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Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluss von Entzündungsmediatoren und

elektromagnetischen Feldern auf tight junction Komponenten der Blut-Hirn-Schranke

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl für Neuroanatomie und

Molekulare Hirnforschung

vorgelegt von

Kerstin Ladage

aus

Essen

Bochum

November, 2006

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Dermietzel 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Lübbert

Inhaltsverzeichnis

II

Inhaltsverzeichnis Seite

1. Einleitung........................................................................................................1 1.1 Blut-Hirn Schranke...................................................................................1

1.1.1 Die Endothelzellen.............................................................................2 1.1.2 Die Perizyten .....................................................................................5 1.1.3 Astrozyten..........................................................................................7 1.1.4 Aufbau der tight junction ....................................................................8

1.2 Die Blut-Hirn-Schranke unter pathophysiologischen Bedingungen........10 1.2.1 Die Wirkung von Zytokinen auf die Blut-Hirn-Schranke ...................11 1.2.2 Die Leukozyten-Endothel-Adhäsions-Kaskade................................12

1.3 Die Wirkung von elektromagnetischen Feldern auf die BHS .................13 1.4 Zielsetzung ............................................................................................16

2. Material und Methoden ................................................................................17 2.1 Material ..................................................................................................17

2.1.1 Zellkulturmedien ..............................................................................17 2.1.2 Verwendete Puffer und Lösungen ...................................................17 2.1.3 Verwendete Chemikalien.................................................................18 2.1.4 Geräte..............................................................................................19

2.2 Methoden...............................................................................................21 2.2.1 Arbeitsmethoden der Zellkultur (in vitro–Versuche) .........................21 2.2.2 Gefäßisolation mittels Nylonsieben (Ex vivo-Versuche) ..................23 2.2.3 In–vivo-Versuche: Lokale Exposition des Rattengehirns mit .............. elektromagnetischen Feldern (UMTS) in vivo..................................28 2.2.4 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ...........................................35 2.2.5 Histochemische Arbeitsmethoden ...................................................44 2.2.6 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden ...........................................46

3. Ergebnisse ....................................................................................................49 3.1 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf Endothelzellen der BHS 49

3.1.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der zerebralen Endothelzellen in vitro......................................................................49 3.1.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine der zerebralen .............. Endothelzellen in vitro......................................................................55

3.2 Darstellung der Proteinexpressionen.....................................................60 3.2.1 Western-Blots und Immunzytochemie zerebraler ............................... Endothelzellkulturen ........................................................................60

3.3 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf die Genexpression von tight-junction-Komponenten isolierter BHS-Mikrogefäße (ex vivo).........66

3.3.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der isolierter ....... BHS-Mikrogefäße (ex vivo)..............................................................66 3.3.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine isolierter Mikrogefäße (ex vivo) ...........................................................................................72

3.4 Ergebnisse zur lokalen Exposition von Rattengehirnen mit UMTS ........... Mikrowellen............................................................................................77

3.4.1 Ergebnisse der Vorversuche............................................................77 3.4.2 Ergebnisse der Hauptversuche........................................................85

Inhaltsverzeichnis

III

3.5 Expression von tight junction Genen in isolierten Gehirngefäße im elektromagnetischen Feld......................................................................91

3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse .......................................................97

4. Diskussion ....................................................................................................99 4.1 Expressionen von tight junction-Komponenten in Endothelzellkulturen

und BHS-Mikrogefäßen unter inflammatorischen Bedingungen ............99 4.2 Expressionsänderungen von tight junction-Genen isolierter BHS-

Mikrogefäße unter elektromagnetischer Befeldung .............................105 4.3 Der Einfluss von UMTS-Mikrowellen auf die Expression von tight

junction-Komponenten der BHS in vivo ...............................................107 4.3.1 Diskussion der Vorversuche (in vivo).............................................107 4.3.2 Diskussion der Hauptversuche ......................................................112

5. Zusammenfassung.....................................................................................116

6. Abkürzungsverzeichnis .............................................................................119

7. Literaturverzeichnis ...................................................................................121

8. Summary .....................................................................................................136

9. Beiträge zu Konferenzen ...........................................................................139

10. Danksagung................................................................................................141

11. Lebenslauf ..................................................................................................142

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Blut-Hirn Schranke Die Blut-Hirn Schranke ist für die Funktion und Regulation des spezifischen

Milieus im zentralen Nervensystem (ZNS) unerlässlich. Sie ermöglicht die Auf-

rechterhaltung der interstitiellen Homöostase und verhindert den Eintritt von

neurotoxischen Substanzen aus dem Blutkreislauf in das Gehirngewebe. Nur

durch Erhaltung dieses spezifischen Milieus im Gehirn ist eine ungestörte neu-

ronale Funktion möglich.

Veränderungen von Hormonkonzentrationen, des pH-Wertes, Schwankungen

von Ionen-, Aminosäure- und Protein-Konzentrationen treten ständig im Blut-

strom auf, dürfen aber die interstitielle Flüssigkeit des Gehirns nicht erfassen.

So würden Änderungen der Ionenkonzentration, insbesondere von Kalium, Nat-

rium und Calcium im extrazellulären Milieu des ZNS das Membranpotential der

Neurone und damit die elektrische Signalverarbeitung (Bradbury, 1993) beein-

flussen. Auch ein ungehindertes Übertreten von Neurotransmittern wie Seroto-

nin und Glutamat aus dem Blut ins Gehirngewebe würde die Signalverarbeitung

am synaptischen Spalt und somit die Kommunikation der Neurone untereinan-

der empfindlich stören (Abott, 1992).

Das Gehirn des Menschen ist zudem abhängig von einer konstanten Nähr- und

Sauerstoffversorgung und setzt mit nur ca. 2% des Körpergewichts rund 20%

der Gesamtenergie des Stoffwechsels um. Es bedarf daher einer hohen Durch-

blutung des ZNS um die Energieversorgung zu gewährleisten, gleichzeitig muss

der Stoffaustausch zwischen Blutmilieu und Gehirnparenchym selektiv und kon-

trolliert erfolgen.

Paul Ehrlich konnte bereits Ende des 19. Jahrhunderts zeigen, dass intravenös

injizierte Farbstoffe alle Organe mit Ausnahme des Gehirns anfärben (Ehrlich,

1885). Ein weiteres Experiment von Goldmann im Jahr 1913 belegte eindeutig,

dass eine Barriere zwischen Blut und Gehirn besteht. Er zeigte, dass nach

intraventrikulärer Injektion eines Farbstoffs eine Anfärbung des gesamten ZNS

erfolgte, jedoch kein peripheres Organ angefärbt wurde. Dies bestätigte auch

1. Einleitung 2

den früheren Befund von Lewandowsky (1900), der nachwies dass die Applika-

tion von Gallensäure in die Blutbahn harmlos ist, eine Injektion ins Gehirn je-

doch neurotoxische Wirkung zeigt. Lewandowsky führte zur Beschreibung die-

ses Phänomens den Begriff „Blut-Hirn-Schranke“ (BHS) ein.

Erst 1967 konnte geklärt werden, welche morphologische Struktur für die

Schrankenfunktion verantwortlich ist. Reese und Karnowsky (1967) zeigten mit

Hilfe der Elektronenmikroskopie, dass die Endothelzellen der Gehirnkapillaren

in die Blutbahn injizierte Meerrettichperoxidase zurückhielten. Heute weiß man,

dass das morphologische Korrelat der BHS nicht nur auf die Endothelzellen be-

schränkt ist, sondern zur funktionellen Einheit der BHS auch die umliegenden

Zellen und Strukturen wie Perizyten, Basalmembran und Astrozyten unerläss-

lich sind. Gewebe-Transplantationsstudien gaben Hinweise darauf, dass nicht

der Ursprung, sondern die Mikroumgebung der zerebralen Endothelzellen für

die Modulation und die Ausbildung ihrer speziellen BHS-Charakteristika wichtig

ist. Stewart und Wiley zeigten dazu im Jahr 1981, dass in das Gehirn transplan-

tiertes Darmgewebe von zerebralen Endothelzellen vaskularisiert wurde, die

neugebildeten Blutgefäße aber in ihrer geänderten Umgebung permeabel für

Farbstoffe (z.B. Trypanblau) waren. Andererseits wurde in den Darm transplan-

tiertes Gehirngewebe von Darm-Endothelzellen vaskularisiert und die gebilde-

ten Blutgefäße waren impermeabel für Farbstoffe.

1.1.1 Die Endothelzellen Die anatomische Grundlage der BHS bilden die Endothelzellen der Gehirnkapil-

laren. Im Gegensatz zu den Kapillaren vieler peripherer Organe sind die Endo-

thelzellen der zerebralen Kapillaren nicht fenestriert und durch die Ausbildung

von besonders dichten tight junctions zwischen benachbarten Endothelzellen,

sowie einer geringen Transzytoseaktivität dieser Zellen wird ein interzellulärer

Austausch von Stoffen aus dem Blutkompartiment in das Gehirngewebe ver-

hindert (Reese und Karnovsky, 1967; Dermietzel, 1975; Brightman, 1989; Kni-

esel und Wolburg, 2000).

Es gibt aber auch Moleküle wie Sauerstoff, Kohlendioxid, Alkohol, Nikotin und

Vitamine der B-Gruppe, die die Endothelzellschicht der Gehirnkapillaren unge-

1. Einleitung 3

hindert durch transzelluläre Diffusion überwinden können. Die Lipophilie und die

Größe von Molekülen sind entscheidende Kriterien für die passive Diffusion ü-

ber die Blut-Hirn Schrank (Abraham et al., 1994; Haabgood et al., 2000).

So können lipophile Stoffe, die kleiner als 600 Dalton (Da) sind, die Wand der

Endothelzellen passieren (Pardrige, 1993). Nach Überwinden der luminalen

Zellmembran müssen diese Stoffe das hydrophile Zytoplasma durchqueren,

bevor sie auf der abluminalen Seite über die Plasmamembran ins Gehirngewe-

be gelangen. Welche intrazellulären Vorgänge für die zytoplasmatische Passa-

ge verantwortlich sind, ist bislang noch ungeklärt. Ein Kriterium für die ZNS-

Gängigkeit eines Stoffes ist der sogenannte Octanol-Wasser Verteilungskoeffi-

zient. In zahlreichen Studien konnte eine mehr oder weniger gute Korrelation

zwischen dem Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten eines Moleküls als

Maß seiner Lipophilie und seiner ZNS-Gängigkeit festgestellt werden, (Levin,

1980; Pardrige, 1993; Lohmann et al., 2002).

Es gelangen jedoch nicht alle lipophilen Stoffe, die auf diese Weise das Zyto-

plasma der Endothelzellen erreichen, automatisch ins Hirngewebe. So ist z.B.

an der luminalen Endothelzellmembran der Gehirnkapillaren das P-Glykoprotein

(Pgp) lokalisiert. Dieses Protein wird als „drug-transporting“ Enzym bezeichnet.

Es transportiert lipophile körperfremde Stoffe, wie z.B. Medikamente oder orga-

nische Anionen, die durch die Zellmembran in das Cytoplasma der Endothelzel-

len gelangt sind, aktiv ins Blut zurück (Tsuji, 1992; Tatsuta, 1992). Das Pgp, ein

170 kDa großes Protein, gehört zu den „ATP-binding cassette (ABC)“-

Transportern (Higgings, 1992). Borst und Schinkel (1998) fanden im Gehirn von

Pgp-knockout Mäusen, im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen, eine Akkumulation

körperfremder Stoffe. In dem von ihnen beschriebenen Versuch wurden für das

ZNS schädliche Toxine wie Vinblastin, Ivermectin und Digoxin verwendet und

ihre Anreicherung im Gehirn untersucht. Die Konzentration dieser Substanzen

in den Gehirnen von Pgp-knockout-Mäusen lag um ein Vielfaches höher als bei

den Wildtyp-Mäusen. Dies zeigt, dass dem Pgp in zerebralen Gefäßen eine

schützende und entgiftende Funktion zukommt, indem schädliche Substanzen

vom Gehirn ferngehalten werden.

Ein therapeutischer Nachteil ist, dass durch den Pgp-Transporter die intraze-

rebrale Pharmakotherapie erheblich erschwert wird. Es sind aber bereits einige

1. Einleitung 4

Substanzen bekannt, die als Inhibitoren des Pgp wirken und somit Medikamen-

ten die Passage durch die cerebralen Endothelzellen ermöglichen (Fisher und

Sikic, 1995; Goldstein, 1995).

Hydrophile Substanzen wie z.B. die D-Glucose, welche eine Hauptenergiequel-

le des Hirnstoffwechsels darstellt (Bradbury, 1993), können nicht durch passive

Diffusion die Endothelzellschicht überwinden. Für hydrophile Nährstoffe, die

vom Blut ins Gehirngewebe, aber auch für Abfallstoffe, die aus dem Gehirnge-

webe ins Blut geschleust werden sollen, existieren Carrier-mediierte Transport-

systeme, sowohl an der luminalen als auch an der abluminalen Plasma-

membran. Die treibende Kraft dieser erleichterten Diffusion ist der Konzentrati-

onsgradient der Substanz, der auch für die Transportrichtung entscheidend ist.

Für den D-Glucose Transport an den cerebralen Endothelzellen sind bisher

zwei verschiedene Transport-Proteine identifiziert, die Glucosetransporter Glut1

und (Crone, 1965; Dick et al. 1984), Glut 3 (Uldry und Thorens, 2004). Glut 1 ist

der prominenteste Blut-Hirn-Schranken assozierte Glucosetransporter, er ist

stereospezifisch für D-Glucose und vermittelt den Transport vom Ort hoher

Konzentration, dem Blut, zum Ort niedriger Konzentration, dem Hirnparenchym.

Der Glukosetransporter ist ein integrales Membranprotein, welches als tetrame-

res Homo-Oligomer, mit einer katalytischen Bindungsstelle pro Untereinheit vor-

liegt (Coderre et al., 1995).

Für die Versorgung des Gehirns mit Aminosäuren zur Synthese von Proteinen

und Neurotransmittern sind fünf verschiedene Transportsysteme an den ce-

rebralen Endothelzellen bekannt. Das wichtigste ist das L (Leucin)-System

(LNAA large neutral amino-acid System) (Oldendorf und Szabo, 1976), welches

große, neutrale und aromatische, essentielle Aminosäuren wie z.B. Phenylala-

nin transportiert (Audus und Borchart, 1987).

Weitere wichtige an den cerebralen Kapillaren nachgewiesene Proteine sind die

γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTP), ein Enzym welches auch als Aminosäure-

Carrier fungiert (Orlowski et al.,1974), die Alkalische Phosphatase (Wislocki und

Leduc, 1952), die Butyryl-Cholinesterase (Joo und Csillik, 1966) und der Trans-

ferrin-Rezeptor (Jefferies et al., 1984).

Zur Aufrechterhaltung der Ionenkonzentration von Natrium- und Kalium-Ionen

im Gehirn existiert in der abluminalen Endothelzellmembran die Natrium-

1. Einleitung 5

Kalium-ATPase. Sie pumpt unter Energieverbrauch die Natriumionen aus dem

Cytosol ins Gehirn und Kaliumionen aus dem Gehirn ins Cytosol. Dabei ent-

steht ein Natriumgradient der von einem anderen Aminosäuretransportersys-

tem, dem so genannten A-System genutzt wird um kleine, neutrale Aminosäu-

ren aus dem Gehirn ins Blut zu transportieren (Goldstein und Betz, 1986;

Vorbrodt et al., 1982)

Die hier beschriebene Schrankenfunktion der zerebralen Endothelzellen wird

unterstützt durch zwei weitere wichtige Zellkomponenten, Perizyten und Astro-

zyten.

1.1.2 Die Perizyten Perizyten sind perivaskuläre Zellen mesenchymaler Herkunft, die die Endothe-

lien von Kapillaren und postkapillären Venolen der Blut-Hirn-Schranke umklei-

den. Sie sind gemeinsam mit den Endothelzellen von einer Basalmembran um-

geben. Die Basalmembran besteht aus Kollagen IV, Laminin, Fibronectin und

Proteoglykanen (Farkas und Luiten, 2001) und stellt gleichfalls eine Barrier ge-

gen geladene Moleküle dar. Perizyten kommen nicht nur an Gehirnkapillaren

vor, sondern sind auch an peripheren Mikrogefäßen assoziiert.

Die Expression von kontraktilen Proteinen in den Perizyten (Joyce et al., 1984,

1985a und b; Herman und D` Amore, 1985) führte zu der Vermutung, dass die

Perizyten an der Regulation des kapillären Blutstroms beteiligt sind (Tilton et al.,

1979). Diese Vermutung konnte jedoch bis heute durch verschiedene experi-

mentelle Studien nicht bestätigt werden (Sims, 1986; Diaz-Flores et al., 1991;

Tilton, 1991).

Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Interaktion und Abhängigkeit zwi-

schen Perizyten und Endothelzellen besteht. In vivo haben Perizyten z.B. die

Fähigkeit, durch die Ausschüttung vom „Transforming Growth Factor type β“

(TGFβ), die Proliferation von Endothelzellen zu inhibieren (Wakui et al., 1997)

Ein zellulärer Kontakt zwischen Endothelzellen und Perizyten wird durch Aus-

stülpungen der Perizyten, den so genannten „peg and socket“-Kontakten her-

gestellt (Matsusaka, 1975; Leeson, 1979; Tilton et al., 1979a, b; Wakui et al.,

1989), deren Anzahl und Größe abhängig vom Gewebetyp sind. An den be-

1. Einleitung 6

schriebenen Kontakten fehlt die Basalmembran zwischen Endothelzellen und

Perizyten.

An den Mikrogefäßen des Gehirn konnten Frey et al. (1991) die Anwesenheit

von γ-Glutamyl-Transpeptidase (γGTP) in Endothelzellen und Perizyten in vivo

und in vitro nachweisen. Dies lässt darauf schließen, dass die Perizyten an der

enzymatischen Funktion der Blut-Hirn-Schranke beteiligt sind (Allat and Law-

renson, 2001). γGTP ist ein heterodimeres Glykoprotein, welches an der extra-

zytoplasmatischen Zelloberfläche lokalisiert ist. Die γGTP ist auf die cerebralen

Gefäße mit BHS-Eigenschaften beschränkt. In den zircumventrikulären Orga-

nen in denen die BHS aufgehoben ist, z.B. der Eminentia media, ist die γGTP

nicht nachweisbar (Allt and Lawrenson, 2001).

Ein weiteres perizytenassoziertes Enzym der BHS wurde im Jahr 1988 von

Krause et al. beschrieben. Hierbei handelt es sich um das Enzym Aminoeptida-

se N. Zur Funktion dieses Enzyms wird vermutet, dass es innerhalb der BHS

funktionell an der Degradierung von Polypeptiden, einschließlich bioaktiver Pep-

tide mit vasoaktiven Fähigkeiten (Kenny und Turner, 1987) und an der Modifika-

tion von Neuropeptiden beteiligt ist. Kunz et al. (1995) konnten zeigen, dass bei

der „experimentellen allergischen Enzephalitis“ (EAE) die Expression dieser pe-

rizytären Aminopeptidase N (pAPN) herunterreguliert ist. Dies geht gleichzeitig

einher mit der vorübergehenden und fokalen Störung der BHS. Diese Herunter-

regulierung der pAPN könnte die Entzündungsantwort der EAE verstärken, in-

dem einige Neuropeptide wie Substanz P, welche auch als Entzündungsmedia-

toren wirken, nicht degradiert werden (Allt und Lawrenson, 2001).

Eine weitere wichtige Kontrollfunktion der Perizyten ist die Eliminierung fremder

im Gehirn befindlicher Stoffe durch Phagozytose (Cancilla et al., 1972; Baker et

al., 1971; Sumner, 1982; Tobrack, 1961).

Hellström et al. (2001) benutzten knock-out Mäuse, denen der „platelet derived

growth factor-β“ (PDGF-β) und der PDGF β-Rezeptor (PDGFR-β) fehlten, als in

vivo Angiogenese-Modell im Gehirn. Sie konnten zeigen, dass die Mikrogefäße

in den Gehirnen der knock-out Tiere eine normale Dichte, Länge und Anzahl an

Verzweigungsstellen aufwiesen. Allerdings fehlten diesen Mikrogefäßen die Pe-

rizyten und sie zeigten, einen vergrösserten Kapillardurchmesser, eine gestei-

gerte Permeabilität und endotheliale Hyperplasie. Dieses Ergebnis deutet dar-

1. Einleitung 7

auf hin, dass die Perizyten auch eine wichtige Rolle bei der Morphogenese der

cerebralen Mikrogefäße spielen.

Auch in der Pathologie der Blut-Retina-Schranke wird den Perizyten eine immer

wichtigere Rolle zugeschrieben. Cogan und Kuwabara haben schon im Jahr

1967 gezeigt, dass im Auge von Diabetikern ein selektiver Verlust an Perizyten

zu beobachten ist. So ist die „vasoproliferative diabetische Retinopathie“ durch

einen frühen Verlust von Perizyten, dem so genannten „pericyte drop-out“, ge-

kennzeichnet (Cogan et al., 1961; Tilton, 1991; Hirschi und D´Amore, 1996).

1.1.3 Astrozyten Astrozyten sind im menschlichen Gehirn der häufigste Gliazelltyp mit 80% der

Gesamtanzahl an Zellen (Kettenmann und Ransom, 2004). Ihre Fortsätze mit

breiten Endfüßchen umschließen die zerebralen Blutgefäße fast vollständig

(Kacem et al. 1998), wobei ihnen vor allem eine Stützfunktion und der mechani-

sche Schutz der cerebralen Kapillaren zugeschrieben wird. Charakteristisch ist

ihr hoher Gehalt an „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) eine Zytoskelettkom-

ponente (White et al., 1981).

Zwischen den Endothelzellen der Hirnkapillaren und den Astrozytenendfüßchen

sind Zellkontakte, welche für die Differenzierung der Endothelzellen und die

Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke Eigenschaften mitverantwortlich sind

(Janzer und Raff, 1987; Risau und Wolburg, 1990). Diese Eigenschaften der

Astrozyten wurden auch anhand von in vitro Modellen der BHS beschrieben.

Hier wurde erkannt, dass eine alleinige Kultivierung von „brain capillary endo-

thelial cells (BCEC)“ ohne Astrozyten bzw. ohne Astrozyten konditioniertes Me-

dium den Verlust von BHS spezifischen Marker-Enzymen wie z.B. der Alkaline-

Phosphatase (ALP) oder der γ-Glutamyl-Transpeptidase zur Folge hat (Meyer

et al., 1990). Andererseits können Astrozyten auch in nicht zerebralen Endo-

thelzellen eine Hochregulierung von BHS-Marker-Enzymen und eine Ausbil-

dung von tight junction induzieren (Hurst and Fritz, 1996; Kuchler-Bopp et al.,

1999).

An astrozytären Endfüßchen wurde außerdem eine hohe Dichte an orthogonal

angeordneten Partikeln (orthogonal arrays of particels (OAPs)) nachgewiesen

(Dermietzel und Leibstein, 1978). Von den OAPs weiß man heute, dass sie den

1. Einleitung 8

Wasserkanal Aquaporin 4 und den Kaliumkanal Kir.4.1. enthalten. Die Polarität

der orthogonalen Anordnung der Partikel stimmt mit der Expression von Agrin

auf der Basallamina überein (Wolburg und Lippoldt, 2002). Durch die Veranke-

rung der in den astrozytären Endfüßchen vorliegenden OAPs mit Agrin der Ba-

salmambran, wird zwischen Astrozyten und Endothelzellen eine Vermittlung

hergestellt.

1.1.4 Aufbau der tight junction Zur Abschirmung des Gehirngewebes gegenüber dem Blutkompartiment stellen

die tight junctions der zerebralen Endothelzellen essentielle Strukturen dar, die

als physikalische Barriere die parazelluläre Diffusion von Ionen, Peptiden und

Immunzellen aus dem Blut ins Gehirngewebe verhindern (Anderson et al.,

1995; Tsukita et al., 1998). Außerdem verhindern die tight junctions einen Aus-

tausch von Membranbestandteilen zwischen apikaler und basaler Membransei-

te und schaffen bzw. erhalten so die polare Organisation der Zytoplasma-

membran der Endothelzellen (Heiskala et al., 2001).

Molekularbiologische Untersuchungen zeigten, dass an dem Aufbau der tight

junctions verschiedene Membranproteine und nicht-Membranproteine beteiligt

sind. Es wurden drei Typen von integralen Transmembranproteinen gefunden:

JAMs (junctional adhesion molecules), Occludine und Claudine (Heiskala,

2001). Diese transmembranären Komponenten der tight junctions sind eng mit

den intrazytoplasmatisch lokalisierten Proteinen ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF-6, 7H6,

Cingulin und Symplekin assoziert (Muto et al., 2000). Die Interaktionen zwi-

schen den transmembranären und den intrazellulären Proteinen mit Verbindung

zum Zytoskelett der Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Organisation und

funktionellen Regulation der tight junctions (Heiskala, 2001) (siehe Abb.1). Alle

zonula-occludens (ZO-) Proteine weisen Bindungsstellen für Aktin, dem Haupt-

protein des Zytoskeletts, auf (Itoh et al., 1999).

1. Einleitung 9

Abb. 1: Darstellung der Interaktion von integralen und zytoplasmatischen Komponen-

ten der tight junction Proteine (graphische Darstellung von Dipl. Biol. Helga Schulze)

Im Nachfolgenden werden die genannaten BHS Komponenten kurz näher er-

läutert.

Das Protein JAM ist ein Mitglied der Immunglobulin–Superfamilie und ist ent-

scheidend an der transendothelialen Migration (TEM) von Leukozyten beteiligt

(Martin-Padura et al. 1998).

Claudine werden als Proteinfamilie zusammengefasst, von der bis heute 24 ver-

schiedene Isoformen in Säugern bekannt sind (Bauer et al., 2004). Alle Proteine

dieser Familie weisen wie das tight junction-Protein Occludin vier Trans-

membrandomänen auf, wobei N- und C-Termini im Zytoplasma lokalisiert sind

(Morita et al., 1999) (siehe Abb. 2), Claudine und Occludin zeigen jedoch keine

Aminosäuresequenz-Homologien (Furuse et al. 1998a). Innerhalb der Claudin-

Familie findet man eine ausgeprägte Aminosäurekonservierung am ersten und

vierten transmembranen Segment und an beiden extrazellulären Schleifen.

1. Einleitung 10

Abb. 2: Schematische Darstellung der Proteindomänen von Occludin im Vergleich zur

Claudin-Familie.

Die Claudine scheinen für die Modulation der tight junction-Funktion eine zen-

trale Rolle zu spielen (Heiskala et al., 2001; Huber et al., 2001). An den zereb-

ralen Endothelzellen mit BHS-Eigenschaften sind bisher fünf Claudine (Claudin-

1, Claudin-3, Claudin-5, Claudin-11 und Claudin-12) gefunden worden, wobei

Claudin-5 das prominenteste und am meisten untersuchte Claudin der BHS ist

(Nitta et al., 2003).

Die molekularen Mechanismen, die zur Etablierung und Aufrechterhaltung der

tight junctions als Permeabilitätsbarriere der Blut-Hirn-Schranke führen, sind

jedoch noch weitgehend unbekannt. Es ist denkbar, dass die Dichtheit und die

Funktion der tight junction durch endogene (z.B. Wachstumsfaktoren) und /

oder exogene Faktoren (chemische / physikalische) moduliert wird.

1.2 Die Blut-Hirn-Schranke unter pathophysiologi-schen Bedingungen

Fehlfunktionen der BHS spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und

dem Verlauf von Erkrankungen des ZNS. So ist bei ischämischen Läsionen (Il-

zecka, 1996) und traumatischen Hirnverletzungen (Morganti-Kossmann et al.,

2002) eine erhöhte Permeabilität der BHS zu beobachten. Schlaganfälle führen

1. Einleitung 11

häufig zu hämorrhagischen Komplikationen (Hamann et al., 1995) mit der Ent-

wicklung eines Hirnödems durch den Eintritt von Proteinen, Salzen und Wasser

aus dem Blut ins Gehirngewebe.

Bei entzündlichen Krankheitsbildern handelt es sich um komplexe Ereignisse,

wie bei der Multiplen Sklerose (MS) (de Vries und Dijkstra, 2004). Hier ist der

Zusammenbruch der BHS ein beschleunigender Faktor für den Verlauf der Er-

krankung. In experimentellen Modellen der MS wird der Zusammenbruch der

BHS durch T-Zellen (Seeldrayers et al., 1993) und Monozyten (Morrissey et al.,

1996) induziert. Läsionen durch die MS gehen einher mit einem Verlust der tight

junction Proteine Occludin und ZO-1 (Bolton et al., 1998; McQuaid et al., 2002;

Kirk et al., 2003) an den zerebralen Mikrogefäßen, der wahrscheinlich durch

inflamatorisch wirkende Zytokine mediiert wird. In einigen Fällen ist der Zu-

sammenhang zwischen Fehlfunktion der BHS und Erkrankung nicht bekannt,

wie z.B. bei der Alzheimer Erkrankung (Wardlaw et al., 2003), jedoch können

auch hier Entzündungsmechanismen durch Aktivierung von Mikroglia ange-

nommen werden (Minagae et al., 2002; Faustmann und Haase, 2006)

1.2.1 Die Wirkung von Zytokinen auf die Blut-Hirn-Schranke Bei den Zytokinen handelt es sich um eine Gruppe parakrin und autokrin regu-

latorisch wirkender Glykoproteine, die eine komplexe Signalkaskade initiieren.

Sie sind sowohl bei der Regulation physiologischer Prozesse der BHS, wie z.B.

Entwicklung und Differenzierung, als auch an pathophysiologischen Prozessen

an der BHS beteiligt.

