Post on 20-Aug-2019
Tierärztliche Hochschule Hannover
Etablierung des Ovalbumin-induzierten Mausmodells
der atopischen Dermatitis zur Beurteilung
pharmakologischer Wirkstoffe
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Hanna Kathrin Köchling
Dortmund
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.
Für meine Familie
-In Liebe und Dankbarkeit-
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung .......................................................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht .............................................................................................................................. 3
2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis ...................................................................................... 3 2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle ................................................. 3 2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD .................................................................... 4 2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD .................................................................. 5
2.2 Histamin ..................................................................................................................................... 9 2.3 Histaminrezeptoren .................................................................................................................. 10
2.3.1 Histamin 1-Rezeptor .......................................................................................................... 10 2.3.2 Histamin 4-Rezeptor .......................................................................................................... 13
2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen Dermatitis und Kontaktallergie .................................................................................................................................. 18
3 Material und Methoden ................................................................................................................... 24 3.1 Material .................................................................................................................................... 24
3.1.1 Material für In-vivo-Versuche ........................................................................................... 24 3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche ...................................................................................... 25 3.1.3 Material für ELISA ........................................................................................................... 26 3.1.1 Material für Histologie ...................................................................................................... 26 3.1.2 Material für FACS ............................................................................................................. 27 3.1.3 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 28 3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung .......................................................................................... 29
3.2 Versuchsübersicht .................................................................................................................... 30 3.3 Methoden .................................................................................................................................. 31
3.3.1 Protokoll des OVA-Modells .............................................................................................. 31 3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der atopischen Dermatitis .................................................................................................................... 32 3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell .................................................................................................................................. 33 3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell ........................................................................... 36
3.4 Statistische Auswertung ........................................................................................................... 41 4 Ergebnisse ....................................................................................................................................... 42
II
4.1 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des Ovalbumin-induzierten Modells der atopischen Dermatitis (OVA-Protokoll) ............................................................................................ 42
4.1.1 Klinischer Hautscore ......................................................................................................... 42 4.1.2 Histologie .......................................................................................................................... 44 4.1.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ................................................................................. 46 4.1.4 Milzzellzahl ....................................................................................................................... 47 4.1.5 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum .......................................................................... 48
4.2 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell ................................................................................................................................................ 48
4.2.1 Klinischer Hautscore ......................................................................................................... 48 4.2.2 Histologie .......................................................................................................................... 51 4.2.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ................................................................................. 55 4.2.4 Milzzellzahl ....................................................................................................................... 58 4.2.5 Zytokinsekretion Splenozyten ........................................................................................... 59 4.2.6 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum .......................................................................... 61 4.2.7 Juckreiz .............................................................................................................................. 62 4.2.8 Vergleich der Vehikelgruppen .......................................................................................... 63
5 Diskussion ....................................................................................................................................... 64 5.1 Das OVA-Modell als Mausmodell der AD .............................................................................. 65 5.2 Einfluss der zusätzlichen Störung der Hautbarriere auf das OVA-Modell .............................. 66 5.3 Stabilität des OVA-Modells ..................................................................................................... 67 5.4 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell ................................................................................................................................................ 69
5.4.1 Effekt des Glukokortikoids Betamethason im OVA-Modell ............................................ 69 5.4.2 Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten im OVA-Modell ......................................... 71
5.5 Schlussfolgerung ...................................................................................................................... 74 6 Zusammenfassung ........................................................................................................................... 76 7 Summary ......................................................................................................................................... 78 8 Literaturverzeichnis ......................................................................................................................... 80 9 Anhang .......................................................................................................................................... 100
III
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AD Atopische Dermatitis
Aqua ad inj. Aqua ad injectionem, Wasser für Injektionszwecke
BSA Bovines Serumalbumin
C Challenge, Provokationswoche
ca. circa
CD Cluster of differentiation
DC Dendritische Zellen
DNCB Dinitrochlorobenzol
D. farinae Dermatophagoides farinae
Dfb Hausstaubmilben
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
et al. und andere
FACS Fluorescense Activated Cell Sorting
FITC Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
HE Hämatoxylin-Eosin
H1R Histamin 1 Rezeptor
H2R Histamin 2 Rezeptor
H3R Histamin 3 Rezeptor
H4R Histamin 4 Rezeptor
IDEC Inflammatorische dendritische epidermale Zellen
IFN Interferon
IgE Immunglobulin E
IL Interleukin
i.p. intraperitoneal
JNJ 3975 JNJ 39758979
k.A. keine Angaben in der Literatur
kg Kilogramm
IV
MCP Monocyte chemotactic protein
mg Milligramm
min Minuten
MIP Macrophage inflammatory protein
ml Milliliter
mRNA messenger Ribonukleinsäure
NaCl Natriumchlorid
NGF Nerve growth factor
OVA Ovalbumin
OVA-Modell Ovalbumin-induziertes Mausmodell
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
p.o. per os
RANTES Regulation and activated normal T-cell expressed and secreted
SD Standardabweichung
SE Sensibilisierungswoche
Std. Stunden
TARC Thymus and activation-regulated chemokine
TDI Toluendiisocyanat
TH T-Helferzelle
TNCB Trinitrochlorobenzen
TNF Tumor necrosis factors
TSLP Thymic stromal lymphopoietin
µg Mikrogramm
µl Mikroliter ® Registered Trade Mark TM Unregistered Trade Mark
± Plus/Minus
% Prozent
Einleitung
1
1 Einleitung
Die atopische Dermatitis ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die mit starkem
Juckreiz einhergeht und sowohl beim Menschen als auch unterschiedlichen Tierarten, wie
z.B. dem Hund, auftritt.
Beim Menschen sind vor allem Säuglinge und Kleinkinder von der atopischen Dermatitis
betroffen, die Prävalenz in den Industriestaaten beträgt 10,2 % (SILVERBERG & HANIFIN
2013).
Die klinischen Symptome unterscheiden sich je nach Krankheitsphase: In der akuten Phase ist
die atopische Dermatitis durch starken Juckreiz und erythematöse Haut mit Papeln
gekennzeichnet. Es finden sich sowohl Exkorationen sowie Erosionen mit serösem Exsudat.
In der subakuten Phase leiden die Betroffenen unter erythematösen, schuppenden Pappeln mit
deutlichen Exkorationen. Die chronische Phase der atopischen Dermatitis ist durch verdickte
Haut, Lichenifikation sowie fibrösen Papeln charakterisiert. In diesem Stadium der atopischen
Dermatitis können Symptome aller drei Krankheitsphasen parallel auftreten (LEUNG 1999).
Auch beim Hund sind Hautläsionen und starker Juckreiz die klinischen Hauptsymptome. Die
Prävalenz beträgt ca. 10 % bis 20 % aller Hunde (NOLI et al. 2014).
Die frühere Annahme, dass die atopische Dermatitis eine klassische Typ 1-
Hypersensitivitätsreaktion mit Bildung von allergenspezifischen Immunglobulin E (IgE)-
Antikörpern sei, ist mittlerweile revidiert. Die atopische Dermatitis gilt heute als
multifaktorielle Erkrankung, bei der komplexe immunologische Vorgänge sowie genetische
Faktoren eine Rolle spielen (LEUNG 2000; NOVAK et al. 2003).
So ist die Beteiligung des im Jahr 2000 entdeckten Histamin 4 Rezeptors (H4R) an der
Entstehung der atopischen Dermatitis bisher noch nicht gänzlich verstanden. Es wird
angenommen, dass dieser vor allem für die Entstehung des Juckreizes eine wichtige Rolle
spielt, da erhöhte Histaminspiegel in atopischer Haut nachgewiesen werden können
(RUZICKA und GLÜCK 1983), eine Behandlung mit Histamin 1 Rezeptorantagonisten
(H1R-Antagonist) jedoch keine zufriedenstellende klinische Besserung hervorruft (HOARE
et al. 2001). Daher scheint der H4R ein neuer vielversprechender Ansatz zur Therapie der
atopischen Dermatitis sein.
Einleitung
2
Das Ziel dieser Arbeit ist es, zunächst ein Tiermodell der atopischen Dermatitis zu etablieren
um im Anschluss den Effekt von H1R- und H4R- Antagonisten in diesem Modell zu
untersuchen. Als Tiermodell wurde das Ovalbumin-induzierte Mausmodell der atopischen
Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) gewählt, da dieses viele Aspekte der humanen
atopischen Dermatitis widerspiegelt. Des Weiteren soll untersucht werden, ob die zusätzliche
Störung der Hautbarriere dieses Modell optimieren kann. Ebenso sollen die Effekte von
unterschiedlichen Wirkstoffgruppen (Glukokortikoid, H1R- und H4R-Antagonist) in diesem
Tiermodell untersucht werden. Auch werden unterschiedliche Behandlungszeiträume sowie
Applikationsarten miteinander verglichen.
Literaturübersicht
3
2 Literaturübersicht
2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis
Um die pathophysiologischen Vorgänge besser zu verstehen und um neue Wirkstoffe
entwickeln und testen zu können, werden Tiermodelle der atopischen Dermatitis (AD)
eingesetzt.
Die Maus bietet als Versuchstier einige Vorteile: es sind kleine Tiere, die Haltungskosten sind
gering, sie haben eine hohe Anzahl an Nachkommen pro Jahr, die Physiologie und
Pathophysiologie der Maus sind bereits sehr gut erforscht. Des Weiteren sind Inzuchtstämme
sowie genetisch veränderte Tier erhältlich (z.B. Knockout-Mäuse) (GUTERMUTH et al.
2004).
Die bisher eingesetzten Mausmodelle der AD können zur besseren Übersicht in drei Gruppen
eingeteilt werden. Die erste Gruppe beinhaltet Mäuse, die spontan atopische Dermatitis
entwickeln, in der zweiten Gruppe wird die atopische Dermatitis durch eine epikutane
Sensibilisierung ausgelöst und in der dritten Gruppe werden genetisch veränderte Mäuse
verwendet (JIN et al. 2009).
2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle
Die Inzuchtstämme NC/NgA, NOA und DS/Nh entwickeln unter normalen Haltungs-
bedingungen spontan AD.
2.1.1.1 NC/NgA-Mäuse
Mäuse des Inzuchtstamms NC/NgA entwickeln bei Kontakt mit Umweltallergenen spontan
Hautveränderungen, die in vielen Aspekten der humanen AD ähneln. Ab einem Alter von
acht Wochen können erste Läsionen im Gesicht, an den Ohren, im Nacken und auf dem
Rücken entstehen. Zu Beginn zeigen die Mäuse Juckreiz, Erytheme und Blutungen, gefolgt
von Ödemen, Errosionen, Exkorationen, Schuppen und trockener Haut. Auch bleiben diese
Tiere im Wachstum zurück. Histologische Veränderungen sind die Zunahme der
Epidermisdicke, Hyper- und Parakeratose sowie interzelluläre Ödeme. Zudem nimmt die
Anzahl an Mastzellen in der Haut deutlich zu, ein Teil dieser ist degranuliert. Die Anzahl an
Eosinophilen nimmt ebenso zu. Der totale IgE-Gehalt im Serum steigt mit Zunahme des
klinischen Schweregrads der AD an (MATSUDA et al. 1997).
Literaturübersicht
4
Eine Störung der Hautbarriere konnte in diesem Tiermodell nachgewiesen werden, so sind der
Gehalt an Ceramiden in der Haut von NC/NgA Mäusen deutlich reduziert und der Wasser-
verlust aus der Haut erhöht (AIOI et al. 2001). Werden die Tiere unter pathogenfreien
Bedingungen gehalten, entwickeln sie keinerlei Symptome, daher scheint der Kontakt zu
Umweltallergenen als Auslöser notwendig zu sein (MATSUDA et al. 1997).
2.1.1.2 NOA-Mäuse
Ein weiterer Inzucht-Stamm, der spontan AD entwickelt, ist die NOA-Maus. Bei diesen
Mäusen entsteht ab einem Alter von zehn Wochen spontan eine ulzerative Dermatitis, die mit
Juckreiz, Mastzell-Infiltration und erhöhten IgE-Serumspiegeln einhergeht. Jedoch fehlen die
für AD typischen histologischen Veränderungen der Haut (WATANABE et al. 1999).
2.1.1.3 DS/Nh-Mäuse
Auch bei DS/Nh-Mäusen entstehen unter konventionellen Haltungsbedingungen Juckreiz und
erythematöse und erosive Hautläsionen. Der erhöhte IgE-Gehalt im Serum korreliert mit dem
Schweregrad der Symptome. In der Haut finden sich vermehrt CD4+ T-Zellen, Eosinophile,
Mastzellen und CD11b+ Makrophagen. Die Hautläsionen sind mit Staphylococcus aureus (S.
aureus) besiedelt. Eine Beteiligung dieses Keims an der Entstehung der Läsionen gilt als sehr
wahrscheinlich (HIKITA et al. 2002).
2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD
Die epikutane Sensibilisierung zur Auslösung von AD-ähnlichen Hautläsionen kann mit
verschiedenen Allergenen erfolgen. Häufig verwendet werden das Hühnereiweiß Ovalbumin
(OVA) oder verschiedene Hausstaubmilben-Extrakte (GUTERMUTH et al. 2004).
2.1.2.1 Epikutane Sensibilisierung mit OVA
Die epikutane Sensibilisierung mit OVA ist sowohl für Balb/c- als auch C57BL/6- Mäuse
beschrieben (SPERGEL et al. 1999).
Die Sensibilisierung erfolgt über die dreimalige Applikation von OVA über 1 Woche auf die
rasierte Haut. Die Pause zwischen den einzelnen Sensibilisierungen beträgt 2 Wochen. Die
Mäuse entwickeln AD-ähnliche Hautläsionen, die histologisch durch epidermale
Hyperproliferation sowie Infiltration von Neutrophilen, Lymphozyten, Mastzellen und
Literaturübersicht
5
Eosinophilen gekennzeichnet sind. Die Expression von mRNA der Zytokine IL-4, IL-5 und
IFN-γ in der Haut ist gesteigert. Der Serumgehalt von totalem sowie allergenspezifischem IgE
ist erhöht. Die Inhalation von aerolisiertem OVA führt bei epikutan sensibilisierten Mäusen
zu asthmaähnlichen Symptomen (SPERGEL et al. 1998; JIN et al. 2009).
2.1.2.2 Epikutane Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten
Die Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten ist bisher für zwei verschiedene
Mausstämme beschrieben worden. Zum einen wird der Inzuchtstamm NC/NgA verwendet.
Die Mäuse werden unter sterilen, pathogenfreien Bedingungen gehalten und dreimal pro
Woche mit einem Extrakt aus der Hausstaubmilbe Dermatophagoides farinae (D. farinae) auf
dem Rücken behandelt. In der zweiten Woche entsteht trockene, juckende Haut, ab der
vierten Woche lassen sich Hautläsionen (Erosionen mit Blutungen, Schuppen) beobachten.
Der totale sowie D. farinae-spezifische IgE-Gehalt im Serum steigt an. Histologische Ver-
änderungen sind die Zunahme der Epidermisdicke sowie eine erhöhte Anzahl an Mastzellen
in der Haut (MATSUOKA et al. 2003).
Im zweiten Modell werden Balb/c-Mäuse mit dem rekombinantem Milbenallergen Der p 8
sensibilisiert. Die epikutane Sensibilisierung erfolgt insgesamt dreimal über jeweils vier Tage
in einem Abstand von 17 Tagen. Klinisch entsteht eine exkorative Dermatitis mit deutlicher
Lichenifikation. Histologisch fallen eine Verdickung der Epidermis, eine Infiltration von
CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie von Mastzellen auf. Eine Zunahme von Nervenendigungen
in der Nähe der Mastzellen sowie ein Anstieg von Neuropeptiden in der Dermis könnten
Hinweise auf eine neurogene Entzündung sein (HUANG et al. 2003).
2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD
Zu dieser Gruppe zählen sowohl transgene als auch Knockout-Mäuse. Diese Modelle sind
besonders geeignet, um z.B. die Bedeutung einzelner Zytokine für die Pathogenese der AD zu
klären (GUTERMUTH et al. 2004).
2.1.3.1 Transgene Mäuse
Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-31 (IL-31), und Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)
transgene Mäuse entwickeln AD-ähnliche Läsionen.
Literaturübersicht
6
IL-4 transgene Mäuse
Das Zytokin IL-4 ist in der Lage, die Differenzierung von TH0-Zellen zu TH2-Zellen
induzieren, als auch B-Zellen zur Produktion von IgE anzuregen.
IL-4 transgene Mäuse exprimieren das murine IL-4 Gen auf basalen Keratinozyten. Dies führt
zu einem erhöhten IL-4 Gehalt in der Haut. Ab einem Alter von 4 Monaten zeigen 43% der
Tiere trockene Haut, Juckreiz sowie erste Hautläsionen. Die Lokalisation dieser Läsionen
ähnelt denen von NC/NgA-Mäusen. Histologisch sind die chronischen Hautläsionen durch
Spongiosis, Hyper- und Parakeratose, Akanthose sowie Infiltration von T-Zellen, Eosino-
philen und z.T. degranulierten Mastzellen gekennzeichnet. Bei 47% der Mäuse mit Symp-
tomen kann eine sekundäre Infektion der Hautläsionen mit S. aureus nachgewiesen werden
(CHAN et al. 2001).
IL-31 transgene Mäuse
Das Zytokin IL-31 wird von TH2-Helferzellen produziert und trägt vermutlich zur Entstehung
von allergischen Erkrankung bei. IL-31 transgene Mäuse überexprimieren IL-31. Ab einem
Alter von vier bis acht Wochen entstehen Alopezie sowie starker Juckreiz, der zu
Hautläsionen führen kann. Die Haut am Ohr ist ebenfalls verdickt. 80 bis 100 Prozent der
sechs Monate alten transgenen Mäuse zeigen klinische Symptome (Alopezie und Juckreiz).
Die histologische Untersuchung der Hautläsionen zeigt Hyperkeratose, Akanthose,
Infiltration von Entzündungszellen und Mastzellen. IL-31 transgene Mäuse zeigen jedoch
keinen Anstieg des Serum-IgE-Gehalts (DILLON et al. 2004).
TSLP transgene Mäuse
Das Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) ist ein Zytokin, das von epithelialen Zellen
gebildet wird und für die Aktivierung von dendritischen Zellen in der Haut verantwortlich ist.
TSLP transgene Mäuse exprimieren ein keratinozytenspezifisches, durch Tetrazykline
induzierbares TSLP-Gen. Unter Gabe von Doxycyclin kommt es nach zwei Wochen zur
Ausbildung von Erythemen. Nach drei bis vier wöchiger Doxycyclin-Behandlung entstehen
sichtbare AD-ähnliche Hautläsionen sowie Splenomegalie und Lymphadenopathie. Die
Histologie zeigt eine Akanthose, Spongiosis, Hyperkeratose und eine Infiltration von
Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen und Eosinophilen. Der Serumgehalt an IgE und
IgG1 ist erhöht, der Gehalt an IgE2a verringert (YOO et al. 2005).
Literaturübersicht
7
2.1.3.2 Knockout-Mäuse
RelB-Knockout-Mäuse sowie Cathepsin E-Knockout Mäuse entwickeln ebenfalls spontan
AD-ähnlich Läsionen.
