Tierärztliche Hochschule Hannover · 2019-01-10 · Tierärztliche Hochschule Hannover Induktion...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen

bei equinen Spermien in vitro

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Janina Rau

Gehrden

Hannover 2016

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Harald Sieme

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

- Klinik für Pferde

Dr. Ir. Harriëtte Oldenhof

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

- Klinik für Pferde

1. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme

2. Gutachterin: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel

Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2016

Gefördert durch ein Stipendium der Joachim und Irene Hahn-Stiftung

Diese Dissertation ist ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin.

Für

all meine Lieben

INHALTSVERZEICHNIS

Abkürzungen ...…………………………………………………………………………….

1 Einleitung ………………………………………………………………………………… 11

2 Literaturübersicht ……………………………………………………………………….. 13

2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation ………………………………………. 13

2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien ……………………..... 14

2.1.1.1. Kapazitation ………………………………………………………………... 14

2.1.1.2. Hyperaktivierung …………………………………………………………... 20

2.1.1.3. Akrosomreaktion ………………………………………………………….... 22

2.2. Kalzium-Ionophor A23187 ……………………..……………………………………... 23

2.3. Procain …………………………………………………………………………………. 24

2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation …………………………………..…... 26

2.4.1. Oozytengewinnung …………………………………………………………… 27

2.4.2. Oozytenreifung ………………………………………………………………. 28

2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung ………………………………………………….…. 30

2.6. Fertilisation …………………………………………………………………………….. 32

2.7. In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler Stadien …...…………………………………... 35

3 Material und Methoden …………………………………………………………………. 40

3.1. Experiment I:

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro …………….. 40

3.1.1. Chemikalien und Reagenzien ……………………………………………….. 40

3.1.2. Samengewinnung und –aufbereitung ……………………………………….. 40

3.1.3. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien

durch Inkubation in speziellen Medien ……………………………………………... 41


durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...……………………. 43

3.1.5. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes

im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen

bei equinen Spermien …………………………………………….………..……...… 44

3.1.6. Computerassistierte Spermienanalyse ………………………………………. 46

3.1.7. Durchflusszytometrische Analyse der Plasma- und Akrosommembran ….… 46

3.1.8. Durchflusszytometrische Analyse der Spermienkapazitation ………….…… 47

3.2. Experiment II:

Untersuchung der Bindungsfähigkeit equiner Spermien an die Zona pellucida in vitro

maturierter porziner Oozyten ….……………………………………………………….…… 48

3.2.1. Chemikalien und Reagenzien ……………………………………………….. 48

3.2.2. Oozytengewinnung und –aufbereitung zur In-Vitro-Maturation …...………. 48

3.2.3. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ……...………………………………. 50

3.2.4. Heterologer Bindungsassay ………….……………………………………… 51

3.2.4.1. Aufbereitung in vitro maturierter porziner Oozyten für die Koinkubation

mit equinen Spermien ……………..………………………………………………... 51

3.2.4.2. Aufbereitung equiner Spermien für die Koinkubation mit

in vitro maturierten porzinen Oozyten ………...…………………….…………...… 52

3.2.4.3. Koinkubation equiner Spermien mit in vitro maturierten

porzinen Oozyten …..………………………………………………………………. 55

3.2.4.4. Bestimmung der Bindungsraten equiner Spermien an der Zona pellucida

in vitro maturierter porziner Oozyten ………………………………………………. 55

3.3. Statistische Auswertung ………………………………………………………………... 58

4 Ergebnisse ………………………………………………………………………………... 59

4.1. Experiment I:

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro ………..…… 59


durch Inkubation in modifizertem Whittens-Medium …………………………….... 59


durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...……………………. 62

4.1.3. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes

im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen

bei equinen Spermien …..……………………………………….…………………... 64

4.2. Experiment II:

Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten

und equinen Spermien ………………………………………………………………………. 67

4.2.1. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ………...……………………………... 67

4.2.2. Bestimmung einer geeigneten Konzentration equiner Spermien

für die Koinkubation mit porzinen Oozyten ……………………………………….. 68

4.2.3. Überprüfung der Inkubationsbedingungen für die equinen Spermien ……….. 71

4.2.4. Einfluss unterschiedlicher Spermienaufbereitungen auf die Bindungsfähigkeit

equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten

und auf die Oozytenmorphologie ………..…………………………………………. 72

5 Diskussion …...…………………………………………………………………………… 77

5.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien

durch Inkubation in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium ……………. 77

5.1.1. Einfluss des Inkubationsmediums auf fertilisationsassoziierte Reaktionen

bei equinen Spermien …………………….…………………………………………. 78

5.1.2. Einfluss der Inkubationsbedingungen auf fertilisationsassoziierte Reaktionen

bei equinen Spermien …………………………………………………...………..…. 80

5.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien

durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain ……………………………...… 81

5.2.1. Einfluss von Kalzium-Ionophor A23187 auf fertilisationsassoziierte

Reaktionen bei equinen Spermien …………………………………….…………..… 82

5.2.2. Einfluss von Procain auf fertilisationsassoziierte Reaktionen

bei equinen Spermien ………………...………………………………………….…. 83

5.2.3. Induktion der Hyperaktivierung bei equinen Spermien ……………………… 84

5.3. Heterologer Bindungsversuch mit in vitro maturierten porzinen Oozyten

und equinen Spermien ……………………………………………………………………… 85

5.3.1. Einfluss des Inkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-Ionophor

A23187 oder Procain auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien …………...…… 86

5.3.2. Einfluss der Inkubation in Magermilchverdünner

auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien ……………………………………..… 87

5.3.3. Einfluss des Spermieninkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-

Ionophor A23187 oder Procain auf die Oozytenmorphologie ………………….…... 89

5.4. Schlussfolgerungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen

bei equinen Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an porzine Oozyten ….……..………… 91

5.5. In-Vitro-Fertilisation equiner Oozyten …………………………………….……...……. 93

6 Zusammenfassung ……………………………………………………………………….. 95

7 Summary …………………………………………………………………………………. 98

8 Abbildungsverzeichnis …………………………………………………………………. 100

9 Tabellenverzeichnis …………………………………………………………………….. 102

10 Literaturverzeichnis ………………………………………………………………….. 103

ABKÜRZUNGEN

ALH Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung

BCECF-AM Bis-Carboxyethyl-Carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester

BSA Bovines Serumalbumin

BWW Biggers-Whitten-Whittingham Medium

CaIP Kalzium-Ionophor A23187

cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat

CASA Computer assistierte Spermienanalyse

CO2 Kohlendioxyd

DAPI Diamidin-Phenylindol

DiSC3 3,3'-Dipropylthiadicarbocyanin Iodid

DMEM F-12 Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

eCG Equines Choriongonadotropin

EGF Epidermal Growth Factor

FCS Fetales Kälberserum

FF Follikelflüssigkeit

FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor

FITC-PNA Fluorescein Isothiocyanat konjugiertes Peanut Agglutinin

FSH Follikel stimulierendes Hormon

GH Growth Hormon

GnRH Gonadotropin Releasing Hormon

hCG Humanes Choriongonadotropin

HCO3- Bikarbonat

HEPES Hydroxyethyl-Piperazinyl-Ethansulfonsäure

HSM Humanes Spermienmedium

ICSI Intrazytoplasmatische Spermieninjektion

IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1

IVM In-Vitro-Maturation

IVF In-Vitro-Fertilisation

KOK Kumulus-Oozyten-Komplex

LH Luteinisierendes Hormon

LIN Linearität

mM Millimolar

µM Mikromolar

MOT Gesamtmotilität

MW Modifiziertes Whittens-Medium

NBCS Neugeborenen-Kälberserum

NK Nichtkapazitations-Medium

nz Nicht zentrifugiert

OPU Ovum Pick Up

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PI Propidium-Iodid

PMS Progressiv motile Spermien

PTP Protein-Tyrosin-Phosphorylierung

PVA Polyvinylalkohol

PVI Perivitelline Injektion

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

SOFM Synthetic Oviduct Fluid Medium

sp TALP Spermien- Tyrode's Albumin Laktat Pyruvat

STR Geradlinigkeit

(TC)M 199 (Tissue Culture) Medium 199

z Zentrifugiert

ZP Zona pellucida

EINLEITUNG ___________________________________________________________________

11

1 EINLEITUNG

Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) findet im Bereich der assistierten Reproduktion beim

Pferd derzeit wissenschaftlich starke Beachtung. Die Erfolgsraten dieses Verfahrens sind

allerdings noch überaus gering, wohingegen IVF bei anderen Nutztieren (v.a. Rind) schon

routinemäßig angewendet wird. Seit 1992 (PALMER et al. 1991; BÈZARD 1992) konnte

mittels IVF (ausgenommen ICSI) kein lebendes Fohlen hervorgebracht werden.

Die Herausforderung der IVF besteht darin, Bedingungen im Labor zu schaffen, die sowohl

die weiblichen als auch die männlichen Gameten auf die Fertilisation vorbereiten. Das

wesentliche Vorgehen der IVF umfasst die Gewinnung intakter Oozyten und deren In-Vitro-

Maturation sowie die Spermiengewinnung und das Auslösen der fertilisationsassoziierten

Spermienreaktionen - Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion. Außerdem

müssen geeignete Inkubationsbedingungen in vitro geschaffen werden, welche die

Gametenreifung, die Fertilisation und die Kultivierung frühembryonaler Stadien ermöglichen.

Der Fertilisationserfolg der bisher zur Verfügung stehenden Protokolle, mit denen equine

Spermien und Oozyten auf die IVF vorbreitet werden, ist eingeschränkt, da erzeugte

frühembryonale Stadien sich bisher nicht über das 16-Zellstadium hinaus entwickeln konnten.

Die Lösung dieses Problems ist herausfordernd, da die komplexen reproduktionsbiologischen

und biochemischen Veränderungen, welche die Gameten während der Vorbereitung auf die

Fertilisation durchlaufen, derzeit noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Zudem weisen equine

Gameten spezielle Eigenschaften im Vergleich zu den Gameten anderer Nutztierarten auf,

sodass bestehende IVF-Protokolle nicht ohne Weiteres übernommen werden können.

Zur Optimierung von IVF-Verfahren mit equinen Gameten werden unterschiedliche

Lösungsansätze verfolgt. So gilt es besonders, die fertilisationsassoziierten Spermien-

reaktionen näher zu untersuchen, um sie effektiver und zeitgenau auslösen zu können.

Ebenfalls sind weiterführende Erkenntnisse nötig, um die In-Vitro-Maturation der Oozyten

unter Vermeidung von Veränderungen der Zona pellucida, welche das Eindringen der

Spermien behindern, zu optimieren. Im Weiteren sind zuverlässige Verfahren für die

Koinkubation der Gameten und die Kultivierung frühembryonaler Stadien zu etablieren.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter

Reaktionen bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen.

EINLEITUNG ___________________________________________________________________

12

Zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen wurde die Effektivität eines

Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Mediums evaluiert und optimale

Inkubationsbedingungen bestimmt. Darüber hinaus wurden die Reagenzien Kalzium-

Ionophor A23187 und Procain auf ihre Wirkung in Bezug auf die Induktion der Kapazitation,

Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien untersucht. Dabei sollte gezeigt

werden, ob und bei welcher Konzentration diese Reagenzien die Spermienreaktionen nach

einer Zeit der Vorinkubation verstärkt induzieren können. Da die verwendeten Reagenzien

nicht nur induzierende Effekte auf die Gameten zeigten, wurde außerdem überprüft, ob die

Reagenzien in der Spermiensuspension nach der Induktion der Spermienreaktionen durch ein

Zentrifugationsverfahren reduziert werden können und welche Auswirkungen dies auf die

Gameten hat.

In einem heterologen Bindungsassay wurde die Bindungsfähigkeit der equinen Spermien an

porzine Oozyten geprüft. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse der

Inkubationsmedien sowie des Zusatzes von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain mit oder

ohne nachfolgendem Zentrifugationsverfahren zur Induktion fertilisationsassoziierter

Spermienreaktionen auf die Spermien-Oozyten-Bindungsrate und die Oozytenmorphologie

evaluiert.

LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________

13

2 LITERATUR

2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation

Die Fertilisationsergebnisse der In-Vitro-Verfahren für die assistierte Reproduktion

beim Pferd liegen deutlich hinter denen der In-Vivo-Besamung zurück. Daher schenken die

Arbeitsgruppen, die sich mit der In-Vitro-Fertilisation befassen, der Aufklärung der einzelnen

Schritte besondere Beachtung, die sowohl Spermium als auch Eizelle von ihrer Genese bis zur

Fertilisation und darüber hinaus durchlaufen. Orientiert an den Vorgängen in vivo sollen

möglichst optimale Bedingungen mit dem Endziel der Fertilisation in vitro geschaffen

werden.

Nach der Spermatogenese im Hodengewebe, wo der Aufbau von Zellorganellen und die

DNA-Transkription abgeschlossen wurden, reifen die Spermien im Nebenhoden aus. Dabei

finden v.a. Umordnungen der Plasmamembran statt, indem vom Nebenhodenepithel

sezernierte Proteine und Lipide in die Membran aufgenommen werden, Zytoplasma

abgegeben wird und die Spermien ihre Bewegungsfähigkeit erlangen (JOHNSON et al.

1980). Das reife Spermium weist eine sehr spezialisierte Zellstruktur auf: der Spermienkopf

enthält die DNA, seine Plasma- und Akrosommembran sind essentiell für die Interaktion mit

der Oozyte und die Mitochondrien des kaudal anschließenden Mittelstückes liefern die nötige

Energie für die Antriebsbewegung der Flagelle als Endstück (VARNER et al. 2015).

Bei der Ejakulation kommen die Samenzellen in Kontakt mit dem Seminalplasma, welches

Dekapazitationsfaktoren wie z.B. freies Cholesterol, Vitamin E und Phospholipid-Transfer-

Proteine enthält, welche die Spermien an der vorzeitigen Auslösung fertilisationsassoziierter

Reaktionen hindern (SUZUKI et al. 2002).

Unmittelbar nach der Ejakulation müssen die noch nicht befruchtungsfähigen Spermien die

strukturellen, molekularen und funktionellen Veränderungen der Kapazitation,

Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durchlaufen, um eine Eizelle aus eigener Kraft

fertilisieren zu können. Diese Prozesse werden durch die Bedingungen im weiblichen

Genitaltrakt ausgelöst (CHANG 1951). Nachdem die Spermien in den Uteruskörper der

Stute ejakuliert wurden, gelangen sie durch die Eileiterpapille in den Eileiter, wo sich ein

Reservoir nicht kapazitierter Spermien bildet. Um den Zeitpunkt der Ovulation kapazitieren

die Spermien, lösen sich mit hyperaktivem Bewegungsmuster aus dem Reservoir und


14

schwimmen durch den selektierenden Eileiter zur reifen Oozyte, an deren Zona pellucida sie

nach Passage der Kumuluszellen binden (SUAREZ 2016). Diese Bindung löst die

Akrosomreaktion aus, welche die Penetration der Zona pellucida und somit das Eindringen

des Spermiums in den perivitellinen Raum der Oozyte ermöglicht, sodass die Fertilisation der

Gameten stattfinden kann.

Auch in vitro sind die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion notwendig für

die Fertilisation einer Oozyte durch Spermien. Nach der Ejakulation besitzen Spermien

grundsätzlich die Voraussetzungen, um unter geeigneten Bedingungen diese Reaktionen zu

durchlaufen (VISCONTI u. KOPF 1998). Demnach müssen entsprechende Bedingungen, die

die Induktion der Spermienreaktionen ermöglichen, im Labor simuliert werden. Es ist jedoch

zu beachten, dass es bei der Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in

vitro große inter- und intraindividuelle Unterschiede gibt (PATRAT et al. 2002).

2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien

2.1.1.1. Kapazitation

Der Begriff Kapazitation bezeichnet Stoffwechsel- und Plasmamembran-assoziierte

Prozesse der Reifung von Spermien im weiblichen Genitale und ist Voraussetzung für die

Induzierbarkeit weiterer fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen. Der größte Anteil

dieser Vorgänge findet im kaudalen Isthmus des Eileiters statt (TÖPFER-PETERSEN u.

WABERSKI 2001). Nur kapazitierte Spermien sind in der Lage, fest und dauerhaft an

Eizellen zu binden. In vivo werden diese Prozesse durch verschiedene, sogenannte

„Kapazitationsfaktoren“ (z.B. Änderungen des Ionenmilieus und Vorkommen Cholesterol

bindender Lipoproteine) ausgelöst, sobald die Spermien in den weiblichen Genitaltrakt

gelangen (GADELLA et al. 2001). Beim Hengst dauert dieser Vorgang mit 6−8 Stunden

relativ lang, verglichen mit 1−2 Stunden beim Eber (YANAGIMACHI 1994).

Die biochemischen Prozesse der Kapazitation sind sehr komplex und z.T. nicht im Detail

aufgeklärt. In einem Review veranschaulichten FLESCH und GADELLA (2000) die

Veränderungen in der Plasmamembran von Säugetierspermien während der Kapazitation

und deren Zusammenhang mit weiteren fertilisationsassoziierten Prozessen. Demnach können

Membrankomponenten wie Proteine, Phospholipide und Cholesterol nicht mehr von


15

ejakulierten Spermien synthetisiert werden, sie können aber aus Genitalsekreten absorbiert,

strukturell modifiziert oder abgespalten werden. Starken Einfluss auf den Gehalt und die

Anordnung der Komponenten hat dabei in vivo das Mikromilieu des jeweiligen Abschnittes

des weiblichen Genitaltraktes, in dem sich die Spermien befinden.

Ein wesentlicher Prozess während der Kapazitation ist die Änderung der Lipid- und

Proteinordnung in der Plasmamembran des Spermiums, welche als Lipiddoppelschicht aus

v.a. Phospholipiden, Cholesterol und eingelagerten Proteinen aufgebaut ist. Für den Hengst

setzt sich die Lipiddoppelschicht zu 57% aus Phospholipiden, 37% Cholesterol und 6%

Glykolipiden zusammen (GADELLA et al. 2001).

Lipide sind transversal heterogen, inter- und intraindividuell unterschiedlich sowie

asymmetrisch in den Phospholipidschichten der Plasmamembran angeordnet. Die

Phospholipide selbst sind in den Membranschichten relativ ungeordnet, Sterole und

Sphingolipide aber lagern sich mit bestimmten Membranproteinen in stabilen Domänen an.

Diese Lipiddomänen werden als 'lipid-rafts' bezeichnet und finden sich in den verschiedenen

funktionalen Abschnitten des Spermienkopfes, sie strukturieren die Membran, machen sie

funktionell variabel und sind vermutlich v.a. für Zell-Zell-Interaktionen notwendig

(GADELLA u. BOERKE 2016). Während der Kapazitation werden die Phospholipide

umgeordnet. Dies erfolgt entlang der Doppelmembran durch Transportproteine über einen

Bikarbonat vermittelten Weg und wird auch als 'Scrambling' bezeichnet (HARRISON u.

MILLER 2000; RATHI et al. 2001).

Der Cholesterolgehalt der Spermien ist zwischen den Säugetieren sehr variabel und erscheint

als ein wesentlicher Faktor im Zusammenhang mit der Kapazitationsdauer der Spermien

unterschiedlicher Spezies (YANAGIMACHI 1994). Kennzeichnend für Hengstspermien ist

ein relativ hoher Cholesterolgehalt (37%) in der Plasmamembran (GADELLA et al. 2001),

wovon den Domänen ein großer Teil während der kapazitationsbedingten

Phospholipidumverteilung entzogen wird. Dieser Cholesterolverlust wird in vivo unterdrückt,

solange die Spermien vom Prostatasekret mit hohen Cholesterolkonzentrationen umgeben

sind, während er im weiblichen Genitale durch Sterol bindende Proteine in den Sekreten

gefördert wird (MINELLI et al. 1998). Die Verminderung des Cholseterolgehaltes in der

Plasmamembran kapazitierter Spermien führt zu einem neuen Cholesterol-Phospholipid-

Verhältnis. Dieses wiederum bedingt eine erhöhte Fluidität der Lipiddoppelschicht, wodurch


16

die Bildung neuer Cholesterol reicher 'lipid-rafts' in der Plasmamembran des apikalen

Bereichs des Spermienkopfes ermöglicht wird. Die resultierende kapazitationsassoziierte

Umorganisation apikaler Membrandomänen geht einher mit einem Verlust von

oberflächlichen Membranproteinen und einer Umverteilung von als Dekapazitationsfaktoren

fungierenden Seminolipiden vom apikalen in den äquatorialen Kopfbereich.

Durch den Verlust oberflächlicher Membranproteine und des fusionshindernden

Seminolipids im apikalen Bereich des Spermienkopfes werden Rezeptorproteine freigelegt,

die später an der Zona pellucida-Erkennung und -Bindung der Spermien sowie der folgenden

Akrosomreaktion beteiligt sind (GADELLA u. BOERKE 2016). Auch transmembrane

Proteine ordnen sich während der Kapazitation über den Spermienkopf hinweg neu, sodass

für die Gametenbindung und -fusion spezialisierte Domänen an der lateralen Kopfmembran

entstehen (sog. 'lateral reorganization') (CHENG et al. 1998; FLESCH u. GADELLA 2000;

GADELLA u. BOERKE 2016). Ein Teil der v.a. transmembranen Proteine durchläuft zudem

während des Kapazitationsprozesses die Tyrosin-Phosphorylierung (PTP), welche als Maß

für den Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation herangezogen werden kann.

