1973 H. Morimoto, M . Hori und I . Yoshida 805 Liebigs Ann. Chem. 1973, 805-8810

Identifizierung von Arginin in Peptiden nach Edman-Abbau durch Gaschromatographie

Hiroshi Morimoto *) * *), Masatake Hori und Isamu Yoshida

Forschungslaboratorium fur Chemie der Takeda Chem. Ind. Ltd., 532-0saka, Jusonishinocho, Higashiyodogawaku; Japan

Eingegangen am 19. Oktober 1972

Nach Reaktion des Arginic-Rests in Peptiden mit Acetylaceton zum Pyrimidinylornithin- Rest (PO) und Edman-Abbau in Losung oder an fester Phase wird das erhaltene Phenylthio- hydantoin-PO (PTH-PO) gaschromatographisch bestimmt.

Identification of Arginine in Peptides by Gas Chromatography after Edman Degradation

The PTH-amino * * *) acids containing PTH-PO, which are formed from arginine-containing peptides by Edman degradation in solution or on a solid phase after conversion of the arginine residue into the pyrimidinylornithine (PO) residue by acetylacetone, are analyzed by gas chromatography.

Die Gaschromatographie von Phenylthiohydantoin-Derivaten (PTH-Aminosau- ren * * *)), welche aus den jeweiligen N-terminalen Aminosauren in Peptiden und Pro- teinen durch Edman-Abbau entstehen, ist eine rasch durchfuhrbare, empfindliche und exakte Methodel.2). Leider ist dies beim Arginin aufgrund der starken Polaritat und geringen Fluchtigkeit von PTH-Arg nicht der Fall. Kurzlich3) wurde die Guani- dinogruppe des Arginins in Oligopeptiden mit Acetylaceton kondensiert und das gebildete Pyrimidinylornithyl-peptid mit Erfolg massenspektrometrisch fragmentiert.

Dieses Prinzip wendeten wir bei der Kombination von Edman-Abbau und Gas- chromatographie von argininhaltigen Oligopeptiden an. Zunachst wurde Pyrimidinyl- ornithin (PO) aus authentischem Arginin nach Vetter-Diechtl und Mitarbeiternd) hergestellt und mit Phenylisothiocyanat in PTH-PO ubergefuhrt. Das PTH-PO und sein Silyl-Derivat lieBen sich unter den von Pisano und Bronzert 1) angegebenen Bedin- gungen gaschromatographieren und ergaben in beiden Fallen einen vor dem Trypto- phan liegenden Peak (Abb. la, b).

*) Korrespondenz bitte an diesen Autor richten. **) Meinem verehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. Th. Wieland, zum 60. Geburtstag gewidmet.

***) Alle Aminosauren dieser Arbeit haben L-Konfiguration. - Abkiirzungen: PTH = Phenylthiohydantoin; PO = Pyrimidinylornithin [Ns-(4,6-Dimethylpyrimidinyl)orni- thin] ; Iboc = Isobornyloxycarbonyl.

1) J. J. Pisano und T . J . Bronzert, J. Biol. Chem. 244, 5597 (1969). 2) J. J . Pisano und T. J . Bronzert, Anal. Chem. 45, 43 (1972). 3) M . M. Schemyakin, Yu. A . Ovchinnikov, E. I. Vinogradova, M. Yu. Feigina, A . A . Kiry-

ushkin, N . A . Aldanova, Yu. B. Alakhov, V. M . Lipkin und B. V. Rosinov, Experientia 23, 428 (1967).

4) H. Vetter-Diechtl, W. Vetter, W. Richter und K . Biemann, Experientia 24, 340 (1968).

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Die Cyclisierung mit Acetylaceton wurde zunachst an Arg-Pro, Arg-Gly und Leu- Arg-Ala, also Beispielen rnit N-terminalem oder mittelstandigem Arginin erprobt und anhand des UV-Maximums von PO bei 310 nm verfolgt. Es erwies sich, da13 die Reaktion mit 86-87proz. Ausbeute verlief. Die erhaltenen PO-Pro, PO-Gly und Leu-PO-Ala wurden dunnschichtchromatographisch gereinigt und nach der Edman-Losungsmethode abgebaut. Hiernach wurden PTH-PO und PTH-Leu gas- chromatographisch sowie die Restaminosaure mit dem Aminosaureanalysator be- stimmt (Schema 1, Tab. 1).