RelB-Knockout-Mäuse
RelB ist ein Protein, das zur Familie des Transkriptionsfaktors NF-κB gehört und vor allem in
spezifischen Regionen von lymphoiden Organen expremiert wird.
RelB-Knockout-Mäuse zeigen neben hämatologischen Veränderungen und Entzündungs-
anzeichen in verschiedenen Organen auch spontan auftretende Hautläsionen (WEIH et al.
1997; BARTON et al. 2000). Diese treten ab einem Alter von vier bis zehn Wochen auf. Erste
Symptome sind eine Verdickung der Haut sowie Haarverlust. Histologisch zeigen sich
Hyperkeratose, Akanthose und eine Infiltration von CD4+ T-Zellen, Eosinophilen und
einigen Mastzellen in der Haut. Der Serumspiegel an IgE ist erhöht (BARTON et al. 2000).
Cathepsin E-Knockout-Mäuse
Cathepsin E ist ein endolysosomale Protease, die vor allem in Zellen des Immunsystems zu
finden ist (YANAGAWA et al. 2007).
Cathepsin E-Knockout-Mäuse entwickeln unter normalen Haltungsbedingungen ab einem
Alter von zehn Wochen Juckreiz und Hautläsionen. Diese sind gekennzeichnet durch
Alopezie, Erytheme, Krusten, Erosionen sowie eine Verdickung der Haut. Der Schweregrad
der Läsionen nimmt mit dem Alter der Tiere zu. Histologisch weisen die Läsionen eine
epidermale Hyperproliferation wie auch eine Infiltration von Eosinophilen, Makrophagen,
Lymphozyten und Mastzellen in der Dermis auf. Der Gehalt an IgE im Blut ist, ebenso wie
der Gehalt an Eosinophilen, gesteigert. In vitro verursacht eine Stimulation von Splenozyten
von Cathepsin E-Knockout-Mäusen eine erhöhte Sekretion von IL-4 und IL-5, nicht jedoch
von IL-2 und IFN-γ (TSUKUBA et al. 2003).
Literaturübersicht
8
Tabelle 1: Übersicht über Befunde der jeweiligen Mausmodelle der atopischen Dermatitis, (k.A. = keine Angaben in
der Literatur) (MATSUDA et al. 1997; WEIH et al. 1997; SPERGEL et al. 1998; WATANABE et al. 1999; BARTON
et al. 2000; CHAN et al. 2001; HIKITA et al. 2002; HUANG et al. 2003; MATSUOKA et al. 2003; TSUKUBA 2003;
DILLON et al. 2004; YOO et al. 2005).
Mausstamm
AD-
ähnliche
Haut-
läsionen
Gen.
Defekt
der
Haut-
barriere
Histologie IgE-
Anstieg Juck-
reiz
Infiltration von Hyper-/
Para-
keratose Lympho-
zyten
Mast-
zellen total spezif.
NC/NgA + + + + + + - +
NOA + k.A. - + - + - +
DS/Nh + k.A. + + + + - +
IL-4
transgen + k.A. + + + + - +
IL-31
transgen + k.A. + + + - - +
TSLP
transgen + k.A. + + + + - k.A.
RelB
Knockout + k.A. + + + + - k.A.
Cathepsin E
Knockout + + + + + + - +
Allergen
OVA + - + + + + + +
D. farinae + + + + + + + +
Der p 8 + - + + + k.A. k.A. k.A.
Literaturübersicht
9
2.2 Histamin
Histamin ist ein biogenes Amin, das als Neurotransmitter im Nervensystem und als
Gewebshormon im Magen-Darm-Trakt, Immunsystem und in der Haut vorkommt. Die
chemische Bezeichnung lautet 2-(4-Imidazolyl)-Ethylamin.
Histamin wurde 1910 von G. Barger und Sir H. Dale als Bestandteil des Getreidepilzes
Mutterkorn entdeckt. Sie stellten fest, dass Histamin eine Konstriktion eines isolierten
Meerschweinchendarms hervorruft (BARGER und DALE 1910). Im selben Jahr zeigten Sir
H. Dale und P. P. Laidlaw in Tierversuchen, dass die Gabe von Histamin bei Säugetieren
schockähnliche Zustände verursacht. Symptome waren Bronchokonstriktion, Konstriktion
von Herz- und Lungenarterien sowie eine Stimulation der Herzkontraktion (DALE und
LAIDLAW 1910). Allerding gelang C. H. Best erst im Jahr 1927 der Nachweis von Histamin
im Körpergewebe, v.a. in der Lunge (BEST et al. 1927).
Histamin wird durch oxidative Decarboxylierung aus der Aminosäure L-Histidin gebildet
(WEISSBACH et al. 1961). In Mastzellen und basophilen Granulozyten liegt es in Granula
vor und ist dort mit Heparin assoziiert. Auch in enterochromaffinen Zellen im Magen, in den
Lymphknoten und im Thymus kommt Histamin in hohen Konzentrationen vor. In Leber,
Lunge und in Varikositäten von histaminergen Neuronen konnte es in geringen
Konzentrationen nachgewiesen werden (ZIMMERMANN et al. 2011).
Histamin hat unterschiedliche physiologische Wirkungen: im Magen fördert es die Säure-
produktion, am Herzen wirkt es positiv chronotrop und inotrop. Im zentralen Nervensystem
beeinflusst es den Schlaf-Wach-Rhythmus, den Appetit, das Lernverhalten und auch das
Gedächtnis. Des Weiteren spielt Histamin eine Rolle als Immunmodulator und als Mediator
Abbildung 1: Strukturformel von Histamin
Literaturübersicht
10
von Entzündungsreaktionen (HAAS und PANULA 2003; MÖSSNER und CACA 2005;
THURMOND et al. 2008).
Auch für pathophysiologische Vorgänge ist Histamin von Bedeutung. So konnten erhöhte
Histaminspiegel in der bronchoalveolären Lavage von Asthma-Patienten nachgewiesen
werden (BROIDE et al. 1991). In der Haut von Patienten mit AD, Psoriasis oder chronischer
Urtikaria wurde ein gesteigerter Gehalt an Histamin festgestellt (JOHNSON et al. 1960;
PETERSEN et al. 1998; KAPLAN et al. 1978). TUOMISTO et al. (1983) konnten im Liquor
von Patienten mit Multipler Sklerose einen Anstieg von Histamin nachweisen. Der Gehalt an
Histamin im Plasma sowie in der Gelenksflüssigkeit bei Rheumatoider Arthritis ist ebenfalls
erhöht (CRISP 1984).
2.3 Histaminrezeptoren
Histamin vermittelt seine Wirkung über vier verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Diese sind nach der zeitlichen Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt: Histamin 1-Rezeptor
(H1R), Histamin 2-Rezeptor (H2R), Histamin 3-Rezeptor (H3R) und Histamin 4-Rezeptor
(H4R).
2.3.1 Histamin 1-Rezeptor
Der H1R wird von vielen Zellen und in vielen Geweben exprimiert, u.a. auf der glatten
Muskulatur von Atemwegen und Gefäßen, auf Neuronen, Hepatozyten, Chondrozyten,
Endothelzellen, Epithelzellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten, Makrophagen,
dendritischen Zellen, T- und B-Zellen. Die Aktivierung des H1R ruft eine
Bronchokonstriktion sowie eine Kontraktion des Darms und eine Erhöhung der
Gefäßpermeabilität hervor (JUTEL et al. 2009). H1R-Knockout-Mäuse zeigen Auffälligkeiten
im Lernverhalten, der Lokomotion und Nozizeption ebenso wie im Gedächtnis (YANAI et al.
1998). T-Zellen dieser Mäuse produzieren weniger IFN γ bei einer gesteigerten Produktion
der TH2 Zytokine IL-4 und IL-13. Histamin scheint daher in der Lage zu sein, über den H1R
die T-Zell-vermittelte Immunantwort zu beeinflussen (JUTEL et al. 2001).
Literaturübersicht
11
2.3.1.1 Histamin 1-Rezeptor-Antagonisten
Nach BAKKER et al. (2000) wirken H1R-Antagonisten als inverse Agonisten, d.h. sie haben
eine hohe Affinität zur inaktiven Form des H1R und verschieben das Gleichgewicht zur
inaktiven Form.
H1R-Antagonisten, auch als Antihistaminika bekannt, werden in zwei Generationen
unterschieden. Zu den H1R-Antagonisten der ersten Generation zählen Diphenhydramin,
Doxylamin, Mepyramin (auch Pyrilamin genannt) und Dimetinden. Antihistaminika der
ersten Generation können leicht die Bluthirnschranke überwinden, so dass als
Nebenwirkungen Sedation und anticholinerge Effekte auftreten (HILL 1990; NICHOLSON et
al. 1991). Daher wurde eine zweite Generation Antihistaminika entwickelt, die nur in
geringen Maßen ins Gehirn gelangt und so weniger sedativ wirkt. Vertreter dieser „neuen“
Generation sind Cetirizin, Levocetirizin, Fexofenadin, Terfenadin, Loratadin und
Desloratadin.
In der Humanmedizin sind H1R-Antagonisten der zweiten Generation Therapie der Wahl bei
allergischer Rhinitis, allergischer Konjunktivitis und Urtikaria. Viele Studien belegen die
Wirksamkeit dieser Medikamente zur Behandlung dieser Krankheiten. H1R-Antagonisten
sind jedoch nur gering wirksam bei AD, Asthma, Anaphylaxie, Erkältungen, Otitis media,
Sinusitis, unspezifischem Husten sowie nicht allergisch-bedingtem Juckreiz. H1R-
Antagonisten der ersten Generation werden auch zur Behandlung von Schlaf- und
Angststörungen, Akathisie, Migräne, Schwindel und zur Sedation eingesetzt. Ein großer
Nachteil ist jedoch das Auftreten von starken Nebenwirkungen, wie z.B. Sinustachykardie,
Mydriasis, trockener Mund und Augen, Gewichtszunahme als auch unerwünschter Sedation
(SIMONS und SIMONS 2011).
Die Abbildungen 2 und 3 zeigen die Strukturformeln der erwähnten H1R-Antagonisten.
Literaturübersicht
12
Doxylamin Diphenhydramin
Dimetinden Mepyramin (Pyrilamin)
Abbildung 2: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der ersten Generation.
Literaturübersicht
13
2.3.2 Histamin 4-Rezeptor
Der H4R wurde im Jahr 2000 zunächst von ODA et al. (2000) beschrieben. In den folgenden
Jahren gelang die Klonierung des H4R von Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen,
Schwein, Affe und Hund (NAKAMURA et al. 2000; LIU et al. 2001; LIU et al. 2001;
MORSE et al. 2001; Zhu et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ODA et al. 2002; ODA et al.
2005; JIANG et al. 2008). Der H4R wurde bisher auf hämatopoetischen Zellen nachgewiesen,
u.a. auf dendritischen Zellen, Eosinophilen, Mastzellen, Monozyten, Neutrophilen sowie T-
und B-Zellen (ODA et al. 2000; MORSE et al. 2001; ZHU et al. 2001; O’REILLY et al.
2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; GUTZMER et al. 2005; GUTZMER et al.
2009). H4R-mRNA konnte auch im Knochenmark, im Gewebe von Milz, Lymphknoten,
Thymus, Skelettmuskel, Hoden, Prostata, Dünndarm, Leber, Pankreas, Lunge, Herz und
Abbildung 3: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der zweiten Generation.
Fexofenadin Levocetirizin
Terfenadin Loratadin Desloratadin
Literaturübersicht
14
Niere nachgewiesen werden (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; MORSE et al.
2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Eine tatsächliche Expression des H4R in
diesen Geweben wird jedoch noch diskutiert, eine mögliche Ursache für den Nachweis von
H4R-mRNA in diesen Geweben könnten eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen
sein (ZHANG et al. 2007).
Der H4R hat eine bedeutende Funktion bei der Regulation der Immunantwort. Er hat Einfluss
auf die Chemotaxis von verschiedenen Zellen und die Zytokinfreisetzung aus diesen. So
verursacht Histamin über den H4R die Migration von Mastzellen ohne jedoch die
Degranulation dieser zu beeinflussen. Eine Aktivierung des H4R auf Mastzellen führt zu einer
Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern (HOFSTRA et al. 2003).
Bei Eosinophilen ruft die Bindung von Histamin an den H4R eine Änderung der Zellform, die
Polymerisation von Aktin und eine gesteigerte Expression von Oberflächenmolekülen wie
z.B. CD11b und CD54 hervor. Auch ist die Chemotaxis in Richtung des Chemokins Eotaxin
erhöht (BUCKLAND et al. 2003; LING et al. 2004). O’REILLY et al. (2002) zeigten, dass
auch Histamin selbst über den H4R chemotaktisch auf Eosinophile wirkt. Bereits 1992
publizierten RAIBLE et al. (1992), dass Histamin einen Calciumanstieg in Eosinophilen
verursacht und dieser über den H3R/H4R-Antagonisten Thioperamid zu blocken ist. Da
LING et al. (2004) nachweisen konnten, dass Eosinophile keinen H3R exprimieren, scheint
der Calciumanstieg allein über den H4R vermittelt zu werden.
Dendritische Zellen (DC) werden über den H1R und den H4R zur Migration angeregt. Dies
kann durch den H1R-Antagonisten Diphenhydramin oder den H4R-Antagonisten JNJ
7777120 geblockt werden (BÄUMER et al. 2008). GUTZMER et al. (2005) zeigten, dass die
Stimulation des H4R auf DC zu Chemotaxis und Aktinpolymerisation sowie einer
verringerten Produktion des TH1-Zytokins IL-12p70 führt. Des Weiteren sind DC in der
Lage, selbst Histamin zu produzieren, welches dann autokrin wirken kann. DC, deren H4R
stimuliert wurde, fördern die TH2-Antwort von T-Zellen, so dass die TH2-Zytokine IL-4 und
IL-5 sowie die inflammatorisch wirkenden Zytokine IL-6 und IL-17 vermehrt produziert
werden (DUNFORD et al. 2006).
Inflammatorische dendritische epidermale Zellen (IDEC) exprimieren ebenfalls den H4R. Das
Zytokin IFN-γ führt zu einer erhöhten Expression des H4R auf IDEC. Eine Stimulation des
Literaturübersicht
15
H4R vermindert die Produktion des TH2-Chemokins CCL2 und des TH1-Zytokins IL-12
(DIJKSTRA et al. 2008).
Langerhans-Zellen exprimieren ebenfalls den H4R. GSCHWANDTNER et al. (2010) zeigten,
dass die Migration von Langerhans-Zellen über den H4R vermittelt wird. Ebenso führt die
Stimulation des H4R zu einer Abnahme der Sekretion des Chemokins CCL2.
GLATZER et al. (2013) zeigten, dass der H4R auf humanen Keratinozyten nachweisbar ist.
Eine Aktivierung mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin induziert die
Proliferation der Keratinozyten. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120
blocken. Auf Keratinozyten von gesunden Mäusen konnte erst nach einer Stimulation mit
Lipopolysaccharid und Peptidoglykan mRNA des H4R nachgewiesen werden. H4R-
Knockout-Mäuse haben eine geringere Epidermisdicke. In vitro zeigen neonatale
Keratinozyten dieser Mäuse eine geringere Proliferation als bei Wildtyp-Mäusen.
Keratinozyten von Wildtyp- oder H4R-Knockout-Mäusen zeigten keinen Unterschied in der
Proliferation nach der Stimulation mit Histamin.
CD8+ T-Zellen werden sowohl über den H4R als auch über den H2R zur Produktion von IL-
16 angeregt. IL-16 wirkt chemotaktisch auf CD4+ T-Zellen und führt zur Migration dieser
(GANTNER et al. 2002).
GUTZMER et al. (2009) publizierten, dass der H4R auch auf CD4+ T-Zellen vorhanden ist
und durch das TH2-Zytokin IL-4 hochreguliert werden kann. TH2-Zellen zeigen eine höhere
Expression des H4R als TH1- oder naive T-Zellen. Eine Stimulation des H4R auf TH2-Zellen
führt zu einem gesteigerten Gehalt an IL-31-mRNA in diesen. Auch auf TH17-Zellen ist der
H4R vorhanden. Wird dieser mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin
stimuliert, kommt es zu einer vermehrten Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-
17. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120 blocken (MOMMERT et al.
2012). ROSSBACH et al. (2011) zeigten zudem, dass sensorische Neurone in der Haut
sowohl den H1R, den H3R als auch den H4R exprimieren. Eine kombinierte Behandlung mit
H1R- und H4R-Antagonisten ist in der Lage H3R-induzierten Juckreiz zu hemmen.
2.3.2.1 Histamin 4-Rezeptor-Antagonisten
Seit der Entdeckung des vierten Histamin-Rezeptors und der Annahme, dass er eine Rolle in
der Regulation des Immunsystems spielt, sind einige Antagonisten entwickelt worden. Der in
Literaturübersicht
16
der Forschung bisher am häufigsten verwendete, erste selektive H4R-Antagonist ist das
Carboxamid JNJ 7777120. Dies hat eine sehr hohe Affinität zum humanen sowie murinen
H4R und eine tausendfache Selektivität gegenüber dem H1R und dem H3R. Da JNJ 7777120
bei oraler Gabe in der Maus eine maximale Plasmakonzentration von 0,8 ± 0,2 µmol/l sowie
eine kurze Halbwertszeit von 1,0 ± 0,04 Stunden hat, ist die Verwendbarkeit für In-vivo-
Versuche jedoch eingeschränkt. In In-vitro-Versuchen hat sich JNJ 7777120 jedoch als sehr
nützliches Hilfsmittel erwiesen (THURMOND et al. 2004; LIM et al. 2010).
Das Benzimidazolyl-Piperazin VUF 6002 (auch als JNJ 10191584 bezeichnet) ist ein
Analogon des Carboxamids JNJ 7777120 und hat eine zehnfach geringere Affinität für den
H4R im Vergleich zu diesem (TERZIOGLU et al. 2004; LIM et al. 2010).
Ein weiterer H4R-Antagonist, welcher für In-vivo-Studien benutzt wird, ist das Benzimidazol
JNJ 28307474. Dieses zeigt ebenfalls eine hohe Affinität zum humanen H4R, jedoch nur eine
geringere Affinität zum murinen H4R (COWDEN et al. 2010).
Der H4R-Antagonist JNJ 40279486 wurde von SAVALL et al. (2011) beschrieben. Chemisch
zählt dieser zu der Gruppe der trizyklischen Aminopyrimidinen. Bisher sind jedoch keine
weiteren Daten über den Einsatz dieses Antagonisten vorhanden.
Der 2014 zum ersten Mal beschriebene H4R Antagonist JNJ 39758979, ein 6-Alkyl-2,4-
Diaminopyrimidin, hat eine sehr hohe Affinität für den murinen H4R mit einer geringen
Affinität für den H3R. Dieser Antagonist wurde bereits in Phase-II klinischen Studien als
Wirkstoff gegen Asthma sowie AD getestet. Da jedoch bei zwei Studienteilnehmern eine
Agranulozytose auftrat, wurden die Studien abgebrochen. Jedoch zeigte sich, dass JNJ
39758979 in der Lage ist, Juckreiz bei Patienten mit AD zu lindern (KOLLMEIER et al.
2014; SAVALL et al. 2014; THURMOND et al. 2014; MURATA et al. 2015).