Diese Reaktion wird in erster Linie durch transmembranen Transport von extrazellulärem

Bikarbonat in das Spermieninnere induziert. Dies aktiviert verbunden mit erhöhtem

Kalziumeinstrom in die Zelle die spermale Adenylatzyklase zur Synthese von cAMP,

wodurch die Protein-Kinase A aktiviert wird und letztlich die PTP erfolgt. Die PTP resultiert

in einer Aktivierung oder Deaktivierung der transmembranen Proteine durch enzymatische

Modifikation von Phosphatgruppen (VISCONTI u. KOPF 1998; DEMARCO et al. 2003).

Mit dem nach innen gerichteten Transport von Bikarbonationen ist neben der PTP eine

Erhöhung des intrazellulären pH-Wertes der Spermien verbunden. Dies stellten LEEMANS

et al. (2014) bei der In-Vitro-Bindung von equinen Spermien an isolierte Eileiterexplantate

fest, da sie erhöhte pH-Werte in epithelialen Drüsenzellen und gebundenen Spermien in

Verbindung mit höheren PTP-Werten beobachteten. Die Tyrosin-Phosphorylierung der

Proteine ist also vom Ionentransport (v.a. Kalzium und Bikarbonat) und somit von den intra-

und extrazellulären Ionenkonzentrationen sowie dem pH-Wert abhängig. So konnten im

weiblichen Genitaltrakt aufsteigend in den Sekreten höhere Kalziumkonzentrationen und pH-

Werte nachgewiesen werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012).


17

Schon HARRISON et al. (1993) beschrieben, dass kapazitationsassoziierte Umbauprozesse in

der Plasmamembran zu einem Status der vorübergehenden Instabilität mit erhöhter Fluidität

und somit zu einer gesteigerten Ionenpermeabilität der Plasmamembran einer Subpopulation

der Spermien führen. Die Spermien sind in vivo auf ihrem Weg vom Nebenhoden, in das

Seminalplasma und durch das weibliche Genitale unterschiedlichen extrazellulären

Ionenkonzentrationen ausgesetzt. Dies führt in der Spermienmembran zur Aktivierung

verschiedener Ionenkanäle und durch sich ändernde Ionenverhältnisse zu Änderungen im

Membranpotential (VISCONTI et al. 2011). Eine erhöhte Permeabilität der Membran für

Kalium- und Natriumionen resultiert in einer Hyperpolarisation der Plasmamembran, welche

wiederum spannungsabhängige Kalziumkanäle aktiviert und so einen verstärkten

Kalziumeinstrom in die Samenzelle bedingt (VISCONTI u. KOPF 1998). Somit kennzeichnet

auch ein Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes den Kapazitationsvorgang.

Kalziumreservoirs im Zytosol equiner Spermien wie das Endoplasmatische Retikulum aus

denen endogen Kalziumionen freigesetzt werden können, sind bisher nicht nachgewiesen. Der

intrazelluläre Kalziumgehalt hängt daher entscheidend vom extrazellulären Ionengehalt ab,

dies erfordert den Zusatz von Kalziumverbindungen im Medium zur Induktion der

Kapazitation in vitro (FLESCH u. GADELLA 2000).

Die dargestellten ionenabhängigen Reaktionen sind molekular bisher noch nicht vollständig

aufgeklärt, machen aber zusammenfassend die Notwendigkeit einer spezifischen

Konzentration von v.a. Kalzium und Bikarbonat in den Kapazitationsmedien in vitro deutlich,

ebenso ist ein adäquater pH-Wert im Medium einzustellen.

In vitro werden durch Zentrifugations- oder Waschverfahren zunächst die im Seminalplasma

enthaltenen Dekapazitationsfaktoren entfernt. Ein geringer Teil der Spermien kapazitiert

bereits nach Wegfall der inhibierenden Faktoren (YANAGIMACHI 1994; SUZUKI et al.

2002). Zum Zwecke der IVF ist allerdings eine weitere Stimulation fertilisationsassoziierter

Spermienreaktionen notwendig. Die Änderungen in der Plasmamembranorganisation werden

v.a. durch die mehrstündige Inkubation der Spermien in bestimmten Medien provoziert.

Geeignete In-Vitro-Kapazitationsmedien (s. Tab. 2.1.) enthalten die Spermienmembran-

veränderungen unterstützende Komponenten. Als (Chole-)Sterol-Akzeptor werden bovines

Serumalbumin oder Cyclodextrine zugesetzt (VISCONTI et al. 1999; BROMFIELD et al.

2014). Bikarbonat fördert das 'Phospholipid-Scrambling' und die PTP und trägt zu einem


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erhöhten pH-Wert bei (FLESCH et al. 2001). Außerdem werden dem Medium i.d.R.

extrazelluläre Kalziumdonoren und eine Energiequelle (Glukose, Laktat, Pyruvat) zugesetzt

(MC PARTLIN et al. 2008). Basismedien zur Negativkontrolle enthalten gewöhnlich kein

BSA und Bikarbonat. Orientiert an den Ergebnissen von MC PARTLIN und Mitarbeitern

(2008) gilt das modifizierte Whittens-Medium als Medium der Wahl zur Kapazitation equiner

Spermien. Sie konnten nach vierstündiger Inkubation in diesem Medium die

Akrosomreaktion und die PTP in hohem Maße auslösen. Mit demselben Medium wiesen

ORTGIES et al. (2012) bereits nach 30 min Kapazitationsprozesse der Spermien nach.

BROMFIELD et al. (2014) konnten die Eignung eines Nicht-Kapazitationsmediums (ohne

Bikarbonat) als Kurzzeittransport-Medium (ca. 4 Std.) belegen, obwohl auch in diesem

Medium physiologische Kapazitationsprozesse in begrenztem Maße abliefen.

Die Inkubationsbedingungen für die Kapazitation unterscheiden sich zwischen

verschiedenen Arbeitsgruppen. In einigen Studien wird die Inkubation in angefeuchteter Luft

mit 5% CO2 empfohlen, um eine unkontrollierte pH-Werterhöhung im Medium durch CO2-

Abgasung und HCO3--Bildung zu vermeiden (ALM et al. 2001; HINRICHS et al. 2002).

Andere Arbeitsgruppen halten eine Inkubation der Spermiensuspensionen in Luft für

geeignet, da eine bikarbonatvermittelte pH-Werterhöhung die PTP auslöst, was als Induktion

der Kapazitation interpretiert werden kann (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012;

MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Die Temperatur beträgt zumeist 37−38°C und die

Inkubationszeiten sind mit 30 min (ORTGIES et al. 2012) bis sechs Stunden (MC PARTLIN

et al. 2008) sehr variabel.

Die Kapazitation equiner Spermien kann zusätzlich zur Inkubation in einem

Kapazitationsmedium durch Zugabe von z.B. Phosphodiesterase-Inhibitoren und cAMP-

Analoga, welche den Reaktionsweg der PTP beeinflussen, durch Kalzium-Ionophore (z.B.

A23187 und Ionomycin) sowie durch Erhöhung des extrazellulären pH-Wertes unterstützt

werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012; ORTGIES et al. 2012; MORATÓ et al.

2013). Kalzium-Ionophore sind sehr effektive Kalziumdonoren, die als fettlösliche Moleküle

ihr Kation durch Zellmembranen transportieren können. Sie fördern sowohl die Kapazitation,

gemessen am intrazellulären Kalziumanstieg und folgender PTP, als auch die

Akrosomreaktion. Allerdings behindern sie in höheren Konzentrationen massiv die

Spermienmotilität. Mit Mausspermien konnte jedoch gezeigt werden, dass deren


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Motilitätsparameter wieder ansteigen und sogar hyperaktive Bewegungsmuster in hohem

Maße provoziert werden, sobald das Reagenz abzentrifugiert wird (TATENO et al. 2013).

Ergänzend seien noch Kapazitationsmethoden erwähnt, die sich näher am In-Vivo-Modell

orientieren: Gemessen an einem Anstieg in der PTP führt eine Koinkubation von equinen

Spermien mit Eileiterepithel (LEEMANS et al. 2014), Follikelflüssigkeit (LEEMANS et al.

2015a) oder foetalem bovinen Serum (GONZÁLEZ-FERNÀNDEZ et al. 2015) zu einem

erhöhten Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation. Nachteilig bei der

Verwendung dieser Zusätze ist deren nicht definierte Zusammensetzung.

Aufgrund der vielschichtigen biochemischen Vorgänge während der Kapazitation besteht

bisher kein Konsens für ein geeignetes Kapazitationsprotokoll equiner Spermien.

Der Erfolg der Kapazitationsinduktion kann im Labor auf vielfältige Weise quantifiziert

werden: Die Analyse der Cholesterolumverteilung und des -effluxes kann mittels Filipin-

Assay erfolgen, da dieses Fluoreszenzmolekül unveresterte Sterole bindet und deren

Anordnung und Anteil in verschiedenen Lokalisationen der Plasmamembran visualisieren

kann (FLESCH et al. 2001). Die Phospholipidumordnung bzw. das „Scrambling“ kann durch

Anfärben mit dem Fluoreszenzfarbstoff Merocyanin 540, einem Marker für geänderte Lipid-

Packungsdichte, durchflusszytometrisch evaluiert werden (RATHI et al. 2001). Die

Ausprägung der PTP kann Antikörper vermittelt durch SDS-PAGE, Immunoblotting,

Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie bestimmt werden (MC PARTLIN et al.

2008). Der kationische DiSC3- Fluoreszenzfarbstoff zeigt Änderungen des

Membranpotentials an (LINARES-HERNÀNDEZ et al. 1998; PATRAT et al. 2002). Die

kapazitationsbedingte Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes kann (an fixierten

Präparaten) mikroskopisch mittels Chlortetracyclinfärbung erfasst werden, welche die

Verteilung von Kalzium auf der Membranoberfläche der Spermien anzeigt (RATHI et al.

2001). Nach Färbung mit z.B. Fluo-3 kann der Kalziumeinstrom anhand eines Anstiegs der

Fluoreszenzintensität durchflusszytometrisch bestimmt werden (HARRISON et al. 1993).

Der intrazelluläre pH-Wertanstieg kann durch z.B. BCECF-AM-Färbung festgestellt werden,

da dieser pH-sensitive Fluoreszenzfarbstoff je nach pH-Wert unterschiedliche Spektren

emittiert (LEEMANS et al. 2014). Eine Aussage über den pH-Wert der

Gesamtspermienpopulation lässt auch der extrazelluläre Medien-pH zu.


20

Für die Analyse von Kapazitationsparametern ist weniger das Erreichen von Schwellenwerten

als vielmehr ein Anstieg ausgewählter Parameter ausschlaggebend, da immer nur eine

Subpopulation der Spermien den Veränderungen durch Kapazitationsreaktionen unterliegt

und nicht alle Spermien der Gesamtpopulation gleichzeitig. Letztlich bietet auch die

Induzierbarkeit der Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) ein gutes Maß für die erfolgte

Kapazitation der Spermien (ALM et al. 2001).

2.1.1.2. Hyperaktivierung

Der Begriff Hyperaktivierung beschreibt ein von der gleichmäßigen progressiven

Bewegung von Säugerspermien abweichendes Bewegungsmuster mit erhöhter

Schlagfrequenz, -amplitude und -asymmetrie der Flagelle.

In vivo dient die Hyperaktivierung dem Ablösen des Spermiums vom Epithel des

Eileiterreservoirs, dem Durchschwimmen des Eileitermukus sowie der Penetration von

Kumuluszellen und der Zona pellucida der Oozyte (HO u. SUAREZ 2001). Außerdem

erleichtert die stärkere seitliche Kopfauslenkung (amplitude of lateral head displacement =

ALH) dem Spermium das Auffinden der Oozyte im Eileiter. Wie SUAREZ und HO (2003)

darlegten, wird angenommen, dass diese Bewegungsmuster um den Zeitpunkt der Ovulation

durch vom Ovidukt, der Oozyte und der Follikelflüssigkeit ausgehende Signale initiiert

werden. In den weiblichen Genitalsekreten sind besonders zyklusbedingte Veränderungen des

extrazellulären Kalziumgehaltes und des pH-Wertes an der Initiation der Hyperaktivierung

beteiligt. Auch noch undefinierte, chemotaktische Aktivierungsreize durch den

Ovulationsprozess werden in Betracht gezogen. Ebenso wird die Rolle von freien

Sauerstoffradikalen im weiblichen Genitale diskutiert, welche eine Lipidperoxidation der

Spermienmembran durch reaktive Sauerstoffspezies bedingen und so die Hyperaktivierung

fördern (GADELLA et al. 2001).

Die biochemische Regulation der Hyperaktivierung ist noch nicht vollends aufgeklärt.

HINRICHS und LOUX (2012) fassten Erkenntnisse zur Hyperaktivierung von

Hengstspermien in vitro zusammen: durch eine extrazellulär bedingte intrazelluläre pH-

Erhöhung gelangt Kalzium aus dem Medium über den Spermien spezifischen, pH-aktivierten

CatSper-Kalziumkanal in die Samenzelle. Dadurch wird über die Aktivierung von

Calmodulin-Kinase die flagellare Dyneinfunktion geändert. Die Dyneinärmchen lassen die


21

Mikrotubuli der Flagelle aneinander entlang gleiten, sodass die spezifische Schlagbewegung

entsteht (MC PARTLIN et al. 2009).

MC PARTLIN et al. (2009) und ORTGIES et al. (2012) beschrieben, dass in vitro eine

Subpopulation von ca. 25−30% der in Kapazitationsmedium inkubierten Spermien spontan

hyperaktivierte Bewegung zeigt, die als biphasische Suchbewegung der Spermien mit

abwechselnd kreisender und progressiver Bewegung erscheint. Gezielt induziert werden kann

die Hyperaktivierung sowohl kapazitierter als auch nicht kapazitierter equiner Spermien

(55−75%) mittels Applikation des Lokalanästhetikums Procain. So aktivierte Spermien zeigen

bei mikroskopischer Betrachtung unter dem Deckglas allerdings kein biphasisches, sondern

ein konstant kreis- bzw. sternförmiges Bewegungsmuster, wobei die kapazitationsassoziierte

Protein-Tyrosin-Phosphorylierung, die Plasmamembranordnung und die Akrosomreaktion

unbeeinträchtigt bleiben. Procain aktiviert CatSper-Kanäle, wirkt aber unabhängig von einem

Kalziumeinstrom und erhöht den intrazellulären pH-Wert. Ein hoher Medium-pH oder 4-

Aminopyridin können zur Induktion der Hyperaktivierung eingesetzt werden (LOUX et al.

2013). Auch durch Applikation von Ionomycin und die Vorselektion von Hengstspermien

kann die Hyperaktivierung ausgelöst werden (MORATÒ et al. 2013). Nach Inkubation in

vorbehandelter Follikelflüssigkeit konnten LEEMANS et al. (2015a) pH- und Kalzium-

(extrazellulär) abhängige Mechanismen nachweisen, die mit der Hyperaktivierung von

Hengstspermien verbunden waren.

Nach bisherigen Erkenntnissen stehen hyperaktive Bewegungsmuster nicht in direktem

Zusammenhang mit den Kapazitationsprozessen der Spermien, sodass die Induzierbarkeit der

Hyperaktivierung keine Auskunft über eine vorangegangene Kapazitation erlaubt (RATHI et

al. 2001).

Die computerassistierte Spermienananalyse liefert fünf Parameter, über die

Hyperaktivierung bestimmt werden kann: Anstieg der Geschwindigkeit auf der gebogenen

Linie (curvilinear velocity = VCL) und der ALH sowie Verminderung der Geschwindigkeit

auf gerader Strecke (straight line velocity = VSL), der Linearität (= LIN) und der Bewegung

auf der geraden Linie (straightness = STR). RATHI et al. (2001) stellten für Hengstspermien

Mindestwerte von VCL ≥180 µm s−1

und ALH ≥12 µm für hyperaktive Bewegung auf, ein

deutlicher Anstieg dieser Parameter zum Basalwert ist aber ebenso aussagekräftig für die

Induktion dieser fertilisationsassoziierten Spermienreaktion.


22

2.1.1.3. Akrosomreaktion

Das Akrosom liegt dem Spermienkopf als große, vesikuläre Struktur apikal auf und

enthält hydrolytische Enzyme, welche essentiell für die Penetration der Zona pellucida (ZP)

der zu befruchtenden Eizelle sind.

Die Akrosomreaktion wird physiologisch durch die Bindung des Kopfes eines kapazitierten

und akrosomintakten Spermiums an die Eizelle ausgelöst (YANAGIMACHI 1994). Die

Rezeptor-Protein-Bindung zwischen den Membranen der Gameten fördert den

Kalziumeinstrom in den Spermienkopf über spannungsabhängige Kanäle, was zur

multifokalen Fusion der Plasmamembran mit der äußeren Akrosommembran führt. Aus

beiden Membranen entstehen Vesikel, welche die hydrolytischen Enzyme des Akrosoms (v.a.

Akrosin und Hyaluronidase) enthalten. Diese Vesikel werden exozytotisch Richtung ZP

abgegeben und ermöglichen eine fokale Lyse dieser. Somit ist der Weg zur Plasmamembran

der Oozyte für das Spermium frei. Am Kopf akrosomreagierter Spermien ist die innere

Akrosommembran mit Proteinbindungsstellen für Integrine der Eizelle freigelegt. Die

Bindung dieser Membran an die Oozyte erfolgt zunächst mit der Kopfspitze des Spermiums.

Darauf bindet es sekundär fest mit dem äquatorialen Bereich, was in Verbindung mit

hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum

ermöglicht (GADELLA et al. 2001). Aufgrund ihres destabilisierten Membranstatus (Kap.

2.1.1.1.) sind kapazitierte Spermien besonders anfällig für Faktoren, die die Akrosomreaktion

auslösen (GADELLA u. HARRISON 2000). Daher weist ein geringer Anteil in vitro

kapazitierter Spermien eine spontane oder durch geringe Umweltreize (z.B. Temperatur-

schwankungen) ausgelöste Akrosomreaktion auf. Somit ist die Induzierbarkeit der

Akrosomreaktion ein guter Index für die erfolgte Kapazitation und kann sogar als Endpunkt

der Kapazitation interpretiert werden (MC PARTLIN et al. 2008).

In vitro kann die Akrosomreaktion in Bikarbonat-haltigem Medium kapazitierter

Hengstspermien durch Zugabe von CaIP (Kalzium-Iononophor A23187) induziert werden,

indem die transmembrane Kalziumpassage erleichtert wird (RATHI et al. 2001; RUNCAN et

al. 2013). Andere Kapazitationsbehandlungen wie z.B. die Inkubation der equinen Spermien

mit Cholesterol bindenden Cyclodextrinen erhöhen ebenfalls die Induzierbarkeit der

Akrosomreaktion (BROMFIELD et al. 2014). Progesteron, welches in hohem Maße in der

Flüssigkeit präovulatorischer Follikel vorkommt, löst nach Hyperpolarisation der


23

Plasmamembran und Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle die akrosomale

Exozytose ebenfalls aus (PATRAT et al. 2002; MC PARTLIN et al. 2008).

Im Hinblick auf die IVF ist zu beachten, dass ein gezieltes Auslösen der Akrosomreaktion

terminiert erfolgen muss, da Spermien, die bereits vor Erreichen der Oozyte reagierten, ihre

Penetrationsfähigkeit verlieren (GADELLA et al. 2001).

Die Akrosomreaktion kann fluoreszenmikroskopisch unter Verwendung von

fluoreszenzmarkierten, Glykoproteine bindenden Lektinen oder von Chlortetracyclinen erfasst

werden, welche an die akrosomalen Membranen binden oder diese penetrieren (RATHI et al.

2001; AITKEN 2006). Fluorisothiozyanat-konjugiertes Peanut Agglutinin (FITC-PNA) oder

auch PNA-Alexa sind gebräuchliche Lektine, welche an ß-Galaktose-Reste der äußeren

Akrosommembran von Hengstspermien binden, deren Integrität anzeigen und somit intakte,

reagierende oder reagierte Akrosome detektieren (RATHI et al. 2001; MC PARTLIN et al.

2008).

2.2. Kalzium-Ionophor A23187

Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt, finden Kalzium-Ionophore biotechnologisch

Anwendung bei der Induktion von Kapazitationsvorgängen und der Akrosomreaktion.

Ebenfalls werden sie für die Oozytenaktivierung (Kap. 2.7.) genutzt. Dabei macht man sich

die Löslichkeit der hydrophoben Ionophore in der Lipiddoppelschicht zum Nutzen. Sie

erhöhen die Membrandurchlässigkeit für anorganische Ionen entlang des elektrochemischen

Gradienten, indem sie die Ladung des transportierten Ions maskieren. Ionophore können als

Kanalbildner oder mobile Ionen-Carrier wirken (ALBERTS et al. 1995). In der

Reproduktionsbiologie wird zumeist das CaIP A23187 genutzt, welches als mobiler Carrier

bivalente Kationen (z.B. Ca2+

, Mg2+

) transportiert und somit deren intrazellulären Gehalt

erhöhen kann. Intrazelluläres Kalzium bindet u.a. an Calmodulin, welches dann Enzyme und

Membranproteine aktiviert oder auch über Ca2+

-Calmodulin-abhängige Kinasen die

Phosphorylierung von Proteinen auslöst (ALBERTS et al. 1995).