Sowohl funktionelle als auch phänotypische Veränderungen des Endothels wer-

den dabei von den Zytokinen induziert (Augustin et al., 1994). Proinflammatori-

sche Zytokine, dazu zählen Interferon-γ (IFN-γ), Interferon-β (IFN-β), Tumor-

Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Interleukin-1 (IL-1) können die zerebralen Endo-

thelzellen in einen aktivierten Zustand versetzen (Pober und Cortan 1990).

Im Gehirn erfolgt die lokale Freisetzung der Zytokine von den Zellen des vasku-

lären Systems, von benachbarten nicht vaskulären Zellen des Gehirnparen-

chyms oder durch Leukozyten direkt (Benveniste 1992).

Für die Pathophysiologie der BHS spielt vor allem die lokale Freisetzung von

Zytokinen durch Zellen des Immunsystems eine Rolle. Durch die Ausschüttung

1. Einleitung 12

von proinflammatorischen Zytokinen durch die Leukozyten im Blut wird die Ex-

pression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Endothelzellen ge-

steuert. Die Adhäsionsmoleküle können in drei Superfamilien unterteilt werden,

die Selektine, die Immunglobuline und die Integrine. Diese Stoffe sind gemein-

sam für die Bindung von Leukozyten an die luminale Endothelzellwand und de-

ren Migration durch die BHS bei Entzündungsprozessen verantwortlich.

1.2.2 Die Leukozyten-Endothel-Adhäsions-Kaskade Durch proinflammatorische Zytokine wird die Expression von Adhäsionsmolekü-

len auf der luminalen Oberfläche des zerebralen Endothels bewirkt.

Zusätzlich werden Liganden auf der Oberfläche von Leukozyten exprimiert, die

die Adhäsion dieser Zellen an die Blutgefäßwand der zerebralen Mikrogefäße

erleichtert und deren Migration durch das Endothel fördert (Bevilacqua, 1993;

McCarron et al., 1993). Diesen komplexen Vorgang kann man systematisch in 4

Schritte gliedern (Springer, 1995)

Die erste initiale Phase der Adhäsionskaskade (Buchter, 1991; McEver, et

al.,1995; Quagliarello und Scheld, 1992), das Leukozyten-Rolling, wird vermit-

telt durch P- und L-Selektine. Dabei binden die Leukozyten reversibel an das

Endothel und „rollen“ mit geringer Geschwindigkeit an der Gefäßwand entlang.

Die P-Selektine werden auf den Endothelzellen und die L-Selektine auf den

Leukozyten exprimiert. P-Selektine werden im Ruhezustand in sekretorischen

Granula nahe der Endothelzellmembran gespeichert und bei Aktivierung der

Zellen durch Mediatoren einer akuten Entzündungreaktion (z.B. Thrombin oder

Histamin) sehr schnell auf der Oberfläche der Endothelzellen verteilt. Die in-

flammatorischen Mediatoren erhöhen gleichzeitig die Synthese der P-Selektine.

Die Selektine reagieren mit Oligosacchariden auf der Oberfläche der Leukozy-

ten bzw. Endothelzellen (Nelson et al., 1993). Durch das „Rolling“ verändert

sich gleichzeitig die Morphologie der Leukozyten.

Die zweite Phase bezeichnet man als Aktivierungsphase. In dieser Phase kom-

men die Leukozyten in so engen Kontakt mit den Endothelzellen, dass die von

den Endothelzellen exprimierten Chemokine an die leukozytären Rezeptoren

binden können. Bei den Chemokinen handelt es sich um eine Gruppe kleiner

(Molekulargewicht: 6-14 kD), basischer Proteine (Olson und Ley, 2002).

1. Einleitung 13

Die dritte Phase wird als Adhäsionsphase bezeichnet und ist durch die feste

Anheftung der Leukozyten an die Endothelzellen gekennzeichnet. Dieser Vor-

gang wird durch Aktivierung von Adhäsionsmolekülen aus der Integrin-Familie

vermittelt. Integrine auf der Oberfläche von Leukozyten sind z.B. das „Lympho-

cyte Function associated Antigen-1“ (LFA-1) und die aktivierten CD11/CD18-

Integrine, die mit den Molekülen der Immunglobulin-Superfamilie z.B. interzellu-

läres Adhäsionsmolekül (ICAM)-1 oder ICAM-2 auf der Oberfläche der Endo-

thelzellen interagieren.

In der vierten Phase der transendothelialen Migration, auch Diapedese ge-

nannt, wandern die Leukozyten durch die Blutgefäßwand ins umliegende Pa-

renchym (Faustmann und Dermietzel, 1987; Dermietzel et al., 1999).

Diese Kaskadenreaktion wird durch aktivierte Makrophagen gefördert, die durch

Sezernierung von TNF-α und IL-1 die Bildung von Selektinen in den Endothel-

zellen weiter stimulieren.

1.3 Die Wirkung von elektromagnetischen Feldern auf die BHS

Durch die beschleunigte Verbreitung mobiler Kommunikationssysteme und ihre

vermehrte Nutzung in der Bevölkerung sind Bedenken aufgetreten, ob diese Art

der Kommunikationssysteme Gesundheitsrisiken bergen könnten. Insbesonde-

re der Kopf und damit das Gehirn sind beim Telefonieren mit dem Handy der

höchsten Strahlendosis ausgesetzt. Hier stellt sich die Frage, ob elektromagne-

tische Felder (EMF) unabhängig von thermischen Effekten, die Funktion der

BHS oder die Funktion von Zellen im ZNS beeinflussen können. Es sind schon

einige in vivo und in vitro Studien durchgeführt worden, die den Einfluss von

EMF auf die BHS untersuchten. Die Ergebnisse der Studien sind widersprüch-

lich.

Bei dem Vergleich der Studien ist zu beachten, dass Permeabitlitätserhöhungen

bzw. die Öffnung der BHS durch thermische oder nicht-thermische Effekte aus-

gelöst werden können. Schon Sutton und Carell konnten im Jahre 1979 zeigen,

dass bei Ratten eine Erwärmung des Gehirns auf 45°C durch ein 2450 MHz-

Feld zu einer gesteigerten Aufnahme von Proteinen ins Gehirn führte. Dieser

1. Einleitung 14

Effekt ist vergleichbar mit einem künstlich herbeigeführten Fieber, welches auch

zu einer reversiblen Öffnung der BHS führen kann. Einige der durchgeführten

Studien (Goldman et al., 1984; Moriyama et al.,1991) konnten den thermischen

Effekt von 2450 MHz-Feldern, den Sutton und Carell gezeigt hatten, und die

damit verbundene Permeabilitätserhöhung der BHS bestätigen.

Bei den im Folgenden aufgeführten Studien wird der Begriff SAR eingeführt.

SAR steht für "Spezifische Absorptionsrate". Der SAR-Wert eines Handys gibt

an, wie viel Sendeleistung eines Gerätes der Körper maximal aufnehmen kann.

Beim Gebrauch des Mobiltelefons direkt am Kopf wird die absorbierte Hochfre-

quenzenergie innerhalb eines kleinen Gewebvolumens in Wärme umgesetzt,

die ihrerseits durch Wärmeleitung und Blutzirkulation abgeleitet wird. Ein lokaler

Wärmeeintrag von 20 W/kg verursacht normalerweise eine Temperaturerhö-

hung von weniger als 1°C. Um sicherzustellen, dass die lokale Temperaturer-

höhung (gemittelt über 10 g Gewebe) auch bei ungünstigen Randbedingungen

1°C nicht übersteigt, wurde von der Strahlenschutzkommission (SSK, 1998)

und der Internationalen Kommission zum Schutz vor nicht ionisierender Strah-

lung (ICNIRP, 1998) als Obergrenze für beruflich exponierte ein Teilkörper-

SAR-Wert von 10 W/kg festgelegt. Für die Normalbevölkerung gelten 4 W/kg für

die Gliedmaßen und 2 W/kg für Kopf und Rumpf.

Im Weiteren soll vor allem auf Studien eingegangen werden, in denen athermi-

sche Effekte von EMF auf die BHS untersucht wurden.

In der Öffentlichkeit wurde in diesem Zusammenhang besonders die Studie des

schwedischen Mediziners Salford (Salford et al., 2003) diskutiert. Seine Ar-

beitsgruppe exponierte Fischer-Ratten die in einer TEM-Zelle (transverse e-

lectromagnetic transmission line cell) mit einem GSM-Feld (Global System for

Mobile Communication) exponiert wurden. Die Leistungen wurden mit 10, 100

und 1000 mW angegeben, numerischen Berechnungen zufolge ergaben sich

daraus Ganzkörper-SAR-Werte von 20 mW/kg, 200 mW/kg und 2 W/kg. Die

Ratten wurden für 2h mit dem EMF exponiert und erst 50 Tage später getötet

und ihre Gehirne entnommen. Als Ergebnis dieser Studie, fand Salford die Aus-

bildung sogenannter „ Dark Neurons“ (dunkle Neurone) im Gehirnparenchym,

sowie Leckstellen für Albumin an den Gehirngefäßen.

1. Einleitung 15

In einer anderen Veröffentlichung beschreiben Neubauer et al. im Jahre 1990,

dass nach einer 30 minütigen Exposition von Ratten in einem 2,45 GHz-Feld,

bei einem SAR-Wert von 2 W/kg für das Gehirn, die Permeabiltiät der BHS für

einen Rhodamin-Ferritin-Komplex erhöht war. Nach einer Vorbehandlung mit

Colchicin, einem klassischen Inhibitor der Tubulinsynthese, wurde keine Per-

meabiltätserhöhung mehr festgestellt, was auf einen Pinocytose ähnlichen Me-

chanismus schließen lässt.

Aubinau (Reisenburg Workshop, 2003, Töre 2001) zeigte bei seinen Versu-

chen, in denen Ratten für 2h einem GSM-Feld von 900 MHz, mit einer SAR von

0,2- 3 W/kg ausgesetzt waren, eine erhöhte Albumin Extravasation an der Dura

mater und an der BHS.

Bei den oben beschriebenen Studien, in denen athermische Effekte für die

Permeabiltiätserhöhung verantwortlich gemacht wurden, handelt es sich um in

vivo Versuche. Auch bei zwei in vitro Studien wurden Veränderungen der BHS-

Eigenschaften festgestellt, die von den Autoren auf athermische Effekte zu-

rückgeführt wurden.

Leszczynski et al. (2002) fanden bei Exposition von Endothelzellkulturen aus

Nabelschnurblut für 1h mit einem GSM 900-Feld, bei einem SAR-Wert von 2

W/kg eine Steigerung der Phosphorylierung des Hitzeschockproteins 27 (hsp

27) und eine erhöhte Expression dieses Proteins, sowie der p38-MAP-kinase.

In einer weiteren in vitro Studie konnten Schirmacher et al. (2000) in porcinen

Endothelzellen, die mit Ratten-Astrozyten ko-kultivierte wurden und in einem

Hohlleiter mit 1,8 GHz (GSM-Standard), bei einer SAR von 0,3 W/kg exponiert

wurden, nach 4 Tagen eine Permeabilitätszunahme der BHS für 14C-

Saccharose feststellen.

Diese Studien werden jedoch kontrovers diskutiert, da sie nicht durchgängig

reproduzierbar waren. Untersuchungen von Gruenau et al. (1982) und Preston

et al. (1979, 1980) zum Beispiel, fanden an feldexponierten Ratten (2,45 MHz)

keine Permeabilitätserhöhung für Saccharose. Auch Permeabilitätsstudien für

Albumin bei einer Frequenz von 1 GHz (Chang et al., 1982) und für Mannitol bei

einer Frequenz von 1,3 GHz (Merrit et al.) zeigten unter nicht-thermischen Be-

dingungen keinen Effekt auf die BHS.

1. Einleitung 16

In zwei weiteren Untersuchungen von Finnie et al. (2001) wurden C57BL Mäu-

se mit einem GSM-Signal (898,4 MHz) für 60 min. bei einem SAR-Wert von 4

W/kg bzw. über 2 Jahre an 5 Tagen/Woche für 60 min mit 0,25, 1, 2 und 4 W/kg

(Finnie et al. 2002) exponiert. Bei beiden Studien wurde im Gehirn der Mäuse

keine Albumin-Extravasation gefunden.

Tsurita et al. (2000) haben einen ähnlichen Versuch wie die Finnie-Gruppe

durchgeführt, allerdings arbeiteten sie mit Ratten, die für 2 oder 4 Wochen, an 5

Tagen/Woche für 60 min. mit 1439 MHz TDMA (japanischer Mobilfunkstandard)

exponiert wurden. Mittels intravital peripher injiziertem Evans Blue wurde die

Dichte der BHS überprüft. Es konnte jedoch kein Übertritt des Evans Blue in

das Gehirnparenchym festgestellt werden, noch zeigte die immunhistologische

Detektion von Serumalbumin ein positives Ergebnis.

1.4 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung chemischer und physikalischer Einflüsse

auf die BHS in Form von Entzündungsmediatoren und von elektromagnetischen

Feldern, insbesondere auf die Expression von tight junction Genen und Protei-

nen der Endothelzellen zu untersuchen.

Der Einfluss von Entzündungmediatoren sollte an zwei verschiedenen BHS-

Modellen untersucht werden; einem in vitro Modell, welches aus primären Rat-

tenendothelzellen bestand und einem ex vivo Modell, aus isolierten Mikrogefä-

ßen von Rattengehirnen. Für beide Modelle sollten die gleichen Untersu-

chungsmethoden angewendet werden. Auf diese Weise können diese Modelle

miteinander verglichen werden und aus möglichen Unterschieden können Rück-

schlüsse auf die Funktion von einzelnen BHS-Komponenten gezogen werden.

Bisherige Veröffentlichungen zur Exposition der BHS mit EMF zeigen ein un-

einheitliches Bild und Genexpressions-Untersuchungen wurden bisher in die-

sem Zusammenhang selten durchgeführt. Ziel dieses Versuchsvorhabens war

es, in vivo und ex vivo, unter genau definierten Bedingungen den Einfluss von

Mobilfunkstrahlen auf die Expression von tight junction Genen und weiteren

Faktoren, die für die Integrität der BHS wichtig sind, zu untersuchen.

2. Material und Methoden 17

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Zellkulturmedien Rat-Brain- Endothelium (RBE)-Medium für Endothelzellen

Medium / Substanz Menge

DMEM mit 4,5g Glucose/l (Invitrogen, Karlsruhe) 100 ml

FCS (Fetal Calf Serum) (Boehringer, Mannheim) 10 ml

Penicillin/Streptomycin (5000U/ml; Invitrogen, Karlsruhe ) 1 ml

Nicht- essentielle Aminosäuren (100x; Invitrogen, Karlsruhe) 1ml

Na-Pyruvat (100 mM; Seromed, Berlin) 1 ml

L-Glutamin (200 mM; Sigma-Aldrich, München) 1 ml

Retinaextrakt (eigene Herstellung nach Literatur) 1 ml

Waschmedium

Medium/Substanz Mengen

DMEM mit 1g Glucose (Invitrogen, Karlsruhe) 1,48 g

Natrium-hydrogencarbonat 0,37g

H2O dest. 100 ml

Penicillin/Streptomycin (5000U/ml;Invitrogen, Karlsruhe) 1 ml

2.1.2 Verwendete Puffer und Lösungen

Puffer Zusammensetzung

ACSF (artificial cerebrospinal fluid)

119 mM NaCl, 2.5 mM KCl,2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4,26 mM NaHCO3,1 mM NaH2PO4 10 mM Glucose für 15 min mit Carbogen begasen, pH ~7.4

Phosphate-buffered saline (PBS) 10 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4

Phosphat Puffer 100 mM Phosphat (H2PO4)


PBS-T PBS + 1% Tween 20

TAE-Puffer 1x 0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA

Laemmlipuffer (1x) 62,5 mM Tris HCl pH 6,8; 2% (w/v) SDS; 5% (v/v) β- Mercaptoethanol; 10% (v/v) Glycerol

Laemmli Probenpuffer (5x) 312,5 mM Tris HCl pH 6,8; 10% (w/v) SDS; 25% (v/v) β- Mercaptoethanol; 50% (v/v) Glycerol

0,025% (w/v) Bromphenolblau

Tris –Puffer ( für Sammelgel) 0,5 M Tris HCl pH 6,8

Tris –Puffer ( fürTrenngel) 1,5 M Tris HCl pH 8,8

Laufpuffer (SDS-Page) (10x) 0,25M Tris, 1,92 M Glycin, 134,7 M Sodiumdode-

cylsulfat

Transferpuffer (semi-dry Blot) 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% (v/v) Methanol,

0,13 mM Sodiumdodecylsulfat

Stripping-Puffer 62,5 mM Tris- HCl pH 7,4, 100mM β-

Mercaptoethanol, 2% (w/v) Sodiumdodecylsulfat

Lösungen Zusammensetzung

1% Toluidinblaulösung 100 ml Aqua dest., 1 g di-Natriumtetraborat

(Na2B4O7 x 10 H2O), 1 g Toluidinblau, 40 g Sac-

charose

DNA-Stop-Mix 10x 2 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5), 4 ml Glycerin,

je ca. 1g Brom-Phenol-Blau und Xylene Cyanol

Alle Puffer und Lösungen wurden mit Aqua dest. in Millipore-Qualität angesetzt.

2.1.3 Verwendete Chemikalien Chemikalien Anbieter / Firma

Acrylamidlösung (gebrauchsfertig) AppliChem, Darmstadt

Bovines Serumalbumin (BSA) PAA Laboratories, Linz

Bradford-Lösung (gebrauchsfertig) Bio-Rad, München

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, München

Ethanol, MEK-vergällt Chemikalienlager

Eindeckmittel ProLong Gold Antifade, Molecular Probes


Entwickler für Röntgenfilme Kodak, Straubenhardt

Essigsäure J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, USA

Fixierer für Röntgenfilme Agfa, Köln

Glycerol J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA

Isopropanol J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA

KH2PO4 · H2O J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA

β-Mercaptoethanol Sigma-Alderich, München

Methanol Riedel-de Haen, Seelze

Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA

Pferdeserum (HS) Sigma-Aldrich, München

Salzsäure (HCl), konz. J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA

Tris AppliChem, Darmstadt

Tween 20 Acros Organics, Geel, Belgien

Temed AppliChem, Darmstadt

Proteinstandards:

Kaleidoskop prestained Marker Bio Rad, München

2.1.4 Geräte

Analysenwaage 1800, Sartorius

Biokular (Zellkultur) CX 2, Olympus; Stermi 2000, Zeiss

Blot-Apparatur Transblot SD, Semidry Transfer Cell, BioRad

CO2-Inkubator Hera cell, Heraeus

Digital-Kamera AxioCam MRm, Zeiss

Heizblock Bioblock Scientific

Magnetrührer Ika-Vibrax-VXR electronic, Jahke & Kunkel

Neubauer Zählkammer Brand

PAGE-Kammer BioRad

PCR-Gerät Thermo-Cycler PTC 200 (MJ Research)


Pipettierhilfe Pipette Boy, Integra Bioscience

pH-Elektrode pH Einstabmesskette Mettler Toledo

pH-Meter Hydrus 300, Fisherbrand

Real-time PCR Gerät

Scanner Arcus, Agfa

Spannungsquellen Phero-stab 200, Biotech Fischer;

Power Pac 300,BioRad

Tischzentrifuge 5415D, Eppendorf

Tischzentrifuge, kühlbar 5415R, Eppendorf

UV/VIS-Spektralphotometer Ultospec 3000, Pharmacia Biotech

Vakuum-Membranpumpe Sartorius

Vortex Oehmen GLW

Wasserbad Memmert

Werkbank, horizontal Lamin Air, Holten

Werkbank Hera, Heraeus

Zentrifuge (bis 50 ml) 3-15, Sigma


2.2 Methoden

2.2.1 Arbeitsmethoden der Zellkultur (in vitro–Versuche)

2.2.1.1 Endothelzell- Präparation 5-6 Ratten (Stamm: Wistar), 12 - 18 Wochen alt, wurden mit CO2 betäubt und

dekapitiert. Die abgetrennten Köpfe wurden in einer großen Glasschale auf Eis

gesammelt. Mit einem sterilen Besteck wurden die Schädel geöffnet, die Gehir-

ne herauspräpariert und in sterilem PBS gesammelt. Alle weiteren Schritte er-

folgten unter sterilen Bedingungen.

Von den Gehirnen wurden die Kleinhirne abgetrennt und verworfen. Danach

wurden unter Binokular-Kontrolle die Meningen und die Plexus choroidei ent-

fernt. Bei allen Gehirnen erfolgte eine sorgfältige Nachkontrolle, um sicher zu

gehen, dass alle Meningen und Plexus entfernt worden waren. Die Gehirne

wurden in eine Petrischale gegeben und mit zwei Skalpellen zerkleinert.

Die Gehirnmasse wurde in ein 50 ml Falcon-Tube gefüllt und mit 10 ml einer

0,75%igen sterilfiltrierten (0,2 µm Filteraufsatz) Kollagenase-Lösung gemischt

(0,075g Kollagenase: Worthinton CLS II in 10 ml DMEM). Das Gemisch wurde

kräftig geschüttelt und im 37°C Wasserbad für 1 h enzymatisch angedaut. Wäh-

rend der Inkubation wurde der Ansatz alle 10 min kräftig geschüttelt. Danach

wurde zur Separation des Myelins das verdaute Gewebe auf einen 25%igen

BSA-Gradienten (7,5g BSA in 30ml PBS) geschichtet (je 8 ml Verdau + 7,5 ml

Gradientenlösung pro Falcontube).

Die Proben wurden bei 1.000 xg in der Sigma Laborzentrifuge für 20 min. bei

RT zentrifugiert. Das in der oberen Phase angereicherte Myelin wurde vorsich-

tig durch Drehen des Falcon Tubes vom Rand gelöst und mit dem restlichen

Überstand in ein neues Falcon Tube gegossen. Die Überstände von jeweils 2

Tubes wurden in einem frischen Tube gesammelt und nochmals zentrifugiert

(1000 xg, 20 min., RT).

Die dunkelbraunen Pellets (sowohl nach dem ersten, als auch nach dem zwei-

ten Zentrifugationsschritt) wurden pro Tube in 2 ml Waschmedium aufgenom-

men, resuspendiert und in einem Falcon Tube gesammelt. Dieser Schritt diente

zum Waschen der Zellen. Die Proben wurden nun bei 1600 xg in der Sigma La-


borzentrifuge für 15 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen

und anschließend erfolgte bei 37 °C für 30 min. ein zweiter Verdau mit 0,1%

Kollagenase (0,1g Kollagenase in 10 ml Waschmedium). Zwischenzeitlich wur-

de in sterilen Corex- Röhrchen (30 ml, Nalge Company) ein kontinuierlicher

50%-iger Percoll-Gradient geschichtet. Dafür wurden 7,33 ml Percoll (Pharma-

cia, Freiburg), 0,53 ml DMEM (10-fach konz.) und 14,33 ml PBS gemischt und

in der Kühlzentrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus) zum Aufbau des Gradienten,

bei 27.000 xg für 1 h bei 8°C im Festwinkelrotor (8x 50ml, Nr. 3335) zentrifu-

giert.

Nach dem zweiten Kollagenase-Verdau wurde das verdaute Gewebe zum Wa-

schen mit Waschmedium auf 30 ml aufgefüllt und in der Sigma Zentrifuge bei

1600 xg für 20 min. bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und es

erfolgte ein DNase-Verdau mit 100 µg/ml DNase I (1ml DNase (Serva) + 4 ml

Waschmedium) für 2 min.. Danach wurde der Verdau mit Waschmedium auf 30

ml aufgefüllt und bei 400 xg in der Sigma Laborzentrifuge für 10 min bei RT

zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen das Pellet in 4 ml Waschmedium resuspendiert

und jeweils 2 ml der Suspension auf den vorbereiteten Percoll-Gradienten ge-

schichtet. Die Gradientenzentrifugation erfolgte in der Kühlzentrifuge (Sigma)

bei 2500 x g für 10 min. bei 4°C.

Nach der Zentrifugation zeigten sich in dem Gradienten drei unterschiedliche

Banden (siehe Abb. 3)

Zelldebris

Mikrovaskuläre Zellen (Endothelzellen)

Erythrozyten

Abb. 3: Percollgradient nach Auftrennung der Zellbestandteile aus der Gehirnpräpara-

tion.


Die Endothelzellen wurden vorsichtig abgesaugt (ca. 10ml Endothelzellsuspen-

sion pro Gradient), in Falcon Tubes gesammelt, mit Waschmedium auf 50 ml

Gesamtvolumen aufgefüllt und bei 1000 xg für 10 min. bei RT in der Sigma

Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende weiße Pellet wurde in 5 ml RBE+ (rat

brain endothelial)-Medium aufgenommen und resuspendiert. Die Zellsuspensi-

on wurde unter dem Phasenkontrast-Mikroskop kontrolliert und die Zellen wur-

den mit Hilfe der Zählkammer (Neubauer-Kammer) ausgezählt. Danach wurden

die Zellen auf Petrischalen (Ø 3 cm, Falcon) ausgesät, welche zuvor für 5–6

Std. bei 37 °C mit Kollagen (Biochrom AG, Berlin) beschichtet waren. Die aus-

gesäte Zelldichte betrug 1 - 1,5 Mio. Zellen pro ml Medium.

2.2.1.2 Reine Perizyten-Kultur Perizytenkulturen können mit derselben Isolationsmethode, wie für Endothelzel-

len beschrieben, gewonnen werden.

Dazu wurden Endothelzellkulturen, die immer mit einer geringen Anzahl Perizy-

ten kontaminiert sind für mindestens 7 Tage bei 37°C (5%CO2) kultiviert (Ram-

sauer, 1999). Dabei wurde alle zwei Tage das Kulturmedium (RBE-

Medium/4,5% Glucose) gewechselt. In den ersten fünf Tagen der Kultur prolife-

rierten unter diesen Kulturbedingungen die Endothelzellen. Nach ca. sieben Ta-

gen starben die Endothelzellen ab, und die ebenfalls in dem Kulturansatz vor-

handenen Perizyten begannen sich zu vermehren. Aus dieser Kultur konnten

nach 12 Tagen reine Perizytenkulturen gewonnen werden.

2.2.2 Gefäßisolation mittels Nylonsieben (Ex vivo-Versuche) Adulte Ratten (zwischen 12 Wochen und 5 Monaten alt) wurden dekapitiert und

die Gehirne wurden aus dem Schädel herauspräpariert. Es wurde nur das

Großhirn und das Zwischenhirn benutzt, das Kleinhirn und der Hirnstamm wur-

den abgetrennt und verworfen. Die Gehirne wurden sorgfältig von den Menin-

gen und vom Plexus choroideus befreit, danach erfolgte die Homogenisierung

der Gehirne. Dazu wurde jeweils 1 Gehirn in 4 ml kalter PBS (Phosphat gepuf-


ferte Saline) 1% BSA- (Bovine Serum Albumin) Lösung mit ca. 50 „strokes“ im

großen Glashomogenisator (50 ml Homogenisator mit L-Pistill, Braun- Melsung)

homogenisiert. Danach wurde das Gehirnhomogenat in einen 15 ml Glashomo-

genisator (Homogenisator mit L-Pistill, Schütt Labortechnik) umgefüllt und mit

25 „strokes“ weiter homogenisiert. Die homogenisierte Gehirnmasse wurde in

einem 10 ml Falcon-Tube gesammelt, wobei der kleine Homogenisator mit ca. 3

ml PBS+1% BSA-Lösung nachgespült wurde. Das Homogenat wurde für ca. 4

sec. gevortext und danach mit Ultraschall (12 Ultraschallstöße: Duty cycle 30,

output control: 2,5) behandelt, um die Gehirngefäße von Geweberesten zu rei-

nigen. Das homogenisierte Gehirngewebe wurde mit Hilfe eines Nylonnetzes

(100 µm Maschenweite) gesiebt. Die auf dem Netz verbliebenen Blutgefäße

wurden mit ca. 10 ml PBS abgespült, Die Gefäßsuspension wurde ein weiteres

Mal in 10 ml Falcon-Tubes gefüllt, 4 sec. gevortext und mit 10 Ultraschallstößen

(duty cycle: 20, output control: 2) behandelt und über ein 100 µm Nylonsieb von

Zellresten gereinigt. Die gereinigten Gefäße wurden je nach weiterer Aufarbei-

tung in PBS bzw. ACSF (artifizielle Cerebrospinal-Flüssigkeit) aufgenommen.

Die Mikrogefäße, die nicht weiter inkubiert werden sollten und zur Kontrolle

dienten, wurden in PBS (pro Gehirn ca. 1ml) aufgenommen, in Eppendorf-Cups

gesammelt und in der Tischzentrifuge (Biofuge Pico, Heraeus Instruments) bei

8000 xg für 7 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verwor-

fen und das Pellet mit den Blutgefäßen wurde in 1 ml Trizol (Ultra Pur, GIBCO

BRL) resuspendiert und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –20 °C eingefroren.

2.2.2.1 Inkubation der isolierten Gehirngefäße und der zerebralen Endo-thelzellen mit Entzündungsmediatoren Bei dieser Versuchsdurchführung wurden die isolierten Gehirngefäße (siehe

2.2.2) in ACSF (pro Gehirn 1,0 ml) aufgenommen und in 6-well Kulturplatten

(Falcon, NJ USA) für 4h bzw. 24h mit Entzündungsmediatoren (siehe Tabelle 2)

im Zellkulturschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation er-

folgte die Zentrifugation der isolierten Gehirngefäße bei 8000 xg für 7 min und

die Aufnahme des Gefäßsediments in 1 ml Trizol zur weiteren Aufarbeitung für


die Real-time PCR bzw. in 1 x Laemmli-Puffer zur weiteren Aufarbeitung für die

Western Blots.

Die primären zerebralen Endothelzellen wurden für drei bzw. vier Tage kultiviert

und dann für 24h bzw. 4h mit den Entzündungsmediatoren (siehe Tabelle 2)

inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen mit 37°C warmen PBS

gewaschen und in Trizol bzw. In 1x Laemmli-Puffer aufgenommen.

