Kursteil D:DNA-Sequenzierung

Bestimmung der Nukleotidsequenz der

cDNA VfNDS-A

Molekularbiologische Arbeitstechniken

WS 2004/05

von Jennifer Wetzel

Gliederung D1: Extraktion der Plasmid-DNA

► Animpfen der Bakterienkulturen► DNA-Gewinnung

D2: Agarose-Gelelektrophorese D3: Sequenzierung der Plasmid-DNA

► Cycle-Sequencing► Reaktionsaufreinigung► Kapillarelektrophorese

D4: DNA-Sequenzauswertung► Vorprozessierung (Basecalling, Vector-clipping)► Assembly

D1: Extraktion von Plasmid-DNA

Animpfen der Bakterienkulturen (unterschiedliche E. coli-Stämme, die alle das selbe Insert tragen > cDNA VfNDS-A)

Gruppe Stamm 1 Stamm 2 Stamm 3 Stamm 4

1 176-1i 176-2i 176-3 176-4i

2 176-81 176-6 176-8i 176-82

3 176-1 176-2i 176-3 176-4i

4 176-81 176-8i 176-6a 176-6b

5 176-1i 176-2i 176-3 176-4i

6 176-6 176-81 176-82 176-8i

► Lysat mittels Puffer3 (sauer) neutralisieren und abzentrifugieren

Plasmid-DNA renaturiert und gelöst, chromosomale DNA und Proteine pelletiert

► Zellen durch Zugabe von Puffer2 (alkalisch) lysieren Denaturierung der chromosomalen und

Plasmid-DNA

► Angezogene Zellen abzentrifugieren und in Puffer1 (RNAse-haltig) resuspendieren

RNA wird hydrolisiert

D1: Extraktion von Plasmid-DNA

DNA-Gewinnung

► Säule mit Elutionspuffer EB (1,4 M NaCl) eluierenPlasmid-DNA wird aus der Säule in Eppi

gewonnen

► Säule mit PE-Puffer (1,2 M NaCl) waschen und zentrifugieren

alle Moleküle < Plasmid-DNA werden ausgewaschen

► Überstand auf QIAprep Spinsäule (Kationenaustauscher) geben und zentrifugieren

gelöste Zellbestandteile ordnen sich ihrer Größe entsprechend an

D1: Extraktion von Plasmid-DNA

D2: Agarose-Gelelektrophorese

Überprüfung der Reinheit und Konzentration der gewonnenen Plasmid-DNA

► Taschenbelegung: - 2 µl Aliquots der extrahierten Plasmide (mit Bromphenolblau angefärbt)

- 5 µl DNA-Ladepuffer

► pro Gel zwei Konzentrationsstandarts bekannter Plasmid-DNA (=Marker)

D2: Agarose-Gelelektrophorese

M1= 50ng-Marker M2= 100ng-Marker M3= 200ng-Marker

St.1 - 4.= E. coli-Stämme 1 bis 4 siehe Tabelle

D3: Sequenzierung der DNA

Cycle-Sequencing

► In PCR-Streifen werden pro Gruppe 8 Ansätze pipettiert - 400 ng Plasmid-DNA - 3 µl Reaktionsmix (Polymerase, dNTPs, Terminatoren) - 1 µl Primer (pro Stamm je einmal M13 universal und M13 reverse) - 1 µl Betain - add 10 µl H2O

► Temperatur-Profil - 60 sec 96°C - 10 sec 96°C - 60 sec 60°C - Lagerung bei 4 -10°C

x 30

Reaktionsaufreinigung

D3: Sequenzierung der DNA

► Entfernen von nicht eingebauten Terminatoren, die DNA-Sequenzierung stören

► Gelfiltration mit Sephadex-G50 - Sephadex auf Mikrotiterplatte mit Wasser quellen - Sequenzierreaktionsprodukte werden aufgetragen und können bei Zentrifugation mit einer zweiten Mikrotiterplatte aufgefangen werden.