24

2.3. Procain

Procain ist ein Lokalanästhetikum des Esther-Typs, welches in der Lage ist, sich

aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften in die Plasmamembran von Zellen einzulagern und

so v.a. spannungsabhängige Natrium- und in höheren Konzentrationen Kaliumkanäle zu

blockieren. Dies führt zur Störung der elektrochemischen Vorgänge an der Zellmembran oder

in der Zelle selbst. Durch das Blockieren von Natriumkanälen kann z.B. die Depolarisation

von (Nerven-) Zellmembranen behindert werden. MC PARTLIN et al. (2009) zeigten, dass

Procain in vitro die Hyperaktivierung equiner Spermien (Kap. 2.1.1.2.) hervorruft und

vermuteten, dass dies in der durch Procain erhöhten Permeabilität der Plasmamembran für

Kalziumionen begründet ist. Außerdem erhöht Procain als schwache Base den intrazellulären

pH-Wert und aktiviert so möglicherweise den pH-abhängigen Kalziumeinstrom durch Cat-

Sper Kanäle (LOUX et al. 2013). Im Detail sind die hyperaktivierenden Eigenschaften von

Procain auf Spermien jedoch noch nicht aufgeklärt.

Tabelle 2.1.: Zusammensetzung von Inkubationsmedien zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro.

Arbeitsgruppe Patrat

et al.

2002

Lopez-

Gonzalez

et al. 2014

Tateno et al.

2013 Rathi et al.

2001 Mc

Partlin et

al. 2007

Mc

Partlin et

al. 2008

Gonzales-

Fernandez

2012

Bromfield et al.

2014

Rau et al. 2016

Spezies Mensch Mensch Maus Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd

Medium BWW HSM Tyrode Tyrode sp TALP MW MW BWW MW

Komponenten

(mM)

NaCl 95 120 119.4 96 100 100 100 91.5 100

KCl 4.8 4 4.8 3.1 3.1 4.7 4.7 4.6 4.7

CaCl 1.7 1.7 2 2 1.7 2.4

KH2PO4 1.2 1.2 0.3 0.3 1.2

NaH2PO4

MgSO4 1.2 1.2 0.4 1.2

MgCl2 1 0.4 1.2 1.2 1.2

Glucose 5.6 5 5.6 5 5 5.5 5.6 5

Na-Pyruvat 0.25 1 1 1 1 1 1 0.27 1

HEPES 20 10 20 10 22 22 20 22

NaHCO3 25 15 25 15 25 25 25 25 24.9

Laktat 20 10 21.7 21.6 4.8 2.4 44 2.4

BSA (mg mL-1

) 5 4 7 7 7 7 3 7

Antibiotika 50µg mL-1

Streptomycin 75µg mL

-1

Penicillin G

50µg mL-1

Kanamycin 5 I.E L

-1

Penicillin

5mg mL-1

Streptomycin

Besonderheit 1mg mL-1

PVA

Grau unterlegt: derzeit bevorzugt verwendetes Medium ('MW') zur Kapazitationsbehandlung equiner Spermien.

Letzte Spalte: Zusammensetzung des in der vorliegenden Studie verwendeten modifizierten Whittens-Mediums, die Abweichungen von 'MW'

sind durch Umrandung hervorgehoben. Die genauen Bezeichnungen der Medien sind dem Abkürzungsverzeichnis zu entnehmen.


26

2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation

Die Oozyten von Säugetieren wachsen in den Follikeln der Ovarien heran, welche sich

von Primär- über Sekundär- und Tertiärfollikeln zu präovulatorischen Graafschen Follikeln

entwickeln. Bei den physiologisch uniparen Equiden geht aus den FSH stimulierten

Follikelwellen i.d.R. nur ein präovulatorischer Follikel je Zyklus hervor. Im präovulatorischen

Follikel ist die Oozyte bereits vollständig ausgebildet mit einem von Ooplasma umgebenen

diploiden Zellkern und einer von Follikelepithelzellen (Corona radiata) und Kumuluszellen

umgebenen Zona pellucida. Die Oozyten befinden sich im Ruhestadium der ersten Meiose

(Dictyotänstadium), bis dieses durch die präovulatorische Reifungsinduktion unterbrochen

wird. Einige Stunden vor der Ovulation ist die erste meiotische Reifeteilung der Eizelle

beendet, wobei ein Polkörper mit einem einfachen Chromosomensatz in den perivitellinen

Raum abgeschnürt wurde. Unter Einfluss von FSH und LH erfolgt schließlich die Ovulation.

Die Eizelle verlässt den Follikel mit den umgebenen Kumuluszellen als Kumulus-Oozyten-

Komplex und wird vom Fimbrientrichter des Eileiters aufgenommen. Gleichzeitig beginnt,

getriggert vom periovulatorischen LH-Peak, die zweite Reifeteilung der Meiose, welche in

der Metaphase II arretiert, bis die Oozyte von einem Spermium fertilisiert wird. Eine

befruchtungsfähige Oozyte zeichnet sich demnach durch den Kernstatus der Metaphase II und

einen Polkörper aus. Sobald ein Spermium in die Eizelle eindringt, wird die zweite

Reifeteilung fortgesetzt und ein weiterer Polkörper abgeschnürt. Im Zellkern liegt dann ein

haploider Chromosomensatz vor, welcher mit dem des Spermiums verschmelzen kann. Die

Fertilisation findet beim Pferd am Übergang von Eileiterampulle und -isthmus statt

(BEZARD et al. 1989). Nicht befruchtete, equine Eizellen verbleiben im Eileiter und werden

dort resorbiert. Für fertilisierte Zygoten aber erfolgt eine Zellteilungsphase von etwa fünf bis

sechs Tagen im Eileiter, woraufhin sie als Morula in den Uterus gelangen und dort ihre

frühembryonale Entwicklung fortsetzen (FLOOD et al. 1979).

In Vorbereitung auf die In-Vitro-Fertilisation müssen die Oozyten zunächst aus den Ovarien

von Spendertieren gewonnen, selektiert und aufbereitet werden. Daraufhin erfolgt die In-

Vitro-Maturation, sodass schließlich eine reife Oozyte zur Fertilisation mit aufbereiteten

Spermien zur Verfügung steht.


27

2.4.1. Oozytengewinnung

Oozyten müssen für In-Vitro-Verfahren zunächst als Kumulus-Oozyten-Komplexe

(KOKs) aus den Follikeln isoliert werden.

Für Nutztierarten wie Rind und Schwein ist für gewöhnlich Schlachthofmaterial zugänglich.

Von aus dem Tier isolierten Ovarien können die Oozyten aus Follikeln durch Aspiration

über eine Kanüle, die mit einem Unterdrucksystem verbunden ist, oder durch Eröffnen des

Follikels mittels Skalpell und anschließendes Ausspülen oder Auskürettieren gewonnen

werden. Eine weitere Methode ist die des sog. `Slicing`, bei der die Ovaroberfläche mehrfach

mit Klingen eingeritzt wird und die KOKs aus den so eröffneten Follikeln ausgewaschen

werden. Bei der Gewinnung equiner KOKs ist zu beachten, dass diese mit breiter Basis über

ihre Kumuluszellen an der Follikelinnenseite befestigt sind und daher durch intensives Spülen

oder Kürettieren abgelöst werden müssen (ALM et al. 1997).

Bei wertvollen Individuen und geringer Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial, wie es häufig

beim Pferd der Fall ist, kann der Follikelinhalt auf verschiedene Weise am lebenden Tier

gewonnen werden. Mit der Technik des Ovum Pick Up (OPU) können die Follikel auf den

Ovarien in situ punktiert werden. Dies kann entweder chirurgisch von der Flanke des Tieres

aus (PALMER et al. 1987) oder transvaginal ultraschallgeleitet (KANITZ et al. 1995) durch

Aspiration des Inhalts über eine lange Nadel vorgenommen werden. Aufgrund der geringeren

Invasivität ist die transvaginale Methode zu bevorzugen. Ein Vorteil des OPU ist außerdem,

dass nach regelmäßiger Follikelkontrolle des Spendertieres selektiv immature oder

präovulatorische Follikel gewonnen werden können.

Das erhaltene Follikelmaterial wird i.d.R. in isotonen Lösungen (z.B. PBS) sedimentiert und

die KOKs daraus isoliert. Zur weiteren Verarbeitung werden KOKs mit gleichmäßigen Kern-

und Zytoplasmastrukturen sowie intakten Kumuluszellschichten selektiert. Ebenso können die

gewonnenen KOKs nach kompakten und expandierten Kumulustypen selektiert werden. Bis

zum Einbringen in das Reifungsmedium verbleiben die KOKs in der zur Gewinnung

verwendeten Spülflüssigkeit (z.B. PBS) oder in dem für die Reifung vorgesehenen Medium

(DELL` AQUILA et al. 1995).


28

2.4.2. Oozytenreifung

Die Oozytenreifung beginnt mit dem Überwinden des Dictyotänstadiums der ersten

meiotischen Teilung und endet in vivo nach der Ovulation mit dem Erreichen des Kernstatus

der Metaphase II. Allerdings ist nicht nur die Kern- sondern auch die Zytoplasmareifung Teil

dieses Prozesses.

Im Dictyotänstadium liegen die Chromosomen noch ungeordnet mit einem Nukleolus im

Kernplasma vor. Nach LH-aktiviertem Start des Kernreifungsprozesses wird der Nukleolus

aufgelöst, die Chromosomen kondensieren, die Kernmembran wird abgebaut und ein

Spindelapparat entsteht (GRONDAHL et al. 1995). Nach der Chromatinkondensation werden

die Kernstadien der Metaphase I, Anaphase und Telophase, in der sich auch der erste

Polkörper abschnürt, durchlaufen, worauf die Metaphase II erfolgt.

Gleichzeitig wird im Zuge der Zytoplasmareifung der perivitelline Spaltraum erweitert, die

Mitochondrien und Lipidvesikel ordnen sich zentral an, der Golgiapparat wird reduziert und

kortikale Granula werden entlang des Oolemms angeordnet (GRONDAHL et al. 1995).

Des Weiteren zeigen die umgebenden Kumuluszellen eine zunehmende Expansion während

der Reifungsphase. Sie sind aufgrund ihrer nutritiven und protektiven Funktion essentiell für

eine erfolgreiche Maturation (BRACKETT u. ZUELKE 1993).

Die Reifung der aus Ovarien isolierten unreifen Oozyten bzw. KOKs unter Laborbedingungen

wird als In-Vitro-Maturation (IVM) bezeichnet. Die Reifungszeit der gewonnenen KOKs

ist tierartspezifisch unterschiedlich, ebenso wie die Anforderungen der KOKs an die

Zusammensetzung der Inkubationsmedien.

Für die IVM von Nutztieroozyten werden häufig industriell hergestellte Medien wie das

(TC)M 199, das Ham’s bzw. DMEM F-12 oder auch das SOFM mit Protein-, Hormon- und

Antibiotikazusätzen verwendet (Tab. 2.2.). Auch die Maturation equiner Oozyten in

Flüssigkeit aus präovulatorischen Follikeln war erfolgreich (HINRICHS et al. 2002; DOUET

et al. 2014a). Als Proteinzusätze in den Medien werden i.d.R. bovine Seren wie das fetale

Kälberserum (FCS) genutzt, für equine Oozyten finden auch homologe Seren Verwendung

(ALM et al. 2001). Diese Seren enthalten u.a. Hormone. Weitere Hormonzusätze sind zumeist

GnRH und Gonadotropin-Analoga, Östradiol 17ß, Wachstumshormon (GH) und

Wachstumsfaktoren wie EGF oder IGF-1 (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002). Auch der


29

Zusatz von Granulosa,- Theka- oder Eileiterepithelzellen zum Medium kann die Eizellreifung

und Kumulusexpansion unterstützen (ALM et al. 1994).

Die Kultivierung zur IVM wird stets in Oozytengruppen vorgenommen. In feuchter Luft mit

5% CO2 werden equine Oozyten bei 37.5–39°C für 24–36 Std. und bovine Eizellen für 20–24

Std. bei 39°C inkubiert. Für porzine Oozyten sind Angaben von 37–39°C für 36–48 Std. zu

finden (Tab. 2.2.). Für selektiv präovulatorisch gewonnene equine KOKs ist eine verkürzte

Inkubationsdauer von 12–18 Std. als ausreichend beschrieben (HINRICHS et al. 2000).

PALMER et al. (1991) gelang es, mit präovulatorischen KOKs nach 6–12 Std. IVM ein

lebendes Fohlen nach IVF hervorzubringen (Kap. 2.6.). Eseloozyten reifen im direkten

Vergleich zu Pferdeoozyten mit 34 Std. etwas langsamer, stellen aber die gleichen

Anforderungen an die IVM-Bedingungen (GOUDET et al. 2016). Allgemein benötigen

Oozyten mit kompaktem Kumulus eine längere Maturationszeit als Eizellen mit expandiertem

Kumulus, was sich für die Fertilisationsraten aber als unbedeutend erwies (HINRICHS et al.

1997). ALM et al. (2001) empfehlen für bereits expandierte equine KOKs eine

Maturationszeit von 18–24 Std. und für kompakte KOKs von 26–40 Std.. GONZÁLEZ-

FERNÁNDEZ et al. (2015) konnten für expandierte equine KOKs eine bessere

Maturationsrate verzeichnen, wenn diese in TCM 199 statt in MW maturiert wurden, während

sich für kompakte KOKs kein wesentlicher Unterschied ergab.

GOUDET et al. (1997) beschrieben die In-Vivo-Reifung von aus Spenderstuten gewonnenen,

immaturen Oozyten nach Injektion in einen präovulatorischen Follikel einer Empfängerstute.

Die reifen Oozyten wurden anschließend kurz vor der Ovulation durch OPU aspiriert.

Die Beurteilung der Oozytenreifung erfolgt anhand der Kern- und Zytoplasmareifung sowie

der Kumuluszellexpansion. Der Kernstatus denudierter Oozyten (Kap. 2.5.) wird an fixierten

Präparaten phasenkontrastmikroskopisch nach Färbung mit Orzein oder Lacmoid beurteilt

(CHOI et al. 1993; DELL´ AQUILA et al. 1996). Auch fluoreszenzmikroskopisch ist dies

nach Anfärbung mit HOECHST, einem DNA-spezifischen Farbstoff, möglich (HINRICHS et

al. 1993). Die Reifungsprozesse im Zytoplasma können elektronenmikroskopisch beurteilt

werden (NEUMANN et al. 1996). Das Ausmaß der Kumulusexpansion wird

stereomikroskopisch erfasst.

Die Reifungsraten sind je nach Tierart, Gewinnungsmethode und Inkubationsbedingungen

sehr unterschiedlich. Für equine Oozyten werden allgemein IVM-Raten von 60–80%


30

verzeichnet (MUGNIER et al. 2009a; AMBRUOSI et al. 2013; GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ

et al. 2015).

2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung

Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt wurde, sind nur kapazitierte Spermien in der

Lage, fest und dauerhaft an die Zona pellucida (ZP) von Eizellen zu binden.

Nachdem das akrosomintakte Spermium die ZP der Oozyte mit seiner Kopfspitze kontaktiert

hat, erfolgt eine Rezeptor-Protein-Bindung, welche die Akrosomreaktion und so die fokale

Lyse der ZP auslöst (YANAGIMACHI 1994) (Kap. 2.1.1.3.). Eine Bindung zwischen

Proteinen der freigelegten inneren Akrosommembran und Integrinen der ZP folgt zunächst

mit der Kopfspitze des Spermiums, darauf bindet das Spermium mittels einer sog.

ʹHaarnadelstrukturʹ fest mit dem äquatorialen Bereich. Dies ermöglicht in Verbindung mit

hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum

der Oozyte, seine Bindung an das Oolemm und schließlich die Fertilisation (FLESCH u.

GADELLA 2000).

Die Bestimmung der Rate von an der ZP von Oozyten gebundenen Spermien gibt Auskunft

über die Bindungsfähigkeit der Spermien. Da die Spermien-Zona pellucida Bindung essentiell

für die Fertilisation ist, geht man davon aus, dass die Bindungsfähigkeit von Spermien etwas

über ihre Fertilisationspotenz aussagt. FAZELI et al. (1995) beschrieben diesbezüglich eine

Korrelation von Bindungsraten equiner Spermien mit den Fertilitätsindices von Hengsten.

Außerdem lassen die Bindungsraten Rückschlüsse auf den Erfolg der Induktion der

Kapazitation und z.T. auch der Akrosomreaktion zu (CLULOW et al. 2010).

Die Koinkubation von Spermien mit Oozyten (meist in vitro maturiert) zur Bestimmung von

Bindungsraten wird auch als ʹBindungsassayʹ bezeichnet. Bindungsassays können mit

Gameten heterologer oder homologer Herkunft durchgeführt werden. Aufgrund der besseren

Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial und etablierten Maturationsverfahren werden häufig

porzine oder bovine Oozyten für heterologe Bindungsassays mit equinen Spermien genutzt.

Das Spermium erkennt die Oozyte an ihrer Oberflächenstruktur (Protein-Rezeptor

Interaktion). Die ZP weist jedoch speziesspezifische Unterschiede in der oberflächlichen

Glykoproteinzusammensetzung und in der elektronenmikroskopischen Struktur (z.B. Dicke,


31

Porendichte) auf, sodass die speziesspezifische Zusammensetzung und -struktur der ZP ein

bestimmender Faktor für die Spermienbindung ist (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al.

2014). MUGNIER et al. (2009b) fanden für equine Spermien schlechtere Bindungsraten an

porzine als an equine Oozyten, während porzine Spermien keinen Bindungsunterschied

zwischen den Oozyten zeigten. BALAO DA SILVA et al. (2013) führten einen

Bindungsassay mit equinen Spermien (sex sorted) und in vitro maturierten porzinen Oozyten

durch. Sie stellten fest, dass die Bindungsrate unabhängig von der Koinkubationszeit (1.5 vs.

3 Std.) der Gameten ist, aber sehr stark zwischen den Hengsten variierte.

MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) beschrieben höhere Bindungsraten für equine Spermien an

bovinen Oozyten, die in mit BSA oder Methyl-ß-Cyclodextrin supplemetierten Medien

inkubiert waren. Auch sie stellten starke hengstindividuelle Unterschiede heraus. MORAES et

al. (2015) verwendeten die Perivitellinmembran von Hühnereiern in einem Bindungsassay für

equine Spermien und bewerteten dieses Substrat als genauso effektiv wie bovine Oozyten.

Ein direkter Vergleich der Bindungsraten zweier Spermienproben an derselben Oozyte kann

erfolgen, indem diese halbiert und ein sog. 'Hemizona Assay' durchgeführt wird (FAZELI et

al. 1995).

Um die Anzahl der ZP-gebundenen Spermien und somit die Bindungsrate bestimmen zu

können, müssen die Eizellen von ihren Kumuluszellen befreit werden. Das sogenannte

Denudieren kann mechanisch durch wiederholtes Aufziehen in eine englumige Pipette, durch

Vortexen oder enzymatisch durch Inkubation der KOKs mit Hyaluronidase erfolgen (CHOI et

al. 1993; MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Nach Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen

können die gebundenen Spermien mikroskopisch gezählt werden (Tab. 2.2.). Dies kann mit

Quetschpräparaten oder nach dem Einbetten der Oozyten für die einzelnen mikroskopischen

Ebenen erfolgen. HOECHST 33342 ist der zu diesem Zweck gebräuchlichste

Fluoreszenzfarbstoff, da er das Kernchromatin der einzelnen Spermienköpfe deutlich und

spezifisch färbt.


32

2.6. Fertilisation

Der Begriff der Fertilisation beschreibt die Fusion einer männlichen und weiblichen

Keimzelle und ihrer Zellkerne.

In vivo findet die Fertilisation bei den Säugetieren im Eileiter statt. Nachdem das kapazitierte

Spermium an die Zona pellucida der Oozyte gebunden hat, penetriert es diese nach erfolgter

Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) und gelangt in den perivitellinen Spalt der reifen Oozyte.

Diese setzt nun ihre zweite Reifeteilung fort. Der Spermienkopf wird nach Bindung mit der

Äquatorialregion an das Oolemm und Fusion der Membranen in die Eizelle aufgenommen,

wobei sowohl die Flagelle als auch die Zellmembranen entfernt werden. Allein der Zellkern

dringt als haploider männlicher Vorkern zu dem Kern der Oozyte vor und verschmilzt mit

diesem (Karyogamie). So entsteht die diploide Zygote, welche nun in die Prophase der ersten

mitotischen Furchungsteilung eintritt.

Bereits während der Fusion der Plasmamembran des Spermiums und des Oolemms kommt es

durch Depolarisation der Eizelle und Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes zur

Entleerung am Oolemm befindlicher, kortikaler Granula in den perivitellinen Raum. Dieser

Vorgang löst den sogenannten ʹPolyspermieblockʹ bzw. das ʹZona hardeningʹ aus, sodass das

Eindringen weiterer Spermien in die Eizelle verhindert wird. Außerdem werden die

Rezeptorproteine für die Spermienbindung auf der Eizelloberfläche durch in den Granula

enthaltene Enzyme reduziert (YANAGIMACHI 1994).

In vitro wird die Fertilisation durch Koinkubation von Spermien mit Eizellen in

Fertilisationsmedien durchgeführt. Die in vivo ablaufenden Fertilisationsprozesse

verdeutlichen die Notwendigkeit der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen

(Kapazitation, Akrosomreaktion, Hyperaktivierung) und der Oozytenmaturation in vivo oder

in vitro als Voraussetzung für die IVF. Das Ziel der IVF ist es, aus Spermien und Oozyten

unter Laborbedingungen präimplantative und transfertaugliche Embryonen zu erzeugen

(KANITZ 2008).

Ist die Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen nicht erfolgreich bzw.

stehen nur befruchtungsunfähige Spermien zur Verfügung oder ist die ZP nach der in vitro

Aufbereitung durch vorzeitiges `Zona hardening` so verändert, dass die Spermien sie nicht

durchdringen können, kann dieses mithilfe der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion

(ICSI) umgangen werden. Der Vorteil der IVF gegenüber ICSI ist die natürliche Selektion


33

befruchtungsfähiger Spermien und Oozyten sowie der deutlich geringere technische

Aufwand.

