Vergleichende Untersuchungen zur dermalen Penetration und ... · Verzahnungen von Epidermis und...

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Vergleichende Untersuchungen zur

dermalen Penetration und Permeation

in Diffusionszellen

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Silke Riedel (geb. Franzbach)

aus Gronau

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.C. Krebs

Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2003

Meinen Eltern

und

meiner Familie

in Dankbarkeit

gewidmet

1 EINLEITUNG 1

2 LITERATURÜBERSICHT 2

2.1 Aufbau und Funktion der Haut 2

2.1.1 Epidermis 2

2.1.2 Dermis 5

2.1.3 Hypodermis 7

2.1.4 Hautanhangsgebilde 7

2.1.5 Gefäßsystem der Haut 8

2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption 9

2.2.1 Barrierefunktion der Haut 9

2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen 12

2.2.3 Penetrationsbeeinflussung 19

2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation 22

2.3.1 In-vivo-Modelle 22

2.3.2 In-vitro-Modelle 23

2.3.2.1 Diffusionszellen 23

2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell 26

2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut 29

2.3.2.4 Perfusionsmodelle 30

2.4 Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison als Testsubstanzen der

transdermalen Penetration und Permeation 32

3 MATERIAL UND METHODEN 35

3.1 Versuchsmaterial 35

3.2 Verwendete Testsubstanzen 37

3.2.1 Benzoesäure 37

3.2.2 Hydrocortison 37

3.2.3 Testosteron 38

3.3 Diffusionszellen 38

3.4 Versuchsdurchführung 39

3.5 Nachweis der Testsubstanzen 40

3.5.1 Enzymimmunoassay 40

3.5.2 Bestimmung von Benzoesäure mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

(HPLC) 41

3.6 Statistische Auswertung 43

4 ERGEBNISSE 44

4.1 Benzoesäurepenetration und -permeation 44

4.1.1 Rattenhaut 44

4.1.2 Hundehaut 45

4.1.3 Pferdehaut 46

4.1.4 Schweinehaut 46

4.1.5 Rinderhaut 49

4.2 Hydrocortisonpenetration und -permeation 51

4.2.1 Rattenhaut 51

4.2.2 Hundehaut 52

4.2.3 Pferdehaut 53


4.2.5 Rinderhaut 55

4.3 Testosteronpenetration und -permeation 57

4.3.1 Rattenhaut 57

4.3.2 Hundehaut 58

4.3.3 Pferdehaut 59


4.3.5 Rinderhaut 61

5 DISKUSSION 63

5.1 Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten 63

5.1.1 Benzoesäurepermeation 63

5.1.2 Hydrocortisonpermeation 64

5.1.3 Testosteronpermeation 65

5.2 Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen 66

5.2.1 Benzoesäurepermeation 66

5.2.2 Hydrocortisonpermeation 69

5.2.3 Testosteronpermeation 70

5.3 Vergleich der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison 73

5.4 Schlußfolgerung 76

6 ZUSAMMENFASSUNG 77

7 SUMMARY 79

8 LITERATURVERZEICHNIS 81

9 ANHANGSTABELLEN 99

Abkürzungsverzeichnis

A. Arteria

Abb. Abbildung

cm Zentimeter

cm² Quadratzentimeter

ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay

g Gramm

°C Grad Celsius

h Stunde

HPLC high performance liquid chromatography

i.v. intravenös

l Liter

ln Logarithmus

m männlich

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

n Anzahl der Versuche

ng Nanogramm

s. siehe

S. Seite

Tab. Tabelle

V. Vena

w weiblich

1

1 EinleitungDie Entwicklung von Arzneimitteln zur topischen Anwendung bei Mensch und Tier macht es

erforderlich, die dermale Penetration, Permeation und Resorption verschiedener Wirkstoffe an

Modellen zu untersuchen. Hier bieten In-vitro-Modelle den Vorteil, daß die resorbierte

Wirkstoffmenge direkt bestimmt und, wenn notwendig, auch mit toxischen Konzentrationen

gearbeitet werden kann. Im Gegensatz zu In-vitro-Modellen werden In-vivo-Untersuchungen

durch ethische Aspekte limitiert. Ferner erschweren die Verteilung eines resorbierten Stoffes

im Organismus sowie dessen mögliche Metabolisierung (Leber) die Interpretation von

Ergebnissen aus In-vivo-Versuchen. In-vitro-Untersuchungen werden an menschlicher und

tierischer Haut und an sogenannten Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt.

Hinsichtlich der Barriereeigenschaften der Haut bestehen offensichtlich ausgeprägte

speziesspezifische Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Ergebnissen im Einzelfall

erheblich einschränken können. So ist im Vergleich zur menschlichen Haut die

Barriereeigenschaft der Haut von Labortieren (z.B. Ratte, Maus) sehr viel geringer

(MARZULLI et al. 1969; BARTEK et al. 1972). Weiter ist zu berücksichtigen, daß die

Hautpermeabilität bei allen Spezies in Abhängigkeit von der Körperregion variiert

(FELDMANN und MAIBACH 1967; BRONAUGH 1985; BEHL et al. 1985).

Die zugängliche Literatur weist eine große Anzahl von In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen

auf, in denen die kutane Pharmakokinetik untersucht wird. Für In-vitro-Penetrationsstudien

werden oft Diffusionszellen eingesetzt, die die Messung der passiven Diffusion einer topisch

applizierten Substanz durch die Haut ermöglichen. Ein Vergleich der Ergebnisse vorliegender

Studien zur dermalen Penetration, Permation und Resorption gestaltet sich aufgrund nicht

einheitlicher Versuchsbedingungen, Hautlokalisationen sowie Unterschieden der Spezies

recht schwierig bzw. unmöglich.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, tierartliche und regionale Unterschiede in einer

vergleichenden Untersuchung der transdermalen Penetration und Permeation unter

identischen Bedingungen darzustellen. In den Versuchen soll die Haut von Schweinen,

Hunden, Rindern, Pferden und Ratten untersucht werden. Für die Darstellung regionaler

Unterschiede werden die Lokalisationen seitliche Brustwand, Rücken, Bauch und Euter

(Rind) gewählt. Die vielfach in vorliegenden Studien eingesetzten Testsubstanzen

Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison sollen aufgrund ihrer unterschiedlichen

Pharmakokinetik in der vorliegenden Arbeit Verwendung finden.

2

2 Literaturübersicht

2.1 Aufbau und Funktion der Haut

Die Haut stellt als äußere Körperbedeckung sowohl eine schützende Grenzfläche als auch

eine breite Kontaktfläche zur Außenwelt dar. Sie ist in erster Linie ein Schutzorgan gegenüber

mechanischen, thermischen, chemischen und biologischen Einflüssen (LIEBICH et al. 1999).

Die Körpertemperatur und der Wasserhaushalt werden u.a. über Hautdrüsen und -blutgefäße

reguliert; weiter fungiert die Haut als Sinnesorgan, welches zur Wahrnehmung von

mechanischen, thermischen und Schmerzreizen dient (LEONHARDT 1990). Die Dicke und

Festigkeit der Haut ist abhängig von Tierart, Rasse, Alter und Körpergegend. Im Allgemeinen

ist die Haut des Rückens dicker als die Bauchhaut, mechanisch stark beanspruchte Hautstellen

sind dicker als geschützt liegende (HABERMEHL 1984). An behaarten Körperstellen ist die

Hautdicke geringer als in haarlosen und haararmen Regionen (LIEBICH et al. 1999).

2.1.1 Epidermis

Die Epidermis (Oberhaut) ist ein mehrschichtiges, verhornendes Plattenepithel, welche als

äußerste Grenzschicht der Haut eine undurchlässige Hornschicht trägt (FRITSCH 1998). Die

Epidermisdicke der behaarten Haut ist stark variabel. In Tab. 1 ist die Epidermisdicke für den

Menschen und für verschiedene Tierarten angegeben.

Spezies vitale Epidermis

(ohne Stratum corneum)

Gesamtdicke der Epidermis

(inklusive Stratum corneum)

Mensch 75-150 (ODLAND 1983)

Ratte 10-30 (UHR 1984) ~ 32 (BRONAUGH et al. 1982b)

Hund 12-45 (SCHWARZ u. MEYER 1994) 10-45 (CREED 1958)

Pferd 25-45 (MEYER 2002) 30-90 (TALUKDAR et al. 1972)

Schwein 34-47 (m) (MEYER 1986)41-57 (w)

70-140 (MEYER u. NEURAND 1975)

Rind ~ 32 (MEYER 2001) 40-60 (GOLDSBERRY u. CALHOUN 1958)

Rindereuter 50-80 (SEEGERS 2003) 60-200 (LUDEWIG et al. 1996)

Tab. 1: Epidermisdicke der behaarten Haut bei verschiedenen Spezies (Angaben in µm)

3

In den folgenden Abbildungen (Abb. 1-6) ist die Epidermis (Bauchhaut) der im Rahmen

dieser Arbeit untersuchten Tierarten histologisch dargestellt.

50 µm

Abb. 1-6: Epidermis (Bauchhaut) von Ratte (1), Hund (2), Pferd (3), Schwein (4),

Rind (5) sowie von Euterhaut (6)

1

65

43

2

4

Die Keratinozyten machen mit etwa 90 % den Hauptanteil der Epidermis aus, daneben enthält

die Epidermis Langerhans-Zellen, Lymphozyten, Melanozyten und Merkelzellen. Die

Epidermis besteht aus vier Schichten, die jeweils durch ihre Morphologie und Funktion

charakterisiert sind (FRITSCH 1998). Abbildung 7 zeigt den schematischen Aufbau der

Epidermis.

Abb. 7: Schematischer Aufbau der Epidermis (nach FRITSCH 1998)

Das Stratum basale besteht aus einer Lage zylindrisch aufgebauter Zellen, die durch

Hemidesmosomen mit einer Basalmembran verbunden sind (RICHTER und LINSS 1998).

Hier beginnt die Erneuerung der Keratinozyten aus den Stammzellen durch Mitose, wobei

Zellgewinn im Gleichgewicht mit Zellverlust steht (FRITSCH 1998).

Das Stratum spinosum ist durch größere, polygonale Keratinozyten charakterisiert. Trotz

deutlicher Interzellularspalten sind die Zellen durch stachelförmige Fortsätze über

Desmosomen miteinander verbunden (LEONHARDT 1990). Eine Besonderheit des Stratum

spinosum sind die sog. „Odland bodies“, Zellorganellen, die Lipide und Enzyme enthalten.

In der aus 2–5 Zelllagen bestehenden Stachelzellschicht geht die Fähigkeit zur Zellteilung mit

dem Eintritt der terminalen Differenzierung verloren. Nur unter besonderen Umständen (z.B.

Stratumcorneum

Stratumgranulosum

Stratumspinosum

Stratumbasale

Desmosom

Keratohyalin-granula

Hemidesmosom

Basallamina

Odlandbodies

5

Wundheilung) finden vereinzelt noch Mitosen statt. Das Stratum basale und das Stratum

spinosum werden daher auch als Stratum germinativum zusammengefaßt (FRITSCH 1998).

Mit dem Übergang in das Stratum granulosum flachen die durch basophile Keratohyalin-

granula charakterisierten Keratinozyten ab. Dehydratation tritt ein, Zellkerne und –organellen

gehen verloren. Durch Exozytose der Odland bodies wird im Interzellularraum die Bildung

einer wenig permeablen Kittsubstanz induziert, wodurch die Zellen starr fixiert werden

(FRITSCH 1998).

Das Stratum corneum ist das Endprodukt der keratinisierten Epidermis, die sich etwa im

Zeitraum von 1-2 Wochen erneuert. Die Anzahl der Zellschichten im Stratum corneum ist

recht variabel. Die Hornschicht besteht jedoch zumeist aus ca. 10 bis 20 Zellschichten voll

keratinisierter Korneozyten. Diese verhornten Zellen sind überwiegend aus Keratinfilamenten

aufgebaut und werden von einer dicht vernetzten, äußerst stabilen Hülle von Proteinen und

Lipiden, dem „cornified envelope“ umgeben. Entsprechend einem „Ziegelstein-Mörtel“-

Modell ist die Hornschicht im wesentlichen aus den Korneozyten und der interkorneozytären,

lamellären Lipidschicht aufgebaut (ELIAS 1983) (siehe 2.2.1).

In den tieferen Schichten des Stratum corneum erschwert ein enger Interzellularraum die

transepitheliale Stoffpassage, oberflächlich lösen sich die Zellen aus dem Epithelverband und

schilfern ab. Die Schichtdicke ist neben Geschlecht, Alter und Körperregion von der Intensität

der mechanischen Beanspruchung und der Abschilferungsrate der Haut abhängig (LIEBICH

et al. 1999).

Die Hornschicht ist für Wasser und wasserlösliche Substanzen fast undurchlässig, sie ist in

ihrer Gesamtheit Träger der Barrierefunktion. Eine hohe Widerstandsfähigkeit besteht gegen

physikalische und chemische Noxen, relativ empfindlich reagiert sie dagegen auf organische

Lösungsmittel und Detergenzien (FRITSCH 1998) (siehe 2.2.3).

2.1.2 Dermis

Die Dermis (Lederhaut) ist der zwischen der Unterhaut und Epidermis gelegene

bindegewebige Anteil der Körperdecke. Vom Grad ihrer Ausbildung wird die Dicke der Haut

bestimmt, so hat z.B. unter Haussäugetieren das Schaf die dünnste und das Rind die dickste

Lederhaut. Im Allgemeinen ist die Dicke der Dermis auch vom Alter der Tiere und von der

Körpergegend abhängig (HABERMEHL 1984).

6

Die Dermis erfüllt komplexe biologische Aufgaben, wie Ernährung der Epidermis und

Bereitstellung von Abwehrzellen. Sie ist zudem für die mechanische Festigkeit der Haut

verantwortlich. Es lassen sich zwei Schichten unterscheiden: ein dünnes, zell- und

gefäßreiches, subepidermales Stratum papillare und ein dickes, faserreiches Stratum reticulare

(SMOLLE 1998).

Das Stratum papillare ist über die Basalmembran mit der Epidermis verbunden. Es ist aus

feinmaschigen kollagenen und elastischen Fasern aufgebaut und enthält reichlich ungeformte

Grundsubstanz, die für das Wasserbindungsvermögen und damit für den Hautturgor

maßgeblich ist. Die Austauschfläche und die Haftung werden durch die regional

unterschiedlich starke Ausbildung von Papillarkörpern - fingerförmigen, papillenartigen

Verzahnungen von Epidermis und Dermis - bestimmt (RICHTER und LINSS 1998). Die

Versorgung, insbesondere die des Stratum germinativum der Epidermis, erfolgt über

haarnadelförmige Kapillarschlingen (die auch zur Regulierung der Körpertemperatur

beitragen), die gemeinsam mit nervösen Endapparaten in die Papillarkörper hineinreichen.

Vorzugsweise befinden sich in dieser Schicht Haare, Talg- und Schweißdrüsen als

Abkömmlinge der Epidermis (LIEBICH et al. 1999). Außerdem charakterisieren freie

Entzündungszellen (Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, Granulozyten) das Stratum

papillare als relevant für die Abwehr (SALT = skin associated lymphoepithelial tissue)

(RICHTER und LINSS 1998). Beim Pferd ist der Papillarkörper der Körperhaut nur schwach

entwickelt bzw. kann fehlen (MEYER et al. 1978a).

Das Stratum reticulare stellt ein Netz aus gröberen kollagenen und elastischen Fasern dar, das

mechanisch hoch belastbar ist (RICHTER und LINSS 1998). Diese Schicht ist relativ arm an

Zellen und Gefäßen, vorzugsweise kleinere Arterien und Venen zu und von den

oberflächlichen Hautschichten passieren diese Bindegewebslagen (LIEBICH et al. 1999). Das

Pferd besitzt als spezielle Bildung eine zusätzliche Schicht der Dermis aus feinen kollagenen

Fasern, in die feine elastische und retikuläre Fasern eingewoben sind. Hier handelt es sich um

den sog. „Roßspiegel“; diese Schicht ruft einen leichten Glanz der Haut hervor. Diese

Struktur überzieht die Kruppe und den Rücken bis zu den Tubera coxae sowie die dorsale

Hälfte des Thorax (MEYER et al. 1978a).

7

2.1.3 Hypodermis

Die Hypodermis, die auch als Tela subcutanea, Subcutis oder Unterhaut bezeichnet wird,

besteht aus lockerem Bindegewebe, elastischen Fasern (Stratum fibrosum) und Fettgewebe

(Stratum adiposum). Sie stellt das Bindeglied zwischen der Dermis und den innenliegenden

Faszien, Muskeln oder Knochen dar und ermöglicht so die Verschieblichkeit der Haut

(ECKERT 1992). Die Fetteinlagerungen dienen als Energiereserven und als Kälteschutz und

an manchen Stellen auch einer mechanischen Polsterung (z.B. Sohlenballen) (LIEBICH et al.

1999). Die wärmeisolierende Eigenschaft ist abhängig vom Grad der Ausprägung des Stratum

adiposum. Dieses ist beim Rind und Pferd nur spärlich, beim Hund und Schwein hingegen

deutlich ausgeprägt (MEYER et al. 1978a). Die Unterhaut des Rindereuters hebt sich von der

Dermis nur undeutlich ab. Auffällig ist hier das Fehlen von Adipozyten (LUDEWIG et al.

1996).

2.1.4 Hautanhangsgebilde

Die Hautdrüsen und deren Modifikationen sind embryonal als Abkömmlinge der Epidermis

anzusehen, sie ragen jedoch größtenteils in die Dermis hinein. Bei den Haussäugetieren

unterscheidet man die holokrin sezernierenden Talgdrüsen von den apokrin sezernierenden

Schweiß- und Duftdrüsen, deren Sekrete die Haut mit einem dünnen Fett- und Säuremantel

bedecken (LIEBICH et al. 1999). Ekkrine „echte Schweißdrüsen“ wie beim Menschen

kommen bei unseren Haussäugern nicht vor.

Die apokrinen Schweißdrüsen (Gll. sudoriferae) gehen aus dem Epithel der Haaranlage hervor

und geben ihr Sekret in die Haarbälge ab; sie können sekundär auch von den Haarbälgen frei

werden (HABERMEHL 1984). Sie haben nur beim Rind und besonders beim Pferd durch

Feuchtigkeits- bzw. Wärmeabgabe in Form erhöhter Schweißsekretion eine Bedeutung für die

Thermoregulation. Bei den Karnivoren sowie bei Schaf, Ziege und Schwein produzieren die

Drüsen individualspezifische Duftstoffe und Substanzen zur Haut- und Haarpflege (MEYER

et al. 1978b).

Die Talgdrüsen (Gll. sebaceae) liegen verhältnismäßig oberflächlich, sie sind kranzförmig um

die Haarbälge herum angeordnet (Haarbalgdrüsen) (HABERMEHL 1984). Der holokrin

sezernierte lipidreiche Talg (Sebum) gelangt über weite Ausführungsgänge in den Haarbalg;

8

auf der Epidermis entsteht ein dünner Fettfilm, der die Durchlässigkeit für Wasser und

wäßrige Flüssigkeiten vermindert und das Stratum corneum und die Oberfläche der Haare

geschmeidig hält (LIEBICH et al. 1999).

Die Haare sind aus Epithelzellen der Epidermis entstandene, biegsame und zugfeste

Hornfäden, die mit ihren Wurzeln schräg in die Dermis eingelassen sind (HABERMEHL

1984). Haare bieten einen Schutz gegen mechanische und thermische Umwelteinflüsse, weiter

wird durch eine dichte Behaarung und starke Pigmentierung UV-Strahlung abgeschirmt

(MONTAGNA 1967; BANKS 1993).

Durch die sensible Innervation des Haarbalges kommt dem Haar eine bedeutende Funktion

als Sinnesorgan zu. Alle Säugetiere außer dem Menschen verfügen über Sinushaare, die im

Gesicht mit Ästen des Nervus trigeminus in Verbindung stehen (MONTAGNA 1967).

