Grundlagen der ImmungenetikGrundlagen der Immungenetik

PD Dr. S. ImmenschuhInstitut für Transfusionsmedizin, MHH

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MHC = Major Histocompatibility Complex• umfasst eine Gruppe von Genen, die Proteine codieren, welche für

- die Immunerkennung,

- die Gewebeverträglichkeit (Histokompatibilität) bei Transplantationen,

- die immunologische Individualität wichtig sind

• bei jeder Species unterschiedlich:

- Mensch: HLA - humanes Leukozytenantigen

- Schwein: SLA - Schweine Leukozytenantigen

- Maus: H2

- Ratte: RT

• beim Menschen sind die HLA Gene auf dem

kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.31)

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• Definition und Genetische Organisation der HLA Gene

• Struktur und Funktion des HLA Komplexes

• Typisierung und Nomenklatur von HLA MolekülenPolymorphismus von HLA Molekülen

• Klinische Bedeutung des HLA SystemsMinor Histokompatibilitätsantigene Histokompatibilität und TransplantationMechanismen der Fremderkennung

Humane Leukozyten Antigene - HLA

Das HLA System Das HLA System ––

Definition und Genetische OrganisationDefinition und Genetische Organisation

Die HLA Gene

Diversität von HLA durch Polygenie und Polymorphismus

Polygenie PolymorphismusBeteiligung mehrerer Gene an Auftreten einer Genvariation (Allel)der Ausbildung eines Phänotyps in einer Population

Polygenie und Polymorphismus tragen zur Diversität der HLA-Moleküle eines Individuums bei

Polygenie = mehrere GenorteHLA Klasse I: HLA-A, HLA-B, HLA-CHLA-Klasse II: HLA-DRB1, DQB1

Polymorphismus = allelische VielfaltHLA-A 630 Allele 649 Allele 697 AlleleHLA-B 979 Allele 1029 Allele 1109 AlleleHLA-C 338 Allele 350 Allele 381 AlleleHLA-DRB1 633 Allele 640 Allele 690 AlleleHLA-DQB1 90 Allele 91 Allele 95 Allele

2670 Allele 2759 Allele 2972 AlleleStand 01/2008 Stand 04/2008 Stand 10/2008

+ 302 neue Allele

Das HLA System

Entdeckung neuer HLA Allele seit 1968

Struktur und Biologische Funktion Struktur und Biologische Funktion

des HLA Systemdes HLA System

Expression von HLA Antigenen

-+++Thrombozyten

--Erythrozyten-+Nierenzellen-+Leberzellen

-+++Granulozyten++++++Antigenpräsentierende Zellen (APC)

++++++Makrophagen++++++B-Zellen++++T-Zellen

Klasse IIKlasse I

HLA-Klasse I Expression auf nahezu allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten

HLA-Klasse II Expression ausschließlich auf Zellen des Immunsystems

Struktur von HLA Klasse I und II Molekülen

Antigenpräsentation über HLA Moleküle

HLA Klasse I und II Pathways

Biologische Funktion des HLA-Systems

MHC-RestriktionAntigene werden nicht als frei lösliche Proteine von T Zellen erkannt, sondern nur wenn diese ihnen als Proteinfragmente (= Peptide) durch HLA Moleküle präsentiert werden

• Unterscheidung von „selbst“ und „fremd“

• Schlüssel-Moleküle für die Initiierung der spezifischen (adaptiven) immunologischen Antwort

• Ligand für Natürliche Killerzellen (NK Zellen)

• Reifung der T-Lymphozyten

Zusammenfassung HLA-Klasse I – Moleküle• Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion, Initiierung einer

adaptiven Immunantwort

• Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten (nicht auf Erythrozyten)

• Präsentation der Peptide an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen) - zytotoxische Zellen geben Proteine (Perforine, Granzyme) ab- Membran der Zielzelle wird durchlässig = Tod der infizierten Zelle

HLA-Klasse II – Moleküle • Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur Initiierung einer

adaptiven Immunantwort

• Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen (z.B. DCs, B-Zellen)

• Präsentation der Peptide an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen)- Zytokine, Chemokine werden ausgeschüttet- Immunreaktionen anderer Zellen (B Zellen, T Zellen) wird verstärkt

Polymorphe Regionen

- Die Positionen der allelischen Vielfalt liegen in den Antigen-bindenden Regionen der HLA-Moleküle

- Sie beeinflussen damit direkt deren Bindungsaffinität und indirekt die Antigenerkennung durch T-Lymphozyten

α1- und α2-Domäne β1-Domäne

Interaktion zwischen HLA Molekül und Peptid

J. Klein et al. N Engl J Med 2000; 343: 702-709

Peptide binden über Ankeraminosäuren

an HLA Moleküle (z.B. P2 und P9)

