Post on 06-Apr-2015
Die Bedeutung der Defensinein der perioperativen Medizin
Malte Book, Frank Stüber
Klinik und Poliklinikfür Anästhesiologie und Schmerztherapie
Inselspital, Bern
Eine Sepsis liegt dann vor, wenn sich innerhalb
des Körpers ein Herd gebildet hat, von dem
kontinuierlich oder periodisch pathogene
Bakterien in den Kreislauf gelangen und zwar
derart, daß durch diese Invasion subjektive und
objektive Krankheitserscheinungen ausgelöst
werden
Schottmüller H. Verhandl dt Kongress Inn Med 1914; 31:257-80
Sepsis ist die Gesamtheit der lebensbedrohlichen
klinischen Krankheitserscheinungen und
pathophysiologischen Veränderungen als Reaktion
auf die Aktion pathogener Keime und ihrer
Produkte, die aus einem Infektionsherd in den
Blutstrom eindringen, die großen biologischen
Kaskadensysteme und spezielle Zellsysteme
aktivieren und die Bildung und Freisetzung
humoraler und zellulärer Mediatoren auslösen.
Schuster HP und Müller-Werdan U: Definition und Diagnose von Sepsis
und Multiorganversagen in Sepsis und MODS, Springer Berlin
Heidelberg (2005)
SIRS nach Trauma
Hoover L, Bochicchio GV, Napolitano LM, Joshi M, Bochicchio K, Meyer W, Scalea TMJ Trauma. 2006 Aug;61(2):310-6
N: 1277 Trauma Patienten, 91% zeigen systemische Inflammation
ISS Mittelwert: 18
Infektion nach SIRS
Hoover L, Bochicchio GV, Napolitano LM, Joshi M, Bochicchio K, Meyer W, Scalea TMJ Trauma. 2006 Aug;61(2):310-6
580 (45%) der Patienten hatten mindestens eine nosokomiale Infektion
Inzidenz: 3 von 1.000 Menschen/Jahr
2 von 100 Krankenhauspatienten/Jahr
715.000 Patienten/Jahr
Letalität: 29%
mehr Tote als durch akuten Myokardinfarkt
Kosten: 17.000.000.000 US$/Jahr
Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310
Herausforderung des Gesundheitssystems
• Körpertemperatur >38 °C oder <36 °C
• Tachykardie: Herzfrequenz >90/min
• Tachypnoe: Atemfrequenz >20 oder Hyperventilation (PaCO2
<4.3 kPa bzw. 33 mmHg)
• Leukozytose (>12.000 weiße Blutkörperchen/mm3) oder
Leukopenie (<4000/mm3) oder >10 % unreife neutrophile
Granulozyten im Differentialblutbild
Sepsis
Entzündung
SIRS Kriterien+
American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsisand organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis (1992) Crit Care Med
2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference Crit Care Med (2003) Vol. 31, No. 4
Zeichen der systemischen Inflammationals Antwort auf eine Infektion
[….] these terms do not allow precise
characterization and staging of patients
with this condition.
2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference Crit Care Med (2003) Vol. 31, No. 4
Limitationen
PIROPIRO
P redisposition
I nfection
R esponse
O rgan dysfunction
Zwillingsuntersuchungen bei Volkskrankheiten
Konkordanzraten
MZ DZ
Diabetes mellitus Typ 2 0,80 0,35
Herzinfarkt (Frauen) 0,44 0,14
Herzinfarkt (Männer) 0,39 0,26
Prostata-Karzinom 0,27 0,07
Epilepsie (idiopathische) 0,69 0,14
Multiple Sklerose 0,28 0,03
Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte 0,38 0,08
Schizophrenie 0,50 0,12
Manische Depression 0,60 0,10
Tuberkulose 0,37 0,15
Warum können einige kritisch kranke Patienten der Keim
beladenen Umwelt widerstehen
während
Andere infektiologische Komplikationen entwickeln?
Warum können einige kritisch kranke Patienten der Keim
beladenen Umwelt widerstehen
während
Andere infektiologische Komplikationen entwickeln?