Tabelle 1: Entzündungsmediatoren

Substanz Anbieter Konzentrationen

LPS (Liposaccharide, Serotyp: 026 : B6; E.coli)

Sigma - Aldrich

100 ng/ml bzw. 1 µg/ml

IL-1β (human Interleukin-1 beta) PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ

500 U/ml bzw. 5000 U/ml

2.2.2.2 Behandlung von isolierten Mikrogefäßen mit UMTS-Strahlung.(ex vivo) Bei diesem Versuch konnte eine Anlage am Universitätsklinikum Münster (Prof.

Dr. med. F. Stögbauer) genutzt werden, in der isolierte Mikrogefäße mit elek-

tromagnetischer Strahlung im UMTS- (Universal Mobile Telecommunications

System) Bereich (siehe Kapitel 2.2.3) exponiert wurden.

Die Mikrogefäße wurden aus den Gehirnen von Wistar-Ratten isoliert (siehe

Kapitel 2.2.2), in ACSF aufgenommen und über Nacht bei 4°C gelagert. Am

nächsten Tag wurden die Mikrogefäße auf Eis nach Münster transportiert.

Die Expositionsanlage befand sich in einem Zellkulturschrank (Inkubator) der

auf 37°C erwärmt und mit 5% CO2 begast wurde. Die Anlage bestand aus zwei

runden Hohlleitern (Abb. 4), in der jeweils 28 Einzelproben exponiert werden

konnten. Die Hohlleiter waren an einen Signalgenerator angeschlossen und die

jeweiligen Proben wurden innerhalb ihrer Behältnisse mit einem SAR-Wert von

1,8 W/kg (UMTS 1,966 GHz) exponiert. Der Versuch wird als Blindversuch

durchgeführt, d.h. ein computergestütztes Zufallsprogramm wählte aus, welcher

der beiden Hohleiter mit dem elektrischen Feld exponiert wurde.


Abb. 4: Die Expositionsanlage mit zwei Hohlleitern im CO2-Inkubator

Ursprünglich war die Anlage für die Bestrahlung von Endothelzellkulturen auf

Filtereinsätzen konzipiert worden. In die vorhandenen Filtereinsätze (Abb. 5 (a)

(4)) konnten die isolierten Mikrogefäße, welche sich in ACSF befanden, einge-

bracht werden. Da nur am Boden dieser Filtereinsätze ein homogenes elektro-

magnetisches Feld gewährleistet war, wurden die Gefäße mit einem feinen Sieb

abgedeckt um einen Auftrieb zu verhindern. Isolierte Mikrogefäße von 3 Rat-

tengehirnen wurden in 3 ml ACSF gesammelt, davon wurden je 1,5 ml auf die

Filtereinsätze in Hohleiter 1 und 2 verteilt. So war gewährleistet, dass das glei-

che Ausgangsmaterial exponiert bzw. nicht-exponiert wurde. Die Behälter (Abb.

5 (a 5)) in denen sich die Filtereinsätze mit den isolierten Gehirngefäßen befan-

den wurden mit ACSF auf 3,5 ml aufgefüllt. Zur Exposition wurden die Einzel-

komponenten (Abb.5 a) zusammengefügt (Abb. 5 b) und in die beiden Hohllei-

ter im CO2-Inkubator eingesetzt.


Abb. 5: Einzelkomponenten (a) der Behältnisse die zusammengebaut (b) in einen der

Hohlleiter der Expositionsanlage für die ex-vivo Versuche eingesetzt wurden.

Die freien Plätze in der Expositionsanlage wurden mit H2O befüllt (Dummies),

da nur bei vollständig bestückten Hohleitern ein homogenes Feld innerhalb ei-

nes jeden Expostionsgefäßes gewährleistet war. Die isolierten Gehirngefäße

wurden für 24h exponiert bzw. „sham“-exponiert.

Nach der Expositionszeit wurden die Mikrogefäße vorsichtig aus den Behältnis-

sen abgesaugt, in Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bei 8000 xg für 8 min.

abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit den Ge-

fäßen in 1 ml Trizol aufgenommen und auf Eis nach Bochum transportiert. Bis

zur Isolation der RNA aus den Gehirngefäßen wurden diese bei -20°C gelagert.

(a)

(b)

(1) (2) (3) (4) (5)


2.2.3 In–vivo-Versuche: Lokale Exposition des Rattengehirns mit elektromagnetischen Feldern (UMTS) in vivo

2.2.3.1 Die Expositionsanlage In diesem Versuchsvorhaben wurde die Wirkung von elektromagnetischen Fel-

dern wie sie im Mobilfunk genutzt werden, auf die Ausbildung und Zusammen-

setzung der interzellulären Kontakte (tight junctions) an der Blut-Hirn-Schranke

untersucht.

Hierzu wurde das im Mikrowellenbereich zwischen 1,90 und 2,17 GHz arbei-

tende neue System der Mobilfunktechnik (UMTS (Universal Mobile Telecom-

munications System), das auch als Mobilfunksystem der 3.Generation bezeich-

net wird und seit 2004 auf dem deutschen Markt ist, verwendet. Sein Einfluss

auf die m-RNA Expression von verschiedenen Komponenten der tight junction

Strukturen sowie einige andere Parameter der BHS wurden überprüft.

In diesem Versuch sollte die Strahlenbelastung der BHS bei Handynutzung si-

muliert werden. Deshalb musste darauf geachtet werden, dass nur der Kopf

bzw. das Gehirn der Ratten kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum mit

der gleichen Strahlendosis in vivo exponiert wird. Für dieses Versuchsvorhaben

war eine besondere Expositionsanlage erforderlich, die in Zusammenarbeit mit

dem Lehrstuhl für Theoretische Elektrotechnik der Bergischen Universität Wup-

pertal (Prof. Hansen) nach neuesten Erkenntnissen als Prototyp entwickelt und

gebaut wurde.

Die Wuppertaler Partner konstruierten eine sphärische TEM-Wellenleitung, die

aus einem Doppelkegel aus Metall bestand (Abb. 6 a).


Abb. 6: Vom Institut für Elektrotechnik und Informationstechnik in Wuppertal entwickel-

ter doppelwandiger Hohlleiter (a) mit innerer Holmstruktur (b) für die Exposition der

Versuchstiere mit UMTS-Feldern.

Der Doppelkegel weist eine sechseckige Form auf und hat eine innere Holm-

struktur. Jedes der sechs Segmente enthält ein Paar Metallholme (siehe Abb. 6

(a)). Zwischen diesen Holmenpaaren (Abstand 6 mm) wird das elektromagneti-

sche Feld konzentriert bis zum unteren Ende des Doppelkegels geführt (siehe

Abb. 6 (b). Die Ratten konnten in der Expositionsanlage so unter den Enden der

Metallholme fixiert werden, dass gezielt ihr Kopf bzw. das Gehirn exponiert wur-

de.

(a)

(b)

Metallholme


Abb. 7: Aufbau der gesamten Expositionsanlage

Abb. 7 zeigt die komplette Expositionsanlage sowie die Hochfrequenz-

Einspeisung an der Spitze des Doppelkegels. Eine gleichmäßige Verteilung des

elektromagnetischen Feldes auf die sechs Segmente war durch die Symmetrie

der Anlage gewährleistet. Zwischen den Bereichen für die Versuchstiere befan-

den sich Metallwände, um gegenseitige Beeinflussungen durch Überkopplung

von Störfeldern zu vermeiden.

In dieser Anlage konnten sechs Ratten gleichzeitig mit derselben Feldstärke in

einem Versuchsdurchlauf unter identischen Bedingungen exponiert werden.

Die Ratten wurden dazu in Plastikröhren fixiert (siehe Abb. 7), wobei der

Schwanz, für die Ratte ein wichtiger Körperbestandteil zur Temperaturregulati-

on, aus der Röhre herausragte. Im vorderen Teil der Fixierröhren befanden sich

Lüftungsschlitze, die einen Wärmestau verhinderten.

Die Schnauzen der Ratten ragten vorne aus den Fixierröhren heraus. In diesem

Bereich wurde durch eine Lüftungsanlage ein leichter Luftstrom erzeugt, sodass

die Ratten animiert wurden, nach vorn zu schnüffeln und so die Beibehaltung


der Position des Kopfes unter dem Expositionsbereich der Anlage gewährleistet

war.

Zum Zeitpunkt der Exposition befanden sich die Ratten nach dem vorgegebe-

nen Tag-Nachtrhythmus in ihrer Ruhephase, d.h. der Hellphase. Um diesen

Rhythmus der Tiere nicht zu unterbrechen war in jedem Segment der Anlage

eine LED-Lampe installiert.

Für die Versuche wurden männliche Ratten (Stamm: Wistar) im Alter von 12 bis

15 Wochen verwendet, die in der zentralen Versuchstierhaltung der Medizini-

schen Fakultät gezüchtet und mit Futter und Wasser ad libium gehalten wurden.

Schon nach dem Absetzen vom Muttertier wurden die für die Versuche vorge-

sehenen Tiere an die Röhren der Versuchsanlage gewöhnt, indem ihnen die

Plastikröhren als Versteck in den Käfig gelegt wurden.

2.2.3.2 Durchführung der Vorversuche In den Vorversuchen sollten 6 Ratten mit den geplanten Hochfrequenzfeldern

im UMTS-Bereich exponiert werden, um die „spezifische Absorptionsrate“

(SAR) zu bestimmen, gemessen in Watt pro Kilogramm Gewebemasse (W/kg).

Dieser Wert gibt den Anteil der Strahlungsleistung an, der vom Körpergewebe

während der Exposition mit elektromagnetischen Wellen aufgenommen wird

und zur Erwärmung des Gewebes führt. In den Vorversuchen musste der SAR-

Wert für die neue Anlage ermittelt werden bei dem die Temperatur im Schädel

nicht mehr als 0,1 °C anstieg, so war sichergestellt, dass während der Versuche

kein thermischer Effekt auftrat.

Um erste Näherungswerte über die Einstellung des Signalgenerators zu erhal-

ten, der die eingespeiste Leistung und damit die Feldstärke bestimmt, wurden

Versuche an Rattenkadavern durchgeführt. Hierzu wurden Ratten durch eine

Überdosis CO2 getötet und ca. zwei Stunden auskühlen gelassen, damit ihre

Körpertemperatur der Raumtemperatur entsprach. Danach wurde mit einem

Skalpell ein Hautschnitt (ca. 0,7cm) in der Mitte des Schädels gesetzt und der

Schädelknochen in einem Bereich von ca. 0,5 cm2 freipräpariert. Im Weiteren

wurde mit einem Präzisionselektrobohrer ein etwa 2 mm großes Loch in den

Knochen gebohrt.


Für die Vorversuche wurde auch eine Plastikröhre im vorderen Drittel der Röhre

mit einem 5 cm langen und 3 mm breiten Spalt versehen.

Durch diesen Spalt musste die Temperatursonde (FISO Technologies, Quebec,

Kanada, siehe Abb. 8) in das Rattengehirn eingeführt werden.

Abb. 8: Schematischer Bau der Temperatursonde zur Messung der Kerntemperatur

des Gehirns

Innerhalb der ersten 10 mm der Sonde befindet sich die thermosensible Zone

(sensitive zone). Während der Messung musste gewährleistet sein, dass sich

dieser Bereich vollständig im Gehirn befand. Nach der Temperaturmessung

wurde daher überprüft, in welchem Teil des Gehirns und vor allem wie tief sich

die Sonde im Gehirn befunden hat (siehe hierzu Abb. 9 (a) und (b)).

Abb. 9: Bereich der Temperatursonde der sich während der Messung im Gehirn

befand (a), Verlauf der Temperatursonde im Großhirn der Ratte (b).

(a) (b)


Abb. 9 (a) zeigt die Länge des Teils der Sonde, der sich im Gehirn der Ratte

befand. Wie auf dem Bild ersichtlich befand sich die Temperatursonde ca. 1,6

cm tief im Schädel, daraus lässt sich schließen, das die thermosensible Zone

vollständig von Gehirngewebe umschlossen war. Bild 7(b) zeigt die ungefähre

Lage der Sonde im Gehirn rekonstruiert nach der Einstichstelle, welche durch

die Temperatursonde im Gehirn entstanden ist.

Nach den Temperaturmessungen am Kadaver, bei denen die Temperaturmes-

sungen für zwei verschiedene in die Wellenleitung eingespeiste Leistungen von

1,4 W und 0,7 W aufgezeichnet wurden, mussten die Vorversuche der Tempe-

raturmessung an sechs narkotisierten Ratten durchgeführt werden. Da die Tier-

kadaver keine Blutzirkulation mehr aufweisen und somit der Wärmeaustausch

im Gehirngewebe verlangsamt stattfindet, war zu erwarten, dass in den Kada-

vern eine größere Temperaturerhöhung bei gleicher Feldstärke zu verzeichnen

war, als in narkotisierten Tieren mit intakter Mikrozirkulation. Zur Narkose der

Ratten wurde ein Gemisch aus Ketamin 10% (100mg/kg) und Xylazin 2% (5

mg/kg) intraperitoneal injiziert. Anhand des Lidschlußreflexes wurde die Narko-

setiefe der Tiere überprüft und erst bei Ausfall des Lidschlußreflexes wurde der

operative Eingriff zur Temperaturmessung vorgenommen. In einzelnen Fällen

musste das Narkosemittel nachdosiert werden. Das Einbringen der Tempera-

tursonde und die Temperaturmessung erfolgten wie oben für die Tierkadaver

beschrieben.

2.2.3.3 Durchführung des Hauptversuches Nachdem in den Vorversuchen die Temperaturverläufe im Gehirn (siehe 3.3.1)

bei SAR-Werten von ca. 2 W/kg und 8 W/kg überprüft wurden, konnten die Ex-

positionsfeldstärken der Hauptversuche errechnet werden, siehe hierzu das

Expositionsschema Tabelle 1.


Tabelle 2 : Schema zur Exposition der Ratten im UMTS-Feld

Anzahl der Tiere Stärke der Exposition Länge der Exposition

18 Ratten 0 W/kg 2 Stunden / Kontrolle

18 Ratten 2 W/kg 2 Stunden

18 Ratten 10 W/kg 2 Stunden

18 Ratten 0 W/kg 0 Stunden / Käfigkontrolle

Insgesamt wurden 9 Messungen mit jeweils 6 Tieren pro Messung durchge-

führt. Die Messungen erfolgten mit einem computergestützten Zufalls-Protokoll

zur Wahrung der Objektivität als Blindversuche.

Vor den Messungen wurden die Ratten kurz zur Überführung in die Plastikröhre

mit CO2 narkotisiert und die Röhren wurden in der Expositionsanlage befestigt

(Abb. 10).

Abb. 10: Aufsicht auf die mit Ratten bestückte Expostionsanlage.

Die Ratten wachten nach einigen Sekunden in den Röhren wieder auf und wa-

ren während der zweistündigen Exposition voll bei Bewusstsein. Nach der Ex-

position wurden die Tiere aus den Röhren genommen, sofort mit CO2 narkoti-

siert und dekapitiert. Die Schädel wurden eröffnet und die Gehirne herausprä-


pariert. Nach Abpräparieren der Meningen und Entfernen der choroidalen Ple-

xen wurden die Gehirne in Eppendorf-Cups bzw. 10 ml Falcon-Tubes gesam-

melt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Bearbeitung für die

Real-time PCR bzw. die Immunfluoreszenz bei -80°C gelagert.

2.2.4 Molekularbiologische Arbeitsmethoden

2.2.4.1 RNA- Isolation mit Trizol Zur Isolation der RNA aus den verschiedenen Gewebeproben wurden die Zel-

len mit Trizol (Ultra Pur, GIBCO BRL) aufgeschlossen. Das Gewebe wurde in 1

ml Trizol homogenisiert bzw. aufgeschlossen. Die Mikrogefäße waren so ro-

bust, dass sie nicht in einem 1 ml Glashomogenisator zerkleinert werden konn-

ten, daher erfolgte die Homogenisierung der Gefäße mit Hilfe eines Ultraschall-

gerätes (Branson Sonifier 250, Mikrotip). Das Gewebe wurde dazu mit 15 Ultra-

schallstößen beschallt (duty cycle: 35% und output control: 3).

Die leichter aufschließbaren Zellkulturen (siehe Kapitel 2.2.1) wurden in Trizol

durch 8x-iges Suspendieren mit einer 1 ml Pipette und Abspülen des Kultur-

schalenbodens homogenisiert. Das homogenisierte Gewebe wurde in 1 ml Tri-

zol für 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt diente der komplet-

ten Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe.

Danach wurden dem Homogenat 200 µl Chloroform zugefügt und die Proben

wurden für 15 sec. geschüttelt. Zur Phasenseparation wurden die Ansätze 2-3

min. bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach in einer Laborzentrifuge

(Sigma 1K-15, Rotor-Nr.12024-H) bei 12.000 x g für 15 min. bei 4 °C zentrifu-

giert.

Die obere (wässrige) Phase wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues

Eppendorf-Cup überführt. In der wässrigen Phase befand sich die RNA, wäh-

rend DNA und Proteine in der Interphase bzw. in der Phenol-Phase angerei-

chert waren.

Zum Fällen der RNA wurden 500 µl Isopropanol zu der Probe gegeben. Zum

besseren Erkennen und Absetzen der gefällten RNA wurden noch 2 µl Glyko-


gen (10mg/ml) zu dem Gemisch hinzugefügt, welches für 10 min. bei Raum-

temperatur inkubiert wurde. Danach erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt

bei 12.000 g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wurde abgenommen und ver-

worfen und das Pellet, welches die RNA enthielt, wurde mit 1 ml 75% EtOH

gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren (5 min., bei 4°C, 7.500 g) wurde der

Überstand abgenommen und verworfen und das Pellet ca. 5 min. bei Raum-

temperatur luftgetrocknet. Danach erfolgte die Resuspension des Pellets in 10

µl Ultra-Pur-H2O (Gibco, Invitrogen). Die so isolierte RNA konnte im -80°C Ge-

frierschrank gelagert werden. Bei dieser Temperatur sind die RNasen inaktiv.

2.2.4.2 Konzentrationsbestimmung des RNA-Gehalts Die Konzentration der isolierten RNA wurde mit Hilfe des Photospektrometers

(Ultraspec 3000, Pharmacia Biotech) bestimmt. Es wurde dazu 1 µl der in H2O

gelösten RNA zu 80 µl H2O dest. gegeben. Zu einem Ansatz wurde keine RNA

gegeben. Dieser diente als Nullabgleich. Jeder Ansatz wurde gut gemischt und

in eine Quarzküvette gegeben. Die Konzentration der RNA wurde mit Hilfe des

Photospektrometers mit Licht der Wellenlänge λ-260 nm bestimmt. Um die

RNA-Konzentration zu berechnen, mussten der Verdünnungsfaktor (x80) und

der geräteinterne Wert zur RNA-Bestimmung (x40) berücksichtigt werden.

2.2.4.3 DNase-Behandlung und c-DNA-Synthese Die isolierte RNA ist relativ instabil, bzw. sie ist immer dem Verdau von RNasen

ausgesetzt, die im Gegensatz zu DNasen extrem stabil sind und für ihre Arbeit

keine Co-Faktoren wie Mg2+ benötigen. Um dieses Problem zu umgehen, wur-

den die isolierten RNA-Sequenzen mit Hilfe einer Reversen-Transkriptase in

DNA-Sequenzen (c-DNA) umgeschrieben.

Als Primer wurden Oligo-dT-Primer verwendet, die sich an den Poly-A+-

Schwanz der RNA binden und am 5´-Ende der mRNA enden. Auf diese Art las-

sen sich komplette c-DNAs synthetisieren, wobei beachtet werden muss, dass

RNAs eine Länge von mehreren Kilobasen (kb) haben können, die Reverse


Transkriptase jedoch nur c-DNAs von ca. 1-2 kb synthetisiert. Somit kann es

vorkommen, dass wichtige, proteinkodierende Teile der mRNA nicht syntheti-

siert werden. Um dies zu umgehen, wurden zusätzlich Hexamerprimer (random

hexamers) eingesetzt, welche an beliebigen Stellen mit der mRNA hybridisieren

und kurze c-DNAs synthetisieren, so dass schließlich die komplette mRNA als

c-DNA abgelesen werden konnte (Sambrook, et al., 1989)

Bevor jedoch mit der reversen Transkription begonnen werden konnte, musste

zuerst eine DNase-Behandlung durchgeführt werden, um noch vorhandene ge-

nomische DNA aus der Probe zu entfernen. Dieser Schritt war wichtig, da im

Weiteren sicher gestellt sein musste, dass es sich bei der synthetisierten DNA

um eine c-DNA, also um transkribierte RNA handelte und nicht um genomische

DNA. Für den DNA-Verdau wurde 1 µg RNA-Probe eingesetzt. Dieser Probe

wurden 1 µl 10x konzentrierter DNase I Reaktionspuffer (Invitrogen) und 1 µl

DNase I (1 U/µl / Invitrogen) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde mit Ultra-Pur H2O

auf 10 µl aufgefüllt. Der Verdau erfolgte für 20 min. bei RT. Zur Inaktivierung der

DNase I wurde dann 1 µl des Chelatbildners EDTA (25 mM) zu dem Ansatz ge-

geben und für 10 min. auf 65°C erhitzt.

Im Anschluss an die DNase- Behandlung erfolgte die 1st- Strand- Synthese mit

Superscript II-RNase-H--Reverse Transkriptase (Invitrogen). Dazu wurde die

DNase-behandelte Probe mit Ultra-Pur H2O auf 31,5 µl aufgefüllt, und nach Zu-

gabe von 2 µl random hexamers (Boehringer, Mannheim) und 2,5 µl dNTPs

(Deoxyribonukleosidtriphosphate, MBI Fermentas) für 5 min. auf 65°C erhitzt.

Danach wurden 10 µl 5x konzentrierter 1st-Reaction Buffer und 5 µl 0,1 M DTT

(beides von Invitrogen) dazu gegeben, für 10 min. bei RT inkubiert und an-

schließend für 2 min. auf 42°C erhitzt. Vor Zugabe von Superscript II (Invitro-

gen) im nächsten Schritt, wurde aus dem Ansatz ein Aliquot von 8 µl entnom-

men. Ein Teil dieser Probe wurde später in die PCR eingesetzt und diente zum

Nachweis von genomischer DNA in dem Ansatz. Ergab diese Probe ein positi-

ves Signal bei der PCR, während die H2O-Kontrolle negativ war, konnte davon

ausgegangen werden, dass es sich bei dem amplifizierten Abschnitt um geno-

mische DNA handelte. In dieser Probe hatte nämlich keine Transkription von

mRNA zu c-DNA stattgefunden. In solch einem Fall kann man auch bei dem

Teil des Ansatzes zu dem die Reverse-Transkriptase (Superscript II) gegeben


wurde nicht sicher sein, dass es sich um ein mRNA-Signal handelte und nicht

um eine genomische DNA-Amplifikation. Deshalb mussten Proben, die positiv

auf genomische DNA getestet wurden, verworfen werden.

Nach Zugabe von 0,9 µl Superscript II (Gibco BRL) wurde der Ansatz für 90

min. bei 42°C inkubiert und zum Beenden der Reaktion auf 72°C erhitzt. Alle

durchgeführten Reaktionsschritte erfolgten in dem PCR-Thermocycler (MJ Re-

search PTC-200, Peltier Thermo Cycler). Mit diesem Gerät wurden die Tempe-

raturwechsel ohne große Verzögerungen gewährleistet. Die so synthetisierte

c-DNA konnte nun bei 4°C oder zur längeren Aufbewahrung bei -20°C gelagert

werden.

2.2.4.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) Mit Hilfe der PCR- Methode gelingt der Nachweis kleinster Mengen spezifischer

DNA-Sequenzen. Die Methode der PCR beruht auf der enzymatischen Vermeh-

rung eines definierten DNA- Abschnitts zwischen zwei Oligonucleotid-Primern.

Der PCR-Ansatz betrug 20µl und wurde nach folgendem Schema pipettiert:

x µl c-DNA 2 µl 10x Taq-Puffer 1,6 µl MgCl2 (25 mM) 0,4 µl dNTPs (10 mM von jedem) 0,5 µl Primer Mix (sense und antisense Primer) 0,2 µl Taq auf 20 µl mit H2O auffüllen. Das Volumen der eingesetzten c-DNA war abhängig von der eingesetzten Men-

ge RNA in die c-DNA-Synthese. Normalerweise wurde 1 µg RNA eingesetzt,

dann betrug das eingesetzte c-DNA Volumen für die PCR 1 µl (= 20ng RNA).

Die Durchführung der PCR diente in diesem Versuchsteil der Kontrolle der c-

DNA auf genomische DNA und der Überprüfung der Effizienz der c-DNA Syn-

these. In dieser PCR wurden der GAPDH-Primer (siehe Tabelle 1) und ein wei-

terer Primer der Real-time PCR, ZO-1 oder Occludin (siehe Tabelle 2) verwen-

det.


Die DNA Amplifikation wurde im Thermo-Cycler PTC 200 (MJ Research) nach

folgendem Pogramm durchgeführt:

1. 2 min 95°C 2. 30 sec. 94°C 3. 30 sec. 52°C 4. 1 min. 72°C 5. 10 min. 72°C 6. ∞ 4°C

Die Schritte zwei bis vier werden je 35x wiederholt.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Basensequenzen des in die PCR eingesetz-

ten GAPDH-Primers.

Tabelle 3: Basensequenz des GAPDH-Primers

Name Forward-Primer Reverse-Primer

GAPDH TCC AGT ATG ACT CTA CCC ACG G CAT CAC CCC ATT TGA TGT TAG C

Der Primer wurde von Invitrogen Life Technologies hergestellt.

2.2.4.4.1 Gelelektrophorese der PCR-Produkte Zur Überprüfung der Ergebnisse der PCR wurden die Proben in einem Agaro-

segel aufgetrennt. Da es sich, resultierend aus den gewählten Primern, um rela-

tiv kleine DNA Fragmente handelte, wurden 2%ige Agarosegele benutzt. Hierzu

wurden 1,6 g Seakem LE Agarose (Biozym) in 80 ml TAE-Puffer gelöst. Das

Gemisch wurde für ca. 3 min. in der Mikrowelle aufgekocht, bis keine Schlieren

mehr in der flüssigen Agarose zu erkennen waren. Zu der flüssigen Agarose

wurden nach kurzem Abkühlen 5 µl Ethidiumbromid gegeben. Dieser Farbstoff

wird durch UV-Licht angeregt und interkaliert in doppelsträngige DNA, sodass

die DNA-Banden im Gel sichtbar gemacht werden konnten. Von jeder Probe

wurden 20 µl in eine Tasche des Gels aufgetragen. Als Standard wurde ein 100

bp- Marker der Firma MBI Fermentas benutzt. Der Lauf des Gels erfolgte in 1x

TAE-Puffer bei 100V für 45 min. Die Sichtbarmachung der Banden und die Do-

kumentation des Gels erfolgte unter UV-Licht mit dem „Image Master“ (Phar-

macia Biotech, Sana Francisco, CA).


2.2.4.5 Real-time quantitative PCR Mit Hilfe der Real-time PCR-Methode können verschiedene DNA-Proben quan-

titativ miteinander verglichen werden. Der für diese Methode verwendete Real-

time-Cycler ist mit einer UV-Lampe ausgestattet und besitzt als Detektionsmo-

dul eine CCD-Kamera, die die Produktzunahme anhand der Fluoreszenzzu-

nahme misst. Das verwendete System arbeitet mit dem Fluoreszenzfarbstoff

CYBR-Green I (Eurogentec EGT Group). Dieser Farbstoff hat die Eigenschaft,

dass er unspezifisch in jede Doppelstrang-DNA interkaliert. Erhöht sich nun im

Laufe der PCR-Reaktion die Menge des Produkts, also die Menge der dop-

pelsträngigen DNA, so resultiert daraus auch ein Fluoreszenzanstieg, der vom

Detektionssystem gemessen und aufgezeichnet werden kann. Anhand der Auf-

zeichnungen kann abgelesen werden, ab welchem Zyklus die Proben in den

linearen Amplifikationsbereich, in dem die Amplifikation exponentiell verläuft,

eintreten, und wann sie die Plateauphase erreichen. Je höher die DNA-

Ausgangsmenge ist, desto schneller wird der lineare Bereich und der Plateau-

bereich erreicht.

Der Nachteil bei der Verwendung des CYBR-Green I-Farbstoffs lag darin, dass

alle doppelsträngigen PCR-Produkte sowohl spezifische als auch unspezifische,

wie z.B. Primer-Dimere, detektiert wurden. Dieses Problem wurde nach abge-

schlossener Amplifikation mittels einer Schmelzkurvenanalyse gelöst. Dabei

erfolgte eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produk-

ten. Die Produkte wurden über einen bestimmten Temperaturbereich kontinuier-

lich aufgeheizt bis sie ihrem Schmelzpunkt entsprechend nur noch als Einzel-

strang vorlagen. Kleinere Fragmente, wie z.B. Primer-Dimere weisen einen

niedrigeren Schmelzpunkt auf als die gewünschten PCR-Produkte, denen man

einen genauen Schmelzpunkt (zwischen 77°C und 85°C) zuordnen konnte. Die

Fluoreszenzabnahme beim Schmelzen der Produkte wurde aufgezeichnet. In

Verbindung mit den unterschiedlichen Temperaturen der Schmelzpunkte konn-

ten Primer-Dimere und spezifische Produkte unterschieden werden. Tabelle 4a

zeigt die Basensequenzen der für die Real-time PCR verwendeten Primer. Ta-

belle 4b zeigt die Länge und die Schmelztemperatur (Tm) des Amplikons der

jeweiligen Primer. Die Primer wurden mit Hilfe der Primer Express Software

ausgewählt und die Sequenzen beziehen sich alle auf das Rattengenom.