HLA Klasse I

HLA TypisierungsmethodenHLA Typisierungsmethoden

Nachweis von HLA Antigenen und HLA AntikörpernNachweis von HLA Antigenen und HLA Antikörpern

HLA Nomenklatur

Indikationen zur Typisierung von HLA Antigenen und Antikörpern

• TransplantationNieren- und Stammzelltransplantation

• TransfusionNachweis von Antikörpern gegen fremde HLA-Antigene bei polytransfundierten Patienten

• Krankheitsassoziation Morbus Bechterew assoziiert mit HLA-B27

• Forensik

• Abstammungsbegutachtung/Vaterschaftsgutachten

Enstehung von HLA Antikörpern

• Transplantationen

• Transfusionen

• Schwangerschaft

HLA Typisierungsmethoden

• nach dem Verfahren- serologisch

komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest(Mikro-Lymphozytotoxizität nach Terasaki)

- molekularbiologischPCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) PCR-PCR-SSP (sequence-specific primers) basierendSequenzierung (sequencing-based typing, SBT)

• nach Auflösungsgrad - niedrige Auflösung (low resolution) – serologisch, molekularbiologisch

= 2 stellig: HLA-A24

- hoche Auflösung (high resolution) – molekularbiologisch= 4 stellig: HLA-A*2402

Prinzip der Benennung von HLA Allelen

Serologie

Molekularbiologie

R. Waßmuth. Einführung in dasHLA System, 1995

Serologische HLA-Typisierung –Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest

Serologische HLA-Typisierung –Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest

positives Testergebnislysierte Zellen

positives Testergebnislysierte Zellen

negatives Testergebnisintakte Zellen

Nachteile der serologischen Typisierung

Niedrigauflösend (low resolution)

= 2 stellig: HLA-B24

Hohe Fehlerrate (insbesondere HLA-DR > 30%)

HLA Typisierungsmethoden

Molekularbiologische Verfahren

PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides)

PCR-SSP (sequence-specific primers)

Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT)

Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)

EXON GTT

EXON ATT

5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’

167 bp

5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’

Valin (V, GTT)

Isoleucin (I, ATT)

167 bp

5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3’ Extension

5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3’ Extension’

Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)

EXON GTT

EXON ATT

5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’

167 bp

5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’

Valin (V, GTT)

Isoleucin (I, ATT)

167 bp

5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3’ STOPP

5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3’ STOPP

1 2 3 4 5 6 7 8

Kontrollbande (hGH)

spezifisches AmplifikatValin (V, GTT)

spezifisches AmplifikatIsoleucin (I, ATT)

Kontrollbande (hGH)

Proben

V/V V/V V/V V/I V/I V/V V/V V/V

Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)

Ergebnis:

Heterozygot A/G

Molekularbiologische HLA Typisierung

A G A C C C A G C G G C TG

A G A C C C A G C G G C T

SBT (sequencing-based typing)

Homozygot G

Homozygot A

A G A C C C G G C G G C T

Molekularbiologische HLA TypisierungSBT (sequencing-based typing)

Klinische Bedeutung des HLA SystemKlinische Bedeutung des HLA System

Klinische Bedeutung des HLA-Systems

• Transplantationsmedizin- Knochenmark- und Stammzelltransplantation- Nierentransplantation

• Assoziation zwischen HLA-Antigenen und diversen Erkrankungen

• Abstammungsbegutachtung

Mechanismen derFremderkennung

HLAMolekül

T-Zelle

zerstört

Virus-infizierte

Zelle

HLA-vermittelte Interaktion zwischenzytotoxischer T-Zelle und Zielzelle

fremdes HLAMolekül

T-Zelle

zerstört

fremde Zelle

Transplantation

TransplantationssituationKlinische Manifestation: Spender-gegen-Patienten Reaktion

Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD)

Patient

Spender

Die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen endet für die betroffene Zelleimmer tödlich!

A)Direkte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen

Direkte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen

Direkte Fremderkennung von HLA Klasse I: Allo-HLA Klasse I Molekülwird durch zytotoxische T-Lymphozyten des Empfängers erkannt.

A.

B)Indirekte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen

Indirekte Erkennung von Alloantigenen

B.

C)Erkennung von allogenen Peptiden

Peptidantigene werden durch HLA Moleküle präsentiert und vom T Zell-Rezeptor erkannt

C.

Akute Abstoßungsreaktionen kommen sowohl bei MHC-differenter als auch -identischer Transplantation vor.

