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Einfluss von azellulärer porziner Dermis als

Implantathülle auf die Kapselfibrose im

Rattenmodell

Molekularbiologische und immunhistochemische

Untersuchungen

Aus der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Raymund E. Horch

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt

von Jasmin Sandra Grüner

geboren in Marktredwitz

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. Raymund E. Horch

Gutachter: Prof. Dr. Michael Weyand

Tag der mündlichen Prüfung: 22. März 2019

Meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

1 ZUSAMMENFASSUNG 5

2 ABSTRACT 7

3 EINLEITUNG 9

3.1 Mammaaugmentation früher und heute 9

3.2 Kapselfibrose 13

3.3 Azelluläre Dermis 18

3.4 Zielsetzung und Fragestellung 19

4 MATERIAL UND METHODEN 20

4.1 Versuchsaufbau und Gruppeneinteilung 20

4.2 Versuchstiere 22

4.3 Silikonprothesen 23

4.4 Azelluläre porzine Dermis 24

4.5 Operationsprotokolle 24

4.6 Aufarbeitung der Gewebeproben 26

4.7 Molekularbiologische Untersuchungen 27

4.7.1 mRNA-Isolation aus Paraffinblöcken 32

4.7.2 Transkription der mRNA in cDNA 34

4.7.3 qPCR 34

4.7.4 DNA-Gelelektrophorese 36

4.7.5 Molekularbiologische Auswertung 38

4.8 Histologische Untersuchungen 39

4.8.1 Hämatoxylin-Eosin 40

4.8.2 Immunhistochemische Färbungen 41

4.8.3 Histologische Messungen 48

4.9 Statistische Auswertung 55

5 ERGEBNISSE 56

5.1 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen 56

5.1.1 qPCR 56

5.1.2 DNA-Gelelektrophorese 65

5.2 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen 65

6 DISKUSSION 89

6.1 Diskussion der Thematik 89

6.2 Diskussion von Material und Methoden 89

6.3 Diskussion der Ergebnisse 92

6.3.1 Diskussion der molekularbiologischen Ergebnisse 92

6.3.2 Diskussion der histologischen Ergebnisse 97

6.4 Aussicht 103

7 LITERATURVERZEICHNIS 104

8 ANHANG 104

8.1 Abbildungsverzeichnis 115

8.2 Tabellenverzeichnis 116

8.3 Formelverzeichnis 117

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 117

10 VORTRÄGE 119

11 DANKSAGUNGEN 120

Zusammenfassung 5

1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Azelluläre dermale Matrizes finden in der rekonstruktiven

Brustchirurgie mit Silikonprothesen bereits seit längerem Anwendung. Hierbei wird zur

Mammaaugmentation als Hüllgewebe um Silikonprothesen unter anderem azelluläre

porzine Dermis (APD) eingesetzt. Detailliertere Untersuchungsergebnisse zur

Integration der APD sowie zum Einfluss auf die Kapselfibrose fehlen jedoch. Ziel dieser

Studie war es, die Gewebereaktion nach Implantation von Silikonprothesen mit und

ohne APD als Hülle im Rattenmodell über einen Zeitraum von einem Jahr zu

untersuchen. Hierzu wurden die Konstrukte paravertebral unterhalb des Panniculus

carnosus in Lewis-Ratten eingesetzt und zu unterschiedlichen Zeitpunkten entfernt. Die

Explantate und das angrenzende Gewebe wurden anschließend molekularbiologisch

sowie immunhistochemisch untersucht.

Methoden: In männliche Lewis-Ratten wurden Silikonprothesen ohne (Kontrollgruppe,

n=56) und mit APD-Hülle (Versuchsgruppe, n=64) beidseits submuskulär am Rücken

platziert. Nach 3, 6, 12 und 52 Wochen wurden die Konstrukte explantiert und

molekularbiologisch sowie immunhistochemisch untersucht. In einer zusätzlichen

Versuchsgruppe (n=48) wurde nur APD ohne Silikonprothese einsetzt, um die

Reaktion des Körpers auf das xenogene Transplantat zu überprüfen.

Molekularbiologisch untersucht wurden die Expressionen der Zytokine Tissue growth

factor β1 (TGFβ1), Tumor Nekrose Faktor α (TNFα), Matrix Metalloproteinase 1

(MMP1) und Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP1) per quantitativer

Real-time Polymerasekettenreaktion (qPCR). Mit Hilfe immunhistochemischer

Färbungen wurde die Anzahl der proliferierenden Zellen, die Anzahl der

Entzündungszellen, die Dicke der myofibroblastenreichen Schichten sowie die Anzahl

der Gefäßanschnitte ermittelt. In der Übersichtsfärbung wurden die Schnitte zudem

mikroskopisch auf Adhärenz beurteilt und außerdem die Dicke der Kollagenschicht

sowie die der APD bestimmt.

6

Ergebnisse und Beobachtungen: Angrenzend an alle Silikonprothesen war eine

myofibroblastenreiche Schicht erkennbar. Eine weitere Myofibroblastenschicht war

zwischen der Kollagenschicht und der APD optional vorhanden. Im Langzeitversuch

von 52 Wochen waren Kollagen- und Myofibroblastenschicht in der Versuchsgruppe

signifikant dünner als in der Kontrollgruppe und die Expression des TGFβ1 war

geringer. In der Versuchsgruppe war die Anzahl CD68-positiver Zellen in beiden

Schichten signifikant geringer und die Expression des TNFα vermindert. Die Anzahl

Ki67-positiver Zellen war in der Versuchsgruppe signifikant höher. Die Expression der

MMP1 war in der Versuchsgruppe geringer als in der Kontrollgruppe. Die Expression

des TIMP1 zeigte nur geringe Gruppenunterschiede. Das Verhältnis „MMP1:TIMP1“

war in der Versuchsgruppe zum Explantationszeitpunkt 12 Wochen signifikant höher

als in der Kontrollgruppe.

Die APD wurde in der zusätzlichen Versuchsgruppe vaskularisiert und von Zellen

infiltriert.

Schlussfolgerungen: Die Verwendung von APD als Hülle um Silikonprothesen im

Rattenmodell zeigte bereits auf molekularbiologischer Ebene eine verminderte

inflammatorische und fibrotische Reaktion, verglichen mit Silikonprothesen ohne APD.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen bestätigten diese

Beobachtungen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die APD als Hüllschicht

um Silikonprothesen im Rattenmodell präventiv hinsichtlich der Kapselfibrose wirken

könnte.

Abstract 7

2 Abstract

Background: Acellular dermal matrices have been used a long time in reconstructive

breast surgery with silicone prostheses. In this connection acellular porcine-derived

dermis (APD) serves amongst others as an envelope around silicone prostheses.

However detailed data concerning the integration of APD and the influence on capsular

contracture is missing. The aim of this study was to investigate the body reaction after

implantation of silicone prostheses with and without APD as an envelope in a rat model

for one year. For this purpose, the constructs were placed under the panniculus

carnosus in the back of Lewis rats and explanted at different time. After that, molecular

biological and immunhistochemical analysis of the explants and their surrounding

tissue was performed.

Methods: Bilateral submuscular implantation of silicone prostheses with (n=56) and

without APD (n=64) as an envelope were carried out in Lewis rats. After 3, 6, 12 and

52 weeks, the constructs were explanted and analyzed immunhistochemically and

molecular biologically. In an additional experimental group, APD without any silicone

prosthesis was implanted in order to examine histologically the body’s reaction on this

single xenogene transplant. Molecular biological investigations included the expression

of tissue growth factor β1 (TGFβ1), tumor necrosis factor α (TNFα), matrix

metalloproteinase 1 (MMP1) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP1)

via quantitative Real-time Polymerase chain reaction (qPCR). With the aid of

immunhistochemical staining the number of proliferating cells, the number of

inflammatory cells, the thickness of myofibroblast layers and the number of cutted

blood vessels within the APD was analysed. Furthermore, samples were judged about

adherence. Additionally, the thickness of the collagene layer and of the APD was

measured.

Abstract 8

Results and observations: Adjacent to all silicone prostheses, a layer rich in

myofibroblasts was observed. Another optional myofibroblast layer was found between

the collagene layer and the APD. In the experimental group, the collagen- and

myofibroblast-layer were significantly thinner than in the control group after 12 and 52

weeks and the expression of TGFβ1 was decreased. After 52 weeks, there was a

significantly lower number of CD68-positive cells within both layers regarding the

experimental group and a decreased expression of TNFα. The number of Ki67-positive

cells was significantly higher in the experimental group at all times. The expression of

MMP1 was reduced in the experimental group compared to the control group. TIMP1

scarcely showed any differences between the two groups. The relation “MMP1:TIMP1”

at 12 weeks was significantly increased in the experimental group compared to the

control group.

Conclusions: In molecular biological investigations, APD as an envelope around

silicone prostheses showed a decrease in inflammatory and fibrotic reaction compared

to silicone prostheses without APD. These observations were confirmed by

immunhistochemical analysis. The findings of this study demonstrate the potential of

APD as an envelope around silicone prostheses to prevent capsular contracture.

Einleitung 9

3 Einleitung

3.1 Mammaaugmentation früher und heute

Anatomie und Funktion der Mamma

Die menschliche Brust entsteht aus dem rudimentären Rest der embryonalen

Milchleiste, die auch bei anderen Säugetieren vorhanden ist. Die Mamma der

erwachsenen Frau setzt sich aus der Brustdrüse (Glandula mammaria) sowie Binde-

und Fettgewebe zusammen. Die Anteile dieser drei Bestandteile und die Elastizität des

Bindegewebes definieren ihre individuelle Form und Größe. Bei der erwachsenen Frau

befindet sich die Mamma medioklavikulär auf Höhe der 3. bis zur 6. Rippe und ist auf

der Fascia pectoralis leicht verschieblich. Ventral ist sie mit der Haut verwachsen.

Dorsal liegt sie den Musculi pectoralis major, obliquus externus abdominis und serratus

anterior auf. Von der Haut bis zur Muskulatur wird die Brust von den sogenannten

Cooper-Ligamenten durchzogen und gestützt. Die Brustdrüse besteht aus vielen Azini,

die zusammen einen Lobulus formen. Diese Lobuli bilden wiederum 15 bis 20 Lobi,

deren Ausführungsgänge im Sinus lactiferi münden. Zentral in der Mamille mündet

dieser Gang an der Hautoberfläche. In der nicht laktierenden Brustdrüse finden sich

kleine Lobuli ohne Lumen, die als Epithelknospen gruppiert stehen. Während einer

Schwangerschaft übernimmt die weibliche Brust eine wichtige Aufgabe bei der

Ernährung des Säuglings.

Arteriell versorgt wird sie durch die A. thoracica interna, die Aa. intercostales der

zweiten und dritten Rippe und die A. thoracica lateralis.

