DNA

Laborbiologie WS 2012

Theresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie

Nukleotide-Funktionen

Energielieferanten bei metabolischen Prozessen

Regulatorische Funktion, sekundärer Botenstoff

Bausteine der Nukleinsäuren

Nukleotide Nukleotid

Nukleosid

Aromatische Moleküle - Delokalisierte Elektronen zwischen den Atomen der Ringe

Nukleotide - Basen

Nukleinsäuren – Struktur

• Nucleinsäuren werden wegen ihrer Polymerstruktur als Polynucleotide bezeichnet

• Ein Polynucleotid besteht aus Monomeren, den Nucleotiden

• zwei Monomere werden unter Abspaltung eines Wassermoleküls kovalent miteinander verbunden = Kondensation

Nukleinsäuren - Struktur Primärstruktur: Phosphodiester-Bindungen verbinden Nukleotide

Es entsteht ein Zucker Phosphat Rückgrat

Nukleinsäuren - Struktur

Nukleinsäuren - Sekundärstruktur Basenpaarung Doppelhelix, 2 antiparalelle Moleküle, komplementäre Sequenz

Nukleinsäuren - Struktur

Sekundärstruktur: Doppelhelix In Polynukleotiden kommt es zur Basenpaarung G paart sich mit C A paart sich mit T Die gepaarten stränge verlaufen immer antiparallel 2 Kräfte halten Doppelhelix: 1. Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen 2. "Stacking interactions" Je mehr H-Brücken umso stabiler je höher der GC-Gehalt umso stabiler

Nukleinsäuren - Struktur

RNA bleibt ein Einzelstrang Dieser bildet sog. Sekundärstrukturen durch Paarung ähnlicher aber entfernter, kurzer Sequenzabschnitte

Nukleinsäuren - Struktur

Nukleinsäuren - Struktur Sekundärstruktur: Doppelhelix

Nukleinsäuren – Organisation in der Zelle - Chromatin

Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA

- Hitze

- pH

- Ethanol

=> Prinzipien?

Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA

=> Sie isolieren DNA von 2 verschiedenen Organismen O1: 30% AT O2: 40% AT Einer von beiden lebt in heißen Quellen. Was vermuten Sie welcher es ist?

Versuchsschema

Mechanisches Aufbrechen des Gewebes

Chemische Lyse der Zellen

Proteinfällung

DNA-Fällung

Überprüfung der Reinheit von DNA Demonstration des thermochromen Effekts

DN

A Isolation C

harakterisierung

Fragen zur DNA-Isolation

=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Nukleinsäuren?

=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Proteinen?

=> Was bewirkt die Zugabe von SDS im Lysepuffer?

=> Warum geben Sie im Lysepuffer RNase zu?

=> Warum enthält der DNA Puffer EDTA?

Absorption von Licht durch Moleküle

Spektrophotometer

Lambert-Beer'sches Gesetz: ]exp[0 clII ε−=

ε: molarer Extinktionskoeffizient [l/(mol cm)] c: Konzentration der absorbierenden Moleküle [mol/l] l: Länge des Licht durch die Probe [cm]

Messgröße: Absorption A = log(I0/I) (auch OD, optische Dichte)

Absorption von Licht durch Nukleotide

Absorption von Licht durch DNA

Hyperchromie

Absorption von Licht durch Nukleotide

OD260 = 1 entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger (ds) DNA, 40 µg/ml RNA, 33 µg/ml einzelträngiger DNA 20 µg/ml bei Oligonucleotiden. Dieses gilt für Nukleinsäuren bei pH 7,0. Es gilt OD260 ~ c für gerine DNA Konzentrationen

Konzentrationsbestimmung von DNA

=> Bestimmen Sie die Konzentration der von Ihnen isolierten DNA!

Absorption von Licht durch Aminosäuren

Maximum bei 190-210nm: π -> π* Übergange in der Amid Gruppe Maximum bei 280nm: π -> π* Übergänge in aromatischen Aminosäuren

=> Warum lässt sich die Konzentration von Proteinen nicht durch Messung der optischen Dichte bei 280nm bestimmen?