Immunologisches Labor

Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV

1

2

Facharztweiterbildung Nuklearmedizin

Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in ...

… der nuklearmedizinischen in-vivo- und in-vitro-Diagnostik unter Verwendung von organ-/zielgerichteten Radiodiagnostika …

… der Radiochemie und der gebietsbezogenen Immunologie

und Radiopharmakologie

3

Juristische Voraussetzungen

Laborrichtlinien KBV 5/1994Nuklearmediziner : RIA (entspr. Weiterbildung/Zeugnis)

Bei NON-RIA : Prüfung Fachkommission

Schriftwechsel KBV 2005 Immunologische Parameter unabhängig von Methode

( RIA , LIA , FIA etc ) durch Nuklearmediziner abzurechnen ,

falls Weiterbildung vorliegt

4

Fachliche Aspekte

Laborkolloquiumvon der KV eingesetztes Gremium

3-4 Mitglieder

( mind. 1 Laborarzt )

Fragenkatalog

Angaben von Kollegen

Inhalt Kolloquium

Immunologische MethodenRIA, LIA, FIA

Immunologisches Testprinzip

Interpretation der Ergebnisse

Rili-BÄK Qualitätsmanagement

Qualitätssicherung

41. Jahrestagung des BDN

Immunologische Messmethoden

Nürnberg, September 2012

In Kooperation mit:Euro-Labor-Freiburg

6

Dr. Hermann Butz,Drei-G-Consulting

Empfohlene Literatur

Sokolowski/Wood: Radioimmunoassay in Theorie und Praxis: nur noch antiquarisch erhältlich

L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage,gebraucht ca. 100 € bei Amazon, Kapitel 52.1: Immunchemische Techniken (S. 1915 – 1936)

Packungsbeilagen der jeweiligen Teste

Ausführlicheres Vortragsscript:

Euro-Labor Freiburg schwabe@euro-labor-freiburg.de

oder hermann.butz@drei-g-consulting.de

7

Klassisches Anwendungsgebiet von Immunoassays: Hormonanalytik

Hormonanalytik von Körperflüssigkeiten (in-vitro, ohne Probenaufbereitung)

Spezifischer Nachweis von Hormonkonzentrationen in Anwesenheit vieler anderer, zum Teil sehr ähnlicher Moleküle: hohe Spezifität gefordert Schlüssel-Schloss-Prinzip von Antigen-Antikörper-Reaktionen

Nachweis extrem niedriger Konzentrationen (10-6 bis 10-16 mol): hohe Signalstärke gefordert = hohe „spezifische Aktivität“ des

Signalträgers gefordert 125J (später weitere Signalträger: Enzyme, Fluoreszenz, Luminesz.)

• Erster Immunoassay: R. Yalow/S. Berson (1959): Nobelpreis 1977 Insulin-RIA, (kompetitiver IA, homogen)

• Heutiger Standard-IA: Sandwich-Immunoassay (nicht-kompetitiver IA, heterogen)

8

„Teilnehmer“ eines Immunoassay

Antigene (Analyte = zu bestimmende Substanz): Hormone (Proteohormone, Steroidhormone,...), Medikamente, ....

Antikörper: Y-Form mit Fab-Teil (Antigenspezifisch) und Fc-Teil (Speziesspezifisch), bindet spezifisch an „Ziel“-Antigene

Antigene und Antikörper bilden Ag-Ak-Komplexe nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip

Ag-Ak-“Reaktionen“ folgen dem Massenwirkungsgesetz (Ag-Ak)

Ag + Ak Ag-Ak Affinitätskonstante K = ------------------- (Ag) x (Ak)

hohe Affinitätskonstante = feste Bindung von Ag und Ak Hohe Analytische Sensitivität möglich

9

Bestandteile eines (Sandwich-)Immunoassays

Gesucht: variable Konzentration eines Ag

Messbar über:

• konstante Zahl von Ak im Immunoassay • Markierung des Ak AkÜberschuss

• Komplexbildung: Ag + AkÜberschuss Ag-Ak + Ak

• Trennung von gebundener Phase Ag-Ak und freier Phase Ak

gesuchte Antigenkonzentration = Menge des Signals in der gebundenen Phase = Ag-Ak

10

Moderne, heterogene IA: Vorwegnahme der Trennung von freier und gebundener Phase durch Kopplung eines Ak an eine Festphase

Festphase (Solid Phase): • Röhrchenwand • Kaverne einer Mikrotiterplatte• Kügelchen• Magnetische Partikel, Latex-Partikel, Glas-Partikel,....