Die weibliche Brust nimmt als sekundäres Geschlechtsmerkmal eine wichtige Rolle im

äußeren Erscheinungsbild der Frau ein. So gilt sie als Symbol für Weiblichkeit und

spielt eine zentrale Rolle bei femininen Schönheitsidealen. Die Vorstellung von einer

optimal geformten Brust ist hierbei so verschieden wie die Patientinnen selbst. Als

Folge einer erforderlichen Mastektomie leiden viele Frauen unter der psychischen

Belastung, welche das Selbstbild verändern und zu depressiven Krisen führen

kann [18]. So entscheiden sich viele Frauen im späteren Verlauf zur Rekonstruktion

der Brust. Sie kann den Patientinnen helfen, das verlorene Gefühl der Femininität

zurück zu gewinnen und die Patientinnen sind zufriedener mit ihrem Körperbild [51, 87,

90].

Einleitung 10

Geschichte der Mammaaugmentation

1895 verpflanzte der deutsche Chirurg Vincenz Czerny einer Frau erstmals ein Lipom

in die Brust, nachdem ihr aufgrund eines Adenoms Brustgewebe entnommen worden

war. Vier Jahre später wurde erstmals Paraffin als Füllsubstanz zur Hoden- und

Mammarekonstruktion per Injektion verwendet. Paraffin ist ein organisches Polymer

aus –(CH2)n– Ketten, welches noch bis 1914 zur Mammaaugmentation eingesetzt

wurde. Von 1915 bis 1943 wurden diverse andere Materialien verwendet. Der Fantasie

waren hierbei scheinbar kaum Grenzen gesetzt. Frauen ließen sich die Brüste mit

Glaskugeln, Schwämmen, bis hin zu Sojabohnenöl vergrößern. All diese Materialien

führten zur chronischen Inflammation und Granulombildung. Von 1988 bis 2009 wurde

zudem Polyacrylamid Hydrogel (PAH) zur Brustformung eingesetzt. Dieses bestand

aus 2.5% Polyacrylamid und 97.5% Wasser. Hieraus bilden sich chemisch Ketten aus

Polypropenoat. Jedoch traten auch bei diesem „Filler“ Komplikationen bei auf. [69]

Silikon wurde als Begriff im frühen 20. Jahrhundert vom britischen Chemiker Professor

Frederic Kipping eingeführt. Es handelt sich um ein Polymer aus Dimethylsiloxanen.

Das heißt Siliciumatome sind über Sauerstoffatome verknüpft und tragen jeweils zwei

Methylgruppen. [62] Silikon kommt nicht in der Natur vor, es muss also synthetisch

hergestellt werden.

Ursprünglich war das Silikon nicht zur medizinischen Anwendung gedacht gewesen,

sondern sollte im Militärwesen eingesetzt werden. Die ersten Produkte aus Silikon

wurden in Kampfflugzeugen verwendet. Ab 1940 wurde flüssiges Silikon Off-Label in

der ästhetischen Medizin verwendet. Etwa 20 Jahre später wurde offiziell von

Komplikationen berichtet, nachdem reines Silikon in großen Mengen appliziert wurde.

Daraufhin wurde die klinische Anwendung in Nevada 1964 verboten. [42]

1962 entwickelten die amerikanischen plastischen Chirurgen Frank Gerow und

Thomas Cronin die erste Silikonprothese und setzte sie ein Jahr später bei der ersten

Patientin ein [19, 62]. Der Eingriff galt als Wegbereiter für den heutigen Routineeingriff.

Heute bestehen die meisten Implantate aus einer Silikonhülle und einer Füllung mit

Silikongel oder Salin-Lösung [30, 40, 74, 85]. Mittlerweile gilt die Mammaaugmentation

mit Silikonprothesen als Routineeingriff in der Plastischen Chirurgie.

Bei der Wiederherstellung der Brust nach Mastektomie gilt jedoch die autologe

Mammarekonstruktion als Goldstandard. Hierbei wird eine Lappenplastik aus

Eigengewebe zum Brustaufbau verwendet. Hierfür eignet sich besonders Gewebe des

Abdomens, wie der Muskel-sparende transverse M.-rectus-abdominis-Lappen (ms-

TRAM-Lappen) oder der deep inferior epigastric artery perforator flap (DIEP-Lappen).

Der ms-TRAM-Lappen ist ein freier Lappen, bei welchem die inferioren epigastrischen

Einleitung 11

Gefäße mikrochirurgisch z.B. an die A. bzw. V. mammaria interna angeschlossen

werden. Diese Technik wird als muskelsparend bezeichnet, da ausschließlich der

Muskelanteil entnommen wird, in dem Gefäße aus der Gefäßachse der inferioren

epigastrischen Gefäße ein- bzw. austreten. Es wird zwischen drei verschiedenen

Möglichkeiten der muskelsparenden Technik unterschieden: Der ms0- TRAM enthält

den Musculus rectus abdominis in seiner vollen Breite. Beim ms1-TRAM wird das

laterale Segment des Muskels stehen gelassen. Der ms2-TRAM schont sowohl das

laterale als auch das mediale Segment. Beim ms3-TRAM wird der gesamte Muskel

geschont. Somit handelt es sich beim ms3-TRAM definitionsgemäß um einen DIEP-

Lappen. Desweiteren kann der TRAM-Lappen als gestielter Lappen gehoben werden.

Auch eine vertikale Entnahme des Lappens ist möglich. Dieser Lappen wird

dementsprechend vertikaler M.-rectus-abdominis-Lappen genannt (VRAM), wird aber

nicht typischerweise zur autologen Brustrekonstruktion verwendet [37, 54, 60]. Der

freie DIEP-Lappen ist ein Perforatorlappen und kommt gänzlich ohne Muskelgewebe

aus. [2, 26, 61, 80]. Eine weitere Möglichkeit ist der freie transverse myokutane

Grazilislappen (TMG-Lappen) vom Oberschenkel oder der A.-glutealis-superior-

Perforator-Lappen (SGAP-Lappen) aus der Gesäßregion, bei welchem kein Muskel

entnommen wird. Dieser Lappen eignet sich beispielsweise für Patientinnen, die zu

wenig Bauch- und Oberschenkelfett aufweisen. Des Weiteren ist die Rekonstruktion

durch den gestielten myokutanen Latissimus-dorsi-Lappen mit Versorgung durch die A.

und V. thoracodorsalis möglich.

Der Nachteil einer Lappenplastik ist grundsätzlich der Hebedefekt und das Risiko eines

partiellen oder kompletten Lappenverlustes. Zentraler Vorteil ist das Auskommen ohne

körperfremdes Material.

Nach Mastektomie ist auch der Einsatz von Silikonprothesen möglich [32]. Zur

Vordehnung des Gewebes ist gelegentlich ein Expander erforderlich [4, 8, 72]. Nach

kontinuierlicher Aufdehnung der präparierten Gewebetasche mithilfe des Expanders

kann normalerweise nach zwei bis drei Monaten die endgültige Silikonprothese

eingesetzt werden.

Zunehmende Beliebtheit ästhetischer Korrekturen

Mittlerweile wurden über 7000 Studien über Silikonprothesen veröffentlicht. Davon

beschäftigten sich über 2000 Studien mit Silikonprothesen für die

Mammaaugmentation. Im Jahr 2014 wurden allein in den USA 286254

Mammaaugmentationen durchgeführt. Dieser Eingriff führte damit die Liste der

ästhetischen Operationen an. Von 2000 bis 2014 stieg die Häufigkeit der Eingriffe um

Einleitung 12

35%. [1] Das häufigste Alter der Patientinnen, die sich einer Mammaaugmentation

unterzogen lag bei Anfang dreißig. Doch auch viele jüngere Patientinnen ließen sich

operieren: Der Anteil an 20- bis 29-jährigen Patientinnen lag in den USA 2014 bei 29%.

Immerhin 3% der Patientinnen waren sogar minderjährig. Die „American Society of

Plastic Surgeons“ berichtet des Weiteren über eine Zunahme elektiver ästhetischer

Eingriffe. Allein im Jahr 2014 wurden in den USA 15.6 Millionen ästhetische

Operationen durchgeführt. [1] Doch auch in Deutschland wird die plastisch-ästhetische

Chirurgie immer populärer und präsenter in den Medien [36]. Etwa die Hälfte der

befragten niedergelassenen plastischen Chirurgen nutzen beispielsweise soziale

Medien zur Informationsteilung [94].

Komplikationen

Bei rein elektiven Eingriffen, wie der ästhetischen Mammaaugmentation durch

Silikonprothesen, sollte umso mehr kein Nachteil für die Patientin entstehen. Trotzdem

kommt es beim Einsatz von Silikonprothesen häufiger zu ernsten Komplikationen wie

der Kapselfibrose und dem „Gelbluten“, bei welchem Silikonpartikel in das umliegende

Gewebe diffundieren [7, 12, 69]. Diese Partikel können sich in Organen ablagern und

zu Autoimmunerkrankungen, wie Lupus erythematodes führen [44]. Schon 1992 wurde

in einer klinischen Studie über weitere Komplikationen nach Mammaaugmentation

berichtet. Fast ein Drittel der Patientinnen litt an einer periprothetischen Kalzifizierung.

Außerdem kam es in 17% der Fälle zu einer Deformierung der Prothese und in 5% lag

ein Implantatleck vor. [23] Eine weitere Komplikation ist der Abrieb von Silikonpartikeln.

Diese können hämatogen oder lymphogen streuen und sowohl lokal als auch peripher

sogenannte Silikonome bilden. Hierbei handelt es sich um Granulome, die sich als

Fremdkörperreaktion auf die Silikonpartikel bilden. Sogar von einem intrapulmonalen

Silikonom wurde berichtet. [25] Risiken, worüber jede Patientin u.a. aufgeklärt werden

muss, sind neben einem unbefriedigenden ästhetischen Ergebnis das Risiko für

weitere Erkrankungen sowie Schmerzen. Die mit Schmerzen der Brust einhergehende

Kapselfibrose ist für viele Patientinnen ein Grund, sich einer Revision zu unterziehen.

Einleitung 13

3.2 Kapselfibrose

Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden gängige operative Verfahren etabliert, die

größere Komplikationen nach der Prothesenimplantation vermeiden sollten. Der

Großteil der Patientinnen ist mit dem Ergebnis ihrer kosmetischen Brustoperation

zufrieden [68, 77, 98]. Die meisten Frauen schildern dabei eine positivere

Wahrnehmung der eigenen Figur [6, 15, 76]. Dennoch häufen sich bis dato

postoperative Probleme, welche für die Patientin mitunter sehr belastbar sein können.

Komplikationen sind ein signifikanter Risikofaktor für die Unzufriedenheit der

Patientinnen [18].

Ein zufriedenstellendes äußerliches Ergebnis ist für die Patientin also essentiell. In

keiner anderen Fachrichtung spielt Ästhetik eine solch große Rolle wie in der

plastischen Chirurgie – nicht zuletzt weil das Operationsergebnis durch die Patientin

visuell beurteilbar ist. Als sekundäres Geschlechtsmerkmal ist der Stellenwert der

ästhetischen Form der Brust für die Patientin nicht zu unterschätzen.

