Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Teil 2Qualitätskontrolle

Trennmethoden

Analytische Verfahren

Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover

Klinische ChemieTel.: 0511-5323940

Quantitative Messung: Einheiten, SI-Konformität

Stoffmenge: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse bekannt ist, in mol beziffert.

Substanzkonzentration: mol/l, mmol/l, µmol/l…

1 Mol jedes Stoffes enthält 6,023 x 1023 Teilchen (Avogadro-Konstante)Beispiel: 1 Mol Wasser sind 18 g (1x16 (O) + 2x1 (H))

Substanzmasse: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse unbekannt ist, in kg (bzw. abgeleiteten Größen) beziffert.

Massenkonzentration: kg/l, g/l, mg/l…

Katalytische Aktivität eines Enzyms: U/l1 Unit (U) ist die Enzymmenge, die 1 µmol Substrat pro Minute bei gegebener Temperatur und Reaktionsbedingungen umsetzen kann.

nicht SI-konform (SI: Système internationale d‘ Unités)

Analytik im Überblick

Nachweisgrenze: Mindestkonzentration eines Analyten, die sicher von Null unterschieden werden kann

Mehrfachmessung analytfreier Probe: Nachweisgrenze = Mittelwert + 3 x SD

Linearitätsgrenze: Messbereich zwischen Nachweisgrenze und Linearitätsgrenze (Verdünnungsgrenze)

Analytische Sensitivität: Maß für Nachweisvermögen einer Methode.Bedeutet auch die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereichs, die sicher unterschieden werden kann.Kritische Differenz = 3 x SD (der Methode)

Analytische Spezifität: das Vermögen des analytischen Verfahrens in der Probe nur die gesuchte Messgröße zu erfassen

SD: Standardabweichung

Einschub: Normalverteilung - Kenngrößen

• Zentrale Tendenz: Mittelwert (MW)• Streuung der Werte: Standardabweichung (s)• Relative Streuung: Variationskoeffizient (Vk)• 95% Vertrauensbereich MW ± 1,96 s• Statistische Teste (Beispiele für zwei Gruppen) – t-

Test (gepaart für abhängige [z.B. vorher und nachher– gleiche Probanden]; ungepaart für unabhängige[z.B. Vergleich zweier Gruppen – Glucose beiMännern und Frauen] Variabeln)

Statistische Ermittlung von parametrischen Kenndaten

2

1

2

1

2

1

_

)(1

1

)(1

1

1

xxn

xxn

n

n

iii

n

iii

n

in

s

s

xx

−−

=

−−

=

=

∑

∑

∑

=

=

=

Mittelwert der Stichprobe vom Umfang n

Varianz der Stichprobe

Standardabweichung der Stichprobe

Die Anzahl der Wiederholmessungen soll n = 20 - besser n = 30 - sein

100.(%)xst

tVK =

Variationskoeffizientaus Standardabweichung und Mittelwert berechnet.

Qualitätskontrolle im Überblick

Ziele:Kontrolle der zufälligen Fehler.Kontrolle der systematischen Fehler über den gesamten klinisch-relevanten Messbereich.Kontrolle jeder Analysenserie (umfasst längstens acht Stunden).Anwendbarkeit in allen Laboratorien.

Vorschriften zur Durchführung der Qualitätskontrolle in med. Laboratorien und Anforderungen bzgl. Güte der Messungen für 87 Messgrößen festgelegt in Richtlinien der Bundesärztekammer (RILIBÄK): Maximal zulässige Unpräzision(Anlage 1, Spalte 5), Maximal zulässige Unrichtigkeit (Anlage 1, Spalte 6), Maximal zulässige Abweichung des Einzelwertes (Anlage 1, Spalte 7)

Hierarchie der GesetzgeberEU – 98/79/EG – (IVD-Richtlinie)

D – Medizinproduktgesetz (MPG) gültig bis Dez 2001 [Originalversion]

Notwendigkeit zur Erweiterung um in vitro Diagnostika

2. Gesetz zur Änderung des Medizinproduktgesetzes (Anpassung des MPG an 98/79) – gültig ab Jan 2002

Rechtsgrundlage für Rili-BÄK (Richtlinien der Bundesärztekammer):Medizinprodukte-Betreiberverordnung (MPBetreibV)

§4a – Kontrolluntersuchungen und Vergleichsmessungen in Medizinischen Laboratorien (QK; RV; Validierung)

Qualitätskontrolle im Überblick

Richtigkeitskontrolle: Abweichungen von einem definierten Zielwert, lässt systematische Fehler erkennen (Unrichtigkeit).