Je kleiner und „beweglicher“ die Festphase, umso kürzer die Inkubationszeit

Wash

Freie Phase

Gebundene Phase

11

Markierung eines Ak mit geeignetem Signalträger

Signalgeber (Tracer): • Radioaktivität (125J, 3H: Gammacounter; 1-10 Minuten)• Enzyme (farblose Substrate farbige Produkte: Photometer (Lambert-Beer‘sches Gesetz; 10-20 Min.))• Lumineszenz (Acridiniumester, Luminol, (Enzym: Alkalische Phosphatase katalysiert Lichtreaktion): Luminometer; 1- 60 sec.)• Fluoreszenz (Fluorophore: Fluorometer; 1 sec.)

Wash

12

Signalarten

_

Farblose Substrate

Farbige Produkte

10 – 20 Minuten

RIA, IRMA,

_

_

E

MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium

AEH2O2 + NaOH

EIA, IEMA

LIA, ILMA

AE‘ + Licht (1-2 sec.)

_LIA, ILMA

TRAnregende Elektrode

Licht

Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....)

Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott

Elektro-CL: Roche

(MPO)

125J Wash Gammacounter

13

Signalarten

_

Farblose Substrate

Farbige Produkte

10 – 20 Minuten

RIA, IRMA,

_

_

E

MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium

AEH2O2 + NaOH

EIA, IEMA

LIA, ILMA

AE‘ + Licht (1-2 sec.)

_LIA, ILMA

TRAnregende Elektrode

Licht

Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....)

Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott

Elektro-CL: Roche

(MPO)

125J Wash Gammacounter

Keine der verschiedenen Signalarten (125J, Enzym,

Fluorophor, Luminophor) ist in der Summe aller Eigenschaften

der anderen eindeutig überlegen

14

EIA oder LIA oder FIA vs. RIA

Was unterscheidet einen RIA von den anderen IA

NUR die Signalart, sonst ist alles gleich !!!

Wer eine RIA abarbeiten und die Ergebnisse im klinischen Kontext bewerten kann, der kann auch mit nicht-Radioaktiven IA korrekt umgehen.

Welche konstruktiven Varianten von IA (RIA, EIA, LIA, FIA) gibt es ?

Nicht-Kompetitive IA vs. Kompetitive IA = IRMA vs. RIA

15

Bestandteile eines IA, Ablauf

„Standard“-Sandwich-Immunoassay: IRMA (Immun-RadioMetrischer Assay)• Ak1 an Festphase• Ak2 mit Signalträger (125J, andere Signalträger: analog)• Inkubation mit Probenantigenen• Waschschritt• Messung

Wash

16

Darstellung der Ag-Ak-Komplexe

Y

Y Vereinfachte Darstellung

Bisherige Darstellung

17

YY

YY

Y.............

SP-AK1 im Überschuss

.............

Signal-AK2 im Überschuss

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Wash

0 1 2 3 4 5 6

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

18

YY

YY

Y.............

SP-AK1 im Überschuss

.............

Signal-AK2 im Überschuss

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Analyt im Unterschuss

Wash

0 1 2 3 4 5 6

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

Relative untere Nachweisgrenze: 1

Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)

19

YY

YY

Y.............

SP-AK1 im Überschuss

.............

Signal-AK2 im Überschuss

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Analyt im Unterschuss

Wash

0 1 2 3 4 5 6

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

Relative untere Nachweisgrenze: 1

Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)

20

YY

YY

Y.............

SP-AK1

.............

Signal-AK2Analyt

Wash

.............

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

Maximales Signal

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

0 1 2 3 4 5 6

6 5 4 3 2 1 0

Relative untere Nachweisgrenze: 1

Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)

21

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Störung eines IRMA: High-Dose-Hook-Effekt

YY

YY

Y.............

