Post on 16-Aug-2019
Biophysik der Moleküle!
7. Vorlesung Rädler WS 2010!
11. Nov. 2010!
Forced unfolding!- bond rupture!-! unfolding of BR!
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 2!
Å Positioning Precision => AFM!
pN Force Resolution => Handling Molecules!
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 3!
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 4!
Rief, Gautel, Oesterhelt, Fernandez, Gaub, !Science 1997, 276, 1109-1112. "
Oesterhelt,Oesterhelt, Pfeiffer, Engel, Gaub, Müller, !Science 2000, 288, 143-146."
Unfolding Proteins"
Unbinding Ligands"
Moy, Florin, Gaub, !Science (1994),Vol 266 , p 257-"
H. Grubmüller, et al., "Science (1995),Vol 271 , p 997-"
AFM experiments with single molecules!
custom-built instrument (M. Rief, H. Gaub et al., Science 275, 1295 (1997)):"
intermolecular forces"
(binding interactions)"
intramolecular forces"
(polymer elasticity)"
Deflection"
Piezopath"
Extension [nm]"
400"300"200"100"0"
600"
-400"
-200"
0"
200"
400"
Fo
rce [
pN
]"
AFM principle and measuring the binding strength of individual ligand-receptor pair!
H.L. Florin, H. Gaub et al., "
Science 264, 415 (1994)"
0" 200" 400" 600" 800" 1000"
adhesion force quantized !in integer multiples of ~160 pN!
commercial instrument designed for!high resolution imaging:!
Precision: position accuracy ~ 0.1 nm!
Sensitivity: measuring forces < 10 pN!
biotin"
avidin!
agarose bead"
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DDD
laser!diode"
lense"
sample"
x-y-z-!piezo!
tube"
cantilever with!integrated tip"
segmented!photodiode!
Principle of the biomembrane force probe (BFP)!(taken from R. Merkel, Physics Reports 346, 343 (2001)"
Merkel et al., Nature 397, 50 (1999)"
Biotin-streptavidin bond strength measured by BFP!
R. Merkel et al., Nature 397, 50 (1999)"
External force along the molecular coordinate, x "adds a mechanical potential to the energy landsscape"
inner barrier dominates !when outer barrier falls !below kBT !
sharp barriers (transition states) change little"
in shape or location under force, while"shallow barriers may completely vanish"
Probing potential landscapes by dynamic force spectroscopy"
Single molecule force spectroscopy: Experimental techniques!
Investigation of individual molecules:!
" " "- study of molecular processes with better resolution"" " "- ensemble averaging is removed"" " "- detailed information on distribution of physical observables"
Desorption einzelner Polymerketten von festen Substraten!
Kra
ft!
Länge!
s
koff
<< F
'Kra
ft!
Länge!
koff
>> F
s
Bindungsstellen !
zwischen Polymer !
und Substrat
koff
kon
F
L
L
s
Fu
Fu
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 12!
!G(0)"
!x"
Kräfte und chemische Bindungen I"
Chemisches Gleichgewicht"
S1! " # S
2
S1 und S2 seien beispielsweise 2 verschiedene Konformationen eines Proteins."
S2[ ]S1[ ]= e
!"G
kT = const =:Keq Gleichgewichtskonstante"
G = H ! TS freie Enthalpie"
S1"
S2"
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 13!
!G(0)"
!x"
Eine Kraft „kippt“ die Potentiallandschaft"
!G(F) " !G(0)# F!x
S2[ ]S1[ ](F) = Keq(F) = e
!"G!F"x
kT
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 14!
Chemische Bindungen unter Kraft II: Nichtgleichgewicht"
Beispiel: Das Rezeptor-Ligand System Biotin-Avidin "
BA! A+ B
Die Polymeranker verhindern eine mögliche Rückbindung"
koff(F)"
kon=0"
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 15!
!Ga*(F=0)"
koff = k0e!"Ga
*
kTArrhenius" k0=!
"#$
%
&Ga
*
kTKramers:"
Das Potential wird als Parabel mit Federkonstante " genähert. Es ist intuitiv klar, daß die Zeit, die der Ligand benötigt, um dieses Potential zu durchqueren #/" sein muß (gedämpfter Oszillator)."
!Ga
*
: Freie Aktivierungsenthalpie"
koff"
!xa
koff(F) = k0e!"Ga
* !F #"xa
kTKraftabhängigkeit der Raten:"
!Ga*(F)"
koff(F)"
Kraftabhängigkeit der Raten"
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 16!
dnBA = !koff " nBA " dt
dPZ = 1! PZ( ) " koff ( t) " dt
dPZ = PÜ ! koff( t) ! dt
PZ(T )= 1! e! koff ( t ) "dt0
T
#
PZ(F)= 1! e!
1
vP "kCkoff ( f ) "df
0
F
#
dPZ
dF(F)=
1
vP ! kC! koff (F) ! e
"1
vP !kC! koff ( f ) !df0
F
#
dPZ: Wahrscheinlichkeit, daß die Bindung innerhalb des Zeitintervalls dt bricht."
PZ: Wahrscheinlichkeit, daß die Bindung bis zum Zeitpunkt t gebrochen ist."
dN = !" # N # dt
analog zum Kernzerfall"
Pü: Wahrscheinlichkeit, daß die Bindung bis zum Zeitpunkt t überlebt." PÜ =1! PZ
: Wahrscheinlichkeitsdichte für einen Bindungsbruch. "dP
Z
dF(F)
dPZ
dF(F) ! "F
gibt die Wahrscheinlichkeit an, daß die Bindung innerhalb des Kraftintervalls !F aufbricht. "
f( t) = vP ! kC ! tmit:"
Federkonst."Ziehgeschw."