In Tabelle 2 sind die Affinitäten der H4R-Antagonisten zum humanen, murinen und caninen
H4R aufgeführt. Abbildung 4 zeigt die Strukturformeln der genannten H4R-Antagonisten.
Literaturübersicht
17
VUF 6002
Abbildung 4: Strukturformeln von H4R-Antagonisten
Tabelle 2: Affinitäten verschiedener H4R-Antagonisten für den humanen, den murinen und den caninen H4R
(k.A. = keine Angaben in der Literatur)
Antagonist pKi H4R (nmol/l, Mittelwert ± Standardfehler)
Mensch Maus Hund
JNJ 7777120 8,3 ± 0,1 8,4 ± 0,1 7,1 ± 0,1
VUF 6002 7,5 ± 0,1 6,9 ± 0,1 6,2 ± 0,1
JNJ 28307474 4,9 ± 1,1 109 ± 8 62 ± 31
JNJ 40279486 9,4 k.A. k.A.
JNJ 39758979 12,5 ± 02,6 5,3 ± 0,4 > 10.000
Literaturübersicht
18
2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen
Dermatitis und Kontaktallergie
H4R-exprimierende Zellen spielen eine Rolle in der Entstehung von allergischen Reaktionen.
Der H4R stellt daher eine mögliche neue Zielstruktur zur Behandlung allergisch bedingter
Erkrankungen. Aus diesem Grund sind bereits verschiedene H4R-Antagonisten in
Tiermodellen getestet worden. Abbildung 5 zeigt mögliche Angriffspunkte dieser
Antagonisten an Zellen, die in der Pathogenese von allergischen Reaktionen eine Rolle
spielen.
Abbildung 5: Rolle von H4R-exprimierenden Zellen bei allergischen Reaktionen, modifiziert nach ZHANG et al.
(2007).
A: Sensibilisierunsphase: Dendritische Zellen prägen und polarisieren naive CD4+ T-Zellen unter
Mitwirkung von Mastzellen.
B: Provokationsphase: Aktivierte T-Zellen produzieren unterschiedliche Zytokine, die zum einen Mastzellen
und Eosinophile zur Migration in das entzündliche Gewebe anregen als auch B-Zellen zur Produktion von
IgE.
Literaturübersicht
19
Die Wirkung von H1R- und H4R-Antagonisten wurde in unterschiedlichen Mausmodellen
der Kontaktallergie sowie einem Mausmodell der AD untersucht.
MATSUSHITA et al. (2012) zeigten, dass die Gabe des H1R-Antagonisten Olopatadin (10
mg/kg p.o.) als auch des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (100 mg/kg p.o.) die klinischen
Symptome (Ekzem-ähnliche Läsionen auf der dorsalen Haut) in einem Mausmodell der
chronischen Kontaktallergie, hervorgerufen durch das Hapten Trinitrochlorobenzen (TNCB),
verbessert. Auch die Kombination der beiden Antagonisten konnte eine Linderung
hervorrufen. Die histologische Untersuchung der betroffenen Hautstellen zeigte eine
geringere Epidermisdicke bei Tieren, die mit JNJ 7777120 oder der Kombination behandelt
worden waren. Die Migration von Eosinophilen in die Haut wurde durch alle drei
Behandlungen verringert. Die Kombination der zwei Antagonisten zeigte jedoch keinen
zusätzlichen Nutzen im Vergleich zu einer Monotherapie mit JNJ 7777120. Die Infiltration
der Haut mit Mastzellen wurde durch JNJ 7777120 gehemmt. Auch hier zeigte die
Kombination des H1R-Antagonisten mit dem H4R-Antagonisten keinen weiteren Effekt. Alle
Behandlungen senkten den IgE-Gehalt im Serum, die Kombination war dabei am effektivsten.
MATSUSHITA et al. (2012) bestimmten auch den Gehalt verschiedener Zytokine in der
Haut: JNJ 7777120 sowie die Kombination senkten die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-6,
während Olopatadin nur den Gehalt an IL-5 reduzierte. Die TH1-Zytokine IFN-γ und IL-12
wurden bei Tieren, die mit JNJ 7777120 behandelt worden waren, vermehrt in der Haut
nachgewiesen. Eine Behandlung mit Olopatadin senkte hingegen den Gehalt dieser Zytokine.
Die Kombination der beiden Wirkstoffe konnte die Einzeleffekte gegeneinander aufheben.
SUWA et al. (2011) untersuchten ebenfalls im TNCB-induzierten Modell der chronischen
Dermatitis die Wirkung eines H1R- und eines H4R-Antagonisten sowie eines
Glukokortikoids. Der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg p.o.; 30 mg/kg p.o.) zeigte
eine dosisabhängige Reduzierung der Hautläsionen auf dem Rücken, während der H1R-
Antagonist Fexofenadin (60 mg/kg p.o.) und das Glukokortikoid Dexamethason (3 mg/kg
p.o.) keine Besserung hervorriefen. Alle drei Wirkstoffe verringerten den IgE-Serumspiegel.
Die Anzahl an Mastzellen in der Haut konnte nur durch JNJ 7777120 gesenkt werden. Der
mRNA-Gehalt des Zytokins IL-4 wurde sowohl durch JNJ 7777120 als auch Dexamethason
gesenkt.
Literaturübersicht
20
Auch SEIKE et al. (2010) zeigten, dass der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg) die
klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken) im TNCB-vermittelten Modell der
chronischen Kontaktdermatitis lindert. Ebenso reduzierte er die Migration von Mastzellen und
Eosinophilen in die Haut sowie den IgE-Serumspiegel. Der Gehalt an den TH2-Zytokinen IL-
4, IL-5 und IL-6 in der Haut wurde durch JNJ 7777120 verringert. Die TH1-Zytokine IFN-γ
und IL-12 waren hingegen erhöht.
In einem weiteren TH2-abhängigen Mausmodell der Dermatitis wurden Effekte des H1R-
Antagonisten Mepyramin (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.), des H4R-Antagonisten
JNJ 7777120 (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.) sowie deren Kombination bestimmt.
Eine Bewertung der klinischen Symptome in diesem Modell erfolgte nicht. Die histologische
Untersuchung ergab, dass keine der Behandlung einen Effekt auf die Infiltration der Haut mit
Mastzellen hat. Die Ex-vivo-Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten
gewonnenen Zellpopulation mit dem zuvor benutzten Antigen zeigte keine Unterschiede in
der Produktion von Zytokinen durch die Monotherapie. Die kombinierte Behandlung
reduzierte die Produktion der Zytokine IL-4 und IL-13, die Produktion von IFN-γ wurde nicht
beeinflusst (MAHAPATRA et al. 2014).
ROSSBACH et al. (2009) untersuchten den Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (15
mg/kg i.p.) und des Glukokortikoids Dexamethason (5 mg/kg i.p.) in zwei unterschiedlichen
Mausmodellen der Kontaktallergie. Im TH1-vermittelten Allergiemodell wurde das Hapten
Dinitrochlorobenzen (DNCB) benutzt, im TH2-vermittelten Allergiemodell das Hapten
Toluendiisocyanat (TDI). In beiden Modellen zeigte JNJ 7777120 keine Verringerung der
Ohrschwellung; Dexamethason reduzierte diese hingegen signifikant. Dies spiegelte sich auch
in der histologischen Untersuchung des Zellinfluxes in die Haut sowie der Ödematisierung
dieser wider. Die Behandlung der Tiere mit dem H4R-Antagonisten bereits während der
Sensibilisierungsphase gegen DNCB konnte ebenfalls keine Linderung der Symptome
bringen. Auch die Blockade aller vier Histaminrezeptoren mit den Antagonisten
Diphenhydramin, Ranitidin und Thioperamid brachte keine Verbesserung.
Die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) und JNJ 28307474 (20
mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) wurden von COWDEN et al. (2010) in einem TH2-vermittelten
Kontaktallergiemodell, ausgelöst durch Fluoresceinisothiocyanat (FITC), untersucht. Beide
Antagonisten konnten die Ohrdicke als klinisches Anzeichen einer Entzündung reduzieren.
Literaturübersicht
21
Histologisch waren sowohl der Gesamtzellinflux als auch die Anzahl an Mastzellen und
Eosinophilen in der Haut verringert. Die Untersuchung des Homogenisats aus den betroffenen
Hautstellen auf den Gehalt verschiedener Zytokine ergab eine Reduktion von MIP-1α,
RANTES, IL-4, MCP-1, IL-1ß, IL-6, GM-CSF ebenso wie TNF-α. Die Ex-vivo-
Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten gewonnenen Zellpopulation führte zu
einer verringerten Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-17.
Im gleichen Model wurde auch der Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 39758979 (20 m/kg
p.o.; 50 mg/kg p.o.) auf die Entstehung von klinischen Symptomen bestimmt. Auch dieser
konnte die Ohrdicke verringern (THURMOND et al. 2014).
OHSAWA und HIRASAWA (2012) untersuchten die Wirkung des H4R-Antagonist JNJ
7777120 (30 mg/kg p.o.) sowie dessen Kombination mit dem H1R-Antagonisten Olopatadin
(3 mg/kg p.o.) in einem Mausmodell, das durch die Verwendung von NC/NgA-Mäusen und
dem Hapten Picrylchlorid, sowohl Teilaspekte der AD sowie einer Kontaktallergie
widerspiegelt. Die klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken sowie an den Ohren)
konnten durch beide Behandlungen reduziert werden. Olopatadin als Monotherapie hingegen
zeigte keinen Effekt. Die Kombination der beiden Antagonisten war genauso effektiv wie das
Glukokortikoid Prednisolon (3 mg/kg p.o.). Die kombinierte Behandlung reduzierte die
Epidermisdicke, die Einzelbehandlung mit JNJ 7777120 verringerte die Anzahl an Mastzellen
in der Haut. Der IgE-Gehalt im Plasma wurde nur durch die Kombination der Antagonisten
signifikant gesenkt. Die Bestimmung der Zytokine in der Haut zeigte eine Abnahme von
NGF, IL-4, IL-5, TSLP und TARC durch JNJ 7777120 sowie durch die Kombination mit
Olopatadin.
Der Effekt von H4R-Antagonisten in einem Mausmodell der AD wurde bisher nur von
KAMO et al. (2014) getestet. Dazu wurden die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (10 mg/kg
i.p.; 30 mg/kg i.p.) und JNJ 28307474 (10 mg/kg i.p.; 30 mg/kg i.p.) in NC/NgA-Mäusen, die
zusätzlich gegen Hausstaubmilben (Dfb) sensibilisiert wurden, auf ihre Wirksamkeit
untersucht. Es konnten jedoch keine Linderung der klinischen Symptome beobachtet werden
(KAMO et al. 2014).
In einigen dieser Modelle wurde auch der Einfluss von H1R- und H4R-Antagonisten auf den
allergisch bedingten Juckreiz bestimmt. So publizierten ROSSBACH et al. (2009), COWDEN
et al. (2010), SUWA et al. (2011) als auch OHSAWA und HIRASAWA (2012), dass der
Literaturübersicht
22
H4R-Antagonist JNJ 7777120 in der Lage ist, den Juckreiz in den jeweiligen Tiermodellen zu
hemmen. Lediglich KAMO et al. (2014) stellten fest, dass JNJ 7777120 keinen Einfluss auf
den allergiebedingten Juckreiz hat. Die Kombination eines H4R-Antagonisten mit einem
H1R-Antagonisten scheint zur Linderung des Juckreizes am effektivsten zu sein
(ROSSBACH et al. 2009; OHSAWA und HIRASAWA 2012).
Tabelle 3 gibt einen Überblick über die beschriebenen Modelle und den Effekt von H4R-
Antagonisten in diesen.
Literaturübersicht
23
Tabelle 3: Übersicht über die Effekte von H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der
atopischen Dermatitis und Kontaktallergie (↓ = Reduktion, - = kein Einfluss, k.A. = keine Angaben)
Antagonist Maus-stamm
Hapten/ Allergen
Klinische Symptome
Mast-zellen
IgE-Gehalt
TH2-Zytokine Autor
JNJ 7777120
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et al. (2012)
HR-1 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Suwa et al. (2011)
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Seike et al. (2010)
Balb/c OVA k.A. - k.A. - Mahapatra et al. (2014)
NMRI DNCB - k.A. k.A. k.A. Rossbach et al. (2009)
NMRI TDI - k.A. k.A. k.A. Rossbach et al. (2009)
Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al. (2010)
NC/Nga Picryl-chlorid ↓ ↓ - ↓
Ohsawa und Hirasawa
(2012)
NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al. (2014)
JNJ 28307474
Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al. (2010)
NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al. (2014)
JNJ 39758979 Balb/c FITC ↓ k.A. k.A. k.A. Thurmond et
al. (2014)
Kombination H1R-
Antagonist +
H4R-Antagonist
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et al. (2012)
Balb/c OVA k.A. - k.A. ↓ Mahapatra et al. (2014)
NC/Nga Picryl-chlorid ↓ - ↓ ↓
Ohsawa und Hirasawa
(2012)
Material und Methoden
24
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Material für In-vivo-Versuche
Baumwollgaze 20 x 20 cm Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied
BlendermTM 3M Medica, Neuss
Combifix Adapter Luer B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Einmalspritzen 1 ml Henry Schein, Hamburg
Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg
Isotone Kochsalz-Lösung 0,9% B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Kanülen 26G Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen
Knopfkanüle WDT, Garbsen
Peha Haft Color Paul Hartmann AG, Heidenheim
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Polypropylen-Röhrchen 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Schermaschine Moser Elektrogeräte GmbH, Unterkirnach
Serum-Gel Röhrchen Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Tesafilm Beiersdorf, Hamburg
Videokamera Legria HF S21 Canon Deutschland GmbH, Krefeld
Aceton Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Aqua ad inj. B. Braun Melsungen AG, Melsungen
ß-Cyclodextrin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Betamethason-17-valerat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Celestan ® MSD Sharp & Dohme GmbH, Haar
JNJ 39758979 Janssen PRD, USA
Mepyraminmaleat Abcam, Cambridge, UK
Methylcellulose Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Material und Methoden
25
Ovalbumin Grade V Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Veet®-Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim
4-Methylhistamindihydrochlorid Tocris Bioscience, UK
3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche
Brutschrank Thermo Fisher Scientific, Braunschweig
Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg
Homogenisator DUALL® 1 ml Omnilab, Gehrden
Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena
Neubauer-Zählkammer VWR International GmbH, Darmstadt
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Polypropylen-Röhrchen 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Polypropylen-Röhrchen 50 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Sterilbank Heraeus Lamin Air H. Jürgens GmbH & Co. KG, Bremen
Sterilfilter Minisart Sartorius, Göttingen
Wasserbad Memmert, Schwabach
Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig
6-,12-,24-,24,48-Well-Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Ethanol CG Chemikalien, Laatzen
Fetales Kälberserum 10 % Biochrom, Berlin
Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe
RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin
Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Trypan-Blau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Material und Methoden
26
3.1.3 Material für ELISA
Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Multipipette Eppendorf, Hamburg
Nunc-Immuno-Platten Thermo Fisher Scientific, Braunschweig
Photometer Dynatech, Denkendorf
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Rundschüttler Reax 2000 Heidolph, Kelheim
Waschpipette Eppendorf, Hamburg
LEGEND MAX™ Mouse BioLegend, San Diego, USA
OVA Specific IgE ELISA Kit
Mouse IL-4 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA
Mouse IL-6 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA
Mouse IL-10 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA
Mouse IFN-γ ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA
TMB Liquid-Substrat-System Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
3.1.1 Material für Histologie
Deckgläser 24x50 mm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Färbeküvetten Glas Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Heiztisch Vogel GmbH, Giesen
Mikrotom 2035 Reichert-Jung, Nusstoch
Objektträger Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Paraffin-Streckbad TFB45 Medite, Burgdorf
Schwämme für Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Paraffin-Einbettsystem MEDITE, Burgdorf
Wasserbad GFL, Burgwedel
Ethanol 70, 80, 96, 100 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Entellan Merck KGaA, Darmstadt
Material und Methoden
27
Eosin Merck KGaA, Darmstadt
Essigsäure AppliChem GmbH, Darmstadt
Giemsa-Lösung Merck KGaA, Darmstadt
Hämalaun Merck KGaA, Darmstadt
Isopropanol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken
Paraffin Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Pikrinsäure VWR International GmbH, Darmstadt
Xylol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken
3.1.2 Material für FACS
FACS-Gerät BD Biosciences, Belgien
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig
96-Well-Platten, round-bottom Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Bovines Serum Albumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
APC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend, San Diego, USA
FITC anti-mouse CD3ε BioLegend, San Diego, USA
PE anti-mouse CD11c Antibody BioLegend, San Diego, USA
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend, San Diego, USA
PE/Cy7 anti-mouse CD19 BioLegend, San Diego, USA
Antibody
Pacific Blue anti-mouse CD8a BioLegend, San Diego, USA
Antibody
Material und Methoden
28
3.1.3 Puffer und Lösungen
PBS Puffer
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2PO4 1,44 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua bidest ad 1000 ml
Einstellung von pH 7,2 (1 mol/l HCl)
Trypanblau-Lösung
Trypanblau 4 mg
PBS 1 ml
RPMI++-Medium
RPMI 500 ml
FKS 10 %
Penicillin/Streptomycin 1 %
Hämolyse-Puffer
NH4Cl 8,29 g
Na2EDTA 0,037 g
NaHCO3 0,839 g
Aqua bidest ad 1000 ml
Einstellung von pH 7,3 (1 mol/l HCl)
Material und Methoden
29
3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung
Für die Versuche wurden weibliche Balb/c Mäuse in einem Alter von 4 bis 8 Wochen von der
Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen.
Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ III mit „Häuschen“ bei 22°C und einem Licht/
Dunkel-Rhythmus von je 12 Stunden gehalten. Die Einstreu bestand aus Weichholzgranulat
(Altromin, Lage/Lippe). Wasser und Pelletfutter (Altromin 1324, Lage/Lippe) standen ad
libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden jeweils 14 Tage vor Versuchsbeginn eingestallt
und zweimal täglich an den Umgang gewöhnt.
Material und Methoden
30
3.2 Versuchsübersicht
Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des OVA-induzierten Mausmodell der atopischen
Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) sowie die Beurteilung verschiedener Wirkstoffe in
diesem Modell. Zunächst wurde untersucht, ob eine Störung der Hautbarriere die Ausprägung
AD- ähnlicher Hautläsionen im OVA-Modell beeinflussen kann. Dazu wurden drei Varianten
des Protokolls miteinander verglichen (s. Tabelle 4). Es wurden jeweils folgende Parameter
erfasst: die Ausprägung der Hautläsionen (Hautscore), die Epidermisdicke, die Anzahl an
Entzündungs- und Mastzellen in der Haut, der Allergen-spezifische IgE-Gehalt im Serum, das
Gewicht und die Zellzahl der Lnn. axillares sowie die Milzzellzahl.
Im Anschluss wurde die Wirkung eines H1R-Antagonisten, eines H4R-Antagonisten sowie
eines Glukokortikoids und deren Kombinationen im OVA-Modell untersucht. Um den
Behandlungserfolg beurteilen zu können, wurden zusätzlich zu den bereits genannten
Parametern das Zellprofil der Lnn. axillares sowie die OVA-induzierte Zytokinproduktion
(IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10) der aus der Milz isolierten Zellen bestimmt. Als Kriterium für
allergischen Juckreiz wurde das Kratzverhalten bewertet.