Akute Abstoßung: MHC und Peptide

MHCa MHCa MHCa

MHCa MHCaMHCb

IsotransplantatAllogene MHC-differenteTransplantation

Allogene MHC-identischeTransplantation

Toleranz schnelle Abstossung langsame Abstossung

0 60 120 0 60 120 0 60 120

Transplantatüberlebensdauer ->

0%

50%

100%

Anz

ahlv

itale

rTr

ansp

lant

ate

Minor HistokompatibilitätsantigeneMinor Histokompatibilitätsantigene

Erkennung von allogenen Peptiden

Minor Histokompatibilitätsantigene sind Peptide, die von polymorphen zellulären Proteinen abstammen.

HLA mismatches versus graft survival

Days after Transplant0 20 40 60 80 100

Prob

abili

ty1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

HLA Mismatch: 3 Loci

HLA Genotypic Match

2 Loci

0 Locus

1 Locus

? HLAeffect

non HLAeffect

HLAeffect

Stammzelltransplantation

Funktionelle Kriterien für mHags

• Peptide aus polymorphen Regionen endogener Proteine

• werden durch alloreaktive T Zellen erkannt

• verursachen GvH-and GvL-Reaktionen

Strukturelle Kriterien für mHags

• relevante Phänotyp-Frequenzen mit niedrigem Polymorphismus(meist 2 Allele)

• Segregation unabhängig von HLA

• definiertes Expressions-Profil- Zellen von Haut, Leber und/oder Darm GvHD- hämatopoetischen Zellen und/oder Stammzellen GvL Reaktion

Minor Histokompatibilitätsantigene (mHags)

PEPTIDE

Graft-versus-Leukemia oder Graft-versus-Host Reaktion

GvLGvHD

NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 4 | MAY 2004 | 373

T-cellT-cell

Allogene Inkompatibilitäten

Minor HistokompatibilitätsAntigene

HLA Klasse IMolekül

Intrazelluläres polymorphes Protein

MHC non-MHC D/R relation Clinical situation Incompatibility

identical identical syngen Identical Twins none

identical different allogen RD, URD minor

different different allogen RD, URD major + minor

D/R relation Donor/Recipient relationRD Related DonorURD Unrelated Donor

Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression

A1/HY HLA-A1 DFFRY (USP9Y) broadA2/HY HLA-A2 SMCY broadA33/HY HLA-A33 TMSB4Y broadB52/HY HLA-B52 RPS4Y1 restrictedB60/HY HLA-B60 UTY broadB7/HY HLA-B7 SMCY broadB8/HY HLA-B8 UTY restrictedDQ5/HY HLA-DRB1*05 D0X3Y (DBY) broadDRB1*1501/HY HLA-DRB1*1501 D0X3Y (DBY) broadDRB1*0301/HY HLA-DRB1*0301 RPS4Y1 broad

Y-chromosomal kodierte mHags

Minor Histokompatibilitätsantigene

Autosomal-kodierte Minor Histokompatibilitätsantigene

Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression

HA-1 HLA-A2/B60 HA-1/KIAA*0223 restrictedHA-2 HLA-A2 Myosin 1G restrictedHA-3 HLA-A1 LBC Oncogene broadHA-8 HLA-A2 KIAA0020 broadHB-1 HLA-B44 unknown restrictedACC-1 HLA-A24 BCL2A1 restrictedACC-2 HLA-B44 BCL2A1 restrictedUGT2B17 HLA-A29 UGT2B17 restrictedLRH-1 HLA-B7 P2X5 restricted

Minor Histokompatibilitätsantigene

Expression in hämatopoetischen Zellen

zwei allelische Varianten des Peptides

HA-1H V-L-H-D-D-L-L-E-A

HA-1R V-L-R-D-D-L-L-E-A Null-Allel

Präsentation durch HLA-A*0201 Moleküle

Erkennung durch alloreaktive CD8+ zytotoxische T Zellen

Mismatching für HA-1H ist assoziert mit dem Auftreten der GvL-Reaktion

Minor Histokompatibilitätsantigen HA-1

Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitätenin HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren

http://www.lumc.nl/5033/dbminor/

Vorhersage von Inkompatibilitäten für Minor Histokompatibilitätsantigene

http://www.lumc.nl/5033/dbminor/

Spender EmpfängerHA-1H/H = HA-1H/R

keine Reaktion

Spender EmpfängerHA-1H/H HA-1R/R

Host-versus-Graft Reaktion(Transplantatabstoßung)

Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren

Spender Empfänger

HA-1R/R HA-1H/H

Graft-versus-Leukämie Reaktion

http://www.lumc.nl/5033/dbminor/

Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren

Abstoßung Immuntherapie

Balance zwischen GvHD und GvLReaktion

GvLT Zellen gegen

GvL-assozierte mHags

GvHDT Zellen gegen

GvHD-assozierte mHags

HA-1 and HA-2 specific CTLs are able to induce complete remission in case of relapse

Marijt et al., 2003

■ CD8+/HA-2-specific T cells

♦ CD8+/HA-1-specific T cells

white blood cell count