Die Koinkubation der Gameten erfolgt in speziellen Fertilisationsmedien. Die

tierartspezifischen Inkubationsbedingungen entsprechen bezüglich der Temperatur und

Atmosphäre i.d.R. denen, wie sie für die Maturation angewendet werden (Kap. 2.4.2.). Häufig

werden Maturationsmedien mit Serumproteinen ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren und

Hormonen als IVF-Medien verwendet. Beispiele sind: TALP (Tyrode supplementiert mit

Albumin, Laktat und Pyruvat), SOFM, DMEM und TCM 199. Gelegentlich werden auch

Kapazitationsmedien (MW) zur Koinkubation der Gameten genutzt (Tab. 2.2.). GONZÁLEZ-

FERNÁNDEZ et al. (2015) machten allerdings deutlich, dass bei der Auswahl des

Fertilisationsmediums in erster Linie die Ansprüche der Eizellen an das Medium und weniger

die der Spermien zu berücksichtigen sind.

Equine Spermien werden in Konzentrationen von 1–5x106 Spermien mL

–1 für 18–24 Std. bei

38–39°C in angefeuchteter Luft mit 5% CO2 mit Eizellen koinkubiert (Tab. 2.2.).

Vergleichend werden für die IVF beim Rind Spermienkonzentrationen von 0.5–6x106

Spermien mL–1

im Fertilisationsmedium über denselben Zeitraum zur Koinkubation genutzt.

Auch eine Kombination aus In-Vivo- und In-Vitro-Verfahren ist möglich, indem z.B.

Oozyten gewonnen, in vitro maturiert und anschließend in die Eileiter oder in

präovulatorische Follikel besamter Empfängertiere eingesetzt werden (KASSENS et al.

2015). Ebenso können Zygoten direkt nach ICSI in die Eileiter transferiert werden, wo die

weitere Embryonenentwicklung stattfindet. Beide Methoden resultierten in einer

Trächtigkeitsrate von etwa 40% beim Pferd (CARNEVALE et al. 2004).

Der Fertilisationserfolg kann anhand einer Penetrations-, Fertilisations- oder

Embryonalentwicklungskontrolle beurteilt werden. Nach Orcein-, HOECHST-, Lacmoid-,

DAPI- oder Mito Tracker Green-Färbung kann der Spermienkopf nach der Penetration in der

Oozyte sowie die fortgesetzte Reifung des Eizellkerns detektiert werden. Nach erfolgter

Fertilisation können beide Vorkerne, Polkörper oder frühembryonale Teilung dargestellt

werden (ALM et al. 2001; MUGNIER et al. 2009a; TABENER et al. 2010; LEEMANS et al.

2015b).

Wie in Kapitel 2.1.1. erläutert, kann die Induktion der fertilisationsassoziierten

Spermienreaktionen auf sehr unterschiedliche Weise mit variierendem Ergebnis erfolgen.


34

Gleiches gilt für die Vorbereitung der Oozyten auf die Fertilisation (Kap. 2.4.), was in den

stark variierenden IVF-Raten der bisher veröffentlichten Studien von 0–72% zum Ausdruck

kommt (Tab. 2.2.).

BLUE et al. (1989) waren eine der ersten Arbeitsgruppen, die sich mit der IVF equiner

Gameten beschäftigten. Sie testeten verschiedene Kapazitationsbehandlungen equiner

Spermien mit denen sie Zona pellucida freie Hamster- und tiefgefrorene Pferdeoozyten

koinkubierten und erzielten eine Penetrationsrate von bis zu 46%. MC PARTLIN et al. (2009)

zeigten, dass die Koinkubation equiner Oozyten mit nicht kapazitierten Hengstspermien in

einer IVF-Rate von 0% resultierte. In dieser Studie waren in Kapazitationsmedium inkubierte

Spermien nur nach Procain-induzierter Hyperaktivierung in der Lage zu fertilisieren (61%)

(Kap. 2.1.1.2.). Nicht kapazitierte hyperaktivierte Spermien waren nicht befruchtungsfähig.

Mit einem vergleichbaren Protokoll wurden für die IVF mit Eselgameten lediglich zu 15%

zwei Vorkerne erreicht (GOUDET et al. 2016). LANGE-CONSIGLIO et al. (2011) konnten

nach Induktion der Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durch Inkubation equiner

Spermien in präovulatorischer Follikelflüssigkeit (FF) equine Oozyten fertilisieren. Dabei

schien Progesteron der ausschlaggebende Faktor in der FF zu sein.

Die Herkunft der Oozyten aus in vivo- oder Schlachthofmaterial hat ebenso wie das Ausmaß

der Kumulusexpansion keinen wesentlichen Einfluss auf den Fertilisationserfolg, sofern die

längere Maturationsdauer (26–40 Std.) für kompakte KOKs berücksichtigt wird (ALM et al.

2001).

HINRICHS et al. (2002) konnten mit Oozyten, die in reiner FF maturiert wurden, deutlich

bessere IVF-Raten erzielen als mit in Maturationsmedium gereiften Eizellen (12 vs. 3%). Die

embryonale Entwicklung nach Eileitertransfer zeigte allerdings gegenläufige Ergebnisse (22

vs. 63% Teilungsrate). Durch eine der IVF vorausgehende 30-minütige Inkubation der in vitro

maturierten Oozyten mit homo- und heterologen Eileiterepithelzellen (MUGNIER et al.

2009a) oder in Eileiterflüssigkeit (AMBRUOSI et al. 2013) konnten die Raten ebenfalls

verbessert werden. MUGNIER et al. (2009a) zeigten außerdem, dass sich die

Fertilisationsfähigkeit equiner Spermien bei Koinkubation mit KOKs oder denudierten

Oozyten nicht unterschied.

Trotz der z.T. recht vielversprechenden IVF-Raten beim Pferd ist zu beachten, dass in vitro

erzeugte frühembryonale Entwicklungsstadien das 8-Zellstadium selten überschreiten.


35

Die Entwicklung frühembryonaler Stadien aus IVF-Zygoten wird in wenigen Studien

berichtet (AMBRUOSI et al. 2013; LANGE-CONSIGLIO et al. 2014). Bisher sind lediglich

zwei Geburten in vitro erzeugter Fohlen (exkl. ICSI) erwähnt (PALMER et al.1991;

BÈZARD 1992).

2.7. In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler Stadien

Nach einer erfolgreichen IVF setzt die Furchungsteilung der Zygoten ein. In vitro

entstandene equine Embryonen können als Morula oder Blastozyste in den Uterus eines

Empfängertieres übertragen werden. Als Kulturmedien für frühembryonale Stadien werden

häufig TCM 199, DMEM F-12 und SOFM verwendet, welche mit Seren, Wachstumsfaktoren

(z.B. EGF, IGF-1) (Kap. 2.4.2.) und ggf. mit somatischen Zellen wie Eileiterepithel,

Granulosa- oder Kumuluszellen in Form von Monolayern oder konditionierten Medien

supplementiert sind.

Erste Teilungsschritte können nach etwa 30-stündiger Kultivierung unter denselben

Inkubationsbedingungen wie bei der In-Vitro-Maturation und -Fertilisation (38–39°C in

angefeuchteter Luft mit 5% CO2) unter dem Stereomikroskop oder fluoreszenzmikroskopisch

nach HOECHST-Färbung beobachtet werden (DOUET et al. 2015).

Besonders kritisch während der Teilungsphase ist die Entwicklung vom 8- zum 16-

Zellstadium (ʹIn-Vitro-Blockʹ), da eine Stoffwechselumstellung vom maternalen auf das

embryonale Genom erfolgt (TELFORD et al. 1990). Wie im Kapitel 2.6. erwähnt, entwickeln

sich aus IVF generierte Zygoten kaum über das 8-Zellstadium hinaus. GOUDET et al. (2015)

sahen den Entwicklungsstop nach Erreichen des 2- bis 4-Zellstadiums in einer schlechten

Qualität der in vitro produzierten Embryonen begründet. Nach 24-stündiger Kultivierung

konnten DOUET et al. (2014b) bessere Zygoten-Entwicklungsergebnisse erzielen, wenn als

Kultivierungsmedium DMEM F-12 anstelle von SOFM genutzt wurde (33–100% vs. 6–42%).

Durch IVF erzeugte Eselzygoten entwickelten sich in DMEM F-12 nicht weiter (GOUDET et

al. 2016).

Bei der Beurteilung frühembryonaler Entwicklungsstadien ist das mögliche Auftreten der

Oozytenaktivierung bzw. Parthenogenese von Eizellen zu beachten. Diese Eizellen

entwickeln sich ohne Befruchtung über die Metaphase II hinaus (OWEN 1849), stellen ihre


36

Zellteilung aber im weiteren Verlauf ein. Laut LAZZARI et al. (2002) kommen

parthenogenetisch entstandene Blastozysten in Raten von 4–16% vor. Als Ursache kommen

eine spontane, zelleigene oder durch exogene Stimuli (chemisch, physikalisch) bedingte

Entwicklungsaktivierung infrage. ALONSO et al. (2014) konnten 22% in vitro maturierter

equiner Oozyten mit Spermienextrakten parthenogenetisch aktivieren.

Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden Spermien.

Teil 1:

Palmer

et al.

1991

Alm et

al. 2001

Hinrichs

et al.

2002

Mugnier

et al.

2009a

Mc

Partlin

et al.

2009

Tabener

et al. 2010

Balao

da Silva

et al.

2013

Ambruosi

et al. 2013

Douet et

al. 2014a

Session-

Bresna-

han et al.

2014

Lange-

Consiglio

et al. 2014

Macías-

García

et al.

2015

Leemans et

al. 2015b

Sper-

mien

equin,

frisch,

1x106

Sp. mL-1

equin,

frisch

oder TG,

1x106 Sp.

mL-1

equin,

frisch,

1x106 Sp.

mL-1

equin,

frisch,

2.5x106

Sp. mL-1

equin,

frisch,

1x106

Sp. mL-1

Esel, frisch

oder TG,

1x106

Sp. mL-1

equin,

frisch,

sex

sorted

equin,

frisch,

1x 106

Sp mL-1

equin,

frisch,

1x106

Sp. mL-1

equin,

frisch

oder TG

equin,

frisch,

1x106

Sp. mL-1

equin,

frisch,

1x106

Sp.

mL-1

equin,

frisch,

1x106

Sp. mL-1

Sper-

mien-

be-

hand-

lung

HHBSA

+ CaIP

(6µM)

Heparin,

CaIP

(7.14

µM)

CaIP

(3 - 7.14

µM)

CaIP

(6 µM)

6Std. in

MW,

dann

5mM

Procain

Iono-

mycin (0.1

µM),

sel. nach

Viabilität

CaIP

(5µM)

6 Std. in

MW, dann

5mM

Procain

5 Std. in

MW,

dann

5mM

Procain

Percoll

sel.,

PC12

6 Std. in

MW, dann

FF/ Pro-

gesteron/

Leptin

4 Std. in

MW ±

MßCD

(0.1-

1mM)

Percoll sel.,

6 Std. in

mod. MW ±

Procain (2.5

mM)

Oozy-

ten-

gewin-

nung

equin

OPU

equin

OPU,

isolierte

Ovarien

equin

isolierte

Ovarien

equin

OPU,

isolierte

Ovarien

equin

isolierte

Ovarien

bovin

isolierte

Ovarien

ohne ZP

porzin

isolierte

Ovarien

equin vs.

porzin

isolierte

Ovarien

equin

OPU,

isolierte

Ovarien

eq.: OPU

bov.:

isolierte

Ovarien

equin

isolierte

Ovarien

bovin

isolierte

Ovarien

equin

isolierte

Ovarien

IVM

Me-

dium

Medium

*

+ 15%

FCS o.

M199 +

HEPES

+ BSA

mod.

TCM 199

+ 20%

Pferde-

serum

+ 2-5

x106 GZ

mod.

M 199 +

FCS +

FSH

± EGF o.

± 20 -

100%

FF

mod.

TCM 199

+ 20%

FCS +

EGF

± eq. o.

porz. EEZ

TCM

199 +

10%

FCS +

FSH

mod.

TCM 199

+ 10%

FCS

+ EGF

NCSU

+Insulin,

Cystein,

EGF,

10% FF

porz.:

TCM199 +

EGF, FSH,

Cysteamin

eq.:

TCM199 +

EGF, 20%

FCS

TCM

199 +

20%

FCS

+ EGF

oder FF

bov.: Me-

dium**

eq.: mod.

TCM 199

+ 10%

FCS,

Pyruvat

TCM199

±

20% FCS,

FSH, LH

mod.

TCM

199

+ 10%

FCS,

FSH,

LH

DMEM-

F12

Legende für Tab. 2.2., Teil 1: Sp. = Spermien; TG = Tiefgefriersamen; HHBSA = Hank´s salts-HEPES-BSA-Medium; PC-12 = Dilauroylphosphatidylcholin-

Liposomen; MßCD = Methyl-ß-Cyclodextrin; sel. = selektiert; mod. = modifiziert; eq. = equin; bov. = bovin; porz. = porzin; * = IVM-Medium nach Ménézo

(1976); **= IVM-Medium n. De La Torre-Sanchez et al. (2006); GZ = Granulosazellen; EF = Eileiterflüssigkeit; FF = Follikelflüssigkeit;

EEZ= Eileiterepithelzellen; NCSU = North Carolina State University Medium; Übrige: s. Abkürzungsverzeichnis

Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden Spermien.

Teil 2:

Palmer et

al. 1991

Alm et

al. 2001

Hinrichs

et al.

2002

Mugnier

et al.

2009a

Mc

Partlin

et al.

2009

Tabener

et al.

2010

Balao da

Silva et

al. 2013

Ambruosi

et al. 2013

Douet et

al. 2014a

Session-

Bresna-

han et al.

2014

Lange-

Consiglio

et al. 2014

Macías-

García

et al.

2015

Leemans et

al. 2015b

IVM

Ver-

fahren

In-Vivo-

Matura-

tion

18 – 40

Std.,

38.5°C,

5%

CO2,

f. Luft

24 – 42

Std..

38.2°C,

5% CO2,

f. Luft

26 – 30

Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

24 Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

24Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

44 Std.,

39°C,

5% CO2,

7% O2,

f. Luft

5% CO2,

f. Luft

porz.: 44

Std., 39°C

eq.: 26-30

Std., 38.5°C

+ 30min in

porz. EF

27 Std.,

38.5°C,

5%CO2

dann

30min in

porc. EF

±

DMBT1

bov.: 20-

24 Std.,

39°C,

5% CO2

eq.: 20

Std., 38.5

°C, 6%

CO2, Luft

29 Std.,

38.5°C,

5% CO2

24 Std.,

39°C,

5%

CO2,

f. Luft

28 Std.,

38.2°C, 5%

CO2,

f. Luft

IVF

Me-

dium

Medium*

+ 15%

FCS

TALP Fert-

TALP

TCM 199 MW mod.

Tyrode

mod.

Tyrode

porz.: Me-

dium***

eq.: MW

MW +

Procain

CDM MW MW MW +

Procain

IVF

Ver-

fahren

18 Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

24 Std.,

38.5°C,

5%

CO2,

f. Luft

24 Std.,

38.2°C,

5% CO2,

f. Luft

24 Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

18 Std.,

38.2°C,

5% CO2,

f. Luft

18-20

Std.,

38.5°C,

5% CO2,

f. Luft

1.5 – 3

Std.,

38°C,

5% CO2,

f. Luft

porz: 39°C

eq.: 38.5°C,

5% CO2,

24 Std.,

f. Luft

18-24

Std.,

38.5°C,

5% CO2

18 Std.,

38.5°C,

5% CO2

18 Std.,

38.5°C,

5% CO2

2 Std.,

39°C,

5%

CO2,

f. Luft

18 Std.,

38.2°C,

5% CO2,

f. Luft

IVF

Ana-

lyse

Penetr.

PK und

PN

(Orcein)

Penetr.

(Orcein)

PK,

Mitose

Chromatin

-integrität

(Hoe.)

Penetr.,

PK und

PN

(Hoe.)

Penetr.,

PN,

Teilung

(Hoe.)

Penetr.

(DAPI),

PN

Bin-

dungs-

assay

(Hoe.)

PN

(Hoe.)

PN,

Teilung

(Hoe.)

PN

(DAPI)

PN + Teil.

Penetr.

(Orcein),

(Hoe.)

Bin-

dungs-

assay

(Hoe.)

Penetr. (MT

Green), PN,

Teilung

(Hoe., Lac.)

IVM /

IVF

Ergeb-

nisse

(Pferd)

IVF: 27%

(1Träch-

tigkeit),

Embryo-

entwickl.

in vivo

IVF:

34%

IVF: 16%

nach In-

Vivo-

Fertil.:

77%

IVF:

15%

IVF:

84%;

Teilung

8-16

Zeller:

66%

IVF:

90%

IVF:

55%

Bindung

porc.:

IVM: 74%,

IVF: 70%

eq.:

IVM: 61%,

IVF: 62%

IVM:

TCM

199:

73-76%

FF:

67-91%

IVF:72%

IVF:

bov.:

26%

eq.: 0%

IVM: 45%

IVF:

51%

Penetr.

19%

Teilung

k.A. 0% IVF,

Teilung nur

durch

Zytokinese

(ca. 60%)

Legende für Tab. 2.2., Teil 2:

f. = feuchte; Penetr. = Penetration; PK = Polarkörper-Formation; PN = Pronukleus-Formation; mod. = modifiziert; eq. = equin; bov. = bovin;

porz. = porzin; * = IVM-Medium nach Ménézo (1976); ***= Medium nach Marchal et al. 2003; EF = Eileiterflüssigkeit; DMBT1 = Deleted in

malignant brain tumors 1 Protein; k.A. = keine Angabe; CDM = chem. definiertes Medium; Hoe. = HOECHST; Lac. = Lacmoid; MT-Green =

Mito-Tracker Green; Übrige: s. Abkürzungsverzeichnis

MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________

40

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1. Experiment I:

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro

3.1.1. Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien, ausgenommen die folgend gelisteten, wurden von der Firma Carl

Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Natriumpyruvat stammte von der Firma Merck

(Darmstadt, Deutschland), Natriumlaktat, Kalzium-Ionophor A23187, DMSO und der

Fluoreszenzfarbstoff Propidium Iodid von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), FITC-

PNA von Vector Laboratories (Burlingame, California, USA), Fluo-3/AM von Enzo Life

Sciences (NY, USA), bovines Serum Albumin von Serva (Heidelberg, Deutschland) und

Procain von Fluka (Buchs, Schweiz).

3.1.2. Samengewinnung und –aufbereitung

Zur Samengewinnung wurden Hengste der Rasse Hannoveraner Warmblut vom

Niedersächsischen Landgestüt Celle eingesetzt, welche eine gute Fruchtbarkeit aufwiesen und

aktiv im Zuchteinsatz standen.

Unter Verwendung einer künstlichen Vagina wurden die Ejakulate der Hengste auf einem

Phantom gewonnen (beide Modell ‘Hannover’; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland).

Unmittelbar darauf wurden der Gelanteil sowie grobe Schmutzpartikel des nativen Ejakulates

mit einem sterilen Zellstofffilter (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) entfernt. Die Ejakulate

wurden zunächst makroskopisch auf Volumen, Farbe, Konsistenz, Geruch und

unphysiologische Beimengungen untersucht. Zur weiteren Aufbereitung wurden nur

physiologisch erscheinende Ejakulate verwendet. Diese wurden pasenkontrastmikroskopisch

auf die Motilität und morphologische Abweichungen der Spermatozoen sowie auf

Fremdzellen untersucht. Die Spermienkonzentration des Nativspermas wurde photometrisch

bestimmt (SpermCue®; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland). Ejakulate von physiologischer

Beschaffenheit wurden weiterverwendet.


41

Das Sperma wurde auf 100×106 Spermien mL

−1 mit Nicht-Kapazitations Medium (NK: 100

mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 22 mM HEPES, 5 mM Glukose, 1 mM

Brenztraubensäure, 2.4 mM Natriumlaktat; pH 7.6; Osmolarität 300 mOsm kg−1

) verdünnt

und die Spermienkonzentration erneut photometrisch validiert. Die Spermiensuspension

wurde nach 30‒60 min weiter verarbeitet.

Mittels Zentrifugation (15 mL Röhrchen mit rundem Boden; bei 100×g für 1 min) wurden

weiterer Debris und tote Spermatozoen in der Spermiensuspension separiert und der

verbleibende Überstand in ein sauberes Probenröhrchen überführt. Die

Spermienkonzentration im Überstand wurde unter Verwendung eines Haemozytometers

(Thoma; Hecht-Assistant, Sandheim an der Rhön, Deutschland) bestimmt und die Probe

weiter auf 10×106 Spermien mL

−1 mit NK verdünnt.

3.1.3. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch

Inkubation in speziellen Medien

Mit dem Ziel die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner

Spermien in vitro auszulösen, wurden zunächst zwei Aliquots einer aufbereiteten

Spermaprobe in Nicht-Kapazitationsmedium (NK; 10×106 Spermien mL

−1) zentrifugiert (15

mL-konische Röhrchen, bei 600×g für 5 min), der anfallende Überstand wurde vorsichtig

entfernt und das verbleibende Spermienpellet in NK (Kontrollmedium) oder

Kapazitationsmedium [modifiziertes Whittens-Medium (MW): 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl,

1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 22 mM HEPES, 24.9 mM NaHCO3, 5 mM Glukose, 1 mM

Brenztraubensäure, 2.4 mM Natriumlaktat, 7 mg mL-1

BSA; pH 7.6; Osmolarität 300 mOsm

kg−1

] mit einer Endkonzentration von ~10×106 Spermien mL

−1 resuspendiert. Die

Spermiensuspensionen wurden daraufhin auf 500 µL Aliquots aufgeteilt, um eine

Inkubationszeitreihe - von bis zu vier Std. bei 37°C in angefeuchteter Luft - zur Evaluierung

von Motilitätsparametern (CASA) und eine durchflusszytometrische Analyse der

intrazellulären Kalziumkonzentration (Fluo-3) sowie Plasma- und Akrosommembranintegrität

der Spermien (s. Kap. 3.1.6–3.1.8.) durchzuführen (Abb. 3.1.).