Material und Methoden
31
3.3 Methoden
3.3.1 Protokoll des OVA-Modells
Das OVA-Standardprotokoll (modifiziert nach SPERGEL et al. (1998)) besteht aus insgesamt
drei epikutanen Sensibilisierungswochen (SE) sowie zwei Wochen Provokationsphase
(Challenge; C). Zwischen diesen Phasen liegen jeweils 14 Tage Pause.
An Tag 1 wurden je Gruppe sieben Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen mittels Veet®-
Enthaarungscreme im Brustbereich enthaart. Nach 1 Std. Ruhezeit wurde den Mäusen ein
Patch mit OVA Grade V (100 µg/100 µl PBS) auf die enthaarte Brust gelegt. Das Patch
bestand aus drei Lagen Baumwollgaze (1,5 cm x 1,5 cm) und wurde mittels einer selbst-
haftenden Bandage (Peha Haft Color®) und chirurgischem, okklusivem Klebeband
(Blenderm®) fixiert. An Tag 4 wurde der Verband entfernt und nach 4 Stunden Wartezeit
wurden die Mäuse mit frisch angesetzter OVA Grade V-Lösung neu verbunden. Die erste
Sensibilisierungswoche endete an Tag 8 mit dem Entfernen des Verbandes. An Tag 22
begann Sensibilisierungswoche 2, diese verlief identisch zur Sensibilisierungswoche 1. Nach
dem gleichen Schema wurde Sensibilisierungswoche 3 ab Tag 43 durchgeführt. Im Rahmen
der ersten Challenge wurden die Mäuse an Tag 64 erneut mit Veet®-Enthaarungscreme
enthaart und nach einer Stunde wurde ein Patch mit OVA Grade VI (100 µg/100 µl PBS) auf
die gleiche Art und Weise wie in den Sensibilisierungswochen auf der Brust fixiert. An Tag
67 wurden der Verband und das OVA-Patch erneuert, dazu wurde frische OVA Grade VI-
Lösung benutzt. Der Verband wurde an Tag 71 morgens entfernt.
Abbildung 6: Zeitachse OVA-Standardprotokoll
Material und Methoden
32
Eine weitere Challenge wurde ab Tag 85 durchgeführt. An Tag 93 erfolgte die Tötung der
Mäuse mit anschließender Probenentnahme für weitere Untersuchungen. Die Tötung erfolgte
unter Inhalation von 5 % Isofluran und nachfolgendem Entbluten unter Narkose durch
Punktion des Herzens zur Blutentnahme.
3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der
atopischen Dermatitis
Es wurden drei Protokolle sowie eine Kontrolle miteinander verglichen (siehe Tabelle 4).
Tabelle 4: Übersicht über die miteinander verglichenen OVA-Protokolle
Protokoll Angewandtes Protokoll 1 PBS-Kontrolle 2 OVA-Standardprotokoll 3 OVA-Standardprotokoll + Aceton 4 OVA-Standardprotokoll + Tesa-Strippen
3.3.2.1 PBS-Kontrolle
Als Kontrolle wurden die Mäuse gemäß dem OVA-Standardprotokoll behandelt, allerdings
wurde auf die Patches keine OVA-Lösung sondern lediglich PBS (100 µl) gegeben.
3.3.2.2 OVA-Standardprotokoll
Das bereits beschriebene OVA-Protokoll wurde in diesem Durchgang als OVA-
Standardprotokoll bezeichnet und unverändert angewandt.
3.3.2.3 OVA-Protokoll mit Aceton
Auch dieses Protokoll basiert auf dem OVA-Standardprotokoll, die Haut an der Brust wurde
zusätzlich vor jedem Auflegen des OVA-Patches dreimal mit einem in Aceton getränktem
Tuch abgewischt. Ziel war es, die Hautbarriere zu stören (RISSMANN et al. 2009).
3.3.2.4 OVA-Protokoll mit Tesa-Strippen
Dieses Protokoll basiert ebenso auf dem OVA-Standardprotokoll, jedoch wurde vor dem
Auflegen des OVA-Patches ein Tesafilmstreifen zehnmal auf die enthaarte Brust geklebt und
schnell abgerissen. Dies erfolgte bei jeder Erneuerung des Verbandes um eine Störung der
Hautbarriere zu verursachen (RISSMANN et al. 2009).
Material und Methoden
33
Abweichend vom eigentlichen OVA-Standardprotokoll hatte dieser Versuch nur eine
Provokationswoche. Daher wurden die Mäuse bereits an Tag 72 getötet und Proben
entnommen. Es wurden folgende Parameter untersucht: der klinische Hautscore, Gewicht und
Zellzahl der Lnn. axillares, Milzzellzahl, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum,
Epidermisdicke sowie die Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.
3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen
Dermatitis im OVA-Modell
Es wurden mehrere Durchgänge des OVA-Standardprotokolls mit unterschiedlichen
Behandlungen durchgeführt (s. Tabelle 5). Je Durchgang wurde immer eine Kontrollgruppe
mit einem Vehikel (Lösungsmittel der Testsubstanzen) behandelt.
Es wurden folgende Parameter untersucht: Klinischer Hautscore, Kratzverhalten,
Lymphknotengewicht und –zellzahl, Zellprofil der drainierenden Lymphknoten, Milzzellzahl,
OVA-induzierte Zytokinproduktion der Splenozyten, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im
Serum, epidermale Hyperproliferation, Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.
Tabelle 5: Verwendete Wirkstoffe und Dosierungen im OVA-Modell
Wirkstoff Dosierung
Mepyramin
(H1R-Antagonist) 20 mg/kg i.p.
JNJ 39758979
(H4R-Antagonist)
20 mg/kg p.o.
50 mg/kg p.o.
20 mg/kg i.p.
Betamethason
(Glukokortikoid)
1 mg/kg p.o.
2 mg/kg i.p.
Mepyramin + JNJ 39758979 20 mg/kg i.p. + 20 mg/kg i.p.
JNJ 39758979 + Betamethason 20 mg/kg i.p. + 2 mg/kg i.p.
Material und Methoden
34
3.3.3.1 H4R-Antagonist JNJ 39758979
Der H4R-Antagonist JNJ 39758979, im folgenden JNJ 3975 genannt, wurde in zwei
unterschiedlichen Dosierungen und zwei Applikationsarten verabreicht. Zur oralen Gabe
wurde JNJ in 20% ß-Cyclodextrin gelöst und mittels einer Knopfsonde zwei- bzw. dreimal
täglich verabreicht (THURMOND et al. 2014). Für die i.p. Behandlung wurde JNJ in Aqua ad
inj. gelöst.
Die jeweiligen Zeitpunkte der Behandlungen sowie die Dosierungen sind in Tabelle 6
aufgeführt.
Tabelle 6: Behandlungsschema JNJ 39758979
Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
20 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.
50 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.
20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.
3.3.3.2 H1R-Antagonist Mepyramin
Die Behandlung mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin erfolgte zweimal täglich in einer
Dosierung von 20 mg/kg i.p.. Dafür wurde Mepyramin in Aqua ad inj. gelöst. Zeitpunkt
sowie Dosierung sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7: Behandlungsschema Mepyramin
Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.
Material und Methoden
35
3.3.3.3 Glukokortikoid Betamethason
Betamethason wurde sowohl als Betamethasonvalerat (oral) als auch als Betamethason-
phosphat (i.p.) einmal täglich morgens verabreicht. Für die orale Gabe wurde Betamethason
in 0,5% Methylcellulose, für die i.p. Gabe in Aqua ad inj. gelöst (MAEKAWA et al. 2006).
Tabelle 8 zeigt das Behandlungsschema.
Tabelle 8: Behandlungsschema Betamethason
Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
1 mg/kg p.o. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.
2 mg/kg i.p. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.
3.3.3.4 Kombination Mepyramin und JNJ 39758979
Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Zeitpunkt sowie Dosierung
sind in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9: Behandlungsschema Kombination Mepyramin und JNJ 39758979
Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C Mepyramin
20 mg/kg i.p. +
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
- - - 2 x tgl.
+ 2 x tgl.
2 x tgl. +
2 x tgl.
Material und Methoden
36
3.3.3.5 Kombination JNJ 39758979 und Betamethason
Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Betamethasonphosphat
wurde einmal täglich verabreicht, JNJ 3975 zweimal täglich (s. Tabelle 10).
Tabelle 10: Behandlungsschema Kombination JNJ 39758979 und Betamethason
Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
+ Betamethason 2 mg/kg i.p.
- - - 2 x tgl.
+ 1 x tgl.
2 x tgl. +
1 x tgl.
3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell
3.3.4.1 Bewertung der Hautläsionen
An Tag 91 erfolgte die Bewertung der Hautläsionen verblindet 8 Stunden nach Entfernung
des Verbandes. Es wurde ein Score-System benutzt. Bewertet wurden drei Parameter:
Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem. Dafür wurde die in Tabelle 11 beschriebene
Skala benutzt:
Tabelle 11: Einteilung Hautscore (Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem)
Score Definition Schweregrad 0 Keine Veränderungen 1 Leichte Veränderungen 2 Moderate Veränderungen 3 Schwere Veränderungen 4 Sehr schwere Veränderungen
Aus der Summe der Einzelparameter ergab sich der Gesamtscore (0-12).
Material und Methoden
37
3.3.4.2 Bewertung des Allergen-induzierten Juckreizes
Am Ende der zweiten Provokationswoche wurden die Mäuse direkt nach dem Entfernen des
Verbandes in Acrylglaskäfige gesetzt und 30 Minuten gefilmt. Bei der Auswertung des
Videomaterials wurde die Anzahl der Kratzattacken (Kratzen mit dem Hinterbein an der
seitlichen Brustwand sowie ventral an Brust und Bauch ohne Absetzen der Gliedmaße)
gezählt.
3.3.4.3 Histologie
Aus dem ventralen Thoraxbereich wurde nach Tötung der Tiere ein ca. 1,5 x 1 cm großes
Hautstück entnommen und in Bouin´scher Lösung fixiert. Nach 48 Stunden wurden die
Hautstücke in Paraffin gebettet, geschnitten und auf Objektträger gezogen. Dazu wurde
folgendes Protokoll angewandt:
Die Hautstücke wurden in Kassetten mit Schaumstoff gebettet und zur Entwässerung in eine
aufsteigende Alkoholreihe gegeben. Danach wurden die Proben für 4 Stunden in Xylol und
über Nacht in Paraffin inkubiert und anschließend in Paraffinblöcke gegossen.
Mittels eines Mikrotoms wurden 7 µm dicke Schnitte angefertigt, in ein Streckbad gegeben
und auf einen Objektträger gezogen. Diese wurden zum Trocknen auf einen 50°C warmen
Strecktisch gelegt. Nachdem die Schnitte über Nacht im Trockenschrank bei 60°C weiter
getrocknet wurden, erfolgte die Färbung der Schnitte (Hämatoxylin-Eosin (HE) oder Giemsa).
3.3.4.4 Bestimmung der Epidermisdicke und Anzahl der Entzündungszellen in der
Haut mittels HE-Färbung
Um die Epidermisdicke sowie die Anzahl der Entzündungszellen in der Haut zu bestimmen,
wurden die Hautschnitte nach folgendem Protokoll gefärbt:
• Xylol 2 Minuten
• Xylol 2 Minuten
• Absteigende Alkoholreihe je 2 Minuten
• Destilliertes Wasser 5 Minuten
• Hämalaun 8 Minuten
• Salzsaurer Alkohol 2 Sekunden
Material und Methoden
38
• Fließendes Leitungswasser 5 Minuten
• Eosin 2 Minuten
• Leitungswasser 30 Sekunden
• Aufsteigende Alkoholreihe je 20 Sekunden
• Xylol 20 Sekunden
• Xylol 20 Sekunden
Direkt nach der Färbung wurden die feuchten Schnitte mit Entellan eingedeckt.
Die histologische Auswertung erfolgte verblindet. Die Epidermisdicke (Distanz von der
Basalmembran bis zum Stratum corneum) wurde an 10 zufällig gewählten Stellen mittels
Axiovision-Software bei zwanzigfacher Vergrößerung gemessen und der Mittelwert pro Maus
berechnet. Die Anzahl der Entzündungszellen wurde mittels eines Scoresystems bewertet:
Dieses reichte von 0 (kein Zellinflux) bis 4 (hochgradiger Zellinflux).
3.3.4.5 Bestimmung der Anzahl an Mastzellen in der Haut mittels Giemsa-Färbung
Zur Bestimmung der Anzahl an Mastzellen in der Haut, wurden die Paraffinschnitte nach
folgendem Protokoll Giemsa gefärbt:
• Xylol 2 Minuten
• Xylol 2 Minuten
• Absteigende Alkoholreihe je 2 Minuten
• Destilliertes Wasser 5 Minuten
• Giemsa-Lösung filtriert 5 Minuten
• Essigsäure 0,1% 20 Sekunden
• Essigsäure 0,1% (Schwenken bis sich keine Farbwolken mehr ablösen)
• Destilliertes Wasser 10 Sekunden
• Isopropanol 20 Sekunden
• Isopropanol 20 Sekunden
• Isopropanol (Schwenken bis sich keine Farbwolken mehr ablösen)
• Xylol 5 Minuten
• Xylol 5 Minuten
Material und Methoden
39
Direkt nach der Färbung wurden die noch feuchten Schnitte mit Entellan eingedeckt. Die
Auswertung erfolgte verblindet. Die Anzahl an Mastzellen wurde in zehn zufällig
ausgesuchten Arealen gezählt und der Mittelwert pro Maus berechnet.
3.3.4.6 Bestimmung des Gewichts und der Gesamtzellzahl der Lnn. axillares
Die axillären Lymphknoten wurden beidseits freipräpariert und gewogen. Jeder Lymphknoten
wurde einzeln mittels einem Homogenisator und Glaspistill in 1ml sterilem PBS manuell
homogenisiert und die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Dazu
wurden 10 µl der Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau-Lösung gemischt und die angefärbten
Zellen unter einem Invertmikroskop bei vierzigfacher Vergrößerung in der Neubauer-
Zählkammer gezählt.
3.3.4.7 Bestimmung der Zellpopulationen in den Lnn. axillares
Die Zellpopulationen in den drainierenden Lymphknoten (Lnn. axillares) wurde mittels
Durchflusszytometrie (Fluorescense Activated Cell Sorting, FACS-Analyse) bestimmt. Pro
Maus wurden 500.000 Zellen/Well auf einer 96-Well-Platte mit rundem Boden ausgesät. Um
die Zellen mit den in Tabelle 12 aufgeführten Antikörper zu färben, wurde ein Mastermix
(2 µl/ Antikörper/Probe) hergestellt und von diesem 12 µl auf jede Probe gegeben. Nach 20
Minuten Inkubationszeit bei 4 °C wurden die Zellen gewaschen. Dazu wurden 100 µl PBS +
5 % BSA auf jede Probe gegeben, bei 300G für 7 Minuten zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Zellpellet in 200 µl PBS + 5% BSA aufgenommen. Im FACS-Gerät wurde
der Gehalt an T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, B-Zellen, dendritischen Zellen und
Makrophagen in der Zellsuspension bestimmt.
Material und Methoden
40
Tabelle 12: Für FACS-Analyse benutzte Antikörper
Antikörper Gefärbte Zellpopulation
FITC anti-mouse CD3ε Antibody T-Zellen
Pacific Blue™ anti-mouse CD8a Antibody CD8+ T-Zellen
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody CD4+ T-Zellen
PE/Cy7 anti-mouse CD19 Antibody B-Zellen
PE anti-mouse CD11c Antibody dendritische Zellen
APC anti-mouse F4/80 Antibody Makrophagen
3.3.4.8 Bestimmung der Milzzellzahl
Zur Bestimmung der Milzzellzahl wurden zwei unterschiedliche Methoden angewandt:
In den ersten zwei Versuchsdurchgängen wurden beide Milzpole entfernt und die Milz mit 10
ml sterilem PBS durchgespült. Die so gewonnene Zellsuspension wurde zentrifugiert (1000G,
10 Minuten) und das entstandene Zellpellet in 5 ml Hämolysepuffer aufgenommen. Die
Hämolysereaktion wurde nach 5 Minuten durch die Zugabe von 45 ml sterilem PBS gestoppt.
Nach erneutem Zentrifugieren (1000G, 10 min.) wurde das Zellpellet in 5 ml RPMI++
resuspendiert. Die vorhandenen Splenozyten konnten in einer Neubauer-Zählkammer mittels
Trypanblau (Verdünnung 1:10) unter einem Invertmikroskop bei vierzigfacher Vergrößerung
gezählt werden. Da mit dieser Methode nur eine geringe Anzahl an Splenozyten gewonnen
werden konnte, wurde in den folgenden Versuchsdurchgängen die Methode geändert:
Die Milz wurde zunächst in vier Teile zerschnitten und durch ein Sieb mit einer
Maschengröße von 70 µm gerieben. Das Sieb wurde im Anschluss mit PBS gespült und die
entstandene Zellsuspension wurde wie bei der bereits beschriebenen Methode weiter
verarbeitet.
Material und Methoden
41
3.3.4.9 Bestimmung der OVA-induzierten Zytokinproduktion der Splenozyten
Die Splenozyten wurden in einer 24-Well-Platte (3 Mio. Zellen/ml RPMI++ /Well) ausgesät.
Drei Wells pro Maus wurde OVA Grade VI (100 µg/100 µl PBS) zugesetzt, weiteren drei
Wells wurde PBS (100 µl) zugesetzt. Die Zellen wurden im Brutschrank inkubiert (37 °C; 5%
CO2), nach 4 Tagen wurden die Überstände genommen und bei -20°C gelagert. Mittels
ELISA wurde der Gehalt an IFN-γ, IL-4, IL-10 und IL-6 bestimmt.
3.3.4.10 Bestimmung des OVA-spezifischen IgE-Gehaltes im Serum
Zur Blutgewinnung wurde das Herz mittels einer 25G-Kanüle punktiert, ca. 500 µl Blut
entnommen und in Serumröhrchen überführt. Nach 20 Minuten Standzeit bei Raum-
temperatur wurde das Serum bei 10.000G für 5 Minuten abzentrifugiert und bis zur Messung
bei -20°C gelagert. Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA
bestimmt. Dieser wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
3.4 Statistische Auswertung
Die Ergebnisse wurden mittels Boxplot (Median, oberes und unteres Quartil, Minimum und
Maximum) oder Streudiagramm mit Mittelwert dargestellt. Die Auswertung der Daten
erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 6, GraphPad Software, Inc.).
Für die Auswertung der untersuchten Parameter wurden die behandelten Gruppen mit der
jeweils entsprechenden Vehikelgruppe auf signifikante Unterschiede verglichen. Dazu wurde
der Kruskal-Wallis-Test verwendet und Irrtumswahrscheinlichkeiten von 0,1 %, 1 % und 5 %
bestimmt. Wurde lediglich eine behandelte Gruppe mit einer Vehikelgruppe verglichen, so
wurde der Mann-Whitney-Test angewendet.