Die häufigste Komplikation nach Mammaaugmentation durch Silikonprothesen ist die

Kapselfibrose [32, 39]. Am häufigsten tritt diese innerhalb des ersten Jahres nach der

Operation auf [41]. Nach der Operation bildet sich als natürliche Reaktion auf den

eingesetzten Fremdkörper eine physiologische Bindegewebshülle, die im Idealfall dünn

und elastisch bleibt. Bei der Kapselfibrose ist die Hülle jedoch fester und verdickt. Die

Brust wird hierbei härter, spannt und es können starke Schmerzen auftreten. Durch

Kontraktion der Bindegewebshülle kann sich die Silikonprothese und dadurch die

gesamte Brust verformen. [14, 35] Schmerzen sowie eine Verhärtung der Brust sind

die medizinischen Hauptgründe für eine spätere Explantation [83]. Umso wichtiger ist

es, die Fremdkörperreaktion des Körpers gegenüber der Silikonprothese zu

untersuchen und die Ursachen für eine Kapselfibrose näher zu beleuchten.

Einteilung der Kapselfibrose in Schweregrade

Von Wilfingseder und Baker wurden Klassifikationen eingeführt, welche die

Veränderungen im angrenzenden Gewebe um die Prothese herum bzw. das klinische

Erscheinungsbild beschreiben, wobei heutzutage im klinischen Alltag insbesondere

die Klassifikation nach Baker Anwendung findet. Baker klassifizierte die

Veränderungen anhand palpatorischer und makroskopischer Kriterien, wobei diese

Einteilung untersucherabhängig ist. Wilfingseder teilte die Schweregrade der

Kapselfibrose nach histopathologischen Kriterien ein. Zu beachten ist, dass der Grad I

Einleitung 14

in beiden Einteilungen dem gewünschten postoperativen Idealzustand entspricht, also

dem Fehlen einer Kapselfibrose.

In der Tab. 1 sind beide Einteilungen im Vergleich dargestellt.

Tab. 1: Übersicht der Klassifikationen nach Baker und Wilfingseder [59, 71, 84]

Grad Baker Wilfingseder

I Implantat nicht palpabel,

Implantatkontur nicht sichtbar Dünne, nicht kontrahierte Kapsel

II Implantat leicht verhärtet,

Implantatkontur nicht sichtbar

„konstriktive Fibrose“,

keine Riesenzellen

III Implantat deutlich verhärtet,

Implantatkontur sichtbar „konstriktive Fibrose“, Riesenzellen

IV Implantat stark verhärtet,

disloziert und deformiert,

Schmerzen

Entzündungszellen, Fremdkörper-

granulome, Neovaskularisierung,

evtl. Neurome

Ätiologie der Kapselfibrose

Obwohl die Kapselfibrose die häufigste Komplikation nach Prothesenimplantation in

der Mamma ist, wurde deren genaue Ursache bis dato nicht geklärt. Es wird von einer

multifaktoriellen Pathogenese ausgegangen [73, 79].

Fibrotische und inflammatorische Komponenten

In der Vergangenheit wurden verschiedene Ursachen diskutiert, welche zur Ausbildung

einer Kapselfibrose führen könnten. Eine zentrale Rolle spielt hierbei eine lokale

Inflammation, bei der T-Helferzellen vom Typ 2 Interleukin-13 ausschütten. Dieses

Zytokin stimuliert in Monozyten und Makrophagen die Produktion des Transforming

growth factor β1 (TGFβ1). Dieser Vorgang wird durch Interleukin 4 und TNFα

moduliert. [29, 56] TGFβ1 gilt als potenter Regulator im Umbau von Extrazellulärmatrix

(EZM) [47, 48, 55, 83]. So ist TGFβ1 bei fibrotischen Erkrankungen wie Morbus

Dupuytren, der Lungenfibrose, der Herzfibrose, sowie in Narbengewebe höher

exprimiert als in gesundem Gewebe [53, 55]. Eine höhere Expression von TGFβ1

wurde auch bei Patientinnen mit Kapselfibrose nachgewiesen. Diese korrelierte mit

einer größeren Menge an gebildeter Extrazellulärmatrix (EZM). Zwischen TGFβ1 und

dem Baker-Grad konnte allerdings keine signifikante Korrelation festgestellt werden.

[52, 89]

Einleitung 15

TGFβ1 ist außerdem das Schlüsselenzym bei Gewebeveränderungen, die mit

Myofibroblasten einhergehen. Das Zytokin reguliert hierbei die Differenzierung dieser

bifunktionalen Zellen. [16, 22] Die Umwandlung von Fibroblasten in Myofibroblasten

führt ebenfalls zur gesteigerten Expression von TGFβ1 [81]. Unter den Myofibroblasten

sind mesenchymale bifunktionale Zellen zu verstehen, die sowohl Eigenschaften der

Fibroblasten (Produktion von Kollagen), als auch der glatten Muskelzellen (Fähigkeit

zur Kontraktion) aufweisen und für die Kapselkontraktur verantwortlich gemacht

werden. [5] Myofibroblasten finden sich klassischerweise bei der Wundheilung und bei

fibroproliferativen Erkrankungen, wie beispielsweise der Lungen-, Leber- oder

Nierenfibrose [31]. Zwischen den Myofibroblasten und dem Baker-Grad ließ sich eine

positive Korrelation feststellen [14]. Auch im Rattenmodell wurde die Ausbildung einer

neuen Schicht mit diesen Zellen angrenzend an die Silikonprothese beobachtet. [78]

Des Weiteren kann es zum Silikonabrieb aus der Prothese kommen - dem

sogenannten Silikonbluten [7, 27, 83]. Die Partikel führen zu einer lokalen

Entzündungreaktion, indem Makrophagen aktiviert werden. Diese phagozytieren die

Fremdpartikel, schütten daraufhin selbst Zytokine aus und halten so den

inflammatorischen Prozess aufrecht.

Der proinflammatorische Tumornekrosefaktor α (TNFα) spielt ebenfalls eine wichtige

Rolle. Eine signifikante Korrelation bestand bei Patientinnen mit Kapselfibrose

zwischen der Expressionsmenge des TNFα und der Höhe des Baker-Grades [89].

Nach Zusammenlagerung von drei TNFα-Molekülen kann das Trimer an zwei

verschiedene Rezeptoren binden. So aktiviert es zum einen den 55-kDA Typ I

Rezeptor (TNFR1) und zum anderen den 75-kDA Typ II Rezeptor (TNFR2). Die

bedeutendste Rolle im Signalweg spielt dabei die Aktivierung des TNFR1. TNFα

aktiviert den Transkriptionsfaktor „kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells“

(NF-κB) und das Aktivatorprotein-1 (AP-1). [95] Beide spielen eine wichtige Rolle in der

Regulation von Zellproliferation und Apoptose.

Des Weiteren wurde beobachtet, dass TGFβ1 von TNFα beeinflusst wird [95]. TNFα

und TGFβ stehen miteinander in biologischer Wechselwirkung.

Bakterien

Es wird ebenfalls eine bakterielle Genese diskutiert, die zur Inflammation führen soll.

So könnten etwa Bakterien der Hautflora, wie Staphylococcus epidermidis iatrogen bis

zur Brustprothese verschleppt werden und einen Biofilm bilden [50, 65, 67]. Diesen

nutzen sie als Schutz vor der Opsonierung. Das bedeutet, die Bakterien sind

schlechter durch Abwehrzellen wie etwa Neutrophile angreifbar, da sie sich mit ihrem

Einleitung 16

Biofilm schützen. Vor allem aber begünstigen die Bakterien eine Fibrose, die potenziell

in einer Kapselkontraktur münden kann [24, 50, 86]. In einer klinischen Studie wurde

nachgewiesen, dass die Kapselkontraktur signifikant mit dem Vorhandensein von

Bakterien auf dem Implantat korreliert [21].

Kollagenschicht

Um die Silikonprothese scheint sich immer eine neue Kollagenschicht zu bilden. Diese

wird in der Literatur auch als Kapsel bezeichnet, die das Implantat global umgibt. [17,

63, 78, 97] Eine Kontraktion durch dieses proliferierende Gewebe ist denkbar. Es

konnte gezeigt werden, dass die Stärke der Kapselkontraktur mit der

Kollagenschichtdicke korreliert [71, 83]. Aus diesem Grund wurde in der Vergangenheit

zudem der Proliferationsmarker Ki67 gemessen. Erwartungsgemäß sollte die

Proliferationstendenz bei der Kapselfibrose hoch sein. Ki67 war bei Patientinnen mit

Kapselfibrose zwar exprimiert, korrelierte jedoch nicht mit der Höhe des Baker-

Grades [82]. Ki67 wird ansonsten klassischerweise in der Tumordiagnostik eingesetzt,

um die Mitoserate der Tumorzellen einschätzen zu können.

Remodeling im angrenzenden Gewebe der Silikonprothese

Matrix-Metalloproteinasen (MMP) und deren Inhibitoren “Tissue inhibitors of

metalloproteinase“ (TIMP) sind für den Umbau der EZM zuständig. So kann eine

geringere Expression der MMP bzw. eine höhere Expression von TIMP zur vermehrten

Produktion von periprothetischer EZM führen [93].

Die MMP1 ist eine interstitielle Kollagenase, welche EZM abbaut. Der Erwartung nach

könnte dieses Enzym bei der Ausbildung einer neuen Kollagenschicht weniger aktiv

sein, wenn sich eine Kollagenschicht um das Implantat bildet. Speziell bei Patientinnen

mit Kapselfibrose oder Morbus Dupuytren war der Mengenunterschied der MMP1 im

Vergleich zu gesunden Patienten jedoch nicht signifikant [91, 92].

Die Gegenspieler der MMP sind die TIMP. Diese Inhibitoren binden die MMP dabei in

einer 1:1 Stöchiometrie. In humanem Mammagewebe wurden bisher vier verschiedene

Typen identifiziert: TIMP1, -2, -3 und -4. Diese Moleküle sind zu 40% homolog in ihrer

Struktur und bezüglich ihrer Reaktionspartner unspezifisch, jedoch unterscheiden sie

sich in ihrer Bindungsaffinität. Bei fibrösen Umbauvorgängen in der EZM sind MMP

und TIMP dysreguliert und unterstützen nach einer Gewebeschädigung den

Heilungsprozess. Sowohl MMP als auch TIMP tragen also zur Regulation des Auf- und

Abbaus von EZM bei. [11, 64] In der Ätiologie der Kapselfibrose scheint hierbei vor

Einleitung 17

allem TIMP1 eine Rolle zu spielen. Bei Patientinnen mit höherem Baker-Grad wurden

signifikant höhere Serumkonzentrationen des TIMP1 gemessen [92].

Des Weiteren wurde in vergangenen Studien das Verhältnis von MMP zu TIMP per

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in humanem Serum untersucht. Dieses

war sowohl bei größerer Ausprägung einer Kapselfibrose, als auch bei Morbus

Dupuytren signifikant geringer als in gesundem Gewebe [91, 92]. Dies bestätigt eine

Dysregulation zwischen MMP und TIMP bei Fibrose.

Tierexperimentelle Untersuchungen zur Dysregulation der MMP und der TIMP beim

Einsatz von Silikonprothesen fehlen bislang.

Prävention der Kapselfibrose

Zur Prävention einer Kapselfibrose werden in der Literatur verschiedene Möglichkeiten

diskutiert. Die wichtigsten Ansatzpunkte sind hierbei Eigenschaften der Silikonprothese

selbst, das operative Vorgehen und die zusätzliche Implantation einer Hüllschicht. Ziel

ist eine Reduktion der Inflammation im angrenzenden Bereich um die Silikonprothese.