Am Haar kann ein proximaler Teil, die Haarwurzel mit ihrem Haarbulbus, von einem distalen

Teil, dem Haarschaft, unterschieden werden, der mit der Haarspitze die Epidermis überragt.

Funktionell läßt die Epidermis-Trias, bestehend aus Haar, Talg- und Schweißdrüsen nach

LIEBICH et al. (1999) ein gemeinsames Haarorgan entstehen.

2.1.5 Gefäßsystem der Haut

Die Haut beinhaltet ein tiefes (fasziales), ein oberflächliches (kutanes) und ein subepitheliales

Gefäßnetz. Über Arteriolen entsteht eine Verbindung zwischen dem tiefen und

oberflächlichen Netz, dessen Gefäße schließlich in einen subepithelialen Venenplexus

münden. Arteriovenöse Anastomosen ermöglichen eine Wärmeregulation in der Lederhaut.

Aus dem kutanen Gefäßnetz entspringen Kapillargefäße, die als haarnadelartige

Kapillarschlingen in die Papillarkörper des Stratum papillare ziehen und von dort über

Diffusion die Epidermis versorgen. Der Rückfluß erfolgt über Kapillaren, Venolen und

Venen, die in der Hypodermis Anschluß an größere Venennetze finden (LIEBICH et al.

1999).

9

2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption

2.2.1 Barrierefunktion der Haut

Das intakte Stratum corneum stellt mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste

Permeabilitätsbarriere der Haut dar. Die Lipide der Hornschicht sind lebensnotwendig, da sie

vor einer Dehydratation schützen; ohne sie würde der Wasserverlust um das 2500fache, bei

Fehlen der Hornschicht um das 4millionenfache zunehmen (LANDMANN 1988). Die Folge

einer großflächigen Eliminierung dieser Hautbarriere wäre eine kurzfristig sich entwickelnde

hochgradige Exsikkation mit maximaler Erhöhung des Hämatokritwertes (STÜTTGEN

1990).

Die Barrierefunktion der Hornschicht läßt sich durch ein Zweikompartimentenmodell (sog.

„brick and mortar model“) (siehe 2.1.1) beschreiben. Demnach sind die ziegelsteinähnlich

geschichteten Korneozyten in einem interzellulären Lipidmörtel eingebettet, welcher sich

vorwiegend aus Ceramiden (ca. 40 %), freien Fettsäuren (ca. 25 %), Cholesterol (ca. 25 %),

Anteilen von Cholesterolsulfat (ca. 6 %) und Triglyceriden zusammensetzt (ELIAS 1983).

Die Lipide der Hornschicht sind als multiple Bilayer ausgebildet und machen 10 – 30 % des

gesamten Hornschichtvolumens aus (ELIAS und LEVENTHAL 1979). Im Gegensatz zu

anderen Biomembranen, die hauptsächlich aus Phospholipiden aufgebaut sind, enthält die

Lipidbarriere der Hornschicht sehr wenige Phospholipide (LAMPE et al. 1983). Im Vergleich

zu anderen Biomembranen ist die Permeabilität des Stratum corneum außergewöhnlich

gering. Nach POTTS und FRANCOEUR (1991) liegt die Erklärung hierfür in der besonderen

Morphologie des Stratum corneum mit ihren großen Permeationswegen durch die

Interzellularräume, die wesentlich zur Effektivität der Hornschichtbarriere beiträgt.

Bereits BURR und BURR (1929) stellen im Tierversuch fest, daß sich durch eine Diät, die

arm an essentiellen Fettsäuren ist, eine Permeabilitätsstörung der Barriere erreichen läßt. Die

Lipide, die für die kutane Hautbarriere verantwortlich sind, entstammen dem Stoffwechsel der

Epidermis (FEINGOLD et al. 1982, 1983). Einen direkten Beweis dafür, daß die kutane

Cholesterolsynthese für die Erhaltung der Barrierefunktion notwendig ist, liefern FEINGOLD

et al. (1990) in Versuchen an Mäusen. Ihre Untersuchungsergebnisse zeigen, daß nach einer

Störung der Permeabilitätsbarriere durch Lipidextraktion die Wiederherstellung der

Barriereeigenschaften durch topische Applikation von Lovastatin gehemmt wird. Lovastatin

10

ist ein kompetitiver Hemmer der HMG CoA-Reduktase, das die Cholesterolsynthese

regulierende Enzym. Cholesterol gehört neben Sphingolipiden und essentiellen Fettsäuren zu

den Bestandteilen der Lipiddoppelschichten des Stratum corneum, die für die

Aufrechterhaltung der epidermalen Barrierefunktion verantwortlich sind (HOLLERAN et al.

1991).

WERTZ et al. (1987) zeigen mittels Elektronenmikroskopie, daß die interzellulären

Lipidlamellen in der gesamten Hornschicht lokalisiert sind. Im Stratum corneum als

morphologisch heterogener Membran sind die interzellulären Lipide der äußeren Zelllagen

lockerer gepackt als die der inneren (PELLETT et al. 1997). Untersuchungen von BLANK

(1952, 1953) über die Wasserdurchlässigkeit der Hornschicht nach Abrissen derselben mittels

eines adhäsiven Klebebandes (z.B. Tesa-Film) zeigen, daß für die Barrierefunktion vor allem

die unterste Schicht des Stratum corneum verantwortlich ist. Mit der Tesa-Film-

Abrißmethode werden durch den Klebstoff die Lamellen des Stratum corneum mehr oder

weniger schichtweise abgetragen. PELLETT et al. (1997) bestätigen diese Ergebnisse durch

spektroskopische Untersuchungen. Ihre Resultate bekräftigen, daß sich die morphologischen

Unterschiede zwischen den inneren und äußeren Schichten des Stratum corneum in

Permeabilitätsunterschieden ausdrücken.

Der Wassergehalt der Hornschicht nimmt von innen nach außen ab (TAGAMI et al. 1980). Er

ist mit maximal 20 % sehr viel niedriger als der Wassergehalt in der lebenden Epidermis, in

der er mit 60 - 80 % relativ konstant ist (WARNER et al. 1988). Dieser deutliche Unterschied

ist in der lipidreichen Zusammensetzung der interkorneozytären Substanz begründet.

Hautanhangsgebilde unterbrechen die Kontinuität der Hornschicht. Die für die Hornschicht

charakteristische Barrierefunktion geht in den tieferen Abschnitten der Haarfollikel verloren.

Diese Regionen sind aufgrund des ihres lipophilen Charakters (Talg) für die Aufnahme

lipophiler Substanzen prädestiniert, während in den oberen Abschnitten die Aufnahme

wasserlöslicher Stoffe im Vordergrund steht (STÜTTGEN 1990).

FELDMANN und MAIBACH (1965) untersuchen die dermale Resorptionsrate von 14C-

markiertem Hydrocortison über einen Zeitraum von zehn Tagen durch normale und

geschädigte Haut im Vergleich zur i.v. Applikation anhand der Nierenausscheidung. Die

Resorptionsrate durch normale und durch Tesa-Film-Abrisse geschädigte Haut liegt

zwischen 0,1 und 1 % der lokal aufgetragenen Hydrocortisonmenge. Hingegen stellen sie fest,

11

daß die Resorptionsrate bei intradermaler Injektion nahezu 100 % beträgt. Da hierbei das

Stratum corneum umgangen wird, kommt es hier zu keiner Depotbildung. Im Gegensatz dazu

wird der Wirkstoff bei intakter Haut über einen längeren Zeitraum kontinuierlich abgegeben.

Bei mit Tesa-Film-Abrissen vorgeschädigter Haut fehlt ebenfalls die Depotbildung; die

Resorptionsrate ist im Vergleich zu normaler Haut signifikant erhöht. Unter okklusiven

Bedingungen wird im Vergleich zu normaler Haut die zehnfache Hydrocortisonmenge

resorbiert, was bedeutet, daß die hydratisierte Hornschicht für Hydrocortison durchgängiger

ist als die durch Tesa-Film-Abrisse vorgeschädigte Haut. Unter Anwendung eines

Okklusionsverbandes wird durch Abdeckung der Haut ihr Feuchtigkeitsgehalt, jedoch

besonders der der Hornschicht, erhöht.

Das Stratum corneum ist mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste

Diffusionsbarriere bei der dermalen Resorption (MARZULLI 1962; ELIAS 1983;

STÜTTGEN 1990). Die darunterliegende, avaskuläre lebende Epidermis ist eher eine

hydrophile Matrix. Voraussetzungen für eine transdermale Diffusion sind sowohl lipophile als

auch hydrophile Eigenschaften penetrierender Moleküle. Im Allgemeinen ist der

Diffusionswiderstand der Hornschicht für polare Lösungen im Vergleich zur lebenden

Epidermis und Dermis groß. Für lipophilere Substanzen hingegen ist er geringer. Dennoch ist

die Hornschicht die mengenbegrenzende Barriere, da die lipophilen Moleküle sich in ihr

anreichern und nur langsam und zu einem geringen Anteil in die wässrige lebende Epidermis

übertreten. Die Dermis ist schließlich mit einem wässrigen Gel vergleichbar, dessen Struktur

aus Kollagenfasern und Elastin besteht. Aufgrund der dermalen Vaskularisation werden bis

hierher vorgedrungene Moleküle letztlich abtransportiert (POTTS et al. 1992). Unter der

Annahme, daß das Stratum corneum, die lebende Epidermis und die Dermis als

aufeinanderfolgende Membranen fungieren, resultiert die Barrierefunktion der Haut aus der

Summe der individuellen Barriereeigenschaften (POTTS et al. 1992).

Für den Prozeß des Wirkstofftransportes in und durch die Haut stellt eine intakte Hornschicht

die Hauptbarriere dar. Neben dieser Funktion fungiert die Hornschicht auch als Reservoir für

topisch applizierte Substanzen. Die Barrierefunktion der Hornschicht nimmt von außen nach

innen zu und im gleichen Umfang nimmt ihre Reservoirfunktion ab (ZESCH et al. 1973).

Zahlreiche topisch applizierte Substanzen sind in der Hornschicht nur schwer löslich, woraus

ein eingeschränktes Diffusionsvermögen resultiert. Es kommt zu einer Anreicherung der

12

Stoffe in den oberen Hornlagen, aus welchen sie, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion

gehorchend, in die tieferen Epidermislagen diffundieren (SCHAEFER et al. 1978a, b).

2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen

Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) versteht man unter der Penetration das

Eindringen einer Substanz in und durch die Hornschicht. Permeation kann als Ausdruck einer

Durchwanderung der Haut aufgefasst werden. Unter einer Adsorption ist der physikalisch-

chemische Vorgang oberflächlicher Bindung und Haftung zu verstehen. Sie ist abhängig von

der Affinität der Hornschicht zum extern zugeführten Stoff. Resorption ist schließlich die

Aufnahme in Blut- und/oder Lymphgefäße. In Abb. 8 sind Penetration, Permeation und

Resorption graphisch dargestellt.

Abb. 8: Substanzaufnahme durch die Haut (nach STÜTTGEN und SCHAEFER 1974)

Einfache Penetrationsversuche an exzidierter Säugetierhaut zeigen, daß der perkutane Flux

direkt proportional zum Konzentrationsgradienten ist (BLANK und SCHEUPLEIN 1969). Es

wird daraus geschlossen, daß der Transport durch die Haut vorwiegend durch passive

Diffusion erfolgt (POTTS et al. 1992). Für die Penetration von Substanzen durch das Stratum

corneum gelten prinzipiell die physikalischen Gesetze der Membrandiffusion. Aktive

Transportvorgänge spielen bei der Aufnahme durch die Haut praktisch keine Rolle

(SCHEUPLEIN 1978a; SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1983). Nach dem Auftragen eines

Wirkstoffes besteht initial ein großes Konzentrationsgefälle von der galenischen

Formulierung zum Stratum corneum. Für den Diffusionsvorgang gelten somit die Gesetz-

mäßigkeiten des 1. Fick´schen Gesetzes:

Penetration Permeation Resorption

Gefäß

Epidermis

Hornschicht

Dermis

13

m= D* F/d (c1-c2)

m = Diffusionsstrom d = Schichtdicke

D = Proportionalitätsfaktor c1-c2 = Konzentrationsgefälle

F = Fläche

Gelangt ein in ein Vehikel inkorporiertes Pharmakon mit einer Membranoberfläche in

Kontakt, kommt es nach einer zeitlichen Verzögerung während der Anreicherung der

Substanz in der Membran allmählich zu einem Gleichgewichtszustand des transmembranären

Flusses. Dieser bleibt so lange bestehen, wie einerseits auf der Membranoberfläche ein

genügend großer Pharmakonvorrat gegeben und andererseits ein kontinuierlicher

Substanzabstrom gewährleistet ist (MERK und BICKERS 1992).

Geschwindigkeitsbestimmend für die dermale Resorption eines Stoffes sind seine chemisch-

physikalischen Eigenschaften. Hierzu zählen Löslichkeit, Polarität, Affinität zum Vehikel und

Struktur- sowie Molekülgröße (STÜTTGEN 1972).

Ein einfaches Modell, um die Pharmakokinetik der dermalen Penetration und Permeation

topisch applizierter Substanzen zu beschreiben, stellen GUY und HADGRAFT (1983) auf

(Abb. 9). Danach sind die zwei geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für die Pharmako-

kinetik eines dermal applizierten Wirkstoffes erstens der Übertritt aus der Grundlage in die

Hornschicht und zweitens die Permeation aus der Hornschicht in das lebende Gewebe. Eine

für jeden Stoff charakteristische Konstante k beschreibt die Geschwindigkeit des

Wirkstoffübertrittes zwischen den jeweiligen Kompartimenten.

Abb. 9: Schematische Darstellung der Wirkstoffaufnahme aus einer galenischen

Formulierung in die Haut (nach GUY und HADGRAFT 1984)

k1 – k4 = Geschwindigkeitskonstanten

k1 k2

k3

k4

galenischeFormulierung

Stratumcorneum

Blut bzw.Rezeptor-flüssigkeit

14

Direkt nach Applikation eines Pharmakons auf die Haut besteht ein großes

Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum Stratum corneum. Der

Wirkstoff gelangt durch passive Diffusion in die Hornschicht. Die Diffusion erfolgt

hauptsächlich vom Stratum corneum in das Blutgefäßsystem und stoffabhängig meist nur in

geringem Maße vom Blutgefäßsystem in die Hornschicht zurück. Die Kenntnis der

Geschwindigkeitskonstanten erlaubt eine Abschätzung des pharmakokinetischen Verhaltens

einer Testsubstanz (siehe 2.4).

Nach dem strukturellen Aufbau der Haut sind verschiedene Möglichkeiten für den dermalen

Stofftransport gegeben. Der transepidermale Transport kann entsprechend der

Zweikompartiment-Struktur der Hornschicht interzellulär und transzellulär erfolgen (Abb.

10). Der letztere Weg setzt voraus, daß die Substanz die Zellmembran und die Lipidschicht

durchqueren kann (KARZEL und LIEDTKE 1989).

Abb. 10: Transportwege durch das Stratum corneum (nach ELIAS 1981)

Die Penetration über die Haarfollikel und Talgdrüsen und/oder die ekkrinen Schweißdrüsen

wird als „Shunt“-Weg bezeichnet (STÜTTGEN et al. 1986). SCHEUPLEIN (1967) geht

davon aus, daß dieser Weg vornehmlich zu Beginn eines Diffusionvorgangs Bedeutung hat.

Auch ILLEL und SCHAEFER (1988) messen diesem Transportweg vor allem initial

Bedeutung bei. Das Erreichen eines Gleichgewichtzustandes zwischen den

15

Geschwindigkeitskonstanten von außen nach innen und denen von innen nach außen resultiert

aus einem Ausgleich dieser beiden Penetrationswege (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).

HUEBER et al. (1993) liefern in einem In-vitro-Resorptionsvergleich von vier unterschiedlich

lipophilen Steroiden an Humanhaut Beweise dafür, daß die Permeation durch normale Haut

signifikant größer ist als durch Narbenhaut, also Haut ohne Haarfollikel und Talgdrüsen.

Aufgrund des geringen Oberflächenanteils von 0,1 – 1 % scheint der transfollikuläre

Transport jedoch insgesamt von untergeordneter Bedeutung zu sein. ILLEL und SCHAEFER

(1988) gewinnen drüsenlose Haut, indem sie die Rückenhaut narkotisierter Ratten eine

Minute mit 60 °C heißem Wasser behandeln, danach wird die Epidermis entfernt. Nach

abgeschlossener Wundheilung nach drei bis vier Monaten ist die neugebildete Epidermis

drüsenfrei. Die Untersuchungsergebnisse an drüsenloser Haut zeigen, daß der transfollikuläre

Weg hauptsächlich bei polaren Stoffen eine Rolle spielt. Für lipophile Pharmaka ist dieser

Weg weniger bedeutsam (ILLEL und SCHAEFER 1988).

Wie bereits erwähnt, ist das Stratum corneum als eigentliche Barriere für den Durchtritt eines

Stoffes durch die Haut zu sehen. Es gelangt zunächst nur ein kleiner Teil der aufgetragenen

Substanz in die tiefen Lagen der Haut. Stoffabhängig verbleibt ein beachtenswerter Teil im

Stratum corneum. Aus diesem kann die Substanz schließlich, dem Konzentrationsgefälle

folgend, in die tieferen Hautschichten eindringen. Die übereinander liegenden Zelllagen

bilden ein System von aufeinanderfolgenden lipophilen und hydrophilen Schichten, in

welchen die Diffusion eines Stoffes, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion gehorchend, nach

innen hin zunehmend erschwert bzw. verlangsamt wird (SCHAEFER et al. 1982; DUPUIS et

al. 1984). Unterhalb der Hornschicht ist die Penetration durch die lockeren Zellanordnungen

im Stratum spinosum und Stratum basale entsprechend erleichtert (NEURAND und MEYER

1987). Das Eindringen in die Epidermis allein ist jedoch nicht gleichbedeutend mit einer

Aufnahme durch den Gesamtorganismus. Da sich die Epidermis stetig von unten her

regeneriert, können Substanzen, die hier länger verweilen, mit den Zellen wieder eliminiert

werden (ZESCH und SCHAEFER 1976). Nach dem Durchdringen des Stratum papillare der

Dermis können aufgetragene Substanzen in die Blut- und Lymphbahnen gelangen; sie können

jedoch schon in der Haut metabolisiert werden, da auch in der Haut eine große Anzahl von

Enzymen mit metabolischer Aktivität vorhanden sind (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).

Qualitativ sind die Enzyme solchen in anderen Organgeweben gleich, die quantitative

16

Umwandlungsrate der Arzneimittel ist in der Haut im Vergleich zur Leber allerdings deutlich

geringer. Bei systemischer Applikation spielt die Haut bei der Metabolisierung von

Arzneimitteln daher nur eine untergeordnete Rolle. Auf der anderen Seite ist die

Metabolisierung in der Haut nach topischer Applikation von entscheidender Bedeutung.

KAPPUS (1989) zeigt auf, daß die Metabolisierungsrate stoffabhängig erhöht oder erniedrigt

ist, woraus eine verminderte bzw. gesteigerte Bioverfügbarkeit resultiert. Ferner weist er

darauf hin, daß neben der Umwandlung zu exkretionsfähigen Verbindungen die enzymatische

Metabolisierung auch zu einer kovalenten Bindung an das Gewebe führen und in Toxizität,

Mutagenität und Kanzerogenität enden kann (BICKERS und KAPPUS 1980; BICKERS

1983).

Die Faktoren, welche auf die perkutane Penetration und Resorption Einfluß nehmen, sind

vielfältig. Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) vergrößert sich die Permeationsrate mit

steigender Löslichkeit der angebotenen Substanz im Stratum corneum entsprechend den

Gesetzen der Diffusion.