Ergebnisse
42
4 Ergebnisse
4.1 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des Ovalbumin-induzierten Modells
der atopischen Dermatitis (OVA-Protokoll)
Es wurden drei Varianten des OVA-Standardprotokolls mit unterschiedlichen Methoden zur
Störung der Hautbarriere mit einer PBS-Kontrollgruppe verglichen. Variante 1 entsprach dem
OVA-Protokoll nach SPERGEL et al. (1998) und wird als OVA-Standardprotokoll
bezeichnet. Um die Hautbarriere zu stören, wurden zwei Methoden angewandt: das
Abwischen der Haut mit Aceton sowie das Tesa-Strippen der Haut. Die Ergebnisse der
untersuchten Parameter sind im Folgenden aufgeführt. Die Einzelwerte der jeweiligen
Parameter finden sich im Anhang.
4.1.1 Klinischer Hautscore
Die entstandenen Hautläsionen wurden mittels eines Scoresystems bewertet und aus den
einzelnen Werten wurde ein Gesamtscore berechnet (siehe Methodenteil 4.). Eine zusätzliche
Störung der Hautbarriere durch Aceton oder Tesa-Strippen war nicht in der Lage, den
gleichen Schweregrad der Hautläsionen wie das OVA-Standardprotokoll hervorzurufen. Der
Score des OVA-Standardprotokolls war bei allen Einzelparametern am höchsten. Sowohl der
Score für die Beurteilung des Erythems als auch der Gesamtscore waren bei diesem Protokoll
signifikant erhöht gegenüber der PBS-Kontrollgruppe (Tabelle 13 und Abbildung 8).
Abbildung 7: Bauchhaut einer nach dem OVA-Standardprotokoll behandelten Maus; zu sehen sind Schuppen,
Erosionen und Erythem.
Ergebnisse
43
Tabelle 13: Übersicht über die Einzelparameter des klinischen Hautscores der verglichenen Protokolle; angegeben ist
der Median der jeweiligen Einzelparameter Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem sowie deren Summe als
Gesamtscore; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit
Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Angewandtes
Protokoll Schuppen
Erosion/
Exkoration Erythem Gesamtscore
PBS 1,5 0,5 1 3
OVA 3 2 2 7
OVA
+
Aceton
2 1 1 4
OVA
+
Tesa
1 1 1 3
Abbildung 8: Klinischer Hautscore der miteinander verglichenen Protokolle, dargestellt ist der Gesamtscore aus den
Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-
Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit
Tesa-Strippen.
Ergebnisse
44
4.1.2 Histologie
Die Epidermisdicke sowie die Anzahl an Entzündungszellen in der Haut wurden verblindet
bei zwanzigfacher Vergrößerung an HE-gefärbten Hautschnitten beurteilt. Haut von Mäusen,
die nach dem OVA-Standardprotokoll oder dem OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen
behandelt wurden, zeigte eine signifikante Zunahme der Epidermisdicke sowie eine
gesteigerte Anzahl an Entzündungszellen im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe. Auch die
Behandlung nach dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton verursachte einen Anstieg der
Epidermisdicke und des inflammatorischen Zellinfluxes, allerdings war dieser nicht
signifikant (Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11).
Abbildung 9: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-
Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit
Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
45
Abbildung 10: HE-gefärbter Hautschnitt einer Maus aus der PBS-Kontrollgruppe.
Abbildung 11: HE-gefärbter Hautschnitt einer Maus aus der OVA-Standardprotokoll-Gruppe; man sieht eine
deutliche Zunahme der Epidermisdicke sowie einen erhöhten inflammatorischen Zellinflux im Vergleich zur PBS-
Kontrollgruppe (Abbildung 10).
Die Anzahl an Mastzellen wurde mittels Giemsa-Färbung bestimmt und pro Schnitt die
Mastzellen in 5 Gesichtsfeldern bei vierzigfacher Vergrößerung gezählt und der Mittelwert
berechnet. Die Anzahl an Mastzellen war bei Mäusen, die nach dem OVA-Standardprotokoll
sowie nach dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton sensibilisiert wurden, signifikant erhöht
(Abbildung 12).
Ergebnisse
46
Abbildung 12: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung); PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-
Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit
Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.
4.1.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl
Der rechte und linke axilläre Lymphknoten wurde entnommen und das Gesamtgewicht sowie
die Gesamtzellzahl beider Lymphknoten zusammen bestimmt. Abbildung 13 zeigt, dass
Mäuse, die nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt wurden, ein signifikant höheres
Lymphknotengewicht als die PBS-Kontrollgruppe aufwiesen. Ein Unterschied in der
Gesamtzellzahl der Lymphknoten war zwischen den einzelnen Gruppen nicht zu erkennen.
Ergebnisse
47
Abbildung 13: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-
Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit
Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.
4.1.4 Milzzellzahl
Als weiterer Indikator für die Aktivierung des Immunsystems wurde die Milzzellzahl
bestimmt. Dabei zeigte sich ein geringerer Anstieg der Milzzellzahl bei Mäusen, die nach
dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton behandelt wurden (Abbildung 14).
Abbildung 14: Milzzellzahl, PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-
Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
48
4.1.5 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum
Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA bestimmt. Bei Mäusen, die
nicht mit OVA sensibilisiert wurden, konnte kein OVA-spezifisches IgE nachgewiesen
werden. Die Behandlung mit OVA führte bei allen Gruppen zu einer Produktion von OVA-
spezifischem IgE im Serum (14,19 ± 10,77 ng/ml).
4.2 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis
im OVA-Modell
Zur Untersuchung des Effekts verschiedener Wirkstoffe im OVA-Modell wurden Mäuse nach
dem OVA-Standardprotokoll behandelt und während der zwei Challengephasen mit den
verschiedenen Wirkstoffen behandelt. Untersucht wurde die Wirkung eines H1R-
Antagonisten (Mepyramin), eines H4R-Antagonisten (JNJ 3975), eines Glukokortikoids
(orale Gabe: Betamethason-17-valerat, intraperitoneale Gabe: Betamethasonphosphat) sowie
deren Kombinationen. Alle Wirkstoffe wurden während den zwei Challengephasen
verabreicht. Im Folgenden sind die Ergebnisse, gegliedert nach den untersuchten
Einzelparametern, gezeigt. Die Einzelwerte sind im Anhang aufgeführt.
4.2.1 Klinischer Hautscore
Die Hautläsionen wurden wie zuvor nach einem Scoresystem bewertet und dabei die
Entstehung von Schuppen, Erosionen/Exkorationen und Erythemen beurteilt. Die Summe der
Einzelparameter ergab den Gesamtscore. Eine Behandlung mit JNJ 3975, unabhängig vom
Applikationsweg und Dosierung, oder Mepyramin allein war nicht in der Lage, die einzelnen
Parameter und somit auch den Gesamtscore im Vergleich zur Vehikelgruppe zu senken
(Abbildung 15 und Abbildung 16). Die intraperitoneale Behandlung mit Betamethason-
phosphat (2 mg/kg) zeigt eine Tendenz zur Verbesserung des Gesamtscores (Abbildung 17).
Ergebnisse
49
Abbildung 15: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.; 20 mg/kg i.p.)
behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der
Gesamtscore aus den Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer
unbehandelten Kontrolle in allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.
Abbildung 16: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle
Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der Gesamtscore aus den
Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer unbehandelten Kontrolle in
allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.
Ergebnisse
50
Abbildung 17: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethason (1 mg/kg p.o.; 2 mg/kg i.p.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der Gesamtscore aus den
Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer unbehandelten Kontrolle in
allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.
Die kombinierte Behandlung mit Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20
mg/kg i.p.) führte zu einer signifikant reduzierten Bildung von Erosionen/Exkorationen und
zu einer Abnahme des Gesamtscores (Abbildung 18).
Abbildung 18: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg
i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der
Gesamtscore aus den Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer
unbehandelten Kontrolle in allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.
Ergebnisse
51
Auch die Behandlung mit der Kombination des H1R-Antagonisten Mepyramin (20 mg/kg
i.p.) und dem H4R-Antagonisten JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) reduzierte die Entstehung von
Erosionen/Exkorationen, Erythem und den Gesamtscore signifikant (Abbildung 19).
Abbildung 19: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg
i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der
Gesamtscore aus den Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer
unbehandelten Kontrolle in allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.
4.2.2 Histologie
Die intraperitoneale Behandlung mit dem Glukokortikoid Betamethasonphosphat (2 mg/kg
i.p.) senkte die Anzahl an Entzündungszellen in der Haut signifikant, beeinflusste jedoch
nicht die Epidermisdicke (Abbildung 20). Die Kombination von Betamethasonphosphat (2
mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) sowie auch die Kombination von Mepyramin (20
mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) reduzierte die Epidermisdicke als auch die Anzahl
an Entzündungszellen in der Haut signifikant (Abbildung 21 und Abbildung 22).
Ergebnisse
52
Abbildung 20: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit Betamethason
(2 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als
Boxplot.
Abbildung 21: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit einer
Kombination aus Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden
nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
53
Abbildung 22: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit einer
Kombination aus Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden
nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Die Anzahl an Mastzellen war bei Mäusen, die mit JNJ 3975 (50 mg/kg p.o.), mit
Betamethason (1 mg/kg p.o.) oder mit der Kombination aus Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und
JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden, signifikant reduziert (Abbildung 23, Abbildung
24, Abbildung 25). Alle anderen Behandlungen zeigten keinen Einfluss auf die
Mastzellanzahl.
Abbildung 23: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit JNJ
3975 20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o. behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
54
Abbildung 24: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit
Betamethason 1 mg/kg p.o. behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll; Darstellung
als Boxplot.
Abbildung 25: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit
Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-
Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
55
4.2.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl
Eine Abnahme des Gewichts und der Zellzahl wurde durch die Behandlung mit Mepyramin
(30 mg/kg i.p.), Betamethason (2 mg/kg i.p.) und der Kombination aus
Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) erreicht (Abbildung 26,
Abbildung 27, Abbildung 28). Alle anderen Behandlungen zeigten keinen signifikanten
Einfluss auf das Lymphknotengewicht sowie die Zellzahl.
Abbildung 26: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Mepyramin
(30 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Abbildung 27: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Betamethason
(2 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
56
Abbildung 28: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Betamethason
(2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt;
Darstellung als Boxplot.
Zellpopulation der Lnn. axillares
Die Bestimmung der Zellpopulation in den Lnn. axillares erfolgte per FACS-Analyse. Dazu
wurden der rechte und der linke Ln. axillaris gepoolt. Tabelle 14 gibt eine Übersicht über die
veränderte Zellanzahl gegenüber der jeweiligen Vehikelgruppe.
Ergebnisse
57
Tabelle 14: Übersicht über die Änderungen der Zellzusammensetzung der Lnn. axillares gegenüber der
jeweiligenVehikelgruppe; - = keine signifikanten Änderungen gegenüber der Vehikelgruppe, ↑ = signifikante
Zunahme der Zellpopulation, ↓ = signifikante Abnahme der Zellpopulation; alle Gruppen wurden nach dem OVA-
Standardprotokoll behandelt.
Behandlung B-Zellen Makro-
phagen DC T-Zellen
CD4+
T-Zellen
CD8+
T-Zellen
JNJ 3975
20 mg/kg p.o. - - - - - -
JNJ 3975
50 mg/kg p.o. - ↑ - - - -
JNJ 3975
20 mg/kg i.p. - - - - - -
Mepyramin
30 mg/kg i.p. ↓ - - ↓ ↓ ↓
Betamethason
1 mg/kg p.o. - - ↓ - - -
Betamethason
2 mg/kg i.p. - - - - - -
Betamethason
+
JNJ 3975
↓ - ↓ ↓ ↓ ↓
Mepyramin
+
JNJ 3975
- - - - - -
Ergebnisse
58
4.2.4 Milzzellzahl
Die Milzzellzahl wurde durch die Behandlung der Mäuse mit JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.) und
auch durch die kombinierte Behandlung mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20
mg/kg i.p.) gegenüber der jeweiligen Vehikelgruppe signifikant reduziert (Abbildung 29 und
Abbildung 30). Alle weiteren Behandlungen zeigten keinen Effekt.
Abbildung 30: Milzzellzahl nach der Behandlung der Mäuse mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg
i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Abbildung 29: Milzzellzahl nach der Behandlung der Mäuse mit JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.); alle Gruppen
wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
59
4.2.5 Zytokinsekretion Splenozyten
Die Stimulation der zuvor isolierten Splenozyten mit OVA führte zu einer Sekretion aller
untersuchten Zytokine. Splenozyten von Mäusen, die mit JNJ 3975 (50 mg/kg p.o.) behandelt
wurden, produzierten signifikant mehr IL-4 als die Vehikelgruppe. Die Behandlung mit
Betamethasonphosphat (1 mg/kg p.o.) hingegen führte zu einer Reduktion von IL-4 im
Überstand (Abbildung 31). Diese Behandlung führte ebenfalls zu einer signifikanten
Abnahme der Zytokine IL-6 und IL-10. Eine verringerte Produktion des Zytokins IL-6 im
Vergleich zur Vehikelgruppe lag auch bei Splenozyten von Mäusen vor, die mit Mepyramin
(30 mg/kg i.p.) behandelt worden waren (Abbildung 32). Die Kombination von Mepyramin
(20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) führte zu einer signifikanten Reduktion von IL-
10 (Abbildung 33). Das Zytokin IFN-γ konnte im Überstand von stimulierten Splenozyten
nachgewiesen werden (406,39 ± 498,81 pg/ml), eine Beeinflussung durch die verschiedenen
Wirkstoffe fand jedoch nicht statt. Die Stimulation der Splenozyten von Mäusen, die mit
Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) oder dem entsprechenden Vehikel
behandelt worden waren, gelang aus unbekannter Ursache nicht. Wider Erwarten produzierten
die Splenozyten der Vehikelgruppe trotz Stimulation mit OVA keine Zytokine.
Abbildung 31: IL-4-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit JNJ 3975 (20 mg/kg
p.o.; 50 mg/kg p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Betamethasonphosphat (1 mg/kg p.o.) behandelt; alle
Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
A: B:
Ergebnisse
60
Abbildung 32: IL-6-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit Betamethason (1 mg/kg
p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Mepyramin (30 mg/kg i.p.) behandelt ; alle Gruppen wurden nach dem
OVA-Standardprotokoll behandelt ; Darstellung als Boxplot.
Abbildung 33: IL-10-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit Betamethason
(1 mg/kg p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.)
behandelt ; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
A: B:
A: B:
Ergebnisse
61
4.2.6 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum
Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA bestimmt. Nur die
kombinierte Behandlung mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) konnte
den IgE-Gehalt gegenüber der Vehikelgruppe signifikant senken (Abbildung 34). Alle
anderen Behandlungen zeigten keinen Unterschied zur Vehikelgruppe.
Abbildung 34: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum von Mäusen, die mit einer Kombination aus Mepyramin (20
mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
62
4.2.7 Juckreiz
Die Mäuse wurden direkt nach dem Entfernen des Verbandes für 30 min gefilmt und die
Kratzattacken gezählt. Mäuse, deren Patch mit PBS anstatt mit OVA getränkt war, zeigten 15
± 2 Kratzattacken in 30 min. OVA-behandelte Mäuse zeigten 45 ± 24 Kratzattacken in 30
min. Eine signifikante Abnahme des Juckreizes wurde durch die Behandlung mit
Betamethason (1 mg/kg p.o.) und durch die Kombination von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und
JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) erreicht (Abbildung 35). Die Behandlung der Mäuse mit
Betamethason (2 mg/kg i.p.) und die kombinierte Behandlung mit Betamethason (2 mg/kg
i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) zeigten eine Tendenz zur Reduktion des Juckreizes. JNJ
3975 und Mepyramin als Monotherapie hatten keinen Einfluss auf den Juckreiz.
Abbildung 35: Anzahl an Kratzattacken/30 min direkt nach Entfernen des Verbandes in der 2. Challenge, alle
Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.
Ergebnisse
63
4.2.8 Vergleich der Vehikelgruppen
Um die Stabilität des OVA-Modells beurteilen zu können, wurden der Gesamtscore der
Hautläsionen sowie der OVA-spezifische IgE-Gehalt der verschiedenen Vehikelgruppen mit-
einander verglichen. Dabei zeigte sich, dass kein Gesamtscore der einzelnen Vehikelgruppen
signifikant voneinander abwich (Abbildung 36). Der OVA-spezifische IgE-Gehalt hingegen
war in den letzten beiden Durchgängen signifikant gegenüber der ersten drei
Versuchsdurchgängen erhöht. Es musste jedoch ein neues ELISA-Kit für die Auswertung
dieser zwei Durchgänge benutzt werden (Abbildung 37).
Abbildung 36: Übersicht über den Gesamtscore der Hautläsionen aller Vehikelgruppen; alle Gruppen wurden nach
dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Streudiagramm mit Median.
Abbildung 37: Übersicht über den OVA-spezifischen IgE-Gehalt im Serum aller Vehikelgruppen; alle Gruppen
wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Streudiagramm mit Mittelwert.
Diskussion
64
5 Diskussion
Die AD ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die mit einer relativ hohen Prävalenz
bei Menschen und Hunden auftritt (HILLIER und GRIFFIN 2001; SILVERBERG und
HANIFIN 2013). Die klinischen Symptome, vor allem jedoch der starke Juckreiz, schränken
die Lebensqualität der Betroffenen deutlich ein (SPERGEL und PALLER 2003). Bisherige
Therapien beim Menschen sind die Gabe von Glukokortikoiden, H1R-Antagonisten und
Immunmodulatoren wie Cyclosporin und Tacrolimus. Diese haben jedoch nicht bei allen
Patienten zufriedenstellenden Erfolg oder verursachen Nebenwirkungen (RUZICKA und
GLÜCK 1983; LEUNG 2000; MATSUOKA et al. 2003; LEUNG et al. 2004). Auch für die
Behandlung der caninen AD werden Glukokortikoide, H1R-Antagonisten und
Immunmodulatoren eingesetzt (OLIVRY und SOUSA 2001). Seit einiger Zeit ist der Janus-
Kinase-Hemmer Oclacitinib zur Behandlung der caninen AD zugelasssen. Dieser zeigt gute
Behandlungserfolge, allerdings können noch keine Aussagen über mögliche Nebenwirkung
durch eine Langzeitgabe getroffen werden (COSGROVE et al. 2013a; COSGROVE et al.
2013b).
Daher besteht weiterer Bedarf an der Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung der AD.
Um diese Wirkstoffe auf ihren Nutzen testen zu können, werden Tiermodelle der AD
benötigt. Dabei sollten diese Modelle folgende Kriterien erfüllen: die klinischen
Hauptsymptome der Krankheit sollten gezeigt werden, sie sollten reproduzierbar sein,
genetische Homogenität der Tiere und detailliertes Wissen über den Organismus dieser Tiere
sollten vorhanden sein und die gewonnenen Daten sollten auf den Menschen übertragbar sein
(GUTERMUTH et al. 2004). Ziel dieser Arbeit war es daher, ein bereits beschriebenes
Mausmodell der AD (SPERGEL et al. 1998; SPERGEL et al. 1999; YOO et al. 2005; WANG
et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; ZHU et al. 2015) näher zu charakterisieren und zu
untersuchen, ob die Störung der Hautbarriere durch Abwischen mit Aceton oder Tesa-
Strippen die Entwicklung der Symptome beeinflusst. Weiterhin wurde an diesem Mausmodell
der AD der Effekt von verschiedenen Wirkstoffen untersucht. Dabei wurde besonderes
Augenmerk auf den H4R als möglichen neuen Ansatzpunkt zur Behandlung der AD gelegt.