Bindungsbruch als statistischer Prozeß"
BA! A+ Bkoff(F)"
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 17!
dPZ
dF(F)=
k0
vP! k
C
! e
"#G* "F !#x
a( )kBT
"1
vP!kC
!kBT !k0
#xa
e
"#G*" F! #x
a
$ % &
' ( )
kBT "e
"#G*
kBT
*
+
, , , ,
-
.
/ / / /
dPZ
dF(F)=
1
vP ! kC! koff (F) ! e
"1
vP !kC! koff ( f ) !df0
F
#
koff(F) = k0 ! e"#G* "F !#xa( )
kBTmit:"
Maximum der Wahrscheinlichkeitsdichte ergibt die wahrscheinlichste Abrißkraft FA"
FA
=kT
!xa
" ln!x
a" k
c
#0" kT
$
% & &
'
( ) ) +kT
!xa
" ln vP[ ]
k0!
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 18!
!"x=3Å"
300"
250"
200"
150"
100"
50"
0"
10"-12"
10"-11"
10"-10"
10"-9"
10"-8"
10"-7"
10"-6"
10"-5"
1/30000 s"1/3000 s"1/300 s"1/30 s"
1/300000 s"
Forc
e [pN
]"
Pulling Speed" [m/s]"
FA
=kT
! ln! k
c
! kT
"
#
$ $ $
%
&
' ' ' +kT
! ln vP[ ]
!"0"!"xa" !"xa
"
!"xa"
Über geschwindigkeitsabhängige Bindungskraftmessungen kann Information über die Potentiallandschaft (!xa) gewonnen werden."
k0!
Pulling Speed" [m/s]"
=1/30000 s"600"
500"
400"
300"
200"
100"
0"
10"-13"
10"-12"
10"-11"
10"-10"
10"-9"
10"-8"
10"-7"
10"-6"
1Å"
2Å"
3Å"4Å"5Å"
Forc
e [pN
]"
k0!
Gaub/SS 2005! BPM §1.5.2! 19!
Schlußfolgerungen"
1. Bindungsbrüche sind thermisch aktivierte statistische Prozesse und haben dementsprechend keinen scharfen Wert sondern eine charakteristische Verteilung"
2. Die Bruchkräfte hängen von der Geschwindigkeit ab, mit der ein Experiment durchgeführt wird."
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 20!
Fillip Oesterhelt"Max Kessler"Daniel Müller "Biozentrum Basel"Andreas Engel "Biozentrum Basel ""Dieter Oesterhelt "MPI Martinsried"
Unfolding Bacteriorhodopsin !
Science 2000, !Vol. 288, 143!
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 21!
Localizing and Manipulating Individual Bactriorhodopsins "in a Purple Membrane"
Oesterhelt, F.; Oesterhelt, D.; Pfeiffer, M.; Engel, A.; Gaub, H. E.; Müller, D. J. Science 2000, 288, 143-!
Forc
e / p
N
100
200
0
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 22!80"60"40"20"0"
Extension / nm"
Single Molecule BR- Unfolding Traces"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 23!
Ensemble Averaged Unfolding Trace"
150"
100"
50"
0"
100"80"60"40"20"0"
Unfo
ldin
g F
orc
e / p
N"
Extension / nm"
< F(x) > = 1/N"$"F (x) "n" n"
#" Fds $ 5 10 J"-17"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 24!
Unfolding frequently occurs pair wise"
Sequential unfolding of !
BR-helics"
Rate dependence of the force"
%!Potential width"
%!Spontaneous transition rate"
Peak position"
%!Unfolding barriers"
BR- Unfolding Traces Sorted by Length"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 25!
Unfolding from the cytoplasmic side"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 26!
Unfolding from the cytoplasmic side"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 27!
Cytoplasmic ! - !Extracellular!Side!
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 28!
Unfolding from the extracellular side"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 29!
Unfolding from the extracellular side"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 30!
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
vert
ical posit
ion in t
he m
em
bra
ne [
nm
]
250200150100500
amino acid number
BA C D E F G
extracellular side
cytoplasmic side
thryptophane proline cytoplasmic peak extracellular peak
50 pN
100 pN
150 pN
200 pN
250 pN
Current Map of the BR- Unfolding Barriers "
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 31!
Ratedependence !provides !potential width"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 32!
Refolding of Helices E and D"
1st unfolding of Helices E and D."
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 33!
Refolding of Helices E and D"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 34!
Refolding of Helices E and D"
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 35!
Forced"unfolding"
Thermal "unfolding"
Binding potential in"conformation "space"
Thermal versus Forced Unfolding"
-(!G +!G - " F(x)dx)/kT
Forced off rate:
k = k eth p
F o
*
p# k eoff
th
k = k ! e F!x / kT
off
th
pF
-(!G - F!x) / kT)" k eoff
th
Gaub/SS 2005! BPM §1.3.2! 36!
Rational:"Folding of complex proteins is difficult to study in"conventional experiments (slow folding, aggregation)."
230 amino acid residues"
Folding rate kf= 10-2-10-3 s-1"
Unfolding rate ku= 10-9 s-1"
!
"G = kBT # lnku
k f= $16 # kBT
Exploring the energy landscape of GFP by single-molecule "mechanical experiments"
H. Dietz & M. Rief 2004 PNAS 101, 16192-"