Die Primer für Claudin-1, -5, -11, Occludin und ZO-2 wurden von Invitrogen Life

Technologies hergestellt, die Primer ZO-1, VEGF, MMP-2, -9, pAPN, c-jun und

c-fos von biomers.net GmbH.

Der Real-time-PCR-Ansatz wurde unter der Holten Lamina-Air Bank angesetzt

und bestand aus folgenden Komponenten.

1x–Ansatz : 20 µl

1. 1 µl cDNA 2. 10 µl 2x Real-time Sybr Green I Mix (Eurogentec EGT Group) 3. 0,12 µl Primer–Mix ( sense und antisense Primer) 4. 8,88 µl H2O (Ultra-Pur)

Tabelle 4 a: Nukleinsäuresequenzen der verwendeten Sense und Antisense Primer

Name Forward-Primer Reverse-Primer

Claudin-1 AGA TGT GGA TGG CTG TCA TCG CCT GGC CAA ATT CAT ACC TGG

Claudin-5 TGG ACC ACA ATA TCG TGA CGG CAC TTT GCA TTG CAT GTG CC

Claudin-11 GGT TGG ATT GGC ATC ATC G AGT TCG TCC ATT TTG CGG C

Occludin TTC GGA TCC TGT CTA TGC TCG AAA GAT GCC CGT TCC ATA GGC

ZO-2 TCG AGA AGA TGG ACC ACA AGG TTG GCC GTC TCA TCT TGT ACG

ZO-1 TGCTGA ACA GCA AAA GCA TGT

TCA AC

GAG CAC AGC AAT GGA GGA AAC

AGC

VEGF TCA ACC CCT GAA TCC TGG AA AGC TGC ATG TTT GAT GGT GG

MMP-2 GCA ACC TCT TTG TGC TGA AGG ATG GTC ATG GTG TTC TGG

MMP-9 ATC ACG GAG GAA GCC AAT TG CGG ATC CTC AAA GGC TGA GGT

pAPN GAT TCC AGG ACC CTT CAG GAA TCA CGA TAT AGG CCA GCA GGT

c-jun CTT GAA AGC GCA AAA CTC CG TGC GTT AGC ATG AGT TGG CA

c-fos GAG AAA CGG AGA ATC CGA AGG GTT GAT CTG TCT CCG CTT GGA

18s GAG GTG AAA TTC TTG GAC CGG CGA ACC TCC GAC TTT CGT TCT


Tabelle 4 b: Länge und Schmelztemperatur der amplifizierten Produkte der Real-time PCR.

2.2.4.6 Auswertung der Real-time PCR-Ergebnisse

Das Prinzip, welches der durchgeführten Real-time PCR-Methode zugrunde

liegt, ist die relative Quantifizierung eines Zielgens im Vergleich zu einem Refe-

renzgen (House-keeping Gen). Pro Probe wurden je Real-time PCR und Primer

drei Vergleichswerte erstellt. Diese Werte ergaben als Einzelwerte keine quanti-

tative Aussage, deshalb musste ein mathematisches Modell benutzt werden,

um die Werte von dem Referenzgen mit den Werten der Zielgene in Beziehung

zu setzen. Zu diesem Zweck wurde das von Paffl (2001) beschriebene Berech-

nungsmodell eingesetzt. Als Referenzgen diente das 18s-Gen, da es sich hier-

bei um ein nicht-reguliertes, ubiquitär und homogen exprimiertes Gen handelt.

Mit Hilfe des Real-time PCR-Geräts werden Ct (threshold-cycle)-Werte gemes-

sen. Der Ct-Wert gibt genau den Zyklus an, an dem die gemessene Fluores-

zenz in der Probe, erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz an-

steigt.

Name Länge des Amplikons Tm Amplikon

Claudin-1 147 bp 78°C



Occludin 128 bp 80°C

ZO-2 110 bp 79°C

ZO-1 251 bp 77°C

VEGF 98 bp 77°C

MMP-2 97 bp 81°C

MMP-9 92 bp 82°C

pAPN 94 bp 81°C

c-jun 120 bp 81°C

c-fos 103 bp 82°C

18s 93 bp 79°C


Das von Pfaffl beschriebenen Modell arbeitet mit folgender Formel:

Vergleichend quantitativer Wert =

Erläuterung:

ΔCt Ziel: dies ist der ermittelte Ct-Wert des Zielgens der internen Kontroll-

probe, subtrahiert von dem Wert der Probe über die eine Aussage getrof-

fen werden soll.

ΔCt Ref.: hier handelt es sich um die Subtraktion der Ct-Werte des Refe-

renzgens (18s), wobei der Wert der internen Kontrollprobe von dem Wert

der Probe subtrahiert wird.

E Ziel : die relative Effizienz des Referenzgens (Referenzprimers).

E Prob.: die relative Effizienz des Zielgens (Zielprimer).

Die Effizienz der einzelnen Primer (Gene) wurde ermittelt, indem eine Verdün-

nungsreihe einer Probe mit definierten Konzentrationen angelegt wurde. Mit

Hilfe dieser Verdünnungen, welche in die Real-time PCR eingesetzt wurden,

konnte für jeden Primer eine Standardkurve erstellt werden.

Die Steigung der Standardkurve des jeweiligen Primers diente zu der Berech-

nung der Effizienz (E).

E = 10 (-1 / Steigung)

Somit wurde bei der Berechnung des quantitativ vergleichenden Endwerts die

Effizienz des jeweiligen Primers mit berücksichtigt.

Die Endwerte wurden mit Hilfe, der von Pfaffl entwickelten Software REST er-

mittelt. Mit Hilfe dieser Software wurden auch für jeden Primer die Signifikanzen

(p-Werte) zwischen den Kontrollwerten und den Werten der Zielgruppen be-

rechnet. Bei dieser Studie wurde die 5%-Schwelle für statistische Signifikanz

angewandt, die auf den Statistiker Fisher zurückgeht. (Fisher, 1973).

p-Wert ≤ 0,05 = signifikant p-Wert ≤ 0,01 = hoch signifikant

(E Ziel) ΔCt Ziel (Kontrolle – Ziel)

(E Ref.) ΔCt Ref. (Kontrolle – Ziel)


2.2.5 Histochemische Arbeitsmethoden

2.2.5.1 Anfertigung von Kryostatschnitten Von den mit elektromagnetischen Feldern behandelten Ratten wurden die Ge-

hirne und Augen entnommen. Während die Gehirne für die molekularbiologi-

schen Methoden aufgearbeitet wurden, sollte an den Augen der Einfluss der

Mikrowellen auf die Blut-Retina Schranke untersucht werden. Es sollte überprüft

werden, ob hier irgendwelche Änderungen unter den verschiedenen Feldinten-

sitäten zu erkennen waren.

Die Augen von jeweils einer Ratte wurden in einem Eppendorf-Cup gesammelte

und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Danach wurden sie im -80°C Gefrier-

schrank gelagert.

Für die Kryostatschnitte wurden die tiefgefrorenen Rattenaugen in Tissue-Tek

(Miles Elkhart/USA) eingebettet.

Die Gefrierschnitte erfolgten mit Hilfe des Kyostaten bei –20 bis -25°C. Die Ge-

webeschnitte, mit einer Schnittdicke von 14 µm, wurden auf runden 12 mm ∅

Deckgläschen aufgenommen, für ca. 10 min. bei 40°C auf einer Wärmeplatte

getrocknet, und anschließend in eine 12-well-Mikrotiterplatte überführt. So

konnten die Kryostatschnitte bis zur Immuninkubation bei –20 °C aufbewahrt

werden.

2.2.5.2 Indirekte Immunfluoreszenz-Methode Zur Charakterisierung der tight junction Komponenten in den isolierten Gefä-

ßen, kultivierten Endothelzellen und Gewebeschnitten der Retina wurde die Me-

thode der indirekten Immunfluoreszenz angewendet. Hierbei werden Antigen-

Antikörperkomplexe mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Zweitanti-

körpern sichtbar gemacht. Die kultivierten Zellen wurden zweimal kurz mit PBS

gewaschen und für 10 min. mit 100 % Ethanol bei RT fixiert. Alle weiteren Pro-

ben wurden tiefgefroren mit eiskaltem EtOH fixiert.

Die nachfolgenden Inkubationsschritte erfolgten für alle Proben bei RT. Nach

der Fixierung wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen. Unspezifische

Bindungsstellen der Präparate wurden mit Blockierungs-Puffer für 30 min abge-

deckt, welcher aus 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA, Merck) und 10 % Ziegen-


serum [normal goat serum (NGS)] in PBS bestand. Anschließend erfolgte über

Nacht die Immunmarkierung der Proben mit spezifischen primären Antikörpern

(siehe Tabelle 5). Bei Doppelimmunmarkierungen wurden zwei primäre Antikör-

per (monoklonale und polyklonale) gemeinsam inkubiert. Als Negativkontrolle

wurde statt des primären Antikörpers nur mit Blockierungs-Puffer inkubiert. An-

schließend wurde 3x je 5 min. mit einer PBS+ 0,1 % BSA-Lösung gewaschen

und danach für ca. 40 min. unter Lichtausschluss mit dem Fluoreszenzfarbstoff

gekoppelten sekundären Antikörper inkubiert. Bei Doppelmarkierungen erfolgte

die Inkubation mit beiden sekundären Antikörpern. Nach zweimaligem Waschen

für 10 min. und einmaligem Waschen für 15 min. mit PBS wurden die Proben

mit Antifade Gold Eindeckmittel (Molecular Probes) für die Immunfluoreszenz-

mikroskopie eingedeckt und haltbar gemacht.

Tabelle 5: Verdünnungen der primären und sekundären Antikörper

Monoklonale Antikörper Verdünnung Bezugsquelle

anti-„140 kDa“-Protein (pAP N) Pur Vatter (1989), Eigenprodukt.

Polyklonale Antikörper Verdünnung Bezugsquelle

anti-Claudin-1 1:100 Zymed / Invitrogen, Karlsruhe


anti-ZO-1 1:200 Zymed / Invitrogen, Karlsruhe

anti-ZO-2 1:100 Zymed / Invitrogen, Karlsruhe

anti- Occludin 1:200 Zymed / Invitrogen, Karlsruhe

Sekundäre Antikörper Verdünnung Bezugsquelle

Alexa (488) anti-rabbit-Alexa 1:1000 Molecular Probes / Invitrogen

Karlsruhe

Alexa (567) anti-mouse-Alexa 1:1000 Molecular Probes / Invitrogen

Karlsruhe


2.2.6 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden

2.2.6.1 Zellaufschluss a) Die isolierten Gehirngefäße eines Gehirns wurden für die Western Blot Expe-

rimente in 200 µl 1x Laemmliprobenpuffer lysiert. Um den Aufschluss der Zellen

zu erleichtern, wurden die Blutgefäße in dem Probenpuffer mit Hilfe einer 200 µl

Eppendorf Pipette mehrmals suspendiert.

b) Die Endothelzellkulturen wurden mit erwärmten (37°C) PBS gewaschen, in

150 µl 1x Laemmliprobenpuffer lysiert und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt.

Dann wurde die Proteinkonzentration bestimmt (siehe 2.2.6.2) und die Proben

direkt in die SDS-PAGE (siehe 2.2.7.3) eingesetzt oder bis zur Elektrophores

bei -20°C aufbewahrt.

2.2.6.2 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Die Konzentrationsbestimmung des Proteingehalts einer Lösung erfolgte durch

eine Farbreaktion mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue (Bradford 1976).

Anhand einer Kalibrierungsgeraden, die mit einer BSA-Standard-Lösung (1

µg/µl) erstellt wurde, konnten die Proteinkonzentrationen der Proben bestimmt

werden.

In Plastikküvetten wurden jeweils 1 µl der zu untersuchenden Proteinlösung mit

799 µl H2O und 200 µl Bradford-Lösung (Protein-Assay, Bio-Rad, München)

gemischt. Nach ca. 3 min wurde die Absorption dieser Lösung photometrisch

bei 595 nm gegen einen Leerwert ohne Protein (800 µl H2O und 200 µl Brad-

ford-Lösung) bestimmt. Das Spektralphotometer (Ultrospec 3000, Pharmacia

Biotch) berechnete anhand der gemessen Absorption und der gemessenen Ka-

librierungsgeraden direkt die Konzentration der Probe.

2.2.6.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western Blot Um die Proteine der oben genannten Proben entsprechend ihrer Molekülgröße

aufzutrennen wurde die Methode der Sodiumdodecylsulfat-

Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) angewendet (Shapiro et al.

1967). Dabei wurde ein von Laemmli eingeführtes SDS-haltiges, diskontinuierli-


ches Tris/ HCl/ Tris-Glycin Puffersystem eingesetzt um eine hohe Auflösung

und Bandenschärfe zu erreichen (Laemmli 1970).

Trenngel und Sammelgel wurden nach folgendem Schema zusammenpippe-

tiert:

Tabelle 6: Zusammensetzung der SDS-Gele

ausreichend für 2 Gele

(5,5 x 8,5 x0,1 cm)

Trenngel

(10% ig)

Sammelgel

(5% ig)

H2O 5,1 ml 2,9 ml

Tris pH-8,8 3,2 ml ---

Tris pH-6,8 --- 1,25 ml

30% Acrylamid 4,2 ml 833 µl

10% SDS 125 µl 50 µl

10% APS 100 µl 37,5 µl

TEMED 10 µl 7,5 µl

Für die Gelelektrophorese wurde die Apparatur Mini PROTEAN 3 (Electropho-

resis System, Bio-Rad, München) benutzt.

Die Proben (Proteingehalt 5-20 µg) wurden kurz vor der Elektrophorese für 5

min. bei 95°C aufgekocht, auf Eis abgekühlt, kurz abzentrifugiert und auf das

Gel aufgetragen. Zusätzlich wurden 7 µl Kaleidoskop-Marker (Bio-Rad) aufge-

tragen. Die Proteine liefen zuerst bei 100 V (20 min) in das Sammelgel ein,

dann erfolgte die Elektrophorese bei 150 V (1h).

Mit Hilfe des Elektroblotting (Western-Blotting) wurden die elektrophoretisch

aufgetrennten Proteine von dem Gel auf eine Nitrozellulose-Membran übertra-

gen. Der Transfer der Proteine erfolgte in der Blot-Apparatur (Tranblot SD, Se-

midryTranfer Cell, Bio-Rad, München) für 1h bei einem angelegten Strom von

160 mA bei zwei Gelen bzw. 90 mA bei einem Gel.

2.2.6.4 Immunologischer Nachweis der transferierten Proteinen Zur Sichtbarmachung spezifischer Proteinbanden auf den Nitrozellulosememb-

ranen wurde eine Immunreaktion nach folgendem Schema durchgeführt. Nach

dem Blottvorgang wurde die Nitrozellulosemembran für 1h bei RT in 0,5% iger

Blockade-Lösung (Roche) inkubiert. Danach wurde die Membran über Nacht


bei 4°C mit dem jeweiligen ersten Antikörper inkubiert (sieheTabelle 7), Ver-

dünnungen mit 0,2% Blockade-Lösung.

Tabelle 7: Verwendete Erst- und Zweitantikörper und Verdünnungen zum immunolo-

gischen Nachweis von Proteinen auf Membranen

Polyklonale Antikörper Verdünnung Bezugsquelle



anti- Occludin 1:1000 Zymed / Invitrogen, Karlsruhe

Monoklonale Antikörper Verdünnung Bezugsquelle

anti- β-Aktin 1:8000 Sigma-Aldrich, München

Zweitantikörper Verdünnung Bezugsquelle

Peroxidase konjugierter α-rabbit 1:8000 Jackson ImmunoResearch (Suf-

folk,GB)

Peroxidase konjugierter α-mouse 1:5000 Jackson ImmunoResearch (Suf-

folk,GB)

Danach erfolgte ein 3x 10-minütiges Waschen der Membran mit 1x PBS-T.

Zur Detektion der gebundenen ersten Antikörper wurde die „enhanced chemi-

luminescence“-Methode angewandt. Dazu wurde die Membran mit einem Pero-

xidase gekoppelten mono- bzw. polyklonalen Zweitantikörper für 1h bei RT in-

kubiert (Verdünnung siehe Tabelle 7). Nach 3x 10 minütigem Waschen in 1x

PBS-T wurde die Membran mit einem Gemisch aus gleichen Anteilen (1,5 ml)

Enhancer und Peroxidase ECL-Lösung (Super Signal West Pico Stable, Pierce)

inkubiert. Durch die nachfolgende Enzym-Substrat-Reaktion kam es zu einer

Emission von Licht und die Proteine konnten in der Dunkelkammer auf einem

Röntgenfilm (Hyperfilm, Amersham Biosciences) sichtbar gemacht werden.

Der für verschieden Zeiten (30 sec. – 25 min) belichtete Film wurde in die Ent-

wicklerlösung gelegt bis die Proteinbanden ausreichend zu sehen waren, dann

kurz mit Wasser gespült, für 5 min in eine Fixiererlösung getaucht, erneut mit

Wasser gespült und dann bei 50°C getrocknet.

Der belichtete Film wurde eingescannt (Arcus-Scanne, Agfa und Photoshop

7.0-Software) und in digitalisierter Form dargestellt.

3. Ergebnisse 49

3. Ergebnisse

3.1 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf Endothelzellen der BHS

Dieser Abschnitt des Versuchsvorhabens diente der Untersuchung von inflam-

matorischen Faktoren auf die tight junction Formation der zerebralen Endothel-

zellen.

Mit Hilfe der Real-time PCR- Mehtode wurden vergleichend quantitative Aussa-

gen zur transkribierten mRNA von verschiedenen Komponenten der tight juncti-

on der Blut-Hirn-Schranke gemacht werden.

3.1.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der ze-rebralen Endothelzellen in vitro

Bei diesem Versuch wurden drei bzw. vier Tage alte primäre Ratten-

Endothelzellkulturen (siehe 2.2.1) für 24h bzw. 4h mit dem Zytokin Interleukin-

1β (IL-1β) im Kulturmedium inkubiert. Hierbei handelt es sich um einen endoge-

nen Faktor, der von Makrophagen, Mikrogliazellen und T-und B-Zellen in der

Inflammationsphase sezerniert wird.

Die Zugabe von IL-1 β sollte in diesem Versuchsansatz einen Entzündungspro-

zess simulieren. Es wurden zwei verschiedene Konzentrationen des Zytokins

eingesetzt, die mit 500 U/ml einem physiologisch bei Entzündungspozessen

vorkommenden Wert und mit 5000 U/ml einer erhöhten stimulierenden Dosis

entsprachen. Unter diesen induzierten inflammatorischen Bedingungen wurde

die Expression von tight junction Komponenten der zerebralen Endothelzellen

untersucht.

Die nachfolgenden Grafiken zeigen die Ergebnisse der Real-time PCR-

Auswertung zur Expression der tight junction Gene Claudin-1, -5 und -11, Occ-

ludin, ZO-1 und ZO-2 unter Wirkung von Il-1β. Die Rohdaten wurden mit dem

Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer) ermittelt und in die von Pfaffl ent-

wickelte Software (REST-version 2, M.W. Pfaffl und G.W. Horgan 2001, 2002)

eingesetzt. Die Genexpression der Endothelzellen, welche für 4h (Abb.11 a + b)

bzw. 24h (Abb.12 a + b) mit 500 U IL-1β/ml (2. Säulengruppe, Abb. 11 a + b; 12

3. Ergebnisse 50

a + b) bzw. mit 5000 U IL-1β/ml (3.Säulengruppe, Abb. 11 a + b; 12 a + b) be-

handelt worden sind, wurden mit der mit PBS behandelten Kontrollgruppe (1.

Säulengruppe, Abb. 11 a + b; 12 a + b) verglichen. Dabei wurden den mit PBS

behandelten Endothelzellen unabhängig von dem benutzten Primer der Wert 1

zugeschreiben. War der Endwert einer mit Il-1β behandelten Kultur kleiner als

1, bedeutete dies, dass die Transkription der mRNA des untersuchten tight

junction-Gens im Vergleich zu der Transkription dieses Gens in den Kontrollkul-

turen (mit PBS behandelte Endothelzellkulturen) erniedrigt war. Ein größerer

Endwert als 1 wies auf eine erhöhte Gentranskription in der untersuchten Kultur

im Vergleich zu der Transkription dieses Gens in den Kontrollkulturen hin.

Es wurden drei unabhängige Versuche (n=3) durchgeführt die in den folgenden

Diagrammen zusammengefasst sind.

Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in zerebralen Endo-

thelzellen die für 4h mit IL-1β inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Kontrolle 500U IL-1β 4h 5000U IL-1β 4h

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

n.s. p=0,48

Abb. 11 a: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von

Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die für

4h mit zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. Die

Expressionsraten der untersuchten tight junction Gene zeigen leichte Veränderungen, die je-

doch nicht signifikant sind.

3. Ergebnisse 51

Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in zerebralen Endothelzellen die

für 4h mit IL-1β inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Kontrolle 500U IL-1β 4h 5000U IL-1β 4h

Rat

ioOccludin

ZO-1

ZO-2

n.s. p=0,302n.s. p=0,259

Abb. 11 b: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von

Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die für 4h mit zwei

verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. In den mit 5000

U/ml inkubierten Endothelzellkulturen zeigen die Expressionen von Occludin und ZO-2 eine

Abnahme um ca. 20%, die jedoch nicht signifikant sind.

Tabelle 8: Endwerte der Real-time PCR und p-Werte [ermittelt mit der REST-Software

(siehe 2.2.4.6)] der Endothelzellkulturen welche für 4h mit IL-1β inkubiert wurden

Endos + PBS Endos + 500U Il-1β Endos + 5000U Il-1β Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert

Claudin-1 1,00 0,805 0,268 0,967 0,887

Claudin-5 1,00 1,245 0,480 0,921 0,801

Claudin-11 1,00 0,994 0,990 0,770 0,604

Occludin 1,00 1,109 0,625 0,793 0,302

ZO-1 1,00 1,024 0,968 1,125 0,838

ZO-2 1,00 1,085 0,687 0,762 0,259

3. Ergebnisse 52

Bei dem Vergleich der Expressionen der unterschiedlichen Gene sind geringe

Änderungen der Werte zu erkennen. Keines der untersuchten Gene zeigt je-

doch eine signifikant erhöhte oder erniedrigte Expressionsrate nach Auswer-

tung mit der REST-Software. Daher muß davon ausgegangen werden, dass es

sich bei den in Abbildung 11 a und b dargestellten Werten um physiologische

Schwankungen der Genexpression handelt und eine vierstündige Behandlung

der Endothelzellkulturen mit 500U bzw. 5000U IL-1β pro ml Medium keine signi-

fikanten Expressionänderungen der untersuchten Gene zeigen.


thelzellen die für 24h mit IL-1β inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Kontrolle 500 U IL1β 4h 5000 U IL-1β 4h

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

*** p=0,001

*** p=0,001


Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die

für 24h mit zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden.

Die Expressionsrate von Claudin-5 ist signifikant um ca. 75% (500 U/ml IL-1β) bzw. um 70 %

(5000 U/ml IL-1β) erniedrigt. Claudin-1 und Claudin-11 weisen keine Veränderungen bzw. ge-

ringe nicht signifikante Erniedrigungen ihrer Genexpressionen auf.

3. Ergebnisse 53



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Kontrolle 500 U IL1β 4h 5000 U IL-1β 4h

Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2*** p=0,001

*** p=0,001*** p=0,001 *** p=0,001

n.s. p=0,094


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die für 24h mit

zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. Die Ex-

pressionsrate von Occludin ist in den mit 500 U/ml IL-1β und in den mit 5000 U/ml IL-1β inku-

bierten Endothelzellkulturen um ca. 70% erniedrigt, während ZO-1 in den mit 500 U/ml IL-1β

behandelten Kulturen ein signifikante Verringerung um 37% und in den mit 5000 U/ml behan-

delten Kulturen eine signifikante Erniedrigung um 42% zeigt. Die gemessenen Verrringerungen

in der Genexpression von ZO-2 sind nicht signifikant.

3. Ergebnisse 54

Tabelle 9: Endwerte der Real-time PCR und p-Werte [ermittelt mit der REST-Software

(siehe 2.2.4.6)] der Endothelzellkulturen, welche für 24h mit IL-1β inkubiert wurden

Endos +

PBS

Endos + 500U Il-1β Endos + 5000U Il-1β

Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert

Claudin-1 1,00 0,918 0,751 0,990 0,974

Claudin-5 1,00 0,247 0,001 0,308 0,001

Claudin-11 1,00 1,003 0,987 0,967 0,871

Occludin 1,00 0,309 0,001 0,295 0,001

ZO-1 1,00 0,633 0,001 0,585 0,001

ZO-2 1,00 0,779 0,094 0,916 0,590

Die mRNA-Expressionen von Claudin-5, Occludin und ZO-1 zeigen in diesen

Versuchen eine signifikante Abnahme nach 24h für Claudin-5 und Occludin um

60-70% im Vergleich zur Kontrollgruppe, für ZO-1 um 37% bei einer Dosis von

500 U IL-1β/ml bzw. 42% bei einer Dosis von 5000 U IL-1β/ml im Vergleich zur

Kontrollgruppe. Dies lässt auf eine Herabsetzung der Aktivität dieser Gene

schließen.

Zusammenfassend lässt sich für die Versuche der IL-1β Wirkung auf die tight

junction-Formation der zerebralen Endothelzellen feststellen, dass eine 4-

stündige Inkubationszeit keine signifikanten Expressionsänderungen der unter-

suchten Gene zeigt. Eine 24-stündige Inkubation der kultivierten Endothelzellen

bewirkt dosisabhängig bei 500 U IL-1 β/ml bzw. 5000 U IL-1β/ml eine signifikan-

te Erniedrigung der Genexpressionsraten von Claudin-5, Occludin und ZO-1.

Die Variationen innerhalb der mRNA-Expressionen der anderen untersuchten

Gene, sind nicht signifikant und stellen physiologisch auftretende Schwankun-

gen dar.

3. Ergebnisse 55

3.1.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine der zerebra-len Endothelzellen in vitro

Bei diesen Versuchen wurde ein weiterer Entzündungsmediator eingesetzt um

eine inflammatorische Situation zu simulieren. Dazu wurden, wie für die Inkuba-

tion mit IL-1β beschrieben, drei bzw. vier Tage kultivierte zerebrale Endothelzel-

len für 4h bzw. 24h mit dem exogenen Faktor Lipopolysaccharid inkubiert. LPS

ist eine Komponente der äußeren Zellwand von gram-negativen Bakterien. Das

hier benutzte LPS stammte von E.coli Bakterien. Es stimuliert die Bildung vieler

inflammatorisch wirkender endogener Zytokine, wie TNF-α, Il-1β, Il-6, Il-8 (Guha

und Mackman, 2000)

Auch in diesen Versuchen wurden, wie oben beschrieben (siehe 2.2.3.1), zwei

verschiedene Konzentrationen (100 ng/ml und 1 µg/ml) des Entzündungsmedia-

tors eingesetzt. Die Genexpressionen der mit 100 ng LPS/ml (2. Säulengruppe)

bzw. mit 1 µg LPS/ml (3. Säulengruppe) behandelten primären Endothelzellkul-

turen wurden mit den Kontrollkulturen (1. Säulengruppe) verglichen, welche nur

mit PBS inkubiert wurden.

Im Gegensatz zu den für 4h mit IL-1β behandelten Endothelzellen zeigte sich in

diesem Versuch schon nach 4h eine signifikante Erniedrigung der Genexpres-

sionen von Claudin-5 und Occludin. Dieses Ergebnis lässt sich damit erklären,

dass es sich bei LPS im Gegensatz zu IL-1β um einen sehr potenten Entzün-

dungsmediator handelt. Dabei kann LPS eine Reaktionskaskade auslösen, die

zur Ausschüttung weiterer pro-inflammatorisch wirkender Zytokine führt. Diese

Potenzierung des LPS führt in den durchgeführten Versuchen bereits nach 4h

Inkubationszeit zu einer signifikanten Expressionsänderung der tight junction-

Komponenten. Die Abnahme der mRNA-Expression von Claudin-5 liegt durch-

schnittlich bei 55%, die von Occludin bei 45% (mit p-Werten ≤ 0,001). Die er-

niedrigte Genexpressionsrate von Claudin-5 und Occludin lässt sich mit einer

erhöhten LPS-Dosis von 1 µg/ml noch weiter absenken.Die mRNA-Expression

von ZO-1 zeigt bei 100ng/ml LPS eine Erniedrigung um 30%, bei 1 µg LPS ist

aber nur eine Erniedrigung der Expression um 15% zu messen. Bei diesem

Gen und auch bei den übrigen untersuchten Genen sind die ermittelten Verän-

derungen jedoch nicht signifikant. Es handelt sich hierbei um natürliche

Schwankungen der Genexpressionen

3. Ergebnisse 56


thelzellen die für 4h mit LPS inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Kontrolle 100 ng LPS 4h 1 µg LPS 4h

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11*** p=0,001

*** p=0,001

n.s. p=0,209


Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für

4h mit zwei verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die

Genexpression von Claudin-5 ist signifikant um 51% (100 ng/ml LPS) bzw. um 57% (1 µg/ml

LPS) verringert. In den mit 1 µg/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen weisen die Expressi-

onsraten von Claudin-1 (ca. 28%) und Claudin-11 (ca. 47%) erhöhte Expressionsraten auf, die

jedoch nicht signifikant sind.

3. Ergebnisse 57


für 4h mit LPS inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

*** p=0,001

*** p=0,001

n.s. p = 0,604


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für 4h mit zwei

verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. In den mit 100

ng/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen konnte für Occludin eine signifikante Abnahme der

Expressionsrate um 48% ermittelt werden, die gemessene Abnahme der Expression von ZO-1

um ca. 30% ist dagegen nicht signifikant. Die Genexpression von Occludin ist in den mit 1 µg/ml

LPS inkubierten Endothelzellen signifikant um ca. 47% erniedrigt.

