DNA - uni-muenster.deTheresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie Nukleotide-Funktionen...
22
DNA Laborbiologie WS 2012 Theresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie
Transcript of DNA - uni-muenster.deTheresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie Nukleotide-Funktionen...
DNA
Laborbiologie WS 2012
Theresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie
Nukleotide-Funktionen
Energielieferanten bei metabolischen Prozessen
Regulatorische Funktion, sekundärer Botenstoff
Bausteine der Nukleinsäuren
Presenter
Presentation Notes
sekundärer Botenstoff: Zellen antworten auf Umgebung Interaktion von extrazellulären Signalen (primärere Botenstoffe) mit Rezeptoren löst of Produktion von sekundären Botenstoffen aus z.B. zyklisches AMP (cAMP), cGMP
Nukleotide Nukleotid
Nukleosid
Presenter
Presentation Notes
zwei verschiedene Pentosen Gezeigt: Ribonukleotid ersetze OH (rot) durch H -> Deoxyribonukleotid
Aromatische Moleküle - Delokalisierte Elektronen zwischen den Atomen der Ringe
Nukleotide - Basen
Presenter
Presentation Notes
partielle Doppelbindungen delokalisierte pi-Elektronen-Systeme planare Moleküle -> parallele Anordnung als Stapel Basen sind hydrophob und schlecht wasserlöslich bei pH7 hydrophobe Wechselwirkungen (stacking interaction) ist eine der beiden wichtigen WW, die die Doppelhelix bedingen andere Komponenten der Stapel-WW: Dipol-Dipol und vdWaals
Nukleinsäuren – Struktur
• Nucleinsäuren werden wegen ihrer Polymerstruktur als Polynucleotide bezeichnet
• Ein Polynucleotid besteht aus Monomeren, den Nucleotiden
• zwei Monomere werden unter Abspaltung eines Wassermoleküls kovalent miteinander verbunden = Kondensation
Nukleinsäuren - Struktur Primärstruktur: Phosphodiester-Bindungen verbinden Nukleotide
Es entsteht ein Zucker Phosphat Rückgrat
Presenter
Presentation Notes
kovalente Bindung zwischen Nukleotiden von DNA und RNA Rückgrat der DNA besteht aus alternierenden Phosphat- und Pentose-Resten Basen können als Seitengruppen betrachtet werden Phosphat-Gruppen haben pK ca. 0 -> bei pH7 komplett ionisiert und negative geladen Ladung später wichtig beim Verständnis des Fällungs-Protokolls negative Ladungen sind in Lösung normalerweise durch Kondensation von Gegenionen kompensiert
Nukleinsäuren - Struktur
Nukleinsäuren - Sekundärstruktur Basenpaarung Doppelhelix, 2 antiparalelle Moleküle, komplementäre Sequenz
Nukleinsäuren - Struktur
Sekundärstruktur: Doppelhelix In Polynukleotiden kommt es zur Basenpaarung G paart sich mit C A paart sich mit T Die gepaarten stränge verlaufen immer antiparallel 2 Kräfte halten Doppelhelix: 1. Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen 2. "Stacking interactions" Je mehr H-Brücken umso stabiler je höher der GC-Gehalt umso stabiler
Presenter
Presentation Notes
Drei Wasserstoffbrücken zwischen GC, zwei zwischen AT => Stabilität Stacking interaction: WW zwischen pi-Elektronen-Systemen WW sowohl parallel als auch in Reihe, genaue Ursache (e.B. elektrostatische Anziehung) unklar
Nukleinsäuren - Struktur
RNA bleibt ein Einzelstrang Dieser bildet sog. Sekundärstrukturen durch Paarung ähnlicher aber entfernter, kurzer Sequenzabschnitte
Nukleinsäuren - Struktur
Nukleinsäuren - Struktur Sekundärstruktur: Doppelhelix
Presenter
Presentation Notes
Abstand Basen: 0.34nm Purin / Pyrimidin Basen der beiden Stränge sind innerhalb der Doppelhelix gestapelt hydrophobe planare Ringstrukturen senkrecht zur Hauptachse
Nukleinsäuren – Organisation in der Zelle - Chromatin
Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA
- Hitze
- pH
- Ethanol
=> Prinzipien?