Auch bezüglich des operativen Vorgehens gibt es zahlreiche Untersuchungen, welche

das Ergebnis für die Patientin untersuchen. In-vitro zeigten humane Fibroblasten

bezüglich einer texturierten oder glatten Oberfläche Verhaltensunterschiede. [81] Es

konnte gezeigt werden, dass texturierte Silikonprothesen weniger häufig zu einer

Kapselfibrose führen als glatte Silikonprothesen. Zudem erwies sich diesbezüglich eine

submuskuläre Lage der Silikonprothese als protektiv im Vergleich zu einer

subglandulären Lage. Zusammenfassend scheint eine texturierte Silikonprothese,

welche submuskulär eingebracht wird, die besten Ergebnisse zu erzielen bzw. die

geringsten Komplikationen hervorzurufen. [88] Außerdem sind Silikonprothesen in

verschiedenen Formen erhältlich. Hierbei konnte kein signifikanter Unterschied

zwischen runden und anatomischen Silikonprothesen festgestellt werden. [33] Des

Weiteren ist ein aseptisches Arbeiten im Umgang mit der Silikonprothese essentiell.

Vor dem Einbringen der Silikonprothese kann ein Handschuhwechsel des Chirurgen

sowie eine erneute Desinfektion des OP-Gebietes und eine Folienabdeckung der

Implantattasche erfolgen. Die sterile Folie wird danach mit einem frischen Skalpell

durchtrennt und die Silikonprothese in die Tiefe eingesetzt. Zudem kann das Implantat

mit einer sterilen Plastiktüte im Sinne eines Spritzbeutels ohne Hautkontakt

eingebracht werden. Auf diese Weise sollen kleinste Läsionen an der Prothese und vor

allem eine Kontamination der Silikonprothese mit Keimen der Hautflora gering gehalten

werden. Speziell die Besiedlung der Silikonprothese mit Bakterien und die damit

einhergehende Biofilmbildung erwies sich als möglicher Auslöser für eine

Einleitung 18

Kapselfibrose. Insbesondere Staphylokokken und Streptokokken, also Bakterien der

Hautflora, können zu Infektionen führen. [3] Experimentell wurden bisher

verschiedenste Substanzen eingesetzt, um eine Kapselfibrose zu verhindern. Der

Einsatz von Botulinum Neurotoxin Typ A zeigte beispielsweise präventive Effekte

hinsichtlich einer Kapselfibrose im Mausmodell [57]. Applikationen mit Vitamin E,

Steroiden, Antibiotika und Leukotrienantagonisten erwiesen sich ebenfalls als protektiv

[58, 96]. Auch das antiprotozoisch wirkende Medikament Halofuginon reduzierte die

Neubildung von Kollagen [66].

Zur besseren Integration der Silikonprothese werden in der Klinik zudem bereits

verschiedene azelluläre Matrizes eingesetzt. Hierfür wurde ein Verfahren etabliert, bei

dem das (humane/porzine/bovine) Spendergewebe gereinigt, konserviert und

sterilisiert wird. Unterschieden wird zwischen humanen, bovinen und porzinen

Präparaten.

Azelluläre Matrizes werden heute in verschiedensten chirurgischen Fächern

verwendet. In der plastischen Chirurgie werden sie etwa zur Versorgung von

Brandwunden, Bauchwandrekonstruktion, Mammaaugmentation durch Silikon-

prothesen, Nasenrückenrekonstruktion, Vaginalplastik oder Lidstraffung eingesetzt.

Dies sind nur einige Beispiele aus dem weitreichenden Anwendungsbereich. [9, 10, 13,

20, 38, 45]

3.3 Azelluläre Dermis

Als Übergang zwischen körperfremder Silikonprothese und körpereigenem Gewebe

könnte eine Schicht aus azellulärer Dermis fungieren. Diese soll im Idealfall eine

Fremdkörperreaktion und somit eine Kapselfibrose verhindern.

Bis dato wurden neben allogenem Material verschiedenste xenogene Transplantate

aus bovinem oder porzinem Gewebe extrahiert. In der Vergangenheit wurde die

Integration azellulärer Matrizes im Rattenmodell histologisch über einen Zeitraum von

12 Wochen untersucht. Die APD soll als biologische Matrix in den Körper integriert

werden und zu weniger Fremdkörperreaktion führen. Ob sie eine Kapselfibrose in der

Klinik schlussendlich effizient verhindern kann, wurde bisher nicht bestätigt.

Im Jahr 2013 wurde die azelluläre porzine Dermis Fortiva® in den USA zugelassen

(Fortiva®, Tutogen Medical, Neunkirchen am Brand, Deutschland). Es handelt sich um

eine unvernetzte kollagene Matrix. Laut Hersteller soll diese ausreichend durchlässig

sein, um eine Neovaskularisation und ein Remodeling zu ermöglichen. Die APD soll im

http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php?wiki=antiprotozoisch

Einleitung 19

Idealfall also von körpereigenen Gefäßen und Zellen infiltriert und dadurch in den

Körper integriert werden.

3.4 Zielsetzung und Fragestellung

Ziel dieser Studie war es, die Auswirkung von APD auf die Integration von

Silikonprothesen in der Ratte zu untersuchen. Hierfür wurden Parameter untersucht,

welche bei Patientinnen mit Kapselfibrose typischerweise verändert sind. Anhand

dieser Marker sollten Inflammation, Proliferation und Fibrose in unmittelbarer

Umgebung der Silikonprothese beurteilt werden. Verglichen wurde der Einsatz von

Silikonprothesen mit und ohne Hülle aus APD.

Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Langzeitgruppe von 52 Wochen. Bis dato

wurde in der Vergleichsliteratur bei vergleichbaren Fragestellungen keine annähernd

langfristige Untersuchung mit einer solch hohen Stichprobenzahl durchgeführt.

Des Weiteren sollte untersucht werden, welche Reaktionen die APD bei solitärer

Implantation (ohne eine Silikonprothese) hervorruft.

Material und Methoden 20

4 Material und Methoden

4.1 Versuchsaufbau und Gruppeneinteilung

Alle Versuche dieser Studie wurden von der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg autorisiert und es lag eine Genehmigung der Regierung

Mittelfranken (Ansbach, Deutschland) vor (Tierversuchsantragsnummer 54-2532.1-

50/13).

Für die Versuche standen insgesamt 84 syngene Lewis-Ratten zur Verfügung. Die

Tiere wurden drei verschiedenen Gruppen zugeteilt:

In der Versuchsgruppe (n=32 Tiere) wurden Silikonprothesen mit APD als Hüllmatrix

eingesetzt.

In der Kontrollgruppe (n=28 Tiere) wurden nur Silikonprothesen implantiert.

In der zusätzlichen Versuchsgruppe (n=24 Tiere) wurde nur APD implantiert.

Die Abb. 1 zeigt diese Gruppeneinteilung zusammenfassend.

Abb. 1: Schema der Gruppen


In allen drei Gruppen wurden jeweils zwei Konstrukte pro Tier dorsal links und rechts

eingesetzt. Die Lage der Prothesen ist der Abb. 2 zu entnehmen.

Abb. 2: Ratte nach der Implantation von zwei Silikonprothesen mit APD

Das Foto zeigt exemplarisch eine Ratte der 6-Wochen-Versuchsgruppe unmittelbar nach der Implantation

der Prothesen. Im rasierten Operationsgebiet ist die Lage beider Konstrukte lateral der Lendenwirbelsäule

zu erkennen. Am Kopfende wird die Ratte per Inhalationsnarkose versorgt.

In der Tab. 2 ist die Anzahl der Versuchstiere der genannten Gruppen dargestellt. Die

doppelte Anzahl der Konstrukte im Vergleich zur Anzahl der Ratten ergibt sich durch

die beidseitige Implantation.

Tab. 2: Umfang der definierten Gruppen

Gruppe Ratten (n=) Konstrukte (n=)

Kontrollgruppe 28 56

Versuchsgruppe 32 64

Zusätzliche Versuchsgruppe 24 48

Insgesamt 84 168

Zu Beginn wurden alle 168 Konstrukte implantiert. Nach 3, 6, 12 und 52 Wochen

erfolgte die Explantation.


Die jeweilige Anzahl der explantierten Elemente kann der Tab. 3 entnommen werden.

Tab. 3: Anzahl der Explantate nach Zeitpunkten und Gruppen

Gruppe

Konstrukte

Explantations-

Zeitpunkt

3 Wochen

(n=)

Konstrukte

Explantations-

Zeitpunkt

6 Wochen

(n=)

Konstrukte

Explantations-

Zeitpunkt

12 Wochen

(n=)

Konstrukte

Explantations-

Zeitpunkt

52 Wochen

(n=)

Kontroll-

gruppe 10 12 12 22

Versuchs-

gruppe 16 16 16 16

Zusätzliche

Versuchs-

gruppe

12 12 12 10*

* Zum Explantationszeitpunkt 52 Wochen fehlten zwei Explantate in der zusätzlichen Versuchsgruppe, da

eine Ratte verstorben ist.

Die Anzahl der Versuchstiere in der zusätzlichen Versuchsgruppe wurde aus ethischen

Gründen geringer gewählt als in der Versuchsgruppe, da lediglich eine untergeordnete

Fragestellung untersucht werden sollte.

Die Anzahl der explantierten Konstrukte waren in Versuchs- und Kontrollgruppe

unterschiedlich hoch. Für die molekularbiologische Auswertung wurde jedoch jeweils

die gleiche Anzahl an Proben in den Gruppen ausgewählt. Bei der statistischen

Auswertung wurden Modelle angewandt, welche die verschieden hohe Probenanzahl

berücksichtigen.

4.2 Versuchstiere

Da im Körper zahlreiche biologische Faktoren zusammenspielen und davon

ausgegangen werden muss, dass die Kapselfibrose einer multifaktoriellen

Pathogenese obliegt, war es notwendig, die Auswirkungen der APD im lebenden

Organismus zu untersuchen. Nur in einem dem Menschen ähnlichen Lebewesen kann

den vielfältigen biologischen Vorgängen und Interaktionen Rechnung getragen werden,


so dass für diese Arbeit nur ein Säugetier in Frage kam. Ratten sind die

sinnesphysiologisch am niedrigsten entwickelten Tiere, bei welchen die Implantation

der Konstrukte praktikabel ist. Die Lewis-Ratte eignet sich als etabliertes Versuchstier

für die Beurteilung der Integration von APD und Silikonprothese und deren Auswirkung

auf die Kapselfibrose. Bei den Versuchstieren handelte es sich um 84 syngene

männliche Lewis-Ratten (Charles River, Sulzfeld, D). Untergebracht wurden die Tiere

unter Befolgung der tierschutzrechtlichen Vorgaben im Franz-Penzoldt-Zentrum der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Die Ratten wurden bei einer

konstanten Raumtemperatur von 22°C, einer gleichbleibenden Luftfeuchtigkeit von

50% und einem Hell-/Dunkelzyklus von 12 Stunden in Einzelkäfigen gehalten. Ihnen

stand artgerechtes Futter ad libitum zur Verfügung (ssniff Spezialdiäten, Soest, D). Die

Ratten wurden mindestens eine Woche vor dem operativen Eingriff geliefert, um eine

Adaptation an die neue Umgebung zu gewährleisten.