SP-AK1 im Unterschuss

.............

Signal-AK2 im Unterschuss

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

0 1 2 3 4

6 5 4 3 2 1 0

Analyt im hohen Überschuss

.............

Wash

.............

.. ..

Maximales Signal

Bei extremen Analytkonzentrationen (z.B. hCG bei Blasenmole) steigt die Zahl von „einzelnen“ AK-Ag-Komplexen (vgl. Heidelberger Kurve) = eine steigende Anzahl von Ag-Signal-Ak-Komplexen wird weggewaschen. Das Mess-Signal (SP-AK1-Ag-Signal-Ak2) sinkt trotz steigender Analytkonzentration. Ein Signal (hier: relatives Signal „3“) kann zu mehreren Konzentrationen gehören (relative Konzentration „3“ oder zu einer extrem hohen Konzentration x).Hilfe: Wash nach SP-Ak1-Ag-Inkubation oder Verdünnungen herstellen und vermessen

x

22

Sandwich-Technik für alle Antigene geeignet ? NEIN !!!

Bestimmung von Steroiden oder Schilddrüsenhormonen ?

Östradiol: MG 272,3 Da

T4: MG 776,9 Da

Sehr kleine Analyte haben nur 1 Epitop, Bindung eines zweiten (Signal-) Antikörpers

an den Analyten ist nicht möglich andere Assaytechnik ist gefordert Markierung des Antigens (Assay-Ag: Ag ) kompetitive Immunoassays

Solid Phase

23

Kompetitive Immunoassays:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

SP-AK

Gesucht: Konzentration des Analyten in der Probe via Ag

Prinzip: Proben-Antigen und markiertes Assay-Antigen konkurrieren um die Bindungsplätze am Antikörper und belegen sie entsprechend ihrer Konzentrationsverhältnisse.Das Messsignal ist am höchsten, wenn kein Probenantigen vorhanden ist. Mit steigender Anzahl von Probenantigen werden immer mehr markierte Assay-Antigene verdrängt und das Messignal sinkt: Konzentrationsbestimmung möglich!

24

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

SP-AK

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

0 1 2 3 4 5 6SP-AK im Unterschuss

Markierter Analyt im Überschuss

25

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

SP-AK

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

0 1 2 3 4 5 6

Wash

SP-AK im Unterschuss

Markierter Analyt im Überschuss

26

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

SP-AK im Unterschuss

Markierter Analyt im Überschuss

Analyt in der Probe

0 1 2 3 4 5 6

Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3

Ag-Probe Ag-Assay

27

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

SP-AK im Unterschuss

Markierter Analyt im Überschuss

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Analyt in der Probe

0 1 2 3 4 5 6

Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3

Wash

Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!)

28

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung

YY

YY

SP-AK im Unterschuss

Markierter Analyt im Überschuss

Analyt in der Probe

Konzentrationsverhältnis: 18 : 6 = 3 : 1

0 1 2 3 4 5 6

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision)

Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!)

Wash

29

Sandwich-IA vs. kompetitiver IA = IRMA vs. RIA

0 1 2 3 4 5 6

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

6 5 4 3 2 1 0

Relatives Signal

Relative Konzentration:Standards (Analyt)

0 1 2 3 4 5 6

6 5 4 3 2 1 0

IRMA: • Relative untere Nachweisgrenze: 1 • Linear und steil ansteigende Standardkurve (= sehr gute Präzision)• Breiter Messbereich (Ak1,2-Erhöhung) mit sehr guter Präzision

RIA: • Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) • flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision)• eingeschränkter Messbereich mit akzeptabler Präzision

30

Zusammenfassung:

• Sehr gute Sensitivität• Sehr gute Präzision• Sehr weiter Messbereich• Sehr gute Spezifität• Sehr schnell

• Gute Sensitivität• Gute Präzision• Weiter Messbereich• Gute Spezifität• Schnell

Ist der Analyt ein Hapten:Kompetitiv = RIA

Ist der Analyt groß genug:Nicht-Kompetitiv = IRMA

RIA‘s unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA

Verschiedene (+/- gleichwertige) Signalarten

31

Vielen Dank für

Ihre Aufmerksamkeit !