Tabelle 10: Endwerte der mit der Real-time PCR ermittelten Daten und p-Werte [ermit-

telt mit der REST-Software (siehe 2.2.4.6)] von den Endothelzellkulturen, welche für 4h

mit LPS inkubiert wurden.

Endos + PBS Endos + 100ng LPS Endos + 1µg LPS


Claudin-1 1,00 1,038 0,785 1,288 0,209

Claudin-5 1,00 0,486 0,001 0,427 0,001

Claudin-11 1,00 0,783 0,511 1,470 0,645

Occludin 1,00 0,580 0,001 0,534 0,001

ZO-1 1,00 0,693 0,604 0,847 0,752

ZO-2 1,00 1,103 0,783 0,870 0,677

3. Ergebnisse 58


thelzellen die für 24h mit LPS inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

*** p=0,003

* p=0,039 *** p=0,001

n.s. p=0,696


Claudin-1, Claudin-5, und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für

24h mit zwei verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die

Expressionsrate des Claudin-1 Gens ist in den mit 100 ng/ml LPS inkubierten Endothelzellkultu-

ren signifikant um 48% und in den mit 1 µg/ml LPS inkubierten Kulturen signifikant um 56%

erniedrigt. In den mit 100 ng/ml LPS behandelten Kulturen konnte für die Verringerung der

Claudin-5 Expression um 29% und die Steigerung der Claudin-11 Expression um 19% keine

Signifikanz ermittelt werden. Die verringerte Expressionsrate von Claudin-5 um 57% in den mit

1 µg/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen ist jedoch signifikant.

3. Ergebnisse 59



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

*** p=0,001*** p=0,001

n.s. p=0,097


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4) die für 24h mit zwei

verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die Expressions-

raten für Occludin sind in den mit LPS inkubierten Endothelzellkulturen signifikant um 48% (100

ng/ml LPS) bzw. um 72% (1µg/ml LPS) erniedrigt. Die Genexpression von ZO-2 weist nicht

signifikante Verringerungen um 14% (100 ng/ml LPS) bzw. um 35% (1µg/ml) auf.


telt mit der REST-Software (siehe 2.2.4.6)] von den Endothelzellkulturen welche für

24h mit LPS inkubiert wurden

Endos + PBS Endos + 100ng LPS Endos + 1µg LPS


Claudin-1 1,00 0,521 0,039 0,438 0,003

Claudin-5 1,00 0,711 0,099 0,425 0,001

Claudin-11 1,00 1,193 0,696 0,888 0,758

Occludin 1,00 0,524 0,001 0,281 0,001

ZO-1 1,00 1,035 0,857 1,018 0,927

ZO-2 1,00 0,859 0,409 0,646 0,097

3. Ergebnisse 60

Auch hier zeigte sich eine Verminderung der mRNA Expressionsrate von Clau-

din-5 und Occludin und zusätzlich von Claudin-1. Im Gegensatz zu den 24h mit

hoher Dosis IL-1β behandelten Endothelzellen kann bei den mit LPS behandel-

ten Endothelzellen ein stärkeres Absinken der Genexpression der oben ge-

nannten Gene beobachtet werden, wenn eine höhere Dosis LPS (1µg/ml) ein-

gesetzt wird.

Die statistische Auswertung zeigt, dass die mRNA-Expressionsrate von Clau-

din-5 nach Inkubation mit 100 ng/ml LPS nicht signifikant erniedrigt ist, obwohl

bereits in Diagramm 7 eine erniedrigte Expressionsrate zu erkennen ist. Nach

der Gabe von 1 µg/ml LPS ist die veränderte Expressionsrate signifikant.

Auch Claudin-1 zeigt in diesem Versuchsansatz eine signifikante Erniedrigung

der Genexpression. Dieses Ergebnis war bei einer Inkubation mit IL-1β weder

nach 4– noch nach 24-Stunden zu beobachten. Die mRNA-Expression von

Claudin-1 wird in den durchgeführten Versuchen nur bei 24-stündiger Inkubati-

on der Endothelzellen mit dem Entzündungsmediator LPS beeinflusst.

3.2 Darstellung der Proteinexpressionen

3.2.1 Western-Blots und Immunzytochemie zerebraler Endo-thelzellkulturen

Wie oben beschrieben (siehe 3.1.1) zeigte sich bei den zerebralen Endothel-

zellkulturen die für 4h und 24h mit LPS und für 24h mit IL-1β behandelt wurden

eine Erniedrigung der Expressionsrate der Gene für Occludin und Claudin-5.

Für diese tight junction-Komponenten wurde im Folgenden die Proteinexpressi-

on mit Hilfe der Western Blot-Methode und der Immunzytochemie untersucht.

3.2.1.1 Proteinexpressionen der mit IL-1β behandelten Endothelzellkultu-ren für 24 h Immunoblot Mit Hilfe der beschriebenen Western-Blot Methode (siehe 2.6.3) wurden die

Proteine der mit IL-1β inkubierten Endothelzellen auf eine Nitrozellulosememb-

ran transferiert und die Proteine Claudin-5 und Occludin mittels spezifischer An-

3. Ergebnisse 61

tikörper sichtbar gemacht. Als Kontrolle (K) dienten Endothelzellkulturen, die

unter denselben Versuchsbedingungen gehalten, aber nicht mit IL-1β behandelt

wurden. Für die Untersuchung von der Claudin-5 wurden 6 µg, für Occludin 5

µg Gesamtprotein auf das SDS-Gel geladen.

Proteinexpression in für 24h mit IL-1β inkubierten Endothelzellkulturen

K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 500 U = Kulturen + 24h 500U/ml IL-1β

5000 U = Kulturen + 24h 5000 U/ml IL-1β

Abb. 15: Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 24h mit IL-1 β

inkubierten Endothelzellen (a), (b) zeigt die β-Aktinexpression der untersuchten Kulturen, die

zur Kontrolle der eingesetzten Proteinmenge untersucht wurde. Für Claudin-5 wurde eine Ge-

samtproteinmenge von 8 µg pro Tasche (12,5%iges SDS-Gel) und für Occludin eine Gesamt-

proteinmenge von 5 µg pro Tasche (10%iges SDS-Gel) aufgetragen.

In Abbildung 15 sind die Proteinexpressionen von Claudin-5 und Occludin in

Endothelzellkulturen dargestellt, welche mit 500 U/ml IL-1β und 5000 U/ml IL-1β

für 24h bzw. mit PBS als Kontrollgruppe behandelt wurden. Die Proteinbande

von Claudin-5 verläuft bei 22 kDa, die von Occludin bei 65 kDa. Die Auftren-

nung der Proteine erfolgte für Claudin-5 über ein 12,5%iges SDS-Gel, während

bei Occludin die Auftrennung über ein 10%iges SDS-Gel durchgeführt wurde.

Claudin-5 ist dabei bei einer Dosis von 5000 U/ml IL-1β nicht mehr nachweis-

bar, während bei einer Dosis von 500 U/ml IL-1β keine Veränderung in der Pro-

teinexpression im Vergleich zur Kontrollgruppe sichtbar ist.

K 500U 5000U

(a)

(b)

Claudin-5 kD 22

K 500U 5000U

Occludin kD 65 51

3. Ergebnisse 62

Occludin zeigt im Immunoblot eine konzentrationsabhängige Abnahme der Pro-

teinexpression.

Immunfluoreszenz Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmethode an zerebralen Endothelzellkulturen der

Ratte wurde die Proteinexpressionsvon Claudin-5 und Occludin nach Behand-

lung der Kulturen für 24h mit IL-1β untersucht.

Expression von Occludin und Claudin-5 in zerebralen Endothelzellen die für 24h

mit IL-1β inkubiert wurden

Abb. 16: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung der tight junction Proteine Claudin-5 und

Occludin in Endothelzellkulturen der Ratte, die für 24h mit IL-1β (5000 U/ml) inkubiert wurden.

Mit Hilfe der Immunfluoreszenz waren keine Unterschiede in der Expression

von Occludin und Claudin-5 im Verhältnis zur Kontrollkultur nachweisbar. Diese

Beobachtung wurde sowohl bei einer Behandlung mit 500 U/ml als auch mit

5000 U/ml IL-1β gemacht.

Occludin

Claudin-5

Kontrolle Il-1β 5000U

3. Ergebnisse 63

3.2.1.2 Proteinexpressionen der mit LPS behandelten Endothelzellkultu-ren für 4h und 24h Immunoblot

Aufgrund der Real-time PCR Ergebnisse der Endothelzellkulturen nach Be-

handlung mit LPS für 4h und 24h wurde mit diesen Proben auch eine Western-

Blot-Analyse durchgeführt.

In der nachfoldenden Abbildung 14 sind die Expressionen der tight junction Pro-

teine Occludin und Claudin-5 in den für 4h mit LPS (100 ng bzw 1µg/ml) inku-

bierten Endothelzellkulturen dargestellt, im Vergleich zu den Kontrollkulturen

(K), die nur mit PBS inkubiert wurden. Zur Untersuchung von Claudin-5 wurden

8 µg, zur Untersuchung von Occludin 5 µg Gesamtprotein auf das SDS Gel ge-

laden.

Claudin-5 zeigt in der Westernblot-Analyse nach Behandlung der Endothelzell-

kulturen mit 100 ng/ml LPS für 4h eine ausgeprägte Proteinbande bei 22 kDa

ähnlich wie die Kontrollgruppe, die nur mit PBS behandelt wurde.

Nach der Behandlung der Endothelzellkulutren mit 1 µg/ml LPS ist dagegen die

Proteinexpression von Claudin-5 nur noch als schwache Bande sichtbar (Abb.

17)

Die Proteinexpression von Occludin zeigt ähnlich wie Claudin-5 in den mit PBS

und den mit 100 ng/ml LPS behandelten Endothelzellkulturen eine starke Aus-

prägung der Proteinbanden. Die für 4h mit 1µg LPS inkubierten Endothelzellkul-

turen zeigen dagegen eine schwächere Proteinbande, d.h. eine verminderte

Proteinexpression ist die Folge der Behandlung der Kulturen mit einer hohen

Dosis an LPS. Die Abnahme der Poteinexpression von Occludin ist aber nicht

so stark ausgeprägt wie die von Claudin-5.

Die unterschiedliche Ausprägung der Proteinbanden für Claudin-5 und Occludin

beruhte auf der unterschiedlichen Sensitivität der Antikörper und auf verschie-

den langen Expositionszeiten während der Belichtung des Röntgenfilms (5-10

min für Claudin-5 und 30 sec.-1 min für Occludin).

3. Ergebnisse 64

Proteinexpression in für 4h mit LPS inkubierten zerebralen Endothelzellen

K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 100 ng = Kulturen + 4h 100 ng/ml LPS

1 µg = Kulturen + 4h 1 µg/ml LPS

Abb. 17: (a) Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 4h mit LPS

inkubierten Endothelzellkulturen der Ratte im Vergleich zur Kontrollkultur (K), (b) zeigt die Akti-

nexpression der untersuchten Kulturen. Die auf das 12,5%ige SDS-Gel aufgetragene Gesamt-

proteinmenge betrug für Claudin-5 8 µg pro Tasche, für Occludin (10%iges SDS-Gel) 4 ug pro

Tasche.

kD 22

kD 65 51

Occludin Claudin-5

K 100 ng 1 µg K 100 ng 1 µg

(a) (b)

3. Ergebnisse 65

Die Proteinexpressionen von Claudin-5 und Occludin wurden auch in für 24h

mit LPS inkubierten Endothelzellkulturen untersucht.

Proteinexpression in für 24h mit LPS inkubierten zerebralen Endothelzellen

K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 100 ng = Kulturen + 24h 100 ng/ml LPS

1 µg = Kulturen + 24h 1 µg/ml LPS

Abb. 18: (a) Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 24h mit LPS

(100 ng/ml und 1 µg/ml) inkubierten Endothelzellkulturen der Ratte im Vergleich zur Kontrollkul-

tur (K), (b) zeigt die Aktinexpression der untersuchten Kulturen. Für Claudin-5 als auch für Occ-

ludin wurde pro Tasche eine Gesamtproteinmenge von 5 µg/ml aufgetragen.

Auf das SDS-Gel wurde eine Gesamtproteinmenge von 5 µg pro Tasche, für

alle verwendeten Proben aufgetragen. Die Proteinbanden von Claudin-5 sind im

Immunoblot schwächer ausgeprägt als die von Occludin, aber auch hier ist die

Proteinexpression von Claudin-5 in den mit 100 ng/ml und 1µg/ml LPS behan-

delten Endothelzellkulturen weiter herunterreguliert, wie an den Banden ersicht-

lich (Abb. 18 (a)).

Die Proteinexpression von Occludin zeigt im Immunoblot eine vom Entzün-

dungsmediator konzentrationsabhängige Abnahme (siehe Abb. 18 (a))

kD 22

kD 65 51 40

K 100 ng 1 µg

K 100 ng 1 µg

(a) (b)

3. Ergebnisse 66

3.3 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf die Gen-expression von tight-junction-Komponenten isolierter BHS-Mikrogefäße (ex vivo)

Ziel dieses Versuchabschnitts war der Vergleich der Genexpressionen ver-

schiedener tight junction-Komponenten kultivierter Endothelzellen (in vitro) und

isolierter BBB-Mikrogefäße aus dem Gehirn der Ratte (ex vivo) unter inflamma-

torischen Bedingungen. Dazu wurden isolierte Mikrogefäße mit den gleichen

Entzündungsmediatoren und unter denselben Bedingungen inkubiert, wie zuvor

(3.1.1 und 3.1.2) für die zerbralen Endothelzellkulturen beschrieben.

3.3.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der iso-

lierter BHS-Mikrogefäße (ex vivo)

Bei diesem Versuchsabschnitt wurden aus Rattengehirnen isolierte Mikrogefä-

ße in ACSF aufgenommen und mit 500 U/ml bzw. 5000 U/ml des Entzün-

dungsmediators IL-1β für 4h bzw. 24h inkubiert. Nach Inkubation der Mikroge-

fäße in dieser Lösung war eine RNA-Isolation möglich. Wurden die Gefäße da-

gegen in RBE-Medium wie die Endothzellkulturen gehalten, konnte keine RNA

isoliert werden. Die Expressionen der verschiedenen tight-junction-Gene wur-

den mittels Real-time PCR-Methode ermittelt.

3. Ergebnisse 67

Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehirn-

gefäßen, die für 4h mit IL-1β inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Kontrolle 500 U IL-1β 4h 5000 U IL-1β 4h

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

n.s. p=0,385

n.s. p=0,085n.s. p=0,089


Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte (n = 4), die für 4h mit

zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. In den iso-

lierten Gefäßen die mit 500 U/ml IL-1β inkubiert wurden sind die Expressionsraten von Claudin-

1 (um ca. 29%) und Claudin-11 (um ca. 22%) gesteigert, in den mit 5000U/ml behandelten Mik-

rogefäßen konnte eine um ca. 42% erhöhte Expression von Claudin-1 gemessen werden. Die

gemessenen Expressionsänderungen sind jedoch nicht signifikant.

Die Gene von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 zeigen in isolierten IL-1β

behandelten Mikrogefäßen keine signifikante Änderung der Expressionsrate.

Jedoch ist auffällig, dass die Expression von Claudin-1 bei hoher Dosis IL-1β

um ca. 40% ansteigt.

3. Ergebnisse 68

Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen, die


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

n.s. p=0,385


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte (n = 4), die für 4h mit zwei ver-

schiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. Die Expressionen

von Occludin, ZO-1 und ZO-2 weisen in isolierten Gehirngefäßen die mit 500 U/ml IL-1β inku-

biert wurden keine Veränderungen auf. In mit 5000 U/ml behandelten Mikrogefäßen ist die Ex-

pressionsrate von Occludin um ca. 23% erniedrigt, während die Genexpression von ZO-2 um

ca. 12 % erhöht ist, diese Veränderungen sind jedoch nicht signifikant.

Bei einer eingesetzten Dosis von 5000 U/ml IL-1β weist das Expressionslevel

von Occludin eine Erniedrigung um ca. 25% auf, während bei ZO-2 eine Erhö-

hung um ca. 15% zu erkennen ist, beide Veränderungen sind jedoch statistisch

nicht signifikant.

3. Ergebnisse 69


telt mit der REST-Software (siehe 2.2.4.6)] von den isolierten Gehirngefäßen der Ratte,

welche für 4h mit IL-1β inkubiert wurden.

Endos +

PBS

isol. Gehirngefäße +

500 U IL-1β


5000U Il-1β


Claudin-1 1,00 1,288 0,089 1,423 0,095

Claudin-5 1,00 1,014 0,967 0,970 0,918

Claudin-11 1,00 1,216 0,314 1,075 0,707

Occludin 1,00 1,018 0,913 0,767 0,385

ZO-1 1,00 1,010 0,970 0,963 0,889

ZO-2 1,00 0,986 0,968 1,122 0,767


gefäßen, die für 24h mit IL-1β inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

n.s. p=0,324n.s. p=0,184

n.s. p=0,213

n.s. p=0,259


Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte (n = 4), die für 24h

mit zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. Die

Expressionsrate von Claudin-5 weist eine Erniedrigung um 28% (500 U/ml IL-1β) und um 21%

(5000 U/ml IL-1β) auf. Für Claudin-11 konnte auch eine verminderte Genexpression von durch-

schnittlich 20% in den mit 500 U/ml und 5000 U/ml behandelten Mikrogefäßen ermittelt werden.

Allerdings sind die gemessenen Veränderungen nicht signifikant.

3. Ergebnisse 70

Auch die Verminderung der Genexpressionen von Claudin-5 (um 20-30%) und

Claudin-11 (um ca. 20%), bei Inkubationen mit 500 U/ml und 5000 U/ml IL-1β

für 24h, weisen in den isolierten Gehirngefäßen keine Signifikanz auf. Das

Claudin-1 Gen weist keine signifikante Änderung der Expressionsrate auf.



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

n.s. p=0,514


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte, die für 24h mit zwei verschie-

denen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. In den mit 500 U/ml IL-1β

inkubierten Mikrogefäßen wurden für Occludin, ZO-1 ZO-2 geringe nicht signifikante Erhöhun-

gen der Expressionen gemessen. Die Expressionsrate von ZO-1 ist in den mit 5000 U/ml be-

handelten isolierten Gehirngefäßen um ca. 39% angestiegen, dieser Anstieg ist jedoch nicht

signifikant.

Die Expressionsraten der Gene Occludin, ZO-1 und ZO-2 weisen in den für 24h

mit IL-1β behandelten isolierten Mikrogefäßen geringfügige nicht signifikante

Erhöhungen auf. Einzig die Genexpression von Occludin ist in den für 24h mit

5000 U/ml inkubierten Gehirngefäßen um 40% angestiegen, hierfür konnte je-

doch auch keine statistische Signifikanz ermittelt werden.

n = 4

3. Ergebnisse 71



welche für 24h mit IL-1β inkubiert wurden.

Endos +

PBS


500 U IL-1β


5000U Il-1β


Claudin-1 1,00 0,959 0,908 1,031 0,932

Claudin-5 1,00 0,720 0,213 0,789 0,324

Claudin-11 1,00 0,772 0,184 0,808 0,259

Occludin 1,00 1,058 0,747 1,101 0,566

ZO-1 1,00 1,062 0,925 1,389 0,514

ZO-2 1,00 1,118 0,630 1,047 0,857

3. Ergebnisse 72

3.3.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine isolierter Mikrogefäße (ex vivo)

Isolierte Mikrogefäße aus Rattengehirnen wurden mit dem Entzündungsmedia-

tor LPS für 4h bzw. für 24h mit Konzentrationen von 100 ng/ml und 1 µg/ml in-

kubiert (siehe 2.2.3.1). Die Expressionen von verschiednen tight junction Genen

wurden auch hier mittels der Real-time PCR-Methode ermittelt.


gefäßen, die für 4h mit LPS inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11


Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehringefäßen der Ratte (n =4), die für 4h mit

zwei verschiedenen Konzentrationen LPS (100ng/ml und 1µg/ml) behandelt wurden. Die Ex-

pressionsrate von Claudin-1 ist in den mit 100 ng/ml LPS inkubierten isolierten Mikrogefäßen

nicht verändert, während die Expressionen der weiteren untersuchten tight junction-Gene in

den mit LPS behandelten Mikrogefäßen Verringerungen um bis zu 10% aufwiesen, die jedoch

nicht signifikant waren.

Verglichen mit der Kontrollgruppe zeigen die Genexpressionen von Claudin-1,

Claudin-5 und Claudin-11, in den mit 100 ng/ml und 1 µg/ml inkubierten Mikro-

gefäßen nach 4h eine geringe, nicht signifikante Verminderung der Expressi-

onsrate.

3. Ergebnisse 73



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

ioOccludin

ZO-1

ZO-2

n.s. p=0,786 n.s. p=0,635

n.s. p=0,521

Abb 21b: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von

Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte (n = 4), die für 4h mit zwei ver-

schiedenen Konzentrationen LPS (100ng/ml und 1µg/ml) behandelt wurden. ZO-2 weist ernied-

rigte Expressionsraten um ca. 19 % (100 ng/ml LPS) bzw. um ca. 14% (1 µg/ml LPS) auf, diese

Veränderungen sind jedoch nicht signifikant. Ebenso ist die um ca. 12% erhöhte Expression

von ZO-1 in den mit 1 µg/ml inkubierten isolierten Mikrogefäßen nicht signifikant.

Die für 4h mit LPS inkubierten, isolierten Gehirngefäße zeigen nicht signifikante

Schwankungen der Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2. In den mit

100 ng/ml inkubierten Mikrogefäßen (2. Säulengruppe, Diagramm 14) sind da-

bei die Expressionsraten von ZO-1 und ZO-2 (ca. 20%) leicht erniedrigt, wäh-

rend die Expression von Occludin geringfügig erhöht ist. In den mit 1 µg/ml in-

kubierten Gehirngefäßen (3. Säulengruppe, Diagramm 14) sind die Expressi-

onslevel von Occludin (um ca. 4%) und ZO-2 (um ca. 14%) vermindert und die

Genexpression von ZO-1 (um ca. 12%) ist erhöht.

3. Ergebnisse 74



welche für 4h mit LPS inkubiert wurden.

Endos +

PBS


100 ng LPS


1 µg LPS


Claudin-1 1,00 0,998 0,996 0,903 0,776 Claudin-5 1,00 0,948 0,879 0,954 0,895 Claudin-11 1,00 0,927 0,792 0,880 0,668 Occludin 1,00 1,050 0,903 0,958 0,911 ZO-1 1,00 0,983 0,968 1,123 0,786 ZO-2 1,00 0,815 0,521 0,862 0,635 Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehirn-

gefäßen, die für 24h mit LPS inkubiert wurden

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

n.s. p=0,713

n.s. p=0,573n.s. p=0,273

Abb 22 a: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von

Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte, die für 24h mit zwei

verschiedenen Konzentrationen LPS (100ng/ml und 1µg/ml) behandelt wurden. In den mit 1 µg

LPS inkubierten isolierten Gehirngefäßen wurden gesteigerte Expressionsraten von Claudin-1

(um 39%), Claudin-5 (um 15,5%) und Claudin-11 (um ca. 15%) gemessen, diese Veränderun-

gen sind jedoch nicht signifikant. Auch die gesteigerte Genexpression von Claudin-5 (um 29%)

in den mit 100 ng/ml LPS behandelten Mikrogefäßen ist nicht signifikant

3. Ergebnisse 75

In den für 24h mit 100 ng/ml LPS inkubierten Mikrogefäßen sind die Ge-

nexpressionen von Claudin-1 und Claudin-11 verglichen mit der Kontrollgruppe

herunterreguliert, während Claudin-5 eine erhöhte Expression um ca. 30%

zeigt, diese Genexpressionsveränderungen sind jedoch nicht signifikant. Eben-

so sind die Steigerungen der Genexpression von Claudin-1 (um ca. 38%),

Claudin-5 (um ca. 16%) und Claudin-11 (um ca. 15%) in den mit 1 µg/ml LPS

inkubierten Mikrogefäßen statistisch nicht signifikant.



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

n.s. p=0,446

n.s. p=0,616


Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen der Ratte, die für 24h mit zwei verschie-

denen Konzentrationen LPS (100ng/ml und 1µg/ml) behandelt wurden. In den mit 100 ng/ml

LPS inkubierten isolierten Mikrogefäßen sind die erhöhten Expressionsraten von Occludin (um

ca. 25%), von ZO-1 (um 44%) und von ZO-2 (um ca. 13%) nicht signifikant. Die Genexpressio-

nen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in den mit 1 µg/ml LPS behandelten Gehirngefäßen weisen

kaum meßbare Veränderungen auf.

3. Ergebnisse 76

Die erhöhten Expressionsraten von Occludin (um ca. 25%), ZO-1 (um ca. 44%)

und ZO-2 (um ca. 13%) in den für 24h mit 100 ng/ml inkubierten Gehirngefäßen

sind nicht signifikant. In den mit 1 µg/ml behandelten Mikrogefäßen zeigen Occ-

ludin und ZO-2 eine verminderte Genexpression, während die Expression von

ZO-1 leicht erhöht ist. Auch diese gemessenen Veränderungen sind nicht signi-

fikant.

Tabelle 15: Endwerte der mit der Real-time PCR ermittelten Daten und p-Werte (ermit-

telt mit der REST-Software (siehe 3.1.1)) von den isolierten Gehirngefäßen der Ratte,

welche für 24h mit LPS inkubiert wurden.

Endos +

PBS


100 ng LPS


1 µg LPS


Claudin-1 1,00 0,839 0,713 1,386 0,273 Claudin-5 1,00 1,289 0,573 1,155 0,757 Claudin-11 1,00 0,929 0,844 1,147 0,724 Occludin 1,00 1,248 0,616 0,942 0,885 ZO-1 1,00 1,439 0,446 1,050 0,862 ZO-2 1,00 1,132 0,720 0,922 0,850

3. Ergebnisse 77

3.4 Ergebnisse zur lokalen Exposition von Rattenge-hirnen mit UMTS Mikrowellen

Dieser Versuch wurde wie schon im Abschnitt Material und Methoden, be-

schrieben in einen Vorversuch und einen Hauptversuch gegliedert. Mit Hilfe des

Vorversuchs mußten die SAR-Werte im Gehirn der Ratten festgelegt werden,

die im Hauptversuch Verwendung fanden. Hierbei war es wichtig, dass es bei

der Exposition nicht zu einer Temperaturerhöhung kam, so konnten thermische

Effekte durch die Bestrahlung ausgeschlossen werden. In den Vorversuchen

wurden dazu Temperaturmessungen im Gehirn der Ratten mit verschiedenen

elektrischen Leistungen durchgeführt.

3.4.1 Ergebnisse der Vorversuche Die Vorversuche fanden in enger Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Theo-

retische Elektrotechnik der Bergischen Universität Wuppertal statt, um genaue

Berechnungen für die neu konzipierte Anlage erstellen zu können.

Es ist unvermeidbar, dass das elektrische Feld von der Körperoberfläche der

Ratten reflektiert wird. Aufgrund dieser Reflexion ist der Quotient zwischen der

elektrischen Feldstärke innerhalb der Wellenleitung und dem Kopf der Ratten

sehr hoch. Dennoch wird aufgrund der hohen Feldstärke zwischen den Holm-

strukturen ein elektrisches Expositionsfeld von mehr als 250V/m innerhalb des

Rattenkopfes bei einer eingespeisten Leistung von 1W erreicht.

Mit Hilfe von vorausgegangenen Berechnungen der Arbeitsgruppe von Prof.

Hansen (A. El Ouardi et al., 2006) an einem fiktiven Wistar-Rattenmodell konnte

die Verteilung des elektrischen Feldes über den gesamten Rattenkörper be-

rechnet werden. Hierbei wurde berücksichtigt, dass die Ratte in einer Plastik-

röhre mit dem Kopf unter dem Holmpaar saß, zwischen dem das Feld geführt

wurde. Abb. 23 zeigt die berechnete Feldausbreitung über den Rattenkörper (A.

El Ouardi et al., 2006). Das elektrische Feld konzentriert sich auf den Kopf der

Ratte und hier vor allem auf die Region des Gehirns. Die Einwirkung des Feldes

auf übrige Körperbereiche war sehr gering, bzw. gar nicht vorhanden.

3. Ergebnisse 78

Errechnete Feldausbreitung im anatomischen Tiermodell

Abb. 23: Numerisch berechnete Feldausbreitung auf der Basis eines anatomischen

Rattenmodells. (A. El Ouardi, A. Bitz, J. Streckert Lehrstuhl für elektromagnetische

Theorie, Universität Wuppertal) (A. El Ouardi et al., 2006)

3. Ergebnisse 79

In der Abbildung 24 sind die numerisch berechneten Verteilungen der SAR-

Werte innerhalb des Rattenmodells in logarithmischem (a) und linearem (b)

Maßstab dargestellt. Die computergestützte Voraus-Berechnungen ergaben

einen SAR-Wert von 8,12 W/kg bei einer eingespeisten Energie von 1,4 W, da-

bei wurde von einem Gehirnvolumen von 2,3 g ausgegangen. Auch bei diesen

Darstellungen ist ersichtlich, dass die wesentliche Absorption des elektromag-

netischen Feldes in der zentralen Region des Kopfes stattfindet.

SAR-Wert Verteilung im Rattenmodell

Abb. 24: Numerisch berechnete SAR-Wert Verteilung (a) logarithmisch, (b) linear (A.

El Ouardi, A. Bitz, J. Streckert Lehrstuhl für elektromagnetische Theorie, Universität

Wuppertal)

(a)

(b)

3. Ergebnisse 80

Weitere Vorausberechnungen wurden mit Hilfe der Bio-Wärme Gleichung ge-

macht. Hiermit können Aussagen über die Temperaturverteilungen in verschie-

denen Geweben bei lokaler Exposition von Versuchstieren getroffen werden.