Schema 1

PO

1973 Gaschromatographie von Arg-Derivaten nach Edman-Abbau 807

Tabelle 1 . Ausbeuten an PTH-Aminosaure und Restaminosaure nach Peptidabbau nach der Edman-Losungsmethode

Abgebautes Ausbeute [ %] Peptid nach Gaschromatographie nach Aminosaureanalyse

PO-Pro PO-Gly

PTH-PO , 35 Pro 40 PTH-PO 68 Gly 39 PTH-Leu 69.5 Ala 52.5 PTH-PO 20.5 Leu-PO-Ala

Der Grund fur die niedrige Ausbeute an PTH-Aminosaure konnte darauf beruhen, daB ein Teil des kurzkettigen Restpeptids oder der Restaminosaure bei der Benzol- extraktion des uberschussigen Phenylisothiocyanats mitextrahiert undjoder das 5-Thi- azolinon-Derivat aus der waBrigen Losung rnit Essigester unvollstandig ausgezogen wurde.

Zur Vermeidung der progressiven Ausbeuteminderung wurden Abbaumethoden auf einem Festkorper herangezogens-8). Wir schutzten die Amino-Endgruppe von Leu-PO-Ala rnit Isobornyloxycarbonylchlorid (Iboc-C1) 9) und fixierten das Iboc- tripeptid quantitativ mit Dicyclohexylcarbodiimid sowie N-Hydroxysuccinimid an der Aminogruppe des nach Merrifeldlo) aufgebauten Glycylpolystyrolharzes. Dabei ergab sich nach Totalhydrolyse und folgender Aminosaureanalyse, daB 15 pmol Iboc-tripeptid an 100 mg getrocknetes Harz gebunden worden waren. Die Abspaltung der Iboc-Gruppe erfolgte rnit Trifluoressigsaure/Methylenchlorid. Das harzgebundene Tripeptid wurde stufenweise nach Edman abgebaut und das Abbauprodukt jeweils gaschromatographisch analysiert (Schema 2, Tabelle 2). Hierbei betrug die Ausbeute an PTH-PO 44 % gegeniiber 20.5 % nach der Edman-Losungsmethode. Die Vermin- derung der Ausbeute an PTH-Aminosaure nach jedem Abbauschritt auch beim Merri- field-Verfahren besagt, dal3 die geringe Ausbeute an PTH-PO kein spezifisches, son- dern ein allgemeines Merkmal der Edman-Verfahren ist.

Tabelle 2. Ausbeute an PTH-Aminosaure aus Leu-PO-Ala nach Edman-Festphasenmethode und Gaschromatographie

PTH-Aminosaure Ausbeute [ % ]

PTH-Leu PTH-PO PTH- Ala

77.7 44.2 26.1

Wir versuchten noch, die Guanidinogruppe des Arginins mit Acetoin oder Diacetyl zum Imidazolring zu cyclisieren, hatten damit jedoch keinen befriedigenden Erfolg.

5 ) G. R. Stark, Fed, Proc. 24, 225 (1965). 6 ) R . A . Laursen, J. Amer. Chem. SOC. 88, 5344 (1966). 7) A. Dijkstra, H . A . Billiet, A . H. van Doninck, H . van Velthuyzen, L. Maat und H. C.

Beyerman, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 86, 65 (1967). 8) A. Schellenberger, H . Jeschkeit, R . Henkel und H. Lehmann, Z. Chem. 7 , 191 (1967). 9) M. Fujino, S . Shinagawa, 0. Nishimura und T. Fukuda, Chem. Pharm. Bull. 20, 1017

(1972). 10) R. B. Merrifield, J. Amer. Chem. SOC. 85, 2149 (1963).

808 H . Morimoto, M. Hori und I . Yoshida 1973

Schema 2

n

J. Iboc-Leu-PO-Ala-G1,y--(tCHz

'1'11 fl""rC.sslgn?iiurr~

Leu-P~Ala-G1y-O-CHz ' ' : l oi-

Edman-Al,bnu

Iboc-C1

Wir haben den Herren vom Peytidlaboratoriurn (Leiter Dr. M . Fujino) in unserem Institut fur die Uberlassung von Peptiden zu danken.

