Vorbereitung

Strukturfaktoren als Vektoren in

der komplexen Zahlenebene

Das Ziel

• Rezept zur Berechnung der Elektronendichte

• Benötigt die Strukturfaktoren, Fhkl

• Jeder Strukturfaktor, Fhkl, ist eine komplette

Beschreibung des gebeugten Strahles, der als

Reflex hkl aufgenommen wird.

• Fhkl wird duch drei Größen beschrieben:

Frequenz, Amplitude, Phase

Phasenproblem

• Von den drei Größen, die die Strukturfaktoren,

Fhkl , beschreiben, kennen wir nur zwei:

Die drei Frequenzterme sind die Indices h,k,l

einer Gruppe paralleler Ebenen, die den Reflex

hkl produzieren.

Die Amplitude ist proportional zu (Ihkl)1/2.

Die Phase ist unbekannt.

Bedeutung der Phase

Original

FT

Farbintensität = Amplitude

Phasen = Farben

• Die FTs kann man visualisieren, indem man ein

Dia der Katze (Ente) ohne Objektivlinse an die

Wand wirft.

Bedeutung der Phase

Inverse FTs

• Phasen sind wichtiger als Amplituden.

Amplituden (Farbtiefe) der Ente

kombiniert mit den Phasen

(Farben) der Katze)

IFT

Strukturfaktoren als komplexe Zahlen

• Die exponentiellen Terme können auch

trigonometrisch ausgedrückt werden als:

[cos 2 (hx + ky + lz] + i sin 2 (hx + ky + lz)]

• In dieser Form ist jeder Term eine komplexe

Zahl der Form a + ib.

Strukturfaktoren als komplexe Zahlen

• Darstellung der Strukturfaktoren als komplexe Zahlen

erlaubt es, Phasen geometrisch abzuleiten.

• Die komplexe Zahl N = a + ib kann als Punkt (Vektor) in

der komplexen Ebene dargestellt werden

Strukturfaktoren als Vektoren in der

komplexen Ebene

• Die Länge von F ist proportional I1/2, der Winkel ist die

Phase von F.

• In dieser Form können F's durch geometrische Vektor-

addition (-subtraktion) kombiniert werden.

Die Anwendung

Isomorpher Schweratomersatz

Schweratome verändern die

Intensitäten der Reflexe

• Jedes Atom einer Elementarzelle trägt zu jedem

Reflex bei (zu einigen mehr, zu anderen

weniger).

• Wenn wir eine kleine Zahl von (Schwer)Atomen

an identischen Stellen in den Elementarzellen

eines Kristalls einführen könnten, sollte man

Intensitätsveränderungen im Diffraktionsmuster

sehen.

• Diese Veränderungen können zur Phasen-

bestimmung genutzt werden.

Schweratome müssen 'schwer' sein

• Um Veränderungen gegenüber dem Signal, das

aus der großen Zahl leichter Atome (C, N, O, H)

stammt, zu sehen, muss ein zusätzliches

schweres Atom (oder eine geringe Zahl von

Schweratomen oder ein Cluster) eingeführt

werden:

Hg, Pb, Au, U, W, Ta, ...

Isomorpher Ersatz

• Im Idealfall ist die einzige Änderung bei der

Einführung eines Schweratomzentrums die

Addition eines oder mehrerer Streuzentren.

• Die Einführung von Schweratomzentren darf

insbesondere die

– Elementarzellkonstanten (Achsen und Winkel)

– Die Lage des Makromoleküls oder seiner

Teile (Konformation) in der Zelle

nicht verändern

• Man spricht daher von „isomorphem Ersatz”.

Herstellung von Schweratomderivaten

• Einlegen nativer Kristalle in Lösungen von

schweren Ionen (Hg, Pt, Au, U)

• Ko-Kristallisation in Gegenwart dieser Salze

• In einigen Fällen binden die Ionen an einer oder

wenigen spezifischen Stellen, ohne die

Konformation des Makromoleküls oder die

Kristallpackung (Zellparameter) zu verändern.

• z.B. Hg2+ - Cystein; Pt4+ - Methionin

Beurteilung der Isomorphie

• Elementarzellparameter sind recht sensitiv

gegenüber Veränderungen der Kristallpackung

oder Veränderungen der Konformation.

• Vergleich der Intensitäten, die für

Scheratomderivat und nativen Kristall gemessen

werden (Skalierung: Größenordnung der R-

Faktoren zum Vergleich äquivalenter Reflexe

zwischen den Datensätzen).

• Ultimativer Test: Schweratomlagen können

bestimmt und die Struktur kann gelöst werden.

Brauchbarkeit eines Derivates

• Intensitätsveränderungen einer gewissen Zahl von

Reflexen müssen detektierbar und ausreichend groß

sein, damit sie genau gemessen werden können.

