen). Ganz besonderer Dank gilt auch Frau Scholz, die sich überaus

kompetent um „den Papierkram“ sorgte.

Im Rahmen des F.A.M. möchte ich mich für die Kooperation bei Herrn Prof. Dr. Munch,

Herrn PD Dr. Schröder (F.A.M.-Leitung), Herrn Prof. Schnyder, Frau Dr. Huber-Sannwald

(Mykorrhiza), Herrn Dr. Schloter (TGGE) und Herrn Dr. Lebuhn (Gaeumannomyces) bedan-

ken.

Für ihre Ideen und Ratschläge rund um das Problem der DNA-Extraktion danke ich Herrn PD

Dr. Weller und Frau Dr. Römmelt, sowie Frau Dr. Boronowski (QIAGEN), die mit mir ge-

duldig zahlreiche Varianten am Telefon besprochen hat.

Mein besonderer Dank gilt meiner Familie, die jederzeit zu mir gestanden hat und meinen

Freunden, die von mir vernachlässigt wurden.

Bei Steffi bedanke ich mich für ihre Unterstützung und ihre Geduld mit mir.

Bei Herrn Aldinger, der leider viel zu früh von uns gegangen ist, möchte mich dafür bedan-

ken, dass es ihm nicht gelungen ist, mir von meinem Studium abzuraten.

Ich danke dem Bundesministerium für Forschung und Bildung für die finanzielle Förderung

des Projekts.

122

Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Holger Geue

Geburtsdatum: 24. Juli 1972

Geburtsort: Augsburg

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulausbildung:

1979 – 1983 Wittelsbacher Grundschule in Augsburg

1983 – 1992 Holbein-Gymnasium in Augsburg

(Abschluß: Allgemeine Hochschulreife)

Buchpreis des Fonds der Chemischen Industrie

Hochschulstudium:

Okt. 1993 – Jun. 1998 Studium der Lebensmittelchemie an der Ludwig-Maximilians-

Universität in München

(Abschluß: Lebensmittelchemiker, 1. Staatsexamen)

Praktische Tätigkeiten:

Jul. 1992 – Sep. 1993 Wehrdienst als Sanitäts- und Stabsdienstsoldat beim

SanLehrBtl. 851 in München

Nov. 1996 - Dez. 1996 Wissenschaftliche Hilfskraft am Lehrstuhl für Lebensmittel-

chemie der Ludwig-Maximilians-Universität in München

Jul. 1998 - Jan. 1999 Wissenschaftlicher Angestellter am Lehrstuhl für Pharmazeuti-

sche Biologie der Ludwig-Maximilians-Universität in München

seit Feb. 1999 Wissenschaftlicher Angestellter am Lehrstuhl für Zellbiologie

der TU München in Freising-Weihenstephan

Von Februar 1999 bis April 2002 wurde die vorliegende Dissertation angefertigt.

Molekularbiologische Untersuchungen zum Nachweis ... · 4.5 Quantifizierung mit der TaqMan®...

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