Hydrophile Stoffe diffundieren nach topischer Applikation nur in begrenztem Umfang in die

Hornschicht, da durch die Lipidmembran nur ungeladene lipophile Substanzen diffundieren.

Auch höhermolekulare Stoffe zeigen in der Regel eine geringere perkutane Penetration. Die

Lipophilie des Arzneistoffes spielt somit für die Diffusion durch die Hornschicht eine

entscheidende Rolle (SCHAEFER et al. 1982). Moleküle mit sowohl polaren als auch

apolaren Eigenschaften penetrieren in der Regel recht gut durch die Hornschicht (KOCH

1985). Außerordentlich gering ist die Penetration von Elektrolyten durch das Stratum

corneum (SCHEUPLEIN 1978b). Soweit diese stattfindet, dürfte sie in erster Linie

interzellulär erfolgen, da die Zellmembranen nach MIDDLETON (1969) für Elektrolyte

undurchlässig sind.

Abgesehen von hochmolekularen Substanzen spielt die Molekülgröße für die Penetration und

Permeation durch die Haut eine eher untergeordnete Rolle. Festzustellen ist, daß bei allen

Molekülen, die die Haut gut durchwandern, eine Beziehung zwischen Molekülgröße und

Permeabilitätsgeschwindigkeit nicht zu belegen ist (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).

Untersuchungen von FELDMANN und MAIBACH (1970) zeigen, daß chemisch verwandte

Verbindungen große Resorptionsunterschiede aufweisen können. So ist die Resorptionsrate

17

für Benzoesäure wesentlich höher als für Hippursäure, dem Glycinkonjugat dieser

Verbindung.

Aufgrund der speziesabhängigen Unterschiede der Morphologie der Haut muß die

Beurteilung der Penetrationsfähigkeit einzelner Substanzen für jede Spezies gesondert

betrachtet werden. Beim Menschen scheint die Barrierefunktion des Stratum corneum recht

stark ausgebildet zu sein (BARTEK et al. 1972). Dem Menschen am ähnlichsten reagieren

nach BARTEK et al. (1972) unter den Tieren Schweine, haarlose Mäuse und einzelne

Affenarten. Meerschweinchen, Hunde, Ratten und Kaninchen zeigen eine deutlich

schwächere Barrierefunktion (siehe auch Tab. 3, S. 27). PRÍBORSKÝ und

MÜHLBACHOVÁ (1990) ermitteln dagegen annähernd gleiche Resorptionsraten bei

Menschen und Meerschweinchen, während sie bei Ratten deutlich höhere Resorptionsraten

ermitteln. MARZULLI et al. (1969) sowie BRONAUGH et al. (1982a) führen die

Permeabilitätsunterschiede der Arten auf die Zahl der Haare und Drüsen sowie die

abweichende Stärke und Zusammensetzung des Stratum corneum zurück.

Von erheblicher Bedeutung sind die großen Permeationsunterschiede in den verschiedenen

Körperregionen. In In-vitro-Untersuchungen an Rattenhaut zeigt BRONAUGH (1985), daß

die dünnere Abdominalhaut permeabler für Wasser, Harnstoff und Kortison ist als die dickere

Rückenhaut. Mit In-vitro-Untersuchungen an haarloser Mäusehaut bestätigen BEHL et al.

(1985) einen Zusammenhang zwischen Hautdicke und regionalen Permeationsunterschieden.

CHAMBIN et al. (1996) testen verschiedene Estradiolformulierungen in vitro an

Schweinehaut von unterschiedlichen Körperregionen. Auch in ihren Untersuchungen hat die

Hautdicke Einfluß auf die Fluxrate, die perkutane Penetration durch dünnere Haut ist

gesteigert.

FELDMANN und MAIBACH (1967) zeigen unter Verwendung von radioaktiv markiertem

Hydrocortison (Messung im Urin nach topischer Applikation), daß die resorbierte Substanz-

menge an Kopfhaut, Achselhöhle, Stirn und Kieferwinkel besonders hoch ist. Mit der 42

fachen resorbierten Substanzmenge bezogen auf die Unterarmhaut (=1) ist die Resorptionsrate

am Skrotum am größten (Tab. 2).

18

Tab. 2: Urinausscheidung von 14C-Hydrocortison nach externer Applikation bezogen

auf die Haut am Unterarm (=1) (FELDMANN und MAIBACH 1967)

Unterarm (ventral) 1,00

Fußsohle 0,14

Fußknöchel (lateral) 0,42

Handfläche 0,83

Unterarm (dorsal) 1,10

Rücken 1,70

Kopfhaut 3,50

Achselhöhle 3,60

Stirn 6,00

Kieferwinkel 13,00

Skrotum 42,00

Nicht nur die Körperregion, sondern auch das Hautalter hat Einfluß auf die perkutane

Penetration und Resorption. Neonatale Haut ist im Allgemeinen deutlich permeabler. Ursache

hierfür ist der im Vergleich zum Erwachsenen höhere Wassergehalt und der verringerte

Lipidgehalt der Hornschicht (POULSEN 1972). Mit zunehmendem Alter weist die Haut

Veränderungen wie erhöhte Trockenheit auf, welche auf der verminderten transepidermalen

Wasserabgabe beruht, die durch die Verhärtung der gealterten Epidermis bedingt ist (RAAB

1990b). Die Verringerung des Lipidgehaltes - den Fettfilm auf der Haut betreffend - geht auf

eine eingeschränkte Funktion der Talgdrüsen zurück (STRAUSS et al. 1986). ROSKOS et al.

(1986) untersuchen die renale Elimination von Testosteron, Östradiol, Hydrocortison und

Benzoesäure nach topischer Anwendung bei 18-35-jährigen und 65-75-jährigen Probanden.

Für das lipophile Testosteron und Östradiol resultiert bei beiden Gruppen kein

Eliminationsunterschied, wohl aber für das weniger lipophile Hydrocortison und für

Benzoesäure, deren Elimination bei den älteren Probanden reduziert ist. Dieses deutet auf eine

geringere Resorptionsrate von weniger lipophilen Substanzen bei älteren Menschen hin.

19

2.2.3 Penetrationsbeeinflussung

Eine intakte Funktion und Struktur der Haut garantiert einen größtmöglichen Schutz

gegenüber externen Substanzen. So ist für viele Substanzen bekannt, daß sie auch nach

längerer Einwirkungszeit in sehr hohem Prozentsatz wieder von der Hautoberfläche eliminiert

werden können. Das ist zunächst von den Eigenschaften der betreffenden Substanz selbst

abhängig, andererseits vom Zustand der Zusammensetzung des Hautoberflächenfilms. Als

Folge verschiedener struktureller Veränderungen der Hornschicht ist eine Beschleunigung der

Penetration topisch applizierter Arzneistoffe bzw. Schadstoffe nachweisbar. Von Bedeutung

sind nach WOHLRAB (2001b) besonders folgende Veränderungen:

- Entfettung der Haut

- Entfernung der oberflächlichen Hornlagen

- Störung der lamellären Struktur des Horns

- Erhöhung der Hydratation der Hornschicht (z.B. bei Okklusion)

- erhöhte Transpiration

- Sonnenlichtexposition

- erhöhte Hautdurchblutung

Organische Lösungsmittel führen aufgrund der Lipidentfernung zu gesteigerter Permeabilität

der Hornschicht. Am meisten wird der transepidermale Wasserverlust durch ein Gemisch aus

Chloroform und Methanol gesteigert (GRICE 1980). HARADEA et al. (1992) machen

deutlich, daß die Entfernung der mehr polaren Lipide durch Chloroform-Methanol-Extraktion

vor allem zu einer Penetrationsverbesserung lipophiler Wirkstoffe führt. IMOKAWA und

HATTORI (1985) zeigen, daß eine Entfettung der Hornschicht mit einem Aceton-Ether-

Gemisch zu einem Verschwinden der lamellären Lipidstrukturen und zu einer Abnahme des

gebundenen Wassers führt. Je länger die Acetonbehandlung anhält, umso ausgeprägter ist die

Exsikkation. IMOKAWA et al. (1986) stellen fest, daß der Hautzustand nach Lipidextraktion

reversibel ist. Durch Auftragen von Lipiden, insbesondere Ceramiden und Glykolipiden,

kommt es wieder zu einer Zunahme des Wasserbindungsvermögens. KIETZMANN und

BLUME (1997) vergleichen am Modell des isoliert perfundierten Rindereuters die Resorption

von Betamethasondipropionat durch unbehandelte Euterhaut und durch mit Aceton

20

vorgeschädigte Euterhaut. Ihre Ergebnisse zeigen, daß Aceton die Hornschicht für den

Wirkstoff durchlässiger macht.

DOWNING et al. (1993) untersuchen die Beeinflussung der Hornschichtbarriere durch

Tenside. Sie zeigen, daß es zu einer Einlagerung der Tenside in das Stratum corneum kommt.

Sie stellen fest, daß die Hornschichtpermeabilität allein durch die Einlagerung von Tensiden

erhöht werden kann, ohne daß die Hornschichtbarriere zerstört wird. Trotzdem kann es

darüber hinaus bei starker Tensideinwirkung zu einer Schädigung der Barrierefunktion durch

Herausemulgieren von Lipiden kommen (DOWNING et al. 1993).

Bei Verlust der Hornschicht gibt es keine wesentliche Barriere mehr für eindringende

Agenzien. Experimentell läßt sich diese Situation, die bei Verbrennungen und teilweise auch

bei Ekzemen vorliegt, durch Entfernen der Hornschicht mittels der Tesa®-Film-Abrißmethode

simulieren (GLOOR 1982). Die Menge des Stratum corneum, die pro Abriss entfernt wird, ist

nicht linear proportional zur Anzahl der Abrisse (TSAI et al. 1991). SCHALLA et al. (1980)

zeigen für Kortikosteroide, daß durch die Tesa®-Film-Abrißmethode die Wirkstoffpenetration

verstärkt wird.

Aus der klinischen Praxis ist die Penetrationssteigerung durch Okklusivverbände bekannt

(GLOOR 1982). Diese führen zu einem Wärme- und Feuchtigkeitsstau mit nachfolgender

Hydratation, Quellung und Auflockerung der Hornschichten. Die Penetration topischer

Arzneistoffe läßt sich dadurch wirkstoffabhängig deutlich steigern (AUBÖCK 1992). Einige

Autoren stellen jedoch fest, daß die Penetration von hydrophilen und einigen lipophilen

Substanzen, insbesondere Methanol, Ethanol (BEHL et al. 1980) und Hydrocortison (BUCKS

et al. 1988) nicht oder nur in geringem Maße durch Hydratation und Okklusion beeinflußt

wird. Obwohl es unter Okklusionsbedingungen zu einer Hydratation der Hornschicht kommt,

unterstützen Untersuchungen von TREFFEL et al. (1992) die Ansicht, daß eine Okklusion

nicht notwendigerweise die perkutane Resorption von Substanzen steigert.

Die perkutane Penetration topisch applizierter Substanzen ist weiterhin temperaturabhängig.

BLANK et al. (1967), GOLDEN et al. (1987) sowie EMILSON et al. (1993) zeigen in In-

vitro-Versuchen, daß die perkutane Penetration mit steigender Temperatur ansteigt. Durch die

Temperaturerhöhung wird die Fluidität der Lipiddoppelschichten der Hornschicht erhöht. Die

Bilayer sind so weniger dicht gepackt, und die entstandene Minderung der Barriere führt zu

gesteigerter Penetration (CLARYS et al. 1996). Die Temperatur kann die Stoffresorption

21

direkt über die Diffusionsrate, aber auch indirekt über die Durchblutung beeinflussen

(KARZEL und LIEDTKE 1989). So beeinflussen Kortikosteroide ihr eigenes pharmako-

kinetisches Profil, da sie durch ihren vasokonstriktorischen Effekt einen negativen Einfluß auf

den Blutstrom ausüben (GIBSON 1990).

Um ein möglichst großes Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum

Stratum corneum zu erreichen, können nach DAVIS und HADGRAFT (1991) übersättigte

Lösungen, wie z.B. Mikroemulsionen verwendet werden. Diese legen einen weiteren

Mechanismus dar, die perkutane Penetration zu verbessern. WATKINSON et al. (1996)

zeigen an einem synthetischen Membranmodell, daß unter konstanten Bedingungen der Flux

durch die Membran sein Maximum erreicht, wenn die äußere Membranschicht gesättigt ist.

Das trifft zu, wenn das Vehikel ebenfalls mit dem Wirkstoff gesättigt ist.

Eine große Anzahl von Substanzen ist bekannt, die für unterschiedliche topisch applizierte

Substanzen als Penetrationsförderer wirksam sind. Diese Eigenschaft wird vielfach für die

Verbesserung der therapeutischen Effektivität galenischer Zubereitungen genutzt

(WOHLRAB 2001a). Penetrationsförderer erhöhen durch Veränderung der Hautstruktur die

Hautpermeabilität, ohne irreversible Schäden hervorzurufen. Dabei haben sie in der

angewandten Konzentration in der Regel keine eigenen pharmakologischen Eigenschaften

(RITSCHEL und SPROCKEL 1988). Lange bekannt ist beispielsweise die

penetrationsfördernde Eigenschaft des Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Wirkung ist mit der

Fähigkeit zu erklären, die Durchlässigkeit der Barriere zu vergrößern. Dabei kommt es zu

einer Reaktion mit den polaren Gruppen der Membran und zu einer Lockerung der

Bindungsenergie, gefolgt von Strukturänderungen, die letztlich zu neuen Wegen durch das

Gewebe führen (SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1987). Auch Stoffe wie Harnstoff und

Salicylsäure finden aufgrund ihrer keratolytischen Eigenschaft Einsatz als

Penetrationsförderer. Die Anwendung von Harnstoff bewirkt ebenso wie eine

Okklusionsbehandlung einen Anstieg des interzellulären freien Wassergehaltes (GLOOR

1982). 5 - 10 %ige Harnstoffpräparate bewirken in Gegenwart von Wasser eine Auflösung der

Interzellularbrücken und damit eine Lösung der Korneozytenhaftung (WOHLRAB 1996). In

Untersuchungen zur Salicylsäurewirkung auf die Haut zeigen HUBER und CHRISTOPHERS

(1977), daß durch die topische Applikation von Salicylsäure die Haftfähigkeit der Hornzellen

22

untereinander gemindert und in den tieferen Hornschichtlagen das Verbundsystem der

Hornzellen gelockert wird.

2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation

Für Untersuchungen der perkutanen Pharmakokinetik stehen derzeit eine Vielzahl von In-

vivo- und In-vitro-Methoden zur Verfügung (SCHAEFER und HENSBY 1990). Die

Untersuchungen werden zumeist an menschlicher und tierischer Haut und an sogenannten

Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt (WESTER und MAIBACH 1985;

SCHAEFER-KORTING 1996).

2.3.1 In-vivo-Modelle

In-vivo-Untersuchungen am Menschen werden nach RIVIERE et al. (1986) durch ethische

Fakten limitiert. Weiter können In-vivo-Methoden wegen toxikologischer Gefährdung oder

aus Gründen des Strahlenschutzes (radioaktiv markierte Substanzen) nur sehr begrenzt am

Menschen angewendet werden (GLOOR 1982). Dagegen bieten sich sowohl in vivo als auch

ex vivo viele Möglichkeiten im Tierversuch an. Untersuchungen an Tieren haben das Ziel, die

perkutane Resorption beim Menschen vorhersagen zu können. Zur Messung der perkutanen

Permeation von Substanzen und deren anschließender Resorption kann nach Applikation

einer Substanz auf die Haut im Blut und Urin des Versuchstieres die Menge der resorbierten

bzw. ausgeschiedenen Substanz in Abhängigkeit von der Kontaktdauer gemessen werden.

Auch die Bestimmung der Verteilung der Substanz in verschiedenen Organen ist möglich

(WOHLRAB 2001b). Allerdings ergibt sich bei der Auswahl eines Tiermodells die

Problematik der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Verhältnisse beim Menschen. So ist

die Barrierefunktion der Hornschicht von Labortieren (z.B. Meerschweinchen, Maus, Ratte)

im Vergleich zur menschlichen Haut deutlich geringer (HOWES et al. 1996). Nach WESTER

und MAIBACH (1985) ist die perkutane Resorption beim Affen und Schwein in den meisten

Fällen mit der des Menschen am ehesten vergleichbar bzw. nahezu identisch.

Die Messung der Resorption hydrophober Substanzen gestaltet sich in vivo oft schwierig, da

die resorbierten hydrophoben Substanzen sich in das Körperfett verteilen und nur sehr

langsam ausgeschieden werden. Aus diesem Grund wären Messungen über Monate

23

notwendig, da es möglich ist, daß nach einer Woche nur ein geringer Prozentsatz der

absorbierten Menge ausgeschieden wurde (BRONAUGH und COLLIER 1991b).

In-vivo-Untersuchungen schließen die Wirkungen des Organismus auf die resorbierte

Substanz, wie Metabolisierung, Verteilung und Exkretion mit ein, so daß die Penetrationsrate

nur indirekt ermittelt wird. Weiterhin ist es mit In-vivo-Modellen nicht möglich, exakte

qualitative und quantitative Aussagen über den Hautmetabolismus zu machen (BRONAUGH

et al. 1982b).

2.3.2 In-vitro-Modelle

In Anbetracht der Nachteile von In-vivo-Methoden ergeben sich für In-vitro-Modelle weitere

Vorteile in einer Einsparung von Tierversuchen und in der Möglichkeit, auch mit toxischen

Dosen arbeiten zu können (WESTER und MAIBACH 1985). Bei den In-vitro-Methoden

unterscheidet man zwischen Modellen mit nicht perfundierter und perfundierter Haut. Zu den

erstgenannten gehören Diffusionszellen und Zellkulturen. Die Perfusionsmodelle sind unter

2.3.2.3 aufgeführt.

2.3.2.1 Diffusionszellen

Die Anwendung von Diffusionszellen basiert auf der Annahme, daß die Barriereeigenschaften

der Hornschicht von exzidierter Haut mit In-vivo-Verhältnissen identisch sind, eine Annahme,

die durch viele Untersuchungen gestützt wird. Nach BRONAUGH und MAIBACH (1985)

behält die Haut auch nach Exzision vom Körper ihre Barriereeigenschaften, da das Stratum

corneum als nicht mehr vitales Gewebe die wichtigste Penetrationsbarriere für Substanzen

darstellt. Vitale Haut ist nach BRONAUGH und MAIBACH (1985) weiterhin keine

Voraussetzung für Penetrationsversuche, weil die Penetration ein passiver Diffusionsprozeß

ist. Die Barriereeigenschaften der Haut können normalerweise nach Gewinnung der Haut vom

Körper und geeigneter Lagerung (-20 °C) bis zu drei Monaten erhalten bleiben (HARRISON

et al. 1984). Unter standardisierten Bedingungen gewonnene Haut von verschiedenen

Tierspezies ist im Gegensatz zu Humanhaut leicht erhältlich. Letztere steht nur in begrenztem

Umfang bei Operationen oder post mortem zur Verfügung. PFLUCKER et al. (1997)

untersuchen morphologische Veränderungen und die dermale Permeation in vitro an

exzidierter Schweinehaut nach Lagerung unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu

24

frischer Haut. Sie finden nach topischer Applikation verschiedener Substanzen keine

Änderungen in den Penetrationseigenschaften der Haut. Das gebräuchlichste In-vitro-Modell

zum Studium des dermalen Wirkstofftransportes ist die Diffusionszelle nach Franz (FRANZ

1975) (Abb. 11) bzw. davon abgeleitete Modifikationen.