Diese Gleichung gibt Auskunft über die lokale Wärmeverteilung bezogen auf die

Wärmeisolation und die Wärmeleitfähigkeit innerhalb verschiedener Arten von

Geweben. Abbildung 25 stellt die mit der Bio-Wärme Gleichung berechnete

Temperaturdifferenz zwischen exponiertem und nicht-exponiertem Gehirnge-

webe dar. Dabei wird von einer Umgebungstemperatur von 24°C und einer Kö-

pertemperatur von 37°C ausgegangen. Die einzuspeisende maximale Leistung

betrug bei dieser Rechnung 1,4 W und es wurde ein Temperaturanstieg von

0,3°C ermittelt.

Berechnete Temperaturverteilung im Rattenmodell

Abb. 25: Temperaturdifferenz zwischen exponiertem und nicht exponiertem Gehirnge-

webe bei einer eingespeisten Leistung von 1,4 W (A. El Ouardi, A. Bitz, J. Streckert

Lehrstuhl für elektromagnetische Theorie, Universität Wuppertal)

Die oben beschriebenen theoretischen Ergebnisse stellen in erster Linie Richt-

werte dar, die in den durchgeführten Vorversuchen am Rattenkörper verifiziert

werden mussten. Dazu wurden gleichzeitig mit der Exposition im elektromagne-

tischen Feld Temperaturmessungen im Gehirn von Rattenkadavern bzw. narko-

tisierten Ratten durchgeführt. Diese Messungen sind in Abb. 26 und Abb. 27

dargestellt.

0.41 0.31 0.2 0.1 0

Tem

pera

turd

iffer

enz

in °C

3. Ergebnisse 81

Temperaturmessungen an Rattenkadavern

Abb. 26: Verläufe von Temperaturmessungen in toten Ratten, bei einer eingespeis-

ten Leistung (Pin) von 1,4 W (a) bzw. bei einer eingespeisten Leistung von 0,7 W (b).

Bei einer eingespeisten Leistung von 1,4 W ergab sich eine durchschnittliche Tempe-

raturerhöhung von 2,16 °C, während für 0,7 W ein durchschnittlicher Temperaturan-

stieg von 0,85°C gemessen wurde.

(a)

Pin = 1.4 W n = 6 SAR = 7.75 W/kg ± 18 % ΔT = 2.16 °C ± 10 %

RF off RF on RF off

Pin = 0.7 W n = 3 SAR = 3.9 W/kg ± 23 % ΔT = 0.85 °C ± 21 %

(b)

3. Ergebnisse 82

In Abbildung 26 ist ein Beispiel eines gemessen Temperaturverlaufs im Gehirn

einer toten Ratte (ohne Blutzirkulation), bei einer eingespeisten Leistung von

1,4 W dargestellt. Es ist deutlich, dass nach Anschalten des elektromagneti-

schen Feldes [RF-(radio-frequency)] Feld) die Temperatur im Gehirngewebe bis

zu einem Plateauwert anstieg. Nach Erreichen des Plateauwerts wurde das RF-

Feld abgesschaltet. Unmittelbar nach Abschalten des Feldes sank die Tempe-

ratur wieder ab, bis sie den Anfangswert erreichte. Anhand der Steigung der

Temperaturkurve konnte der SAR-Wert bei dieser Leistung ermittelt werden. Er

betrug im Durchschnitt 7,75 W/kg, bei einem durchschnittlichen Temperaturan-

stieg von 2,16°C. Abb. 26 (b) zeigt den Temperaturverlauf im Gehirn einer toten

Ratte bei einer eingespeisten Leistung von 0,7W. Der durchschnittliche SAR-

Wert lag bei 3,9 W/kg, bei einem durchschnittlichen Temperaturanstieg von

0,85°C.

3. Ergebnisse 83

Temperaturmessungen im Gehirn narkotisierter Ratten

Abb. 27: Temperaturmessungen im Gehirn von 3 narkotisierten Ratten bei Exposition

mit einer Leistung (Pin) von 1,4 W (a) und 0,7 W (b) über einen Zeitraum von 15-20

min. Bei einer eingespeisten Leistung von 1,4 W lagen die gemessenen Temperatur-

anstiege zwischen 0,2 und 0,4°C, während sie bei einer Leistung von 0,7 W zwischen

0,05 und 0,2 °C lagen.

(a)

Pin = 1.4 W n = 3 SAR = 7.75 W/kg ± 18 % ΔT = 0.2 – 0.4 °C

(b)

RF on

RF on

Pin = 0.7 W n = 4 SAR = 3.9 W/kg ± 23 % ΔT = 0.05 – 0.2 °C

3. Ergebnisse 84

Abb. 27 zeigt die Temperaturverläufe von drei narkotisierten Ratten während

der Exposition im elektromagnetischen Feld. Auffällig ist, dass bei einer einge-

speisten Leistung von 1,4 W (Abb. 27 (a)) die Temperatur im Gehirn der Ratte

nur um maximal 0,4 °C anstieg und bei einer Leistung von 0,7 W (Abb.27(b))

der Temperaturanstieg nur bei maximal 0,2 °C lag.

Dieser Unterschied im Temperaturverhalten zwischen totem und narkotisiertem

Tier beruht auf dem Vorhandensein einer intakten Blutzirkulation beim lebenden

Tier. Der Blutkreislauf garantiert einen schnellen Wärmeaustausch im Gehirn-

gewebe. Des Weiteren war bei den Temperaturmessungen an den narkotisier-

ten Tieren ersichtlich, dass die Temperaturantwort von der Narkosetiefe abhing,

die bei jedem Tier individuell unterschiedlich ansprach. Die Narkose beeinflusst

die Regulation der Körpertemperatur und mit abnehmender Narkosetiefe stieg

die Temperatur des Gehirngewebes wieder kontinuierlich an.

In der nachfolgenden Tabelle 12 sind die Vorversuchsergebnisse der Tempera-

turmessungen an den Rattenkadavern und an den narkotisierten Tieren zu-

sammengefasst und die daraus resultierenden Parameter für die Hauptversu-

che dargestellt.

Tabelle 16: Zusammenfassung der Vorversuchsergebnisse zur Ermittlung der SAR-

Werte und daraus resultierende Parameter für die Hauptversuche (verändert nach

A.Bitz)

Tierkadaver narkotisierte Ratte Hauptversuch

Eingespeiste Leistung

1,4 W 0,7 W 1,4 W 0,7 W 1,8 W 0,36 W

SAR Brain (Messung)

7,75 W/kg ± 18%

3,9 W/kg ± 23%

__ __ 10 W/kg 2 W/kg

SAR Brain (num. Berechnung)

8,2 W/kg 4,1 W/kg 8,2 W/kg 4,1 W/kg __ __

ΔT (Messung) 2,16°C ± 10%

0,82 ± 21%

0,2 -0,4°C

0,05 – 0,2°C

? ?

ΔT (Rechnung) __ __ 0,3°C __ __ __

Die aus den Vorversuchen errechneten Expositionsparameter waren so ge-

wählt, dass ein thermischer Effekt durch die Bestrahlung auszuschließen war.

Ein Temperaturanstieg um 0,5 °C wie er in den Vorversuchen bei einer einge-

3. Ergebnisse 85

speisten Leistung von 1,4 W ermittelt wurde, liegt im physiologischen Schwan-

kungsbereich der Körpertemperatur der Ratte.

Als hohe Dosis wurde im Hauptversuch eine eingespeisten Leistung von 1,8 W

benutzt, die einem SAR-Wert von 10 W/kg entsprach, als niedrige Dosis wurde

eine Leistung von 0,36 W gewählt mit einem SAR-Wert von 2 W/kg. In den

Hauptversuchen waren die Ratten während des Expositionszeitraums nicht nar-

kotisiert und die Thermoregulation der Ratten nicht eingeschränkt. Somit wurde

bei diesen Tieren ein noch geringer Temperaturanstieg auch bei einem SAR-

Wert von 10 W/kg erwartet. Allerdings konnte der Temperaturanstieg im Gehirn

nicht-narkotisierter Ratten aus ethischen Gründen nicht überprüft werden.

3.4.2 Ergebnisse der Hauptversuche In den Hauptversuchen sollte der Einfluss von elektromagnetischer Strahlung

auf die Genexpression verschiedener Komponenten der Blut-Hirn Schranke

ermittelt werden. Dazu wurden männliche Ratten für zwei Stunden mit 0 W/kg

(Stress-Kontrolle), 2 W/kg, bzw. 10 W/kg (siehe Tabelle 4 Expositionsschema,

Material + Methoden) exponiert. Als Referenztiere dienten außerdem Ratten

aus Käfighaltung gleichen Alters und gleichen Geschlechts, die nicht in die Ex-

positionsanlage gebracht wurden, so dass der Stressfaktor der Röhrenhaltung

auszuschließen war. Es wurden ausschließlich männliche Tiere gewählt, um

Körpertemperaturschwankungen während des weiblichen Östrus zu vermeiden.

Aus den Gehirnen der exponierten und der sham-exponierten Ratten, sowie der

Referenztiere wurden die Mikrogefäße isoliert (siehe 2.3.1). Aus der RNA dieser

Mikrogefäße wurde in mehreren Schritten c-DNA hergestellt, welche mit ver-

schiedenen Primern in die Real-time PCR eingesetzt wurde (siehe 2.5.5).

Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen die RNA-Expression für verschiedene

Blut-Hirn Schranken Komponenten. Bei diesen Komponenten handelt es sich

zum einen um tight junction Bestandteile der Endothelzellen, wie Claudin-1, -5,

-11, Occludin, ZO-1 und ZO-2, wie sie bereits an Endothelzellkulturen in vitro

untersucht wurden, zum anderen wurden Faktoren untersucht die sowohl von

Endothelzellen als auch Perizyten gebildet werden und eine wichtige Rolle bei

der Aufrechterhaltung einer intakten BHS spielen, dazu zählen VEGF, MMP-2

3. Ergebnisse 86

und MMP-9, sowie das perizytäre Enzym (pAPN). Des Weiteren wurden als

Stressindikatoren die m-RNA-Expressionen von c-fos und c-jun- Genen unter-

sucht. Diese Gene gehören zu der Gruppe der Protoonkogene, sogenannte

„early-response“-Gene, die bei Stress, Zellwachstum und Zellvermehrung akti-

viert werden und auch vermehrt in transformierten Zellen exprimiert werden.

In Diagramm 9 sind die Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Clau-

din-11 in den mit UMTS-Feldern exponierten Gehirngefäßen dargestellt. Die

verschiedenen Säulengruppen zeigen folgende m-RNA Expressionen der ze-

rebralen Mikrogefäße der Ratten: Käfigkontrolle, sham-exponiert (0 W/kg), 2

W/kg exponiert und 10 W/kg exponiert. Wie oben beschrieben (siehe 3.1.1)

wurden die ermittelten Rohdaten (ct-Werte) mit Hilfe der REST-Software aus-

gewertet, die gleichzeitig die Signifikanzen zwischen den untersuchten Gruppen

errechnet.

Die Säulengruppe der Käfigkontrolle dient wie in den Zellkulturversuchen be-

schrieben als Referenzgruppe und hat bei allen untersuchten Primern den Wert

1. Werte unter 1 weisen auf eine Verminderung der Expression, Werte über 1

auf eine Erhöhung der Expression des jeweiligen Gens im Verhältnis zur Refe-

renzgruppe hin. Die m-RNA Expressionsraten von Claudin-5 und Claudin-11

zeigen in diesem Versuch (Abb. 28 a) eine Erniedrigung in den Gruppen der

sham-exponierten, sowie der mit 2 W/kg und 10 W/kg exponierten Tiere. Diese

Änderungen sind jedoch nicht signifikant.

Die Genexpressionsrate von Claudin-1 in der mit 0 W/kg (3,515) und 2 W/kg

(3,47) exponierten Gruppen zeigt dagegen eine 250 %ige und eine ca. 540%

ige Erhöhung in der mit 10 W/kg exponierten Gruppe (6,393) im Vergleich zur

Käfigkontrolle. Auch der Vergleich zwischen den m-RNA Expressionen der

sham–exponierten und der 2 W/kg exponierten Tieren mit der Gruppe der 10

W/kg exponierten Tiere zeigt eine signifikante Erhöhung der Claudin-1 m-RNA

in der zuletzt genannten Gruppe.

3. Ergebnisse 87

Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 an der BHS in

mit einem UMTS-Feld exponierten Ratten

0

1

2

3

4

5

6

7

Käfigkontrolle Mess. 0 W/kg Mess. 2 W/kg Mess. 10 W/kg

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

*** p=0,001

*** p=0,001

*** p=0,001

*** p=0,005*** p=0,006


Claudin-1, -5 und -11 in den Gehirngefäßen der Ratten (n = 12), die mit UMTS-Feldern expo-

nierten wurden. Für Claudin-1 konnten signifikant erhöhte Genexpressionen in den nicht-

exponierten (0 W/kg, um 251%), den mit 2 W/kg (um 247%) und den mit 10 W/kg(um 539%) -

exponierten Ratten im Vergleich zur Käfigkontrolle gemessen werden. Dabei ist die Genexpres-

sion in den mit 10 W/kg exponierten Tieren signifikant erhöht im Vergleich zu den sham-und

den mit 2 W/kg exponierten Ratten. Die Expressionsraten von Claudin-5 und Claudin-11 weisen

geringe nicht signifikante Verminderungen auf.

3. Ergebnisse 88

Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 an der BHS von mit einem

UMTS-Feld exponierten Ratten

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2


Occludin, ZO-1, ZO-2 in den Gehirngefäßen der Ratten (n = 12) die mit UMTS-Feldern expo-

nierten wurden. Die Expressionsraten von Occludin, ZO-1 und ZO-2 sind in den exponierten

Gruppen, sowie in der sham-exponierten Gruppe erniedrigt (genaue Werte siehe Tabelle 17),

diese Veränderungen sind jedoch nicht signifikant.

Für die Gene von Occludin, ZO-1 und ZO-2 zeigen sich in diesem Versuchsan-

satz (Abb. 28 b) zwar geringe Abnahmen der Genexpressionen, sie sind jedoch

nicht signifikant.

3. Ergebnisse 89

Genexpressionen von VEGF, MMP-2, MMP-9 und pAPN an der BHS von

mit einem UMTS-Feld exponierten Ratten

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


Rat

io

VEGF

MMP 2

MMP 9

pAPN

Abb. 28 c: Darstellung der der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte

von VEGF, MMP 2, MMP 9 und pAPN in den Gehirngefäßen der Ratten (n = 12) die mit UMTS-

Feldern exponierten wurden. Die Genexpressionen von VEGF, MMP-9 und pAPN sind in den

mit 0 W/kg, den mir 2 W/kg und den mit 10 W/kg exponierten Ratten nicht signifikant erniedrigt

(siehe Tabelle 17). Die Expressionsrate von MMP-2 zeigt in den sham- als auch in den mit 2

W/kg exponierten Gruppen kaum Veränderungen, während sie in der mit 10 W/kg exponierten

Gruppe um ca. 20% erhöht ist, wobei diese Erhöhung nicht signifikant ist.

Abbildung 28 c gibt im selben Versuchsansatz die Genexpressionsraten für

VEGF, MMP-2, MMP-9 und pAPN wieder. Die Genexpression von MMP-2 zeigt

einen Anstieg bei den mit 10 W/kg exponierten Tieren. Diese Tendenz einer

erhöhten Genexpression bei erhöhter Strahlendosis ist jedoch nicht signifikant.

Für die Gene von VEGF, MMP-9 und pAPN ist in allen Expositionsgruppen eine

nicht signifikante Verringerung der m-RNA Expressionsrate ermittelt worden.

3. Ergebnisse 90

Genexpressionen von c-jun und c-fos an der BHS von mit einem UMTS-

Feld exponierten Ratten

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


Rat

io

c-jun

c-fos

Abb 28 d: Darstellung der der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte

von c-jun und c-fos in den Gehirngefäßen der Ratten (n = 12) die mit UMTS-Feldern exponier-

ten wurden. Beide Protoonkogene weisen in den sham- als auch in den mit 2 W/kg exponierten

Ratten eine Verminderung ihrer Expression auf, während ihre Genexpressionsrate in den mit 10

W/kg exponierten Tieren erhöht ist (genaue Werte siehe Tabelle 17). Die gemessenen Verän-

derungen der Protoonkogene sind jedoch nicht signifikant.

Die Genexpressionen der Protoonkogene c-jun und c-fos (Abb. 28 d) zeigen

unbestrahlt bzw. stressbedingt ein Absinken der m-RNA-Expressionsrate und

mit zunehmender Strahlenbelastung einen Anstieg in der Expressionsrate bei-

der Protoonkogene. Diese Änderungen sind jedoch nicht signifikant.

3. Ergebnisse 91


telt mit der REST-Software ( siehe 2.2.4.6 )] der untersuchten Genexpressionen in den

Expositionsgruppen.

Käfigkontrolle 0 W/kg 2 W/kg 10 W/kg

Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert Endwert p-Wert

Claudin-1 1,00 3,515 0,001 3,47 0,001 6,393 0,001 Claudin-5 1,00 0,928 0,622 0,937 0,69 0,954 0,808

Claudin-11 1,00 0,96 0,742 0,884 0,407 0,82 0,227

Occludin 1,00 0,854 0,295 0,716 0,069 0,883 0,567

ZO-1 1,00 0,724 0,499 0,628 0,393 0,762 0,587

ZO-2 1,00 0,81 0,114 0,727 0,112 0,741 0,231

VEGF 1,00 0,751 0,088 0,671 0,078 0,704 0,228

MMP 2 1,00 0,991 0,958 1,052 0,84 1,211 0,443

MMP 9 1,00 0,802 0,298 0,658 0,104 0,678 0,119

pAPN 1,00 0,78 0,278 0,721 0,286 0,801 0,583

c-jun 1,00 0,767 0,364 0,724 0,229 1,152 0,559

c-fos 1,00 0,801 0,631 0,895 0,801 1,099 0,843

In Tabelle 12 sind zusammenfassend die mit Hilfe der REST-Software ermittel-

ten Expressionswerte der verschiedenen Gene und die errechneten p-Werte,

die Auskunft über die Signifikanz zwischen der Käfigkontrolle und den weiteren

Expositionsgruppen geben, dargestellt.

3.5 Expression von tight junction Genen in isolierten Gehirngefäße im elektromagnetischen Feld

Die Real-time PCR-Auswertung der isolierten zerebralen Mikrogefäße ersuch-

sanlage in Münster exponiert wurden (siehe 2.5), erfolgte in unserem Bochumer

Labor. Die RNA-Ausbeute der isolierten Gehirngefäße von 11/2 Gehirnen war

hierbei so gering, dass die Gehirngefäße von 2 Proben zusammengegeben we-

rden mussten um eine ausreichende Menge RNA für die nachfolgenden Ver-

suchsschritte zu erhalten. Die Auswertung der Real-time PCR Ergebnisse er-

folgte wie in Kapitel 3.1.1 beschrieben mit Hilfe der REST-Software.

3. Ergebnisse 92

In den nachfolgenden Diagrammen sind die Genexpressionen der tight junction

Komponenten Claudin-1, -5 und -11, Occludin, ZO-1 und ZO-2 dieses ex-vivo

Versuchsabschnittes dargestellt.

Die Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Versuchen ermittelt, wobei pro

Versuch die RNA-Transkription von isolierten Gehirngefäßen aus drei Gehirnen

gepoolt und gemittelt wurde.

Genexpression von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten Ge-

hirngefäßen nach Exposition im elektromagnetischen Feld

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Mikrogefäße sham-exponiert Mikrogefäße exponiert

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

* p= 0,026


Claudin-1, Claudin-5, und Claudin-11 in isolierten Mikrogefäßen der Rattengehirne (n = 3), die

im elektrischen Feld exponiert (1,8 W/kg) bzw. sham exponiert (0W/kg) wurden. Die Expressi-

onsrate von Claudin-11 ist in den mit 1,8 W/kg exponierten Gehingefäßen signifikant um 169%

erhöht. Claudin-1 und Claudin-5 weisen in den exponierten zerebralen Mikrogefäßen erhöhte

Expressionen um 35% bzw. 30% auf, die jedoch nicht signifikant sind.

Die sham-exponierten isolierten Gehirngefäße stellen die Referenzgruppe dar,

die bei allen untersuchten Primern den Wert 1 trägt. Die Genexpressionsrate

von Claudin-11 zeigt in den Mikrowellen-exponierten Mikrogefäßen einen signi-

fikanten Anstieg um mehr als 150% (Abb. 29 a).

3. Ergebnisse 93

Die Expressionsraten von Claudin-1 und Claudin-5 zeigen in den exponierten

Mikrogefäßen ebenfalls einen Anstieg, der jedoch nicht signifikant ist.

Genexpression von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefäßen

nach Exposition im elektromagnetischen Feld

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Mikrogefäße sham-exponiert Mikrogefäße exponiert

Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

*** p= 0,007


Occludin, ZO-1, und ZO-2 in isolierten Mikrogefäßen der Rattengehirne (n = 3), die im elektri-

schen Feld exponiert (1,8 W/kg) bzw. sham exponiert (0 W/kg) wurden. Für die Genexpression

von Occludin konnte in den exponierten isolierten Gehirngefäßen eine signifikante Erhöhung

um ca. 220% gemessen werden. Die verminderte Expressionsrate von ZO-2 ist nicht signifi-

kant.

In den ex-vivo Mikrowellen-exponierten Gehirngefäßen ist die Genexpression

von Occludin im Vergleich zu den sham-exponierten Gehirngefäßen signifikant

um mehr als 200% erhöht. Die Expression des ZO-1 Gens zeigt keine Verände-

rung, während bei der Genexpression von ZO-2 eine nicht signifikante Erniedri-

gung zu erkennen ist.

3. Ergebnisse 94



exponierten isolierten Mikrogefäßen

Mikrogefäße

sham-exponiert

Mikrogefäße

exponiert

Endwert Endwert p-Wert

Claudin-1 1,00 1,348 0,702 Claudin-5 1,00 1,3 0,412 Claudin-11 1,00 2,688 0,026 Occludin 1,00 3,19 0,007 ZO-1 1,00 1,005 0,996 ZO-2 1,00 0,759 0,502 Als Kontrollversuch zu den ex-vivo Versuchen im elektromagnetischen Feld

wurden neben den sham-exponierten Gehirngefäßen auch isolierte Gehirnge-

fäße eingesetzt, die für 8h bei 42°C im CO2-Inkubator hyperthermisch behan-

delt wurden. Dieser Versuch sollte die thermischen Einflüsse auf die tight junc-

tion-Gene bei einer defekten BHS zeigen. Hierzu wurde eine weitere Kontroll-

gruppe untersucht, die für 8h bei 37°C inkubiert wurde und in der Auswertung

mit dem Wert 1 festgelegt wurde (1. Säulengruppe, Abb. 30a und b).

3. Ergebnisse 95

Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in isolierten

Gehirngefäßen unter Hyperthermie (positiv Kontroll)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Kontrolle 37°C 42 °C

Rat

io

Claudin-1

Claudin-5

Claudin-11

*** p=0,003


Claudin-1, Claudin-5, und Claudin-11 in isolierten Mikrogefäßen von Rattengehirnen (n = 3), die

bei 37 °C (Kontrolle) bzw. 42°C inkubiert wurden. Die Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-

5 und Claudin-11 weisen alle, in den bei 42°C inkubierten Gehinrgefäßen eine Erniedrigung auf,

allerdings ist nur die um 60% verminderte Expressionsrate von Claudin-5 signifikant.

Die Genexpressionen der Kontrollgruppe wurden mit denen bei 42°C inkubier-

ten, isolierten Mikrogefäßen verglichen (2. Säulengruppe, Abb. 30 a und b). Die

Genexpression von Claudin-5 (Abb. 30 a) ist hierbei signifikant um 60% ernied-

rigt. Die Gene Claudin-1 und Claudin-11 zeigen Erniedrigungen ihrer Expressi-

onsraten um 30% bzw. 15%, die jedoch nicht signifikant sind.

3. Ergebnisse 96

Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in isolierten Gehirngefä-

ßen unter Hyperthermie (positiv Kontroll)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Kontrolle 37°C 42 °C

Rat

io

Occludin

ZO-1

ZO-2

*** p=0,001


Occludin, ZO-1, und ZO-2 in isolierten Mikrogefäßen von Rattengehirnen (n = 3), die bei 37°C

(Kontrolle) bzw. 42°C inkubiert wurden. Die Expressionsrate von ZO-1 ist in den hypertherm

behandelten Mikrogefäßen signifikant um 67% vermindert. Occludin und ZO-2 zeigen auch

erniedrigte Expressionen, die jedoch nicht signifikant sind.

Die Expression des ZO-1 Gens weist in den bei 42°C inkubierten isolierten Ge-

hirngefäßen eine signifikante Erniedrigung um 67%, im Vergleich zu der Kon-

trollgruppe auf. Bei den Genexpressionen von Occludin und ZO-2 ist die ver-

minderte Expressionsrate nicht signifikant.

3. Ergebnisse 97



exponierten isolierten Mikrogefäßen

Mikrogefäße

Kontrolle, 37°C

Mikrogefäße

hyperthermisch behandelt, 42°C

Endwert Endwert p-Wert

Claudin-1 1,00 0,709 0,22 Claudin-5 1,00 0,407 0,003 Claudin-11 1,00 0,861 0,491 Occludin 1,00 0,932 0,833 ZO-1 1,00 0,324 0,001 ZO-2 1,00 0,719 0,137

3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse

Versuch Ergebnis in vitro Modell

Kultivierte Endothelzellen für 4h

mit IL-1β inkubiert

Keine signifikanten Änderungen der Ge-

nexpressionen von Claudin-1, Claudin-5,

Claudin-11, Occludin, ZO-1 und ZO-2.


mit IL-1β inkubiert.

Signifikante Erniedrigung der Genexpres-

sion von Claudin-5, Occludin und ZO-1.

Verminderte Proteinexpressionen von

Claudin-5 und Occludin.


mit LPS inkubiert

Signifikant erniedrigte Expressionen von

Claudin-5 und Occludin, sowohl auf Gen-

als auch auf Proteinebene.


mit LPS inkubiert

Signifikant verringerte Genexpressionraten

von Claudin-1, Claudin-5 und Occludin.

Verminderte Proteinexpression von Clau-

din-5 und Occludin.

3. Ergebnisse 98

ex vivo Modell

Isolierte Gehirngefäße für 4h mit

IL-1β behandelt


IL-1β inkubiertt


LPS behandelt


LPS inkubiert

Keine signifikanten Veränderungen in den

Genexpressionsraten von Claudin-1,

Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1,

ZO-2


elektromagnetischem Feld (SAR:

1,8 W/kg) exponiert

Signifikante Erhöhung der Genexpression

von Claudin-11 und Occludin.

in vivo Modell

Die Gehirne von Ratten wurden für

2h mit elektromagnetischer Strah-

lung (UMTS 2,1 GHz) exponiert.

SAR-Werte 0 W/kg (sham-

exponiert), 2 W/kg, 10 W/kg.

Signifikante Erhöhung der Genexpression

von Claudin-1 bei sham-exponierten, den

mit 2 W/kg und mit 10 W/kg exponierten

Ratten. Die mit 10 W/kg exponierten Tiere

zeigen verglichen mit den 2 W/kg und 0

W/kg exponierten Ratten eine signifikant

um mehr als das Doppelte erhöhte Ex-

pressionsrate. Keine signifikante Verände-

rungen der Geneexpressionen von Clau-

din-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1, ZO-2,

VEGF, MMP-2, MMP-9, pAPN, c-jun und

c-fos.

4. Diskussion 99

4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung chemischer und physikalischer

Einflüsse auf die Funktion der BHS in vivo und in vitro untersucht. Hierbei wur-

den in erster Linie die tight junction-Komponenten der zerebralen Endothelzel-

len analysiert, aber auch andere charakteristische BHS-Komponenten, wie Me-

talloproteinasen und das perizytäre BHS-spezifische Enzym pAPN.

4.1 Expressionen von tight junction-Komponenten in Endothelzellkulturen und BHS-Mikrogefäßen un-ter inflammatorischen Bedingungen

In diesem zuerst durchgeführten Versuchsabschnitt wurden inflammatorische

Effekte auf die tight junction-Formation in vitro und ex vivo untersucht.

Die Wirkung von zwei Entzündungsmediatoren, IL-1β und LPS, wurde an pri-

mären Endothelzellkulturen und an isolierten zerebralen Mikrogefäßen der Rat-

te dargestellt und die Genexpressionen und Proteinexpressionen verschiedener

tight junction-Komponenten verglichen.

Die Endothelzellkulturen, welche für 4h und 24h mit LPS und für 24h mit IL-1β

inkubiert wurden zeigten für die Expressionen von Claudin-5 und Occludin eine

Abnahme der Genprodukte. Nach 4-stündiger Inkubation mit IL-1β zeigten sich

allerdings keine Expressionsänderungen der untersuchten tight junction-Gene.

Dieses Ergebnis kann damit erklärt werden, dass IL-1β ein weniger potenter

Entzündungsmediator ist als LPS. LPS stimuliert zudem die Bildung vieler in-

flammatorisch wirkender endogener Zytokine, wie „Tumor-necrosis factor- α“

(TNF-α), IL-1β, IL-6 und IL-8 (Guha und Mackman, 2000). Auch die Proteinex-

pressionen von Claudin-5 und Occludin zeigen in den mit IL-1β (24h) und mit

LPS (4h und 24h) behandelten Endothelzellkulturen eine Abnahme.