32

33

Rili-BÄK

Aktuell = 4. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (gültig seit 15.02.2008)

Sie gilt für jeden, der analytische Messungen durchführt und stellt eine Vielzahl komplexer Anforderungen an das Management und das Personal in Laboren und Praxen!

Der heutige Fokus liegt auf Teil A und Teil B1 der Rili-BÄK:

Teil A betrifft die grundlegenden Anforderungen an die Qualitätssicherung

Teil B1 die QS quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen

34

Rili-BÄK

Teil A der Richtlinie fordert die Erstellung eines umfassenden Qualitätsmanagement-Systems zur Regelung der folgenden Bereiche:

1. Struktur (Organigramm, Zuständigkeiten…)2. Technische- und Personelle Ressourcen (Räume, Ausrüstung…)3. Präanalytik (Gewinnung, Transport, Vorbereitung Probenmaterial…)4. Analytik (Standardisierte Arbeitsanleitungen, Validierte

Untersuchungsverfahren…)5. Postanalytik (technische und medizinische Validation, Laborbericht…)6. Qualitätsmanagementhandbuch (QM-Ziele & Strategien,

Arbeitsprozesse…)7. Dokumentenlenkung (Versions-Nr., Freigabe, Schulung…)8. Umgang mit Beschwerden (Dokumentation, Korrekturmaßnahmen…)9. Fremdlaboratorien (Versanddokumentation, Kontrolle…)10.Fehlerhaften Untersuchungsergebnisse (Verfahrensbeschreibung…)

35

Rili-BÄK

Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS

Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a

1 lfd.

2 Analyt

3 Zulässige relative Abweichung des Einzelwertes bzw. des relativen quadratischen Mittelwertes

4 Gültigkeitsbereich der Spalte 3 und 5

5 Zulässige relative Abweichung beim Ringversuch

6 Zielwertart beim Ringversuch

von bis Einheit

57 Thyreotropes Hormon TSH

13,5 % 0,1 40 mU/l 24,0 % SW

59 freies Thyroxin fT4 14,0 % >20 >26

85 109

ng/l pmol/l

24,0 % SW

15,0 % 2 2,6

≤ 20 ≤ 26

ng/l pmol/l

63 freies Trijodthyronin fT3

14,5 % 1 1,5

25 39

ng/l pmol/l

24,0 % SW

SW = messmethodenspezifischer Sollwert

36

Rili-BÄK

Interne QS: alle vom medizinischen Laboratorium durchgeführten quantitativen Untersuchungen unterliegen der internen Qualitätskontrolle

Tabelle B1 Parameter

Non-B1 Parameter

Festgelegte Fehlergrenze gem. Tabelle B1/Sp3

Ermittlung der laborinternen FehlergrenzeMessung von mind. 15 Kontrollprobenwerten an 15 Tagen; zwischenzeitlich gelten die Herstellergrenzen

Retrospektiv: Nach Beendigung des Kontrollzyklus ist der relative quadratische Mittelwert der Messabweichung

(QMDM) zu errechnen

Zeitnah: Kontrollprobeneinzelmessung

37

Rili-BÄK

Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS

Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a

1 lfd.

2 Analyt

3 Zulässige relative Abweichung des Einzelwertes bzw. des relativen quadratischen Mittelwertes

4 Gültigkeitsbereich der Spalte 3 und 5

5 Zulässige relative Abweichung beim Ringversuch

6 Zielwertart beim Ringversuch

von bis Einheit

57 Thyreotropes Hormon TSH

13,5 % 0,1 40 mU/l 24,0 % SW

59 freies Thyroxin fT4 14,0 % >20 >26

85 109

ng/l pmol/l

24,0 % SW

15,0 % 2 2,6

≤ 20 ≤ 26

ng/l pmol/l

63 freies Trijodthyronin fT3

14,5 % 1 1,5

25 39

ng/l pmol/l

24,0 % SW

SW = messmethodenspezifischer Sollwert

38

Rili-BÄK

Konsequenz bei nicht Einhaltung der zulässigen relativen Abweichung

Überschreitet ein Kontrollprobeneinzelmesswert die vorgegebene Fehlergrenze, ist das Messverfahren vorläufig gesperrt; es muss nach der Ursache der Abweichung gesucht und diese beseitigt werden; die Messung wird wiederholt.