Hypothese
Die Funktion des Innaten Immunsystems
wir durch genetische Varianten moduliert
Genom Mutationen
Chromosomen Mutation
Deletion Insertion Inversion
Tandem Repeats
ATGGCAGG AAACGGCT
1 – 6 bp, 10 – 100 x wiederholt
ATGGCAGG AAACGGCT
6 – 100 bp, bis 20 kb Länge
ATGGCAGG AAACGGCT
Mindestens 100 bp, mehrere Megabasen Länge
Mikrosatelliten
Minisatelliten
Satelliten
Single Nucleotide Polymorphisms
• Frequenz ca. 1/1000 Bp
• ca. 10.000.000 SNPs/Individuum
Gene Polymorphism(rs number)
Location (functionalRelevance)
AlleleFrequency %
Disease association
TLR1 A→Grs5743551
-7202Essential splice site
7.5 Allele G caused higher NF-kB activation and higher cell surface TLR1 expression. In sepsis patients predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al. (2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]
TLR2 G→Ars5743708
Exon(753 Arg→Gln)
1.5 Heterozygous patients showed elevated TNF and decreased IFN- and IL-8 blood concentrations in response to candida sepsis [Woehrle et al. (2008) Cytokine 41(3):322-329]
G→Ars5743708
Exon(753 Arg→Gln)
1.5 Heterozygous patients with inflammatory bowel diseases showed increased risk for pancolitis [Pierik et al. (2006) Inflamm Bowel Dis 12(1):1-8]
A→Grs1898830
Intron 35 Allele is associated with increased shedding and lesional rates in patients with genital Herpes Simplex virus typ 2 infections
TLR4 A→Grs4986790
Exon(299 Asp→Gly)
3 Interruption of TLR4 mediated LPS signalling [Arbour et al (2000) Nat Genet 25(2):187-191]
LBP T→Crs2232571
CAAT box 11 Association with gram negative bacteremia related mortality after hematopoietic cell transplantation [Chien et al (2008) Blood 111(4):2462-2469]
IL-6 G→Crs1800795
Promoter-174
40 Decreased gene transcription after LPS stimulation [Fishman et al (1998) J Clin Invest 102(7):1369-1376]
TNF G→Ars 1800629
Promoter-308
21 Increase in transcriptional activity following LPS stimulation [Wilson et al (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):3195-3199]. Association with death from meningococcal disease [Nadel et al (1996) J Infect Dis 174(4):878-880]. Increased susceptibility to septic shock and associated with death due to septic shock [Mira et al (1999). JAMA 282(6):561-568]
G→Ars361525
Promoter-238
7.4 Development of pneumonia in systemic lupus erythematosus is associated with allele A [Kinder et al (2007). Arthritis Rheum 56(8):2679-2686]
IRAK 1 C→Trs1059703
Exon 12(532 Ser→Leu)
18 Increased incidence of shock in septic patients [Arcaroli et al (2006) Am J Respir Crit Care Med 173(12):1335-1341]
MIF C→Grs755622
Promoter-173
16 Increased MIF plasma levels in patients post CABG surgery [Lehmann et al (2006) Eur J Cardiothorac Surg 30(1):59-63]
eNOS G→Trs1799983
Exon 8(Glu→Asp)
34.2 Risk factor for hypotension in patients with E. coli bacteremia [Huttunen et al (2008) Shock]
TLR1 A→G
rs5743551
Allele G caused higher NF-kB activation and higher
cell surface TLR1 expression. In sepsis patients
predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al.
(2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]
TNF G→A
rs 1800629
Promoter
-308
Allele TNF2 showed increased
susceptibility to septic shock and
associated with death due to septic
shock [Mira et al (1999). JAMA
282(6):561-568]
Kandidatengene (SNPs)
Gen ROT
Gen GRÜN
Gen BLAU
Copy Number Variation (CNV)
homologe Chromosomen
(2 Gen Kopien pro diploidem
Chromosomensatz)
Redon et al. Nature. 2006 Nov 23;444(7118):444-54
A total of 1,447 copy number variable regions (CNVRs), which can encompass overlapping or adjacent gains or losses, covering 360 megabases (12% of the genome) were identified in these populations.