Das Protein Occludin wird in Abhängigkeit von der Konzentration des Entzün-

dungsmediators herunterreguliert, während die Proteinexpression von Claudin-5

nur bei der höchsten Dosis der verwendeten Entzündungsmediatoren messbar

vermindert ist. Die in der vorliegenden Arbeit gefundene Abnahme der Occlu-

4. Diskussion 100

din-Expression nach inflammatorischem Stimulus stimmt mit Studien überein,

die in experimentellen MS-Modellen eine Unterbrechung der BHS durch T-

Zellen (Seelendrayer et al., 1993) und Monozyten (Morrissey et al., 1996) indu-

ziert haben. Die MS-Läsionen gingen einher mit einem Verlust von Occludin

und ZO-1 an den zerebralen Mikrogefäßen (Bolton et al., 1998; Mc Quaid et al.

, 2002; Kirk et al., 2003), begleitet von einer Freisetzung der Zytokine „Monocy-

te chemoattractant protein-1“ (MCP-1) (Song und Patcher, 2004), TNF-α, IL-1 β

und Interferon-γ (Minangar und Alexander, 2003).

Die Verringerung der Genexpressionsrate von ZO-1 in den für 24h mit IL-1β

inkubierten Endothelzellen korreliert mit den oben genannten Beobachtungen

bei MS-Läsionen. Die Endothelzellkulturen, welche mit dem Entzüdungsmedia-

tor LPS behandelt wurden, zeitgen allerdings keine signifikante Verringerung

innerhalb der ZO-1 Genexpression. Dies lässt vermuten, dass LPS einen ande-

ren Reaktionsmechanismus innerhalb der Endothelzellen auslöst als IL-1β.

Eine Inkubation einer kultivierten zerebralen Endothelzelllinie der Maus („brain

microvascular endothelial cells, BMEC) mit MCP-1, auch unter dem Namen Be-

ta-Chemokin CCL2 bekannt, führte zu einer verminderten Expression von Occ-

ludin und ZO-1 Proteinen, sowie zu einer signifikanten Herunterregulation von

Caveolin-1 (Song und Pachter, 2004). Caveolin-1 ist das Hauptstrukturprotein

von Mikrodomänen der Zellmembran (Caveolae), die in zahlreiche Signalwege

der Zelle, sowie in den vesikulären Transports involviert sind (Couet et al.,

2001; Hommelgaard et al., 2005; Insel et al., 2005; Wolburg, 2006). Song et al.

(2006) konnten zeigen, dass ein „Knockdown“ der Caveolin-1 Expression in

BMEC zu einer reduzierten Expression der tight junction-Proteine Occludin und

ZO-1, zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität und zu einer gesteigerten

transendothelialen Migration von Monozyten stimuliert durch MCP-1, führt. Die

Autoren vermuten, dass Caveolin-1 eine entscheidende Rolle bei der MCP-1-

induzierten Modulation der tight junction-Expression an Endothelzellen, sowie

bei der Regulation von Entzündungsprozessen der BHS spielt.

Stamatovic et al. (2003) zeigten, dass MCP-1 die Reorganisation des Zytoske-

lettes durch Ausbildung von Stressfasern und die Umverteilung der tight juncti-

on-Proteine Claudin-5, Occludin, ZO-1 und ZO-2 von der Triton X-100-löslichen

in die Triton X-100-unlöslichen Fraktion induziert. Die Umverteilung der tight

4. Diskussion 101

junction-Proteine in die unlösliche-Fraktion wird mit einer engen Assoziation

dieser Proteine an das Aktin-Zytoskelett begründet. Außerdem konnten Stama-

tovic et al. (2003) mit Hilfe von immunzytochemischen Untersuchungen zeigen,

dass in mit MCP-1 behandelten BMEC die Ausprägung der Proteine Claudin-5,

Occludin, ZO-1 und ZO-2 an den tight junction-Strängen vermindert war. Diese

morphologischen Veränderungen waren mit einem verminderten TEER und ei-

ner erhöhten Permeabilität für 14C-Inulin assoziert. Die Autoren zeigten weiter-

hin, dass die Inhibition der Rho-Kinase die MCP-1 induzierte Permeabilitätser-

höhung, die Reorganisation des Zytoskeletts und die Umverteilung der tight

junction-Proteine vollständig verhinderte. Die von MCP-1 ausgelöste Hyper-

permeabilität der zerebralen Endothelzellen scheint also durch einen

RhoA/Rho-Kinase Signalweg vermittelt zu werden.

Für das tight junction-Protein Occludin konnte gezeigt werden, dass Rho direkt

die Phosphorylierung des C-Terminus stimuliert und auf diese Weise die Inter-

aktion von Occludin mit dem Zytoskelett reguliert, wodurch wiederum die para-

zelluläre Permeabilität beeinflusst wird (Hirase et al., 2001; Benais Pont et al.,

2003).

Diese Phosphorylierung des C-Terminus durch Rho ist bis jetzt nur für Occludin

beschrieben worden, es könnte jedoch möglich sein, dass derselbe Mechanis-

mus auch für andere tight junction-Proteine gilt.

Die genaue Wirkungsweise der Entzündungsmediatoren auf die tight junction

der zerebralen Endothelzellen, sowie die von ihnen ausgelösten Signalwege

sind weitgehend unbekannt. Es ist denkbar, dass verschiedene Entzündungs-

mediatoren unterschiedliche Signalwege auslösen und somit auch auf ver-

schiedene tight junction-Komponenten der BHS Einfluss nehmen.

In der vorliegenden Arbeit zeigten 24h mit IL-1β bzw. LPS behandelte Endo-

thelzellkulturen signifikant verminderte Genexpressionen der tight junction-

Proteine Claudin-5 und Occludin. Des Weiteren wurde in den mit IL-1β inkubier-

ten Endothelzellkulturen eine verringerte Expressionsrate von ZO-1 und in den

mit LPS inkubierten Endothelzellen eine verminderte Expression von Claudin-1

gefunden.

Vergleichend zu diesen Studien zeigten Nitta et al. (2003) bei Untersuchungen

an Claudin-5 knock-out Mäusen eine teilweise Öffnung der BHS für Stoffe klei-

4. Diskussion 102

ner als 800 Da, der vermutete Zusammenbruch der BHS bei vollständigem Ver-

lust von Claudin-5 blieb allerdings aus.

Interessant ist auch das Ergebnis einer Studie in der Claudin-5 in einer Nieren-

zelllinie „Madin-Darby canine kidney II cells“ (MDKC II) überexprimiert wurde

(Wen, 2004). Der transepitheliale Widerstand erhöhte sich in den MDCK II um

das 5-fache und die Leitfähigkeit für monovalente Kationen war selektiv redu-

ziert. Mutationen von Aminosäureresten im ersten extrazellulären Loop von

Claudin-5 veränderten die Eigenschaften der bei einer Überexpression ausge-

bildeten tight junction. Es konnte gezeigt werden, dass die konservierten

Cysteine eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung eines hohen transepithe-

lialen Widerstandes, sowie bei der selektiv verringerten Leitfähigkeit für Mono-

saccharide spielen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Endothelzellen unter in-

flammatorischen Bedingungen immer Expressionsveränderungen mehrerer

tight junction-Gen aufweisen. Wie auch schon an den oben aufgeführten Stu-

dien ersichtlich, scheint das Zusammenspiel und die gegenseitige Beeinflus-

sung der verschiedenen tight junction-Proteine wichtig für die Integrität der BHS

zu sein. So kann, wie schon für Claudin-5 beschrieben, eine Expressionsverän-

derung oder der Verlust eines einzelnen tight junction-Proteins zu Permaebili-

tätsänderungen der BHS für bestimmte Moleküle führen, allerdings scheinen

die Mikrogefäße vor einem vollständigen Zusammenbruch der BHS bei Verlust

einzelner Komponenten der tight junction weitgehend geschützt.

Weiterhin scheint der Einfluss von Perizyten und der Basalmembran eine mo-

dulierende Rolle auf die Expression von tight junction-Genen an der BHS unter

inflammatorischen Bedingungen zu spielen. In der hier beschriebenen Arbeit

wurden isolierte Mikrogefäße aus Rattengehirnen unter denselben Bedingungen

wie die Endothelzellkulturen mit den Entzündungsmediatoren IL-1β und LPS

inkubiert. Es konnten jedoch in den isolierten Gehirngefäßen, im Gegensatz zu

den in vitro Untersuchungen keine signifikanten Veränderungen in den Expres-

sionsmustern der untersuchten tight junction-Gene Claudin-1, Claudin-5, Occ-

ludin, ZO-1 und ZO-2 gemessen werden.

In einer Studie von Tracy et al. (2005) konnte der Einfluss von chronisch-

inflammatorischen Schmerzen auf die funktionale und molekulare Integrität der

4. Diskussion 103

BHS nachgewiesen werden. 72h nach der Injektion von Freudschen-Adjuvans

in die Hinterpfoten von Ratten, konnte eine erhöhte Permeabilität der BHS-

Mikrogefäße für 14C-Sucrose festgestellt werden. Außerdem konnten eine Ver-

minderung der Occludin Expression und Erhöhungen in den Expressionen der

tight junction-Proteine Claudin-3 und Claudin-5 nachgewiesen werden, während

ZO-1 keine Veränderung im Expressionsmuster zeigte.

Mit der vorliegenden Arbeit korreliert nur das Ergebnis, dass unter chronisch-

inflammatorischen Schmerzen keine Veränderung der ZO-1 Proteinexpression

gefunden wurde. Allerdings handelt es sich in unserer Studie um einen ex vivo

Versuch in dem isolierte Mikrogefäße einer Entzündungssituation ausgesetzt

wurden. Tracy et al. (2005) führten dagegen einen in vitro Versuch durch. Au-

ßerdem wurde eine periphere Entzündung ausgelöst und die tight junction-

Expression erst nach 72h untersucht. Die längste Zeitspanne zwischen Inflam-

mation und Untersuchung der Genexpressionen lag in dem hier durchgeführten

Versuch bei 24h. Über Veränderungen der Genexpression nach einer längeren

Zeitspanne kann daher hier keine Aussage gemacht werden. Ein weiterer wich-

tiger Aspekt könnte ein Einfluss von Astrozyten auf die Expression von tight

junction-Komponenten sein. Die isolierten Mikrogefäße bestehen aus Endothel-

zellen, Basalmembran, Perizyten und teilweise noch vorhandenen Astrozyte-

nendfüßchen. Bei in vivo Studien sind die Astrozyten noch vollständig vorhan-

den und können zusätzlich einen modulierenden Einfluss auf die BHS ausüben

könnten.

Für die Expression von tight junction-Proteinen und Genen unter inflammatori-

schen Bedingungen scheint also das Zusammenspiel der einzelnen tight juncti-

on-Komponenten, sowie der zelluläre Einfluss der BHS-Umgebung eine wichti-

ge Rolle zu spielen.

So konnten Willis et al. (2004) zeigen, dass ein primärer Astrozyten-Verlust

ausgelöst durch das Toxin 3-Chloropropanediol (S-alpha-chlorohydrin), zu einer

Öffnung der BHS führt.

Über den Einfluss von Perizyten auf die BHS ist bekannt, dass sie in Ko-Kultur

mit Endothelzellen und Astrozyten die Formation von Kapillaren-ähnlichen

Strukturen (capillary-like structures) stabilisieren können (Ramsauer et al.,

2002). Außerdem konnten Hori et al. (2004) zeigen, dass ein von den Perizyten

4. Diskussion 104

ausgeschüttetes Angiopoetin die Expression von Occludin induziert, was darauf

hindeutet, dass Perizyten in die Induktion und / oder die Aufrechterhaltung von

Schrankeneigenschaften im zerebralen Endothel eingebunden sind (Hawkins

und Davis, 2005).

Eine weitere wichtige Komponente der BHS stellt die Basallamina dar. Die ext-

razelluläre Matrix der Basallamina interagiert mit dem zerebralen Gefäßen-

dothel. Eine Störung der extrazellulären Matrix ist mit einer erhöhten Permeabi-

lität der BHS verbunden (Rosenberger et al., 1993; Rascher et al., 2002). Ra-

scher et al. fanden in vaskularisierten „Glioblastoma multiforme“-Tumoren einen

Verlust von Agrin, einem Bestandteil der Basallamina, der eng assoziert war mit

dem Verlust der tight junction Moleküle Occludin, Claudin-5 und Claudin-1.

Auch weitere Autoren konnten zeigen, dass Matrixproteine die Expression von

tight junction Proteinen beeinflussen können (Tilling et al., 1998, Savettieri et

al., 2000).

Die in dieser Arbeit wenig übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der Ex-

pression von tight junction Genen und Proteinen unter inflammatorischen Be-

dingungen in vitro und ex vivo können somit Hinweise geben auf den wichtigen

Einfluss von Perizyten und Basallamina bei Entzündungsprozessen. Das unter-

schiedliche Expressionsmuster der tight junction Komponenten in vitro kann er-

klärt werden mit dem Fehlen der umgebenden BHS-Strulturen. Auch Cohen et

al. (1996), Neuwelt (2004) und Wang et al. (2004) wiesen darauf hin, dass

mikrovaskuläre Endothelzellen, Astrozyten, Perizyten, Neurone und die extra-

zelluläre Matrix eine „Neurovaskuläre-Einheit“ bilden und dass dieser Zusam-

menhang wichtig für das Verständnis der Entwicklung und der Physiologie der

BHS ist.

4. Diskussion 105

4.2 Expressionsänderungen von tight junction-Genen isolierter BHS-Mikrogefäße unter elektromagneti-scher Befeldung

In diesem Versuchsabschnitt wurde die Genexpression der tight junction-

Komponenten Claudin-1, Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1 und ZO-2 in

isolierten Gehirngefäßen von Ratten nach einer 24h Exposition mit einem 1,966

GHz (UMTS)-Signal bei einem SAR-Wert von 1,8 W/kg untersucht.

Die Versuche wurden unter suboptimalen Bedingungen durchgeführt, da die

Gehirngefäße in Bochum isoliert, über Nacht bei 4°C gelagert, dann nach

Münster transportiert und erst ca. 24h nach der Isolation aus dem Gehirn, in die

speziell für Zellkulturen konzipierte Expositionsanlage (Franke et al., 2005) ein-

gebracht wurden.

Franke et al. (2005) haben in dieser Expositionsanlage Endothelzellkulturen, die

aus Schweinegehirnen gewonnen wurden (Porcine brain endothelial cells,

PBEC), bis zu 48h mit einem UMTS-Feld bei 1,8 W/kg exponiert.

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals Genexpressions-Untersuchungen

an intakten, isolierten Gehirngefäßen, die mit elektromagnetischen Feldern ex-

poniert wurden, durchgeführt. Damit sollte der Versuchsaufbau von Franke et

al. den in vivo-Bedingungen einen Schritt näher gebracht werden.

Unter nicht-thermischen Bedingungen zeigten sich in den Ergebnissen von

Franke et al. keine Permeabilitätsänderungen für 14C-Sucrose und Serum-

Albumin, sowie keine Veränderungen des transendohtelialen elektrischen Wi-

derstandes (TEER) im Vergleich zu den sham-exponierten Kontrollkulturen.

Weiterhin konnten mittels Western-Blot-Methode und Immunfluoreszenz keine

Veränderungen innerhalb der Ausprägung der Proteine Occludin und ZO-1 er-

mittelt werden, die auf eine verminderte Integrität der BHS hätten schließen las-

sen.

In der vorliegenden Arbeit wurden in den für 24h exponierten isolierten Gehirn-

gefäßen signifikant gesteigerte Expressionsraten für Claudin-11 und Occludin

gefunden. Diese Veränderung der Genexpression von Occludin ex vivo ist bei

den in vitro Untersuchungen der Proteinexpression in PBEC von Franke et al.

(2005) nicht bestätigt worden. Die Proteinexpression von Occludin in den iso-

4. Diskussion 106

lierten Gehirngefäßen muss noch überprüft werden um sicherzustellen, dass

die erhöhte Transkription von Occludin-mRNA auch translatiert wird.

In vielen Studien (Williams et al., 1994; Goldman et al., 1984; Sutton und Car-

rol, 1979) wird postuliert, dass eine Erwärmung des Gehirngewebes durch e-

lektromagnetische Felder mit erhöhten SAR-Werten zur Öffnung der BHS und

somit zu erhöhter Permeabilität von Saccharose und Proteinen führt. Lin et al.

(1998) zeigten, dass bei anästhesierten Ratten, die selektive Exposition einer

Hirnhälfte mit einem 2,45 GHz-Feld, bei einem SAR-Wert von 208 W/kg, zu ei-

nem Temperaturanstieg auf 42,7°C führt. Außerdem war die Permeabilität der

BHS reversibel für das Cytostatikum Methotrexat bis zu einem Zeitraum von ca.

45 min nach der Exposition erhöht.

Anhand der Positiv-Kontrolle zu dem hier beschriebenen ex vivo-Versuchsteil

wird ersichtlich, dass eine Inkubation von isolierten Mikrogefäßen der Ratte bei

42°C für 8h eine signifikante Erniedrigung der Genexpressionen von Claudin-5

und ZO-1 auslöst. Da eine Erhöhung der Temperatur auf 42°C laut Literatur

(Roth, 2002) zu einer Öffnung der BHS führt, konnte mit Hilfe dieser Studie die

Veränderung der Expression von Claudin-5 und ZO-1 unter thermischem Stress

dokumentiert werden. In isolierten Gehirngefäßen der Ratte scheinen diese

Gene bzw. Genprodukte eine zentrale Rolle bei der Öffnung der BHS durch

thermische Effekte zu spielen. Die erhöhte Genexpression von Claudin-11 und

Occludin bei Exposition der zerebralen Gefäße ex vivo muss dagegen nicht in

den Mechanismus der Öffnung der BHS involviert sein. Vielmehr könnten sie

auf intrazelluläre Regulationsmechanismen Einfluss nehmen.

Welche zellbiologischen Prozesse diesen Genexpressionsveränderungen

zugrunde liegen und welche Funktionen (z.B. Schutzfunktion) sie tatsächlich

haben, muss in zukünftigen Studien noch geklärt werden.

4. Diskussion 107

4.3 Der Einfluss von UMTS-Mikrowellen auf die Ex-pression von tight junction-Komponenten der BHS in vivo

4.3.1 Diskussion der Vorversuche (in vivo) In dem Versuchsteil, der sich mit den physikalischen Einflüssen auf die Funkti-

on der BHS befasst, wurde die Wirkung von elektromagnetischen Feldern, wie

sie für Mobiltelefonen entsprechend dem UMTS Standard genutzt werden, auf

die Genexpression verschiedener tight junction-Komponenten der BHS über-

prüft.

Grundsätzlich werden niederfrequente und hochfrequente elektromagnetische

Felder unterschieden. Niederfrequente elektromagnetische Felder werden über-

all dort generiert, wo elektrischer Strom durch einen Leiter fließt. Ihr Frequenz-

bereich liegt unterhalb von 105 Hz. Die hochfrequenten elektromagnetischen

Felder haben einen Frequenzbereich zwischen 105 und 1012 Hz. Hierzu zählen

Radarfelder, Mobilfunkfelder, sowie Strahlungsfelder von Rundfunk und Fern-

sehen (Höfling 1994).

In der von uns benutzten Expositionsanlage wurde ein UMTS-Feld mit einem

Hochfrequenzbereich von 2100 GHz (1 GHz = 1.000.000.000 Hz) erzeugt.

Die Eindringtiefe des elektromagnetischen Feldes ist von der Frequenz abhän-

gig. Je niedriger die Frequenz des elektromagnetischen Feldes ist, desto tiefer

dringt es z.B. in menschliches Gewebe ein. Felder der Rundfunk-Mittelwelle, die

ungefähr bei 3 MHz liegen, haben im menschlichen Gewebe eine Eindringtiefe

von 30 cm. Dagegen weisen Frequenzen im Gigaherzbereich, wie sie bei Mobil-

funk oder beim Mikrowellenherd genutzt werden (0,8 bis 2,5 GHz), beim Men-

schen eine Eindringtiefe von nur wenigen Zentimetern auf (Bundesamt für

Strahlenschutz, 1999).

Das Verhältnis zwischen der Größe des bestrahlten Objekts und der Wellenlän-

ge der Radiofrequenz ist ausschlaggebend für die Absorption der mitgeführten

Energie des Feldes. Weiterhin ist für die Absorption der Energie entscheidend,

wie weit ein Körper von der Strahlungsquelle entfernt ist. Je weiter die Distanz

ist, desto weniger Energie wird absorbiert. Von der Regulierungsbehörde für

Telekommunikation und Post und vom Bundesamt für Strahlenschutz wurden

4. Diskussion 108

deshalb für bestimmte Strahlungsquellen wie Sendemasten und Radarstationen

Mindestabstände vorgegeben. Bei Mobilfunkstationen ist ein Abstand von 3 bis

8 m je nach Anlage vorgeschrieben. Für Mobiltelefone ist kein Mindestabstand

gefordert, allerdings dürfen sie eine Sendeleistung, die je nach Frequenzbe-

reich (900 MHz (GSM) – 2000 MHz (UMTS)) zwischen 4,5 W/m2 und 10 W/m2

liegt, nicht überschreiten (Bundesamt für Strahlenschutz, 1999).

Frei et al. (1989) zeigten in ihrer Studie, dass auch die Orientierung des Kör-

pers zum elektromagnetischen Feld die Absorption beeinflusst. Eine Exposition

von Sprague-Dawley-Ratten, bei der die Körperlängsachse parallel zum elektri-

schen Feld E lag (E-Orientierung), führte zu einer stärkeren Erwärmung der -

Peripherie, während bei einer Orientierung, bei der die Körperlängsachse paral-

lel zum magnetischen Feld H (H-Orientierung) ausgerichtet war, eine stärkere

Erwärmung des Körperkerns gemessen wurde.

Zu dem vor 4 Jahren auf dem deutschen Markt für Mobiltelefone verbreiteten

UMTS-System gibt es bisher nur wenig Forschungsvorhaben und -ergebnisse.

Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurden männliche Wistar-

Ratten in Plastikröhren fixiert und immobilisiert, da die Exposition der Tiere un-

ter genau definierten Expositionsparametern (SAR-Werten), als Teilkörperex-

position des Gehirns erfolgen sollte. Die Ratten wurden für 2h einem UMTS-

Signal von 2100 MHz ausgesetzt, diese Bedingungen optimierten die gezielte

Exposition des Gehirns, denn bei der Exposition frei beweglicher Tiere, wie in

den Versuchen von Salford (2003) durchgeführt, wird die Ausrichtung des Kör-

pers zum elektromagnetischen Feld laufend verändert. Auf diese Weise wird je

nach Orientierung des Körpers eine unterschiedliche Menge an Energie aufge-

nommen (Frei et al. 1989). Außerdem wurde in unserem Versuch eine Teilkör-

perexposition des Gehirns durchgeführt, die bei freilaufenden Tieren nicht mög-

lich ist.

Ein Nachteil bei der Röhrenfixierung der Ratten ist, dass die Tiere während der

Exposition Stress ausgesetzt sind, der die möglichen Effekte, die durch Exposi-

tion im elektromagnetischen Feld hervorgerufen werden, verfälschen oder über-

lagern könnte. Hierzu wurde in einer Studie von Stagg et al. (2001) bei Ratten,

die für 2h in Röhren fixiert wurden, ein um 2 - 5 fach erhöhter Kortikosteronge-

halt im Plasma im Vergleich zu den Käfigkontrollen festgestellt. Des weiteren

4. Diskussion 109

zeigten sich im Cortex von Ratten, die für 2h fixiert wurden, im Vergleich zu Kä-

figkontrollen erhöhte RNA-Wertel der „early-response“-Gene c-jun, jun-B, jun-D,

zif-268 und c-fos, die mit einer veränderten neuronalen Aktivität assoziert sind

(Melia et al., 1994).

Die in dieser Arbeit untersuchten m-RNA Expressionen von den „early respon-

se“-Genen (Protoonkogenen) c-jun und c-fos zeigten keine signifikanten Verän-

derungen zwischen den exponierten Ratten, den sham-exponierten Ratten und

den Käfigkontrollen. Auch Stagg et al. (2001) zeigten in ihren Versuchen keinen

Unterschied der RNA-Level von c-jun- und c-fos-Genen im Gehirn von expo-

nierten (SAR-Werte: 0,15 – 5 W/kg, 1,6 GHz) und sham-exponierten Tieren. Ein

ähnliches Ergebnis wurde von Fritze und Hossmann (1997) publiziert, die keine

Akkumulation von c-fos und c-jun Proteinen im Gehirn von Ratten bei der Expo-

sition mit 900 MHz (GSM) für 4h und SAR-Werten von 0,3 W/kg oder 1,5 W/kg

fanden.

Zur Vorbereitung auf die Exposition in den Plastikröhren wurden unsere Ver-

suchstiere schon im Alter von 3-4 Wochen, nach dem Absetzen vom Muttertier,

mit den Expositionsröhren vertraut gemacht, indem den Jungtieren die Röhren

in den Haltungskäfig gelegt wurden. So nutzten die Ratten die Röhren bis zum

Versuchsbeginn zum Spielen und Verstecken.

Es erfolgte allerdings kein gerichtetes Training auf die Fixierung hin, welches

den Stressfaktor während der Exposition weiter hätte herabsetzen können. So

zeigte Klein (2002), dass bei männlichen B6C3F1-Mäusen, die pro Tag für 2h in

Röhren fixiert wurden, nach 8 Tagen keine signifikante Erhöhung der Körper-

temperatur, die als Indiz für den Stresseinfluss herangezogen wurde, gemessen

werden konnte. Da in unserem Versuch Käfigkontrollen, sham-exponierte und

exponierte Tiere miteinander verglichen wurden, können signifikante Verände-

rungen, die schon zwischen Käfigkontrollen und sham-exponierten Tieren auf-

treten, auf ein erhöhtes Stressniveau aufgrund der Fixierung zurückzuführen

sein.

In der vorliegenden Studie sollten thermische Effekte, die durch das elektro-

magnetische Feld induziert werden, ausgeschlossen werden. Im Unterschied zu

Wärmequellen durchdringen elektromagnetische Felder das oberflächliche Ge-

webe und erwärmen das Körperinnere. Die Erwärmung geschieht auf molekula-

4. Diskussion 110

rer Ebene, wobei Elektronen, Atome und Dipole (z.B. Wassermoleküle) ange-

regt von der Frequenz des Feldes in Schwingung versetzt werden. Die Bewe-

gungsenergie der in Schwingung versetzten Moleküle wird beim Abbremsen in

Form von Wärme freigesetzt (Bernhardt, 1992).

Die chemische Zusammensetzung der Gewebe ist entscheidend für die Strah-

lungsenergie, die absorbiert und in Wärme umgewandelt wird. Da der Körper

aus unterschiedlichen Geweben besteht (z.B. Muskelgewebe, Fettgewebe und

Knochen), die sich besonders durch ihren Wasser- und Fettgehalt unterschei-

den, ist die „Dosimetrie“ ein entscheidender Faktor, der aufgrund der unter-

schiedlichen elektrischen und absorbierenden Eigenschaften der verschiedenen

Gewebe abzuklären ist (Guy, 1997; Kuster und Balzano, 1997). In bestimmten

Körperregionen können abhängig vom Wassergehalt, Leitfähigkeit und Geomet-

rie überdurchschnittliche Absorptionsraten, so genannte „hot spots“ auftreten

(Verschaeve und Maes, 1998).

Die Kenntnis der spezifischen Absorptionsraten ist daher ein wesentlicher Be-

standteil für die fundierte Beurteilung der Expositionsbedingungen bzw. der

Wirkmechanismen der Befeldung. Sie muss zur Risikoabschätzung, insbeson-

dere lokal für den exponierten Kopf/Hirn-Bereich, bei allen in Betracht kommen-

den Frequenzen, für die vorliegende Modulationsart und unterschiedliche Gerä-

tekonfiguration überprüft werden (Tillmann und Buschmann, 2000).

Zur Bestimmung eines definierten SAR-Wertes des Gehirns wurden Vorversu-

che notwendig, in denen Temperaturmessungen an Rattenkadavern und narko-

tisierten Ratten im Gehirnparenchym durchgeführt wurden.

Swicord et al. (1999) ermittelten bei einer Ganzkörperexposition toter BALB/c-

Mäuse, mit einem elektromagnetischen Feld der Frequenz 1600 MHz, unter-

schiedliche SAR-Werte in verschiedenen Geweben der Mäuse. Allein im Gehirn

wurden in verschiedenen Regionen SAR-Werte von 2,2, 2,4 bzw. 2,9 W/kg ge-

messen, denen Temperaturerhöhungen von 0,9, 1,0 und 1,2°C zuzuordnen wa-

ren. Diese Studie kann jedoch nicht mit dem von uns durchgeführten Vorver-

such verglichen werden, da es sich bei der Studie von Swicord um eine Ganz-

körperexposition mit einem elektromagnetischen Feld in nicht vergleichbarem

Frequenzbereich handelt.

4. Diskussion 111

Temperaturmessungen im Gehirn von narkotisierten Tieren in der hier durchge-

führten Art und Weise sind vollkommen neu. In Arbeiten von Salford et al.

(2003), Finnie et al. (2001, 2002), Tsurita et al. (2000) und Fritze et al. (1997)

wurden zur SAR-Wert Bestimmung nummerische Berechnungen erstellt, Tem-

peraturmessungen im Experiment wurden jedoch nicht durchgeführt. Theore-

tisch kann anhand der Bio-Wärme-Gleichung die Temperaturverteilung in ver-

schiedenen Körpergeweben, in diesem Fall im Gehirn der Ratte, unter Expositi-

onsbedingungen berechnet werden. Diese Daten wurden erstmals in dem hier

beschriebenen experimentellen Aufbau überprüft. Der mit Hilfe der Bio-Wärme-

Gleichung berechnete Temperaturwert von 0,3°C, bei einer eingespeisten Leis-

tung von 1,4 W in die verwendete Expositionsapparatur, stimmte sehr gut mit

den gemessenen Temperaturen an lebenden, narkotisierten Tieren überein, die

zwischen 0,2 und 0,4°C lagen.