Zusätzlich wurde über die Inkubationszeit der pH-Wert der Spermiensuspensionen mittels

pH-Streifen (Neutralit®, Merck, Darmstadt, Deutschland) bestimmt.

Abbildung 3.1.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung fertilisationsassoziierter

Reaktionen bei equinen Spermien im Verlauf der 240-minütigen Inkubation in Kontrollmedium (NK) oder Kapazitationsmedium

(MW). Messzeitpunkte: 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 min.

pH-Wert


43


Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain

Nach Festlegung des geeigneten Inkubations- und Kontrollmediums sowie der

adäquaten Inkubationszeit wurden die Effekte von Kalzium-Ionophor A23187 (CaIP) und

Procain auf die Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in MW

getestet. Die Stammlösung von CaIP wurde mit einer Konzentration von 2.5 mM in DMSO

erstellt, die von Procain als eine 2.5 M Stammlösung in destilliertem Wasser.

Die Spermien wurden aufbereitet wie im vorangegangenen Kapitel beschrieben (10×106

Spermien mL−1

in MW) und die Proben bei 37°C in angefeuchteter Luft für 60 min

vorinkubiert. Daraufhin wurden die Proben aliquotiert (492−500 µL) und die Stammlösungen

der Reagenzien mit einer Endkonzentration im Aliquot von 0−10 µM CaIP und 0−10 mM

Procain zugesetzt. Die erhaltenen Proben wurden für weitere 30 min bei 37°C inkubiert und

anschließend die Parameter der Spermienmotilität (CASA) und –kapazitation (Fluo-3) sowie

die Integrität der Plasmamembran (PI) analysiert (Abb. 3.2.).

Abbildung 3.2.:

Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung

fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach Zusatz von

Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain in unterschiedlichen Konzentrationen (CaIP: 0,

0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 3, 5, 10 µM; Procain: 0, 1, 2.5, 5, 8, 10 mM).

Präinkubation

60 min bei

37°C in

feuchter Luft


44

3.1.5. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im

Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen

Spermien

Zusätzlich zur Charakterisierung der Effekte des Zusatzes steigender Konzentrationen

von CaIP und Procain (im Folgenden auch als Reagenzien bezeichnet) nach 60-minütiger

Präinkubation in MW wurden die fertilisationsassoziierten Reaktionen nach Reduktion des

Reagenziengehaltes im Medium evaluiert. Dazu wurden die Spermaproben wie unter 3.1.3.

beschrieben aufbereitet. Die Präinkubation erfolgte allerdings mit einer

Spermienkonzentration von 25×106 mL

−1, um zentrifugationsbedingte Spermienverluste

auszugleichen und so die Anforderungen der Messgeräte an die Zellkonzentrationen in den

Proben nicht zu unterschreiten. Nach 60 min Inkubation bei 37°C wurden drei

unterschiedliche Proben erstellt: 25×106 Spermien mL

−1 in MW (1) ohne den Zusatz der

Reagenzien, (2) mit Zusatz von 2.5 µM CaIP oder (3) 2.5 mM Procain. Diese wurden 10 min

bei 37°C inkubiert und in Aliquots aufgeteilt, wobei die Hälfte der Proben dem

Zentrifugationsverfahren unterzogen wurde (600×g für 5 min). Unmittelbar nach der

Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das entstandene Spermienpellet mit frischem

MW resuspendiert. Daraufhin wurden die unterschiedlichen Ansätze in 500 µL Aliquots

geteilt und bis zur Analyse der Spermienparameter bei 37°C inkubiert. Die

Parametermessungen erfolgten 15, 45 und 90 min nach der Zentrifugation. Diese

Postinkubationsphase (15−90 min) sollte der ‘Erholung’ der Spermien mit Anpassung des

Zellstoffwechsels und der Spermienmotilität sowie der Homogenisierung des Mediums

dienen. Die Motilität, die Plasma- und Akrosommembranintegrität und der intrazelluläre

Kalziumgehalt der Spermien wurden mittels CASA und fluoreszenzmikroskopisch ermittelt

(Abb. 3.3.).

45

Abbildung 3.3.:

Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung

fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach Zusatz von

Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain und nachfolgender Anwendung eines

Zentrifugationsverfahrens zur Verringerung des Reagenziengehaltes im Medium.

T1 + 2 = 2.5 µM CaIP

T4 + 5 = 2.5 mM Procain

T3 = kein Inducer

A = Zentrifugation 5 min bei 600xg, Resuspension in MW

B = ohne Zentrifugation

a = CASA, b = PI / Fluo-3, c = FITC-PNA; jeweils 15, 45 und 90 min Nachinkubationszeit

500 µL

Aliquot

s

Zugabe v. CaIP

o. Procain;

Inkub. 10 min

bei 37°C in

feuchter Luft

25x106 Sp. mL

-1

in MW, Präinkubation

60 min bei 37°C

in feuchter Luft

T1 A

T1

T2 B

T2

T3 B

T3

T5 A

T5

T4 B

T4

a

a

a

a

a

b

b

b

b

b

c

c

c

c

c

15, 45, 90 min


46

3.1.6. Computerassistierte Spermienanalyse

Das System der Computerassistierten Spermienanalyse (CASA, SpermVision®;

Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) wurde für die Analyse des Bewegungsmusters der equinen

Spermien angewendet. Das verwendete Gerät verfügt über ein Phasenkontrastmikroskop mit

einem beheizbaren und motorisch automatisierten Objekttisch, eine beheizbare Arbeitsplatte

(HT 300®; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) sowie über eine Kamera. Die

Geräteeinstellungen wurden gemäß den Herstellerinformationen angewendet. Für die

Messungen wurden jeweils 3 µL der unterschiedlich aufbereiteten Spermaproben aus den

inkubierten 500 µL Aliquots entnommen und in eine Kammer eines 20 m Vierkammer-

Objektträgers (Leja Products BV, Nieuw Vennep, Niederlande) überführt. Die Analyse der

Bewegungsmuster wurde bei 37°C Probentemperatur durchgeführt. Für jede Probe errechnete

das Computerprogramm des Systems die Motilitätsparameter als Durchschnittswert von acht

Sichtfeldern. Zur genauen Beurteilung wurden folgende Parameter näher betrachtet: die

Gesamtmotilität (MOT, %), progressiv motile Spermien (PMS, %: mittlere Geschwindigkeit

auf einer geraden Bahn > 40 µm s−1

und Geradlinigkeit oder Geschwindigkeit auf einer

geraden Bahn vs. mittlere Geschwindigkeit > 0.5), Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie

(VCL in µm s−1

) und die Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (ALH in µm). Spermien

wurden als hyperaktiviert gewertet, sofern ein Anstieg der Werte für VCL und ALH

gegenüber den Basiswerten der Probe zu verzeichnen war.

3.1.7. Durchflusszytometrische Analyse der Plasma- und Akrosommembran

Der prozentuale Anteil der Spermien mit intakter Plasma- und Akrosommembran

wurde durchflusszytometrisch mittels Doppelfärbemethode unter Verwendung der

Fluoreszenzfarbstoffe Propidium Iodid (PI) und Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertes

Peanut Agglutinin (FITC-PNA) bestimmt. Einer 500 μL Spermaprobe (10−25×106 Spermien

mL−1

in NK oder MW, mit oder ohne Reagenzien) wurden jeweils 3 µM PI und 0.45 mM

FITC-PNA zugesetzt. Die gefärbten Proben wurden für 10 min bei 37°C inkubiert, bevor sie

mit einem Cell Lab Quanta SC MPL Durchflusszytometer (Beckman-Coulter®, Fullerton,

California, USA) analysiert wurden. Dieses Durchflusszytometer war ausgestattet mit einem

488 nm Argon-Ionenlaser von 22 mW zur Anregung, einem 525/30 nm Bandpassfilter zur


47

Detektion von Grünfluoreszenz und einem 670 nm Longpassfilter zur Detektion von

Rotfluoreszenz. Als Durchflussmedium wurde gefiltertes PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,

10 mM Na2HPO4, 1.8 KH2PO4, pH 7.4) verwendet, dessen Fließgeschwindigkeit auf ca. 30

µL min−1

eingestellt war, was in einer Zählrate von 200−500 counts s−1

resultierte. Je Probe

wurden mindestens 5000 Spermien analysiert, deren Selektion aus der Gesamtpartikelmasse

basierend auf den Eigenschaften ihrer Seitwärtsstreuung und ihres elektronischen Volumens

erfolgte.

Rot fluoreszierende Spermien wurden als plasmamembrangeschädigt gewertet (PI-positiv),

grün fluoreszierende dagegen als akrosomgeschädigt bzw. als Spermien mit erfolgter

Akrosomreaktion (FITC-PNA-positiv), da dieser Farbstoff nur an die innere

Akrosommembran binden kann. Folglich wurden Spermien als plasma- und

akrosommembranintakt angesehen, die weder grün noch rot fluoreszierten (PI- und FITC-

PNA-negativ).

3.1.8. Durchflusszytometrische Analyse der Spermienkapazitation

Um die Ausprägung der Kapazitation der behandelten Spermien bewerten zu können,

wurde deren intrazellulärer Kalziumgehalt mit Hilfe einer Doppelfärbemethode bestimmt. Ein

497 µL Aliquot der Spermaprobe (10–25×106 Spermien mL

−1 in NK oder MW, mit oder ohne

Reagenzien) wurde mit 0.88 µM Fluo-3/AM (Fluo-3) - gelöst in DMSO- und 3 µM PI

supplementiert und für 10 min bei 37°C inkubiert. Die DMSO-Endkonzentration betrug in der

Probe 0.2% (v/v). Die Proben wurden wie zuvor beschrieben durchflusszytometrisch

analysiert. Die mittlere Grünfluoreszenzintensität PI-negativer Spermien wurde als Maß für

den intrazellulären Kalziumgehalt plasmamembranintakter Spermien bestimmt. Ein Anstieg

der Fluoreszenzintensität wurde als Indikator für eine Erhöhung des intrazellulären

Kalziumgehaltes der Spermien im Zuge der Kapazitationsvorgänge interpretiert.


48

3.2. Experiment II:

Untersuchung der Bindungsfähigkeit equiner Spermien an die Zona pellucida in vitro

maturierter porziner Oozyten

3.2.1. Chemikalien und Reagenzien

Die Hersteller der Chemikalien und Reagenzien des verwendeten

Maturationsmediums sind der Tabelle 3.1. zu entnehmen. Der Fluoreszenzfarbstoff

HOECHST 33342 wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), Silikonöl von

(Serva, Heidelberg, Deutschland) und Dulbeccos PBS von (AppliChem, Darmstadt,

Deutschland) bezogen.

3.2.2. Oozytengewinnung und –aufbereitung zur In-Vitro-Maturation

Für den heterologen Bindungsversuch wurden in vitro maturierte Schweineeizellen

verwendet. Die Aufbereitung der Oozyten erfolgte wie von TIEDEMANN (2015)

beschrieben. Um die Oozyten zu erhalten, wurden am Schlachthof physiologisch

erscheinende Ovarien, die kein Corpus luteum aufwiesen, vom Genitaltrakt frisch

geschlachteter Sauen isoliert, in vorgewärmten, temperaturisolierten Transportgefäßen

gesammelt und innerhalb von zwei Stunden in das Labor verbracht. Nach dem Transport

wiesen die Ovarien eine Temperatur von 27–30°C auf. Vor der weiteren Verarbeitung wurden

die Ovarien in isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Daraufhin wurden die Kumulus-Oozyten-

Komplexe (KOKs) aus 3–5 mm großen Follikeln isoliert. Zu diesem Zweck wurde ein

Aspirationssystem verwendet, bestehend aus einer mit einer Aspirationsvorrichtung

verbundenen 18G Nadel und einer Vakuumpumpe. Die aspirierten KOKs und die

Follikelflüssigkeit wurden in 50 mL-Röhrchen gesammelt, welche mit 37°C warmem

Handling-Medium (Dulbeccos PBS supplementiert mit 1% Neugeborenen-Kälberserum)

aufgefüllt wurden, sobald je etwa 20 mL Follikelinhalt gewonnen waren. Nach 15 min

aufrechter Lagerung setzte sich das zelluläre Material am Boden der Röhrchen ab und der

entstandene Überstand wurde abpipettiert. Das die KOKs enthaltende Sediment wurde durch

ein- bis zweimaliges Resuspendieren mit Handling-Medium, Sedimentieren und Entfernen

des Überstandes gewaschen (Medium : KOKs = 1 : 9 – 1 : 19), um den Anteil der Follikel-


49

flüssigkeit zu reduzieren. Die KOKs wurden in einer Petrischale unter dem Stereomikroskop

(SMZ-2T®, Nikon, Düsseldorf, Deutschland) selektiert. Nur KOKs mit mindestens drei

vollständigen Kumuluszellschichten und gleichmäßigem Zytoplasma wurden zur Maturation

ausgewählt (Abb. 3.4., A). Mit einer ausgezogenen Glaspipette wurden geeignete KOKs in

Gruppen zu je 50 aufgeteilt und 2× 1 min in Maturationsmedium (Tab. 3.1.) gewaschen.


50

3.2.3. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten

Zur Maturation wurden je 50 selektierte KOKs in ein Well eines 4-Well

Kulturschälchens (Nunc A/S, Kamstrupvej, Dänemark) mit 500 µL Maturationsmedium (Tab.

3.1.) verbracht. Das Maturationsmedium war zuvor mindestens zwei Stunden lang bei 38.5°C

und 5% CO2 äquilibriert worden. Die In-Vitro-Maturation erfolgte unter diesen

Inkubationsbedingungen über 46 Stunden.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Expansion des Kumulus oophorus der KOKs

unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung bewertet (Abb. 3.4., B). Zur

Einschätzung des Maturationserfolges wurden im Zuge der Auswertung des Bindungsassays

der Kernstatus und die Polkörperausbildung nach HOECHST-Färbung unter dem

Fluoreszenzmikroskop beurteilt (Kap. 3.2.4.4.).

Tabelle 3.1.: Zusammensetzung des Maturationsmediums nach TIEDEMANN (2015);

Mengenangaben für 1 ml Medium.

Substanz Menge Hersteller

DMEM-Medium 315 µL Life Technologies

(Darmstadt,

Deutschland) Ham´s F-12 Medium 315 µL

FCS 70 µL

L-Glutamin 0.26 mg

Sigma

(Seelze, Deutschland)

BSA 0.625 mg

Penicillin 0.04 mg

Streptomycin 0.03 mg

Wachstumsfaktoren:

EGF 50 ng

IGF-1 100 ng

FGF 5 ng

Hormone:

eCG 10 IU Intervet

(Haar, Deutschland) hCG 10 IU


51

3.2.4. Heterologer Bindungsassay

3.2.4.1. Aufbereitung in vitro maturierter porziner Oozyten für die Koinkubation mit

equinen Spermien

Nach erfolgter Maturation wurden die KOKs mit mindestens zweifach expandiertem

Kumulus zunächst durch intensives Auf- und Abpipettieren unter dem Stereomikroskop

denudiert (Abb. 3.4., C) und anschließend zweimalig in Handling-Medium gewaschen. Die

Aufbereitung der Oozyten erfolgte bei etwa 38°C. Die denudierten Oozyten wurden in 20er-

Gruppen in jeweils einen Koinkubationstropfen (Kap. 3.2.4.3.) verbracht.

C A B

Abbildung 3.4.:

Stereomikroskopische Bilder porziner Oozyten.

A: Oozyte mit gleichmäßigem Zytoplasma und mehrschichtigem Kumulus oophorus

nach Isolation aus dem Follikel. (Maßbalken = 100µm)

B: Oozyte mit stark expandiertem Kumulus oophorus nach 46 Std. In-Vitro-Maturation.

(Maßbalken = 200µm)

C: Denudierte Oozyte. (Maßbalken = 200µm)


52

3.2.4.2. Aufbereitung equiner Spermien für die Koinkubation mit in vitro maturierten

porzinen Oozyten

Die Samengewinnung und -aufbereitung erfolgte im Wesentlichen wie für das

Experiment I im Kapitel 3.1.2. beschrieben. Die Proben wurden jedoch nach der

Zentrifugation (100×g für 1 min) mit NK oder INRA82-Magermilchverdünner (VIDAMENT

et al. 2000) auf 100×106 Spermien mL

−1 verdünnt. Nach der Aufbereitung wurden zwei mit

NK und eine mit INRA82 verdünnte Probe zu je 25 mL in verschlossenen Probenröhrchen

mit einem Fassungsvermögen von 50 mL in einer Styroporbox innerhalb von 60 min in das

Labor des Instituts für Nutztiergenetik vom Friedrich-Loeffler-Institut in Mariensee

transportiert, wo die Oozytenaufbereitung und der heterologe Bindungsassay durchgeführt

wurden. Die Spermiensuspensionen wurden für 5 min bei 600×g zentrifugiert, der anfallende

Überstand vorsichtig entfernt und das verbleibende Spermienpellet in INRA82-Magermilch-

verdünner, NK (Nicht-Kapazitations-/Kontrollmedium) oder MW (Kapazitationsmedium)

resuspendiert. Die Proben wurden auf die gewünschte Endkonzentration (1‒100×106

Spermien mL−1

) verdünnt, 1 mL Aliquots wurden auf 1.5 mL Eppendorfgefäße verteilt und

bei 37°C in angefeuchteter Luft inkubiert. Zur Induktion fertilisationsassoziierter

Spermienreaktionen wurden fünf Aliquots mit in MW inkubierten Hengstspermien erstellt.

Eines der mit (1) MW sowie das mit (2) NK und das mit (3) INRA82 resuspendierte Aliquot

wurden für 120 min ohne weitere Behandlung inkubiert. Zwei weitere in MW präinkubierte

Aliquots wurden nach 110 min mit (4) 2.5 µm CaIP bzw. (5) 2.5 mM Procain supplementiert

und weitere 10 min inkubiert. Die beiden übrigen Aliquots in MW wurden bereits nach 85

min mit (6) 2.5 µm CaIP bzw. (7) 2.5 mM Procain supplementiert, wobei nach 10 min eine

Zentrifugation der Proben (5 min bei 600×g) erfolgte und die entstandenen Spermienpellets

mit frischem MW resuspendiert wurden, um die Konzentration der induzierenden Reagenzien

in der Spermiensuspension zu reduzieren (Kap. 3.1.5.). Die zentrifugierten Proben wurden

zunächst für 15 min nachinkubiert. Insgesamt wurden so sieben unterschiedliche

Spermienaufbereitungen (1–7) erstellt (Abb. 3.7.). Eine mikroskopische Motilitätskontrolle

(optische Schätzung der Gesamt- und Progressivmotilität) wurde jeweils nach der

Samengewinnung, dem Transport und der Inkubationszeit vorgenommen. Nur

Spermiensuspensionen mit >50% Gesamtmotilität wurden für die Koinkubation mit den

porzinen Oozyten verwendet.


53

Die 120 minütige Inkubation der Spermiensuspensionen erfolgte zunächst in geschlossenen

Aliquots mit wenig Luftüberstand im Wasserbad (37°C). Dabei fiel auf, dass die

Suspensionen nach der Inkubationszeit inhomogen erschienen und sich zelluläres Material am

Boden der Probe absetzte.

Um einen möglichen Zusammenhang mit der geschlossenen Inkubationsform zu evaluieren,

wurde diese gegen eine offene Inkubation getestet. Außerdem wurde der Einfluss der

Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Spermien mL

−1) in der Suspension auf die

Spermienmotilität (CASA), den pH-Wert im Medium (pH-Streifen Neutralit®, Merck,

Darmstadt, Deutschland) und die makroskopisch beurteilbaren Parameter der

Spermiensuspensionen evaluiert. Dazu wurden 100×106 Spermien mL

−1 in NK für 60 min bei

37°C in feuchter Luft in offenen oder geschlossenen Röhrchen präinkubiert, anschließend

zentrifugiert (5min bei 600 xg) und in NK oder MW mit einer Endkonzentration von 10 bzw.

25×106 Spermien mL

−1 resuspendiert. Die Proben wurden auf 0.5 mL Aliquots verteilt und

für bis zu 240 min offen oder geschlossen bei 37°C in feuchter Luft inkubiert (Abb. 3.5.).

Anhand der Ergebnisse sollten die Inkubationsbedingungen für equine Spermien vor der

Koinkubation mit porzinen Oozyten optimiert werden.

54

Abbildung 3.5.:

Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung der

Motilitätsparameter (CASA), des pH-Wertes (pH-Streifen) sowie zur Beurteilung von

Aussehen und Geruch der Proben im Verlauf der 240-minütigen Inkubation präinkubierter

equiner Spermien in offenen oder geschlossenen Röhrchen.

