1

DNAシーケンスプロトコール (2009.06.14改定)

サンプルの準備

1. 反応カクテルの準備（BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit）

Dye 希釈率 1/8

5× Sequencing Buffer* 1.875 l

BigDye Terminator 0.25 l

Template 1 l

Primer (2 pmol/l) 1 l

DW 5.875 l

*5× bufferの組成: 400 mM Tris-HCl pH 9.0, 10 mM MgCl2

2. シーケンス反応：反応はオートクレーブ済み 200 l PCR用チューブまたは、のオートクレー

ブ済み再利用 8連チューブを使用

96 ºC 2 min

96 ºC 30 sec

50 ºC 15 sec 25 cycles

60 ºC 4 min sequence反応を 55分程度で終了したい場合は

4 ºC pause BioTechniques, 43, 58-62 (2007)を参照のこと。

3. エタノール沈殿

↓1 L 125 mM EDTA

↓1 L 3 M AcONa (pH 5.4) + 25 L EtOH

↓5 min 氷上静置

↓遠心（10500 rpm, 20 min, rt）

ppt

↓80% EtOH 80 L → この洗浄が不十分だと nt70付近に Dye による大きな peakが

↓遠心（10500 rpm, 5 min, rt） 出る。いつも peakが出る場合は、EtOH による洗浄

ppt を 2回行うか、EtOH 沈殿の代わりにカラム等で Dye

↓dry up を取り除く。

4. Hi-Di Formamide もしくは DW 10 lに溶かす。(500 Lずつ分注してある)

5. ヒートショック (95 ºC 2 min)

6. ・8連チューブをプレートアセンブリにセット。

・サンプルを 96-well plate に移す場合は：

(a) 使用したウェルは備え付けの用紙に印をつけておく。

(b) ウェルは再利用するので使用後水で洗っておく。

7. プレートアセンブリを組み立てる。

8 連チューブを使用しているときは、バランスを取りやすいように適宜予備チューブをセット

しておく。

(注) 4 本キャピラリーなので、4 の倍数サンプルがない場合は足りないウェルに Hi-Di

Formamideを入れて 4の倍数にする。サンプルは 4の倍数個用意すると無駄がない。

2

3130 Genetic Analyzer使用方法

1. PC起動

User name: Administrator

Password:

2. 3130本体起動

3. Run 3130 Data Collection v3.0 起動する。

4. プレートレコード作成

i. ga3130－Plate Managerを選択

ii. Newをクリック

iii. Plate Dialog入力

3

iv. SequencingAnalysis Plate Editor 入力

測定時間の目安

Fast Run (700 bp)：Run数 × 1時間 + 解析 30分

Standard (850 bp)：Run数 × 2時間 + 解析 30分

BigDye Ver3.1の kitを使用する場合は下の組み合わせを使用すること。

Instrument Protocol1→Fastseq50_POP7_BDv3 or StdSeq50_POP7_BDv3

Analysis Protocol1 → 3130KB_POP7_BDv3

Instrument Protocol1→Fastseq50_POP7_BDv3 or StdSeq50_POP7_BDv3

Analysis Protocol1 → 3130KB_POP7_BDv1

の組み合わせを使用すると Tの peakが右側にずれる。

4

～測定開始前のチェック～

5. 気泡チェック：気泡があれば下記WiZARD にて除去する。

i. Wizards－Bubble Remove Wizardを選択

Remove Bubblesをクリックし、終了後、Next

ii. 青矢印の領域に気泡がないかをチェック

5

iii. あれば Yesを選択し、Remove Bubblesをクリック。終了後 Next。

なければ Noを選択し ivへ。

iv. 下図の矢印部分に気泡がないかチェック。あれば図示したネジをゆるめて Flush Array

Port。その際、キャピラリーをねじらないように注意。気泡がなければ No を選択し、

Next。

6

v. 本体のドアを閉め、Fill Arrayせずに Finishで OK。

7

6. polymer残量確認

i. 新しいポリマーを用意する：7 mL入りのポリマーを購入しているので、半分に分注して

使用。ピペットなどはエアーが入りやすいので使わずに、別のボトルに流し込んで分注。

ii. Wizards－Replenish Polymer Wizard を選択。

iii. 表示された画面の Same Lot（同じボトルの場合）か Different Lot（違うボトルの場合）

を選び、Nextをクリック。ちなみに、、、Same Lot の方が楽ですね・・・

iv. Close Valveをクリック。本体の扉を開け、ポリマーのボトルをはずし、新しいボトルを

取り付ける。この際、ボトルに入っているノズルを容器にぶつけないように、また、ボ

トルをあまり引っ張り出し過ぎないように注意しつつ取り付ける。

8

v. Nextをクリックし、Step3の画面へ。

Step3では、Primeをせずに、FinishしてWizard を終了する。

（ポリマーを余分に使ってしまうため、Primeの代わりに Bubble Remove Wizard をこの

後で行うため）

vi. 確認画面が出てきたら、Yesで終了。

vii. Wizards－Bubble Remove Wizardを選択し、bubble removeする。（上記 5.を参照）

viii. 使用ノートにポリマー交換日を記入する。

7. 陽極および陰極の Buffer交換（2日に 1度）

注 (a) TRAY を取り出すときは停止するのを待ってから本体の蓋を開ける。

(b) キャピラリーが乾燥しないように作業はさささのさっと行い、途中でどこかに行

かないように。

(c) 各リザーバーは水洗いし、DWですすいだ後、キムワイプなどでふく。

(d) Bufferは必ず Bufferと書いてあるリザーバーに入れ、1にセットする。

(e) セプタが浮かないようにセットする。

(f) セプタは使用したものは洗って風乾し、交換時は乾燥したものを使用する。

9

8. プレートをセット

i. プレートアセンブリをオートサンプラーにセット（切れ込みが奥）

ii. 装置のドアを閉める

注 装置のドアを閉めるときは常に、Bufferセプタが浮き上がっていないかチェック

（6の注意事項も参照）

9. プレートのリンク

i. ga3130－ABI3130－Run Schedulerを選択

ii. Searchもしくは Find Allでプレートレコードを表示し、目的のプレートレコードをクッ

リックし、Plate Position Indicator をクリック。Plate Position Indicatorが黄色から緑色にな

れば OK。

10

iii. Run Schedular－Run Viewをクリックし、Run Schedule を確認する。

（ここに表示された Run数を使用ノートに記入する）

iv. Run開始

10. Runのモニタリング

i. ga3130－ABI3130－Instrument Statusでステータスチェック

ii. Capillaries Viewerでラン中の Raw Data をモニタリング可能。ただし、この画面は開きっ

ぱなしにせず、Status画面に戻してから席を離れること。フリーズの原因になるので。

11

11. 測定終了後

i. プレートを取り出す。（キャピラリーにぶつからないように注意）

ii. Data Collection ソフトウェアの Service Consoleの Stop Allをクリックし、全てのステータ

スが赤丸印に変わってから 3130本体の電源 OFF。

12. 使用ノートに記入

12

Sequencing Analysis Software 5.2を用いたデータ解析

User Name: lifescience

Password: lifescience

1. データの読み込み

i. ga3130－ABI3130－Run Schedulerを選択

File－Add Sample(s)もしくは下図のボタンをクリック

ii. フォルダに入っている全データを読み込みたいときはフォルダを選択して Add Selected

Samplesをクリック。個別に選ぶ場合は各ファイルを選択して Add Selected Samplesをクリ

ック。ファイルを選んだら OKをクリック。

iii. 波形データの表示：Row をクリックし全データを選択後、Show ボタンをクリックすると

全データの波形が表示される（図参照）。個別に波形を表示もしくは非表示させたいとき

は各サンプルにある Showのチェックをつける、もしくははずす。

13

iv. 配列の範囲指定

14

v. 初期設定画面（最初に設定しておけば保存されるので OK）

シーケンスデータを FASTA 形式のテキストファイルで保存したい場合の設定

2007. 7. 3 間違いや苦情および要望は k-mari@sophia.ac.jp にお願いします