Die Wirkung eines Glukokortikoids wurde als häufig genutzte Standardtherapie bei AD als
Diskussion
65
Positivkontrolle im untersuchtem Tiermodell eingesetzt (DRAKE 1992; LEUNG et al. 1997;
OLIVRY und SOUSA 2001).
5.1 Das OVA-Modell als Mausmodell der AD
Das OVA-induzierte Mausmodell der AD nach SPERGEL et al. (1998) spiegelt die
Hauptsymptome der AD wider: Schuppen, Erosionen/Exkorationen, Erythem, Juckreiz,
Anstieg des Allergen-spezifischen IgEs, epidermale Hyperproliferation, gesteigerter
inflammatorischer Zellinflux in die Haut sowie ein Zunahme der Mastzellen in der Haut
(GUTERMUTH et al. 2004). Des Weiteren können bei epikutan mit OVA sensibilisierten
Mäusen durch die Inhalation von OVA asthma-ähnliche Symptome ausgelöst werden
(SPERGEL et al. 1998).
Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die epikutane Sensibilisierung mit OVA
die genannten Symptome der AD hervorruft. So wurde ein Anstieg des Gesamtscores der
klinischen Hautläsionen gegenüber einer PBS-Kontrollgruppe festgestellt. Eine Zunahme des
Juckreizes sowie des OVA-spezifischen IgEs lagen vor. Die histologischen Untersuchungen
zeigten eine epidermale Hyperproliferation, einen Anstieg des inflammatorischen Zellinfluxes
und der Mastzellzahl. Ebenso wurde die Zunahme der Zellzahl der drainierenden
Lymphknoten als Anzeichen für eine gesteigerte T-Zell-Proliferation und Differenzierung
nach Präsentation des Antigens durch DC festgestellt.
Die nach GUTERMUTH et al. (2004) genannten Anforderungen an Tiermodelle werden in
diesem Modell erfüllt: das OVA-Modell ist reproduzierbar, durch die Verwendung des
Inzuchtstamms Balb/c ist eine genetische Homogenität gegeben ebenso wie das Wissen über
den Organismus dieser Tiere. Jedoch fehlt bei Verwendung von Balb/c-Mäusen im OVA-
Modells die genetische Störung der Hautbarriere, von der angenommen wird, dass sie eine
wichtige Rolle für die Entstehung von AD spielt (MORAR et al. 2006). PALMER et al.
(2006) zeigten, dass besonders ein Defekt des Fillagrin-Gens eine Prädisposition für AD
hervorruft. Ein interessanter Ansatz könnte daher die Verwendung eines Mausstamms, bei
denen dieses Gen ausgeschaltet ist, im OVA-Modell sein. Auch bei NC/NgA-Mäusen ist eine
genetische Komponente vorhanden, diese ist jedoch bisher noch nicht näher beschrieben
worden (JIN et al. 2009). Trotzdem scheint die NC-NgA-Maus, wenn sie noch zusätzlich
epikutan mit Hausstaubmilbenextrakt sensibilisiert wird, zur Zeit das Tiermodell zu sein, das
Diskussion
66
der AD am nächsten kommt (GUTERMUTH et al. 2004). So spiegelt dieses Modell alle oben
genannten Aspekte wider, im Gegensatz zum OVA-Modell ist jedoch auch eine genetische
Komponente beteiligt. Nachteil der NC/NgA-Mäuse ist jedoch eine eingeschränkte
Verfügbarkeit sowie ein hoher Anschaffungspreis. Auch stehen für die Beantwortung von
detaillierte Fragestellungen zur Pathogenese der AD keine transgenen oder Knockout-Mäusen
in diesem Modell zur Verfügung. Daher wird für die Entstehung von AD bei transgenen oder
Knockout-Mäuse häufig das OVA-Modell verwendet (GUTERMUTH et al. 2004).
5.2 Einfluss der zusätzlichen Störung der Hautbarriere auf das OVA-Modell
Eine defekte Hautbarriere scheint ein wichtiger Faktor für die Entwicklung von AD zu sein.
Sie ermöglicht das Eindringen von Antigenen in die Haut. Diese werden dort von
Langerhans-Zellen aufgenommen und zu den drainierenden Lymphknoten transportiert um
dort den T-Zellen präsentiert zu werden. Auch das OVA-Modell benötigt eine Störung der
Hautbarriere zur Auslösung von Hautläsionen. So stellten JIN et al. (2009) fest, dass die
epikutane Sensibilisierung mit OVA bei haarlosen Mäusen, die weder rasiert noch chemisch
enthaart wurden, keinerlei Immunantwort hervorrief. Auch in einem eigenen Versuch, in dem
Mäuse bereits 24 Stunden vor Applikation des OVA-Patches mit Veet® chemisch enthaart
wurden, entwickelten die Mäuse trotz der Durchführung von drei Challengephasen keine
Hautläsionen. JIN et al. (2009) stellten weiterhin fest, dass die mechanische Störung der
Hautbarriere nicht nur das Eindringen von Antigenen ermöglicht, sondern auch die
Freisetzung von Zytokinen in die Haut hervorruft. Diese Zytokine scheinen die Polarisation
von naiven T-Zellen zu TH2-Zellen zu fördern.
In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch
Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen vor Applikation des OVA-Patches
verstärkte Symptome im Vergleich zum OVA-Standardprotokoll verursachen kann. Alle
Mäuse dieses Versuchsdurchgangs wurden jedoch zuvor auch chemisch mit Veet® enthaart.
Der klinische Hautscore von Mäusen, deren Hautbarriere nicht zusätzlich durch Abwischen
mit Aceton oder Tesa-Strippen beeinflusst wurde, war signifikant erhöht gegenüber den PBS-
Kontrolltieren. Das Abwischen mit Aceton oder das Strippen mit Tesafilm brachte keine
zusätzliche Verstärkung der Symptome. Eine mögliche Erklärung ist, dass durch beide
Methoden die obersten Korneozytenschichten der Epidermis entfernt werden (RISSMANN et
Diskussion
67
al. 2009). Daher könnte die Entstehung von Schuppen eingeschränkt sein. Da die
Epidermisdicke in den durchgeführten Versuchen nur bis zum Beginn Stratum corneums
gemessen wurde, zeigten sich wie erwartet keine Unterschiede zwischen dem OVA-
Standardprotokoll und der zusätzlichen Störung der Hautbarriere. Auch die weiteren
untersuchten sekundären Parameter zeigten keinen Vorteil durch die Störung der Hautbarriere
gegenüber dem OVA-Standardprotokoll. Die Milzzellzahl war bei Mäusen, die zusätzlich mit
Aceton behandelt worden waren, verringert. Möglicherweise denaturiert Aceton das Protein
OVA, so dass nur ein geringer Teil des OVAs durch die Haut dringt und von DC
aufgenommen wird. Dies erklärt auch, warum das Abwischen der Haut mit Aceton den
geringsten Gesamtscore der Hautläsionen sowie auch die geringste Epidermisdicke und den
niedrigsten inflammatorischen Zellinflux verglichen mit dem OVA-Standardprotokoll und
dem zusätzlichen Tesa-Strippen verursachte.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch
Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen keine zusätzliche Verstärkung der
Symptome hervorruft. Die Hautläsionen waren nach der Sensibilisierung nach dem OVA-
Standardprotokoll am stärksten, so dass dieses für die nachfolgenden Versuche zum
Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe gewählt wurde. Weiterhin konnte festgestellt werden,
dass eine grundsätzliche Störung der Hautbarriere durch chemisches Enthaaren kurz vor der
Applikation des OVA-Patches für die Entwicklung von AD-ähnlichen Hautläsionen zwingend
notwendig ist.
5.3 Stabilität des OVA-Modells
Ein wichtiges Kriterium zur Wahl eines bestimmten Tiermodells ist die Reproduzierbarkeit.
Für diese Arbeit wurden insgesamt fünf vergleichbare Durchgänge des OVA-
Standardprotokolls durchgeführt. Der Vergleich des Gesamtscores der Hautläsionen der
Vehikelgruppen dieser Durchgänge zeigte lediglich in Versuchsdurchgang 2 eine Abnahme.
Eine mögliche Ursache ist, dass das angewendete OVA Grade VI bereits seit ca. drei Jahren
verwendet wurde. Für die nachfolgenden Durchgänge wurde neues OVA Grade VI
verwendet. Ein weiterer Faktor, der den Grad der Hautläsionen möglicherweise beeinflusste,
ist die Unruhe im Stall. Während Versuchsdurchgang 3 fanden weitere Versuche im gleichen
Stall statt, so dass tagsüber häufig Unruhe herrschte. Dies könnte den leichten Anstieg des
Diskussion
68
Gesamtscores von Vehikelgruppe 3 erklären. Für Patienten mit AD ist bekannt, dass Stress
den Schweregrad der AD verstärken kann (SPERGEL und PALLER 2003). Zur Abklärung
des Einflusses von Stress auf die Symptome im OVA-Modell sollten weitere Versuche
durchgeführt werden, z.B. mit Lärmbelastung der Mäuse oder einem geänderten Tag/Nacht-
Rhythmus. Ein weiterer Faktor, der die Stabilität des OVA-Modells beeinflussen könnte, ist
der korrekte Sitz der Verbände mit dem OVA-Patch. Besonders nach der Erneuerung der
Verbände an Tag 4 der jeweiligen Sensibilisierungs- oder Challengewoche verrutschten diese
häufiger, da eine Fixierung des Verbandes am Nackenfell schlechter möglich war. Somit lag
das OVA-Patch nicht bei allen Mäusen über sieben Tage auf der gleichen Stelle. Eine
zusätzliche Fixierung des OVA-Patches mit okklusivem Tape verursachte zusätzliche, nicht-
Allergie bedingte und somit unerwünschte Hautläsionen.
Ein Einfluss der Jahreszeit auf die Stabilität des OVA-Modells war nicht zu erkennen.
Als weiterer Parameter für die Stabilität des OVA-Modells wurde der OVA-spezifische IgE-
Gehalt im Serum zwischen den Vehikelgruppen verglichen. Es zeigte sich, dass alle Mäuse
OVA-spezifisches IgE produzierten und somit die Sensibilisierung gegen OVA erfolgreich
war. Der deutliche Anstieg des IgE-Gehalts der Vehikelgruppen vier und fünf lässt sich durch
die Verwendung eines neuen ELISA-Kits erklären. Eine Korrelation zwischen dem
Gesamtscore der Hautläsionen und dem OVA-spezifischem IgE-Gehalt im Serum konnte
nicht festgestellt werden. Dies wurde bereits von SPERGEL et al. (1999) gezeigt. Auch beim
Hund konnte kein Zusammenhang zwischen dem IgE-Gehalt und dem Schweregrad der AD
nachgewiesen werden (DEBOER & HILLIER 2001). Im Gegensatz dazu ist bei der humanen
AD ein Zusammenhang zwischen dem IgE-Gehalt und dem Schweregrad der AD bekannt
(OGAWA 1971; LASKE und NIGGEMANN 2004).
Im OVA-Modell wurden bisher nur Balb/c-Mäusen verwendet (SPERGEL et al. 1998;
SPERGEL et al. 1999; YOO et al. 2005; WANG et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; ZHU
et al. 2015). Ob das OVA-Modell auf andere Mausstämme übertragbar ist, ist daher zu
prüfen.
Generell lässt sich sagen, dass die epikutane Sensibilisierung nach dem OVA-
Standardprotokoll bei Balb/c-Mäusen reproduzierbar ist. Jedoch sind Schwankungen
innerhalb der Versuchsdurchgänge möglich. Da es bereits bei unbehandelten Kontrolltieren
durch das Tragen des Verbandes zu einer geringen Erhöhung des Gesamtscores der
Diskussion
69
Hautläsionen (Median 3) kommt, sollte eine epikutane Sensibilisierung erst als erfolgreich
angesehen werden, wenn der Gesamtscore im Median über 3 liegt. Die Haut von PBS-
Kontolltieren (Mittelwert 24 µm) zeigte keine Zunahme im Vergleich zu Haut von
unbehandelten Balb/c-Mäusen (Mittelwert 21 µm) (GLATZER et al. 2013). Daher könnte der
Anstieg der Epidermisdicke auf über 30 µm als weiteres Kriterium zur Bewertung des
Erfolges der Sensibilisierung gesehen werden. Auch der Nachweis von OVA-spezifischem
IgE im Serum sollte möglich sein, um den jeweiligen Durchgang als erfolgreich ansehen zu
können.
5.4 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis
im OVA-Modell
5.4.1 Effekt des Glukokortikoids Betamethason im OVA-Modell
Glukokortikoide werden auf Grund ihrer antiinflammatorischen, antiproliferativen und
immunsuppressiven Wirkung als Standardtherapie bei AD eingesetzt. Dabei wird beim
Menschen häufig die topische beim Hund jedoch oft die systemische Applikation gewählt
(DRAKE 1992; LEUNG et al. 1997; OLIVRY und SOUSA 2001). Da in dem von uns
gewählten OVA-Modell eine tägliche topische Applikation von Wirkstoffen nicht möglich ist,
wurde die Wirkung der systemischen Gabe eines Glukokortikoids untersucht. Die Wahl des
Glukokortikoids fiel auf Betamethason, da für dieses die Langzeitgabe bei der Maus
beschrieben ist (MAEKAWA et al. 2006). Betamethason gilt als lang wirksames
Glukokortikoid mit einer 30 - 40fachen glukokortikoiden Wirkung im Vergleich zu Cortisol
(FREY und LÖSCHER 2002).
Verschiedene Glukokortikoide sind bereits in unterschiedlichen Mausmodellen der AD
eingesetzt worden. MAEKAWA et al. (2006) untersuchten den Effekt von Betamethason-17-
valerat (1 mg/kg p.o.) in NC/Jic-Mäusen, die spontan Hautläsionen sowie Juckreiz
entwickeln. Die Behandlung mit Betamethason konnte den Juckreiz hemmen, verstärkte
jedoch die Hautläsionen. MAEKAWA et al. (2006) zeigten weiterhin, dass Betamethason die
Nervenaktivität in der Haut im Vergleich zu Vehikel behandelten Tieren senkt. Die Abnahme
des Juckreizes könnte daher durch die Beeinflussung der Nerven durch Betamethason
entstanden sein.
Diskussion
70
Dies zeigte sich auch in den eigenen Versuchen: der Gesamtscore der Hautläsionen konnte
weder durch die intraperitoneale noch die orale Gabe von Betamethason signifkant
vermindert werden. Der Juckreiz hingegen wurde durch die orale Gabe signifikant gehemmt,
Betamethason i.p. zeigte eine Tendenz zur Abnahme des Juckreizes.
In einem weiteren beschriebenen Modell wurden NC/Jic-Mäuse verwendet um den Effekt von
Dexamethason zu untersuchen. Zur Auslösung von Juckreiz wurden die Mäuse mit 2,4,6-
Trinitrochlorobenzen behandelt. Die intraperitoneale Gabe von Dexamethason (1 und 3
mg/kg) minderte den Juckreiz. Eine Untersuchung der Hautläsionen erfolgte nicht
(YAMASHITA et al. 2007). KIM et al. (2012) zeigten jedoch, dass die Behandlung mit
Dexamethason (5 mg/kg p.o.) die Hautläsionen von NC/NgA-Mäusen verringert. Auch die
epidermalen Hyperproliferation sowie der IgE-Gehalt nahmen durch Dexamethason ab. In
den eigenen Versuchen konnte der Einfluss eines Glukokortikoids auf den IgE-Gehalt jedoch
nicht gezeigt werden. Die Abnahme der epidermalen Hyperproliferation durch die
intraperitoneale Behandlung mit Betamethasonphosphat (2 mg/kg) konnte bestätigt werden,
die orale Behandlung mit Betamethason-17-valerat (1 mg/kg) zeigte lediglich eine Tendenz
zur Reduktion der Epidermisdicke.
YATSUZUKA et al. (2007) untersuchten die topische Gabe von Dexamethason. Dazu
wurden Balb/c-Mäuse intraperitoneal mit OVA sensibilisiert und dann täglich mit einem
OVA-Patch behandelt. Durch den täglichen Wechsel des Patches wurde eine topische
Behandlung möglich. Die wiederholte topische Gabe reduzierte den Juckreiz sowie den
Hautscore.
Die Diskrepanz in dem Effekt von Glukokortikoiden auf den Schweregrad der Hautläsionen
lässt sich vielleicht durch die unterschiedlichen Applikationsarten erklären. MCCLAIN et al.
(2009) stellten die Vermutung auf, dass nach systemischer Applikation von Glukokortikoiden
kein ausreichend hoher Wirkstoffspiegel in der Haut erreicht wird. Lediglich die systemische
Verabreichung einer sehr hohen Dosis von Dexamethason (5 mg/kg p.o.) zeigte eine
Reduktion der Hautläsionen (KIM et al. 2012).
Ein antiinflammatorischer Effekt von Betamethason konnte in den eigenen Versuchen durch
die Gabe von 2 mg/kg Betamethasonphosphat gezeigt werden. Sowohl das Lymphknoten-
gewicht als auch die Zellzahl waren signifikant reduziert.
Diskussion
71
Abschließend lässt sich feststellen, dass die Gabe eines Glukokortikoids in den eigenen
Versuchen nicht den erhofften Effekt der Linderung der klinischen Symptome hatte. Eine
zusätzliche topische Behandlung könnte eine Abnahme der Hautläsionen hervorrufen. Auch
die Erhöhung der Dosis könnte versucht werden, da die Mäuse keine offensichtlichen
Nebenwirkungen durch die Gabe von Betamethason während des Versuches zeigten.
5.4.2 Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten im OVA-Modell
5.4.2.1 H1R-Antagonist Mepyramin
H1R-Antagonisten werden schon seit langem zur Behandlung der AD, insbesondere zur
Linderung des Juckreizes, eingesetzt (LEUNG et al. 1997; DEBOER und GRIFFIN 2001).
Allerdings fehlen in der Literatur bisher klare Hinweise auf den positiven Effekt von H1R-
Antagonisten zur Behandlung von AD (HOARE et al. 2001). Die aktuellen Leitlinien zur
Behandlung der caninen AD empfehlen einen Einsatz von H1R-Antagonisten zur Therapie
von Rötungen und durch den sedativen Effekt von Antihistaminika der ersten Generation zur
Linderung des Juckreizes (OLIVRY et al. 2015).
In verschiedenen Mausmodellen der Kontaktallergie sowie der AD ist bisher der Effekt von
systemisch verabreichten H1R-Antagonisten auf Juckreiz untersucht worden (HOSSEN et al.
2005; YAMASHITA et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; MATSUSHITA et al. 2012;
ZHU et al. 2015). In allen Studien wurde der Juckreiz signifikant reduziert. Die eigenen
Ergebnisse zeigten keinen Einfluss des H1R-Antagonisten Mepyramin auf den Juckreiz. Die
Bewertung des Juckreizes erfolgte nach der zweiten Challengephase und somit in der späten
Phase der Entwicklung der AD. YATSUZUKA et al. (2007) zeigten in einem OVA-Modell
mit intraperitonealer Sensibilisierung, dass die H1R-Antagonisten Chlorphenamin und
Epinastin den Juckreiz nur in der frühen Phase der Entstehung der AD hemmen konnten.