T1 = resuspendiert in MW

T2 = resuspendiert in NK

a = 10 x106 Sp. mL

-1

b = 25 x106 Sp. mL

-1

Messzeitpunkte: 10, 60, 120, 240 min


55

3.2.4.3. Koinkubation equiner Spermien mit in vitro maturierten porzinen Oozyten

Als Koinkubationsmedium für die Gameten wurde das Maturationsmedium ohne

Hormonzusätze und Wachstumsfaktoren verwendet (Tab. 3.1.). Nach mindestens

zweistündiger Äquilibrierung des Mediums unter Inkubationsbedingungen (38.5°C und 5%

CO2) wurden 90 µL Tropfen auf Petrischalen verteilt und mit Silikonöl überschichtet. In jeden

dieser Tropfen wurden 20 maturierte, denudierte Oozyten eingesetzt und 10 µL einer der

sieben aufbereiteten Spermiensuspensionen (Kap. 3.2.4.2.) zugegeben (100 µL Endvolumen

mit 0.1‒10×105 Spermien je 20 Oozyten). Die Koinkubation erfolgte über 120 min bei 38.5°C

und 5% CO2 (Abb. 3.7.).

Die für den folgenden Bindungsassay verwendeten Spermienkonzentrationen wurden in

einem Vorversuch auf ihre Eignung für die Koinkubation mit porzinen Oozyten geprüft. Dazu

wurden in NK verdünnte Spermaproben wie in Kapitel 3.2.4.2. beschrieben aufbereitet und

nach der Zentrifugation (5 min bei 600×g) in NK bzw. MW mit einer Endkonzentration von

1‒100×106 Spermien mL

−1 resuspendiert.

3.2.4.4. Bestimmung der Bindungsraten equiner Spermien an der Zona pellucida in

vitro maturierter porziner Oozyten

Nach Ablauf der Koinkubationszeit (120 min) wurden die Oozyten mit den daran

gebundenen Spermien aus den Koinkubationstropfen entnommen und wiederholt intensiv im

Handling-Medium auf und ab pipettiert, um nicht fest an die Zona pellucida gebundene

Spermien zu entfernen. Anschließend wurden die Spermien-Oozyten-Komplexe für 10 min in

einer HOECHST-Färbelösung (5 mg mL‒1

HOECHST 33342 in DPBS mit 10% NBCS) im

Dunkeln bei 38°C inkubiert und daraufhin erneut im Handling-Medium gewaschen.

Unmittelbar nach diesem Färbevorgang wurden die Spermien-Oozyten-Komplexe auf

Objektträger verbracht und bis zur Analyse im Dunkeln gelagert. Um eine dreidimensionale

Beurteilung und somit ein Auszählen der gebundenen Spermien auf allen Seiten der Oozyten

zu gewährleisten, wurden je fünf gefärbte Spermien-Oozyten-Komplexe innerhalb eines

Lochverstärkerringes in Silikonöl eingebettet (Abb. 3.6.). Die Auszählung der gebundenen

Spermien pro Oozyte erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast

(Olympus BX 60, Olympus Tokio, Japan), welches mit einer Kamera (Olympus DP 72;


56

Olympus Deutschland GmbH, Hamburg) und zugehöriger Software ausgestattet war.

Ebenfalls wurden der Kernstatus, die Ausbildung eines Polkörpers und die Morphologie der

Oozyten evaluiert. Als maturiert wurden Oozyten gewertet, die einen Polkörper ausgebildet

und den Kernstatus der Metaphase II erreicht hatten.

Abbildung 3.6.:

Schematische Darstellung der Objekt-

träger zur fluoreszenzmikroskopischen

Auszählung der an der Zona pellucida in

vitro maturierter porziner Oozyten

gebundenen equinen Spermien.

Abbildung 3.7.:

Schematische Darstellung der Gametenaufbereitung, Inkubations- und Verfahrensschritte sowie der Analysemethode für den

heterologen Bindungsassay mit equinen Spermien und porzinen Oozyten.

Die sind veranschaulicht.

IVM

46 Std.

bei 38.5 °C

mit 5% CO2


58

3.3. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung der ‘SAS’ Software (SAS

Institute Inc., Cary, NC, USA) gemäß den Nutzungsanweisungen durch das Institut für

Biometrie und Epidemiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

Der Test auf Normalverteilung wurde jeweils mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test

durchgeführt, bevor für Varianzanalysen ein globaler F-Test für wiederholte Messungen bzw.

der Dunnett-Hsu-Test für Multivarianzanalysen angewendet wurde, um die durch CASA-

Messungen, durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikroskopisch bestimmten Parameter zu

evaluieren. Varianzen wurden mit einem p-Wert < 0.05 als statistisch signifikant und mit p <

0.001 als statistisch hochsignifikant gewertet. Die Darstellung der Daten erfolgte als

arithmetische Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

59

4 ERGEBNISSE

4.1. Experiment I:



Inkubation in modifiziertem Whittens-Medium

Ziel dieses Versuchsteils war es herauszufinden, ob und nach welcher

Inkubationsdauer das modifizierte Whittens-Medium (MW) die Kapazitation,

Hyperaktivierung und Akrosomreaktion von Hengstspermien in vitro induziert. Ebenso wurde

der Frage nachgegangen, ob NK diese Reaktionen nicht beeinträchtigt und somit als

Kontrollmedium geeignet ist. Während der Inkubation in MW oder NK für bis zu vier

Stunden wurden vergleichend die Motilitätsparameter, der intrazelluläre Kalziumgehalt sowie

die Plasma- und Akrosommembranintegrität der Spermien analysiert; die Ergebnisse sind in

Abb. 4.1. veranschaulicht.

Während der vierstündigen Inkubation in NK war nur ein geringer, gleichmäßiger Abfall des

Anteils membranintakter Spermien (von 75% auf 65%) zu verzeichnen. Bei den in MW

inkubierten Spermien trat innerhalb von 120 min eine Verringerung des Anteils

membranintakter Spermien um 35% ein und dieser Status blieb während der weiteren

Inkubationszeit konstant. Das Inkubieren in MW steigerte sowohl den intrazellulären

Kalziumgehalt der Spermien (gemessen an einem Anstieg der Fluo3-Fluoreszenzintensität)

als auch den Anteil akrosomreagierter Spermien (FITC-PNA-fluoreszierende Spermien). Die

Fluo-3 Fluoreszenzintensität der Spermien erreichte nach einer Inkubationsdauer von 180 min

ein Maximum von 18.5 in NK mit einem Anstieg um das 1.6-Fache des Ausgangswertes

(11.9) (p=0.04). In MW zeigte sich eine 2.4-fache Steigerung der Fluoreszenzintensität

innerhalb von 120 min auf ein Maximum von 20.25 (p=0.003) mit nachfolgendem Abfall des

Wertes (16.1 nach 240 min). Dieses Ergebnis weist auf einen signifikanten Anstieg des

intrazellulären Kalziumgehaltes hin und lässt auf die Induktion des Kapazitationsprozesses

bei einem maximalen Anteil von Spermien in der Population der Proben nach 120-minütiger

Inkubation in MW schließen.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

60

Die Akrosomreaktion durchliefen die Spermien mit einem maximalen Wert FITC-PNA

angefärbter Akrosome von 31% der Gesamtpopulation nach 120 min in MW. Die Steigerung

der Werte dieses Parameters gegenüber dem Ausgangswert (11%) war nach mehr als 60 min

Inkubationszeit hochsignifikant (p < 0.0001). In NK wurde lediglich ein Anstieg

akrosomreagierter Spermien von 7% nach 120-minütiger Inkubation verzeichnet (von 6 auf

13%). Der prozentuale Anteil progressiv motiler Spermien (PMS) verminderte sich um nur

6% (von 40 auf 34%) in NK während der ersten 120 min der Inkubation und um weitere 15%

während der folgenden zwei Stunden (19% nach 240 min). Inkubiert in MW fiel der Anteil

der PMS innerhalb der ersten 120 min um 20% ab (von 51 auf 31%; p=0.009). Dieser

Rückgang war v.a. bedingt durch einen signifikanten Anstieg der Geschwindigkeit auf der

gebogenen Linie von 140 auf 164.6 µm s−1

(p=0.01) und der Amplitude der seitlichen

Kopfauslenkung der Spermien von 2.1 auf 3.2 µm innerhalb 120-minütiger Inkubation.

Während der Inkubation in NK zeigte die Spermienpopulation nach 120 min keine Anzeichen

der Hyperaktivierung (VCL: 146−149 µm s−1

, ALH: 2.5−2.8 µm). In MW wurde der Anteil

vorwärtsbeweglicher Spermien außerdem durch mikroskopisch feststellbare Agglutinationen

mehrerer Spermienköpfe eingeschränkt. Derartige Agglutinationen waren in NK kaum zu

finden und hengstindividuell sehr unterschiedlich ausgeprägt.

Der pH-Wert der Spermiensuspensionen steigerte sich während der vierstündigen Inkubation

in MW von 7.5 auf 8.5 und somit stärker als in NK (von 7.0 auf 7.5).

Insgesamt wiesen die Spermien unterschiedlicher Hengste große interindividuelle

Unterschiede bezüglich des zeitlichen Verlaufs und des Ausmaßes der beschriebenen

fertilisationsassoziierten Reaktionen auf.

Das stärkste Ausmaß der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen war im

Durchschnitt während einer 60−120 minütigen Inkubation in MW zu verzeichnen. In NK

konnten diese Reaktionen während der Inkubationsdauer nicht induziert werden. Folglich ist

MW als Kapazitations- und NK als Kontrollmedium geeignet.

61

Abbildung 4.1.:

Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität, des akrosomalen Status und des

intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien während der 240-minütigen Inkubation in

Kapazitationsmedium (MW) (A, C) oder Kontrollmedium (NK) (B, D).

Plasma- und akrosommembranintakte Spermien (%, rot) (A, B)

Akrosomgefärbte Spermien (%, grau gestrichelt) (A, B)

Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (a.u., grün gestrichelt) (A, B)

Progressiv motile Spermien (%, blau) (A, B)

Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (µm s-1

, VCL, violett) (C, D)

Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, ALH, orange) (C, D)

Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sechs

Hengsten.

Informationen zu den Signifikanzwerten der dargestellten Parameter sind Kap. 4.1.1. zu entnehmen.

Pro

gr.

mo

tile

Sp

. (%

)

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

62


Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain

Aus dem vorangegangenen Versuchsteil wurde deutlich, dass nach einer

Gesamtinkubationsdauer von 60−120 min in MW maximale Werte für die Kapazitations-,

Akrosomreaktions- und Hyperaktivierungsparameter erreicht und somit fertilisations-

assoziierte Reaktionen bei Hengstspermien induziert werden konnten. Die Eignung von NK

als Kontrollmedium ist ebenfalls gegeben (Abb. 4.1.), da bei darin inkubierten Spermien die

genannten Reaktionen weitestgehend ausblieben.

Basierend auf diesen Ergebnissen sollte die Wirkung des Zusatzes von Kalzium-Ionophor

A23187 (CaIP) und Procain auf die Induktion fertilisationsassozierter Spermienreaktionen

getestet werden. Nach 60-minütiger Präinkubation in MW wurden CaIP mit Konzentrationen

von 0–10 µM und Procain mit 0–10 mM zugegeben und die Spermieneigenschaften nach 30

min Einwirkzeit evaluiert (Abb. 4.2.).

Der Prozentsatz plasmamembranintakter Spermien war durch den Zusatz der Reagenzien

auch bei maximalen Konzentrationen kaum beeinträchtigt. Ebenso zeigte die Fluo-3

Fluoreszenzintensität keine Veränderungen nach Behandlung der Proben mit steigenden

Procain-Konzentrationen. Nach Zugabe von CaIP stiegen die Werte dieses Parameters an und

kennzeichneten somit einen Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes der Spermien. Eine

Steigerung um das 3.7-Fache von 26.4 auf ein Maximum von 96.8 wurde durch Applikation

von 3 µM CaIP erreicht (p < 0.0001). Der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien nahm bei

Zusatz steigender Konzentrationen von CaIP- und Procain ab. Dieser Anteil verringerte sich

hochsignifikant (p < 0.0001) nach Zugabe von CaIP mit Konzentrationen von mehr als 0.5

µM. Mit 3 µM CaIP konnten kaum noch progressiv motile (2%) oder hyperaktivierte

Spermien (VCL 80.4 µm s-1

, ALH 1.7 µm) vom CASA-System detektiert werden.

Mikroskopisch war erkennbar, dass ein großer Teil der Spermien, die mit CASA als immotil

erfasst waren, ein hochfrequentes Kopfzittern zeigten. Mit steigenden Procain-

Konzentrationen verringerte sich der Anteil progressiv motiler Spermien um 23%. Dieser

Werterückgang war statistisch hochsignifikant (p < 0.0001) nach Zusatz von Procain-

konzentrationen von mehr als 2.5 mM. Dabei wurde ein Zusammenhang mit einem Anstieg

der VCL und ALH ersichtlich. Die VCL erreichte ein Maximum vom 167 µm s−1

nach der

Inkubation mit 2.5 mM Procain gegenüber einem Ausgangswert von 135 µm s−1

(p = 0.01)

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

63

und die ALH erreichte ein maximales Plateau von 4.4 µm durch Zugabe von 2.5−5 mM

Procain gegenüber 2.2 µm ohne Zugabe von Procain (p < 0.0001).

Abbildung 4.2.:

Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität und des intrazellulären Kalzium-

gehaltes equiner Spermien nach 60-minütiger Präinkubation in Kapazitationsmedium (MW) und

nachfolgendem Zusatz von CaIP (A, C) oder Procain (B, D) für 30 min in unterschiedlichen

Konzentrationen.

Plasma- und akrosommembranintakte Spermien (%, rot) (A, B)

Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (grün gestrichelt) (A, B)

Progressiv motile Spermien (%, blau) (A, B)

Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (µm s-1

, VCL, violett) (C, D)

Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, ALH, orange) (C, D)

Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sieben

Hengsten.

Informationen zu den Signifikanzwerten der dargestellten Parameter sind Kap. 4.1.2. zu entnehmen.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

64

4.1.3. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im

Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen

Spermien

In Hinblick auf die Koinkubation von Oozyten und Spermiensuspensionen sollte die

Konzentration der Reagenzien CaIP und Procain in den Medien durch Zentrifugation,

Entfernen des reagenzienhaltigen Überstandes und Resuspension der Spermienpellets in

frischem Medium reduziert werden. Es sollte festgestellt werden, ob die durch

Reagenzienzusatz induzierten fertilisationsassoziierten Prozesse bzw. Zustände der Spermien

auch nach der Zentrifugation beibehalten bleiben.

Die equinen Spermien wurden zunächst 60 min in Kapazitationsmedium präinkubiert und für

10 min mit 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM Procain behandelt. Die Hälfte der Proben wurde

daraufhin zentrifugiert und das Pellet in MW resuspendiert. Die fertilisationsassoziierten

Reaktionen der Spermien wurden im Anschluss an die Zentrifugation nach 15−90 min

weiterer Inkubation bei 37°C mittels CASA und durchflusszytometrisch beurteilt.

Die Zugabe von CaIP oder Procain resultierte in einer Abnahme des Anteils progressiv

motiler Spermien verglichen mit den reagenzienfreien Proben in MW (PMS: 24% in MW, 9%

mit CaIP, 10% mit Procain) (Abb. 4.3.). Die zentrifugierten und resuspendierten Proben

wiesen einen geringeren Anteil plasmamembranintakter (PI neg.: 31% mit CaIP, 29% mit

Procain) und einen um 9% (CaIP) bzw. um 11% (Procain) signifikant höheren Anteil

akrosomreagierter Spermien auf als die Proben, die mit den Reagenzien supplementiert und

nicht zentrifugiert wurden (PI neg.: 32% mit CaIP, 37% mit Procain) (Akrosomreaktion: CaIP

p=0.014, Procain p=0.05). Die ALH war nach dem Zusatz der Reagenzien reduziert (2-fach

für CaIP nz, 1.2-fach für Proc nz vergl. zu MW). Dabei wiesen zentrifugierte und

resuspendierte CaIP-haltige Proben höhere ALH-Werte auf als nicht zentrifugierte Proben

(CaIP z: 2.8 vs. nz: 1.7 µm; Procain z: 2.5 vs. nz: 2.8 µm). Die Supplementierung mit CaIP

führte zu einem Anstieg der Fluo-3 Fluoreszenzintensität (2.2-fach, von 8.3 in MW auf 18.0

mit CaIP) und folglich zu einem erhöhten intrazellulären Kalziumgehalt der Spermien. Durch

die Reduktion des CaIP-Gehaltes im Medium durch Zentrifugation und Resuspension

verringerte sich die Fluo-3 Intensität (1.5-fach auf 12.3). Der Vergleich der

Fluoreszenzintensitäten für mit Procain behandelte Proben ergab eine 1.8-fach geringere

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

65

Fluo-3 Fluoreszenz von 8.1 für zentrifugierte Proben gegenüber 14.8 ohne Zentrifugation

(p=0.007).

Für die 15- bis 90-minütige Inkubationszeit nach Zentrifugation und Resuspension zeigten

sich nach 15 bis 45 min ähnliche Entwicklungen der Parameterwerte im Vergleich zwischen

verschiedenen Ejakulaten. Daher wurde eine Nachinkubationszeit von 15 min für die

`Spermienerholung` nach Zentrifugation für weitere Experimente ausgewählt.

Insgesamt bedingte die Zentrifugation und Resuspension der Proben Verluste

membranintakter Spermien. Das Ausmaß der Kapazitation (gemessen am intrazellulären

Kalziumgehalt) war durch das Abzentrifugieren der Reagenzien vermindert, das der

Akrosomreaktion aber positiv beeinflusst.

66

* * *

Abbildung 4.3.:

Entwicklung der Motilitätsparameter, der Akrosomintegrität und des intrazellulären Kalziumgehaltes

equiner Spermien nach Anwendung eines Zentrifugationsverfahrens im Anschluss an eine 60-

minütige Präinkubation in Kapazitationsmedium (MW) und Zusatz von 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM

Procain für 10 min. Vor der Analyse wurden alle Proben für 15 – 90 min nachinkubiert.

Inkubation in MW (Kontrolle, grün)

Zusatz von CaIP für 10 min mit (z, blau) oder ohne Zentrifugation (nz, blau gestreift)

Zusatz von Procain für 10 min mit (z, gelb) oder ohne Zentrifugation (nz, gelb gestreift)

Progressiv motile Spermien (%, A)

Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, B)

Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (C)

Akrosomgefärbte Spermien (%, D)

Die Diagramme zeigen die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sechs

Hengsten nach 15 min Nachinkubationszeit.

* = Signifikante Unterschiede (p < 0.05) der Parameterwerte zwischen zentrifugierten und nicht

zentrifugierten Proben derselben Reagenzie.

Pro

gr. m

oti

le S

p. (

%)

Flu

o-3

Flu

ore

szen

z (a

.u.)

Akr

oso

mge

färb

te S

p. (

%)

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

67

4.2. Experiment II:

Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten und equinen

Spermien

4.2.1. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten

Die aus Schlachthofovarien gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexe zeigten nach

46-stündiger Inkubation in Maturationsmedium bei 38.5 °C und 5% CO2 mit einer Rate von

79.7% einen zwei- bis dreifach expandierten Kumulus oophorus sowie den Kernstatus der

Metaphase II und die Ausprägung eines Polkörpers (Abb 4.4.).

Sp.

PK

M II

Sp.

PK

M II

A B

Abbildung 4.4:

Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten nach 120 min

Koinkubation mit equinen Spermien.

Die Spermien-Oozyten-Komplexe sind mit HOECHST gefärbt, sodass die Kernstrukturen der

Gameten nach Anregung blau fluoreszieren. An der Zona pellucida (→) sind vereinzelt Spermien

(Sp.) gebunden; der Kernstatus der Metaphase II (M II) ist erreicht und ein Polkörper (PK)

ausgebildet.

A: Phasenkontrast-Dunkelfeld

B: Phasenkontrast-Hellfeld

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

68

4.2.2. Bestimmung einer geeigneten Konzentration equiner Spermien für die

Koinkubation mit porzinen Oozyten

Die Auswertung der Spermienbindungsrate an der Zona pellucida in vitro maturierter

porziner Oozyten erfolgte fluoreszenzmikroskopisch nach HOECHST-Färbung. Zur

Koinkubation mit den reifen Eizellen musste eine Spermienkonzentration ermittelt werden,

mit der eine repräsentative und gut auszählbare Anzahl von Spermien an die Oozyten band.

Sowohl in Kontrollmedium (NK) als auch in Kapazitationsmedium (MW) vorinkubierte

Spermaproben wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen 5−10 reifen Oozyten je

Koinkubationstropfen zugegeben. Die geschätzte Gesamtmotilität der Spermien betrug nach

120-minütiger Koinkubation durchschnittlich 55%.

Die Anzahl gebundener Spermien pro Oozyte stieg mit der Spermienkonzentration. Bei einer

Konzentration von 100×106 Spermien mL

−1 waren die gebundenen Spermien nur noch schwer

voneinander zu differenzieren (Abb. 4.5., Tab. 4.1). Außerdem zeigten die Spermien nach

Vorinkubation in MW eine 1.4- bis 2.6-fach höhere Bindungsrate als in NK. Bei

Koinkubation mit einer Konzentration von 25×106 Spermien mL

−1 waren durchschnittlich 28

(NK) bzw. 60 (MW) Spermien, mit 50×106 Spermien mL

−1 48 (NK) bzw. 122 (MW)

Spermien pro Oozyte gebunden (Tab. 4.1.).

Aufgrund der Ergebnisse aus Experiment I war zu erwarten, dass der Zusatz von CaIP und

Procain zu den Spermaproben zu einer Steigerung der Bindungsraten führen würde. Daher

wurde für die Experimente zur Bestimmung der Spermien-Oozyten-Bindung nach Induktion

fertilisationsassoziierter Reaktionen durch Inkubation in MW oder Zusatz von CaIP und

Procain eine Konzentration von 25×106 Spermien mL

−1 zur Koinkubation mit den porzinen

Oozyten verwendet. Diese Konzentration entsprach einer Spermienzahl von 2.5×105 je

Koinkubationstropfen von 100 µL mit 20 Oozyten.

