DNA シーケンスプロトコール (2009.06.14改定kanzawa/seibutsu/abi3130/3130.pdf1 DNA...
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1 DNA シーケンスプロトコール (2009.06.14 改定) サンプルの準備 1. 反応カクテルの準備（BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit） Dye 希釈率 1/8 5× Sequencing Buffer* 1.875 l BigDye Terminator 0.25 l Template 1 l Primer (2 pmol/l) 1 l DW 5.875 l *5× buffer の組成: 400 mM Tris-HCl pH 9.0, 10 mM MgCl 2 2. シーケンス反応：反応はオートクレーブ済み 200 l PCR 用チューブまたは、のオートクレー ブ済み再利用 8 連チューブを使用 96 ºC 2 min 96 ºC 30 sec 50 ºC 15 sec 25 cycles 60 ºC 4 min sequence 反応を 55 分程度で終了したい場合は 4 ºC pause BioTechniques, 43, 58-62 (2007)を参照のこと。 3. エタノール沈殿 ↓1 L 125 mM EDTA ↓1 L 3 M AcONa (pH 5.4) + 25 L EtOH ↓5 min 氷上静置 ↓遠心（10500 rpm, 20 min, rt） ppt ↓80% EtOH 80 L → この洗浄が不十分だと nt70 付近に Dye による大きな peak が ↓遠心（10500 rpm, 5 min, rt） 出る。いつも peak が出る場合は、EtOH による洗浄 ppt を 2 回行うか、EtOH 沈殿の代わりにカラム等で Dye ↓dry up を取り除く。 4. Hi-Di Formamide もしくは DW 10 l に溶かす。(500 L ずつ分注してある) 5. ヒートショック (95 ºC 2 min) 6. ・8 連チューブをプレートアセンブリにセット。 ・サンプルを 96-well plate に移す場合は： (a) 使用したウェルは備え付けの用紙に印をつけておく。 (b) ウェルは再利用するので使用後水で洗っておく。 7. プレートアセンブリを組み立てる。 8 連チューブを使用しているときは、バランスを取りやすいように適宜予備チューブをセット しておく。 (注) 4 本キャピラリーなので、4 の倍数サンプルがない場合は足りないウェルに Hi-Di Formamide を入れて 4 の倍数にする。サンプルは 4 の倍数個用意すると無駄がない。
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DNAシーケンスプロトコール (2009.06.14改定)
サンプルの準備
1. 反応カクテルの準備（BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit）
Dye 希釈率 1/8
5× Sequencing Buffer* 1.875 l
BigDye Terminator 0.25 l
Template 1 l
Primer (2 pmol/l) 1 l
DW 5.875 l
*5× bufferの組成: 400 mM Tris-HCl pH 9.0, 10 mM MgCl2
2. シーケンス反応：反応はオートクレーブ済み 200 l PCR用チューブまたは、のオートクレー
ブ済み再利用 8連チューブを使用
96 ºC 2 min
96 ºC 30 sec
50 ºC 15 sec 25 cycles
60 ºC 4 min sequence反応を 55分程度で終了したい場合は
4 ºC pause BioTechniques, 43, 58-62 (2007)を参照のこと。
3. エタノール沈殿
↓1 L 125 mM EDTA
↓1 L 3 M AcONa (pH 5.4) + 25 L EtOH
↓5 min 氷上静置
↓遠心（10500 rpm, 20 min, rt）
ppt
↓80% EtOH 80 L → この洗浄が不十分だと nt70付近に Dye による大きな peakが
↓遠心（10500 rpm, 5 min, rt） 出る。いつも peakが出る場合は、EtOH による洗浄
ppt を 2回行うか、EtOH 沈殿の代わりにカラム等で Dye
↓dry up を取り除く。
4. Hi-Di Formamide もしくは DW 10 lに溶かす。(500 Lずつ分注してある)
5. ヒートショック (95 ºC 2 min)
6. ・8連チューブをプレートアセンブリにセット。
・サンプルを 96-well plate に移す場合は：
(a) 使用したウェルは備え付けの用紙に印をつけておく。
(b) ウェルは再利用するので使用後水で洗っておく。
7. プレートアセンブリを組み立てる。
8 連チューブを使用しているときは、バランスを取りやすいように適宜予備チューブをセット
しておく。
(注) 4 本キャピラリーなので、4 の倍数サンプルがない場合は足りないウェルに Hi-Di
Formamideを入れて 4の倍数にする。サンプルは 4の倍数個用意すると無駄がない。
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3130 Genetic Analyzer使用方法
1. PC起動
User name: Administrator
Password:
2. 3130本体起動
3. Run 3130 Data Collection v3.0 起動する。
4. プレートレコード作成
i. ga3130－Plate Managerを選択
ii. Newをクリック
iii. Plate Dialog入力
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iv. SequencingAnalysis Plate Editor 入力
測定時間の目安
Fast Run (700 bp)：Run数 × 1時間 + 解析 30分
Standard (850 bp)：Run数 × 2時間 + 解析 30分
BigDye Ver3.1の kitを使用する場合は下の組み合わせを使用すること。
Instrument Protocol1→Fastseq50_POP7_BDv3 or StdSeq50_POP7_BDv3
Analysis Protocol1 → 3130KB_POP7_BDv3
Instrument Protocol1→Fastseq50_POP7_BDv3 or StdSeq50_POP7_BDv3
Analysis Protocol1 → 3130KB_POP7_BDv1