Möglicherweise hemmt Mepyramin den Juckreiz nur in der ersten Challengephase des OVA-
Modells. Dies sollte in eigenen Versuchen durch die Bewertung des Juckreizes bereits nach
der ersten Challengewoche untersucht werden.
Bisher durchgeführte Studien zum Effekt von H1R-Antagonisten auf allergie-bedingte
Hautläsionen zeigen widersprüchliche Effekte (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA &
HIRASAWA 2012). In den eigenen Versuchen wurde der klinische Hautscore durch
Mepyramin nicht beeinflusst. Dies stimmt mit einer Studie von OHSAWA und HIRASAWA
Diskussion
72
(2012) an NC/NgA-Mäusen überein. MATSUSHITA et al. 2012 stellten jedoch fest, dass der
H1R-Antagonist Olopatadin in einem Modell der murinen Kontaktallergie die Hautläsionen
mindern konnte. Möglicherweis könnte die zusätzliche topische Applikation von Mepyramin
zu einer Verbesserung der Hautläsionen führen. Dies wurde bereits für die topische
Applikation von Diphenhydramin in einem Hapten-induzierten Mausmodell der AD gezeigt
(LIN et al. 2012).
5.4.2.2 H4R-Antagonist JNJ 3975
Die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ 3975 konnte in keiner der untersuchten
Applikationsarten und Dosierungen die Entstehung von Hautläsionen reduzieren. Auch in der
bisher einzig publizierten Studie, die den Einfluss von H4R-Antagonisten in einem Modell
der AD untersucht hat, wurde keine Abnahme der klinischen Symptome festgestellt (KAMO
et al. 2014). Untersuchungen von H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der
Kontaktallergie zeigten widersprüchliche Ergebnisse. Die H4R-Antagonisten JNJ 7777120
und JNJ 28307474 konnten nicht in allen Modellen die Symptome reduzieren (siehe
Literaturübersicht, Tabelle 3). Der in dieser Arbeit verwendete H4R-Antagonist JNJ 3975
verringerte im FITC-Modell die Ohrdicke (THURMOND et al. 2014). Die Mastzellanzahl in
der Haut wurde durch die orale Gabe der hohen Dosis JNJ 3975 (50 mg/kg) reduziert. Auch
für diesen Parameter zeigen die bisherigen Publikationen kein einheitliches Bild (siehe
Literaturübersicht, Tabelle 3). Die Milzzellzahl als Indikator für die T-Zellproliferation wurde
durch die orale Gabe von JNJ 3975 (20 mg/kg) verringert. Die orale Gabe der hohen Dosis
(50 mg/kg) hatte keinen signifikanten Effekt auf die Milzzellzahl. Auch THURMOND et al.
(2014) konnten durch die Gabe eine höheren Dosis JNJ 3975 nicht die gleichen Effekte im
FITC-Modell erreichen. Die Applikationsart scheint ebenfalls einen Einfluss auf die Wirkung
von JNJ 3975 zu haben, da die intraperitoneale Gabe der gleichen Dosis (20 mg/kg) nicht die
Ergebnisse der oralen Gabe widerspiegelt. Ein nicht zu erklärender Effekt von JNJ 3975 ist
der Anstieg der Sekretion des TH2-Zytokins IL-4 durch OVA-stimulierte Splenozyten.
MAHAPATRA et al. (2014) zeigten eine Reduktion von IL-4 durch die Gabe von JNJ
7777120. Auch die Bestimmung der TH2 -Zytokine in der Haut zeigte in den bisherigen
Studien immer eine Reduktion von IL-4 (COWDEN et al. 2010; SEIKE et al. 2010; SUWA et
al. 2011; MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA und HIRASAWA 2012). Lediglich eine
Diskussion
73
Studie, in der eine Variante des OVA-Modells verwendet wurde, zeigte JNJ 7777120 keinen
Effekt auf die Produktion von TH2-Zytokinen (MAHAPATRA et al. 2014).
Die Verwendung von H4R-Knockout-Mäusen im OVA-Modell zeigte eine deutliche
Minderung der klinischen Symptome, eine Abnahme der epidermalen Hyperproliferation, des
inflammatorischen Zellinfluxes, der Mastzellzahl, des OVA-spezifischen IgEs und der
Milzzellzahl (Rossbach et al. 2015). Die Hypothese, dass der Einsatz eines H4R-Antagonisten
im OVA-Modell dieses ebenfalls zeigen würde, konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt
werden. Mögliche Gründe hierfür sind zum einen die pharmakokinetischen und
pharmakodynamischen Eigenschaften des verwendeten H4R-Antagonisten als auch der
Zeitpunkt der Behandlung. ROSSBACH et al. (2015) zeigten, dass durch eine Behandlung
mit dem H4R-Antagonisten JNJ 28307474 im OVA-Modell während der Sensibilisierung und
Challenge kein Effekt auf die klinischen Symptome gesehen werden kann.
5.4.2.3 Kombination des H1R-Antagonisten Mepyramin und des H4R-Antagonisten
JNJ 3975
Die Kombination eines H1R-Antagonisten und eines H4R-Antagonisten konnte bereits in
zwei Studien die klinischen Symptome reduzieren (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA
und HIRASAWA 2012). Die eigenen Ergebnisse zeigten ebenfalls eine signifikante
Reduktion der Hautläsionen durch die Verabreichung von Mepyramin und JNJ 3975. Auch
die weiteren Hauptsymptome der AD (epidermale Hyperproliferation, inflammatorischer
Zellinflux in die Haut, Mastzellzahl, OVA-spezifisches IgE und Juckreiz) konnten durch die
Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975 verringert werden.
Der allergen-induzierte Juckreiz wurde in zwei Modellen der Dermatitis (TDI-Modell,
DNCB-Modell) durch die Kombination von Cetirizin und JNJ 7777120 stärker reduziert als
durch die jeweilige Einzelgabe (ROSSBACH et al. 2009).
Der Gehalt des antiinflammatorisch wirkenden Zytokins IL-10 wurde in der Literatur bisher
nicht untersucht (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA und HIRASAWA 2012;
MAHAPATRA et al. 2014). In dieser Arbeit wurde ein Anstieg der Produktion von IL-10
durch OVA-stimulierte Splenozyten nach der Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975
gesehen.
Diskussion
74
Da sowohl JNJ 3975 und auch Mepyramin als Monotherapie im OVA-Modell keine
eindeutige Reduktion der klinischen Symptome hervorrief, scheint die kombinierte
Behandlung ein interessanter Therapieansatz zu sein.
5.4.2.4 Kombination des Glukokortikoids Betametathason und des H4R-Antagonisten
JNJ 3975
Die kombinierte Behandlung mit Betamethason und JNJ 3975 wurde im OVA-Modell
getestet, um zu untersuchen, ob die Gabe eines H4R-Antagonisten einen zusätzlichen Effekt
zur Gabe eines Glukokortikoids hat. In der Literatur konnten keine Studien zur Wirkung der
kombinierten Behandlung mit einem Glukokortikoid und einem H4R-Antagonisten gefunden
werden. Lediglich PARADIS et al. (1991) beschrieben einen Glukokortikoid-sparenden
Effekt durch die Kombination mit einem H1R-Antagonisten bei der Behandlung des caninen
Juckreizes. In den eigenen Versuchen hatte die alleinige Gabe des Glukokortikoids keinen
signifikanten Effekt auf die Entstehung von Hautläsionen, sondern zeigte lediglich eine
Tendenz zur Reduktion dieser. Die kombinierte Behandlung reduzierte den klinischen
Hautscore signifikant. In fast allen weiteren untersuchten Parametern konnte die Kombination
die Ergebnisse der Monotherapie mit Betamethason widerspiegeln. Jedoch zeigte sich im
Gegensatz zur Einzelgabe von Betamethason keine Beeinflussung der Zytokinsekretion durch
die kombinierte Behandlung, aber eine deutliche Änderung des Zellprofils der Lnn. axillares
(siehe Ergebnisse, Tabelle 14).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination eines Glukokortikoids mit einem
H4R-Antagonisten vielversprechend erscheint. Möglicherweise lässt sich durch die Gabe des
H4R-Antagonisten die Dosis des Glukokortikoids reduzieren, so dass auch das Risiko für
Nebenwirkungen sinkt.
5.5 Schlussfolgerung
Das OVA-Modell scheint als Mausmodell der AD gut geeignet. Es zeigt die Hauptaspekte der
humanen und caninen AD. Besonders der mögliche Einsatz von transgenen und Knockout-
Mäusen zur Beantwortung spezieller Fragestellungen ist ein großer Vorteil (GUTERMUTH
et al. 2004). Die Reproduzierbarkeit des OVA-Modells konnte in den durchgeführten
Diskussion
75
Versuchen bestätigt werden. Eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch Abwischen der
Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen brachte keine Verstärkung der Hautläsionen. Ein
Nachteil des OVA-Modells ist das Fehlen der genetischen Störung der Hautbarriere. Der
Einsatz von Knockout-Mäusen im OVA-Modell, die einen genetischen Effekt der
Hautbarriere haben, scheint ein interessanter Ansatz zu sein.
Die Untersuchung von Betamethason im OVA-Modell zeigte nicht den erwarteten Effekt der
Minderung der klinischen Symptome. Möglicherweise wird in der Haut durch die
systemische Gabe kein ausreichender Wirkstoffspiegel erreicht (MCCLAIN et al. 2009). Eine
zusätzliche topische Behandlung könnte daher notwendig sein. Der Effekt einer topische
Behandlung mit Dexamethason wurde bereits von YATSUZUKA et al. (2007) in einem
OVA-Modell mit intraperitonealer Sensibilisierung gezeigt. Falls die topische Behandlung im
hier verwendeten OVA-Modell keinen Effekt hat, sollte dieses als Tiermodell der AD neu
bewertet werden.
Die Behandlung mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin zeigte keine Reduktion des
Juckreizes wie in der Literatur beschrieben. Möglicherweise wurde der Juckreiz durch
Mepyramin nur in der frühen Challengephase gehemmt, beobachtet wurde er jedoch in der
zweiten späten Challengephase. Daher sollte der Juckreiz während der ersten Challenge noch
untersucht werden.
Die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ 3975 zeigte im Gegensatz zu H4R-Knockout-Mäusen
keine Reduktion der klinischen Symptome (ROSSBACH et al. 2015). Da auch eine Blockade
des H4R während der Sensibilisierungs- und Challengephase im OVA-Modell keinen Effekt
auf die Hautläsionen zeigte (ROSSBACH et al. 2015), muss überlegt werden, ob
pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften der H4R-Antagonisten eine
mögliche Ursache sein könnten.
Die kombinierte Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975 lieferte vielversprechende
Ergebnisse (Reduktion der Hauptsymptome der AD). Dies sollte jedoch nochmals bestätigt
werden, evtl. in einem weiteren Mausmodell der AD (z.B. NC/NgA-Mäuse).
Auch die Kombination von Betamethason mit JNJ 3975 könnte ein interessanter neuer Aspekt
zur Behandlung der AD sein, da durch die Gabe des H4R-Antagonisten eventuell eine
Reduktion der Dosis des Glukokortikoids möglich ist und somit ein geringeres Risiko für
Nebenwirkungen besteht.
Zusammenfassung
76
6 Zusammenfassung
Hanna Kathrin Köchling
Etablierung des Ovalbumin-induzierten Mausmodells der atopischen Dermatitis zur
Beurteilung pharmakologischer Wirkstoffe
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, dass Ovalbumin-induzierte Mausmodell (OVA-
Modell) der atopischen Dermatitis (AD) zu etablieren und im Anschluss die Wirkung
verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe in diesem zu untersuchen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das OVA-Modell auf den Einfluss der zusätzlichen
Störung der Hautbarriere durch Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen auf die
Entwicklung der klinischen Symptome untersucht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich
mit dem Effekt von verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen und deren Kombinationen
im OVA-Modell. Getestet wurden der Effekt des Glukokortikoids Betamethason, des
Histamin-1-Rezeptor-Antagonisten (H1R-Antagonist) Mepyramin und des Histamin-4-
Rezeptor-Antagonisten (H4R-Antagonist) JNJ 39758979.
Zunächst wurden weibliche Balb/c-Mäuse nach einem modifizierten Protokoll von SPERGEL
et al. (1998) gegen das Protein Ovalbumin (OVA) sensibilisiert. Dabei wurde bei einer
Mausgruppe die Hautbarriere durch das mehrfache Abwischen der Haut mit Aceton gestört,
bei einer weiteren Gruppe durch das Strippen der Haut mit Tesafilm. Eine andere Mausgruppe
wurde nach dem Standardprotokoll behandelt. Als Kontrolle dienten nach dem gleichen
Protokoll nur mit PBS behandelte Mäuse. Bei allen Tieren, die mit OVA behandelt wurden,
zeigten sich klinische Symptome der allergisch-bedingten Deramtitis. Die zusätzliche Störung
der Hautbarriere führte zu keiner weiteren Verstärkung der Symptome. Daher wurde in den
folgenden Versuchen zur Untersuchung verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe auf eine
zusätzliche Störung der Hautbarriere verzichtet.
Das Glukokortikoid Betamethason wurde oral als Betamethasonvalerat (1mg/kg) und
intraperitoneal als Betamethasonphosphat (2 mg/kg) verabreicht. Es brachte jedoch nicht den
erwarteten Effekt der deutlichen Linderung der Symptome, sondern zeigte lediglich eine
Tendenz. Sowohl die Monotherapie mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin (30 mg/kg i.p.)
Zusammenfassung
77
als auch mit dem H4R-Antagonisten JNJ 39758979, der auf verschiedenen
Applikationswegen und in unterschiedlichen Dosierungen gegeben wurde, zeigte keinen
Effekt auf die klinischen Symptome. Die Kombination dieser beiden Wirkstoffe könnte
jedoch ein vielversprechender neuer Ansatz zur Behandlung der AD sein, da diese zu einer
Reduktion der Symptome im OVA-Modell führte. Die Kombination des Glukokortikoids
Betamethason mit dem H4R-Antagonisten JNJ 39758979 konnte die Symptome ebenfalls
mindern. Auch dies könnte ein interessanter Therapieansatz zur Behandlung der AD sein, da
so eine Dosisreduktion des Glukokortikoids möglich sein könnte.
Summary
78
7 Summary
Hanna Kathrin Köchling
Establishing the murine ovalbumin-induced model of atopic dermatitis to evaluate
different pharmacological drugs
Aim of this study was to establish the murine ovalbumin-induced model (OVA-model) of
atopic dermatitis (AD) in order to test different pharmacological drugs.
In the first part of this study the influence of additional skin barrier disruption on the clinical
symptoms of the OVA-model was examined. The skin barrier was disrupted by wiping the
skin with acetone or tape-stripping. In the second part of this study the effects of different
pharmacological drugs, namely the glucocorticoid betamethasone, the histamine H1 receptor
(H1R) antagonist mepyramine and the histamine H4 receptor (H4R) antagonist JNJ 39758979
and their combinations, were determined in the OVA-model.
First female Balb/c-mice were sensitised against the protein ovalbumin according to a
modified protocol of SPERGEL et al. (1998). The mice were either treated according to the
standard protocol of the OVA-model or the skin barrier was additionally disrupted by wiping
the skin several times with acetone or tape-stripping. As a control mice were sensitised with
PBS according to the standard protocol. The sensitisation against OVA induced clinical
symptoms of AD, just as skin lesions and elevated IgE levels. Furthermore additional
disrupting of the skin barrier had no influence on the severity of the clinical symptoms.
Therefore the following trials were done without additional disruption.
The glucocorticoid betamethasone, given orally as betamethasonvalerate (1 mg/kg) or
intraperitoneally as betamethasonphosphate (2 mg/kg), did not ameliorate clinical symptoms
in the OVA-model significantly as expected, it just showed a slight tendency. Either the
monotherapy with the H1R antagonist mepyramine (30 mg/kg i.p.) nor the monotherapy with
the H4R antagonist JNJ 39758979, given at different dosages and administration routes, had
an effect in the OVA-model. Though the combination of these drugs could be a promising
new treatment approach for AD as it reduced clinical symptoms significantly. The
combination of the glucocorticoid betamethasone and the H4R antagonist JNJ 39758979
Summary
79
ameliorated clinical symptoms in the OVA-model as well. Therefore it could also be a
promising treatment approach for AD, leading to a dose reduction of the glucocorticoid.