Da in diesem Versuchsteil lediglich zwei Ejakulate eines Hengstes verwendet wurden, wurde

auf eine statistische Auswertung verzichtet.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

69

Tabelle 4.1.: Mittlere Anzahl der gebundenen equinen Spermien pro in vitro gereifter

Schweineoozyte in Abhängigkeit von der Spermienkonzentration und dem Präinkubations-

medium.

Spermien-

konzentration (Sp. mL

−1)

Spermien pro

Oozyte nach

Präinkubation der

Spermien in NK

Spermien pro

Oozyte nach

Präinkubation der

Spermien in MW

1×106 3,6 5,2

25×106 27,6 59,4

50×106 47,6 122,4

100×106 n.a. > 300 n.a. > 300

Die Spermien wurden in NK (Kontrollmedium) oder MW (Kapazitationsmedium) für 120

min präinkubiert und dann für weitere 120 min mit den Oozyten koinkubiert. Die HOECHST-

gefärbten Spermien wurden an je 10 reifen Oozyten ausgezählt.

n.a. = nicht auszählbar.

Die für die Bindungsassays ausgewählte Spermienkonzentration ist hellgrau unterlegt.

70

Abbildung 4.5.:

Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten nach 120 min

Koinkubation mit unterschiedlich konzentrierten equinen Spermien (Phasenkontrast-

mikroskopie nach HOECHST-Färbung).

→: Zona pellucida, Sp.: Spermien, MII: Metaphase II, PK: Polkörper

A: Spermienkonzentration: 1 x 106 Sp. mL

-1. Bindung vereinzelter Spermien.

B: Spermienkonzentration: 25 x 106 Sp. mL

-1. Multifokale Spermienbindung. *

C: Spermienkonzentration: 50 x 106 Sp. mL

-1. Diffuse Spermienbindung mit guter

Differenzierbarkeit. *

D: Spermienkonzentration: 100 x 106 Sp. mL

-1. Diffuse Spermienbindung mit schlechter

Differenzierbarkeit. *

* Der Kernstatus (MII) der Oozyte ist in der abgebildeten Ebene nicht dargestellt.

Sp.

PK

M II

A

Sp.

C

Sp.

D

Sp. B

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

71

4.2.3. Überprüfung der Inkubationsbedingungen für die equinen Spermien

Bei 120-minütiger Inkubation der Spermiensuspensionen in geschlossenen Röhrchen

im Wasserbad (37°C) setzten sich Spermien und anderes zelluläres Material ab. Die

Bindungsrate an den porzinen Oozyten war für ein Ejakulat desselben Hengstes im Vergleich

zu einer Vorinkubation in einem Röhrchen mit 50% Luftüberstand um 44% reduziert.

Um einen möglichen Zusammenhang dieser Beobachtungen mit der geschlossenen

Inkubationsform zu evaluieren, wurde diese über 240 min gegen eine offene Inkubation

getestet. Außerdem wurde der Einfluss der Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Spermien

mL−1

) und des Inkubationsmediums auf die Spermienmotilität, den pH-Wert im Medium und

die makroskopische Erscheinung der Spermiensuspensionen evaluiert.

Der Anteil progressiv motiler Spermien (PMS) war nach 240 min Inkubation in den

geschlossen inkubierten Proben (9 bzw. 19% in NK, 1.5 bzw. 6% in MW) im Vergleich zu

den offen inkubierten Proben (21 bzw. 26% in NK, 7.5 bzw. 7% in MW) geringer. Der PMS

in MW inkubierter Spermien war abhängig von den inkubierten Spermienkonzentrationen

insgesamt (1.5% bzw. 7.5%) geringer als für in NK inkubierte Spermien (9% bzw. 26%). Die

Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Sp. mL

−1) zeigte für die Inkubation in NK (5 bzw.

10% Differenz) einen stärkeren Einfluss auf den PMS als in MW (1 bzw. 4% Differenz)

(Abb. 4.6. A). Für die VCL war nach 240 min im geschlossenen System eine deutliche

Verringerung zu verzeichnen. In MW betrug der Werteabfall für 10 bzw. 25×106 Sp. mL

−1 61

bzw. 65.2 µm s−1

und in NK 0 bzw. 14.4 µm s−1

.

In geschlossen inkubierten Proben kam es medienabhängig über die Zeit zu einem Abfall des

pH-Wertes (auf pH zwischen 6.75 und 7.5). Bei offener Inkubation in NK traten über 240 min

kaum pH-Änderungen auf (pH 7.5 bzw. 7.75), wohingegen in MW unabhängig von der

Spermienkonzentration ein Anstieg festgestellt wurde (auf pH 7.5 bzw. 8.5) (Abb. 4.6. B).

Bei pH ≤ 7.0 war durch grobsinnliche Beurteilung ein säuerlicher Geruch wahrnehmbar. Bei

geschlossener Inkubation agglutinierten Spermien nach 60 min am Boden der Röhrchen. Dies

war verstärkt in NK und mit höherer Spermienkonzentration (25×106 Spermien mL

−1)

festzustellen.

Aufgrund dieser Ergebnisse erfolgte die Vorbereitung der Spermien auf die Koinkubation mit

porzinen Oozyten zur Erfassung von Bindungsraten im offenen Inkubationssystem.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

72

4.2.4. Einfluss unterschiedlicher Spermienaufbereitungen auf die Bindungsfähigkeit

equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten und auf die Oozyten-

morphologie

Durch einen heterologen Bindungsassay sollte der Einfluss unterschiedlicher

Spermienaufbereitungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen auf die

Bindungsfähigkeit der Spermien an die Zona pellucida der porzinen Eizellen und die

Oozytenmorphologie evaluiert werden.

Spermienaufbereitungen in Kontroll- (NK) und Kapazitationsmedium (MW) mit bzw. ohne

Zusatz von CaIP und Procain und nach Reduktion des Reagenziengehaltes durch

Zentrifugation sowie in INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierte Spermien wurden mit

in vitro maturierten porzinen Oozyten inkubiert.

pH

Pro

gr.

mo

tile

Sp

. (%

)

A

Abbildung 4.6.:

Anteil progressiv motiler Spermien (A) und pH-Wert (B) in Spermiensuspensionen mit

unterschiedlicher Konzentration bei geschlossener (zu, gestreifte Balken) und offener (o,

ausgefüllte Balken) Inkubation in Kapazitationsmedium (MW; grün, violett) oder Kontrollmedium

(NK; orange, blau, rot) über 240 min.

Inkubation mit 10 ×106 Spermien mL

−1 (blau, grün) bzw. 25 ×10

6 Spermien mL

−1 (rot, violett).

A: Progressiv motile Spermien (%) nach 240 min Inkubation.

B: pH-Wert: Basisprobe mit 100 ×106 Spermien mL

−1 in NK (orange) vor der Inkubationszeit;

verdünnte Proben nach 10 und 240 min Inkubation.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________

73

Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der Spermien-Oozyten-Komplexe nach Anfärben

mit HOECHST 33342 ergab im Mittel die höchste Bindungsrate für in INRA82-

Magermilchverdünner transportierte und vorinkubierte Spermien (durchschnittlich ~90 Sp.

pro Oozyte). Der Unterschied zu den Bindungsraten der Spermien aller anderen

Aufbereitungen war hochsignifikant (p < 0.0001) (Abb. 4.7., A). Die Vorinkubation in NK im

Vergleich zu MW resultierte in einer mehr als doppelt so hohen Anzahl gebundener Spermien

pro Oozyte (26 vs. 12). Die mit den induzierenden Reagenzien CaIP und Procain

aufbereiteten Spermiensuspensionen wiesen ebenfalls geringe Bindungsraten auf. Diese

wurden durch Zentrifugation der Proben zur Reduktion des Reagenziengehaltes im Medium

zusätzlich leicht verringert (Proc nz: 11 vs. Proc z: 8 und CaIP nz: 13 vs. CaIP z: 10).

Insgesamt unterschieden sich die Spermienbindungsraten sowohl inter- als auch

intraindividuell sehr stark (Abb. 4.7., B). Ferner war die Anzahl gebundener Spermien für die

einzelnen Oozyten eines Koinkubationstropfens sehr variabel.

Bei Betrachtung der Spermien-Oozyten-Komplexe fiel auf, dass das Ooplasma einiger

Oozyten eine abnormale, unregelmäßige Struktur aufwies (Abb. 4.8.). Diese Veränderungen

waren für alle Spermienaufbereitungen (in NK oder MW mit und ohne CaIP oder Procain) zu

verzeichnen. Oozyten, die mit in INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierten Spermien

koinkubiert waren, zeigten diese Ooplasmaveränderungen nicht (Tab. 4.2.). Der größte Anteil

der Ooplasmaveränderungen trat bei Oozyten auf, die mit CaIP oder Procain vorbehandelten

und zentrifugierten Spermien koinkubiert wurden (CaIP z: 7%, Proc z: 9%). Insgesamt

wurden Ooplasmaabweichungen bei 5.4% aller analysierten Oozyten beobachtet (Tab. 4.2.,

Abb. 4.9.).

74

Abbildung 4.7.:

A: Anzahl gebundener equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten nach 120 min

Koinkubation.

Spermienaufbereitungen: 120 min Präinkubation in NK bzw. MW oder in INRA82-

Magermilchverdünner (grün, rosa); 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP (blau)

oder Procain (gelb) mit (z) oder ohne (nz, schraffiert) anschließende Zentrifugation.

Das Diagramm zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen für sieben Ejakulate von vier

Hengsten an 870 Oozyten.

** = Unterschied zu allen anderen Behandlungen p < 0.001

* = Unterschied zwischen nicht zentrifugierten und zentrifugierten Proben mit Procainzusatz p < 0.05.

B: Spermienbindungsraten an in vitro maturierte porzine Oozyten für zwei verschiedene Ejakulate (a,

b) desselben Hengstes.

0

25

50

75

100Sp

erm

ien

je O

ozy

te

A S

perm

ien p

ro O

ozyte

*

** S

perm

ien p

ro O

ozyte

B

75

Sp

.

A

PK

B

Abbildung 4.8.:

Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten mit verändertem

Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien (Phasenkontrast-Dunkelfeld nach

HOECHST-Färbung). Trotz der Ooplasmaabweichungen sind Spermien (Sp.) an der Zona pellucida

(→) gebunden (A) und Polkörper (PK) als Zeichen der Kernreifung erkennbar (B).

76

Tabelle 4.2.:

Anzahl und prozentualer Anteil in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem

Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien.


Magermilchverdünner; 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP oder Procain

mit (z) oder ohne (nz) anschließende Zentrifugation.

Medium Oozyten

gesamt

(n)

Oozyten mit

verändertem

Ooplasma (n)

Oozyten mit

verändertem

Ooplasma (%)

NK 186 8 4,30

MW 185 6 3,24

CaIP nz 184 12 6,52

CaIP z 180 13 7,22

Proc nz 186 11 5,91

Proc z 188 16 8,51

INRA 82 114 0 0,00

Gesamt 1223 66 5,4

Oo

zyte

n m

it

verä

ndert

em

Oopla

sm

a (

%)

Abbildung 4.9.:

Anteil (%) in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem Ooplasma nach 120 min

Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien.


Magermilchverdünner (grün, rosa); 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP (blau)

oder Procain (gelb) mit (z) oder ohne (nz, schraffiert) anschließende Zentrifugation.

Das Diagramm zeigt die Mittelwerte für eine Gesamtzahl von 1223 untersuchten Oozyten unter

Verwendung von insgesamt zehn Ejakulaten sieben verschiedener Hengste.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

77

5 DISKUSSION

Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) mit equinen Gameten stellt im Bereich der assistierten

Reproduktionstechniken eines der wichtigsten Forschungsthemen für diese Spezies dar. Trotz

mehrerer Jahrzehnte intensiver Arbeit wird diese Technik beim Pferd noch nicht routinemäßig

angewandt. IVF-Protokolle, wie sie bei anderen Nutztierarten (v.a. Rind) angewendet werden,

konnten nicht erfolgreich übernommen werden. Daher müssen speziesspezifische Verfahren

zur Vorbereitung der Oozyten und Spermien auf die Fertilisation unter Laborbedingungen

entwickelt werden. Im Einzelnen müssen die Oozyten gewonnen und in vitro maturiert

werden, bei den Spermien müssen nach ihrer Gewinnung die fertilisationsassoziierten

Reaktionen Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion ausgelöst werden. Obwohl

einzelne Verfahrensschritte bereits erfolgreich in vitro durchgeführt werden können, läuft die

IVF equiner Gameten zumeist fehlerhaft oder unvollständig ab, was in sehr geringen

Entwicklungsraten frühembryonaler Stadien resultiert.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Reaktionen

equiner Spermien in vitro zu untersuchen und die Auswirkungen ausgewählter

Inkubationsbehandlungen auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien an porzine Oozyten zu

testen.

5.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch

Inkubation in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium

Zunächst wurde die Effektivität der Inkubation equiner Spermien in einem

Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium (modifiziertes Whittens-Medium, MW)

zur Induktion der Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion evaluiert. Vor der

Inkubation zur Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen wurden die

Hengstspermien nach ihrer Gewinnung durch Zentrifugation im Kontrollmedium aufbereitet,

um im Überstand enthaltene Dekapazitationsfaktoren des Seminalplasmas zu reduzieren.

SUZUKI et al. (2002) zeigten, dass das Reduzieren des Seminalplasmaanteils für die

Induktion der Kapazitation vorteilhaft ist, daher wurden geringe zu erwartende Verluste hoch

motiler Spermien, die wieder in den Überstand aufgeschwommen waren, toleriert.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

78

5.1.1. Einfluss des Inkubationsmediums auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei

equinen Spermien

Mithilfe der Analyse von Parametern, die als Merkmale der Kapazitation,

Hyperaktivierung und Akrosomreaktion von Spermien etabliert sind, konnte die Eignung des

modifizierten Whittens-Mediums für die Induktion dieser Prozesse nachgewiesen werden. Im

Kontrollmedium (ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA) wurden diese Reaktionen nicht

ausgelöst.

Die Inkubation von Spermien in Bikarbonat- und BSA- haltigen Medien zur Vorbereitung auf

die IVF findet in den Protokollen für mehrere Spezies Anwendung. Für equine Spermien wird

in Anlehnung an die Ergebnisse von MC PARTLIN et al. (2008) von vielen Arbeitsgruppen

das modifizierte Whittens-Medium zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen genutzt,

da dieses Medium sich in der Studie im Vergleich mit TALP und BWW als das effektivste

erwies. Dabei wurden Bikarbonat und BSA als die ausschlaggebenden Komponenten im

Medium identifiziert. ORTGIES et al. (2012) beobachteten für Whittens-Medium gegenüber

Tyrode-Medium außerdem einen protektiven Effekt auf die Plasmamembran der Spermien.

Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde für die Spermieninkubationen in der vorliegenden

Arbeit ebenfalls ein modifiziertes Whittens-Medium gewählt, welches zusätzlich

Kalziumchlorid enthielt.

Das im Medium enthaltene Bikarbonat beeinflusst als Ion die biochemischen Vorgänge

während der Spermienreaktionen und fördert v.a. die PTP und Änderungen im

Membranpotential während der Kapazitation (VISCONTI u. KOPF 1998).

Extrazelluläre Kalziumverbindungen erleichtern die Induktion der Kapazitations- und

Akrosomreaktionsvorgänge (FLESCH u. GADELLA 2000; RATHI et al. 2001).

BSA als (Chole-)Sterol-Akzeptor wird zugesetzt, da es die Abgabe und die Umverteilung von

Cholesterol während der kapazitationsbedingten Neuordnung der Spermienmembran und

somit die Spermien-Oozyten-Interaktion positiv beeinflusst (VISCONTI et al. 1999;

GADELLA u. BOERKE 2016). Diesen Effekt von BSA auf den Cholesterolefflux bei der

Kapazitation equiner Spermien zweifelten MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) an, sie konnten

aber andere kapazitationsassoziierte Wirkungen von BSA nicht ausschließen. Allgemein ist zu

beobachten, dass es in BSA-haltigen Medien vermehrt zur Agglutination von Spermienköpfen

kommt (BROMFIELD et al. 2014). Dies konnte hengstindividuell in unterschiedlicher

DISKUSSION ___________________________________________________________________

79

Ausprägung auch in der vorliegenden Studie beobachtet werden (Kap. 4.1.1.). Es ist davon

auszugehen, dass aufgrund dessen die Messgenauigkeit der CASA- und durchfluss-

zytometrischen Analysen beeinträchtigt wurde. Da jedoch weniger die absoluten Werte als

vielmehr die Entwicklungen der untersuchten Merkmale als aussagekräftige Ergebnisse zu

werten sind, kann die BSA-bedingte Spermienagglutination weitgehend unberücksichtigt

bleiben. Alternativ zu BSA wurden in Studien auch auch PVA (Polyvinylalkohol) oder

Cyclodextrine als nichttierische Sterolakzeptoren eingesetzt, die zugleich eine stärkere

Wirkung zeigten und weniger Spermienagglutinationen bewirkten (LOUX et al. 2013;

BROMFIELD et al. 2014).

Als Kontrollmedium (NK) wurde entsprechend anderen IVF-Protokollen für Pferdesperma

(MC PARTLIN et al. 2008) das MW ohne Bikarbonat, BSA und Kalzium (CaCl) genutzt.

BROMFIELD et al. (2014) zeigten, dass ein solches Kontrollmedium auch als

Kurzzeittransport-Medium (ca. 4 Std.) geeignet ist, da während der Inkubation in diesem

Medium weniger fertilisationsassoziierte Spermienreaktionen auftreten als in

Magermilchverdünner. Auch für die in der vorliegenden Studie untersuchten

Spermienparameter waren während der vierstündigen Inkubation in NK keine signifikanten

Veränderungen der Parameterwerte und somit keine Induktion fertilisationsassoziierter

Spermienreaktionen zu verzeichnen. Dies spricht für die Eignung von NK als Transport- und

Spermienaufbereitungsmedium. So konnte auf einen magermilch- oder eidotterhaltigen

Transportverdünner verzichtet und mögliche, undefinierte Effekte von Verdünnerresten in den

Proben während der Versuche ausgeschlossen werden.

In der vorliegenden Studie wurde ein deutlicher Anstieg der Werte fertilisationsassoziierter

Spermienparameter zum Basiswert als eine Induktion der Spermienreaktionen interpretiert.

Insgesamt konnten starke inter- und intraindividuelle Varianzen in Bezug auf den zeitlichen

Verlauf und das Ausmaß der induzierten fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen

beobachtet werden, wie sie schon von PATRAT et al. (2002) beschrieben wurden. Auf den

Vergleich der Daten mit denen anderer Arbeitsgruppen oder empfohlenen Mindestwerten

(RATHI et al. 2001) wurde aufgrund dessen verzichtet.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

80

5.1.2. Einfluss der Inkubationsbedingungen auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei

equinen Spermien

In MW war die stärkste Zunahme fertilisationsassoziierte Reaktionen kennzeichnender

Parameterwerte nach Inkubation über 60–120 min bei 37°C in offenen Röhrchen und

angefeuchteter Luft zu verzeichnen.

In einigen Studien wird eine Inkubationsatmosphäre aus angefeuchteter Luft mit 5% CO2

empfohlen, um den pH-Wert des Mediums konstant zu halten (ALM et al. 2001; HINRICHS

et al. 2002). Es wurde beobachtet, dass sich bei einer offenen Inkubation in angefeuchteter

Luft der pH-Wert zeitabhängig durch Abgasung von CO2 aus dem Medium und

Bikarbonatbildung erhöht (MC PARTLIN et al. 2008; MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Durch

diese pH-Werterhöhung im Inkubationsmedium wird v.a. die Kapazitationsreaktion durch

Induktion der PTP und verstärkten Kalziumeinstrom (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ et al.

2012) und die Spermienhyperaktivierung (HINRICHS u. LOUX 2012; LOUX et al. 2013)

stimuliert. Daher wurden die Spermiensuspensionen in der vorliegenden Arbeit ebenfalls in

angefeuchteter Luft offen inkubiert und ein zeitabhängiger Anstieg des pH-Wertes im

Kapazitationsmedium auf 8.5 (nach 240 min) verzeichnet. Der pH-Wert des Kontrollmediums

blieb stabil. Die negativen Effekte der geschlossenen Inkubation wurden in Vorbereitung auf

den heterologen Bindungsversuch erkennbar. In geschlossenen Proben sank der pH-Wert auf

≤ 7, der Anteil motiler Spermien verringerte sich und die immotilen Spermien sedimentierten

in den Proben.

In Bezug auf die notwendige Inkubationszeit zur Induktion der Spermienreaktionen waren in

der vorliegenden Studie bereits nach 30 min Inkubation in MW erhöhte Parameterwerte für

die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion feststellbar, was die Ergebnisse von

ORTGIES et al. (2012) stützt. Maximale Werte waren nach 60 bis 120 min erreicht. Die

Inkubation in MW für mehr als 120 min resultierte in einer Verringerung der analysierten

Parameter. Dies steht den Ergebnissen von MC PARTLIN et al. (2008) entgegen, die eine

vier- bis sechsstündige Inkubationszeit in MW empfehlen und somit auch den dieser Studie

folgenden Spermien-Inkubationsprotokollen anderer Arbeitsgruppen für die equine IVF

(LANGE-CONSIGLIO et al. 2011; AMBRUOSI et al. 2013; DOUET et al. 2014a). Diese

empfohlene lange Inkubationszeit entspricht jedoch der Kapazitationsdauer equiner Spermien

von 6–8 Stunden in vivo (YANAGIMACHI 1994).