4.3 Silikonprothesen

Aufgrund der Größenverhältnisse zwischen einer Ratte und herkömmlichen

Mammaprothesen wurden kleinere Hundehoden-Prothesen eingesetzt. Deren Aufbau

entspricht dem der Mammaprothesen. Insgesamt kamen 180 sterile glatte

Silikonprothesen mit einer Länge von 0.63" inch = 1.6 cm zum Einsatz (Neuticles

UltraaNeuticles®ULTRAPLUS XX small, Neuticles CTICorporation, Oak Grove, MO,

USA). Die Silikonprothesen mussten nach der Explantation entfernt und entsorgt

werden, bevor das umliegende Gewebe untersucht werden konnte. In der Abb. 3 sind

exemplarisch zwei Silikonprothesen dargestellt.

Abb. 3: Zwei Silikonprothesen vor Implantation in der Kontrollgruppe

http://www.fpz.uni-erlangen.de/


4.4 Azelluläre porzine Dermis

Bei dem eingesetzten Produkt handelt es sich um eine biologische Matrix, die aus

porziner Dermis zell- und antigenfrei aufbereitet wird (Fortiva®, Tutogen Medical,

Neunkirchen am Brand, D). Hierbei wird das xenogene Transplantat gewebeschonend

gereinigt, sterilisiert und anschließend bestrahlt. Die bei Lieferung prähydrierte APD

wurde unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur und vor Sonne geschützt

gelagert. Das Produkt ist mit der CE-Kennzeichnung 0197 zertifiziert (TÜV Rheinland

LGA Products). Die verwendete APD war laut Hersteller 16 cm lang, 20 cm breit und

1,5 mm ± 3 mm dick. Vor der Implantation wurde sie jedoch unter sterilen Bedingungen

an die Größe der Silikonprothesen angepasst. Der Zuschnitt erfolgte so, dass die APD

als geschlossene Hüllschicht um die Silikonprothese gelegt werden konnte.

In der Abb. 4A und B ist das Material nach Zuschnitt im Querschnitt und in

Flächenansicht dargestellt. Außerdem erlaubt der abgebildete Nadelhalter im Foto eine

grobe Einschätzung der Größenverhältnisse. Die verschlossene APD als Hülle um die

Silikonprothese ist in Abb. 4C von oben und in Abb. 4D von der Seite dargestellt. Die

APD wurde hierbei durch eine fortlaufende Naht verschlossen.

Abb. 4: Azelluläre porzine Dermis

(A) APD im Querschnitt; (B) APD in Flächenansicht; (C,D) Mit APD umhüllte Silikonprothesen

4.5 Operationsprotokolle

Implantation

Die Ratten wurden mit Isofluran inhalativ narkotisiert und anschließend gewogen

(Forene® 100%, Völtar GmbH, Hamburg, D). Nachfolgend wurde das Fell im

Operationsbereich abrasiert und mit alkoholhaltigem Hautantiseptikum steril

abgewaschen (Cutasept® F, Bode Chemie, Hamburg, D).

In die Nackenfalte wurden 0.2 ml Rimadyl® (Wirkstoff: Carprofen) subcutan injiziert

(Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, D). Dieses Analgetikum gehört zur Gruppe der

C D B A


nichtsteroidalen Antirheumatika. Zur Antibiose wurden 0.2 ml Veracin® (Wirkstoffe:

Dihydrostreptomycinsulfat, Benzylpenicillin-Procain und Benzylpenicillin-Benzathin)

intramuskulär in die Hinterläufer gespritzt (Albrecht GmbH, Aulendorf, D).

Lateral der Lendenwirbelsäule erfolgte anschließend die Hautinzision per Skalpell. Mit

einer Präparierschere wurde unter dem Panniculus carnosus eine kleine Tasche

stumpf freigelegt. In diese wurde das jeweilige Konstrukt eingesetzt. Schließlich

wurden Dermis und Subkutis durch Einzelknopfnähte mit einem resorbierbaren

geflochtenen Faden aus Polyglactin 910 adaptiert (Vicryl® 4-0, Johnson&Johnson

Medical GmbH, Ethicon Surgical Care, Norderstedt, D). Während der Aufwachphase

wurden die Tiere überwacht und erhielten im Anschluss Trinkwasser, welches 3 Hübe

Tramadolhydrochlorid auf 500 ml Wasser (entspricht einer Konzentration von 75 mg/l)

enthielt (Tramal® Tropfen, Grünenthal, Aachen, D). Während der ersten 10 Tage nach

der Operation wurde täglich die Lokalisation der Implantate palpatorisch überprüft und

eine Wundheilungsstörung, sowie subcutane Serombildung ausgeschlossen.

Explantation

Zunächst wurden die Ratten mit Isofluran (Forene® 100%, Völtar GmbH Hamburg, D)

inhalativ narkotisiert und anschließend gewogen. Das Fell wurde im Operationsgebiet

rasiert und antiseptisch abgewaschen (Cutasept® F, Bode Chemie, Hamburg, D). Mit

einer chirurgischen Schere wurde behutsam von der Haut bis in die Tiefe zum

implantierten Konstrukt präpariert. Daraufhin erfolgte die Exstirpation hufeisenförmig

unter dem Konstrukt. Die En-bloc-Resektate wurden bis zur histologischen

Aufarbeitung in Formaldehyd (Roti®-Histofix 4%, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D) im

Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Die Euthaniserung der Tiere erfolgte unter

Aufrechterhaltung der Narkose unmittelbar nach der Explantation durch die

intrakardiale Injektion von 0,5 ml T61® (Intervet Deutschland GmbH,

Unterschleißheim, D).


4.6 Aufarbeitung der Gewebeproben

Am Tag nach der Explantation wurden die Konstrukte für die molekularbiologischen

und histologischen Untersuchungen vorbereitet. Bei den Explantaten der Versuchs-

und Kontrollgruppe wurde die Silikonprothese zunächst entfernt. Die Resektate wurden

mit der Hautseite nach unten auf einer glatten Unterlage ausgerichtet.

Wie in der Abb. 5 eingezeichnet, wurden mit einem Skalpell in senkrechter paralleler

Schnittführung vier Teile abgetrennt. Es wurde darauf geachtet, dass in jedem

Abschnitt alle Schichten des Konstrukts enthalten sind. Für die histologische

Auswertung wurden drei Zuschnitte von je etwa 8 mm Dicke (s. Abb. 5,

Markierungen A-C) und für die molekularbiologische Auswertung ein etwas breiterer

Anteil von etwa 12 mm Dicke zugeschnitten (s. Abb. 5, Markierung D). Letzterer wurde

für die molekularbiologischen Untersuchungen aus Frischgewebe aufbewahrt. Die

finalen Ergebnisse der qPCR entstammen jedoch den Untersuchungen aus

Paraffinblöcken - also aus Abschnitt A, B oder C (nähere Informationen zur RNA-

Isolation aus Paraffinblöcken s. Kap. 4.7).

Abb. 5: Schematischer Zuschnitt eines Explantates

Probe der Versuchsgruppe, Explantations-Zeitpunkt 6 Wochen; Unter der Gewebevorwölbung befindet

sich noch die mit APD umhüllte Silikonprothese. Diese wurde vor dem Zuschnitt entnommen.

(A-C) Proben für die histologischen und molekularbiologischen Untersuchungen; (D) Probe, die

ursprünglich für die molekularbiologischen Untersuchungen hervorgesehen war

Anschließend wurden die zugeschnittenen Proben für die histologischen

Untersuchungen mit der optisch besseren Schnittfläche nach unten zeigend einzeln in

Einbettkassetten gelegt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass zwischen den

Gewebeschichten keine Scherkräfte entstehen. Bereits hier wurden die drei Schnitte

makroskopisch nach Adhärenz, Glätte der Schnittfläche und Vollständigkeit beurteilt

und aufgrund dieser Kriterien in eine Rangfolge gebracht. Waren die Schichten unter

A B C D


dem Mikroskop nicht adhärent, so konnte der makroskopisch zweitbeste Schnitt

untersucht werden.

Zunächst erfolgte die Dehydrierung im Gewebeeinbettautomat nach Protokoll, welches

der Tab. 4 zu entnehmen ist (Shandon Hypercenter XP, Thermo Shandon

GmbH/Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Die entwässerten Proben

wurden anschließend in einer Ausgießstation (Shandon Histocenter 2, Thermo

Shandon GmbH/Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) in Paraffin

eingebettet.

Tab. 4: Entwässerungsprotokoll

Reagenz Inkubationszeit (min)

Formalin 10%1

180

Ethanol 70%2 30

Ethanol 96%2 60

Ethanol 100%2 2x60

Isopropanol2 2x60

Xylol2 3x60

Paraffin3 2x60

Spülung mit Paraffin3 20

1Roti®-Histofix 10 %, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

2Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

3Sasol Wax GmbH, Hamburg, D

4.7 Molekularbiologische Untersuchungen

Für die molekularbiologischen Untersuchungen wurde Boten-Ribonukleinsäure (engl.:

messenger ribonucleic acid; mRNA) aus den Paraffinblöcken isoliert, anschließend in

komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) umgeschrieben und mit Hilfe der

Real-time Polymerasekettenreaktion (qPCR) vervielfältigt. Die initiale Menge der

exprimierten Gene sollte anschließend Aufschluss über regulatorische Veränderungen

in Kontroll- bzw. Versuchsgruppe geben. Bei den finalen Untersuchungen wurden

jeweils acht Proben der Versuchsgruppe und acht der Kontrollgruppe zu den

Explantations-Zeitpunkten 12 und 52 Wochen - also insgesamt 32 Proben - untersucht.


Es wurden solche Gene herangezogen, die Aufschluss über inflammatorische sowie

fibrotische Umbauvorgänge im Gewebe geben könnten: TGFβ1 wurde als

Fibrosemarker eingesetzt, TNFα fungierte als inflammatorischer Marker und MMP1

sowie TIMP1 wurden als Indikatoren für ein Remodeling eingesetzt.

Etablierung geeigneter Methoden

Der nachfolgende Abschnitt beschäftigt sich mit der Optimierung der

molekularbiologischen Methoden. Die endgültigen Protokolle sind den Kapiteln 4.7.1-

4.7.4 zu entnehmen.

RNA-Isolation aus Paraffinblöcken

Die molekularbiologischen Fragestellungen ergaben sich während der Anfangsphase

des Projekts. Als bereits erste Explantationen stattgefunden hatten, waren die

exstirpierten Präparate ausschließlich in Form von Paraffinblöcken konserviert worden.

Bei allen nachfolgenden Explantationen wurde zusätzlich zur Paraffinkonservierung

jeweils ca. ein Drittel des entnommenen Frischgewebes eingefroren.

Zunächst musste geprüft werden, ob sich aus den ersten Paraffinblöcken, welche zu

diesem Zeitpunkt bereits mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert worden waren

grundsätzlich mRNA isolieren lässt. Hierfür wurde zunächst das RNeasy® FFPE Kit

getestet (Qiagen GmbH, Hilden, D). Zunächst konnten hiermit nur geringe Mengen bis

gar keine mRNA gewonnen werden. Die höchste gemessene Dichte an isolierter

mRNA in Lösung lag mit dieser Methode vorerst bei nur 24.8 ng/μl.