Präzisionskontrolle: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Messung, Erkennung grober und zufälliger Fehler.Auch mittels Labor-EDV errechenbar aus RichtigkeitskontolldatenMittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient (VK)

Ringversuche: externe Richtigkeitskontrolle, zentral durch Ringversuchsleiter (Referenzinstitition der DGKL, INSTAND eV...), Erlangung von RV-Zertifikaten.

Qualitätskontrolle im Überblick

Kontrollen: Es werden zur Überwachung von Richtigkeit und Präzision ausschließlich Richtigkeitskontrollen verwendet.

Kalibratoren:primärer Standard: Kalibrationsstandard aus abgewogener (ideal) Reinsubstanz gelöst in reinem Lösungsmittel.

Material soll keine Komponenten enthalten,die einen unspezifischen Beitrag zum Messsignalliefern.

sekundärer Standard: Masse kann nur indirekt durch chem. Analyse ermittelt werden, wenn exakte Einwaage nichtmöglich ist (z.B. bei konstanter Restfeuchte (Albumin))Matrixhaltig: enthält die gleichen Haupt- und Nebenbestandteile wie die Patientenproben

Dokumentation laborinterner Qualitätskontrolle

(105,6-103) : 3 = 0,87 = 1SDSDx100/103 = 0,84 = %VK max. Impräzision: Mittelwert + 3 SD

Dokumentation externer Qualitätskontrolle

YOUDEN-Diagramm zur Darstellung aller Teilnehmerergebnisse.Zielwerte im Zentrum des Diagramms.Quadrat zeigt die Bewertungsgrenzen nach RILIBÄK an.Zertifikate der Referenzinstitution nur für Teilnehmer innerhalb dieses Quadrates.

RV nicht bestanden?Überprüfung der Berechnung/ProtokolleÜberprüfung der internen Qualitätskontr.Abschätzung des Fehlertyps(grob/systematisch aus graphischer Auswertung)Vergleich mit anderen TeilnehmernDurchführung verstärkter interner Qualitätskontrolle

Zum Nachdenken

z.B. S-ChloridWert [mmol/l]

Tag 1 100

Tag 2a 102Tag 2b 105

Max. Impräzision der Methode beträgt 2,5%

Anstieg des S-Chloridoder nicht im Fall a oder b?

Kritische Differenz = 2 √2 x SD (3 x SD)

Trennmethoden in der Klinischen ChemieBeispiel Prinzip

Ausfällung Ausfällen von Proteinen Erzeugung von unlöslichen durch Trichloressigsäure Niederschlägen

Sedimentation Abtrennung der Blutkörperchen Höhere rel. Dichte der suspendiertenvom Plasma Teilchen

Zentrifugation Abtrennung der Blutkörperchen Beschleunigung dervom Plasma Sedimentationsgeschwindigkeit (2000g)

UltrazentrifugationTrennung von Zellkomponenten hohe Beschleunigung der Sed.geschw.(z.B. 100.000-500.000 g)

Filtration Klären von trübem Urin Abtrennung von festen Partikelndurch Filter

Ultrafiltration Proteinanreicherung im Urin, Liquor Abtrennung gelöster makromolekul.Stoffe von niedermolekularen

Elektrophorese Trennung von Proteinen Unterschiedliche Wanderungs-geschwindigkeit im elektr. Feld

Chromatographie Auftrennung von Proteinen, Auftrennung von Stoffgemischen durch Pharmaka, Drogen.... unterschiedliche Verteilung in mobiler

und stationärer Phase

Extraktion Abtrennung hydrophober von Löslichkeit in organ. Lösungsmittelnhydrophilen Substanzen

ChromatographieUnterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei verschiedenen Phasen, genauer gesagt an den Phasengrenzflächen dera) stationären (unbeweglichen) Phase, b) mobilen (beweglichen) Phase

Voraussetzung: Beide Phasen sind nicht mischbar

Man unterscheidet zwischen:Dünnschichtchromatographie, PapierchromatographieSäulenchromatographie

Trennprinzipien:• Adsorptionschromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Gelchromatographie• Affinitätschromatographie

Rf-Wert:Laufstrecke der Substanz ab StartlinieLaufstrecke der Lösungsmittelfront ab Startlinie

Dünnschichtchromatographie

Stationäre Phase:meist polares Adsorbens in Solvathülle (dünne Wasserschicht)(z.B. Kieselgel, Al2O3)