Experimenteller Ted Die Schmelzpunkte wurden auf dem Kofler-Heiztischmikroskop (Fa. Yanagirnoto) be-

stimmt und nicht korrigiert. - Die UV-Spektren wurden rnit einem Hitachi-Spektrograph, EPS-2, aufgenomrnen. - Zur Arninosaureanalyse diente der Hitachi-Aminosaureanalysator KLA-3 B. - Fur die Dunnschchichtchromatographie (DC) verwendete man Kieselgel-Fertig- platten (20 x 20 cm; Fa. Tokyo-Kasei). ~ Authentische PTH-Aminosauren waren Handels- produkte (Fa. Seikagaku-Kogyo).

Gaschromatographisches Verfahren: Verwendet wurde der Shimadzu-Gaschromatograph GC-5 A mit Flammenionisationsdetektor. Zur Bereitung der stationaren Phase wurden 5 g DC-560 in 50 rnl Aceton gelost und nach Pisano und Bronzertl) zu 5 g Chromosorb W (100 bis 120 mesh) gegeben, welches rnit NazC03-Losung, dann rnit verd. Salzsaure gewaschen und rnit Dichlordirnethylsilan impragniert worden war. Zur Entluftung wurde 10 min i. Vak. belassen, dann abgesaugt und bei 70°C getrocknet. - SaulengroBe 0.2 x 180 cm; Tragergas 150 ml He/min; die Saule wurde 30 min bei 50°C gehalten, danach 5"C/min bis 320°C erhitzt und dann 24 h bei 320°C gehalten.

Silylierung von PTH-Aminosuuren: Man lie13 die Probe rnit N,O-Bis(trimethylsily1)acet- amid 2 min bei 80°C reagieren und gaschromatographierte dann unter folgenden Bedin-

1973 Gaschromatographie von Arg-Derivaten nach Edman-Abbau 809

gungen: Saulenternperatur wie in Abb. 1 angegeben; Tragergas 80 ml He/min, Detektor- temperatur 330°C. - Zur quantitativen Auswertung dienten die Peakhohen im Chrornato- gramrn, bezogen auf Eichwerte authentischer Substanzen.

Pyrimidinylornithin.HC1 (PO.HC1). - Die Losung von 733 mg Arg.HC1 und 931 mg NaHCO3 in 6 rnl Wasser wurde rnit je 10 ml Acetylaceton sowie 96proz. Athano1 versetzt und 10 h unter RiickfluR erhitzt. Dann wurde i. Vak. eingedampft, der Riickstand in 50 rnl Wasser gelost und ca. 12 h irn Kiihlschrank stehengelassen. Nach Abnutschen des ausgefal- lenen 2-Acetyl-3,5-dimethyIphenols wurde das Filtrat 3 ma1 rnit je 50 ml Ather gewaschen, mit 1 N HCI auf pH 5 angesauert und i. Vak. eingeengt. Die hierbei ausgefallenen Nieder- sEhlage wurden gerneinsarn in 1 ml 1 N HCI gelost. Durch Zugabe von Aceton erhielt man 630 mg (61.7%) farblose Nadeln; Schmp. 244-248°C (Zen.). - UV (0.1 N HCI): A,,, (E) = 231 (16300), 310 nm (5800).

[CllH19N402]Cl.H20 (292.8) Ber. C 45.1 H 7.2 N 19.1 Gef. C 45.1 H 7.3 N 19.1

Phenylthiohydantoin-Derivat (PTH-PO). - 1 18 mg (0.43 mmol) PO. HC1 loste man in 20 ml Pufferlosung (pH 9.5), welche aus 1 ml Dimethyl-allylamin, 11.4 ml Pyridin und 7.6 rnl Wasser hergestellt worden war, gab 1 rnl (7 mrnol) Phenylisothiocyanat hinzu und belieB 1 h bei 40°C. Dann wurde i. Vak. bei 35°C auf 10 ml eingeengt und iiberschiissiges Phenyliso- thiocyanat durch Extraktion mit 5mal je 10 ml Benzol entfernt. Die waBrige Schicht wurde i. Vak. eingedampft, der Ruckstand in 10 ml 1 N HCI gelost und die Losung 15 min auf 80°C erhitzt. Nach Neutralisieren auf pH 5 rnit 1 N Natronlauge wurde 4mal rnit je 10 ml Essig- ester extrahiert. Aus dem Esssigesterextrakt erhielt man durch Einengen 114 mg (71.3 %) farblose Nadeln; Schmp. 183-185°C (aus Methanol). - UV (C~HSOH): A,,, (E) = 238 (20200), 271 nrn (15 100). C18H21N50S.O.5 CH30H (371.5) Ber. C 59.8 H 6.2 N 18.9 Gef. C 59.8 H 6.1 N 18.7