Abb. 11: Schematische Darstellung des Aufbaus sog. „Franz-Zellen“ (nach FRANZ 1975)

Die „Franz-Zelle“ besteht aus einer doppelwandigen, temperierbaren Glaskammer zur

Aufnahme der Rezeptorflüssigkeit. Auf dieses Gerät wird entweder das vom subkutanen Fett

befreite Hautstück oder nur die Epidermis gelegt und durch einen Glasring und eine

Metallklammer so fixiert, daß es mit der dermalen Seite in Kontakt zum Rezeptormedium

gelangt. Die epidermale Seite der Haut wird in die trockene bzw. kontrolliert hydratisierte

Umgebung gerichtet eingesetzt. Als Diffusionsbarriere können auch synthetische Materialien

benutzt werden (NACHT und YEUNG 1985). Da das wässrige dermale Gewebe

wasserlösliche Substanzen leicht diffundieren lässt, stellt es nur eine minimale Beeinflussung

für die Penetration der applizierten Substanzen dar. Hydrophobe Substanzen hingegen

diffundieren nur sehr langsam durch die Dermis, weshalb im Vergleich zu In-vivo-

Untersuchungen die Resorption lipophiler Substanzen langsamer erscheint (BRONAUGH

und COLLIER 1991).

Probe-entnahmerohr

Hautpräparat

Abdeckung

Dichtungsring

Temperatur-mantel

Zufluß

AbflußMagnetrührer

25

Eine auf das Stratum corneum aufgetragene Substanz diffundiert, den Gesetzen der

Fick´schen Diffusion folgend, durch die Schichten der Haut und kann anschließend in der

Rezeptorflüssigkeit nachgewiesen werden. Die gewählte Rezeptorflüssigkeit darf das Ausmaß

der Penetration der Testsubstanz nicht begrenzen, d.h. die Substanz muß im Rezeptormedium

vollständig löslich sein. Die Konzentration der Testsubstanz im Rezeptormedium muß

während der Versuchsdauer gering bleiben, um eine signifikante Rückdiffusion zu vermeiden.

Es muß weiterhin beachtet werden, daß die Barriereeigenschaften der Haut, sowie die

physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Substanz und die Analytik

nicht nachteilig durch die Rezeptorflüssigkeit verändert werden (HOWES et al. 1996). Bei

längerandauernden Experimenten ist nach COLLIER und BRONAUGH (1991) eine

Antibiotikazugabe zur Rezeptorflüssigkeit erforderlich.

Eine besondere Modifikation der Diffusionszelle ist die Durchflußdiffusionszelle („flow-

through“-Diffusionszelle). Sie wurde entwickelt, um die Probennahme zu automatisieren.

Weiter läßt sich hier die Problematik der Rückdiffusion von Stoffen aus der

Rezeptorflüssigkeit in die Haut, die unter Verwendung der Diffusionszelle eintreten kann,

vermeiden. Diese Durchflußdiffusionszellen entsprechen eher der In-vivo-Situation, da durch

den ständigen Austausch der Rezeptorflüssigkeit die penetrierende Substanz durch die

Mikrozirkulation aus der Haut entfernt wird. Im Vergleich zu statischen Diffusionszellen

stimmen die Penetrationsprofile und die penetrierenden Mengen von Wasser, Kortison und

Benzoesäure überein (BRONAUGH und STEWART 1985). Im Gegensatz dazu stellen

WESTER und MAIBACH (1985) signifikante Unterschiede zwischen statischen und „flow

through“-Diffusionszellen fest. Sie untersuchen die Penetration des Desinfektionsmittels

Triclocarban in die menschliche Bauchhaut. Die Penetration im statischen System beträgt 0,1

%, im Durchflußsystem 6,0 % der applizierten Dosis. Die geringe Penetrationsrate wird durch

die schlechte Löslichkeit des Triclocarban in der Rezeptorflüssigkeit erklärt, weshalb diese

Substanz in der Haut verbleibt. Die Löslichkeit im „flow-through“-System ist durch das

höhere Volumen größer, weshalb dieser Zustand eher dem kontinuierlichen Blutfluß in vivo

entspricht. Die perkutane Resorption von Triclocarban in vivo beträgt etwa 7 %. Um die

Resorption vorherzusagen, eignet sich in diesem Fall das „flow-through“-System besser

(WESTER und MAIBACH 1985).

26

Bei der Verwendung von Diffusionszellen ist zu beachten, daß Enzyme aus der Dermis in die

Rezeptorflüssigkeit übertreten können, so daß penetrierte Substanzen möglicherweise erst in

der Rezeptorflüssigkeit metabolisiert werden (BUNDGAARD et al. 1983). DECARVALHO

et al. (1996) zeigen, daß auch eine Diffusion des Wassers aus der Rezeptorkammer in die

Donatorkammer möglich ist, was die Penetration einer Testsubstanz beeinflussen kann.

2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell

Das sog. Saarbrücker Penetrationsmodell (SB-M) wurde auf der Basis von exzidierter

Humanhaut entwickelt. Es können die Arzneistoffkonzentrationsverläufe in den einzelnen

Hautschichten ermittelt werden. Im Gegensatz zur „Franzzelle“, die für die

Wirkstoffpermeation durch die Haut entwickelt wurde, dient das SB-M der Untersuchung der

Wirkstoffpenetration in die Haut.

Am SB-M werden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Wirkstoffpenetration in die

verschiedenen Hautschichten untersucht, wobei die Haut selbst als Akzeptor für die zu

penetrierende Substanz fungiert. Eine Hydratation der Haut wird vermieden und damit auch

mögliche Veränderungen der Hauteigenschaften, die bei Verwendung der „Franzzelle“ durch

die Rezeptorflüssigkeit entstehen können. Jedoch stellt die Inkubationszeit hier in

Abhängigkeit von der verwendeten Substanz einen limitierenden Faktor dar, da die

Voraussetzungen für das Eindringen der Substanz über die gesamte Versuchsdauer erhalten

werden müssen.

Für den Versuchsablauf wird ein Hautstück zusammen mit einem mit Ringerlösung

getränkten Papierfilter in die Aushöhlung eines Teflonblocks gebracht. Die Arzneimittel-

zubereitung mit der zu penetrierenden Substanz befindet sich in der Aushöhlung eines

Gegenstückes, welches ebenfalls aus Teflon besteht. Dieses Gegenstück wird auf die

Oberfläche der Haut aufgelegt und mit Schrauben fixiert. Um einen transepidermalen

Wasserverlust zu vermeiden, wird die Lücke zwischen den beiden Teflonstücken mit

Plastibase versiegelt. Die gesamte Apparatur wird in in einer Plastikbox in einem 32 °C

warmen Wasserbad über unterschiedlich lange Zeit inkubiert.

Zur Bestimmung der Verteilung der Substanz in den verschiedenen Hautschichttiefen wird

das Hautstück im Anschluß an den Versuch mit zwei verschiedenen Methoden segmentiert:

mit der Tesa-Film-Abrißmethode wird das Stratum corneum Schicht für Schicht abgetragen.

27

Die „lebende“ Epidermis wird mit dem Gefriermikrotom parallel zur Hautoberfläche in

definierten Schichtdicken abgetragen. Durch anschließende Extraktion der zu untersuchenden

Substanz aus den Hautschnitten und Bestimmung der Konzentrationen mittels HPLC kann die

Verteilung in den Hautschichten errechnet werden (WAGNER et al. 2000).

WAGNER et al. (2000) vergleichen das SB-M mit der etablierten „Franzzelle“ und In-vivo-

Daten, wobei sowohl für das SB-M als auch für die „Franzzelle“ für den Arzneistoff

Flufenaminsäure eine gute In-vitro-/ In-vivo-Korrelation gefunden wird. Außerdem stellen sie

fest, daß die starke Hydratation der Haut bei Verwendung der „Franzzelle“ insbesonders den

Arzneistoffkonzentrationsverlauf in den tieferen Hautschichten stark beeinflußt.

Zur Bestimmung der In-vitro-Permeabilitätseigenschaften der Haut gibt es zahlreiche

Untersuchungen. Tabelle 3 faßt in absteigender Reihenfolge in vitro bestimmte

Hautpermeabilitäten bei verschiedenen Spezies zusammen.

TREGEAR (1966) MARZULLI et al. (1969) McCREESH (1965) Hautpermeabilität

Kaninchen Maus Kaninchen

Ratte Meerschweinchen Ratte

Meerschweinchen Ziege Meerschweinchen

Mensch Kaninchen Katze

Pferd Ziege

Katze Affe

Hund Hund

Affe Schwein

Schwein

Mensch

Schimpanse

Tab. 3: In vitro-Hautpermeabilität bei verschiedenen Spezies in absteigender

Reihenfolge (nach TREGEAR 1966; MARZULLI et al. 1969; McCREESH

1965)

Schweinehaut ist nach DICK et al. (1997) für Voraussagen bezüglich der Permeabilität durch

die Haut des Menschen sehr gut geeignet. Rattenhaut stellt ebenfalls ein geeignetes Modell

+++++

+

28

für menschliche Haut dar, wenn die applizierte Substanz hydrophiler Natur ist, führt aber

grundsätzlich zu einer Überschätzung der penetrierten Menge bei lipophilen Substanzen.

BRONAUGH (1985) kann auch in vitro an Rattenhaut regionale Unterschiede feststellen. Die

dünnere Abdominalhaut ist für Wasser, Kortison und Harnstoff permeabler als die dickere

Rückenhaut. BEHL et al. (1985) dagegen zeigen in Versuchen an haarlosen Mäusen, daß hier

die Rückenhaut dünner und gleichzeitig permeabler als die Bauchhaut ist.

Im Hinblick auf die Darstellung der Penetration, also dem Weg durch die Hornschicht und

Anreicherung in der Epidermis, kann zwischen In-vivo- und In-vitro-Versuchen kein

prinzipieller Unterschied festgestellt werden. Wesentliche Abweichungen ergeben sich

jedoch, sobald die Kutis mit ihren Gefäßsystemen in die Penetrationsuntersuchungen

einbezogen wird. Da der Transport durch die Gefäße und die davon abhängige

Gleichgewichtseinstellung in vitro nicht mehr möglich ist, sofern die Haut nicht perfundiert

ist, sind solche Ergebnisse auf In-vivo-Verhältnisse schlecht übertragbar (STÜTTGEN und

SCHAEFER 1974).

Nach KLIGMANN (1983) ist die Auswertbarkeit der In-vitro-Ergebnisse leichter, da bei

diesen Untersuchungen nur die Haut erfasst wird. Er ist daher der Ansicht, daß In-vitro-

Ergebnisse valider sind als In-vivo-Daten, und daß bei bestehenden Unterschieden die In-vivo-

Ergebnisse fragwürdiger sind.

BRONAUGH et al. (1982b) untersuchen die Resorption von Benzoesäure, Acetylsalicylsäure,

Harnstoff und Coffein durch Rattenhaut. Sie vergleichen die erzielten In-vivo- und In-vitro-

Ergebnisse und stellen fest, daß sich sowohl qualitativ als auch quantitativ eine gute

Übereinstimmung zeigt. Andere Autoren stellen ebenfalls zwischen In-vivo- und In-vitro-

Untersuchungen gute Übereinstimmungen fest (AINSWORTH 1960; SEKURA und SKALA

1972; CREASY et al. 1978).

29

2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut

Da zu Untersuchungen zur Hautphysiologie und -pathophysiologie frisch exzidierte gesunde

Humanhaut nicht immer in ausreichend großer Menge zur Verfügung steht und Ergebnisse

aus Resorptionsstudien am Tier nur begrenzt auf den Menschen übertragbar sind, stehen als

Ersatzverfahren u.a. kultivierte Hautzellen und rekonstruierte Epidermis bzw. künstliche Haut

zur Verfügung (SCHAEFER-KORTING 1996).

Zellkulturen werden heute in großem Umfang zur Testung von Pharmaka eingesetzt. Hierbei

werden Zellen von Epidermis und Korium in künstlichen Nährmedien vermehrt. Kultiviert

man Keratinozyten in Gegenwart physiologischer Kalziumionenkonzentration, d.h. in einem

kalziumreichen Nährmedium, gelingt es, einen Differenzierungsprozeß in Gang zu setzen, aus

dem mehrschichtige (2-5 Zelllagen) Präparate hervorgehen. In kalziumarmen Nährmedien

wird dagegen nur eine Zelllage ausgebildet (SCHAEFER-KORTING 1996).

Schon DUBERTRET (1990) verwendet ein Hautäquivalent zur Untersuchung dermo-

epidermaler Wechselwirkungen, indem er menschliche Fibroblasten mit Kollagen Typ I und

III mischt. Die Kollagenfasern werden durch die Fibroblasten zusammengezogen. Diese

dreidimensionale Kultur wird anschließend mit Keratinozyten bedeckt.

Für die Herstellung „künstlicher Haut“ werden Keratinozyten beispielsweise auf

mesenchymalem Gewebe (isoliertes Korium oder in Kollagen eingebettete Fibroblasten)

gezüchtet und durch Inkubation an der Luft-Medium-Grenze zur Verhornung gebracht. Diese

„Ersatzhaut“ weist allerdings eine geringere Barrierefunktion als gesunde Humanhaut auf.

Während die verstärkte Durchlässigkeit tierischer Haut auf die Vielzahl von Haarfollikeln

(Shuntweg der Penetration) zurückgeführt wird, ist sie bei der Kunsthaut auf eine den

physiologischen Bedingungen nicht entsprechende Ausbildung des Stratum corneum

zurückzuführen. Epidermale Lipide (Ceramide) entstehen in geringerer Konzentration,

werden unzureichend sezerniert und zudem nicht gemäß der Beschreibung unter 2.2.1

arrangiert. Die in vitro kultivierten Keratinozyten haben jedoch das Potential zur normalen

Ausreifung keinesfalls verloren. Nach Transplantation von „Kunsthaut“ in Nacktmäuse

resultiert nämlich eine Normalisierung der Barrierefunktion (SCHAEFER-KORTING 1996).

Es liegen verschiedene Permeabilitätsstudien und Untersuchungen zur Barrierefunktion von

künstlicher Haut vor (RÉGNIER et al. 1992; DOUCET et al. 1997). LOTTE et al. (1997)

zeigen, daß die Penetrationskinetik von Wasser, Benzoesäure, Coffein und Hydrocortison an

30

rekonstruierter Epidermis deutlich unterschieden werden kann. In dieser Reihenfolge nehmen

die Penetrationsraten der genannten Stoffe ab. Dieses entspricht auch der Reihenfolge der

Permeabilität durch Humanhaut, wobei die mit rekonstruierter Epidermis erzielten absoluten

Werte jedoch wesentlich höher liegen.

SCHMOOK et al. (2001) vergleichen die Penetrationseigenschaften von Menschen-, Ratten-

und Schweinehaut mit kommerziell erhältlichen Hautäquivalenten. Sie kommen zu dem

Ergebnis, daß die momentan angebotenen Kunsthautmodelle (z.B. Graftskin®, Skinethik ®,

Skin²®, Episkin®) nicht ohne Einschränkung für In-vitro-Penetrationsstudien einsetzbar sind.

2.3.2.4 Perfusionsmodelle

Nach HOWES et al. (1996) ist die Verwendung perfundierter Haut aus physiologischer Sicht

wünschenswert, da die Versuchsanordnung in Diffusionszellen nur Aussagen zur dermalen

Penetration, jedoch nicht zur Resorption topisch applizierter Substanzen erlaubt

(KIETZMANN und LÖSCHER 1993). In-vitro-Verfahren, die die In-vivo-Situation am

ehesten widerspiegeln, stellen Perfusionsmodelle dar (BEHRENDT et al. 1989). Es gibt

jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Modellen, die als aussagekräftig angesehen werden.

Für Routineuntersuchungen der perkutanen Absorption werden sie aufgrund ihres höheren

technischen Aufwandes und der begrenzten Lebensfähigkeit der perfundierten Organe

seltener genutzt (HOWES et al. 1996). Wie bereits beschrieben, ist zu beachten, daß die

dermale Penetration und Resorption regional erheblich variiert (FELDMANN und

MAIBACH 1969). Diese Tatsache schränkt die Übertragbarkeit von Ergebnissen generell auf

Zieltierarten bzw. auf den Menschen ein (SCHAEFER et al. 1987).

Eine etablierte Versuchsanordnung stellt das isoliert perfundierte Kaninchenohr dar, welche

erstmals von PISSEMSKI (1914) im Rahmen physiologischer Untersuchungen beschrieben

wird. Später werden verschiedene Modifikationen dieser Methode für Untersuchungen zur

Resorption und zum Hautmetabolismus topisch applizierter Substanzen entwickelt (EKERDT

et al. 1985; KELLNER et al. 1986; BEHRENDT und KAMPFFMEYER 1987, 1989; BAST

und KAMPFFMEYER 1994), jedoch ist die Übertragbarkeit der am Kaninchenohr

gemessenen Resorptionsrate auf andere Tierarten oder den Menschen nur mit

Einschränkungen möglich (PERSHING und KRUEGER 1987).

31

Ein weiteres Modell stellt die isoliert perfundierte Hundehaut dar (KJAERSGAARD 1954).

Die Haut des Hinterlaufes wird exzidiert und über die A. saphena mit heparinisiertem

Hundeblut perfundiert. Nach BEHRENDT et al. (1989) ist diese Methode für

Routineuntersuchungen weniger geeignet, da aus anatomischen Gründen kein geschlossenes

arteriovenöses System mittels zusätzlicher venöser Kanülierung erreicht werden kann.

Alternativ zur isoliert perfundierten Hundehaut kann das isoliert perfundierte Hundebein

verwendet werden. Die Gliedmaße wird im Bereich des Hüftgelenkes abgesetzt; als Anschluß

an die Perfusionsapparatur dienen die A. femoralis und die V. saphena medialis (FRIEDMAN

1966; McELFRESH und KELLY 1973; VICK 2000).

Beim isoliert perfundierten Hinterbein der Ratte erfolgt die Perfusion über die A. femoralis.

CROSS et al. (1993) stellen fest, daß durch Erhöhung des Perfusionsflusses um das

Zweifache die Flußrate in der tiefer gelegenen Muskulatur auf das Fünffache ansteigt,

während sich die Flußrate in der Haut und den oberflächlichen Muskeln nur verdoppelt.

Entsprechend der Flußrate nimmt die Wirkstoffkonzentration in den verschiedenen Geweben

zu.

Die Methoden zur Durchführung der Perfusion an isolierten Gliedmaßen werden immer

wieder modifiziert und verbessert. Das isoliert perfundierte Schweinebein ist heute als Modell

für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen etabliert (NOGUEIRA et al.

1999).

Mit dem Modell der isoliert perfundierten Humanhaut nach HIERNICKEL (1986) ist die

zusätzliche Perfusion des subkutanen Fettgewebes und eines Lymphknotens möglich. Ein bei

Operationseingriffen exzidierter Leistenhautlappen wird über die A. epigastrica perfundiert,

Venen- und Lymphflüssigkeit werden gesammelt. Das Perfusionsmedium ähnelt in seiner

Zusammensetzung Plasmaersatzflüssigkeit. Nach einer Perfusionszeit von 50 Stunden läßt

sich sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch kein Unterschied zu frisch entferntem

Gewebe erkennen.

Einen höheren Arbeitsaufwand im Vergleich zu anderen Perfusionsmodellen erfordert das

Modell des isoliert perfundierten Schweinehautlappens (RIVIERE et al. 1986). Ein zunächst

operativ gewonnener, mit kanülierbaren Gefäßen (A. und V. epigastrica superficialis

caudalis) versehener Hautstiellappen wird nach sechs Tagen in einem zweiten operativen

Eingriff isoliert und steht dann zur Perfusion zur Verfügung. Licht- und

32

elektronenmikroskopische Untersuchungen nach acht Stunden zeigen eine normal

erscheinende Schweinehaut (MONTEIRO-RIVIERE et al. 1987).