の組み合わせを使用すると Tの peakが右側にずれる。
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～測定開始前のチェック～
5. 気泡チェック：気泡があれば下記WiZARD にて除去する。
i. Wizards－Bubble Remove Wizardを選択
Remove Bubblesをクリックし、終了後、Next
ii. 青矢印の領域に気泡がないかをチェック
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iii. あれば Yesを選択し、Remove Bubblesをクリック。終了後 Next。
なければ Noを選択し ivへ。
iv. 下図の矢印部分に気泡がないかチェック。あれば図示したネジをゆるめて Flush Array
Port。その際、キャピラリーをねじらないように注意。気泡がなければ No を選択し、
Next。
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v. 本体のドアを閉め、Fill Arrayせずに Finishで OK。
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6. polymer残量確認
i. 新しいポリマーを用意する：7 mL入りのポリマーを購入しているので、半分に分注して
使用。ピペットなどはエアーが入りやすいので使わずに、別のボトルに流し込んで分注。
ii. Wizards－Replenish Polymer Wizard を選択。
iii. 表示された画面の Same Lot（同じボトルの場合）か Different Lot（違うボトルの場合）
を選び、Nextをクリック。ちなみに、、、Same Lot の方が楽ですね・・・
iv. Close Valveをクリック。本体の扉を開け、ポリマーのボトルをはずし、新しいボトルを
取り付ける。この際、ボトルに入っているノズルを容器にぶつけないように、また、ボ
トルをあまり引っ張り出し過ぎないように注意しつつ取り付ける。
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v. Nextをクリックし、Step3の画面へ。
Step3では、Primeをせずに、FinishしてWizard を終了する。
（ポリマーを余分に使ってしまうため、Primeの代わりに Bubble Remove Wizard をこの
後で行うため）
vi. 確認画面が出てきたら、Yesで終了。
vii. Wizards－Bubble Remove Wizardを選択し、bubble removeする。（上記 5.を参照）
viii. 使用ノートにポリマー交換日を記入する。
7. 陽極および陰極の Buffer交換（2日に 1度）
注 (a) TRAY を取り出すときは停止するのを待ってから本体の蓋を開ける。
(b) キャピラリーが乾燥しないように作業はさささのさっと行い、途中でどこかに行
かないように。
(c) 各リザーバーは水洗いし、DWですすいだ後、キムワイプなどでふく。
(d) Bufferは必ず Bufferと書いてあるリザーバーに入れ、1にセットする。
(e) セプタが浮かないようにセットする。
(f) セプタは使用したものは洗って風乾し、交換時は乾燥したものを使用する。
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8. プレートをセット
i. プレートアセンブリをオートサンプラーにセット（切れ込みが奥）
ii. 装置のドアを閉める
注 装置のドアを閉めるときは常に、Bufferセプタが浮き上がっていないかチェック
（6の注意事項も参照）
9. プレートのリンク
i. ga3130－ABI3130－Run Schedulerを選択
ii. Searchもしくは Find Allでプレートレコードを表示し、目的のプレートレコードをクッ
リックし、Plate Position Indicator をクリック。Plate Position Indicatorが黄色から緑色にな
れば OK。
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iii. Run Schedular－Run Viewをクリックし、Run Schedule を確認する。
（ここに表示された Run数を使用ノートに記入する）
iv. Run開始
10. Runのモニタリング
i. ga3130－ABI3130－Instrument Statusでステータスチェック
ii. Capillaries Viewerでラン中の Raw Data をモニタリング可能。ただし、この画面は開きっ
ぱなしにせず、Status画面に戻してから席を離れること。フリーズの原因になるので。
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11. 測定終了後
i. プレートを取り出す。（キャピラリーにぶつからないように注意）
ii. Data Collection ソフトウェアの Service Consoleの Stop Allをクリックし、全てのステータ
スが赤丸印に変わってから 3130本体の電源 OFF。
12. 使用ノートに記入
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Sequencing Analysis Software 5.2を用いたデータ解析
User Name: lifescience
Password: lifescience
1. データの読み込み
i. ga3130－ABI3130－Run Schedulerを選択
File－Add Sample(s)もしくは下図のボタンをクリック
ii. フォルダに入っている全データを読み込みたいときはフォルダを選択して Add Selected
Samplesをクリック。個別に選ぶ場合は各ファイルを選択して Add Selected Samplesをクリ
ック。ファイルを選んだら OKをクリック。
iii. 波形データの表示：Row をクリックし全データを選択後、Show ボタンをクリックすると
全データの波形が表示される（図参照）。個別に波形を表示もしくは非表示させたいとき
は各サンプルにある Showのチェックをつける、もしくははずす。
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iv. 配列の範囲指定
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v. 初期設定画面（最初に設定しておけば保存されるので OK）
シーケンスデータを FASTA 形式のテキストファイルで保存したい場合の設定
2007. 7. 3 間違いや苦情および要望は [email protected] にお願いします