Die Möglichkeit aus den Paraffinblöcken mRNA zu gewinnen schien also grundsätzlich

gegeben, jedoch war eine deutliche Optimierung bei der Isolation notwendig.

Hierfür wurde ein paraffinlösendes Produkt, welches keinen Einfluss auf die Struktur

der Nukleinsäuren hat vor dem Isolationsprozedere zu den Paraffinschnitten gegeben.

Das Protokoll der mRNA-Isolation wurde auf diese sogenannte „Deparaffinization

Solution“ (Qiagen GmbH, Hilden, D) abgestimmt und anhand der Ergebnisse weiter

optimiert.

Beim Vortexen von fünf Paraffinschnitten mit je 10 μm Dicke kam es auch mit der

Deparaffinization Solution zur Agglomeration im Eppendorf-Gefäß, die sich auch mit

Wärme nicht revidieren ließ. Deshalb wurde die Anzahl der eingesetzten

Paraffinschnitte auf drei reduziert. Mit mehr Flüssigkeit im Verhältnis zum

Paraffinschnitt konnte die Isolation schließlich deutlich erleichtert werden.


RNA-Isolation aus Frischgewebe

Da die Isolation aus Paraffinblöcken im Vergleich zum Frischgewebe aufwendiger und

kostspieliger ist, sollte validiert werden, ob dieses Vorgehen auch hinsichtlich der

Qualität der mRNA eine tragbare Alternative darstellt. So wurde zusätzlich aus

mehreren tiefgefrorenen Frischgewebeproben mRNA isoliert und diese bezüglich der

Konzentration und der Reinheit mit dem Isolationsverfahren aus Paraffinblöcken

verglichen. Hierfür wurde als Bewertungsmaßstab der Quotient aus den Extinktionen

bei 260 nm und 280 nm gewählt, der maschinell gemessen wurde. Für RNA liegt der

optimale Wert dieses Quotienten bei 2. Ist der Quotient geringer, so kann von einer

Verunreinigung durch Proteine, Phenol oder andere Kontaminanten ausgegangen

werden. Zwischen den Isolationsmethoden aus Paraffinblöcken und Frischgewebe

konnte diesbezüglich kein Unterschied beobachtet werden. Beim Frischgewebe konnte

jedoch eine deutlich höhere Dichte der mRNA in Lösung erzielt werden. Diese lag bei

durchschnittlich 2112.5 ng/μl. Jedoch musste zur Transkription in cDNA ohnehin stets

die gleiche Menge an mRNA eingesetzt werden - sprich die Probe wurde je nach

initialer Dichte entsprechend mit Wasser verdünnt. Deshalb konnte die Diskrepanz bei

den Dichtemessungen vernachlässigt werden. Lediglich eine zu geringe Dichte, die

willkürlich bei einem Wert von unter 20 ng/μl definiert wurde, sollte als insuffizient

eingestuft werden. Bei solchen Proben wurde die RNA-Isolation wiederholt.

RNA-Gelelektrophorese

Außerdem wurde stichprobenweise eine RNA-Gelelektrophorese durchgeführt. Das

bedeutet RNA-Fragmente wurden nach Größe aufgetrennt, wanderten danach entlang

einer angelegten Spannung und wurden schließlich im UV-Licht sichtbar gemacht. Auf

diese Weise konnte erneut sichergestellt werden, dass außer der relevanten

Nukleinsäure keine weiteren irrelevanten genetischen Informationen isoliert wurden

(wie etwa menschliche RNA des Untersuchers).

Fazit

Da bei der Isolation aus Paraffinblöcken zusammenfassend keine Qualitätseinbußen

der extrahierten mRNA verzeichnet wurden, konnte diese Methode für die finalen

Ergebnisse angewendet werden.


Transkription der mRNA in cDNA

Zum Umschreiben der mRNA in cDNA wurden zwei verschiedene Kits getestet. Das

Sensiscript® Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, D) lieferte in

Verbindung mit der anschließenden qPCR bessere Ergebnisse als das Quantitect®

Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, D), so dass für die finalen

Untersuchungen ersteres verwendet wurde. Einzig der Primer Mix wurde aus

wirtschaftlichen Gründen weiterhin aus dem Quantitect® Reverse Transcription Kit

verwendet.

qPCR

Für die qPCR wurde stets der SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix

verwendet (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D).

Die Temperatur, bei der sich die Primerpaare an die cDNA anlagern wird als

Annealing-Temperatur bezeichnet. Ist diese zu niedrig gewählt, so kommt es zu einer

instabilen Bindung. Ist sie zu hoch, so wird überhaupt kein Produkt gebildet. In

Kombination mit dem qPCR Kit sollte die ideale Annealing-Temperatur für das

Protokoll bestimmt werden. Für jeden Primer wurde eine qPCR bei verschiedenen

Temperaturen durchgeführt. Getestet wurden in 0.2°C-Schritten Annealing-

Temperaturen zwischen 59°C und 60.2°C. Hierbei wurde aus der Versuchsgruppe

sowohl Frischgewebe, als auch Gewebe aus Paraffinblöcken untersucht. Bei beiden

Verfahren konnten optimale Ergebnisse bei einer Temperatur von 59°C erzielt werden.

Standardkurve

Zum Test der Primereffizienz wurde je Primer-Paar eine qPCR mit unterschiedlichen

Konzentrationen der cDNA durchgeführt. Die Probe mit der höchsten Konzentration

enthielt 4 μl cDNA. Beim darauffolgenden Well lag die Konzentration der cDNA jeweils

noch bei 1:5 der vorherigen. Es wurden insgesamt fünf Verdünnungsstufen

durchgeführt. Idealerweise soll die resultierende Gerade in der qPCR eine Steigung

von m= -3.3 vorweisen. Die Effizienz E, welche automatisch durch das Programm

errechnet wird, soll Werte zwischen 90% und 110% annehmen. Der Parameter R2,

welcher die Linearität bewertet, soll größer als 0.99 sein.


Primerdesign

Wenn die Effizienz des Primer-Paares schlecht war oder wiederholt „Primer-Dimer“

aufgetreten waren, wurde ein neues Primer-Paar designt. Unter „Primer-Dimern“

versteht man die fälschliche gegenseitige Anlagerung von Primern, in dessen Folge die

gesuchte DNA-Sequenz nicht vervielfältigt wird. Diese wurden hinsichtlich Primerlänge,

Produktlänge und angegebener Schmelztemperatur variiert (Primer-Blast, National

Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD,

USA). Die Suche nach einem geeigneten Primer-Paar wurde hinsichtlich folgender

Parameter eingegrenzt: Die Produktlänge (vervielfältigte DNA des gesuchten Gens)

sollte zwischen 40 und 50 Basenpaaren (bp) liegen. Das Primer-Paar selbst sollte

20 bp lang sein. Die Schmelztemperatur sollte zwischen 59°C und 60°C gewählt

werden, da hier das qPCR Kit sein Wirkoptimum hat. Die „Selbstkomplementarität“

innerhalb des Primer-Paares, also die Übereinstimmung in komplementären Basen

sollte den Wert 3 nicht übersteigen. Bei zu hoher Selbstkomplementarität wären

Primer-Dimer die Folge. Außerdem sollte der Gehalt an Guanin und Cytosin möglichst

gering gehalten werden, da dieser mit der Schmelztemperatur korreliert.

Zusammenfassend wurden in den verschiedenen Schritten bis hin zur qPCR mehrere

Kits getestet und Protokolle angepasst. Letztendlich wurde die qualitativ beste

Kombination der Produkte aus den drei verschiedenen Schritten (mRNA-Isolation,

cDNA-Synthese und qPCR) ausgewählt und für alle Proben angewandt.


4.7.1 mRNA-Isolation aus Paraffinblöcken

Zunächst wurden von jedem Paraffinblock drei 10 µm dicke Schnitte mit einem

Mikrotom angefertigt und in Eppendorf-Gefäße gegeben. Zum Entparaffinieren wurde

die „Deparaffinization Solution“ zugegeben (Qiagen GmbH, Hilden, D). Die Mischung

wurde für 10 s in einem Vortexer gemischt und für 3 min auf 56°C erhitzt. Anschließend

wurde die Probe wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Für die nachfolgende mRNA-

Isolation wurde das RNeasy® FFPE Kit (Qiagen GmbH, Hilden, D) verwendet, welches

speziell für Paraffinproben geeignet ist. Die Isolation erfolgte für jede Probe nach

demselben Protokoll in der Tab. 5.

Tab. 5: Protokoll der RNA-Isolation

Reagenz/ Tätigkeit Inkubationszeit Temperatur

240µl Buffer PKD1

- 20°C

Zentrifugieren bei 11000g 1 min 20°C

10 µl Proteinase K1 15 min 56°C

15 min 80°C

Zentrifugieren bei 20000g 15 min 20°C

20 µl DNase Booster Buffer1 - 20°C

10 µl DNase I Stock Solution2 15 min 20°C

500 µl Buffer RBC1 - 20°C

1200 µl Ethanol 100%3 - 20°C

1RNeasy® FFPE Kit Qiagen GmbH, Hilden, D

2 DNase I, RNase free Qiagen GmbH, Hilden, D; gelöst in 550 µl RNase-freiem Wasser

3 Ethanol absolute ≥99,8%, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Zuerst wurde ein Puffer zur Probe gegeben und beim 11000fachen der

Erdbeschleunigung (g) für 1 min zentrifugiert. Zur Auflösung des Gewebes wurde in die

dadurch entstandene untere klare Phase die Proteinase K pipettiert. Die Probe wurde

danach jeweils für 15 min bei 56°C und 80°C im Heizblock inkubiert (Thermomixer

comfort, Eppendorf AG, Hamburg, D). Mit Hilfe der Vortexfunktion des Gerätes wurde

die Probe währenddessen alle 3 min gemischt.

Die untere klare Phase wurde in ein neues Eppendorf Gefäß überführt und für 3 min

auf Eis gekühlt. Anschließend erfolgte die Zentrifugation beim 20000fachen von g für

15 min. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Gefäß gegeben. Hierbei wurde

besonders darauf geachtet, dass das entstandene Pellet am Boden nicht mit der

Pipette resuspendiert wird.


Anschließend wurde ein weiterer Puffer hinzugegeben. Die DNase I wurde zunächst in

550 µl sterilem Nuklease-freiem Wasser gelöst. Aus dieser Lösung wurden 10 µl

verwendet. Danach wurde das Gefäß aufgrund der empfindlichen DNase nur vorsichtig

geschwenkt und anschließend für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgten ein

weiterer Puffer und Ethanol 100%. Im Anschluss wurden je 700 µl aus der

hergestellten Probe entnommen und in ein spezielles Gefäß mit Filter (RNeasy

MinElute column, Qiagen GmbH, Hilden, D) überführt. Es folgte eine Zentrifugation

beim 8800fachen von g für 15 s. Das Filtrat wurde erneut auf die Membran gegeben

und zentrifugiert. Der Durchlauf wurde anschließend verworfen. Nachfolgend wurde ein

Waschpuffer auf den Filter gegeben und beim 8000fachen von g für 15 s zentrifugiert.