Sowohl das menschliche Leistenhautpräparat als auch die Schweinehautplastik enthalten

erhebliche Fettmengen, in die lipophile Pharmaka diffundieren und die die Kinetik von

Substrat und Metaboliten verändern. Diese Nachteile sind am isoliert perfundierten

Schweineohr nicht vorhanden. DE LANGE et al. (1992) perfundieren Schweineohren mit

Carbogen begastem Blut über einen Zeitraum von vier Stunden. Bei der Durchführung von

perkutanen Penetrationsstudien mit diesem Modell ermitteln ELLIOT et al. (1997) jedoch

Penetrationsraten mit einer großen Variabilität.

Ein weiteres Modell zur Prüfung der dermalen Resorption ist das isoliert perfundierte

Rindereuter, welches von Schlachttieren gewonnen wird. Das Rindereuter besitzt eine am

isolierten Organ gut zugängliche arterielle und venöse Gefäßversorgung, die die isolierte

Perfusion ermöglicht (KIETZMANN et al. 1993). Erste Versuche am isoliert perfundierten

Rindereuter wurden bereits unternommen, um die Physiologie der Milchbildung zu

untersuchen (PETERSEN et al. 1939, 1941). ARENS (1991) untersucht am isoliert

perfundierten Rindereuter die dermale Penetration von topisch applizierten Substanzen. Hier

weist sie neben einer Penetration und Resorption auch eine In-vitro-Metabolisierung von

Wirkstoffen nach.

2.4 Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison als Testsubstanzen der

transdermalen Penetration und Permeation

Die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison werden aufgrund ihrer

unterschiedlichen Pharmakokinetik in vielen Penetrationsstudien als Modellsubstanzen

verwendet. GUY und HADGRAFT (1984) nutzen unter Verwendung dieser Substanzen ein

pharmakokinetisches Modell zur Beschreibung des pharmakokinetischen Verhaltens von

Stoffen (siehe 2.2.2). Sie können anhand der am Menschen in vivo ermittelten

Geschwindigkeitskonstanten k1 – k4 (gemäß Abb. 9, S. 13) zeigen, wie deutlich sich

Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison voneinander unterscheiden. Die Unterschiede in

der Pharmakokinetik dieser Substanzen resultieren hauptsächlich aus der unterschiedlichen

transepidermalen Penetration und Permeation, was auch aus den Halbwertzeiten (t50), die sich

33

auf die Eindringgeschwindigkeit beziehen, ersichtlich ist. Der Zusammenhang zwischen

Halbwertzeit (t50) und Geschwindigkeitskonstante (k) ergibt sich aus der Formel t50 = ln2 / k

(Tab. 4).

Substanz k1 t50 k2 t50 k3 t50 k4 t50

Benzoesäure 0,184 3,8 2,88 0,2 0,014 49,5 0,592 1,2

Testosteron 0,058 12,0 1,44 0,5 2,70 0,3 0,104 6,7

Hydrocortison 0,022 31,5 1,44 0,5 0,180 3,9 0,158 4,4

Tab. 4: Geschwindigkeitskonstanten k1-k4 (1/h) (gemäß Abb. 3, S. 13) und

Halbwertzeiten t50 (h) (t50 = ln2 / k) für Benzoesäure, Testosteron und Hydro-

kortison (nach GUY und HADGRAFT 1984)

Es wird deutlich, daß Hydrocortison im Vergleich zu Benzoesäure und Testosteron nur

langsam in die Hornschicht penetriert (t50 = 31,5 Stunden), woraus eine sehr langsame

Anflutung resultiert. Aufgrund seiner chemisch-physikalischen Eigenschaften permeiert es

anschließend jedoch relativ schnell durch die Dermis in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit

(t50 = 0,5 Stunden). Benzoesäure dagegen tritt mit einer Halbwertzeit von 0,2 Stunden fast

doppelt so schnell aus der Hornschicht in das Blut bzw. in die Rezeptorflüssigkeit über wie

Testosteron und Hydrocortison (t50 = 0,5 Stunden). Etwas langsamer, aber im Vergleich zur

Anflutung in das Stratum corneum relativ schnell, diffundiert Hydrocortison aus dem Blut

bzw. der Rezeptorflüssigkeit zurück in die Haut (t50 = 3,9 Stunden). Auch Testosteron hat mit

einer Halbwertzeit von 0,3 Stunden eine hohe Affinität zur Hornschicht, wohingegen

Benzoesäure nur zu einem minimalen Teil zurückdiffundiert (t50 = 49,5 Stunden). Für die drei

Wirkstoffe ergeben sich folglich unterschiedliche Verteilungsprofile in der Haut (Abb. 12).

k2 k1 k3

k4


Stratumcorneum


34

Somit ergibt sich, daß sich das Stratum corneum mit Benzoesäure schnell anfüllt. Dann flutet

es sehr schnell wieder ab. Eine Rückdiffusion erfolgt nur in sehr geringem Maße.

Testosteron tritt dagegen relativ langsam in die Hornschicht über. Die Abflutung erfolgt nur

langsam, da es fast doppelt so schnell in das Stratum corneum zurückdiffundiert, wie es aus

diesem freigesetzt wird.

Die Anflutung von Hydrocortison erfolgt noch langsamer. Es flutet in gleichem Maße wie

Testosteron aus der Hornschicht ab, diffundiert aber langsamer wieder in diese zurück.

Daraus resultiert ein geringerer Nettofluß des Hydrocortisons, wodurch sich der sog.

Reservoireffekt der Hornschicht erklärt. GUY und HADGRAFT (1984) errechnen aus dem

Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten k3/k2 die relative Affinität einer Substanz zum

Stratum corneum (20 = hoch; 0,5 = mittel; 0,002 = gering). Für die drei hier untersuchten

Substanzen ergibt sich demnach die höchste Affinität für Testosteron (1,88), gefolgt von

Hydrocortison (0,13) und Benzoesäure (0,005).

Da sich die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison in ihrer

Pharmakokinetik so deutlich voneinander unterscheiden und weil bereits viele Studien

vorliegen, in denen diese Substanzen verwendet werden, dienen sie in der vorliegenden Arbeit

ebenfalls als Untersuchungssubstanzen, um die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse mit

Ergebnissen aus der zugänglichen Literatur vergleichen zu können.

0

Zeit (h)

72

1

0,1

0,01

Konzentration(Dimension)

36

Abb. 12: Schematische Verteilungs-

profile in der Haut als Zeitfunktion

für Benzoesäure (B), Testosteron (T)

und Hydrocortison (H)

(nach GUY und HADGRAFT 1984)

35

3 Material und Methoden

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen

Penetration und Permeation in einer vergleichenden Untersuchung unter identischen

Bedingungen darzustellen. Als Testsubstanzen dienten Benzoesäure, Testosteron und

Hydrocortison, die aufgrund unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften

unterschiedlich schnell durch die Haut diffundieren und vielfach eingesetzte

Modellsubstanzen sind (siehe 2.4).

3.1 Versuchsmaterial

Die in den Versuchen verwendeten Häute wurden von euthanasierten Schweinen, Hunden,

Rindern, Pferden und Ratten gewonnen. Die Euterhaut stammte aus Schlachthofmaterial von

gesunden Deutschen Holsteinischen Kühen (5-6 Jahre alt). Bei den Schweinen handelte es

sich um drei Monate alte Tiere (2 weiblich und 2 männlich) aus dem zentralen Tierlabor der

Medizinischen Hochschule Hannover. Sowohl die Ratten der Rasse Wistar (weiblich) als

auch die Hunde (Beagle, 9-11 Jahre alt, männlich) stammten aus dem Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die

Rinderhaut wurde von Deutschen Holsteinischen Kühen (3-6 Jahre alt) im Institut für

Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover entnommen. Bei den Pferden handelte es

sich um Tiere (> 20 Jahre alt), die im Institut für Anatomie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover euthanasiert worden waren.

Wie aus den Abb. 13 - 15 zu entnehmen ist, wurden bei den Tierarten Pferd, Schwein, Rind

und Hund Hautproben aus den Regionen der seitlichen Brustwand (Regio costalis), des

Rückens (Regio lumbalis) und des Bauches (Regio umbilicalis) entnommen. Rattenhaut

stammte nur aus der Rücken- und Bauchregion. Die Euterhaut wurde von der seitlichen

Euterwand gewonnen.

36

Abb. 13: Hautentnahmestellen beim Hund (analoge Hautstellen beim Pferd,

Schwein und Rind)

Abb. 14: Hautentnahmestellen bei der Ratte

Abb. 15:

Hautentnahmestelle

am Euter

dorsal ventral

Rücken Bauch

Brustwand Brustwand

dorsal ventral

37

Die Haut wurde von subkutanem Fett befreit, mit Enthaarungscreme (Veet®) behandelt, in

4x4 cm große Stücke geteilt und bis zum Versuchsbeginn in flüssigem Stickstoff bei –196 °C

aufbewahrt.

3.2 Verwendete Testsubstanzen

Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison standen als Reinsubstanzen (Sigma Chemie,

Deisenhofen) zur Verfügung. Sie wurden vor Versuchsbeginn in 70 %igem Ethanol (Merck,

Darmstadt) gelöst. Die Substanzen wurden als 0,8 %ige alkoholische Lösung appliziert.

3.2.1 Benzoesäure (Abb. 16)

Benzoesäure ist bei 25 °C relativ schlecht in Wasser löslich (3,4 mg/ml), die Löslichkeit

nimmt jedoch mit der Zugabe von alkalischen Substanzen zu. Benzoesäure ist sehr gut in

kaltem Alkohol (435 mg/ml) und Aceton (333 mg/ml) löslich (ANONYMUS 1983).

COOH

3.2.2 Hydrocortison (Abb. 17)

Hydrocortison ist bei 25 °C schlecht in Wasser löslich (0,28 mg/ml), dagegen löst es sich gut

in Ethanol (15 mg/ml) und Aceton (9,3 mg/ml) (ANONYMUS 1983).

O

CH3

HO

H

H H

CH3C

OH

O

CH2OH

Abb. 16:Strukturformel vonBenzoesäure

Abb. 17:Strukturformelvon Hydrocortison

38

3.2.3 Testosteron (Abb. 18)

Testosteron ist wie alle Steroide in Wasser unlöslich, dagegen in Alkohol, Ether und anderen

organischen Lösungsmitteln sowie Ölen gut löslich (ANONYMUS 1983).

CH3

CH3OH

O

3.3 Diffusionszellen

Abb. 19: Darstellung des Versuchsaufbaus

Die in Abb. 19 dargestellten statischen Diffusionszellen bestehen aus einer nach oben offenen

Rezeptorkammer mit 50 ml Fassungsvermögen. Es befindet sich ein Zugang zu der

Abb. 18:Strukturformelvon Testosteron

1 = “Franzzelle“ (siehe auch Abb. 11, S. 24)

2 = Magnetrührer3 = Wasserbad4 = Pumpe

1

2 3

4

1

39

Rezeptorkammer am Boden und ein weiterer unter dem Hals. Über den oberen Zugang erfolgt

die Probennahme, der untere dient dem Volumenersatz. Auf dem trichterförmigen Hals der

Rezeptorkammer befindet sich ein Glaszylinder mit einem Durchmesser von 1,6 cm. Durch

das Einspannen der Haut wird er zur nach oben offenen Donatorkammer. Der Zylinder ist mit

einer Klammer an der Rezeptorkammer befestigt. Die Rezeptorkammer ist von einem

Glasmantel mit Zu- und Ablauf umgeben. Mittels einer Pumpe wird durch diesen Glasmantel

in einem Wasserbad erwärmtes Wasser gepumpt, so daß die Temperatur der

Rezeptorflüssigkeit mit 32 - 34 °C der der Hautoberflächentemperatur entspricht. Als

Rezeptorflüssigkeit wird ein Phosphatpuffer verwendet. Sie wird kontinuierlich gerührt.

Zusammensetzung der verwendeten Rezeptorflüssigkeit (pH 7,4):

11,50 g Na2HPO4*2 H2O (Merck, Darmstadt)

2,96 g NaH2PO4 (Merck, Darmstadt)

5,84 g NaCl (Merck, Darmstadt)

ad 1 l Aqua bidest.

3.4 Versuchsdurchführung

Die Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison wurden als 0,8 %ige

alkoholische Lösungen appliziert. Die jeweils aufgetragene Substanzmenge betrug 800 µg pro

Applikationsfläche von 2 cm² (400 µg/cm²). Je Tierart und Hautlokalisation (seitliche

Brustwand, Rücken und Bauch bzw. Euter) wurden pro Testsubstanz vier Versuche

durchgeführt. Die Versuchsdauer betrug sechs Stunden. Unmittelbar vor dem Auftragen der

Testsubstanzen auf die vorbereiteten Hautstücke erfolgte eine erste Probennahme von 300 µl

Rezeptorflüssigkeit. Weitere Proben von 300 µl wurden nach 1, 2, 4 und 6 Stunden

entnommen. Nach jeder Probennahme wurden die Diffusionszellen mit 300 µl

Rezeptorflüssigkeit wieder aufgefüllt. Die Proben wurden bis zur Auswertung bei –20 °C

eingefroren.

40

3.5 Nachweis der Testsubstanzen

Die Benzoesäurekonzentration wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

(HPLC) gemessen. Die Bestimmung der Hydrocortison- und Testosteronkonzentrationen

erfolgte mit enzymgebundenen Immunadsorptionstests (ELISA) (Cortisol Saliva Nr. RE

52261, IBL, Hamburg; Testosteron Nr. RE 52151, IBL, Hamburg).

3.5.1 Enzymimmunoassay

Das Prinzip der beiden Enzymimmunoassays (ELISA) ist gleich. Das Hormon in der Probe

konkurriert mit Meerrettichperoxidase markiertem Hormon um die Bindung an eine begrenzte

Anzahl von Antikörpern, mit denen eine Mikrotiterplatte beschichtet ist. Nach Inkubation und

Waschen der Mikrotiterplatte wurde zur Entwicklung des Assays ein Farbreagenz

hinzugegeben, das Tetramethylbenzidin enthält. Nach einer weiteren Inkubation wurde die

Enzymreaktion durch die Zugabe einer Stop-Lösung (0,5 M Schwefelsäure) beendet. Die

Intensität des gebildeten Farbstoffes wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm

im Mikroplate Reader MRX (Dynatech Deutschland GmbH, Denkendorf) gemessen. Die

Extinktion des gelben Farbstoffes ist umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration in den

Proben.

Bei jedem Messansatz wurde eine Standardreihe mitgeführt, die von 2 - 80 ng/Ansatz (Hydro-

kortison) bzw. 0,2 - 16 ng/Ansatz (Testosteron) reichte. Aus den Standards wurden die

Bindungsraten des Hormons ermittelt. Diese Bindungsraten (%-Bindung) dienten der

Berechnung einer Kalibrationskurve nach Probittransformation. Die Extinktionen der Proben

wurden auf diese Eichkurve bezogen. Die Nachweisgrenze lag bei 2 ng/ml (Hydrocortison)

bzw. 0,5 ng/ml (Testosteron). Die Inter- und Intra-Assay-Varianz der Tests liegt nach

Herstellerangaben bei 4,6 - 6,3 % (Hydrocortison) und 3,8 - 5,8 % (Testosteron). Die

Kreuzreaktivitäten der Immunoassays sind in Tab. 5 zusammengefaßt.

41

Tab. 5: Spezifität der verwendeten Antikörper:

a) Hydrocortison - Antikörper

Hydrocortison 100 %

Prednisolon 60 %

Kortikosteron 29 %

Übrige Steroide < 3 %

b) Testosteron - Antikörper

Testosteron 100 %

Androstendion 0,9 %

Androsteron 1 %

Übrige Steroide < 0,9 %

3.5.2 Bestimmung von Benzoesäure mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato-

graphie (HPLC)

Reagenzien

Na2HPO4*2 H2O (Merck, Darmstadt)

NaH2PO4 (Merck, Darmstadt)

NaCl (Merck, Darmstadt)

KH2PO4 (Merck, Darmstadt)

Phophorsäure 85% (Merck, Darmstadt)

Benzoesäure-Reinsubstanz (Sigma Chemie, Deisenhofen)

Acetonitril (Labscan, Dublin, Irland)

Aqua bidest.

42

Aufarbeitung der Proben

Die Proben wurden bei 4 °C und 15000 g/Minute 5 Minuten lang zentrifugiert (Eppendorf

Zentrifuge 5403, Hamburg). Dem Überstand jeder Probe wurden 16 µl 8,5 %ige Phosphor-

säure zugegeben, um einen pH-Wert von 3,0 zu erhalten. Dieses Volumen wurde zuvor

mittels Titration der Rezeptorflüssigkeit mit 8,5 %iger Phosphorsäure ermittelt.

HPLC-Anlage

Autosampler: Gilson Model 231, Abimed mit Dilutor 401, Langenfeld

Pumpe: System Gold 116, Beckman, München

Detektor: Modell 2050, Varian, Darmstadt

P.C./Software: Gold Nouveau, Beckman, München

Vorsäule: LiChrospher 100 RP-18e (5 µm)

Merck, Darmstadt

Trennsäule: LiChrospher 100 RP18 endcapped, (5 µm), 250-4

Merck, Darmstadt

HPLC-Bedingungen

Eluent: Acetonitril : Phosphatpuffer (110 : 200), pH-Wert 3,0

Phosphatpuffer: 6,804 g KH2PO4 ad 1 l Aqua bidest.

mittels 85 %iger Phosphorsäure auf pH 2,4 eingestellt

Fluß: 1 ml/ Minute

Detektion: UV 230 nm

Injektionsmenge: 100 µl

Für die Kalibrationsreihe wurden aus einer Stammlösung von Benzoesäure (1 mg

Benzoesäure/ml Rezeptorflüssigkeit) Verdünnungen von 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400, 600,

800, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000, 15000 und 20000 ng/ml Phosphatpuffer

43

hergestellt. Aus den ermittelten Peakhöhen der Standards wurde mittels linearer Regression

(Excel 7.0) die Funktion der Kalibrationskurve errechnet. Es ergab sich folgende Funktion:

x (ng Benzoesäure/ml) = (y – 4150,5) / 65,236

(r = 0,9998)

Die Berechnung der Benzoesäurekonzentration in der Rezeptorflüssigkeit erfolgte mit Hilfe

der Regressionsgeraden. Mit der Methode wurde eine Nachweisgrenze von 40 ng/ml erreicht.

3.6 Statistische Auswertung

Aus den Wirkstoffkonzentrationen in der Rezeptorflüssigkeit wurde die pro Fläche (cm2) und

Zeiteinheit (h) penetrierte Menge berechnet. Die Menge (µg/cm² Haut) errechnet sich nach

folgender Gleichung:

M = C x R / F

M = penetrierte Menge (µg/cm² Haut)

C = gemessene Wirkstoffkonzentration (ng/ml)

R = Menge der Rezeptorflüssigkeit (50 ml)

F = Hautfläche (2 cm²)

Wegen der jeweils geringen Versuchsanzahl (n=4) wurden die penetrierten Wirkstoffmengen

mit Hilfe des nicht parametrischen U-Tests für ungebundene Stichproben nach MANN und

WHITNEY (1947) verglichen. Die Berechnungen erfolgten mit dem Computerprogramm

SigmaStat für Windows (Version 1.0, Jandel Corporation). Eine Irrtumswahrscheinlichkeit

von 5 % (p < 0,05) galt als schwach signifikant, eine von 1 % (p < 0,01) als signifikant, eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1 % (p < 0,001) als hoch signifikant. Einige wenige der

Hautproben waren nicht auswertbar, da die gemessenen Wirkstoffkonzentrationen in der

Rezeptorflüssigkeit eine Schädigung der Haut auswiesen.

44

4 Ergebnisse

4.1 Benzoesäurepenetration und -permeation

4.1.1 Rattenhaut (Abb. 20–21)

Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs

Stunden 256 – 291 µg/cm² durch die Rückenhaut und 194 – 291 µg/cm² durch die Bauchhaut.

