Ingo Rechenberg

PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung „Biosensorik / Bionik II“

Wie baut man einen Biosensor ?

Zwischen Bionik und Biotechnologie

Weiterverwendung nur unter Angabe der Quelle gestattet

Biotechnologie versus Bionik

Lotus Effekt

Biotechnologie

Bionik

versus

Lotusblumen Zellkultur

Erkundung des Effekts

Enthält Pflanzenextrakte

Synthetisches Produkt

Photobiologische

Wasserstoffproduktion

Biotechnologie

Bionik

versus

Heterocyste

Vegetative ZelleH O2

O2

H2N

2

2 2

COCH O

2

2<

<

O H

Algen-Analoga Bakterien-Analoga

2H

BlaualgeNostoc muscorum

Konstruktion eines

Schallschnelle-Vektormessgeräts

Partikel Geschwindigkeit

Biotechnologie

Bionik

versus

Technische Schaltung

Der bionische Ansatz

AC

Rezeptor

G-Protein

ATP

ATP

ATPcAMP

cAMP

cAMP cAMP cAMP

cAMP

cAMPAC = Adenylcyclase

cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat

Einmoleküldetektion durch eine Enzymkaskade Duftstoff

Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft

1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor

2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein

3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)

4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP

5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an

6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen

7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal

Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft

1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt

2. Es entsteht Metarhodopsin

3. Metarhodopsin zerfällt in Opsin und all-trans Retinal

4. Metarhodopsin aktiviert Transducin

5. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE)

6. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP

7. Dadurch schliessen sich Na-Kanäle

8. Es kommt zu einer Hyperpolarisation

9. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV

3 000

2 000

Molekulare Verstärkung: 6 000 000

Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !

NS

N

S

NS

oder

Mechanisches Modell der Wirkung eines Katalysators

NS

N

S

Mechanisches Enzym

NS

NS

NS

NS

NS

NS

NS

· · ·1000

· · ·1000

1000

1000 000

NS

1000 000

An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten

Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden

Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten

Hypothetisches Beispiel:

Konstruktion eines Magensäure-Biosensors

Pepsinogen: Kann noch kein Eiweiß spalten !

Magensäure

Pepsin: Kann Eiweiß spalten.

In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden

Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix

Kovalente atomare Bindung des Enzyms

Enzym in semipermeabler Membran-Hülle

Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms

Enzym

Technisches Substrat

Enzym-Vernetzung

Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen

Immobilisiertes

Magensäure

Messung desEiweiß-Spaltprodukts

Eiweißspaltung

PepsinogenPepsin

Messlösung

Elek

trode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?

Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt

Text

Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode

VElektrode 1 E lektrode 2Leitende Brücke

E lektrolyt

M etallstab

E lektro lyt

Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so werden an der Phasengrenze Ladungsträger verschoben. Die Potenzialdifferenz ist aber separat nicht messbar.

Um das Potenzial zu messen ist eine zweite (Ableit)elektrode notwendig !

Elektrochemische Zelle

Bei der Amperometrie wird an die Elektroden ein konstantes Potenzial gelegt und der dadurch resultierende Stromfluss gemessen.

Arbeitselektrode Referenze lektrode

E lektro lyt

A

Angelegtes Potenzial

z. B. 600 mV

)(red

oxln cc

FzTRU

Konzentrationselement

NERNSTsche Gleichung

Semipermeable Membran A gA g e- e-e-

U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration

U

NO3

cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels

cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels

G lucose O 212

G lucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal

G lucono-lactonase

G luconsäure H ++

Kalorimetrie

Am perom etrieLum ineszenz

pH-E lektrodeM O SFET

Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz

Technische Messaufnehmer

für einen Glukose-Sensor

S cha lt-kre is

S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nze igegerä t

S ensor

Schema eines Biosensors

AnalytlösungSelektor

(Rezeptor) Effekt Transducer

Elektrode

Thermistor

Piezokristall

Verstärker

Chem ischeSubstanz

Tem peratur

Licht

Masse

ElektrischesPotenzial

Ele

ktr

isc

he

s S

ign

al

Funktionsprinzip eines Biosensors

Therm odynam ik

M ikrogravim etrie P hotom etrie

E lektrochem ie

Transducer

K a lo rim etrie

M echan ik O ptik

P o ten tiom etrieA m perom etrieK onduktom etrie

Tem pera turm essungW ägung

Lum ineszenz-, Farb -M essung

S pannungs-, S trom -, W iders tands-M essung

Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.

Foto

: For

schu

ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Knoblauch

Foto

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schu

ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Zyanid

Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.

Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.

Der Penicillinsensor besteht auseinem Schichtpaket aus Aluminium, p-dotiertem Silizium, Siliziumdioxid,pH-empfindlichem Siliziumnitridund dem Penicillin abbauendenEnzym Penicillinase. Das Enzymist mit “Cross-Linker-Molekülen” an die Oberfläche gekoppelt. Taucht der Sensor in eine penicillinhaltige.Lösung, werden bei der enzymati-schen Reaktion Wasserstoffionenfrei. Diese lagern sich an die Silizi-umnitridoberfläche an und ändern die elektrische Kapazität desSchichtpaketes.

Penicillin-Biosensor

Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment

VerkapselungPlatinelektrode

Siliziumchip

Aktive Sensoroberfläche

Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix

SiO2

300 m µ

130 m µ

Glukosesensor in Mikrosystemtechnik

G ehäuse

Source (Quelle)

G ate (Tor)M em bran

Enzym gem isch

Drain (Senke)Isolator

Spannungsquelle S trom m essgerät

A

pn n

Referenzelektrode

Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)

Isolatoren Halbleiter Metalle

Kunststoffe

GlasGlimmer

DiamantQuarz

Selen

Germanium

Silizium

10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8

Silber

Eisen

Leitfähigkeit 1 m

Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.

Silizium

Bor

Phosphor

p-dotiert

n-dotiert

Elektronenle itung und Löcherle itung

im dotierten H alb le iter

“Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken

n-dotiert p-dotiert

+

SperrschichtDurchlass+

Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher

MOSFET

p-dotiert

n n

p

n-dotiert

DrainSourceGate

Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.

Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor

n n

p

SG

D

p-dotiert

n-dotiert

MOSFET

Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke.

n n

p

S DG

p-dotiert

n-dotiert

CEMFET BIOFET

Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.

Signalmolekül

Rezeptor

Membran

Ionen

VImmobilisierte Enzyme

n n

p

S DG

Vergleich

Na+-Tore / BIOFET

A

A

Die Elektronenröhre

Ein steuerbares Tor

Extreme Empfindlichkeit

Selektivität auf biologische Stoffe

Was zeichnet den Biosensor aus ?

Extreme Empfindlichkeit

Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode

Glukose: Amperometrischer Biosensor

Harnstoff: Potentiometrischer Biosensor

Amperometrischer BiosensorLactat:

Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay

Piezoelektrizität Immunoassay

Candida albicans:

Cholesterin: Amperometrischer Biosensor

Penicillin:

Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:

Potentiometrischer Biosensor

Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode

Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-Sensor

pH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode

Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik

Zyanid-Biosensor

Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3

Anthrax-Biosensor

Harnstoff-BiosensorEnzym Urease

Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak

Enzym ???

Enzyme für Biosensoren

Ende

Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.