Presenter
Presentation Notes
Renaturierung: solange einige Basenpaare intakt sind: schneller Prozess, es sei denn Hairpins bilden sich (Reissverschlussprinzip) falls die Stränge komplett getrennt sind: Zunächst Keimbildung notwendig Frage 1: Denaturierung: Hitze (Entropie), pH erhöhen (Laugen nehmen positive Ladung auf -> stärkere elektrostatische Abstossung) Ethanol: interferiert mit Wasserstoffbrückenbindungen, polares Lösungsmittel
Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA
=> Sie isolieren DNA von 2 verschiedenen Organismen O1: 30% AT O2: 40% AT Einer von beiden lebt in heißen Quellen. Was vermuten Sie welcher es ist?
Presenter
Presentation Notes
Typische Denaturierungstemperatur: 80°C Renaturierung: solange einige Basenpaare intakt sind: schneller Prozess, es sei denn Hairpins bilden sich (Reissverschlussprinzip) falls die Stränge komplett getrennt sind: Zunächst Keimbildung notwendig Frage 2: Die Schmelztemperatur von DNA hängt vom AT-Gehalt, von der Länge des DNA-Strangs und von der Ionenstärke in Lösung ab. Die Bindung zwischen AT ist geringer als für GC (2 / 3 Wasserstoffbrückenbindungen), also ist es wahrscheinlich, dass O1 in heißen Quellen lebt.
Versuchsschema
Mechanisches Aufbrechen des Gewebes
Chemische Lyse der Zellen
Proteinfällung
DNA-Fällung
Überprüfung der Reinheit von DNA Demonstration des thermochromen Effekts
DN
A Isolation C
harakterisierung
Fragen zur DNA-Isolation
=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Nukleinsäuren?
=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Proteinen?
=> Was bewirkt die Zugabe von SDS im Lysepuffer?
=> Warum geben Sie im Lysepuffer RNase zu?
=> Warum enthält der DNA Puffer EDTA?
Absorption von Licht durch Moleküle
Spektrophotometer
Lambert-Beer'sches Gesetz: ]exp[0 clII ε−=
ε: molarer Extinktionskoeffizient [l/(mol cm)] c: Konzentration der absorbierenden Moleküle [mol/l] l: Länge des Licht durch die Probe [cm]
Messgröße: Absorption A = log(I0/I) (auch OD, optische Dichte)
Absorption von Licht durch Nukleotide
Presenter
Presentation Notes
Aromatische Ringe bestimmen die Absorptionseigenschaften Für gemischte Nukleotide: Maximum bei 260nm Purine: höhere Absorption
Absorption von Licht durch DNA
Hyperchromie
Presenter
Presentation Notes
Durch WW (stacking) der Basen wird die Absorption abgeschwächt
Absorption von Licht durch Nukleotide
OD260 = 1 entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger (ds) DNA, 40 µg/ml RNA, 33 µg/ml einzelträngiger DNA 20 µg/ml bei Oligonucleotiden. Dieses gilt für Nukleinsäuren bei pH 7,0. Es gilt OD260 ~ c für gerine DNA Konzentrationen
Konzentrationsbestimmung von DNA
=> Bestimmen Sie die Konzentration der von Ihnen isolierten DNA!
Absorption von Licht durch Aminosäuren
Maximum bei 190-210nm: π -> π* Übergange in der Amid Gruppe Maximum bei 280nm: π -> π* Übergänge in aromatischen Aminosäuren
=> Warum lässt sich die Konzentration von Proteinen nicht durch Messung der optischen Dichte bei 280nm bestimmen?
Presenter
Presentation Notes
Die Amplitude des 280nm-Peaks hängt von der Aminosäure-Zusammensetzung ab, daher kann er nicht allein zur Bestimmung der Proteinkonzentration genutzt werden