Das sind jeweils mehr als 50 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten

Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6. Die Symbole in den nachfolgenden

Abbildungen kennzeichnen jeweils das Ergebnis eines Versuches.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation ist zwischen Rücken- und

Bauchhaut der Ratte kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der

statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.

Abb. 20:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

Abb. 21:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

0

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300

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0 2 4 6Zeit (h)

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te M

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cm²)

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300

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eier

te M

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(µg/

cm²)

45

4.1.2 Hundehaut (Abb. 22-24)


Stunden 50 – 135 µg/cm² durch die Rückenhaut, 42– 203 µg/cm² durch die Bauchhaut und

134– 350 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken und Bauch weniger als

50 % und an der Brustwand mehr als 50 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der

permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Abb. 22:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 23:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 24:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

0

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cm²)

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eier

te M

enge

(µg/

cm²)

46

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen Rücken-,

Bauch- und Brustwandhaut des Hundes keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >

0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.

4.1.3 Pferdehaut (Abb. 25-27)


Stunden 13 – 76 µg/cm² durch die Rückenhaut, 260 – 386 µg/cm² durch die Bauchhaut und

374 – 397 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken weniger als 25 % und

am Bauch und an der Brustwand biszu fast 100 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung

der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation durch die Rücken-, Bauch-

und Brustwandhaut des Pferdes bestehen schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05)

sowohl zwischen der Rücken- und Bauchhaut als auch zwischen der Rücken- und

Brustwandhaut. Hier ist die Rückenhaut für Benzoesäure weniger permeabel als die Bauch-

und Brustwandhaut des Pferdes. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang

in Tabelle 7 aufgeführt.

4.1.4 Schweinehaut (Abb. 28-30)


Stunden 51 – 96 µg/cm² durch die Rückenhaut, 29 – 246 µg/cm² durch die Bauchhaut und 81

– 124 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken weniger als 25 % und am

Bauch und an der Brustwand durchschnittlich 25 % der aufgetragenen Menge. Die

Berechnung der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen Rücken-,

Bauch- und Brustwandhaut des Schweines keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >

0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.

47

Abb. 25:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

Abb. 26:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

Abb. 27:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

0

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cm²)

48

Abb. 30:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

Abb. 28:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

Abb. 29:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

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eier

te M

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cm²)

49

4.1.5 Rinderhaut (Abb. 31-34)


Stunden 4 – 31 µg/cm² durch die Rückenhaut, 24 – 282 µg/cm² durch die Bauchhaut, 47 –

380 µg/cm² durch die Haut der Brustwand und 181 – 285 µg/cm² durch die Euterhaut. Das

sind am Rücken weniger als 10 %, am Bauch und an der Brustwand bei Vernachlässigung der

Ausreißer (*) weniger als 50 % und an der Euterhaut mehr als 50 % der aufgetragenen

Menge. Die Berechnung der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter

3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen der Rücken-,

Bauch- und Brustwandhaut des Rindes bei Vernachlässigung der Ausreißer keine

signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05). Es scheint jedoch die Rückenhaut

tendenziell für Benzoesäure weniger permeabel als die Bauch- und Brusthaut zu sein. Die

Euterhaut des Rindes ist im Vergleich zur Rückenhaut für Benzoesäure wesentlich

permeabler. Hier besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Im Vergleich der

Benzoesäurepermeation durch die Euter-, Bauch und Brustwandhaut sind auch bei

Vernachlässigung des Ausreißers (*) keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05).

Die Euterhaut scheint jedoch tendenziell für Benzoesäure permeabler als die Bauch- und

Brusthaut zu sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7

aufgeführt.

50

Abb. 31:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 32:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 33:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 34:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteEuterhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

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cm²)

*

51

4.2 Hydrocortisonpenetration und -permeation

4.2.1 Rattenhaut (Abb. 35-36)

Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs

Stunden 1,7 – 3,9 µg/cm² durch die Rückenhaut und 1,9 – 3,4 µg/cm² durch die Bauchhaut.

Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten

Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation ist zwischen Rücken- und



Abb. 35:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

Abb. 36:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

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cm²)

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te M

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(µg/

cm²)

52



Stunden bis zu 0,4 µg/cm² durch die Rückenhaut, bis zu 3,5 µg/cm² durch die Bauchhaut und

bis zu 0,26 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken 0,1 %, am Bauch

weniger als 1 % und an der Brustwand weniger als 0,1 % der aufgetragenen Menge. Bei der

Rücken-, Bauch- und Brustwandhaut eines Hundes (Nr. 1, s. Anhangstab. 2) lag die in der

Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.

Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Abb. 37:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 38:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 39:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

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cm²)

53

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Rücken-, Bauch-

und Brustwandhaut des Hundes sind zwar keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >

0,05), dennoch deutet sich an, daß ist die Bauchhaut für Hydrocortison permeabler als die

Rücken- und Brusthaut sein könnte. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im

Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.



Stunden 3,6 – 12,7 µg/cm² durch die Bauchhaut und 23,8 – 97,2 µg/cm² durch die Haut der

Brustwand. Das sind am Bauch weniger als 5 % und an der Brustwand bis zu 25 % der

aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der


Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Abb. 40:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

Abb. 41:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

0

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(µg/

cm²)

54

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Bauch- und

Brustwandhaut des Pferdes ist kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05).

Tendenziell scheint die Bauchhaut jedoch für Hydrocortison weniger permeabel als die

Brusthaut zu sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7

aufgeführt.



Stunden 0,2 – 1,3 µg/cm² durch die Bauchhaut und bis zu 2,4 µg/cm² durch die Haut der

Brustwand. Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Bei den Rückenhäuten

(keine Abbildung) und bei der Bauchhaut eines Schweines (Nr. 1, s. Anhangstab. 4) lag die in

der Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der

Nachweisgrenze. Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß

Angaben unter 3.6.

Abb. 42:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

Abb. 43:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

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cm²)

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cm²)

55

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Bauch- und

Brustwandhaut des Schweines ist kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die

Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.



Stunden bis zu 6,1 µg/cm² durch die Bauchhaut, bis zu 0,2 µg/cm² durch die Haut der

Brustwand und 2,7 - 4,8 µg/cm² durch die Euterhaut. Das sind am Bauch weniger als 2 %, an

der Brustwand weniger als 0,1 % und am Euter mehr als 1 % der aufgetragenen Menge. Bei

den Rückenhäuten (keine Abbildung), bei zwei Bauchhäuten (Nr. 3 und 4, s. Anhangstab. 5)

und bei einer Brustwandhaut (Nr. 1, s. Anhangstab. 5) lag die in der Rezeptorflüssigkeit

gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze. Die Berechnung der

permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation ist zwischen Bauch- und

Brustwandhaut des Rindes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Euterhaut

des Rindes ist im Vergleich zur Brustwandhaut für Hydrocortison wesentlich permeabler.

Hier besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Im Vergleich der

Hydrocortisonpermeation durch die Euter-, Bauchhaut ist kein signifikanter Unterschied

ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle

7 aufgeführt.

56

Abb. 44:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 45:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 46:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteEuterhautproben des Rindes(Cave: Skalierung bis 5 µg/cm²).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

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cm²) *

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cm²)

57

4.3 Testosteronpenetration und -permeation

4.3.1 Rattenhaut (Abb. 47-48)

Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs

Stunden 2,3 – 3,0 µg/cm² durch die Rückenhaut und 2,6 – 3,7 µg/cm² durch die Bauchhaut.

Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten

Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Rücken- und



Abb. 47:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Rückenhautproben derRatte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

Abb. 48:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben derRatte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.

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(µg/

cm²)

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(µg/

cm²)

58



Stunden 0,6 – 1,8 µg/cm² durch die Rückenhaut, 0,8 – 1,9 µg/cm² durch die Bauchhaut und

1,4 – 2,3 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das ist jeweils weniger als 1 % der

aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß

Angaben unter 3.6.

Abb. 49:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Rückenhautproben desHundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 50:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desHundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

Abb. 51:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.

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cm²)

59

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation durch die Rücken-, Bauch-

und Brustwandhaut des Hundes sind keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05).

Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.




Brustwand. Das sind am Bauch etwas mehr als 1 % und an der Brustwand etwas mehr als 2 %

der aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der


Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Bauch- und

Brustwandhaut des Pferdes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Tendenziell

Abb. 52:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desPferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

Abb. 53:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Pferdes (Cave: Skalierung bis 10µg/cm²).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.

0

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cm²)

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0 2 4 6Zeit (h)

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eier

te M

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(µg/

cm²)

60

scheint die Bauchhaut jedoch für Testosteron weniger permeabel als die Brustwandhaut zu

sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.




Brustwand. Das sind am Bauch etwas mehr als 1 % und an der Brustwand weniger als 1 %

der aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der


Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation durch die Bauch- und

Brustwandhaut des Schweines besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Hier

Abb. 54:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

Abb. 55:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.

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cm²)

61

ist die Bauchhaut für Testosteron permeabler als die Brustwandhaut des Schweines. Die

Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.



Stunden 0,3 – 2,1 µg/cm² durch die Bauchhaut, 0,1 – 1,4 µg/cm² durch die Haut der

Brustwand und 0,9 – 10,4 µg/cm² durch die Euterhaut. Das sind am Bauch und an der

Brustwand weniger als 1 % und am Euter mehr als 2 % der aufgetragenen Menge. Bei der

Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der Rezeptorflüssigkeit gemessene

Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze. Die Berechnung der permeierten

Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.

Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Bauch- und

Brustwandhaut des Rindes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Im Vergleich

der Testosteronpermeation durch die Euter-, Bauch- und Brustwandhaut sind keine

signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05). Die Euterhaut scheint jedoch tendenziell für

Testosteron permeabler als die Bauch- und Brustwandhaut zu sein. Die Ergebnisse der


62

Abb. 56:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desRindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 57:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

Abb. 58:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Euterhautproben desRindes. An einem Euter (Nr. 4)permeierten insgesamt 10,4 µg/cm².Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.

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5

0 2 4 6Zeit (h)

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cm²)

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perm

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te M

enge

(µg/

cm²)

63

5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit sollen tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen

Penetration und Permeation in einer vergleichenden Untersuchung unter identischen

Bedingungen dargestellt werden. Es ist zu untersuchen, ob eine allgemein gültige Reihenfolge

für verschiedene Hautlokalisationen, Tierarten und Untersuchungssubstanzen mit variablen

chemisch-physikalischen Eigenschaften aufgestellt werden kann.

Für einen Vergleich der Ergebnisse vorliegender Studien zur dermalen Penetration, Permation

und Resorption sind detaillierte Informationen über die Versuchsbedingungen notwendig, da

die Stoffpenetration in Abhängigkeit von dem Versuchsmodell, der Tierspezies und Haut-

lokalisation erheblich variiert. Die Angabe der penetrierten bzw. resorbierten Menge erfolgt

meist in % der applizierten Dosis. Hier muß berücksichtigt werden, daß nur der Anteil des

Wirkstoffes aus der Formulierung in die Haut penetrieren kann, der mit dieser in Berührung

steht. Daher ist ein direkter Vergleich der in der Literatur genannten Ergebnisse aufgrund der

unterschiedlichen Versuchsbedingungen kaum möglich.

Die „Franz“-Diffusionszelle ist als In-vitro-Modell etabliert und scheint zur Untersuchung der

Penetrationsraten verschiedener Stoffe durch das Stratum corneum hinreichend geeignet zu

sein (FRANZ 1975). Für Resorptionsstudien ist perfundierte Haut notwendig, da hier die

Versuchsbedingungen den tatsächlichen biologischen Verhältnissen am nächsten kommen.

5.1 Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten

Die Permeabilitätsunterschiede zwischen den Hautlokalisationen Rücken, Bauch und seitliche

Brustwand werden im Folgenden einzeln für jede der Testsubstanzen Benzoesäure, Hydro-

kortison und Testosteron diskutiert.

5.1.1 Benzoesäurepermeation (s. 4.1)

Beim Vergleich der Benzoesäurepermeation durch die Bauchhaut und die Haut der seitlichen

Brustwand aller untersuchten Tierarten sind weder statistisch noch tendenziell generelle

Permeabilitätsunterschiede erkennbar. Beim Vergleich der Benzoesäurepermeation durch die

Ratten-, Hunde- und Schweinehaut lassen sich ebenfalls keine generellen

Permeabilitätsunterschiede zwischen den Hautlokalisationen Rücken, Bauch und seitliche

64

Brustwand darstellen. Beim Pferd ist die Rückenhaut für Benzoesäure weniger permeabel als

die Bauch- und Brustwandhaut. Beim Rind scheint die Rückenhaut für Benzoesäure

tendenziell weniger permeabel als die Bauch- und Brustwandhaut zu sein. Die Euterhaut des

Rindes ist für Benzoesäure permeabler als die Rückenhaut und scheint auch durchlässiger als

die Bauch- und Brustwandhaut zu sein.

Bereits FELDMANN und MAIBACH (1967) stellten in In-vivo-Untersuchungen am

Menschen fest, daß an der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion

Permeabilitätsunterschiede bestehen (s. Tab. 2, S. 18). In den eigenen Untersuchungen kann

zwar bestätigt werden, daß auch bei Tieren Permeabilitätsunterschiede in Abhängigkeit von

der Körperregion bestehen, jedoch kann für Benzoesäure keine allgemein gültige Aussage

über eine Reihenfolge der Permeabilität der verschiedenen Hautlokalisationen der

untersuchten Tierarten gemacht werden.

5.1.2 Hydrocortisonpermeation (s. 4.2)

Im Vergleich der Hydrocortisonpermeation durch die Rattenhaut kann zwischen Rücken- und

Bauchhaut weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied festgestellt werden. Die

Hydrocortisonpermeation durch die Rücken-, Bauch und Brustwandhaut des Hundes läßt

auch hier keine signifikanten Unterschiede erkennen, jedoch scheint die Bauchhaut

permeabler als die Rücken- und Brustwandhaut zu sein. Bei den Tierarten Pferd, Schwein und

Rind ist an der Rückenhaut keine Hydrocortisonpermeation nachweisbar. Zwischen Bauch-

und Brustwandhaut dieser Tierarten bestehen auch keine statistischen Unterschiede bezüglich

der Permeabilität für Hydrocortison. Beim Pferd allerdings scheint die Bauchhaut weniger

permeabel für Hydrocortison zu sein als die Haut der Brustwand. Beim Rind ist festzustellen,

daß die Euterhaut für Hydrocortison permeabler ist als die Haut der Brustwand.

Auch hier können für die eigenen Untersuchungen die von FELDMANN und MAIBACH

(1967) (s. Tab. 2, S. 18) festgestellten Permeabilitätsunterschiede der Haut in Abhängigkeit

von der Körperregion bestätigt werden, jedoch kann keine allgemein gültige Aussage über

eine Reihenfolge der Hydrocortisonpermeabilität der verschiedenen Hautlokalisationen der

untersuchten Tierarten gemacht werden. Es kann jedoch festgestellt werden, daß die

Rückenhaut der Großtiere Pferd, Schwein und Rind während einer Versuchsdauer von sechs

Stunden für Hydrocortison nicht permeabel ist.

65

5.1.3 Testosteronpermeation (s. 4.3)

Im Vergleich der Testosteronpermeation durch die Ratten- und Hundehaut kann zwischen

Rücken-, Bauch- und Brustwandhaut weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied

festgestellt werden. Bei den Tierarten Pferd, Schwein und Rind ist an der Rückenhaut keine

Testosteronpermeation nachweisbar. Die Bauchhaut des Pferdes scheint weniger permeabel

für Testosteron zu sein als die Haut der Brustwand. Beim Schwein allerdings ist die

Bauchhaut für Testosteron permeabler als die Haut der Brustwand. Die Euterhaut des Rindes

erscheint für Testosteron permeabler als die Bauch- und Brustwandhaut.

Wie auch für Hydrocortison können hier für die eigenen Untersuchungen die von

FELDMANN und MAIBACH (1967) (s. Tab. 2, S. 18) festgestellten Permeabilitäts-

unterschiede der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion bestätigt werden, jedoch kann

auch hier keine allgemein gültige Aussage über eine Reihenfolge der Testosteronpermeabilität

der verschiedenen Hautlokalisationen der untersuchten Tierarten gemacht werden. Es kann

jedoch festgestellt werden, daß die Rückenhaut der Großtiere Pferd, Schwein und Rind

während einer Versuchsdauer von sechs Stunden für Testosteron nicht permeabel ist.

Zusammenfassend wird jedoch festgestellt, daß in den vorliegenden Untersuchungen bei der

Ratte zwischen Rücken- und Bauchhaut Permeabilitätsunterschiede weder für Benzeosäure,

noch für Hydrocortison, noch für Testosteron bestehen. Dasselbe gilt für die Hundehaut

(Rücken, Bauch und Brustwand), wobei allerdings zu berücksichtigen ist, daß hier die

Bauchhaut für Hydrocortison permeabler zu sein scheint als die Haut der Brustwand. Die

Rückenhaut des Pferdes ist für alle drei Testsubstanzen am wenigsten permeabel. Es besteht

kein Unterschied zwischen der Bauch- und Brustwandhaut bezüglich der Benzoesäure-

permeabilität, allerdings fällt beim Pferd auf, daß die Haut der Brustwand sowohl für

Hydrocortison als auch für Testosteron permeabler zu sein scheint als die Bauchhaut. Bei den

Hautlokalisationen des Schweines bestehen bezüglich der Benzoesäurepermeation keine

Unterschiede. Für die Substanzen Hydrocortison und Testosteron ist, wie beim Pferd, die

Rückenhaut des Schweines am wenigsten permeabel. Im Gegensatz zu Hydrocortison, für das

zwischen Bauch- und Brustwandhaut kein Permeabilitätsunterschied besteht, permeiert

Testosteron besser durch die Bauchhaut als durch die Haut der Brustwand des Schweines. Die

Rückenhaut des Rindes ist, wie beim Pferd, für alle drei Testsubstanzen am wenigsten

66

permeabel. Zwischen Bauch- und Rückenhaut bestehen hinsichtlich der Permeabilität der

Substanzen keine Unterschiede. Es deutet sich an, daß die Euterhaut die durchlässigste Haut

aller untersuchten Körperregionen des Rindes sein könnte. Hier scheint die Permeabilität für

Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron im Vergleich zur Rücken-, Bauch- und

Brustwandhaut am größten (bei Vernachlässigung der Ausreißer) zu sein.

5.2 Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen

Die Permeabilitätsunterschiede zwischen den Rücken-, Bauch- und Brustwandhäuten der

verschiedenen Tierarten sollen im Folgenden einzeln für jede der Testsubstanzen

Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron diskutiert werden. Die Ergebnisse der

statistischen Berechnungen sind im Anhang in Tabelle 8 aufgeführt.

5.2.1 Benzoesäurepermeation

Die Rückenhaut der Ratte ist im Vergleich zu den Rückenhäuten der anderen Tierarten für

Benzoesäure am durchlässigsten. Hier bestehen jeweils schwach signifikante Unterschiede (p

< 0,05). Zwischen der Rückenhaut des Schweines und des Rindes besteht ebenfalls ein

schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05), hier ist die Schweinehaut für Benzoesäure

permeabler als die Rinderhaut. Zwischen den Rückenhäuten von Hund, Pferd und Schwein

können im statistischen Vergleich keine Unterschiede festgestellt werden (p > 0,05).

Tendenziell scheint jedoch die Rückenhaut des Hundes für Benzoesäure permeabler zu sein

als die Pferde- und Schweinehaut, die sich nicht voneinander unterscheiden; diese wiederum

sind für Benzoesäure permeabler als die Rückenhaut des Rindes (s. Abb. 20, 22, 25, 28, 31).

Um den Vergleich zwischen den Tierarten anhand der Körperregionen anschaulicher zu

machen, werden die Abbildungen 20, 22, 25, 28 und 31, die bereits im Ergebnisteil dargestellt

wurden, exemplarisch für die Benzoesäurepermeabilität auf der folgenden Seite noch einmal

wiederholt.