Mobile Phase (Fließmittel):Gemisch organischer Lösungsmittel

Messgröße zur Auswertung:Retentionswert Rf

SäulenchromatographiePrinzip Ionenaustausch

Man unterscheidet:AnionenaustauscherKationenaustauscher

Stationäre Phase:org. Ionenaustauscherharze, tragen elektrostatisch gebundene OH-- bzw H+-Ionen

Mobile Phase (Fließmittel):Wässrige Lösung, Säure bzw. Lauge zur Regeneration

SäulenchromatographiePrinzip Gelchromatographie

Je größer ein Teilchen ist, umso schneller wandert es bei der Gelchromatographie durch die Säule (umgekehrter Siebeffekt)

Stationäre Phase:Poröse (schwammartige) Trägermaterialien von einheitlichen Durchmesser (z.B. aus Polydextran, Agarose, Polyacrylamid)

Mobile Phase (Fließmittel):z.B. wässriger Puffer

hochmolekulare Substanzen im Ausschussvolumen V0niedermolekulare Substanzen im Totalvolumen Vt

ChromatographieEine Automatisierung chromatographischer Methoden führt generellauch zu einer Ankopplung an ein analytisches Nachweisverfahren hierbei in Form eines entsprechenden Detektorssolche chromatographischen Systeme können folgendermaßen benannt sein:HPLC High Performance Liquid ChromatographyLC Liquid ChromatographyGC Gas ChromatographyBei der Vielzahl möglicher Detektionsformen spielt vor allem die Massenspektroskopie (MS) ein besondere Rolle.In Kombination mit GC: GC-MSDurch Elektronenstoß entstehen bei der MS positiv geladene Fragmente einer Substanz, die in charakteristische Größe und Anzahl auftreten (molek. Fingerabdruck)

Auftragung Intensität vs. Masse/Ladung

Auftragung Intensität vs. Zeit

Elektrophorese: SerumelektrophoreseWanderung in Lösung befindlicher Teilchen beim Anlegen einer Gleichspannung

Geschwindigkeit der Moleküle ist proportional der Feldstärkeund der Molekülladung und umgekehrt proportional der Molekülgröße

Serumelektrophoreseauf Celluloseacetatfolie als Trägermaterial

Elektrophorese: SDS-PAGE

PAGE: Polyacrylamid-GelelektrophoreseSDS: Natrium-Dodecylsulfat, amphophile Substanz, die sich mit zu untersuchenden Proteinen verbindet, negative Außenladung, Wanderungsgeschwindigkeit nur noch von Molekülmasse abhängig

Analytische Verfahren in der Klinischen Chemie

Beispiel Prinzip

Potentiometrie pH-Messung Potentialmessung

Coulometrie Coulometrische Chlorid-Bestimmung Messung der Strommenge

Kryoskopie Osmolalität von Serum/Urin Gefrierpunktserniedrigung

Optische Messmethoden

Photometrie Protein-Bestimmung mit Messung der Absorbance(Spektrometrie) Biuretreagenz

Flammenphotom. Natrium im Serum/Urin Messung der Lichtemission

Atomabsorptions- Kupfer im Urin Messung der atomarenspektrometrie Absorption

Densitometrie Elektrophoreseauswertung Messung der Lichtdurchlässigkeit

Turbidimetrie Immunglobulin-Bestimmung Trübungsmessung

Nephelometrie Streulichtmessung

Fluorimetrie DNA/RNA-Bestimmung Fluoreszenzmessung

Proteinbindung Tumormarker-Bestimmung Enzymimmunoassay

Empfindlichkeit analytischer Verfahren

Spektroskopie: Photometer (Grundbausteine)

Spektroskopie: (Geräteaufbau eines Einstrahlphotometers)

SpektroskopieLichtquellen

man unterscheidetzwischen:LinienstrahlerKontinuumstrahler

Ziel ist die Generierung monochromatischen Lichtes

Spektroskopie: Lambert-Beersches Gesetz

Absorbance A hat Messbereich von Null bis UnendlichI = I0 A = 0I = 0 A = Unendlich

Transmission T (I/I0) hat Messbereich von 0 bis 1

log 1/T = A

I = I0 T = 1 (%T = 100)I = 0 T = 0

log Io/I = A = ac x c x d

A: Absorbance (im Deutschen früher Extinktion E)(spektrales dekadisches Absorptionsmaß)

ac: Proportionalitätsfaktor (Extinktionskoeffizient)c: Schichtdicke in cmd: Konzentration in mol/l