Nativ Derivat

Die Strukturfaktoramplituden von

Protein und Schweratom sind additiv

• Die Beugungsbeiträge aller Atome zu einem Reflex sind

additiv.

Ergebnis 1

• Wenn wir ein Beugungsbild berechnen, in

dem die Amplitude jedes Reflexes gegeben

ist als

(|FPH| -|FP|)2

ist das Ergebnis das Beugungsbild des

Schweratoms allein in der Zelle des Proteins.

• Die Schweratom-„Substruktur” ist wesentlich

vereinfacht im Vergleich zur Proteinstruktur.

Bestimmung der Proteinphasen

• Annahme: Wir können das Schweratom in

der Zelle lokalisieren.

• Rezept zur Berechnung der Strukturfaktoren

einer bekannten Struktur (Amplituden UND

Phasen):

Bestimmung der Proteinphasen

• Betrachte einen einzelnen Reflex, hkl, der

im nativen und Derivatdatensatz auftaucht

Verhältnis von FP, FPH und

FH in der komplexen Ebene

für EINEN Reflex.

Ein entsprechendes

Verhältnis gilt für JEDEN

der tausenden Reflexe.

Für JEDEN dieser Reflexe

muss dieselbe Form von

Gleichung gelöst werden.

Bestimmung der Proteinphasen

• Die Beugungsbeiträge der Atome sind

additive Vektoren:

FPH = FH + FP

FP = FPH - FH

Harker Diagram SIR

• Das Harker Diagram erlaubt eine geometrische

Lösung der Gleichung FP = FPH - FH

Der rote Kreis zeigt alle

denkbaren Werte für FPH - FH.

Der grüne Kreis zeigt alle

denkbaren Werte für FP.

Harker Diagram SIR• EIN Schweratomderivat erlaubt die Eingrenzung der

möglichen Proteinphasen jedes Reflexes auf einen von

zwei möglichen Werten, repräsentiert durch die

Vektoren FPa und FP

b.Wenn die möglichen

Lösungen dicht genug

beieinander liegen, liefert

der Mittelwert eine gute

erste Abschätzung.

Die Phasen können dann

zyklisch durch

DICHTEMODIFIKATION

verbessert werden.

Single Isomorphous

Replacement (SIR)

Allgemeine Lösung• Ein ZWEITES Schweratomderivat erlaubt eine

Differenzierung zwischen den zwei möglichen Werten.

Die beiden Derivate stimmen in einer Lösung überein.

Multiple Isomorphous Replacement (MIR).

Nicht-ideale Situationen• Für zahlreiche Reflexe kann die Präzision einer der

Phasenbestimmungen gering sein.

• Es werden daher oft mehr als zwei Derivate benötigt.

Experimenteller Fehler

FPHFP

FH

P

Lack of

closure

FPHFP

FH

P

H

PH

FP = FPH - FH FP ≈ FPH - FH

Aus einer größeren Zahl nicht perfekter Derivate kann eine

Phasenwahrscheinlichkeit berechnet werden, um die Qualität

der Phasen zu beurteilen.

Gewichtung der Phasen beim Berechnen der Elektronendichte.

Lokalisation der Schweratomzentren

• „Extraktion” des Diffraktionsbeitrags der

Schweratome.

• Lösung der vereinfachten Schweratom-

Substruktur in der Zelle des Proteins.

Patterson Funktion

• Werkzeug zur Lösung des Problems: Patterson Funktion

(Patterson Synthese)

• Die Patterson Funktion ist eine Fourier Summation ohne

Phasen.

• Die Koordinaten (u,v,w) der Patterson Funktion P(u,v,w)

benennen einen Punkt in einer Patterson Karte (genauso wie

(x,y,z) einen Punkt in der Elektronendichtekarte benennen).

• |Fhkl|2 ist proportional zur Intensität des Reflexes (messbar).

Differenz-Patterson Funktion

• Patterson-Funktion die lediglich auf den

Schweratombeiträgen beruht.

• ISOMORPHE Differenz-Patterson Funktion

• Patterson mit Amplituden ( F)2 = (|FPH| - |FP|)2.

Bedeutung der Patterson Funktion

• Eine Konturkarte der Patterson Funktion, P(u,v,w)

besitzt Maxima an Koordinaten, die INTER-ATOMAREN

ABSTANDSVEKTOREN entsprechen.

• Es gibt mehr solcher Vektoren als Atome, daher ist die

Patterson „Map” komplexer als eine

Elektronendichtekarte (Maxima an Atompositionen)

• Wenn eine Struktur einfach ist (z.B. Schweratom-

Substruktur) kann sie über eine Patterson Map

interpretiert werden.

