Molekulargenetische AB0-Typisierung

Dr. G. Heymann

Einsatzgebiete

• Serologische Bestimmung ist unmöglich:– Vortransfusion– KMT

• Serologie ergibt unklare Ergebnisse

• Pränataldiagnostik

• Familienstammbaum

• wissenschaftliche Fragestellungen

Bisherige Fragestellungen

• Antigenseite paßt nicht zur Serumseite– schwaches Antigen?

• Serumseite paßt nicht zur Antigenseite

• multiple Vortransfusion

• auffälliger Bed-side Test

• Neugeborenes / Mutter

• Chimärismus

Bisherige Fragestellungen II

• Von 157 ausgewerteten Untersuchungen– betrafen 57 (36%) AB0-System– im Vergleich:– Rhesus 80 (51%), HTLA 11 (7%), andere

(MNS, K, Fy, Jk) 9 (6%)– Im AB0-System konnten 67% problemfrei

aufgeklärt werden.– Weitere 16% ergaben bedingt ein Ergebnis.

Bisherige Fragestellungen IIIPCR-Vermögen nach Anforderung

12

67

5

8

2

21

1

3

4

3

1

1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

schwaches A schwaches B Blutgruppe Familie SerumseiteSerumseite

nein

bedingt

ja

Ca. 25%

Generelle Probleme

• Nachweis eines Polymorphismus der AB0-Transferase ist nur indirekte Blutgruppen-bestimmung.

• Bestimmung einer Variante basiert allein auf dem Ausschluß von „Unnormalem“.

• Molekulargenetische Nomenklatur ist uneinheitlich und nicht mit Serologie vergleichbar.

AB0-Blutgruppen

AB0-Blutgruppen

N-Acetylgalaktosamin an verzweigten Ketten

Sequenzen

Alle

l

261

297

467

526

657

703

796

803

930

1059

A101 G A C C C G C G G C0o1 xA201 T xB101 G G T A A C A

Exon 6 Exon 7

Spezifisch für 0 Spezifisch für B Spezifisch für B

0o20o3A104A204Ax02

0o80o9A102A103Ael02

0o3A204A206

0o9A203

024A204A206

Spezifisch für B

0o8A302Aw02Aw03

Prinzip der PCR-SSP

Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

Prinzip der PCR-SSP

5´

3´

3´

5´

Primerannealing bei 37 - 72°C

Antisenseprimer

Senseprimer

Prinzip der PCR-SSP

5´

3´

3´

5´

Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C

Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon-gation, bis PCR-Cyclen beendet.

Auflösungsvermögen

• Die PCR-SSP erkennt (nur!?) bekannte Varianten

• Watanabe 8 Mixe A/01,B/01,01,01,02,B,A2,Alle(A2)

• Kommerziell 8 Mixe 01, n01, 02, n02, B, nB, A2, nA2

– InnoTrain, BAG

• Eigene PCR 48 Mixe

• Hannover 96 Mixe

• Ausschluß um so besser möglich, je mehr Varianten erkannt werden.

Besondere BefundePruß A, Heymann GA et al., Acute intravascular hemolysis after transfusion of a chimeric RBC unit.

Transfusion 2003; 43: 1449-51

M .K oh lh o ffB ru d erd on or

0 / 0 (B )

M u tte rke in e D N A

V ate rve rs to rb enke in e D N A

M . K oh lh o ffS ch w es te r

0 / 0 (B )

V a te rg esch ied enke in e D N A

Toch te rB / 0

Alle

l

261

297

796

802

1059

A101 G A C G C0o1 x0o2 x G0o3 G AA201 xB101 G A

Besondere Befunde

523 526

Spenderin wurde initial als B bestimmt. Beim Bed-side Test ausKonserve fiel ein schwaches A auf.

721

261

297

523

526

657

703

721

796

803

930

GX R R S Y R Y M S RA101 G A G C C G C C G GAw04 TA new A TB101 G G T A A C A

Prinzip der Sequenzierung

5´

3´

3´

5´

Primerannealing bei 37 - 72°C nach Denaturierung

Sequenzierprimer

Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon-gation, bis Cyclen beendet. Es entstehen verschiedenlange Ketten, die aufgetrennt werden können.

Prinzip der Sequenzierung

5´

3´

Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C bis Kettenabbruch

Nondeletionale 0 AlleleA. Seltsam, Arbeitsgruppentagung, Hannover 2004

• Es gibt AB0-Transferase, die keine Deletion an 261 zeigen, jedoch eine große Anzahl von Mutationen aufweisen.

• Diese „0-Allele“ zeigen kaum Aktivität.• Es kommt jedoch, zumindest bei 0o3, zu einer

nachweisbaren Menge von A auf den Erys. Dies reicht aus, um Isoagglutinine zu supprimieren.

• Bisher hier 4 Fälle mit antigenseitig 0, serumseitig A.

261

297

467

526

646

681

771

800

802

829

893

927

1059

A101 G A C C T G C G G G C C C0o3 G G A0o8 T +G x014 T T015 A

Nomenklatur• Die Allele wurde v.a. nach der serologischen Reaktivität der

Erstbeschreibung benannt.• Diese deckt sich fast nie mit der Reaktivität der gleichen Allele

bei späteren Patienten.• Beispiele für Benennung:

– 0o1: auch 01, 0a– 0o6: auch 0v1, 0tlse1– A201: auch A105, A2, Aw-1– cisAB01: auch C101

• Von 3 Ael Verdachtsfällen waren bisher 2 Ax01 und 1 A104, keines Ael01(A109, Ael1) oder Ael02(A110, Ael2).

Besonderheit: 1 Transferase = 2 Antigene

• Es gibt Allele, die eine Konjugierung mit Gal und N-Ac-Gal gleichermaßen vermitteln.

• Phänomen des Cis-AB 29

7

467

526

657

700

703

796

803

930

A101 A C C C C G C G GB101 G G T A A C AB(A)01 G G A C AB(A)02 G G T G A A C AcisAB01 T CcisAB02 G T A CcisAB03 G G T T A A C A

Kosten

• Pro Primer 0,02 Euro60 versch. Primer =1,20 Euro– Für Platin Taq 3,56 Euro

– Für PCR-Puffer 1,- Euro

– Gel, Photo, Puffer 1,50 Euro

– DNA-Isolierung 3,- Euro

• kommerziell (BAG) 250,-Euro / 10 Tests• pro Test In House ca. 10,- Euro

kommerziell ca. 30,- Euro (weniger Verbrauchsmaterial)

• Dauer: min. ca. 3 h

Fazit

• Die Fragestellung entscheidet essentiell über den Aufwand, der betrieben werden muß.

• Die Ursache für serologisch unklare AB0-Bestimmungen ist nur in seltenen Fällen eine Mutation.

• Es ist meist keine direkte Aussage zur vermutlichen serologischen Reaktivität möglich.

Literatur zum Nachlesen• Zur PCR:

– Watanabe et al. Human Genetics 1997;99;34-37– Yip. Blood 2000;95;1487ff– Gassner et al. Blood 1996; 88; 1852-1856

• Zu einzelnen Allelen:– Yamamoto et al. Vox sanguinis 1993; 64; 116-119 und 171-174 und

175-178– Yamamoto et al. Vox sanguinis 1995; 69; 1-7– Olsson et al. Blood 2001; 98; 1585ff

• Im Internet:– Blood Group Antigene Gene Mutation Database:

http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/abo.htm