Nach Verwerfen des Durchlaufs wurde erneut ein Puffer hinzugegeben und diesmal für

2 min beim 8000fachen von g zentrifugiert. Das Filtrationsgefäß wurde auf ein neues

Eppendorf Gefäß gesetzt und für 5 min auf die maximale Geschwindigkeit

beschleunigt. Anschließend wurde es erneut in einem leeren Eppendorf Gefäß

platziert. Auf die Membran wurden 22 µl steriles Nuklease-freies Wasser pipettiert. Es

folgte die Zentrifugation bei maximaler Beschleunigung für 1 min. Das gewonnene

Filtrat wurde auf Eis gelagert. Der Elutionsschritt wurde wiederholt, wobei die Probe vor

der Zentrifugation erst 10 min in der Säule inkubiert wurde. Die extrahierte mRNA

wurde anschließend mit einem elektronischen Spektrophotometer gemessen (Nano

Drop 2000c Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Dieses Gerät misst die Konzentration der mRNA minutiös. Als Leerprobe wurde 1 µl

steriles Nuklease-freies Wasser auf die Messfläche gegeben. Danach wurde die

Extinktion der gewonnenen mRNA-Probe gemessen. Es wurde nur mit mRNA-Proben

weitergearbeitet, die eine mRNA-Dichte von über 20 ng/µl aufwiesen.


4.7.2 Transkription der mRNA in cDNA

Von der isolierten mRNA wurde eine komplementäre Nukleinsäurekopie (cDNA)

hergestellt. Die Transkription erfolgte nach Protokoll in der Tab. 6 mit dem

Sensiscript® Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, D). Das Verhältnis von

RNA und Nuklease-freiem Wasser wurde anhand der gemessenen Dichte für jede

Probe berechnet. Es wurden jeweils 100 ng mRNA umgeschrieben. Nach Mischen von

Puffer, Nukleotiden, Primer Mix, Reverser Transkriptase, sterilem Nuklease-freiem

Wasser und isolierter mRNA wurde die Lösung für wenige Sekunden zentrifugiert

sowie für 60 min bei 37°C inkubiert.

Tab. 6: Reverse Transkription von RNA in cDNA

Reagenz Volumen

10xBuffer RT1 4 µl

dNTP Mix1 4 µl

RT Primer Mix2

2 µl

Sensiscript Reverse Transcriptase1 2 µl

mRNA und Wasser 28 µl

1 Sensiscript® Reverse Transcription Kit, Qiagen GmbH, Hilden, D 2

QuantiTect® Reverse Transcription Kit, Qiagen GmbH, Hilden, D

4.7.3 qPCR

Zum quantitativen Nachweis der initialen Menge des exprimierten Gens wurde eine

Polymerasekettenreaktion in Echtzeit (engl.: quantitative Real-time PCR; qPCR) nach

Protokoll durchgeführt. Zur Vorbereitung wurde aus 10 µl Fluoreszenzfarbstoff SYBR

Green (SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix, Bio-Rad Laboratories

GmbH, München, D), jeweils 0,6 µl des gewünschten Vorwärts- und Rückwärtsprimer

und 6,8 µl sterilem Nuklease-freiem Wasser ein Mastermix hergestellt. Die Menge der

pipettierten Substanzen wurde an die Anzahl der Ansätze angepasst. Das Verhältnis

blieb hierbei immer gleich. Aus dem Mastermix wurden jeweils 18 µl pro Vertiefung in

die PCR-Platte pipettiert (Low-Profile Multiplate unskirted PCR Plate, Bio-Rad

Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Es folgten jeweils 2 µl cDNA. Danach wurde

das Gemisch mit der Pipette resuspendiert. Jede Probe wurde auf der Platte dreimal

wiederholt („Triplett“). Als Negativkontrolle wurden 18 µl Mastermix mit 2 µl sterilem

Nuklease-freiem Wasser in ein Well gegeben.


Die stets auf Eis gelagerte Platte wurde mit einer selbstklebenden Schutzfolie luftdicht

verschlossen und bei 1500 Umdrehungen pro Minute für 4 min zentrifugiert.

Anschließend wurde die Platte in einem Thermo Cycler (CFX96 Real-Time System

C1000 Touch™ Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) nach

Protokoll in der Tab. 7 bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert.

Tab. 7: Protokoll des Bio-Rad Thermal Cyclers

Zyklus Anzahl Temperatur (°C) Zeit (s)

1 1x 95 30

2 40x 95

59

5

30 3 59 30

4 1x 95 10

5 110x 40 (Erhöhung um

0,5°C pro Zyklus)

5,5

6 1x 20 Haltetemperatur

Die manuell eingestellte Annealing-Temperatur lag bei 59°C. Auf jeder Platte wurde

pro Primer-Paar eine Negativkontrolle (steriles Nuklease-freies Wasser plus Vorwärts-

sowie Rückwärtsprimer) mitgeführt. Nach dem fünften Zyklus wurde die Probe bei

20°C stehen gelassen. Diese Temperatur wird in der Tab. 7 als „Haltetemperatur“

bezeichnet. Anschließend wurde jede Platte eingefroren, um später ggf. ein DNA-Gel

aus den Proben anzufertigen zu können.

Haushaltsgen

Neben der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurden drei weitere

Referenzgene getestet, welche im Körper der Ratte ebenfalls nicht reguliert werden:

Die β-Glucuronidase (GUSB), ein Enzym, das β-Glucuronidine spaltet. Das

Ribosomale Protein 13A (RPL13A), ein Protein in der 60S Einheit der Ribosomen. Und

das TATA-Box bindende Protein (TBP), welches spezifisch an eine feste Basenabfolge

aus Thymin und Adenin bindet. Dieses Protein ist für die Initiierung der Transkription

von Bedeutung.


Die Sequenzen der vier genannten Primer-Paare sind in der Tab. 8 dargestellt.

Tab. 8: Sequenzen der untersuchten Haushaltsgene

Gen Vorwärtsprimer (5‘-3‘) Rückwärtsprimer (5‘-3‘)

GAPDH CAACGACCCCTTCATTGACC

TTCTCAGCCTTGACTGTGCC

GUSB TGGCCTTGGCTTTGTGTACT

CGTGGGTGCTAGGAATCGAA

RPL13A CTCATGAGGTCGGGTGGAAG AGAGCTGCTTCTTCTTCCGG

TBP GTGGCAGCATGAAGTGACAC ATGCTGCAGGGTGATCTCAG

Da GAPDH das stabilste Haushaltsgen Gen war, erfolgte die Normalisierung der

Expressionsdaten gegen dieses Gen. Das Enzym kommt als Teil der Glykolyse

ubiquitär im Körper vor. Es katalysiert die Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-

phosphat zu 1,3-Bisphosphoglycerat.

Versuchsgene

In der Tab. 9 sind die Sequenzen der final verwendeten Versuchsgene Transforming

growth factor β1 (TGFβ1), Tumornekrosefaktor α (TNFα), Matrixmetalloproteinase 1

(MMP1) und Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) angegeben.

Tab. 9: Sequenzen der verwendeten Primer

Gen Vorwärtsprimer (5‘-3‘) Rückwärtsprimer (5‘-3‘)

TGFβ1 TGGAGCCTGGACACACAGTA

TGTTGGTTGTAGAGGGCAAGG

TNFα TCAGCCTCTTCTCATTCCCG

ACAGAAGAGCGTGGTGGC

MMP1 GGAAGGTGATATTGTGTTCGCC

CTATGGTCTCCTCTGTAGAAGGC

TIMP1 ACGCTAGAGCAGATACCACG

AGAGGCCAGAGATGCAAAGG

4.7.4 DNA-Gelelektrophorese

Um zu gewährleisten, dass das Fluoreszenzsignal in der qPCR nicht fälschlicherweise

durch Zusammenlagerung von Primern untereinander (Primer-Dimer) entstanden war,

sondern das gewünschte Produkt markiert wurde, folgte nach der qPCR eine

Gelelektrophorese. Anhand der Basenpaarlänge in diesem DNA-Gel konnte festgestellt

werden, ob es sich um das gewünschte Produkt oder um Primer-Dimer handelt. Bei

mehr als einem Produkt aus der PCR-Platte würden mehrere Banden erscheinen und

es wäre von einer Verunreinigung durch unerwünschte Genfragmente auszugehen.

https://de.wikipedia.org/wiki/Glycerinaldehyd-3-phosphathttps://de.wikipedia.org/wiki/Glycerinaldehyd-3-phosphathttps://de.wikipedia.org/wiki/1,3-Bisphosphoglycerat


Hierbei würde etwa eine Verunreinigung durch DNA des Untersuchers sichtbar

werden.

Zur Vorbereitung wurde TRIS-Borat-EDTA-Puffer (TBE-Puffer) aus 54 g

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) (Merck KGaA, Darmstadt, D),

27.5 g Borsäure (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA),

20 ml 0.5 M Ethylendiamin-tetraacetat (EDTA) (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich

Corporation, St. Louis, MO, USA) und Wasser hergestellt. Der TBE-Puffer wurde 1:10

verdünnt (0,5fach TBE). Für das 4% Gel wurden 2.8 g Agarose (Agarose Molecular

Grade, Bioline, London, UK) und 70 ml 0.5fach TBE gemischt und in der Mikrowelle so

lange erhitzt bis keine Luftblasen mehr zu sehen waren. Als Ultraviolett-Farbstoff

wurden 7 µl SYBR Safe (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)

hinzugegeben. Die Mischung wurde dann in einen Schlitten gegossen. Anschließend

wurde zügig ein hitzestabiler Kamm eingesetzt, der beim Erkalten des Gels die

Taschen für die Elektrophorese vorformt. Nach 30 min wurde der Kamm entfernt und

die Taschen mit dem Rest aus 0.5 TBE gespült. Jeweils 10 µl einer Probe der qPCR-

Platte wurden in eine Geltasche pipettiert. Um die Anzahl der Basenpaare ablesen zu

können, wurde in der ersten Tasche eine genormte Reagenz, der sogenannte „Ladder“

(O'RangeRuler 20 bp DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)

ohne DNA-Probe hinzugegeben. Anschließend wurde eine Spannung von 60 V für

90 min angelegt. Das Gel wurde am Ende unter Ultraviolett-Strahlung im Bio-Rad

Chemi Doc™ MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

fotografiert und mit dem Programm Image Lab Version 5.2 (Bio-Rad Laboratories,

Hercules, CA, USA) ausgewertet.


4.7.5 Molekularbiologische Auswertung

Die Ergebnisse der qPCR wurden mit dem Bio-Rad CFX Manager 3.0 (Bio-Rad

Laboratories, Hercules, CA, USA) ausgewertet. Die Expression der Gene TGFβ1,

TNFα, MMP1 sowie TIMP1 wurde per relativer Quantifizierung gemessen. Die

Normalisierung erfolgte gegen GAPDH. Grundsätzlich erreicht das Fluoreszenzsignal

bei einer bestimmten cDNA-Menge einen Schwellenwert. An diesem Punkt befindet

sich in verschiedenen Proben gleich viel cDNA. Dieser Grenzwert wird nach einer

bestimmten Anzahl an Zyklen erreicht und als cycle threshold (Ct) bezeichnet. Er

markiert gleichzeitig den Beginn des exponentiellen Anstiegs der Kurve im

Thermocycler. Mit Hilfe der qPCR-Software wurde aus den drei Ct-Werten jedes

Tripletts (vgl. Kap. 4.7.3) automatisch der Mittelwert bestimmt. Anschließend wurde

das Ergebnis des Versuchsgens (TGFβ1, TNFα, MMP1 oder TIMP1) in Relation zur

Expression des nicht regulierten Gens GAPDH gesetzt.