Copy number variations
Richard Redon et al. Nature 444, 444-454 (23 November 2006)
Innate Immunität
• Angeboren
• Unterscheidung selbst/fremd
durch molekulare Muster
• Sehr schnell, bzw. sofort einsatzbereit
• In der Evolution konserviert
•Protein Barrieren
- Komplement
- Lysozym
- Defensine
Innate Immunität
•Physikalische Barrieren
- Epidermis
- Mucosa
•Zelluläre Barrieren
- Neutrophile
- Makrophagen
- NK-Zellen
Rezeptoren/Mediatoren-TLRs-TNF
-Interleukine
Over the past several years my laboratory has utilized the Xenopus laevis oocyte system to study RNA expression in eukaryotes (1-5). Ovaries used in these studies were removed surgically from anesthetized adult females. Incisions were made through both the skin and the nonadherent muscular layer of the abdomen into the peritoneum. After removal of the ovaries, the muscular wall and the skin were separately repaired with sutures. Despite the nonsterile surgical procedure and the microbially contaminated water-filled tanks to which the animals were returned immediately after surgery, it was extremely rare for these surgical wounds to develop infection. Indeed, sutures dissolved after several weeks, and normal healing of the scar almost always occurred. Infections were not seen on the cut margins of the wound, at the sites of suture placement, or within the communicating subdermal space or peritoneum. Healing occurred with little gross evidence of inflammation or cellular reaction at the wound sites. The absence of infection under these conditions was medically remarkable.
Zasloff M. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Aug;84(15):5449-53
Antimicrobial Peptides
• Defensin, Cathelicidin, Hepcidin
• 15-45 Aminosäuren lang
• Positiv geladen
• In der Evolution hoch-konservierte Gene
• Vorkommen in vielen Geweben
• Antimikrobielle Wirkung gegen Bakterien,
Pilze und Viren
• Beta–Defensine 2, 3 und 4 mit sehr hoher
antimikrobieller Aktivität
• Immunmodulatorische Wirkung
Defensine
Alpha (Helix) Beta (Faltblatt)
Gene 11 (Pseudogene) 49 (Pseudogene)
Expression meist konstitutiv meist induzierbar
Vorkommen Neutrophile, T-
Zellen, NK-Zellen,
GIT, Knochenmark
epitheliale Organe,
monozytäre Zellen,
Testis
-Defensine: Effektormoleküle der Innaten Immunität
• Milner SM et al Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds
Burns. 1999 Aug;25(5):411-3
• Book M, Stuber F et al. Inducibility of the endogenous antibiotic peptide beta-defensin
2 is impaired in patients with severe sepsis. Crit Care. 2007;11(1):R19
• Chen QX et al Genomic variations within DEFB1 are associated with the susceptibility
to and the fatal outcome of severe sepsis in Chinese Han population. Genes Immun
2007 Jul;8(5):439-43
• Kota S et al. Role of human beta-defensin-2 during tumor necrosis factor-alpha/NF-
kappaB-mediated innate antiviral response against human respiratory syncytial virus. J
Biol Chem. 2008 Aug 15;283(33):22417-29
• Soto E et al. Human beta-defensin-2: a natural antimicrobial peptide present in
amniotic fluid participates in the host response to microbial invasion of the amniotic
cavity. J Matern Fetal Neonatal Med. 2007 Jan;20(1):15-22
critic
ally i
ll
healt
hy co
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ls
Sever
e se
psis
0
2
4
6
10
20
30
40
50
60
70
80
Nornalized Ratio ofhBD2 mRNA expression
*
* p<0.05, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparison test
Book M, Chen Q, Stuber F Crit Care. 2007 Feb 15;11(1)
Leukozytäre Defensin-2 Induzierbarkeit inPatienten mit schwerer Sepsis verringert
healt
hy co
ntro
ls
critic
ally i
ll non
-sep
tic
surv
ivor s
. s.
nons
urviv
or s.