Kapillarelektrophorese

D3: Sequenzierung der DNA

► Laseroptik am Ende der Kapillare detektiert die floureszierenden Terminatoren

► Injektion der DNA-Fragmente in die Kapillare - 9 V für 45 sec - DNA wandert ein

► Elektrophorese - 1500 V für 200 min (3,3 h) - DNA-Fragmente werden ihrer Molekulargröße entsprechend aufgetrennt

D4: DNA-Sequenzauswertung

► primäres Basecalling (Herausrechnen der Effekte der Farbstoffe; Qualität der Sequenzierung)

Vorprozessierung

ScoreCard (Basensequenzlänge/Qualität [%])

D4: DNA-Sequenzauswertung

► sekundäres Basecalling (erneute Datenprozessierung, aber mit anderem Programm >objektiver)

Darstellung der Basensequenz mit dem trev.editor

(blaue Balken = Qualitätsangabe)

► Vector-clipping mit VecScreen

D4: DNA-Sequenzauswertung

Vergleich der gewonnenen Datensequenz mit Vektor-Datenbanken in VecScreen

► Probleme: - (teilweise) schlechte Sequenz-Qualität - verwendeter Vektor existiert nicht in Datenbank

D4: DNA-Sequenzauswertung

► manuelles Vector-clipping - Suche nach Enzym-Schnittstellen GAATTC und CACCTC - Vergleich mit Angaben aus VecScreen - Markierung des Vektors

Markierung des Vektorbereichs (rosa)

D4: DNA-Sequenzauswertung

► Template Display der überlappenden Stränge

Contig 1 Contig 2

Assembly mit GAP4 ► nur Basen mit Qualität > 20

D4: DNA-Sequenzauswertung

► Template Display der einzelnen Basen des Contigs

► Parameter: - Grauabstufung: Qualität der Sequenzierung dieser Base (je heller, desto besser) - grüne Markierungen: abweichende und fehlende Basen oder Basen mit Qualität < 20

D4: DNA-Sequenzauswertung Ergebnis:

Nukleotidsequenz der cDNA VfNDS-A

Contig 1:cggcacgaggccaatttatctcatcctcctttcacattgtcaaaatgtctaaacctgtctttcgagaatatattggtgtgaagccagactcaaaaagtttggctgattttccacaaatcacccaaacagaaaccat

Contig 2:aattcggcacgagcactgatataaattccataagaaaaagaaaacaagaacttattatattgatactaagagaagtaattctccacacttttaacataatacaaaaacacatgaaaaatacaatgggtcttatttaatatttaaaggctaatgcatatagagcttatagtctttgatagatgacccatatcacgaaagatttattactgactagatatagccagttagtcatcatttggcgaggagctcttccaagacatgctctactttgaaaggttcatccccattattggagtcattagcgttccagaaaaaaacaccgggtagtgatgaggtttgtttgagttttgtgcagccaccaatgaatatatcccgtgtaattttaatatttatgtggtcaagcgggtcggtgctaaatcctggaaggactttacgaggatggtagtcatttactaccctttcatagatgtctacaaaagcatcatctgtggatacaggatttagttgattgctgaactgataatcaaccaaattgatatagtctgggtttgcattatacaaattcaggtaggaggatgcgttgttttcagatggagcaatggacaccacatggatgtttaggtcacgttcttttttgagttctgttataagttggcctatcaacctaggaaacgcctcatcccatttgatgtgctcataattaatgtcaatgccatcaatcaagttgccgctttcatttttgtatttttgaatgatcagtttgagtgactttacagcgttcgaaacccatacattttgctcagctggatcgaatggagtttcaacgccacgacctccaatgcttattaccacctttacctctggatgttttgttttcaaaattctcactttatctggaccgaagaactcatccttccaagattcctcgaaatttcccgaaccttttctgctttcgttatacttttcagtggcaaagcccaaaatgaagt