Die Temperaturmessungen im Gehirn der Rattenkadaver dienten zur Absiche-

rung der mit Hilfe des Feldberechnungsverfahren ermittelten SAR-Werte, da

man auch anhand des Wärmeeintrags in das Gehirngewebe und dem daraus

resultierenden Temperaturanstieg, mittels der Temperaturkurve den SAR-Wert

bestimmen kann. Auch hier zeigten sich gute Übereinstimmungen zwischen

den theoretischen und den experimentellen Werten (siehe Tabelle 16).

Ein Nachteil bei den Temperaturmessungen der Vorversuche lag darin, dass

die Ratten zur Implantation der Temperatursonde narkotisiert werden mussten.

Daraus resultierte eine Herabsetzung der Stoffwechselaktivität und eine Absen-

kung der Körpertemperatur (Komlos und Folnes, 1959; Frei und Jauchem,

1988).

Außerdem konnten wir feststellen, dass mit abnehmender Narkosetiefe die

Temperatur im Gehirn wieder kontinuierlich anstieg, es musste darauf geachtet

werden, dass dieser Effekt nicht die Temperaturmessung während der Exposi-

tion überlagerte.

Frei und Jauchem (1988) haben nach Ganzkörperexposition mit 2,8 GHz Mik-

rowellen, bei einem SAR-Wert von 14,4 W/kg in mit Ketamin anästhesierten, in

wachen röhrenfixierten und in toten Ratten (Stamm: Fischer) die Zeit gemes-

sen, in der die Rektaltemperatur um 1°C anstieg. Des Weiteren wurden bei den

4. Diskussion 112

narkotisierten und den fixierten Tieren die subkutane Hauttemperatur und der

Blutdruck kontrolliert.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Temperaturanstieg im Gehirnparenchym

nach Teilkörperexpostion des Gehirns mit ca. 4 W/kg bzw. 8 W/kg in narkoti-

sierten und toten Ratten gemessen. Interessanterweise zeigte sich bei diesen

Messungen ein gegensätzliches Ergebnis, verglichen zu den Messungen von

Frei und Jauchem, die einen viel langsameren Temperaturanstieg der Rektal-

temperatur der toten Tiere (10,6 ± 1 min) im Gegensatz zu den anästhesierten

Tieren (7,1 ± 0,4 min.) feststellten. Dagegen zeigten die durchgeführten Mes-

sungen dieser Arbeit im Gehirnparenchym einen viel schnelleren und deutlich

höheren Temperaturanstieg bei den toten Ratten verglichen mit den narkotisier-

ten Tieren (siehe Tabelle 12). Die Unterschiede könnten auf die unterschiedli-

chen Messorte und vor allem auf die unterschiedlichen Expositionsparameter,

hier Teilkörper- versus Ganzkörperexposition, zurückzuführen sein.

4.3.2 Diskussion der Hauptversuche Es wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen Permeabilitätsstudien an der

BHS feldexponierter Ratten durchgeführt, allerdings liegen für die BHS in vivo

bis jetzt noch keine Studien in Bezug auf die Expression von tight junction-

Genen unter Befeldung vor.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Genexpressionen der tight junction-

Gene Claudin-1, Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1 und ZO-2 untersucht

und des Weiteren die Gene von MMP-2, MMP-9, VEGF, pAPN, c-jun und c-fos.

Diese Gene wurden ausgewählt, da Änderungen in ihrem Expressionsmuster

Hinweise auf BHS-Störungen unter Einfluss von UMTS-Mikrowellen geben

könnten.

MMPs sind eine Gruppe von extrazellulär aktiven Metalloproteasen. Weite Be-

reiche ihrer Genstruktur weisen Sequenzhomologien auf und sie besitzen alle

eine Zink enthaltende katalytische Domäne (Murphy et al., 1991; Massova et

al., 1998; Nagase und Woessner, 1999; Gröters et al., 2005). Sie sind an vielen

physiologischen und pathologischen Prozessen im Organismus beteiligt. Unter

anderem besteht ihre Funktion im Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix.

4. Diskussion 113

Der Wachstumsfaktor VEGF ist ein angiogener Faktor und stimuliert die Teilung

von Endothelzellen. Er ist im Gehirn an den physiologischen Prozessen der An-

gio-und Vaskulogenese (Risau, 1997; Risau und Flamme 1995) als auch an

pathologischen Phänomenen, wie der Hypoxie-induzierten Hyperpermeabilität

und Angiogenese (Bates et al. 2002, Feng et al. 1999) beteiligt.

Die Perizyten der BHS exprimieren eine spezielle Isoform der Aminopeptidase

N (CD 13) (Krause et al., 1988; Kunz et al., 1994), die unter pathophysiologi-

schen Bedingungen, wie z.B. am experimentellen Tiermodell für Multiple Skle-

rose (EAE-Modell) Expressionsänderungen zeigt (Kunz et al. 1995).

C-jun und c-fos gehören wie oben (4.4.4.) schon beschrieben zur Gruppe der

„early-response“-Gene.

Die in vivo und in vitro Ergebnisse zu den Permeabilitätsstudien an der BHS

unter Exposition mit elektromagnetischen Feldern werden in der Fachliteratur

kontrovers diskutiert. Bisher wurden jedoch keine reproduzierbaren experimen-

tellen Beweise für eine physiologische Veränderung der BHS aufgrund nicht-

thermischer Einwirkung elektromagnetischer Felder geliefert. (Stögbauer und

Franke, 2004).

Hardell et al. (2002) haben allerdings eine epidemiologische Studie veröffent-

licht, in der die Benutzer von Analog-, GSM- und Schnurlos-Telefonen bezüglich

des Auftretens von Hirntumoren untersucht wurden. In der Gruppe der Lang-

zeitbenutzer (mehr als 10 Jahre) analoger Mobilfunktelefone haben die Autoren

ein signifikant erhöhtes Risiko für das Auftreten von Hirntumoren entdeckt. Be-

sonders auffällig (odds ratio 3,5, die Chance ist um das 3,5-fache erhöht zu er-

kranken) war in dieser Gruppe das Auftreten des „Akustikus Neurinoms“, eines

Tumors im Bereich des Hörnervs.

Erklärbar könnte dieser Befund damit sein, dass der Hörnerv in dem Bereich

des Kopfes liegt, in dem beim Telefonieren die höchsten SAR-Werte erwartet

werden (Meyer, 2003).

In einer in vivo Studie von Lai und Singh (1995) wurde gezeigt, dass es in Ge-

hirnzellen von Ratten, die für zwei Stunden mit einem 2450 MHz Feld bei Ganz-

körper-SAR-Werten von 0,6 bzw. 1,2 W/kg exponiert wurden, zu vermehrten

DNA-Einzelstrangbrüchen kam. Ratten, die erst 4h nach der Exposition getötet

wurden, zeigten verglichen mit den sofort getöteten Tieren noch ausgeprägtere

4. Diskussion 114

DNA-Brüche. Malyapa et al. (1998) konnten die von Lai und Singh gefundenen

Ergebnisse jedoch nicht bestätigen. In der Studie von Malyapa et al. wurden

Ratten auch für 2h einem 2450 MHz-Feld bei einem SAR-Wert von 1,2 W/kg

ausgesetzt. Danach wurden Zellen aus dem Cortex und Hippocampus auf

DNA-Einzelstrangbrüche untersucht, es wurden keine Veränderungen in Bezug

zu nicht-exponierten Ratten gefunden.

Die meisten in vivo Studien beschreiben aber Permeabilitätsuntersuchungen an

der BHS oder die Entstehung von Tumoren im Gehirn der exponierten Tiere,

ohne Berücksichtigung der zellulären und molekularen Parameter.

In der vorliegenden Arbeit konnte unter Exposition mit UMTS-Feldern eine sig-

nifikante Änderung der Genexpression von Claudin-1 gezeigt werden. Aller-

dings zeigte sich die erhöhte Genexpression auch in den sham-exponierten Tie-

ren im Vergleich zur Käfigkontrolle. Claudin-1 ist eines der ersten Claudine,

welches in Endothelzellen von Säugetieren identifiziert wurde. In einem Trans-

fektionsmodell, bei dem tight junction freie Fibroblasten mit Claudin-1 bzw.

Claudin-5 transfiziert wurden, konnte im Gefrierbruch gezeigt werden, dass

Claudin-1 P-face assozierte tight junction und Claudin-5 E-face assozierte tight

junction ausbildeten (Morrita et al., 1999 a, b).

Da die Expression von Claudin-1 schon in den sham-exponierten Tieren eine

erhöhte Expressionsrate zeigt, kann daraus geschlossen werden, dass diese

Erhöhung eine Reaktion auf den Stress darstellt, dem die Ratten bei der Röh-

renfixierung ausgesetzt sind. Die signifikant um das Doppelte erhöhte Expressi-

onsrate von Claudin-1 in den mit 10 W/kg exponierten Ratten, im Vergleich zu

den sham-Kontrollen, und mit 2 W/kg exponierten Tieren kann wiederum auf

einen additiven Effekt des elektromagnetischen Feldes im Zusammenhang mit

Stress hindeuten. Bis heute ist nichts bekannt über Änderungen der Gen- oder

Proteinexpression von Claudin-1 bei BHS-Defekten.

Witt et al. (2003) konnten am Rattenmodell zeigen, dass Hypoxie/ Reoxygenie-

rungs-Stress zu einer erhöhten Permeabilität der BHS und zu einer verminder-

ten Expression von Occludin in den Endothelzellen der BHS führt. Auch bei ex-

perimentellen Modellen der Multiple Sklerose wurde eine Unterbrechung der

BHS gezeigt, die mit einem Verlust von Occludin und ZO-1 (Bolton et al., 1998;

4. Diskussion 115

McQuaid et al., 2002; Kirk et al., 2003) an den Mikrogefäßen des Gehirns asso-

ziiert ist.

Expressionsänderungen von Claudin-1 an tight junction wurden bis heute allein

an Darmepithelzellen bei kolorektalen Tumoren nachgewiesen. Miwa et al.

(2001) und Resnick et al. (2005) konnten zeigen, dass Claudin-1 in neoplasti-

schem Gewebe, im Gegensatz zur normalen Darmmukosa, hochreguliert ist.

Weiterhin bestand ein deutlicher Zusammenhang zwischen einer reduzierten

Claudin-1 Expression und einer geringeren Differenzierung des Tumorgewebes,

sowie der Wiederkehr der Krankheit und einer geringeren Überlebenschance

der Patienten (Resnick et al. 2005). In krankhaft verändertem Darmgewebe

könnte die vermehrte Expression von Claudin-1 also einen Schutzeffekt für das

gesunde Gewebe darstellen. Es ist jedoch schwierig, Ergebnisse zur Claudin-1

Expression in Darmepithelzellen des Menschen auf BHS-Endothelzellen der

Ratte zu übertragen.

Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass nach Exposition von

röhrenfixierten Ratten keine signifikanten Veränderung der Genexpressionen

von Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1, ZO-2, MMP-2, MMP-9, VEGF,

pAPN, c-jun und c-fos gemessen wurden. Allein Claudin-1 zeigt eine signifikant

erhöhte Expression, die jedoch schon für die sham-exponierten Ratten, vergli-

chen mit den Käfigkontrollen, ermittelt wurde. Die signifikante Steigerung der

Genexpression von Claudin-1 in den mit 10 W/kg exponierten Tieren, verglichen

mit den sham-exponierten Tieren könnte auf einen additiven Effekt der Exposi-

tion mit dem elektromagnetischen Feld in Zusammenhang mit der Stresssituati-

on hindeuten. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein 2100 GHz UMTS-Feld bei Teil-

körperexposition des Gehirns mit einem SAR-Wert von 10 W/kg, unter Stress

eine Veränderung der Genexpression von Claudin-hervorruft. Allerdings gibt

dieses Ergebnis keinen Hinweis auf eine Öffnung der BHS. Hierfür muss in wei-

terführenden Versuchen die Proteinexpression untersucht werden um sicherzu-

stellen, dass die Änderung innerhalb der Genexpression auch eine Änderung

der Proteinexpression verursacht.

5. Zusammenfassung 116

5. Zusammenfassung Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine Gefäßbarriere dar, die einen ungehin-

derten Übertritt von Stoffen aus dem Blut ins Gehirnparenchym unterbindet. Ei-

ne funktionell essentielle Struktur der BHS sind die interendothelialen tight junc-

tion der zerebralen Mikrogefäße. Unter pathologischen Bedingungen kommt es

häufig zur Öffnung der BHS, die durch erhöhte Permeabilität der Endothelzellen

gekennzeichnet ist und nicht schrankengängige Stoffe ins Gehirnparenchym

eindringen läßt. Die molekularbiologischen Veränderungen, die zur Öffnung der

BHS führen, sind weitgehend unbekannt und waren Forschungsgegenstand

dieser Arbeit.

Das durchgeführte Forschungsprojekt ist in zwei Teile gegliedert, in denen zwei

verschiedene Parameter untersucht wurden, die zur möglichen Öffnung der

BHS führen:

1. wurden zerebrale Mikrogefäße einer entzündungsähnlichen Situation

ausgesetzt,

2. wurden zerebrale Mikrogefäße im elektromagnetischen Feld exponiert,

das dem Frequenzbereich des Mobilfunks entsprach.

Für beide Parameter wurde die Expression der charakteristischen tight junction

Komponenten der zerebralen Endothelzellen, Claudin-1, Claudin-5, Claudin-11,

Occludin, ZO-1 und ZO-2 auf molekularbiologischer Ebene untersucht. Als Un-

tersuchungsmethoden wurden die real-time PCR für Aussagen zur Genexpres-

sion und der Westernblot für Aussagen zur Proteinexpression eingesetzt.

Des Weiteren wurden für beide Versuchsparameter verschiedene Ausgangsbe-

dingungen gewählt. Es wurden intakte zerebrale Gehirngefäße (in vivo- bzw. ex

vivo-Versuche) sowie isolierte kultivierte zerebrale Endothelzellen (in vitro-

Versuche) verwendet. Der Einsatz dieser Bedingungen diente dazu, Aussagen

über die funktionelle Notwendigkeit aller für die BHS spezifischen Bestandteile

für die Formation der endothelialen tight junction zu machen.

Im ersten Teil der Arbeit wurden die chemische Substanzen Il-1β und LPS ge-

wählt, von denen eine entzündungsmediierende Wirkung bekannt ist. Sie wur-

den in einem Kurzzeit- (4h) und in einem Langzeitversuch (24h) eingesetzt und


nach der Inkubation wurden die Genexpression und die Proteinexpression der

verschiedenen tight junction Proteine ermittelt.

Als Ergebnis waren in den isolierten Endothelzellkulturen (in vitro) die tight junc-

tion Komponenten Claudin 5 und Occludin sowohl auf Gen- wie auch auf Prote-

inebene signifikant erniedrigt. Daneben zeigte die Endothelzellkultur erniedrigte

ZO-1 Genexpression nach IL-1β-Behandlung (24h) und erniedrigte Claudin-1

Genexpression nach LPS-Behandlung (24h).

Dagegen wurden für die isolierten Gehirngefäße (ex vivo) nach Inkubation mit

den Entzündungsmediatoren keine signifikanten Expressionsveränderungen der

tight junction Komponenten gefunden. Dieser Befund dient als Indiz für die

Wichtigkeit des Zusammennspiels aller BHS-Bestandteile für die funktionelle

Integrität der BHS. Perizyten, Basalmembran und Astrozytenendfüßchen oblie-

gen auch innerhalb der isolierten Gehirngefäße offensichtlich modulierende

Kontrollfunktionen für den Erhalt der tight junction Struktur.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluß elektromagnetischer Felder auf die

tight junction der BHS in vivo (2,1 GHz UMTS-Feld, 2 W/kg und 10 W/kg für

2h) und ex vivo (1,966 GHz, 1,8 W/kg für 24 h) untersucht.

Die in vivo Versuche, bei denen die Versuchstiere lebend exponiert wurden,

zeigen ausschließlich für die tight junction Komponente Claudin-1 eine signifi-

kante Erhöhung der Genexpression bei Exposition von 10 W/kg. Die mit 2 W/kg

exponierten, aber auch die die sham-exponierten Tiere, die in Versuchsröhren

fixiert wurden, zeigen eine erhöhte Claudin-1 Expression im Vergleich zu den

Käfig-Kontrolltieren. Diese Expressionsänderungen sind auf die Stressbedin-

gungen während des Versuches zurückzuführen und müssen bei der Interpreta-

tion der Werte berücksichtigt werden. So ist die erhöhte Claudin-1 Expression

der mit 10 W/kg exponierten Tiere auf einen additiven Effekt der Stressbedin-

gungen sowie der Wirkung des elektromagnetischen Feldes zu werten.

Andere tight junction Komponenten, wie Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1

und ZO-2, sowie weitere in diesem Versuchsteil untersuchte BHS-spezifische

Komponenten, wie VEGF, MMP-2, MMP-9, pAPN, c-jun und cfos sind nicht sig-

nifikant verändert.

Ex vivo Versuche, in denen isolierte Gehirngefäße im elektromagnetischen Feld

exponiert wurden, zeigten dagegen eine signifikante Erhöhung der Genexpres-


sionen von Claudin-11 und Occludin. Als Positiv-Kontrollgruppe wurden Gehirn-

gefäße ex vivo für 8h einer Hyperthermie (42°C) ausgesetzt. Von diesen Bedin-

gungen ist bekannt, dass sie zur Öffnung der BHS führen. Hierbei wurden er-

niedrigte Genexpressionsraten für Claudin-5 und ZO-1 gefunden.

Ein Vergleich der unterschiedlichen Expressionsmuster der tight junction Kom-

ponenten nach chemischen und physikalischen Einflüssen auf die BHS lässt

vermuten, dass nicht unter allen Bedingungen die BHS defekt und permeabel

ist, sondern dass sekundäre molekulare Effekte in Gang gesetzt werden, die

modulierenden Einfluß auf die BHS nehmen können.

6. Abkürzungsverzeichnis 119

6. Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung

ACSF artifizielle Cerebrospinal-Flüssigkeit

AK Antikörper

ALP Alkaline-Phosphatase

APS Ammoniumperoxysulfat

ATP Adenosintriphosphat

BBB Blood-Brain Barrier

BCEC Brain Capillary Endothelial Cells

BSA Bovine Serum Albumin

°C Grad Celsius

(c)-DNA (Copy)-Deoxyribonucleic Acid

C-Terminus Carboxy-Terminus

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco´s Modified Eagel´s Medium

DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxy Nucleosidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiaminetraacetic Acid

EMF Elektromagnetisches Feld

EtOH Ethanol

FCS Fetal Calf Serum

FCS Fötales Kälberserum

g Erdbeschleunigung

GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein

GSM Global System for Mobile Communication

hsp heat shock protein

IL Interleukin

JAM Junctional Adhesion Molecule

Kb Kilobasenpaare

6. Abkürzungsverzeichnis 120

KDa Kilo Dalton

LPC Laser-Pressure Catapulting

LPS Lipopolysaccharid

M Molar

Min. Minuten

Ml Milliliter

mm Millimeter

MMP Matrix Metalloproteinase

(m)RNA (messenger) Ribonucleic Acid

pAPN perizytäre Aminopeptidase N

PBS Phosphate-Buffered Saline

PCR Polymerase-Chain-Reaction

RBE Rat-Brain-Endothelium

RT Raumtemperatur

SAR Spezifische Absorptionsrate

SDS Sodiumdodecylsulfat

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat EDTA

TEMED Tetramethylethylendiamin

TIGHT JUNCTION Tight junctions

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

Tris Trihydroxymethylaminomethan

U Unit

UMTS Universal Mobile Telecommunications System

v/v Verhältnis Volumen/Volumen

VEGF Vascular endothelial growth factor

w/v Verhältnis Volumen/Masse

ZNS zentrales Nervensystem

ZO-1/2 Zonula Occludens Protein 1 / 2

µl Mikroliter

7. Literaturverzeichnis 121

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8. Summary 136

8. Summary The Blood Brain Barrier (BBB) is a physical vessel barrier which limits the

crossing of substances from the blood to the brain parenchyma. Among the

functionally essential structures of the BBB are the interendothelial tight junc-

tions of the cerebral microvessels.

Under pathological conditions the permeability of the BBB can be increased,

thus, allowing the entrance of potentially harmful substances into the brain pa-

renchyma. The molecular changes that lead to this opening are widely unknown

and therefore, subjects of the present study.

The research project consists of two parts investigating two putative noxes that

potentially may lead to the event of BBB opening:

1. inflammatory stimulation of cerebral microvessels under cell culture con-

ditions

2. exposure of cerebral microvessels to electromagnetic fields correspond-

ing to the frequencies used for mobile telephony.

For both situations the expression of the tight junction forming proteins Clau

din-1, Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1 and ZO-2 was examined on the

molecular level. To quantify gene expression Real-time PCR was implied and to

measure protein expression Western Blot Analysis was performed.

Two distinct experimental paradigms were created: For the in vivo and ex vivo

experiments intact cerebral microvessels were used and for the in vitro part iso-

lated cerebral endothelial cells were cultivated. This fractioning of the BBB

components was chosen to provide the possibility to assess the importance of

the specific BBB constituents for its functional integrity.

In the first part of the study, the inflammatory mediators IL-1ß and LPS were

implied to microvessel and endothelial cell culture systems. After short term (4

hours) and long term (24h) incubation with these agents gene and protein ex-

pression levels of the tight junction forming proteins were examined.

As a first result, endothelial cell cultures exhibited significantly reduced gene

and protein expression levels for the tight junction proteins Claudin-5 and Oc-

8. Summary 137

cludin. In the same cultures the gene expression of ZO-1was reduced after 24h

incubation with IL-1ß and that of Claudin-1 after 24h of stimulation with LPS.

However, in the cultivated intact microvessels (ex vivo setup) the incubation

with the inflammatory mediators did not induce any changes in the tight junction

gene expression. This result indicates the importance of the presence and the

concert of all BBB components as a prerequisite for its functional integrity.

Pericytes, the basal membrane and the astrocytic endfeet seem to interact for

and at the same time underlie modulatory control functions for the maintenance

of the tight junction structure even in isolated cerebral microvessels.

In the second part of the study, the influence of electromagnetic fields on BBB

tight junctions was investigated in vivo (2,1 GHz–field, 2 W/kg and 10 W/kg for

2h) and ex vivo (1,966 GHz, 1,8 W/kg for 24h).

During the in vivo experiments isolated microvessels of adult rats that were ex-

posed to 10 W/kg showed a significant upregulation of Claudin-1 mRNA. For

animals exposed to 2 W/kg as well as for sham treated rats an increase in the

Claudin-1 mRNA expression was observed as compared to their control litter-

mates. The latter changes in the expression pattern can be regarded as stress-

induced, but have to be taken into consideration for the interpretation of the

whole test results. Thus, the marked increase of the Claudin-1 gene transcrip-

tion in the 10W/kg group can be attributed to an additive effect of the electro-

magnetic field exposure on the stress-induced changes.

None of the other tight junction forming proteins Claudin-5, Claudin-11, Oc-

cludin, ZO-1 or ZO-2 exhibited significant changes on mRNA level. Other BBB

associated genes and proteins, such as VEGF, MMP-2, MMP-9, pAPN and the

immediate early genes c-jun and c-fos were investigated for changes in expres-

sion patterns, but the analysis did not reveal significant differences, either.

However, ex-vivo experiments that were conducted with isolated cerebral mi-

crovessels under defined culture conditions showed a significant upregulation of

Claudin-11 and Occludin mRNA after the exposure to electromagnetic fields.

Brain microvessels exposed to hyperthermia of 42°C for 8 hours served as posi-

tive controls as these conditions are known to induce BBB opening. Here, hypo-

thermia alone lead to a downregulation of Claudin-5 and ZO-1 mRNA.

8. Summary 138

This detailed comparison of the expression patterns of the different tight junc-

tion proteins after chemical and physical stimulation revealed that the applied

noxes do not lead inescapably to a BBB breakdown. In contrast, the concert of

all components involving secondary molecular mechanism seem to have a

modulating effect on the BBB.

9. Beiträge zu Konferenzen 139

9. Beiträge zu Konferenzen Präsentationen: 5. Blut-Hirn Schranken-Expertentreffen (Bad Herrenalb 26.-28. Mai 2003):

Regulation von tight junction Proteinen der Blut-Hirn-Schranke in vivo und

in vitro

7. Blut-Hirn Schranken-Expertentreffen (Bad Herrenalb

Expression von tight junction Genen unter entzündlichen Bedingungen

FGF-Seminar: Blood-Brain Barrier and RF- Newest Insights, Düsseldorf,

Vodafon, 29.05.2006:

Influences on the expression of endothelial tight junction genes and proteins at

the blood-brain barrier by RF-field interation

Poster-Präsentationen:

Fourteenth Meeting European Neurological Society (ENS)

June 26-30, 2004 Barcelona, Spain

Levetiracetam normalizes Connexin 43 expression and intercellular communica-

tion in rat primary astrocytes.

K. Ladage, A. Haghikia, D. Hinkerohe, D. Smikilla, R. Dermietzel, P.-M. Faust-

mann (Bochum)

77. DGN Jahrestagung 6.-9. Oktober 2004

Levetiracetam normalisiert die Connexin 43 Expression und die interzelluläre

Kommunikation in primären Astrozytenkulturen. K. Ladage, A. Haghikia, D. Hin-

kerohe, D. Smikilla, R. Dermietzel, P.-M. Faustmann (Bochum)

27th BEMS Annual Meeting, Dublin, Ireland, June 2005

New concept for local brain 2-GHz exposure of rodents in vivo. Bitz, S. Bloch,

V. Hansen, D. Krause-Finkeldey, K. Ladage, T. Reinhardt, J. Streckert:

9. Beiträge zu Konferenzen 140

Conference on Electromagnetic Fields, Health and Environment (EHE

'06), Madeira Island, Portugal, April 2006, 2.29-2.34.

Set-up for local brain exposure of rodents in vivo to UMTS-like modulated test

signals. A. El Ouardi, A. Bitz, J. Streckert, T. Reinhardt, D. Krause-Finkeldey,

K. Ladage, V. Hansen

German Microwave Conference (GeMiC 2006), Ulm, Germany, April 2006.

Numerical computation of field and temperature distribution for a device aiming

at local brain exposure of rodents in vivo at 2 GHz. Int. A. El Ouardi, A. Bitz, J.

Streckert, T. Reinhardt, V. Hansen, D. Krause-Finkeldey, K. Ladage

10. Danksagung 141

10. Danksagung Ich danke Professor Dr. Rolf Dermietzel für ein interessantes und überaus

spannendes Forschungsthema, an dem ich arbeiten durfte. Für seine Betreu-

ung, Hilfe und Kritik.

Vielen Dank an Professor Dr. H. Lübbert für die freundliche Übernahme des

Koreferats.

Mein herzlichster Dank geht an Dr. Dorothee Krause-Finkeldey, sie hat mir in

jeder Lebenslage mit Rat und Tat zur Seite gestanden und ist mir in fachlicher

als auch menschlicher Hinsicht ein Vorbild.

Ich danke Frau Schreiber-Minjolie für die Hilfe bei den Zellkultur-Arbeiten.

Ich danke Bianca Wasielewski für die angeregten Diskussionen und arbeitsrei-

chen Wochenenden die wir zusammen an der Uni verbracht haben.

Ich danke allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Neuroanatomie und molekulare

Hirnforschung für das angenehme Arbeitsklima und den Spaß den wir zusam-

men gehabt haben.

Ganz besonders danke ich den Mitarbeitern des Lehrstuhls für Theoretische

Elektrotechnik der Bergischen Universität Wuppertal, Herrn Streckert, Herrn

Bitz und Herrn El Ouardi für die Bereitstellung des Expositionsgerätes und für

die geduldigen Erklärungen.

Meinem lieben Freund und Partner Jorge Castro-Hernandez danke ich von

ganzem Herzen für die Unterstützung in allen Lebenslagen und seine Liebe.

Mein allergrößter Dank gilt meinen Eltern die mir das Studium in dieser Form

ermöglicht haben und die mich zu jeder Zeit und in jeder Form unterstützt ha-

ben.

11. Lebenslauf 142

11. Lebenslauf Persönliche Angaben:

Name: Kerstin Ladage

Adresse: Im Eickhof 9

45529 Hattingen

Telefon: 0177/ 4919173

Mobil: 0177/ 4919173

E-Mail: [email protected]

Geburtsort: Essen

Geburtstag: 24.10.1975

Familienstand: ledig, keine Kinder

Berufspraxis:

seit Juni 2002 - heute wissenschaftliche Angestellte am Lehrstuhl für

Neuroanatomie und molekulare Hirnforschung

(Ruhr-Universität Bochum)

Sep. 2003 - heute Lehrkraft bei einer Logopädenschule

(„Die Schule“, Bochum, IFBE-med GmbH)

Okt.: 2002 – Nov.2004 freie Mitarbeiterin,

„Schule Natur“, Grugapark Essen

Studium/Schulbildung:

Okt. 2002 – heute Doktorarbeit (Schwerpunkt Neurobiologie, Blut-Hirn

Schranke) am Lehrstuhl für

Neuroanatomie und molekulare Hirnforschung der

Ruhr-Universität Bochum

Okt. 1995 – Jan. 2002 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Abschluss: Dipl.-Biol.

Abschlussnote: sehr gut

11. Lebenslauf 143

Aug. 1986 – Mai 1995 Gymnasium, B.M.V.-Schule Essen,

Abitur (Abschlussnote 2,3)

Aug. 1982 – Juni 1986 Grundschule Essen-Burgaltendorf

Auslandserfahrung: Feb. 2002 – Mai 2002 Auslandsaufenthalt in Mittelamerika (Guatemala und

Costa-Rica), zwecks Erlernen der spanischen Sprache

und Arbeiten als Volunteer

Sprachkenntnisse: Englisch fließend

Spanisch gute Kenntnisse

Französisch ausbaufähige Grundkenntnisse

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