s.0
500
1000
15003000
5000
pg/ml hBD2 plasma level
Defensin-2 Plasmaspiegel inPatienten mit schwerer Sepsis erhöht
Book M, Chen Q, Stuber F Crit Care. 2007 Feb 15;11(1)
* p<0.05, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparison test
**
Exon 1
CAATTATA
-72T/C-233G/C-876C/T-992G/A
NF-B NF-IL-6AP-1
4 Varianten (SNPs) im
hBD2 Gene Promotor
hBD2 Promotor Aktivität: Effekt der SNPs
0
5
10
15
• Wildtype and variant indicate no significant differences in inducible promoter activity
Endotoxin response
Chromosomale Duplikation auf Chromosom 8
Hollox et al. Am J Hum Genet. 2003 Sep;73(3):591-600
DEFB103
DEFB4 DEFB4
DEFB103
SPAG11 SPAG11
DEFB104 DEFB104
DEFB106 DEFB106
DEFB105 DEFB105
DEFB107 DEFB107
7250k 7350k 7700k 7800k
Beta Defensin Copy Number Variation
CYP2D6 Gen Kopie Anzahl Variation
CYP2D6 Gen Kopie Anzahl Variation beeinflusst den antiemetischen Effekt und die Plasma Spiegel von Topisetron
Kaiser et al. J Clin Oncol. 2002 Jun 15;20(12):2805-11
Anzahl der CYP2D6 Gene
To
pis
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on
Se
rum
Ko
nze
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atio
n,
µg
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Ep
iso
de
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Erb
rech
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s (M
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n)
Relative DNA Gen Kopie Anzahl Quantifizierung mit PCR
Referenz Gen Ziel Gen
Prinzip
• Ein Kalibrator mit je 2 Kopien Referenz- und Ziel-Gen läuft in jedem Lauf
• Relative Ratio von Ziel- zu Referenz-Gen wird durch den „crossing point“ berechnet
• PCR Effizienz korrigierte Quantifizierung
• Ziel-/Referenz-Gen Ratio von jeder Probe wird geteilt durch Ziel-/Referenz-Gen Ratio des Kalibrators
Effizienz Berechnung
Slope: -3,609E=10(-1/slope)=1.8927
Slope: -3,575E=10(-1/slope)=1.9042
Quantifizierung der Defensin CNPs
Chen Q, Book M, Stuber F J Immunol Methods. 2006 Jan 20;308(1-2):231-40
Proben Quantifizierung
Quantifizierung der Defensin CNPs
Chen Q, Book M, Stuber F J Immunol Methods. 2006 Jan 20;308(1-2):231-40
Funktionelle Bedeutung der hBD2 CNVs
1 2 3 4 5 61.5
2.5
3.5
4.5
Gen Kopien
rela
tive
hBD
2 m
RN
A M
enge
R2 0,8149, p < 0,05 R2=0,9643, p < 0,05
1 2 3 4 5 60
200
400
600
800
Gen KopienhB
D2
Pro
tein
(pg
/ml)
Ausblick Defensin CNVs• Assoziation mit Inflammation, Infektion, Sepsis bei
kritisch kranken perioperativen Patienten?
• Quantitative Modulation der Genexpression bei unterschiedlichen
Patienten (z.B. HLM OP, Blood Stream Infection, Peritonitis, Pneumonie)?
• Quantitative Modulation der Proteinspiegel?
• Zuordnung zu SNP und CNV Haplotypen?
Hiratsuka et al.Thorax. 2003 May;58(5):425-30
Gen Kopie Anzahl Polymorphismus
Wildtyp
Homozygoter Wildtyp mit 2 Gen Kopien
Homozygote Variante
Mutation
Heterozygote Variante
TLR1 A→Grs5743551
Allele G caused higher NF-kB activation and higher cell surface TLR1 expression. In sepsis patients predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al. (2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]
TNF G→Ars 1800629
Promoter-308
Allele TNF2 showed increased susceptibility to septic shock and associated with death due to septic shock [Mira et al (1999). JAMA 282(6):561-568]