Überschreitet der relative quadratischen Mittelwert der Messabweichung (QMDM) einer Kontrollprobe, den in Tabelle B1a-c/Sp3 angegebenen oder den laborintern ermittelten Wert, ist das Untersuchungsverfahren für weitere Messungen von Patientenproben zu sperren. Das Messverfahren kann erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Funktionsfähigkeit des Verfahrens durch geeignete Maßnahmen festgestellt wurde.

Alle QS- Maßnahmen müssen lückenlos dokumentiert werden.

39

Rili-BÄK

Externe Qualitätssicherung (Ringversuche)

Für alle durchgeführten Analysen, der in Tabelle B1 a-c aufgeführten Parameter, ist die Teilnahme an einem Ringversuch pro Quartal Pflicht.

Die vollständige Richtlinie (incl. Tabelle B1a bis c) erhalten Sie auf der Homepage der Bundesärztekammer unter www.bundesaerztekammer.de

Für weitere Informationen und/oder die Zusendung des Scripts können Sie gerne Frau Regina Clotten (QMB euro-labor) unter der E-Mail Adresse: clotten@euro-labor-freiburg.de kontaktieren.

40

Kooperations-Möglichkeiten

Kostenbetrachtung

Reduzierung der Vergütung für SD-Parameter (GKV-EBM) 2000 und 2006 um je 30-60 !!!

„Herstellungskosten“ für Immunologische Parameter konstant / steigend (Personal, Geräte, Miete...)

Rili-BÄK – Zusätzliche Kosten!!!

Teil A: Qualitätsmanagemant (Handbuch etc.)

Teil B: Interne + Externe Qualitätskontrollen

z.B. 15-20 SD-Patienten/Tag >> 20 – 30.000,- € Kosten/Jahr

41

Kooperations-Möglichkeiten

Optimale Teste für SD-Parameter (unabh. Von Methode, Preis etc.)

> Eigenständiges Immunologisches Labor

> Mehrere Analysegeräte für unterschiedliche SD-Parameter

> Kontroll-Möglichkeiten für jeden einzelnen einsendenden Arzt

> Auswahl nach aktueller Qualität

(Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Ablauf etc.)

Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t

42

Kooperations-Möglichkeiten

Immunologische Laboratorium-Untersuchung

I Ärztlich Untersuchungsentscheidung (Indikation)

III Laboratoriumsmedizinische Analyse

II Präanalytik

IV ärztliche Beurteilung

43

Kooperations-Möglichkeiten

Immunologische Laboratorium-Untersuchung

Indikationsstellung, Präanalytik (Schritt I+II)

Qualitätsprüfung (Korrelation mit anderen Parametern, Verlauf, Therapiebeeinflußung etc.)Befundung (Schritt IV)

Immunologische Laboratorium-Untersuchung

in eigener Praxis

44

Kooperations-Möglichkeiten

Immunologische Laboratorium-Untersuchung

Technische Leistung (Schritt III) =

Laboratoriumsmedizinische Analyse

(zentral erbracht)

Immunologische Laboratorium-Untersuchung

„im ausgelagertem Labor“

45

Kooperations-Möglichkeiten

Eigenständiges Abrechnen

Modell „Immunologie Freiburg“

Erste von der KV genehmigte überörtliche Leistungserbringergemeinschaft zur Erbringung immunologischer Untersuchungen in Deutschland

Schritte I, II, IV in eigener Praxis

Schritt III in Rahmen „Immunologie Freiburg“

46

Kooperations-Möglichkeiten

eigenständiges Abrechnen

Systematik des §15 Abs. 3 BMW-Ä:

Die Leistung wird als eigene Leistung desjenigen Arztes abgerechnet, wenn Schritt 1, 2, 4 in eigener Praxis und Schritt 3 in Rahmen der Leistungserbringergemeinschaft „Immunologie Freiburg“ im Auftrag des Arztes durch einen anderen erbracht wird.

Mitgliedschaft in „Immunologie Freiburg“ bedeutet eigenständige Leistungserbringung!