Berechnungen aus der qPCR

Zur Auswertung wurde die untenstehende Formel 1 angewendet, die eine

Quantifizierung unter Berücksichtigung der Gruppen im Vergleich erlaubt [70]:

Ratio = (EZielgen)

δCtZielgen(Kontrollgruppe-Versuchsgruppe)

(EGAPDH)δCtGAPDH(Kontrollgruppe-Versuchsgruppe)

Formel 1: Berechnung der Ratio aus den Ergebnissen der qPCR

Diese Ratio wurde für jedes Zielgen einzeln berechnet. Für den Platzhalter

„Versuchsgruppe“ in der Formel 1 wurden die Mittelwerte der Tripletts aus der

Versuchsgruppe eingetragen. Dies waren also zu jedem Zeitpunkt acht Werte. Ein

Vergleich eines bestimmten Explantates der Versuchsgruppe mit einem bestimmten

der Kontrollgruppe hätte keinen Sinn gemacht, da für alle acht Tiere innerhalb einer

Gruppe die gleichen Versuchsbedingungen galten. Deshalb wurde in der

Kontrollgruppe pro Zeitpunkt zunächst ein Mittelwert aus den acht untersuchten Proben

gebildet und erst dieser in die Formel 1 für den Platzhalter der Kontrollgruppe

eingesetzt.

Die Einzelwerte der Versuchsgruppe wurden dann in der Formel 1 von diesem

Mittelwert der Kontrollgruppe abgezogen. Das gleiche Procedere wurde für das

Referenzgen GAPDH im Nenner durchgeführt.


E steht für die Effizienz des eingesetzten Primer-Paares und soll idealerweise den

Wert 2 annehmen. Es wurden solche Primer verwendet, die diesbezüglich

entsprechende Ergebnisse vorweisen konnten (vgl. Kap.4.7)

Die Potenzfunktion innerhalb der Formel hebt die logarithmische Funktion, welche das

qPCR-Gerät berechnet auf und transferiert sie in einen absoluten Wert (entspricht der

„Ratio“ in der Formel 1). Dieser lässt am Ende einen unmittelbaren Vergleich der

Ergebnisse zu.

Das bedeutet: Je höher die initiale Expression eines Gens ist, desto kleiner fällt der Ct-

Wert aus und desto höher ist die berechnete Ratio aus der Formel 1.

Separate Formel für das Verhältnis MMP1:TIMP1

In einer Studie ging ein geringeres Verhältnis MMP:TIMP mit einem höherem Baker-

Grad bei Patientinnen mit Kapselfibrose einher [92]. Um die Ergebnisse mit dieser

Veröffentlichung vergleichen zu können, wurde das Verhältnis MMP1:TIMP1

berechnet, auch wenn im Gegensatz zur o.g. Literatur nur je ein Typ der MMP und der

TIMP untersucht wurde und die Marker in der hiesigen Studie mittels qPCR im

Rattenmodell untersucht wurden. Bei der Berechnung des Verhältnisses MMP1:TIMP1

konnten nicht einfach die absoluten Werte in die Formel 1 eingesetzt werden, da

Versuchs- und Kontrollgruppe gemeinsam in einem Wert verrechnet sind. Deshalb war

eine getrennte Betrachtung des Verhältnisses MMP1:TIMP1 in der Kontrollgruppe im

Vergleich zur Versuchsgruppe notwendig. Aus diesem Grund wurde die Formel 2

entwickelt:

Verhältnis MMP1:TIMP1= 2

CtMMP1-CtGAPDH

2CtTIMP1-CtGAPDH

(modifiziert nach Pfaffl, M. W. [70])

Formel 2: Berechnung des Verhältnisses MMP1:TIMP1 aus den Ergebnissen der qPCR

4.8 Histologische Untersuchungen

Mit einem Rotationsmikrotom (HM 355 S, MICROM International GmbH, Walldorf, D)

wurden zunächst Schnitte von 2.5µm Dicke aus den Paraffinblöcken angefertigt. Diese

wurden mit einem Pinsel aufgefangen und im Wasserbad entfaltet. Von dort wurden sie

auf silanisierte Objektträger überführt, entparaffiniert, rehydriert und mit dem jeweiligen

Reagenz gefärbt.


Alle Schnitte wurden abschließend mit Wasser gebläut und mit Aquatex und einem

Deckglas eingedeckt.

4.8.1 Hämatoxylin-Eosin

Die Hämatoxylin Eosin-Färbung (H.E.) gilt als standardmäßige Übersichtsfärbung. Sie

färbt basophile Strukturen (z.B. Zellkerne) blau und azidophile Strukturen (z.B.

Zytoplasmaproteine) blassrot.

Von jedem Konstrukt wurden drei histologische Schnitte in der H.E.-Färbung nach

Protokoll in der Tab. 10 angefertigt.

Tab. 10: Protokoll der H.E.-Färbung

Reagenz Inkubationszeit (s)

Xylol1

1x240, 2x150

100% Isopropanol1 1x30, 1x60

96% Isopropanol1 2x30

70% Isopropanol1 30

Fließendes Leitungswasser 30

Hämatoxylin2

1x90, 1x120


Essigsäure-Lösung 10


Eosin2

20

70%Isopropanol1 30

96% Isopropanol1 30

100% Isopropanol1 1x30, 2x60

Xylol1 2x30, 1x60

1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

2 Merck KGaA, Darmstadt, D

Die Paraffinschnitte wurden mit Xylol entparaffiniert und durch eine absteigende

Alkoholreihe rehydriert. Nachfolgend wurden die basophilen Zellkerne durch

Hämatoxylin (Hämatoxylin Lösung Gill, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO,

USA) blau und die azidophilen Strukturen des Zytoplasma durch Eosin (Eosin Y

Lösung alkoholisch, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA) rot gefärbt. Die

Essigsäure-Lösung wurde frisch aus destilliertem Wasser und Chlorwasserstoff (HCl)


hergestellt. Gebläut wurden die Schnitte unter fließendem Wasser. Abschließend

folgten eine aufsteigende Alkoholreihe sowie eine erneute Inkubation mit Xylol (Carl

Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D), um die Schnitte zu dehydrieren und von

überschüssigem Alkohol zu befreien.

4.8.2 Immunhistochemische Färbungen

In der Immunhistochemie werden immunologische und histologische

Detektionsmethoden kombiniert. Es wird ein Primärantikörper verwendet, der gegen

das Epitop einer gesuchten Struktur (zum Beispiel ein Protein) gerichtet ist. Ein

enzymgekoppelter Sekundärantikörper dockt am Primärantikörper an und ermöglicht

auf diese Weise die sichtbare Färbung. Die gesuchte Struktur wird also indirekt

nachgewiesen.

Entparaffinierung und Rehydrierung

Die Entparaffinierung mit Xylol und die Rehydrierung in einer absteigenden

Alkoholreihe ist der Tab. 11 zu entnehmen. Das Protokoll wurde für alle nachfolgend

aufgelisteten immunhistochemischen Färbemethoden angewendet. Als Waschpuffer

wurde bei allen Färbungen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) mit pH 7.4

verwendet.

Tab. 11: Protokoll der Entparaffinierung und Rehydrierung

Reagenz Inkubationszeit (min)

Xylol1

2x15

100% Ethanol1 2x3

96% Ethanol1 2x3

70% Ethanol1 2x3

1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Suche nach geeigneten Färbungen

Vor den finalen Untersuchungen war die Entwicklung geeigneter Färbemethoden

notwendig. Die Problematik bestand vor allem darin, dass sich die APD nicht in allen

Färbungen adäquat darstellen ließ.


Problematik bei Cluster of Differentiation 31 (CD31), Lektin und Von-

Willebrand-Faktor (vWF)

Das Thrombozyten-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1), auch unter dem

Namen CD31 bekannt, dient als Endothelmarker. Mit Hilfe dieser Färbung sollten

Gefäße detektiert werden. Es wurde ein polyklonaler Kaninchenantikörper (Rabbit anti-

CD31, Zytomed Systems GmbH, Berlin, D). verwendet. Jedoch war die APD bei dieser

kochpflichtigen Färbung teilweise oder komplett ausgewaschen.

Da in dieser Schicht aber später Gefäßanschnitte gezählt werden sollten, wurde als

Alternative die Lektin-Färbung getestet. Hierbei werden die terminalen α-D-Galaktosyl-

Reste auf der Zellmembran von Endothelzellen detektert. Es wurde Lektin aus der

afrikanischen Schwarzbone verwendet (Lectin from Bandeiraea simplicifolia (Griffonia

simplicifolia), BS-I Isolectin B4, Biotin Conjugate, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis,

MO, USA).

Die Qualität hinsichtlich der APD war in dieser Färbung zwar etwas besser als bei

CD31, für die anstehenden Untersuchungen jedoch ebenfalls insuffizient. Das negative

Resultat in der Lektin-Färbung ist in der Abb. 6 beispielhaft dargestellt.

Abb. 6: Ausgewaschene APD in der Lektin-Färbung

Von oben nach unten ist die Subcutis, der Panniculus carnosus, die Kollagenschicht und die APD zu

sehen (25fache Vergrößerung), Schnitt der Versuchsgruppe, Explantations-Zeitpunkt 3 Wochen

Außerdem war keine sichere Detektion von kleineren Gefäßen unter dem Mikroskop

möglich. Deshalb wurde getestet, ob die Markierung des Von-Willebrand-Faktors

(vWF) besser geeignet wäre. Dieses Molekül wird u.a. von Endothelzellen gebildet. Als

Primärantikörper wurde ein polyklonaler Kaninchenantikörper (Factor VIII, Biocare


Medical Inc., Concord, CA, USA) verwendet. Diese Färbung lieferte hinsichtlich der

Qualität der APD bereits deutlich bessere Ergebnisse als CD68 und Lektin.

Am besten gelang die Färbung der Gefäße mit einer Kombination aus zwei Färbungen

(s. Abschnitt Doppelfärbung α-Smooth Muscle Actin und Von-Willebrand-Faktor).

Problematik bei CD163

Cluster of Differentiation 163 (CD163) ist ein Marker zur Darstellung inflammatorischer

Zellen. Es wurde ein monoklonaler Mausantikörper (Novocastra CD163, Leica

Biosystems, Wetzlar, D) verwendet, der an der Ratte erprobt ist.

Bei dieser kochpflichtigen Färbung zeigte sich die gleiche Problematik wie bei CD31

und Lektin: Die APD wurde ausgewaschen. Außer der APD waren hier auch die

Subkutis und die Kollagenschicht betroffen. Die schlechte Qualität der APD im

histologischen Bild könnte aufgrund der gemeins

Einfluss von azellulärer porziner Dermis als Implantathülle auf ......Einfluss von azellulärer...

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