Ingo Rechenberg PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung Biosensorik / Bionik II Wie baut man einen...
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Ingo Rechenberg
PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung „Biosensorik / Bionik II“
Wie baut man einen Biosensor ?
Zwischen Bionik und Biotechnologie
Weiterverwendung nur unter Angabe der Quelle gestattet
Biotechnologie versus Bionik
Lotus Effekt
Biotechnologie
Bionik
versus
Lotusblumen Zellkultur
Erkundung des Effekts
Enthält Pflanzenextrakte
Synthetisches Produkt
Photobiologische
Wasserstoffproduktion
Biotechnologie
Bionik
versus
Heterocyste
Vegetative ZelleH O2
O2
H2N
2
2 2
COCH O
2
2<
<
O H
Algen-Analoga Bakterien-Analoga
2H
BlaualgeNostoc muscorum
Konstruktion eines
Schallschnelle-Vektormessgeräts
Partikel Geschwindigkeit
Biotechnologie
Bionik
versus
Technische Schaltung
Der bionische Ansatz
AC
Rezeptor
G-Protein
ATP
ATP
ATPcAMP
cAMP
cAMP cAMP cAMP
cAMP
cAMPAC = Adenylcyclase
cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat
Einmoleküldetektion durch eine Enzymkaskade Duftstoff
Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft
1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor
2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein
3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)
4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP
5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an
6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen
7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal
Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft
1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt
2. Es entsteht Metarhodopsin
3. Metarhodopsin zerfällt in Opsin und all-trans Retinal
4. Metarhodopsin aktiviert Transducin
5. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE)
6. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP
7. Dadurch schliessen sich Na-Kanäle
8. Es kommt zu einer Hyperpolarisation
9. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV
3 000
2 000
Molekulare Verstärkung: 6 000 000
Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade
Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !
NS
N
S
NS
oder
Mechanisches Modell der Wirkung eines Katalysators
NS
N
S
Mechanisches Enzym
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
· · ·1000
· · ·1000
1000
1000 000
NS
1000 000
An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten
Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden
Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten
Hypothetisches Beispiel:
Konstruktion eines Magensäure-Biosensors
Pepsinogen: Kann noch kein Eiweiß spalten !
Magensäure
Pepsin: Kann Eiweiß spalten.
In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden
Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix
Kovalente atomare Bindung des Enzyms
Enzym in semipermeabler Membran-Hülle
Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms
Enzym
Technisches Substrat
Enzym-Vernetzung
Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen
Immobilisiertes
Magensäure
Messung desEiweiß-Spaltprodukts
Eiweißspaltung
PepsinogenPepsin
Messlösung
Elek
trode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?
Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt
Text
Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode
VElektrode 1 E lektrode 2Leitende Brücke
E lektrolyt
M etallstab
E lektro lyt
Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so werden an der Phasengrenze Ladungsträger verschoben. Die Potenzialdifferenz ist aber separat nicht messbar.
Um das Potenzial zu messen ist eine zweite (Ableit)elektrode notwendig !
Elektrochemische Zelle
Bei der Amperometrie wird an die Elektroden ein konstantes Potenzial gelegt und der dadurch resultierende Stromfluss gemessen.
Arbeitselektrode Referenze lektrode
E lektro lyt
A
Angelegtes Potenzial
z. B. 600 mV
)(red
oxln cc
FzTRU
Konzentrationselement
NERNSTsche Gleichung
Semipermeable Membran A gA g e- e-e-
U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration
U
NO3
cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels
cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels
G lucose O 212
G lucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal
G lucono-lactonase
G luconsäure H ++
Kalorimetrie
Am perom etrieLum ineszenz
pH-E lektrodeM O SFET
Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz
Technische Messaufnehmer
für einen Glukose-Sensor
S cha lt-kre is
S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nze igegerä t
S ensor
Schema eines Biosensors
AnalytlösungSelektor
(Rezeptor) Effekt Transducer
Elektrode
Thermistor
Piezokristall
Verstärker
Chem ischeSubstanz
Tem peratur
Licht
Masse
ElektrischesPotenzial
Ele
ktr
isc
he
s S
ign
al
Funktionsprinzip eines Biosensors
Therm odynam ik
M ikrogravim etrie P hotom etrie
E lektrochem ie
Transducer
K a lo rim etrie
M echan ik O ptik
P o ten tiom etrieA m perom etrieK onduktom etrie
Tem pera turm essungW ägung
Lum ineszenz-, Farb -M essung
S pannungs-, S trom -, W iders tands-M essung
Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.
Foto
: For
schu
ngsz
entru
m J
ülich
Biosensor für Knoblauch
Foto
: For
schu
ngsz
entru
m J
ülich
Biosensor für Zyanid
Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.
Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.
Der Penicillinsensor besteht auseinem Schichtpaket aus Aluminium, p-dotiertem Silizium, Siliziumdioxid,pH-empfindlichem Siliziumnitridund dem Penicillin abbauendenEnzym Penicillinase. Das Enzymist mit “Cross-Linker-Molekülen” an die Oberfläche gekoppelt. Taucht der Sensor in eine penicillinhaltige.Lösung, werden bei der enzymati-schen Reaktion Wasserstoffionenfrei. Diese lagern sich an die Silizi-umnitridoberfläche an und ändern die elektrische Kapazität desSchichtpaketes.
Penicillin-Biosensor
Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment
VerkapselungPlatinelektrode
Siliziumchip
Aktive Sensoroberfläche
Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix
SiO2
300 m µ
130 m µ
Glukosesensor in Mikrosystemtechnik
G ehäuse
Source (Quelle)
G ate (Tor)M em bran
Enzym gem isch
Drain (Senke)Isolator
Spannungsquelle S trom m essgerät
A
pn n
Referenzelektrode
Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)
Isolatoren Halbleiter Metalle
Kunststoffe
GlasGlimmer
DiamantQuarz
Selen
Germanium
Silizium
10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8
Silber
Eisen
Leitfähigkeit 1 m
Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.
Silizium
Bor
Phosphor
p-dotiert
n-dotiert
Elektronenle itung und Löcherle itung
im dotierten H alb le iter
“Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken
n-dotiert p-dotiert
+
SperrschichtDurchlass+
Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher
MOSFET
p-dotiert
n n
p
n-dotiert
DrainSourceGate
Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.
Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor
n n
p
SG
D
p-dotiert
n-dotiert
MOSFET
Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke.
n n
p
S DG
p-dotiert
n-dotiert
CEMFET BIOFET
Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.
Signalmolekül
Rezeptor
Membran
Ionen
VImmobilisierte Enzyme
n n
p
S DG
Vergleich
Na+-Tore / BIOFET
A
A
Die Elektronenröhre
Ein steuerbares Tor
Extreme Empfindlichkeit
Selektivität auf biologische Stoffe
Was zeichnet den Biosensor aus ?
Extreme Empfindlichkeit
Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode
Glukose: Amperometrischer Biosensor
Harnstoff: Potentiometrischer Biosensor
Amperometrischer BiosensorLactat:
Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay
Piezoelektrizität Immunoassay
Candida albicans:
Cholesterin: Amperometrischer Biosensor
Penicillin:
Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:
Potentiometrischer Biosensor
Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode
Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-Sensor
pH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode
Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik
Zyanid-Biosensor
Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3
Anthrax-Biosensor
Harnstoff-BiosensorEnzym Urease
Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak
Enzym ???
Enzyme für Biosensoren
Ende
Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.