67

Abb. 20: Benzoesäurepermeation durch Abb. 22: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut der Ratte die Rückenhaut des Hundes

Abb. 25: Benzoesäurepermeation durch Abb. 28: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut des Pferdes die Rückenhaut des Schweines

Abb. 31: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut des Rindes

Die Benzoesäurepermeation durch die Bauchhaut der verschiedenen Tierarten läßt, statistisch

gesehen, einen schwach signifikanten Unterschied (p < 0,05) nur zwischen der Pferde- und

Hundehaut erkennen. Hier ist die Bauchhaut des Pferdes für Benzoesäure permeabler als die

des Hundes. Im statistischen Vergleich der übrigen Bauchhäute sind zwischen den Tierarten

keine Unterschiede nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die Bauchhaut des

Pferdes für Benzoesäure permeabler zu sein als die der Ratte, welche wieder permeabler

erscheint als die Hunde- und Schweinehäute, die sich nicht voneinander unterscheiden; diese

wiederum scheinen für Benzoesäure permeabler zu sein als die Rückenhaut des Rindes (bei

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68

Vernachlässigung des Ausreißers) (s. Abb. 21, 23, 26, 29, 32). Die Haut der Brustwand ist bei

Pferd und Hund für Benzoesäure durchlässiger als beim Schwein. Hier bestehen im

statistischen Vergleich schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05). Im statistischen

Vergleich der übrigen Brustwandhäute sind zwischen den Tierarten keine Unterschiede

nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die Haut der Brustwand des Hundes für

Benzoesäure permeabler zu sein als die Schweine- und Rinderhäute (bei Vernachlässigung

des Ausreißers) (s. Abb. 24, 27, 30, 33).

Weiter wurde die Euterhaut des Rindes mit den verschiedenen Körperregionen bezüglich der

Benzoesäurepermeabilität verglichen. Der Euterhaut am ähnlichsten erschienen unter den

Rücken- und Bauchhäuten die Rattenhaut und unter den Häuten der Brustwand die Hundehaut

(s. Abb. 20, 21, 34).

Die in diesem Abschnitt beschriebenen Ergebnisse der Benzoesäurepermeation durch die

verschiedenen Häute werden mit bekannten Untersuchungen zur In-vitro-Hautpermeabilität

bei verschiedenen Spezies (TREGEAR 1966; MARZULLI et al. 1969; McCREESH 1965)

verglichen (s. Tab. 3, S. 27). Diese Untersuchungen geben allerdings keinen Aufschluß

darüber, welche Hautlokalisationen in vitro untersucht wurden. So fällt hier auf, daß die

Reihenfolge der untersuchten Tierarten bezüglich ihrer Hautpermeabilität nicht einheitlich ist.

Für die Tierarten, die auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, ergab sich nach

McCREESH (1965) folgende In-vitro-Permeabilität in absteigender Reihenfolge: Ratte >

Hund > Schwein. MARZULLI et al. (1969) untersuchten Pferdehaut und stellten fest, daß

diese durchlässiger sei als die Hunde- und Schweinehaut. Rattenhaut wurde hier nicht

untersucht, allerdings ist die Hautpermeabilität dieser Spezies nach BARTEK et al. (1972) mit

den in dieser Studie untersuchten Labornagern Meerschweinchen und Kaninchen

vergleichbar, deren Hautpermeabilität größer ist als die des Pferdes. Für die

Benzoesäurepermeation durch die Brustwandhaut kann diese Reihenfolge (Pferd > Hund >

Schwein) bestätigt werden. Bei der Rückenhaut konnte jedoch festgestellt werden, daß die

Hundehaut tendenziell permeabler erscheint als die Pferdehaut; an der Bauchhaut zeigt sich,

daß die Pferdehaut permeabler ist als die Rattenhaut (bzw. Labornager), womit die Reihung

nach MARZULLI et al. (1969) hier nicht bestätigt werden kann.

69

5.2.2 Hydrocortisonpermeation

Die Permeabilität der Rückenhaut für Hydrocortison ist bei der Ratte am größten. Es besteht

ein schwach signifikanter Unterschied zur Rückenhaut des Hundes (p < 0,05) (Abb. 35, 37).

Bei Pferd, Schwein und Rind liegt die Hydrocortisonkonzentration in der Rezeptorflüssigkeit

unterhalb der Nachweisgrenze. Der Grund hierfür ist die sog. „lag“-Phase, die die Zeitspanne

der „Auffüllung“ des Stratum corneum mit einer Substanz bis zur Freisetzung derselben aus

der Hornschicht beschreibt. Für die meisten der hier untersuchten Hautlokalisationen dauert

diese „lag“-Phase 1 – 2 Stunden, erst danach können Hydrocortisonkonzentrationen in der

Rezeptorflüssigkeit nachgewiesen werden. GUY und HADGRAFT (1984) (s. 2.2.2 und 2.4)

zeigen, daß die Halbwertzeit, mit der Hydrocortison aus der galenischen Formulierung in die

Hornschicht freigesetzt wird, mehr als 30 Stunden beträgt. Für die Rückenhaut von Pferd,

Rind und Schwein reicht die Versuchszeit von sechs Stunden daher nicht aus, um

Hydrocortison in der Rezeptorflüssigkeit nachzuweisen, da hier die „lag“-Phase länger als

sechs Stunden anhält.

Im statistischen Vergleich der Hydrocortisonpermeation durch die Bauchhaut ist ein schwach

signifikanter Unterschied (p < 0,005) nur zwischen Ratten- und Schweinhaut erkennbar. Hier

ist die Rattenhaut permeabler als die Schweinehaut. Zwischen den übrigen Bauchhäuten sind

keine signifikanten Unterschiede nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die

Bauchhaut des Pferdes für Hydrocortison sehr viel permeabler zu sein als die Rattenhaut, die

wieder durchlässiger erscheint als die Bauchhäute von Hund, Schwein und Rind, die sich

wiederum nicht voneinander unterscheiden (Abb. 36, 38, 40, 42, 44).

Extrem auffällig ist die Hydrocortisondurchlässigkeit der Haut der Brustwand des Pferdes.

Hier permeieren bis zu 25 % der aufgetragenen Menge, wogegen bei Hund und Rind weniger

als 0,1 % und beim Schwein weniger als 1 % permeieren. Hier bestehen jeweils schwach

signifikante Unterschiede (p < 0,05). Zwischen den Brustwandhäuten von Hund, Schwein und

Rind bestehen keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Dieses soll anhand der

Abbildungen 39, 41, 43 und 45, die bereits im Ergebnisteil dargestellt wurden und an dieser

Stelle exemplarisch für die Hydrocortisonpermeation noch einmal wiederholt werden,

veranschaulicht werden.

70

Abb. 39: Hydrocortisonpermeation durch Abb. 41: Hydrocortisonpermeation durch die Haut der Brustwand des Hundes die Haut der Brustwand des Pferdes

Abb. 43: Hydrocortisonpermeation durch Abb. 45: Hydrocortisonpermeation durch die die Haut der Brustwand des Schweines Haut der Brustwand des Rindes

Bezüglich der Permeabilität für Hydrocortison erschienen der Euterhaut des Rindes unter den

untersuchten Körperregionen die Rücken- und Bauchhaut der Ratte am ähnlichsten (s. Abb.

35, 36, 46).

Der Vergleich der in diesem Abschnitt beschriebenen Ergebnisse mit den Untersuchungen zur

In-vitro-Hautpermeabilität nach MARZULLI et al. (1969) und McCREESH (1965) (s. Tab. 3,

S. 27) zeigt bezüglich der Permeabilität der Rücken- und Bauchhaut keine Übereinstimmung

mit der dargestellten Reihenfolge (Labornager > Pferd > Hund > Schwein). Die Rückenhaut

des Hundes ist für Hydrocortison permeabler als die Pferdehaut und an der Bauchhaut besitzt

die Pferdehaut die größere Durchlässigkeit für Hydrocortison als die Rattenhaut (bzw.

Labornager). Allein die Reihung der Häute der Brustwand bestätigt die Reihenfolge der In-

vitro-Untersuchungen nach MARZULLI et al. (1969).

5.2.3 Testosteronpermeation

Auch für Testosteron ist die Permeabilität der Rückenhaut bei der Ratte am größten. Es

besteht ein schwach signifikanter Unterschied zur Rückenhaut des Hundes (p < 0,05) (Abb.

47, 49). Bei Pferd, Schwein und Rind liegt die Testosteronkonzentration in der

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Rezeptorflüssigkeit, wie auch bei Hydrocortison, unterhalb der Nachweisgrenze. GUY und

HADGRAFT (1984) (s. 2.2.2 und 2.4) zeigen, daß die Halbwertzeit, mit der Testosteron aus

der galenischen Formulierung in die Hornschicht freigesetzt wird, 12 Stunden beträgt. Für die

Rückenhaut von Pferd, Rind und Schwein reicht die Versuchszeit von sechs Stunden daher

auch hier nicht aus, um Testosteron in der Rezeptorflüssigkeit nachzuweisen, da hier die

„lag“-Phase (s.o.) länger als sechs Stunden anhält.

Die Testosteronpermeation durch die Bauchhäute läßt einen schwach signifikanten

Unterschied (p < 0,05) nur zwischen der Ratten- und Hundehaut erkennen. Hier ist die

Rattenhaut permeabler als die Hundehaut. Zwischen den übrigen Bauchhäuten sind keine

signifikanten Unterschiede (p > 0,05) nachweisbar. Tendenziell scheinen jedoch die

Bauchhäute von Pferd und Schwein, wie auch die Rattenhaut, für Testosteron durchlässiger

zu sein als die Hunde- und Rinderhaut (Abb. 48, 50, 52, 54, 56).

Die Haut der Brustwand ist beim Pferd für Testosteron durchlässiger als beim Schwein und

Rind. Hier bestehen jeweils schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05). Zwischen Pferd

und Hund besteht kein signifikanter Unterschied (p > 0,05), tendenziell ist die Haut der

Brustwand des Pferdes jedoch wesentlich permeabler als die Brustwandhaut des Hundes,

welche sich nicht von der Rinderhaut unterscheidet, jedoch etwas permeabler als die

Schweinehaut zu sein scheint. Anhand der Abbildungen 51, 53, 55 und 57, die bereits im

Ergebnisteil dargestellt wurden, soll auf der folgenden Seite die Testosteronpermeation

exemplarisch veranschaulicht werden.

Der Vergleich der Euterhaut des Rindes mit den o.a. Körperregionen bezüglich der

Permeabilität für Testosteron gestaltet sich aufgrund der starken Streuung der Ergebnisse der

Testosteronpermeation durch die Euterhaut eher schwierig. Es deutet sich jedoch an, daß der

Euterhaut die Bauchhaut von Ratte, Pferd und Rind und die Rückenhaut der Ratte am

ähnlichsten ist (s. Abb. 47, 48, 52, 56).

Die erzielten Ergebnisse der Testosteronpermeation durch die Rücken- und Bauchhaut

stimmen mit der dargestellten Reihenfolge (Labornager > Pferd > Hund > Schwein) der

Untersuchungen zur In-vitro-Hautpermeabilität nach MARZULLI et al. (1969) und

McCREESH (1965) (s. Tab. 3, S. 27) nicht überein. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten

Ergebnisse zeigen z. B., daß die Rückenhaut des Hundes für Testosteron permeabler ist als

die Pferdehaut und die Bauchhaut von Ratte, Pferd und Schwein für Testosteron durchlässiger

72

erscheint als die Hundehaut. Wie auch für Benzoesäure und Hydrocortison bestätigt allein die

Reihung der Häute der Brustwand bezüglich der Permeabilität für Testosteron die

Reihenfolge der In-vitro-Untersuchungen nach MARZULLI et al. (1969).

Abb. 51: Testosteronpermeation durch die Abb. 53: Testosteronpermeation durch die Haut der Brustwand des Hundes Haut der Brustwand des Pferdes

Abb. 55: Testosteronpermeation durch die Abb. 57: Testosteronpermeation durch dieHaut der Brustwand des Schweines Haut der Brustwand des Rindes

Insgesamt wird hier deutlich, wie sehr sich die Hauteigenschaften in Abhängigkeit von der

Körperregion unterscheiden. Um einen Vergleich zwischen verschiedenen Spezies

anzustellen, ist es demnach von besonderer Wichtigkeit, für Permeabilitätsuntersuchungen

immer die gleiche Hautlokalisation zu wählen. Die Frage der „Übertragbarkeit“ erzielter

Ergebnisse auf den Menschen kann somit ebenfalls beantwortet werden. Bereits

FELDMANN und MAIBACH (1967) zeigten in In-vivo-Untersuchungen am Menschen

Permeabilitätsunterschiede der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion (s. Tab. 2, S. 18).

Demnach ist es notwendig, sowohl am Menschen als auch am Tier eine bestimmte

Körperregion zu definieren, die für zukünftige Permeabilitätsstudien als „Standardregion“

verwendet werden kann. Die Frage der „Übertragbarkeit auf den Menschen“ muß somit auf

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73

die „Übertragbarkeit auf eine Körperregion des Menschen“ (s. FELDMANN und MAIBACH

(1967)) erweitert werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.

5.3 Vergleich der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und

Hydrocortison

Die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison wurden in der vorliegenden

Arbeit aufgrund ihrer unterschiedlichen pharmakokinetischen Eigenschaften verwendet. Da

sie sich so deutlich voneinander unterscheiden, werden diese Stoffe in vielen Studien der

transdermalen Penetration, Permeation und Resorption als „Modellsubstanzen“ eingesetzt. So

dienten sie auch GUY und HADGRAFT (1984) zur Beschreibung des pharmakokinetischen

Verhaltens von Stoffen mittels eines pharmakokinetischen Modells (s. 2.2.2 und 2.4).

Es soll untersucht werden, ob die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Ergebnisse von

GUY und HADGRAFT (1984) bestätigen. Dabei muß allerdings berücksichtigt werden, daß

bei den in der eigenen Arbeit erzielten Ergebnissen die Werte der Freisetzung aus der

galenischen Formulierung (k1), der Rückverteilung (k3) und der Ausscheidung aus dem Blut

(k4) nicht errechnet werden konnten.

Substanz k1 t50 k2 t50 k3 t50 k4 t50

Benzoesäure 0,184 3,8 2,88 0,2 0,014 49,5 0,592 1,2

Testosteron 0,058 12,0 1,44 0,5 2,70 0,3 0,104 6,7

Hydrocortison 0,022 31,5 1,44 0,5 0,180 3,9 0,158 4,4

1Tab. 6: Geschwindigkeitskonstanten k1-k4 (1/h) (gemäß Abb. 9, S. 13) und Halbwertzeiten t50

(h) (t50 = ln2 / k) für Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison (nach GUY und

HADGRAFT 1984)

1 Tab. 6 = Tab. 4 (S. 33), um Lesbarkeit der Arbeit zu erleichtern

k2 k1 k3

k4


Stratumcorneum


74

Weiter wird das Permeationsverhalten der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und

Hydrocortison durch die Hautlokalisationen der verschiedenen Spezies miteinander

verglichen. Die Ergebnisse der statistischen Berechnungen sind im Anhang in Tabelle 9

aufgeführt.

Beim Vergleich der drei Testsubstanzen fällt auf, daß die Permeabilität aller untersuchten

Hautlokalisationen für Benzoesäure am größten ist. Hier bestehen für die meisten

Hautlokalisationen schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05) sowohl zwischen der

Benzoesäure- und Hydrocortisonpermeation als auch zwischen der Benzoesäure- und

Testosteronpermeation. In wenigen Fällen ergeben sich laut statistischer Berechnung keine

signifikanten Unterschiede (p > 0,05), tendenziell ist jedoch auch in diesen Fällen die

Benzoesäurepermeation wesentlich höher als die Permeation der Steroide.

Die Tatsache, daß die Diffusionsrate von der Haut in die Rezeptorflüssigkeit für Benzoesäure

am größten ist, bestätigt die Geschwindigkeitskonstante (k2 = 2,88) und die daraus errechnete

Halbwertzeit (t50 = 0,2 Stunden) nach GUY und HADGRAFT (1984). Hier erfolgt der

Übertritt von Benzoesäure aus der Haut in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit fast doppelt

so schnell wie der Übertritt der Steroide (t50 = 0,5 Stunden). Nach GUY und HADGRAFT

(1984) erfolgt eine Rückdiffusion der Benzoesäure nur in geringem Maße (k3 = 0,014, t50 =

49,5 Stunden). In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Diffusionsweg zwar nicht untersucht,

jedoch zeigt sich in den Ergebnissen, daß der prozentuelle Anteil der diffundierten

Benzoesäuremenge im Vergleich zu Hydrocortison und Testosteron sehr hoch ist.

Abgesehen vom Pferd (s.u.) ist im statistischen Vergleich der Permeationsraten zwischen

Testosteron und Hydrocortison, außer am Hunderücken, kein signifikanter Unterschied

erkennbar. Die Permeabilität der Haut scheint jedoch, abgesehen von der Rattenhaut, der

Brustwandhaut des Schweines und der Euterhaut des Rindes, für Testosteron tendenziell

höher zu sein als für Hydrocortison. Bezüglich der Permeationsraten für Hydrocortison und

Testosteron stellt das Pferd eine Ausnahme dar. Hier ist die Permeabilität der Haut der

Brustwand für Hydrocortison viel höher als für Testosteron; es besteht ein schwach

signifikanter Unterschied (p < 0,05). Tendenziell verhält es sich an der Bauchhaut des Pferdes

genauso, allerdings ist hier kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) ersichtlich. Zur

Veranschaulichung der Permeationsverhältnisse von Hydrocortison und Testosteron an der

75

Pferdehaut werden die Abbildungen 40, 41, 52 und 53, die bereits im Ergebnisteil dargestellt

wurden, an dieser Stelle noch einmal wiederholt.

Abb. 40: Hydrocortisonpermeation durch die Abb. 52: Testosteronpermeation durch die Bauchhaut des Pferdes Bauchhaut des Pferdes

Abb. 41: Hydrocortisonpermeation durch die Abb. 53: Testosteronpermeation durch die Haut der Brustwand des Pferdes Haut der Brustwand des Pferdes

Nach GUY und HADGRAFT (1984) gibt es bezüglich der Übertrittsgeschwindigkeit von der

Haut in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit für Hydrocortison und Testosteron keinen

Unterschied (k3 = 1,44; t50 = 0,5 Stunden). Läßt man die Parameter k1 und k3 außer Acht, so

bestätigt dieses Schema die Verhältnisse an der Rattenhaut, an der Brustwandhaut des

Schweines und an der Euterhaut des Rindes. So wurde hier zwischen Hydrocortison und

Testosteron weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied festgestellt. An der Hunde- und

Rinderhaut, sowie an der Bauchhaut des Schweines ist die Permeabilität für Testosteron

jedoch tendenziell höher als für Hydrocortison. So wird nach GUY und HADGRAFT (1984)

Hydrocortison aus der galenischen Formulierung viel langsamer (t50 = 31,5 Stunden)

freigesetzt als Testosteron (t50 = 12 Stunden). Dieses führt bei den genannten

Hautlokalisationen während der kurzen Versuchsdauer von sechs Stunden insgesamt zu einer

höheren Testosteronkonzentration in der Rezeptorflüssigkeit.