Literaturverzeichnis
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Anhang
100
9 Anhang
Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-Modells
Tabelle 15: Klinischer Hautscore; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-
Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
PBS
1 0 0 1 1 2 2 1 1 4 3 2 2 1 5 4 0 0 1 1 5 1 0 1 2 6 2 1 1 4
OVA
1 3 2 2 7 2 4 3 1 8 3 3 2 2 7 4 1 1 1 3 5 3 2 2 7 6 3 4 2 9 7 3 3 2 8
OVA +
Aceton
1 2 2 1 5 2 0 0 1 1 3 2 2 2 6 4 1 1 1 3 5 3 2 1 6 6 2 1 1 4 7 1 0 1 2
OVA +
Tesa
1 1 1 1 3 2 1 0 1 2 3 4 4 2 10 4 3 3 1 7 5 1 0 1 2 6 1 0 1 2 7 2 1 1 4
Anhang
101
Tabelle 16: Histologie; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-
Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
PBS
1 21,25 1 1,6 2 31,33 2 0,8 3 26,58 1 1,6 4 21,97 1 2,2 5 19,42 1 1,6 6 23,6 1 2,6
OVA
1 60,48 4 7,4 2 50,82 4 7,6 3 42,63 4 7,4 4 33,62 3 7,8 5 48,2 3 8 6 52,23 4 10 7 46,13 4 -
OVA +
Aceton
1 46,71 3 6,4 2 35,7 3 5,2 3 38,61 2 5,4 4 31,47 2 4,4 5 42,88 4 8,4 6 35,61 2 7,6 7 36,7 3 9,6
OVA +
Tesa
1 47,35 4 4 2 45,5 3 9,4 3 48,35 3 7,2 4 55,13 3 6,8 5 52,49 4 6,2 6 46,47 2 5,2 7 54,38 4 6,2
Anhang
102
Tabelle 17: Lymphknotengewicht und –zellzahl; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA +
Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
PBS
1 11,5 6,3 2 16,3 22,2 3 10,7 17,1 4 10,4 5,7 5 12 8,4 6 14,3 10
OVA
1 21,9 10,3 2 24 11,8 3 21,3 12,3 4 17,9 9,6 5 19,5 11,4 6 19,8 10,1 7 25,3 11,9
OVA +
Aceton
1 20,5 14,4 2 10,8 6,8 3 12,8 18,1 4 13,6 9,1 5 16,1 15,7 6 11,5 8,3 7 11,2 9,9
OVA +
Tesa
1 23,6 7,4 2 20,5 8,7 3 24,7 12,5 4 17,7 11 5 19,1 12,8 6 14,7 9,6 7 20,8 11,2
Anhang
103
Tabelle 18: Milzzellzahl; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-
Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
PBS
1 16,65 2 25,95 3 14,1 4 21,75 5 20,55 6 15
OVA
1 43, 95 2 30,6 3 22,65 4 18,6 5 31,2 6 15,6 7 10,2
Aceton
1 9,9 2 3,45 3 6,75 4 7,5 5 7,2 6 0,9 7 8,7
Tesa
1 25,5 2 22,95 3 30,3 4 13,95 5 18,9 6 7,65 7 7,95
Anhang
104
Tabelle 19: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml); PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll,
OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
PBS
1 1,84 2 0 3 0,41 4 0 5 0 6 0
OVA
1 5,65 2 8,56 3 29,46 4 8,80 5 5,40 6 7,60
OVA +
Aceton
1 8,21 2 18,64 3 34,65 4 13,72 5 14,67 6 29,96
OVA +
Tesa
1 7,37 2 4,41 3 5,45 4 7,48 5 9,40 6 35,98
Anhang
105
Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im
OVA-Modell
Klinischer Hautscore Tabelle 20: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o)
behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
Vehikel
1 3,5 1 2 6,5 2 0 1 0 1 3 4 3,5 2 9,5 4 1,5 3 2 6,5 5 3 2 1 6 6 1 3 1 5
JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 3,5 3,5 2 9 2 4 2 2 8 3 3 2,5 1 6,5 4 2 2 1 5 5 3,5 1,5 1 6 6 3 1 1 5 7 3 2 1 6
JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 1 0 0 1 2 4 1 2 7 3 1 2 1 4 4 2 3 1 6 5 3,5 3 2 8,5 6 2,5 1,5 1 5
Anhang
106
Tabelle 21: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1
mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
Vehikel
1 1 1 1 3 2 1 2 1 4 3 2 1 1 4 4 2 1 1 4 5 1 0 1 2 6 2 1 1 4
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 1 1 1 3 2 1 1 1 3 3 1 1 1 3 4 2 1 1 4 5 1 0 1 2 6 2 2 1 5 7 1 0 1 2
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 2 1 1 4 2 2 1 1 4 3 1 1 1 3 4 2 1 1 4 5 1 1 1 3 6 1 0 1 2
Tabelle 22: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder
Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
Vehikel
1 1 1 1 3 2 2 2 1 5 3 3 4 2 9 4 4 4 3 11 5 1 2 1 4 6 4 4 2 10
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 3 2 2 7 2 3 3 1 7 3 3 2 1 6 4 2 2 1 5 5 2 1 1 4 6 4 3 2 9
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 2 3 1 6 2 2 2 1 5 3 1 1 1 3 4 3 4 2 9 5 1 1 1 3 6 2 2 1 5 7 0 0 2 2
Anhang
107
Tabelle 23: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979
(20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
Vehikel
1 2 3 2 7 2 2 2 2 6 3 1 2 2 5 4 2 3 2 7 5 2 1 2 5 6 3 2 2 7
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 2 1 2 5 2 2 1 2 5 3 2 1 2 5 4 1 1 1 3 5 1 0 2 3
Tabelle 24: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg
i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore
Vehikel
1 2 2 2 6 2 2 2 2 6 3 2 2 2 6 4 2 1 2 5 5 1 1 1 3 6 3 2 2 7 7 2 3 2 7
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 1 0 1 2 2 1 0 1 2 3 2 0 1 3 4 1 0 1 2 5 1 1 1 3 6 2 0 2 4 7 1 0 1 2
Anhang
108
Histologie Tabelle 25: Histologie von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen
wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
Vehikel
1 22,87 2 4,4 2 27,14 2 4,4 3 24,84 2 6,8 4 35,95 3 4,2 5 31,15 3 5,2 6 23,28 2 7,4
Vehikel JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 25,41 2 4,6 2 23,35 2 3,0 3 27,60 2 3,4 4 34,68 3 4,0 5 21,69 2 4,6
OVA JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 24,47 3 5,2 2 29,01 2 3,2 3 22,15 3 2,8 4 27,44 3 2,6 5 32,93 1 3,8 6 30,74 2 3,0
Tabelle 26: Histologie von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen;
alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
Vehikel
1 25,75 2 8,8 2 23,34 3 4,4 3 25,24 3 5,6 4 18,41 2 5,0 5 25,47 3 4,6 6 22,63 3 4,2 7 29,01 2 -
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 24,26 2 4,6 2 19,21 2 2,8 3 26,31 2 2,6 4 18,79 2 3,8 5 22,29 2 3,2 6 32,23 3 2,8 7 16,41 2 4,2
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 23,81 3 3,0 2 20,41 2 5,6 3 20,95 3 4,8 4 25,12 2 5,0 5 21,37 2 4,6 6 28,14 3 3,8
Anhang
109
Tabelle 27: Histologie von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
Vehikel
1 28,94 2 3,4 2 19,51 2 3,4 3 31,52 3 5,2 4 42,01 3 9,4 5 22,04 2 2,8 6 44,52 3 2,8
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 21,55 3 4 2 25,68 3 2 3 30,63 3 4,6 4 26,90 2 3,8 5 31,80 2 3,0
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 30,77 2 3,2 2 27,69 2 3,2 3 26,16 2 3,4 4 22,49 2 4,4 5 19,72 1 1,6 6 24,40 2 4,0 7 17,30 1 5,8
Tabelle 28: Histologie von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
Vehikel
1 51,79 3 5,2 2 47,62 3 6,4 3 40,53 2 6,0 4 50,54 4 5,4 5 46,91 3 5,0
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 29,4 2 5,8 2 26,76 1 4,8 3 27,58 2 7,0 4 26,14 1 4,4 5 27,29 1 6,0
Anhang
110
Tabelle 29: Histologie von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle
Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)
Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen
Vehikel
1 42,31 3 8,2 2 49,0 3 4,0 3 47,8 3 6,2 4 45,13 2 4,0 5 57,78 4 6,4 6 48,96 4 9,0 7 46,05 3 3,8
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 29,51 2 3,8 2 26,41 2 5,2 3 29,0 2 2,4 4 26,68 3 4,2 5 23,63 1 3,0 6 25,51 1 3,2 7 22,03 2 3,8
Lymphknotengewicht und –zellzahl Tabelle 30: Lymphknotengewicht und –zellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 9,1 13,3 2 10,1 15,55 3 12,6 19,25 4 11,1 19,25 5 7,4 11,3 6 9,4 9,05
JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 10,1 12,25 2 11 10,8 3 6,7 9,2 4 10,2 14,5 5 9,2 9,7 6 5,7 4 7 14,4 21,75
JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 13,1 11,6 2 9,7 12,9 3 9,8 14,45 4 10,6 18,8 5 8,5 13,65 6 13,5 18
Anhang
111
Tabelle 31: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg
p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 8,7 9,2 2 6,7 7,85 3 9,1 12,7 4 12,2 16,95 5 7,9 11,45 6 9,1 11,3
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 7,2 7,45 2 4,8 5,05 3 10,7 10,05 4 7,9 5,65 5 8,2 8,55 6 11,3 9,95 7 3,9 5,05
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 6,4 8,65 2 7,3 9,95 3 7 8,75 4 7,2 8,75 5 7,1 7,5 6 7,1 7,7
Tabelle 32: Lymphknotengewicht und –zellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 10,1 8,35 2 2,2 2,55 3 12,4 9,95 4 8,7 16,05 5 9,6 10,3 6 10,6 16,65
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 8 11,15 2 14,6 22,15 3 7,5 5,05 4 6,9 10,6 5 7,3 12,75 6 7,5 9,4
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 4,4 5,3 2 6,1 8,05 3 4,6 6,3 4 2 3,45 5 3,9 4 6 3,8 4,3
Anhang
112
Tabelle 33: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 10,9 10,05 2 8,6 6,05 3 10 6,25 4 9,9 16,55 5 5,3 3,7 6 7,1 8,85
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 5,3 3,35 2 4,3 2,55 3 4,3 2,55 4 5,1 2,55 5 4,6 1,8
Tabelle 34: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.)
behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 6,6 7,5 2 6,4 4,75 3 12,8 12,55 4 12,4 14,25 5 11,1 11,3 6 7,2 9,05 7 8,8 8,75
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 7,1 7,4 2 9,9 12,35 3 7,9 7,25 4 3,9 2,2 5 3,1 1,75 6 7,9 13,3 7 4,3 3,9
Anhang
113
Milzzellzahl Tabelle 35: Milzzellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen
wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 54 2 44,75 3 61,25 4 54,75 5 28,25 6 45,75
JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 36,75 2 14,5 3 31,5 4 24 5 33,75 6 28,25 7 47
JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 36,75 2 32,5 3 34,5 4 46,5 5 34,5 6 45,25 7 36,75
Tabelle 36: Milzzellzahl von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 40,25 2 44 3 27 4 24 5 28,25 6 41,5
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 36 2 33,75 3 11,5 4 27,75 5 44,25 6 63 7 10
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 33,5 2 29,75 3 37 4 27,75 5 24 6 27
Anhang
114
Tabelle 37: Milzzellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 13,75 2 24,125 3 29,125 4 21,125 5 12,625 6 17,25
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 1,375 2 46 3 19,625 4 16,25 5 14,875 6 8,875
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 14,5 2 1,875 3 1,375 4 15,125 5 7,75 6 14 7 8,5
Tabelle 38: Milzzellzahl von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 75,5 2 65,5 3 27,5 4 84 5 73,5 6 66,5
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 39,5 2 33,5 3 48 4 43,5 5 43
Anhang
115
Tabelle 39: Milzzellzahl von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle
Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Zellzahl (Mio)
Vehikel
1 60 2 81,6 3 68,1 4 58,8 5 54 6 63,9 7 55,5
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 50,1 2 41,1 3 42,3 4 51,3 5 48,9 52,8
6 55,5
Zytokinsekretion Splenozyten Tabelle 40: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von JNJ 39758979 (20
mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt; angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
JNJ 39758979
20 mg/kg p.o.
JNJ 39758979
50 mg/kg p.o.
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 6,15 ± 2,47
43,34 ± 34,03
3,39 ± 2,60
101,53 ± 133,49
5,60 ± 2,86
201,77 ± 72,92
IL-10 25,33 ± 14,61
928,67 ± 566,74
17,33 ± 25,57
717,57 ± 869,83
31,35 ± 34,37
1796,50 ± 1058,38
IL-6 0,00 ± 0,00
209,76 ± 76,22
0,00 ± 0,00
164,87 ± 126,34
1,38 ± 3,38
253,09 ± 58,21
IFN-γ 0,00 ± 0,00
896,30 ± 382,94
0,00 ± 0,00
707,22 ± 837,98
18,05 ± 44,21
1318,13 ± 446,17
Anhang
116
Tabelle 41: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von JNJ 39758979 (20
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben ist
der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
JNJ 39758979
20 mg/kg i.p.
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 1,45 ± 3,55
49,06 ± 48,17
0,00 ± 0,00
66,03 ± 54,83
IL-10 63,78 ± 136,37
1652,03 ± 1636,43
156,00 ± 116,85
2724,47 ± 1781,67
IL-6 39,21 ± 71,31
311,79 ± 282,97
150,87 ± 174,07
752,18 ± 804,78
IFN-γ 185,12 ± 400,61
225,64 ± 325,22
361,41 ± 410,75
320,36 ± 219,25
Tabelle 42: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Mepyramin (30
mg/kg i.p) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben ist
der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
Mepyramin
20 mg/kg i.p.
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 11,09 ± 2,32
100,16 ± 34,74
3,77 ± 3,12
89,99 ± 72,44
IL-10 70,89 ± 28,02
914,78 ± 342,41
34,86 ± 34,07
782,00 ± 607,58
IL-6 70,10 ± 65,09
320,10 ± 62,64
2,96 ± 4,51
166,16 ± 67,68
IFN-γ 373,33 ± 430,51
404,45 ± 275,85
0,00 ± 0,00
170,18 ± 189,79
Anhang
117
Tabelle 43: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Betamethasonvalerat
(1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben
ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
Betamethason
1 mg/kg p.o.
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 11,09 ± 2,32
100,16 ± 34,74
0,00 ± 0,00
16,37 ± 11,59
IL-10 70,89 ± 28,02
914,78 ± 342,41
25,89 ± 35,27
363,33 ± 137,07
IL-6 70,10 ± 65,09
320,10 ± 62,64
0,00 ± 0,00
147,15 ± 33,24
IFN-γ 373,33 ± 430,51
404,45 ± 275,85
0,00 ± 0,00
198,64 ± 198,62
Tabelle 44: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Betamethason-
phosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt;
angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
Betamethason
2 mg/kg i.p.
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 1,45 ± 3,55
49,06 ± 48,17
3,12 ± 7,68
12,72 ± 10,28
IL-10 63,78 ± 136,37
1652,03 ± 1636,43
421,11 ± 630,44
1727,31 ± 1655,07
IL-6 39,21 ± 71,31
311,79 ± 282,97
141,64 ± 203,79
294,27 ± 265,29
IFN-γ 185,12 ± 400,61
225,64 ± 325,22
788,47 ± 1030,99
576,11 ± 522,87
Anhang
118
Tabelle 45: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Mepyramin (20
mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-
Standardprotokoll behandelt; angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.
Zytokin Vehikel
Mepyramin
+
JNJ 39758979
unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert
IL-4 1,04 ± 1,79
16,76 ± 19,28
1,86 ± 3,67
36,24 ± 19,26
IL-10 24,29 ± 17,71
162,86 ± 163,45
19,76 ± 6,12
505,24 ± 277,79
IL-6 36,85 ± 13,42
108,84 ± 43,21
7,22 ± 8,03
139,71 ± 58,44
IFN-γ 0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
37,56 ± 73,79
OVA-spezifischer IgE-Gehalt Tabelle 46: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o)
behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
Vehikel
1 2569,19 2 2794,90 3 3795,88 4 1842,98 5 5238,47 6 7407,26
JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 8427,87 2 3118,74 3 3442,59 4 11263,98 5 4482,83 6 1165,85 7 4453,39
OVA JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 3982,34 2 13226,69 3 1558,39 4 4551,52 5 4021,59 6 6573,11
Anhang
119
Tabelle 47: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder
Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
Vehikel
1 3214,48 2 4897,74 3 5458,82 4 4047,06 5 2825,34 6 3024,43
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 2771,04 2 8318,55 3 2463,35 4 9268,78 5 4789,14 6 10798,19 7 4246,15
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 3657,92 2 5875,11 3 6246,15 4 2581,00 5 6237,10 6 3395,48
Tabelle 48: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder
Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll
behandelt.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
Vehikel
1 1757,25 2 1824,68 3 7151,72 4 1831,42 5 5142,28 6 2498,99
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 11197,57 2 2606,88 3 6153,74 4 2397,84 5 3436,28 6 2856,37
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 1480,78 2 2917,06 3 637,90 4 981,79 5 1514,50 6 2849,63 7 1332,43
Anhang
120
Tabelle 49: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ
39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
Vehikel
1 11444,44 2 11722,22 3 5174,60 4 8904,76 5 6603,17 6 9142,86
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 1523,81 2 7198,41 3 7277,78 4 2992,06 5 5571,43
Tabelle 50: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)
Vehikel
1 12336,77 2 11821,31 3 10171,82 4 10515,46 5 8247,42 6 12508,59 7 7079,04
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 4123,71 2 5704,47 3 6391,75 4 6391,75 5 7903,78 6 6941,58 7 8178,69
Anhang
121
Juckreiz Tabelle 51: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten
Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min
Vehikel
1 36 2 42 3 76 4 54 5 56 6 67
JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.
1 39 2 15 3 66 4 71 5 50 6 46 7 43
OVA JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.
1 49 2 61 3 33 4 55 5 71 6 52
Tabelle 52: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg
p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min
Vehikel
1 54 2 71 3 45 4 49 5 60 6 57
Mepyramin 30 mg/kg i.p.
1 52 2 77 3 55 4 50 5 24 6 92 7 64
Betamethason 1 mg/kg p.o.
1 39 2 32 3 30 4 29 5 46 6 46
Anhang
122
Tabelle 53: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min
Vehikel
1 49 2 36 3 26 4 55 5 68 6 44
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
1 25 2 23 3 41 4 46 5 60 6 25
Betamethason 2 mg/kg i.p.
1 38 2 33 3 16 4 40 5 24 6 34 7 17
Tabelle 54: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20
mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min
Vehikel
1 24 2 13 3 126 4 58 5 56 6 54
Betamethason 2 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 28 2 27 3 38 4 30 5 23
Anhang
123
Tabelle 55: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.)
behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.
Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min
Vehikel
1 12 2 25 3 25 4 16 5 21 6 11 7 23
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p
1 7 2 17 3 2 4 5 5 11 6 11 7 9
Anhang
124
Danksagung
Ein besonderer Dank geht an meinen Doktorvater Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die
Überlassung des spannenden Themas, die freundliche und engagierte Betreuung bei der
Entstehung dieser Arbeit sowie die sehr netten, schwarzgelben Gespräche.
Herrn Prof. Dr. Bäumer danke ich für seine hilfreichen Ratschläge und die freundliche
Unterstützung trotz der großen Entfernung.
Ein sehr großer Dank geht an Kristine für das stets offene Ohr, egal zu welcher Zeit, die
geduldige Betreuung und die sehr schnelle Korrektur.
Katrin möchte ich für die freundliche Betreuung, vor allem während meiner ersten Zeit in der
Toxi, und der großen Hilfe am FACS-Gerät sowie die netten Gesprächen danken.
Prof. Dr. Thomas Werfel, Prof. Dr. Ralf Gutzmer und Dr. Susanne Mommert danke ich für
die angeregten Diskussionen und Ratschläge während der Histamintreffen.
Bei Gesine und Jessi möchte ich mich für die vielen netten Gespräche und Ratschläge sowie
die schönen Mittags-Gassi-Runden bedanken.
Viki, Alina und Sonja danke ich für die große Hilfe im Labor und während der Versuche.
Ein großer Dank geht an Caro für ihre unermüdliche Hilfe beim Mäuse einpacken und den
Juckreiz-Videos sowie der tollen Zeit auch außerhalb der Toxi.
Meinen Mitdoktoranden Kim, Kathy, Ellie, Paula und Jenny danke ich für die lustigen
Gespräche und ihre Hilfe an den Probeentnahmetagen.
Anhang
125
Carmen und Steffi danke ich für die lustige gemeinsame Zeit als Bewohner des Schlauches,
für die vielen Gespräche und die Geduld, wenn mal etwas nicht so funktionierte. Auch
möchte ich mich für die vielen schönen Unternehmungen bedanken.
Carmen: Tanze dein Leben! #1
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die finanzielle Unterstützung dieser
Arbeit.
Ein großer Dank geht an alle meine Freunde für die Unterstützung während der Entstehung
dieser Arbeit. Es ist schön, Freunde wie euch zu haben.
Ein großes Dankeschön geht an Sebastian für die liebevolle Untertützung und Geduld
während der stressigen Schreibphase.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie. Meiner Schwester möchte ich für ihre
Unterstützung und die tolle gemeinsame Zeit in Kalifornien danken. Meinen Eltern möchte
ich für ihre Liebe, Geduld und ihren stetigen Glauben an mich danken. Ihr habt mir dies alles
erst ermöglicht. Ohne euch wäre ich jetzt nicht da, wo ich bin.