• Da keine Phasen involviert sind, kann eine Patterson

Funktion (Map) IMMER mit einem Satz

kristallographischer Rohdaten berechnet werden.

Konstruktion einer Patterson Map

Ohne Ursprung: 6 Peaks pro

Zelle („Patterson Atome”).

Allgemein: N Atome erzeugen

N*(N-1) Patterson Peaks.

Am Ursprung summieren sich

alle Selbstvektoren.

Lösung der Struktur aus einer

Patterson Map

• Eine Möglichkeit: Versuch und Irrtum

• Hier: 6 Patterson-Atome, d.h. 3 Realraum-Atome

• Suche Dreiergruppe (hier: a, b, Ursprung)

• Generiere eine Patterson Map und vergleiche

Symmetrie vereinfacht das Problem

xz

y

180 (-x,y,-z)(x,y,z)

• Die Zweifachachse entlang y wird ein Schweratom bei

(x,y,z) auf (-x,y,-z) bringen.

• Der Abstandsvektor zwischen diesen Punkten sollte als

Peak in der Differenz-Patterson auftauchen.

Symmetrie vereinfacht das Problem

xz

y

180 (-x,y,-z)(x,y,z)

• Der Abstandsvektor ist:

(x,y,z) - (-x,y,-z) = (2x,0,2z) = (u,v,w).

• D.h. wir erwarten einen Peak in der Ebene v=0 der Patterson

Map, dessen Koordinaten uns x und z berechnen lassen:

x = u/2, z = w/2

Symmetrie vereinfacht das Problem

xz

y

180 (-x,y,-z)(x,y,z)

• Die Ebene v=0, bei der eine Unbekannte eliminiert wird,

wird Harker-Ebene (Harker Section) genannt.

• Peaks in dieser Ebene sind die Harker-Vektoren.

Harker-Ebene und Harker-Vektor

v = 0

(2x,0,2z) = (u,v,w)

x = u/2, z = w/2

Harker-Ebene und Harker-Vektor

Symmetrie-äquivalente Positionen

in der Elementarzelle

Beispiel: Raumgruppe P21

x, y, z

-x, y+1/2, -z

Harker-Vektor

(u,v,w) = (x, y, z) - (-x, y+1/2, -z) = (2x,1/2,2z)

Harker-Ebene bei v = 1/2

Beispiel: SFP

• Au-Derivat

• Raumgruppe P43212

• Zellkonstanten:

a = b = 65.36 Å , c = 150.69 Å, = = = 90°

• Symmetrie-äquivalente Positionen:

x,y,z -x,-y,½+z ½-y,½+x,¾+z ½+y,½-x, ¼+z

y,x,-z -y,-x,½-z ½-x,½+y,¾-z ½+x,½-y,¼-z

Beispiel: SFP

• Au-Derivat

• Raumgruppe P43212

• Zellkonstanten:

a = b = 65.36 Å , c = 150.69 Å, = = = 90°

• Symmetrie-äquivalente Positionen:

x,y,z -x,-y,½+z ½-y,½+x,¾+z ½+y,½-x, ¼+z

y,x,-z -y,-x,½-z ½-x,½+y,¾-z ½+x,½-y,¼-z

Harker-Ebene

w = 0.5

u

v0.41

0.12

(u,v,w) =

(x,y,z) - (-x,-y,½+z) =

(2x, 2y, 1/2)

u = 2x = 0.41

x = 0.205

v = 2y = 0.12

y = 0.06

Beispiel: SFP

• Au-Derivat

• Raumgruppe P43212

• Zellkonstanten:

a = b = 65.36 Å , c = 150.69 Å, = = = 90°

• Symmetrie-äquivalente Positionen:

x,y,z -x,-y,½+z ½-y,½+x,¾+z ½+y,½-x, ¼+z

y,x,-z -y,-x,½-z ½-x,½+y,¾-z ½+x,½-y,¼-z

Harker-Ebene

u = 0.5

(u,v,w) =

(x,y,z) - (½+x,½-y,¼-z ) =

(1/2, 2y-1/2, 2z-1/4)

Für y = 0.06 wird w gesucht:

v = 2y-1/2 = 0.12-0.5 = -0.38

v

w

0.62 (= -0.38)

0.13

w = 0.13 = 2z – ¼

z = 0.19

Beispiel: SFP

• Zellkonstanten:

a = b = 65.36 Å , c = 150.69 Å, = = = 90°

• Koordinaten des ersten AU-Atoms:

Fraktionale Koordinaten:

x = 0.205, y = 0.06, z = 0.19

Orthogonale Koordinaten:

x = 13.4 Å, y = 3.9 Å, z = 28.6 Å