Uberf iihrung von Arginin in Peptiden zu Pyrimidinylornithin (PO) : 3 mmol Peptid und 5 ml (50 rnmol) Acetylaceton wurden in 5 rnl 96proz. k h a n o l 10 h unter RiickfluB gekocht. Der Ansatz wurde, wie beim PO HCl angegeben, aufgearbeitet. Der erhaltene Riickstand, welcher aufgrund der UV-Extinktion bei 310 nm 86-87% PO-Peptid enthielt, wurde in 0.5 ml Eis- essig gelost und der DC rnit Pyridin/Butanol/Wasser (1 : I :1) unterworfen. Der im UV-Licht erkennbare Fleck wurde rnit 30proz. waBrigem Pyridin extrahiert und aus dem eingedampften Pyridinextrakt das PO-Peptid (vgl. Tab. 1) erhalten.

Iboc-Leu-PO-Ala. ~ 150 mg (0.36 mmol) Leu-PO-Ala wurden in 5 ml 1 N Natronlauge rnit 1 ml (6 mmol) Isobornyloxycarbonylchlorid (Iboc-C1) unter Eiskiihlung wahrend 1 h quantitativ umgesetzt. Die Reaktionslosung wurde zur Entfernung des Isoborneols 5mal mit je 5 ml Petrolather ausgezogen, dann rnit 1 N HCl auf pH 4 angesauert und 5mal rnit je 5 ml Essigester extrahiert. Der eingedampfte Essigesterextrakt ergab 21 I mg (97.3 %) farb- loses Pulver.

Edman-Abbau

a) Losungsmethode: 3 ymol Peptid wurden, wie bei PTH-PO angegeben, in der Pufferlo- sung (pH 9.5) nach Edman 11) abgebaut. Die Essigesterlosung der entstandenen PTH-Amino- saure wurde der Gaschromatographie unterworfen.

b) Festphasenmefhode: 21 1 mg Iboc-Leu-PO-Ala wurden in 10 ml Dimethylformamid mit 222 mg (1.9 mmol) N-Hydroxysuccinirnid und 390 mg (I .9 rnmol) Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert und rnit 1 g Gly-0-Harz (0.56 mrnol Gly/g Harz), welches nach der Merrifield-Syn- these 10) rnit Glycin fixiert worden war, 3 h bei Raumternperatur geriihrt. Das Peptid-Harz wurde nacheinander rnit Dimethylformamid, Eisessig und Methanol gewaschen und i. Vak. 11) P. Edman und G . Begg, Eur. J. Biochern. 1, 80 (1967).

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bei Raumtemperatur getrocknet. 315 mg Harz wurden zur Abspaltung des Iboc-Rests in der Mischung aus 2 ml Trifluoressigsaure und 2 ml Methylenchlorid 30 min bei Raumtemperatur geriihrt. Dann wurde abgesaugt, der Niederschlag nacheinander rnit Dimethylformamid, Methylenchlorid und 100 ml Pyridin/Triathylamin (9 : 1) gewaschen, rnit einer Losung von 1 ml Phenylisothiocyanat in 10 ml Pyridin/Triathylamin (9 : 1) versetzt und 2 h unter Stick- stoff bei Raumtemperatur geriihrt. Man filtrierte erneut und wusch rnit Pyridin/Triathylamin (9 : l), Dimethylformamid und Methylenchlorid. Das Harz wurde jetzt 30 min rnit 4 ml Tri- fluoressigsaure unter Stickstoff geriihrt, filtriert und rnit Methylenchlorid gewaschen. Die Trifluoressigsaure- und die Waschlosung wurden gemeinsam i. Vak. eingedampft. Den Riick- stand lieB man rnit 1 ml 1 N HCl 15 min bei 80°C reagieren und extrahierte nach dem Ab- kiihlen 5mal rnit je 1 ml Essigester. Die im Essigesterextrakt enthaltene PTH-Aminosaure wurde der Gaschromatographie unterworfen. Das Harz wurde fur den nachsten Edman- Abbauschritt eingesetzt.

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