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76

5.4 Schlußfolgerung

Die Ergebnisse der vorliegenen Arbeit machen insgesamt deutlich, daß die transdermale

Permeation nicht einem starren Schema unterliegt. Für einen Vergleich der Hauteigenschaften

verschiedener Tierarten ist es notwendig, die gleichen Hautlokalisationen zu untersuchen, da

sich teilweise gravierende Permeabilitätsunterschiede ergeben. Weiter sind die

Permeabilitätseigenschaften der Haut bezüglich der Testsubstanzen von großer Bedeutung. So

stellte sich heraus, daß die Pferdehaut im Vergleich zu anderen Spezies wohl eine Ausnahme

bezüglich der Permeation von Steroiden darstellt (s. 5.3). Aufgrund der in dieser Arbeit

erzielten Ergebnisse ist es unter pharmakologischen und toxikologischen Aspekten

notwendig, Untersuchungen zur transdermalen Penetration, Permeation und Resorption an

Hautstellen durchzuführen, an denen die Permeation von Stoffen auch während einer kurzen

Versuchsdauer erfolgt. So wurde in den vorliegenden Untersuchungen z.B. festgestellt, daß

weder Hydrocortison noch Testosteron während einer Versuchsdauer von sechs Stunden

durch die Rückenhäute der Tierarten Pferd, Schwein und Rind in nachweisbarer Menge

permeierte. Diese Hautlokalisation eignet sich demnach weniger für eine Prüfung von

Wirkstoffen.

Die sich bei Betrachtung der Untersuchungsergebnisse immer wieder zeigenden Streuungen

können verschiedene Ursachen haben. Neben genetischer Varianzbreite der ausgewählten

Tiere kommen Alters- und Rasseunterschiede hinzu. Da von den ausgewählten Tierarten nur

eine geringe Anzahl für Versuchszwecke euthanasiert bzw. geschlachtet wird, steht keine

„Standardhaut“ zur Verfügung. Die geringere Streuung der Ergebnisse, die an der Rattenhaut

ermittelt wurden, beruht wahrscheinlich auf den homogenen biologischen Gegebenheiten,

denen die Versuchstiere entstammen (gleiche Rasse, gleiches Alter und Geschlecht).

Wegen des großen Umfangs an Untersuchungsobjekten wurden pro Tierart und

Hautlokalisation jeweils nur vier Proben untersucht (n=4). Bei speziellen Untersuchungen

hinsichtlich der transdermalen Penetration sollte eine höhere Anzahl an Versuchsobjekten

(n>4) gewählt werden.

In der vorliegenden Arbeit konnten tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen

Penetration und Permeation dargestellt werden, die bei pharmakologischen und

toxikologischen Untersuchungen zu berücksichtigen sind.

77

6 Zusammenfassung

Silke Riedel

Vergleichende Untersuchungen zur dermalen Penetration und Permeation in

Diffusionszellen

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen

Penetration und Permeation in einer vergleichenden In-vitro-Untersuchung unter identischen

Bedingungen darzustellen. Es wurde untersucht, ob eine allgemein gültige Reihenfolge für

verschiedene Hautlokalisationen, Tierarten und Untersuchungssubstanzen mit variablen

chemisch-physikalischen Eigenschaften aufgestellt werden kann.

Als In-vitro-Modell mit nicht perfundierter Haut wurden statische Diffusionszellen nach

FRANZ (1975) eingesetzt. Diese Versuchsanordnung erlaubt Aussagen zur dermalen

Penetration und Permeation, nicht jedoch zur Resorption topisch applizierter Substanzen. In

den Versuchen wurde Haut aus den Regionen der seitlichen Brustwand, des Rückens und des

Bauches der Tierarten Ratte, Hund, Pferd, Schwein und Rind untersucht. Rattenhaut stammte

nur aus der Rücken- und Bauchregion. Zusätzlich wurde Euterhaut von der seitlichen

Euterwand gewonnen. Als Testsubstanzen dienten Benzoesäure, Testosteron und

Hydrocortison, die in Ethanol gelöst auf die Hautstücke appliziert wurden. Der Nachweis der

während einer Versuchsdauer von sechs Stunden in die Rezeptorflüssigkeit der Diffusions-

zellen diffundierten Testsubstanzen erfolgte mittels Enzymimmunoassay (Hydrocortison und

Testosteron) und Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Benzoesäure).

Beim Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten konnten regionale

Permeabilitätsunterschiede teilweise nur tendenziell dargestellt werden. Für Pferd, Schwein

und Rind wurde festgestellt, daß bei der Rückenhaut während einer Versuchsdauer von sechs

Stunden sowohl die Hydrocortison- als auch die Testosteronkonzentrationen in der

Rezeptorflüssigkeit unterhalb der Nachweisgrenze lagen.

78

Beim Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen konnte für Benzoesäure,

Hydrocortison und Testosteron eine für die Hautpermeabilität absteigende Reihenfolge Ratte

> Pferd > Hund > Schwein für die Haut der Brustwand aufgestellt werden. Für die Rücken-

bzw. Bauchhaut galt diese Reihenfolge nicht.

Der Vergleich der Permeationsraten von Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron zeigte,

daß die Permeabilität der verschiedenen Häute für Benzoesäure am größten war.

Insgesamt bleibt festzustellen, daß speziesbedingte und regionale Unterschiede der

transdermalen Penetration und Permeation vorliegen, welche bei pharmakologischen und

toxikologischen Untersuchungen zu berücksichtigen sind und eine sorgfältige Standardi-

sierung durchzuführender Versuche erforderlich machen. Basierend auf In-vitro-Studien

erscheinen allgemein gültige prädiktive Aussagen für den Menschen oder andere Spezies zur

transdermalen Penetration und Permeation schwierig.

79

7 Summary

Silke Riedel

Comparative examinations of dermal penetration and permeation with diffusion cells

Object of the present studies was to show differences in transdermal penetration and

permeation. A comparative in vitro examination dependent on species and anatomical sites

was done under identical conditions. It was examined whether it was possible to arrange a

general ranking for different anatomical sites of skin, species and substances with various

chemical and physical characteristics.

Static `Franz´ diffusion cells were used as in vitro model with non perfused skin. These

experiments with diffusion cells allow statements about dermal penetration and permeation,

but not about absorption of topically applied substances. Skin samples of the costal, lumbar

and umbilical region of rats, dogs, horses, pigs and cattle were used in the experiments. Rat

skin was only taken from the lumbar and umbilical region. Additionally, udder skin was taken

from the lateral udder region. Benzoic acid, testosterone and hydrocortisone dissolved in

ethanol were used as test substances and were applied to the skin (400 µg/cm² skin). The

drugs diffused over six hours into the receptor fluid of the diffusion cells. Benzoic acid was

detected via high performance liquid chromatography, while hydrocortisone and testosterone

were measured with enzyme linked immuno assays.

The anatomical sites of the skin of each tested species were compared. Differences in

permeability, dependent on the anatomical site, were shown in tendencies. Using skin samples

of the back from horse, pig and cattle, hydrocortisone and testosterone were not detectable in

the receptor fluid after six hours.

The different species were compared according to their anatomical sites. A decrease in the

rank of the skin permeability could be shown for rat > horse > dog > pig on the costal skin for

each of the tested substances benzoic acid, hydrocortisone and testosterone. This ranking did

not apply to the skin of the lumbar and umbilical region.

80

The comparison of permeation rates of benzoic acid, hydrocortisone and testosterone showed

the skin as most permeable to benzoic acid.

In conclusion, species dependent and regional differences do exist in transdermal penetration

and permeation which must be considered in pharmacological and toxicological studies and

require test standardization. Based on in vitro studies, predictive statements for mankind or

other species concerning transdermal penetration and permeation appear to be difficult.

81

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9 Anhangstabellen

Anhangstabelle 1: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken- undBauchhaut der Ratte (NWG = Nachweisgrenze: Benzoesäure = 1 µg;Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).

Zeit(h)

Ratte Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

Ratte Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG1 2.39 < NWG < NWG 2.12 0.28 0.172 34.88 0.07 0.16 18.33 1.50 1.334 271.89 1.01 2.27 181.41 2.77 2.806 286.96 1.68 2.83 194.19 3.41 3.030 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG1 1.03 < NWG < NWG 8.36 < NWG 0.242 13.50 0.07 0.09 76.95 0.46 1.644 180.63 1.31 1.48 271.21 1.50 3.226 291.02 2.94 2.39 291.24 1.92 3.410 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG1 2.27 < NWG < NWG 5.64 0.10 0.202 13.91 0.15 0.04 26.85 0.63 1.014 207.38 1.13 1.14 265.85 2.80 2.386 256.32 3.87 2.29 271.75 3.00 2.630 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG1 1.55 < NWG 0.07 21.88 0.13 0.772 21.15 0.90 0.93 85.23 1.15 3.004 220.49 1.68 2.67 250.66 2.27 3.516 287.65 3.60 3.03 276.15 2.50 3.68

Anhangstabelle 2: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Hundes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).

Zeit(h)

Hund Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

Hund Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

Hund Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG2 0.26 < NWG 0.05 < NWG < NWG 0.02 < NWG < NWG 0.044 39.09 < NWG 0.66 99.90 < NWG 0.26 105.91 < NWG 0.586 88.84 < NWG 1.66 125.30 < NWG 0.78 350.00 < NWG 1.410 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG 0.02 < NWG 0.21 0.04 < NWG < NWG 0.022 0.71 < NWG 0.11 4.07 1.08 0.22 2.27 < NWG 0.134 103.62 0.21 1.07 21.72 2.23 1.09 132.19 < NWG 1.196 135.33 0.40 1.84 42.46 3.47 1.90 232.34 0.07 1.870 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.04 < NWG < NWG 0.102 0.87 < NWG 0.08 7.28 < NWG 0.17 5.53 < NWG 0.214 50.74 0.07 0.47 151.05 < NWG 1.10 167.94 0.09 0.986 111.27 0.19 1.39 171.97 0.42 1.82 202.28 0.26 2.250 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 1.31 0.03 < NWG < NWG 0.812 0.12 < NWG 0.05 3.61 6.13 0.24 < NWG < NWG 1.324 12.08 < NWG 0.16 183.51 13.68 1.12 49.75 0.06 12.036 50.00 0.06 0.61 203.32 13.98 1.33 133.92 0.07 17.68

100

Anhangstabelle 3: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Pferdes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).

Zeit(h)

Pferd Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron


Hydro-korti-son

Tes-tos-teron


Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 5.17 < NWG 0.06 13.07 < NWG 0.122 < NWG < NWG < NWG 78.85 0.23 0.16 127.27 1.46 2.214 1.25 < NWG < NWG 304.39 2.84 2.41 312.59 22.01 4.906 12.50 < NWG < NWG 386.44 12.69 4.07 391.35 29.58 8.880 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 27.79 < NWG 0.04 13.68 0.74 0.142 < NWG < NWG < NWG 156.72 0.11 0.43 98.60 5.35 1.924 9.69 < NWG < NWG 240.09 1.88 3.04 276.21 48.38 4.626 39.08 < NWG < NWG 366.43 6.33 4.36 374.38 70.83 6.530 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 3.40 < NWG 0.24 26.37 0.12 0.052 < NWG < NWG < NWG 73.52 < NWG 0.26 166.32 2.19 0.924 23.38 < NWG < NWG 233.30 0.46 0.87 363.10 9.48 4.016 75.75 < NWG < NWG 338.45 3.61 2.30 396.65 23.75 4.830 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 1.16 0.73 20.10 0.09 0.462 < NWG < NWG < NWG 24.74 8.06 4.07 161.45 4.74 3.274 8.25 < NWG < NWG 125.15 74.55 6.43 314.73 40.88 6.106 37.07 < NWG < NWG 259.59 146.25 11.43 397.17 97.20 7.95

Anhangstabelle 4: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Schweines (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).

Zeit(h)

Schwein Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron


Hydro-korti-son

Tes-tos-teron


Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 0.10 < NWG 0.05 < NWG < NWG 0.052 < NWG < NWG < NWG 4.13 < NWG 0.26 < NWG < NWG 0.074 11.26 < NWG < NWG 65.77 0.18 1.49 45.14 < NWG 0.176 50.99 < NWG < NWG 113.31 0.20 3.07 122.59 < NWG 0.260 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.05 0.06 < NWG < NWG 0.012 < NWG < NWG < NWG 10.01 0.07 0.38 < NWG < NWG 0.014 9.37 < NWG < NWG 227.72 0.19 3.53 28.91 < NWG 0.026 44.51 < NWG < NWG 245.77 0.20 4.33 124.28 0.06 0.220 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.10 0.12 < NWG 0.08 0.022 < NWG < NWG < NWG 0.11 0.17 0.50 < NWG 0.11 0.024 36.50 < NWG < NWG 12.87 0.29 2.64 37.31 0.22 0.046 72.86 < NWG < NWG 29.43 0.31 3.95 96.32 0.30 0.200 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.30 < NWG < NWG 0.032 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.27 0.38 < NWG 0.09 0.084 31.57 < NWG < NWG 95.01 1.12 0.64 28.38 0.58 0.416 95.80 < NWG < NWG 118.19 1.30 1.23 80.67 2.38 1.21

101

Anhangstabelle 5: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch-, Brustwand- und Euterhaut des Rindes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).

Zeit(h)

Rind Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

Rind Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

Rind Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.11 0.01 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG 3.36 0.26 0.08 < NWG < NWG < NWG4 10.01 < NWG < NWG 11.44 2.02 0.72 12.48 < NWG 0.026 13.26 < NWG < NWG 23.70 4.98 2.12 47.03 < NWG 0.080 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 3.14 < NWG < NWG 3.92 < NWG 0.112 < NWG < NWG < NWG 48.57 1.00 0.06 55.64 < NWG 0.174 4.83 < NWG < NWG 218.58 2.74 0.10 248.64 < NWG 0.296 30.56 < NWG < NWG 282.38 6.09 0.29 379.84 0.05 0.670 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.11 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG 0.95 < NWG 0.16 1.42 < NWG < NWG4 < NWG < NWG < NWG 24.36 < NWG 0.29 50.77 < NWG 0.186 3.57 < NWG < NWG 44.33 < NWG 0.76 140.76 0.21 1.010 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.10 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 2.16 2.48 < NWG 0.034 < NWG < NWG < NWG 37.62 < NWG 13.65 30.85 < NWG 0.546 < NWG < NWG < NWG 126.49 < NWG 22.28 76.61 0.23 1.44

Zeit(h)

Rind Ben-zoe-säure

Hydro-korti-son

Tes-tos-teron

0 Euter 1 < NWG < NWG < NWG1 8.82 < NWG < NWG2 100.21 0.06 < NWG4 251.45 0.87 0.186 271.65 2.70 0.870 Euter 2 < NWG < NWG < NWG1 1.05 < NWG < NWG2 25.37 < NWG 0.054 118.96 0.78 1.666 181.28 4.18 4.090 Euter 3 < NWG < NWG < NWG1 1.25 < NWG < NWG2 17.22 < NWG 0.054 209.08 0.92 0.996 284.72 2.86 2.370 Euter 4 < NWG < NWG < NWG1 7.13 < NWG < NWG2 73.46 0.06 0.354 222.60 2.24 3.996 280.81 4.84 10.38

102

Anhangstabelle 7: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches derKörperregionen von Ratte, Hund, Pferd, Schwein und Rind (*p < 0,05 =schwach signifikant; p < 0,01 = signifikant; p < 0,001 = hoch signifikant).

Tierart VergleichKörperregion

Benzoe-säure

Hydro-kortison

Testos-teron

Ratte Rücken-Bauch 0.686 0.686 0.114Hund Rücken-Bauch 0.486 0.400 0.886

Rücken-Brustwand 0.057 0.886 0.229Bauch-Brustwand 0.200 0.400 0.400

Pferd Rücken-Bauch *0.029 0.057 0.057Rücken-Brustwand *0.029 *0.029 *0.029Bauch-Brustwand 0.057 0.057 0.057

Schwein Rücken-Bauch 0.343 *0.029 *0.029Rücken-Brustwand 0.057 0.114 *0.029Bauch-Brustwand 1.000 0.686 *0.029

Rind Rücken-Bauch 1) 0.057 0.343 *0.029 1) p = 0,114 bei Vernachlässigung von Bauch 2Rücken-Brustwand 2) *0.029 0.114 *0.029 2) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Brustwand 2Bauch-Brustwand 3) 0.486 0.886 0.049 3) p = 0,400 bei Vernachlässigung von Bauch 2 undRücken-Euter *0,029 *0,029 *0,029 Brustwand 2Bauch-Euter 4) 0,200 1,000 0,114 4) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Bauch 2Brustwand-Euter 5) 0,343 *0,029 0,114 5) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Brustwand 2

Anhangstabelle 8: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches derTierarten anhand der Hautlokalisationen Rücken, Bauch, seitliche Brustwandund Euter (*p < 0,05 = schwach signifikant; p < 0,01 = signifikant; p < 0,001= hoch signifikant).

Benzoesäure Hydrocortison TestosteronVergleich

TierartRücken Bauch Brust-

wandRücken Bauch Brust-

wandRücken Bauch Brust-

wandRatte-Hund *0.029 0.057 *0.029 0,629 *0.029 *0.029Ratte-Pferd *0.029 0.200 *0.029 0,057 *0.029 0,629Ratte-Rind *0.029 0.200 *0.029 1.000 *0.029 0,057Ratte-Schwein *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 0.686Hund-Pferd 0.057 *0.029 0.057 0.114 0,100 *0.029 *0.029 0,057 0,343Hund-Rind *0.029 0.886 0.343 0.114 0,857 0.886 *0.029 0,629 0,114Hund-Schwein 0.343 0.686 *0.029 0.114 0,857 0.686 *0.029 0.200 0,057Pferd-Rind 0.114 0.571 0.057 - 0,229 *0.029 - 0,100 *0.029Pferd-Schwein 0.200 *0.029 *0.029 - 0,057 *0.029 - 0,629 *0.029Rind-Schwein *0.029 1.000 1.000 - 1.000 0.486 - 0,114 0.686Euter-Ratte 0.200 0.886 0.686 0.343 0.886 1.000Euter-Hund *0.029 0.057 0.686 *0.029 0,229 *0.029 0.200 0.200 0,400Euter-Pferd *0.029 0.200 *0.029 *0.029 0,229 *0.029 *0.029 1,000 0.343Euter-Rind *0.029 0.200 0.343 *0.029 1.000 *0.029 *0.029 0,114 0.114Euter-Schwein *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 1.000 0.057

Anhangstabelle 9: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches desPermeationsverhaltens der Testsubstanzen Benzoesäure (BS), Hydrocortison(HC) und Testosteron (T) (*p < 0,05 = schwach signifikant; p < 0,01 =signifikant; p < 0,001 = hoch signifikant).

Ratte Hund Pferd SchweinVergleichSubstanz

Rücken Bauch Rücken Bauch Brust-wand

Rücken Bauch Brust-wand


BS - HC *0.029 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029BS - T *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029HC - T 0.486 0.200 *0.029 0,629 0.057 1.000 0.400 *0.029 1.000 0.057 0.886

RindVergleichSubstanz


Euter

BS - HC 0.114 *0.029 *0.029 *0.029BS - T 0.114 0.057 *0.029 *0.029HC - T 1.000 1,000 0.114 0.686

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. M. Kietzmann für die Überlassung dieses Themas sowie

für seine stets freundliche Betreuung und Unterstützung bei der Anfertigung der vorliegenden

Arbeit.

Allen Mitarbeitern und Doktoranden des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie möchte ich für die angenehme Zusammenarbeit und ihre jederzeit freundliche

Hilfestellung danken. Dr. Frank Niedorf danke ich für seine tatkräftige Unterstützung bei

HPLC-Problemen. Dr. Ulrike Seegers möchte ich für die Bereitstellung der histologischen

Schnitte danken.

Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Instituts für Anatomie und des Instituts für Pathologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover und den Mitarbeitern des Zentralen Tierlabors der

Medizinischen Hochschule Hannover für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der

Hautproben.

Mein herzlicher Dank gilt Tanja Wolf für das aufmerksame Korrekturlesen.

Meinem Sohn Joshua danke ich dafür, daß er mich auch in stressigeren Zeiten immer wieder

zum Lachen brachte.

Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, Schwiegereltern und nicht zuletzt meinem

Ehemann. Ohne ihre unendliche Unterstützung wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.

Vergleichende Untersuchungen zur dermalen Penetration und ... · Verzahnungen von Epidermis und...

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