DISKUSSION ___________________________________________________________________

81

Die Messungen maximaler Parameterwerte nach 60–120 min Inkubation in MW in der

vorliegenden Arbeit war gleichbedeutend damit, dass nach dieser Inkubationszeit ein

maximaler Anteil der Spermienpopulation in der Probe die fertilisationsassoziierten

Reaktionen durchlaufen hatte. Subpopulationen der Spermien zeigten die Induktion der

Reaktionen in geringerem Maße über den gesamten Inkubationsverlauf von vier Stunden

(niedrigere Parameterwerte). Daraus kann geschlossen werden, dass das Auslösen der

Spermienreaktionen in vitro zeitlich gestaffelt in Subpopulationen stattfindet. Dies entspricht

der Heterogenität der individuellen Spermien in vivo, deren Reaktionen zu unterschiedlichen

Zeitpunkten auf Reize im weiblichen Genitale hin ausgelöst werden. Diese gestaffelte

Induktion von Spermienreaktionen einzelner Gruppen aus der Gesamtpopulation des

Ejakulates führt zur Ausdehnung des Zeitrahmens der Befruchtungsfähigkeit der Spermien

(GADELLA u. BOERKE 2016).

5.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen

Spermien durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain

Da fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen Spermien in MW nach einer

Inkubationszeit von 60–120 min in hohem Maße ausgelöst werden konnten (Kap. 5.1.), wurde

eine Präinkubationszeit von 60 min in MW gewählt, um zu untersuchen, ob die

fertilisationassoziierten Reaktionen durch Zugabe von Kalzium-Ionophor A23187 (CaIP) und

Procain zusätzlich gesteigert werden können. Dazu wurde der Einfluss des Zusatzes der

Reagenzien in unterschiedlichen Konzentrationen auf die fertilisationsassoziierten

Spermienparameter evaluiert.

Da die Reagenzien nicht nur induzierende, sondern auch inhibierende Effekte auf die

Spermien zeigten und im Hinblick auf IVF-Versuche eine mögliche Embryotoxizität der

Reagenzien verringert werden sollte, wurden sie in den supplementierten Proben nach der

Induktion der Spermienreaktionen durch Zentrifugation und Resuspension reduziert und die

Auswirkungen dieser Maßnahmen auf die Gameten untersucht.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

82

5.2.1. Einfluss von Kalzium-Ionophor A23187 auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei

equinen Spermien

Nach 60-minütiger Präinkubation in MW und weiterer Inkubation mit CaIP für 30 min

zeigten sich maximale Parameterwerte für den intrazellulären Kalziumgehalt equiner

Spermien unter Verwendung einer Konzentration von 3 µM CaIP. Auch ALM et al. (2001)

und HINRICHS et al. (2002) konnten die Kapazitation equiner Spermien mit 3–7.14 µM CaIP

induzieren.

Die Motilitätsparameter der Spermien waren in der vorliegenden Arbeit durch Zusatz von

CaIP in höheren Konzentrationen als 0.5 µM stark eingeschränkt. Da die

Plasmamembranintegrität vom CaIP-Zusatz in unterschiedlichen Konzentrationen

unbeeinträchtigt blieb, konnte gezeigt werden, dass die durch CaIP immobilisierten Spermien

nicht avital waren. Vielmehr zeigten sie ein mikroskopisch sichtbares hochfrequentes

Kopfzittern mit flagellarer Starre (Kap. 4.1.2.). Auch RATHI et al. (2001) beschrieben die

Lähmung der gesamten Population equiner Spermien nach CaIP-Zugabe und dreistündiger

Inkubation bei noch vorhandener Vitalität. HINRICHS et al. (2002) dagegen konnten weder

auf die Motilität noch auf die IVF-Rate equiner Spermien einen Effekt unterschiedlicher

CaIP-Konzentrationen feststellen. Die flagellare Starre nach CaIP-Supplementierung wurde

ebenfalls für Mausspermien beschrieben und mit einem exzessiv hohen intrazellulären

Kalziumgehalt begründet (TATENO et al. 2013). In dieser Studie wurde außerdem gezeigt,

dass die Spermien nach dem Abzentrifugieren des CaIP-haltigen Mediums und 30-minütiger

´Erholungszeit´ Merkmale der Hyperaktivierung aufwiesen. In der vorliegenden Arbeit

konnten auch für equine Spermien nach Abzentrifugieren des Ionophor-haltigen Überstandes

der Probe und 15-minütiger Nachinkubationszeit hyperaktivierte Bewegungsmuster in

begrenztem Maße festgestellt werden. Vergleichbare Ergebnisse für equine Spermien

beschrieben LOUX et al. (2013), die Spermien mithilfe hoher CaCl2-Konzentrationen oder

Ionomycin immobilisierten und diesen Effekt durch Zugabe von Kalzium- oder

Kalziumkanal-Antagonisten aufheben konnten. Sie vermuteten, dass die Immobilisierung

equiner Spermien durch die Überschreitung einer Art intrazellulärer Kalziumgrenze bedingt

ist.

Die Akrosomreaktion konnte in der vorliegenden Studie nicht durch Zugabe von CaIP zu in

MW präinkubierten Spermien induziert werden. Der Anteil akrosomreagierter Spermien

DISKUSSION ___________________________________________________________________

83

entsprach dem Wert, der nach 60-minütiger Inkubation in MW ermittelt wurde. Dies ist

gegensätzlich zu den Ergebnissen von RATHI et al. (2001), MC PARTLIN et al. (2008) und

RUNCAN et al. (2014), die die Akrosomreaktion bei zuvor in bikarbonathaltigem Medium

kapazitierten Hengstspermien mit CaIP A23187 auslösten. Eine in der vorliegenden Arbeit

beobachtete, etwa 10 prozentige Steigerung des Anteils akrosomreagierter Spermien durch die

Zentrifugation zur Reduktion des CaIP-Gehaltes im Medium beruht offenbar auf der

physikalischen Induktion der Akrosomreaktion durch die Zentrifugationskräfte, wie

GADELLA und HARRISON (2000) sie beschrieben.

5.2.2. Einfluss von Procain auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen Spermien

Der Zusatz von 2.5–5 mM Procain zu in MW präinkubierten equinen Spermien

steigerte deren Hyperaktivierungsparameter VCL und ALH auf maximale Werte. Die

Plasmamembran- und Akrosomintegrität sowie der intrazelluläre Kalziumgehalt der Spermien

blieben durch den Zusatz von Procain auch in höheren Konzentrationen unbeeinträchtigt.

Für mit Procain behandelte Proben ist eine gewisse Fluoreszenzlöschung insbesondere für die

Fluo-3 Fluoreszenz beschrieben (LOUX et al. 2013). Somit ist der anhand der Fluo-3

Fluoreszenzintensität bestimmte Kapazitationsparameter in der vorliegenden Studie für mit

Procain behandelte Proben nicht zweifelsfrei auswertbar. In weiterführenden Arbeiten sollten

Procain supplementierte Proben mit anderen Kapazitationsanalyseverfahren als der Fluo-3

Färbung untersucht werden.

Auch MC PARTLIN et al. (2009) und ORTGIES et al. (2012) zeigten, dass Procain

ausschließlich die Parameterwerte der Hyperaktivierung erhöht und andere fertilisations-

assoziierte Spermienparameter unbeeinträchtigt bleiben. Für in Kapazitationsmedium

präinkubierte Spermien erwies sich in beiden Studien eine Konzentration von 2.5–5 mM

Procain als optimal zur Hyperaktivierung. Somit wird die in der vorliegenden Studie als

optimal bewertete Procainkonzentration von 2.5 mM bestätigt. Die isolierte Wirkweise von

Procain ohne Beeinflussung weiterer fertilisationassoziierter Spermienparameter ist für ein

induzierendes Reagens ungewöhnlich und lässt in Verbindung mit der Beobachtung von MC

PARTLIN et al. (2009), dass Procain ein kreis- bzw. sternenförmiges und kein physiologisch

biphasisches Bewegungsmuster der Hyperaktivierung hervorruft, den Zweifel an der

Fähigkeit zur Penetration der Zona pellucida durch mit Procain hyperaktivierte Spermien zu.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

84

5.2.3. Induktion der Hyperaktivierung bei equinen Spermien

Hyperaktive Bewegungsmuster mit erhöhten VCL- und ALH-Werten waren in der

vorliegenden Arbeit in etwa gleichem Maße durch Inkubation in MW für 120 min und durch

Zusatz von 2.5–5 mM Procain zu präinkubierten Proben sowie in geringerem Maße nach

Zentrifugation CaIP-supplementierter Proben induzierbar.

Weder MC PARTLIN et al. (2008) noch ORTGIES et al. (2012) beobachteten hyperaktivierte

Bewegungsmuster nach Inkubation der Spermien in Whittens-Medium in angefeuchteter Luft,

sie konnten diese erst durch Zusatz von Procain induzieren. Als Ursache für die Induktion der

Hyperaktivierung durch Inkubation in MW als Ergebnis der vorgelegten Studie kommt im

Vergleich zum Medium der genannten Arbeitsgruppen die Verwendung einer anderen

Kalziumquelle (CaCl) in MW infrage. HINRICHS und LOUX (2012) erläuterten mögliche

Funktionen von Kalzium bei der Hyperaktivierung von Spermien unterschiedlicher Spezies

und folgerten, dass Kalzium in Verbindung mit einem erhöhten pH-Wert im Medium zur

Aktivierung von Dyneinärmchen und somit zu einem verstärkten Flagellenschlag führen

kann. LOUX et al. (2014) vermuteten, dass die Kalziumregulation der Flagellenbewegung in

equinen Spermien anders als in den Spermien anderer Tierarten erfolgt und die

Hyperaktivierung equiner Spermien in vivo auf anderem Wege induziert wird als durch den

Einfluss von Kalzium und pH-Wert.

Die Induktion der Hyperaktivierung equiner Spermien in der vorliegenden Studie durch

Zugabe von 2.5 mM Procain entspricht, wie bereits beschrieben, den Ergebnissen von MC

PARTLIN et al. (2009), die Befruchtungsraten von 61% bei equinen Oozyten durch mit

Procain hyperaktivierte Spermien erzielen konnten. Sie folgerten daraus, dass für die IVF ein

Mindestanteil hyperaktivierter Spermien für die Koinkubation mit Oozyten nötig ist, der nur

durch Zusatz von Procain erreicht werden kann. Auch nach CaIP induzierter Hyperaktivierung

befruchteten equine Spermien in vitro maturierte Pferdeoozyten, die sich aber nicht zu

Zygoten weiterentwickelten (ALM et al. 2001).

DISKUSSION ___________________________________________________________________

85

5.3. Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten und equinen

Spermien

Im heterologen Bindungsassay wurden equine Spermien mit in vitro maturierten

porzinen Oozyten koinkubiert, um die Oozytenbindungsfähigkeit der Spermien zu prüfen.

Zusätzlich wurde der Einfluss der Spermienaufbereitung auf die Oozytenmorphologie

evaluiert.

Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, erkennen equine Spermien porzine Oozyten

und binden abhängig von ihrer Aufbereitung an sie, obwohl die ZP equiner und porziner

Oozyten speziesspezifische Unterschiede in der elektronenmikroskopischen Struktur und der

Glykoproteinzusammensetzung aufweist (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al. 2014).

MORAES et al. (2015) beschrieben, dass Hengstspermien auch an bovine Oozyten und die

Perivitellinmembran von Hühnereiern binden.

Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse eines heterologen mit einem homologen Bindungsassay

ist nach MUGNIER et al. (2009b) eingeschränkt, da equine Spermien schlechter an porzine

als an equine Oozyten binden. Dagegen banden porzine Spermien genauso gut an porzine wie

an equine Oozyten, sodass eine erhöhte Selektivität der ZP porziner Oozyten im Vergleich zur

equinen ZP oder eine stärkere Selektion durch die Hengstspermien zu vermuten ist.

Wie bei der Induzierbarkeit der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen waren in der

vorliegenden Arbeit auch in Bezug auf die Bindungsfähigkeit der Spermien starke intra- und

interindividuelle Unterschiede feststellbar, die ebenfalls von BALAO DA SILVA et al. (2013)

beobachtet wurden. Ferner zeigten die Oozyten desselben Koinkubationstropfens deutliche

Unterschiede in der Anzahl gebundener Spermien. Eine individuelle Bindungsbereitschaft der

ZP verschiedener Oozyten wurde schon von FAZELI et al. (1995) beschrieben.

Aufgrund der in der vorliegenden Studie ermittelten deutlichen Bindungsunterschiede

verschieden aufbereiteter Spermien können anhand der Ergebnisse des heterologen

Bindungsassays Aussagen über die mögliche Fertilisationspotenz der Spermien getroffen und

Spermienaufbereitungen für weiterführende Versuche ausgewählt werden. FAZELI et al.

(1995) beschrieben eine Korrelation der Bindungsraten von Spermien an die ZP reifer

Oozyten mit den Fertilitätsindices von Hengsten. Daher ist es denkbar, den heterologen

Bindungsassay mit equinen Spermien zukünftig zur Erhebung von Fertilitäts-Indices für

Hengste anzuwenden.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

86

5.3.1. Einfluss des Inkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-Ionophor

A23187 oder Procain auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien

In Kontrollmedium vorinkubierte Spermien wiesen bessere Bindungsraten auf als

Spermien, bei denen die fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen durch Inkubation in

MW oder durch Zugabe von CaIP oder Procain induziert worden waren. Auch MACÍAS-

GARCÍA et al. (2015) verzeichneten keinen positiven Effekt auf die Bindungsfähigkeit

equiner Spermien durch Präinkubation in Whittens-Medium. Nicht kapazitierte equine

Spermien banden auch an Eileiterexplantate in höheren Raten (LEEMANS et al. 2014).

In der vorliegenden Studie war während der Inkubation in Bikarbonat-haltigem MW ein

initialer Verlust plasmamembranintakter Spermien zu beobachten. Der erhöhte Anteil

plasmamembrangeschädigter Spermien nach Präinkubation in MW begründet möglicherweise

die geringere Bindungsfähigkeit in MW- im Vergleich zu in NK-präinkubierten Spermien.

HARRISON et al. (1993) fanden heraus, dass der Zusatz von Bikarbonat den Anteil

membrangeschädigter Spermien erhöht. RATHI et al. (2001) verzeichneten 55%

membrangeschädigte Spermien nach 5-stündiger Inkubation in Kapazitationsmedium.

Nach den Ergebnissen von MC PARTLIN et al. (2009) sind nur kapazitierte und

hyperaktivierte equine Spermien in der Lage, Oozyten zu befruchten. Auch für andere Spezies

wurde festgestellt, dass nur kapazitierte Spermien die Zona pellucida (ZP) von Oozyten

erkennen und an sie binden können (YANAGIMACHI 1994).

Da in der vorliegenden Studie in NK vorinkubierte, nicht kapazitierte Spermien gute

Bindungsraten aufwiesen, ist zu vermuten, dass während des Bindungsassays Kapazitations-

prozesse im FCS- und BSA-haltigen Koinkubationsmedium stattgefunden haben.

BROMFIELD et al. (2014) und MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) wiesen für die

Serumkomponente BSA und das Analogon Methyl-ß-Cyclodextrin eine fördernde Wirkung

auf die ZP-Bindungsfähigkeit equiner Spermien nach. Ob es sich dabei um eine

kapazitationsbedingte oder unspezifische Wirkung der Komponenten handelt, ist nicht

beschrieben. Nach Zugabe von FBS zu TCM 199 oder Whittens-Medium beobachteten

GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ et al. (2015) eine höhere Kapazitationsrate equiner Spermien als

in BSA supplementierten Medien. In der vorliegenden Arbeit wurde eine gute Verträglichkeit

des Koinkubationsmediums durch eine geschätzte Spermienmotilität von 55% nach 120-

minütiger Koinkubation belegt. In weiterführenden Studien sollte der Einfluss des

DISKUSSION ___________________________________________________________________

87

Koinkubationsmediums auf die fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen besonders unter

Berücksichtigung der einzelnen Serumkomponenten (FCS und BSA) erfolgen.

Der Zusatz von CaIP oder Procain zum MW steigerte die Spermien-Oozyten-Bindungsraten

gegenüber alleiniger Präinkubation in MW nicht. Auch BALAO DA SILVA et al. (2013)

konnten keinen Bindungsunterschied zwischen CaIP behandelten und unbehandelten equinen

Spermien feststellen.

Die geringsten Bindungsraten zeigten in der vorliegenden Studie Spermien, die zur Reduktion

des CaIP- oder Procaingehaltes im Medium zentrifugiert und resuspendiert worden waren.

Dies ist möglicherweise mit einem Verlust hoch motiler Spermien durch schnelles

Aufschwimmen nach der Zentrifugation und dem Verwerfen dieser Spermien mit dem

Medienüberstand zu erklären. Für diese Hypothese spricht der Nachweis hoher

Fertilitätsparameter für besonders hochmotile equine Spermien (Spermienselektion mittels

Dichtegradientenzentrifugation) durch MORATÓ et al. (2013).

Eine Spermienkonzentration von 2.5 x105 Spermien pro Koinkubationstropfen ermöglichte

eine gute Auszählbarkeit der gebundenen Spermien. Die Koinkubationszeit der Gameten

wurde auf zwei Stunden festgelegt und folgte so den Vorgaben von BALAO DA SILVA et al.

(2013), die zeigten, dass die Bindungsraten equiner Spermien sich bei einer

Koinkubationszeit von 1.5 oder 3 Std. in Kapazitationsmedium nicht unterschieden.

5.3.2. Einfluss der Inkubation in Magermilchverdünner auf die Bindungsfähigkeit

equiner Spermien

Die signifikant höchsten Bindungsraten wurden für Spermien verzeichnet, die in

INRA82-Magermilchverdünner transportiert und vorinkubiert waren. Auch COUNTINHO

DA SILVA et al. (2012, 2014) erzielten dreifach erhöhte Bindungsraten mit in (Kenneys-)

Magermilchverdünner inkubierten equinen Spermien an bovine oder equine Oozyten. Als

begünstigenden Faktor identifizierten sie im Verdünner enthaltene Caseine.

Möglicherweise beruhen die erhöhten Bindungsraten in Magermilchverdünner inkubierter

Spermien auf der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in diesem Medium.

Erhöhte Werte mit diesen Spermienreaktionen assoziierter Parameter nach Inkubation in

Magermilchverdünner konnten im Vergleich zu einem BSA- und Bikarbonat-freien Medium

(BROMFIELD et al. 2014) sowie TALP (POMMER et al. 2002) gezeigt werden. Eine

DISKUSSION ___________________________________________________________________

88

Analyse fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen wurde in der vorliegenden Studie nach

Transport und Inkubation in Magermilchverdünner nicht durchgeführt.

Andererseits können die erhöhten Bindungsraten von Spermien dieser Proben auf einer

höheren Spermienviabilität (höherer Anteil motiler, plasmamembran- und akrosomintakter

Spermien) beruhen, die durch die nutritiven und membranprotektiven Komponenten des

Magermilchverdünners begünstigt ist. Daher wäre für weiterführende Untersuchungen zu

überprüfen, ob ein Zusatz von Milchproteinen zum Spermieninkubations- oder Fertilisations-

medium die Bindungs- und Fertilisationsfähigkeit equiner Spermien verbessert.

TABENER et al. (2010) und MORATÓ et al. (2013) zeigten, dass durch

Dichtegradientenzentrifugation vorselektierte Esel- und Pferdespermien mit hoher Viabilität

bovine Oozyten (ohne ZP) besser penetrierten als nichtselektierte Spermien. Eine

Spermienselektion stellt somit eine Möglichkeit der Optimierung von Befruchtungsraten mit

equinen Spermien dar.

Bei Betrachtung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit fiel auf, dass im Zuge der

Bestimmung einer geeigneten Spermienkonzentration für die Koinkubation mit den porzinen

Oozyten (´Vorversuch´, Kap. 4.2.2.) die Bindungsrate der in MW präinkubierten Spermien

deutlich höher war als bei in NK präinkubierten Spermien. Dies war gegenläufig zu den

Ergebnissen der weiteren Bindungsversuche (´Hauptversuch´, Kap. 4.2.4.). Auch die

Bindungsraten insgesamt waren im `Vorversuch` höher als im `Hauptversuch`. Diese

Beobachtung kann ebenfalls durch eine möglicherweise herabgesetzte Spermienviabilität

erklärt werden, da die Transportzeiten für die Spermien des ´Hauptversuches´ doppelt so lang

waren wie für den ´Vorversuch´. In der Folge können die in NK transportierten Proben des

´Hauptversuches` während der 120-minütigen Vorinkubationszeit anfälliger für BSA-

abhängige Plasmamembranschädigungen durch Inkubation in MW gewesen sein (Kap.

5.3.1.). Eine durchflusszytometrische Überprüfung dieser Hypothese ist zu empfehlen.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

89

5.3.3. Einfluss des Spermieninkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-

Ionophor A23187 oder Procain auf die Oozytenmorphologie

Bei 5.4% der beurteilten porzinen Oozyten fielen nach Koinkubation mit den equinen

Spermien Ooplasmaveränderungen auf. Davon ausgenommen waren Oozyten, die mit in

INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierten Spermien koinkubiert wurden. Deutlich

verstärkt war der Anteil der Oozyten mit verändertem Ooplasma nach Koinkubation mit

Spermien, die in CaIP- oder procainhaltigen Medien inkubiert worden waren. Möglicherweise

besteht diesbezüglich ein Zusammenhang mit parthenogenetischen Veränderungen der

Oozyten.

Kalzium-Ionophore sind in der Lage, bei Oozyten ohne die Penetration durch ein Spermium

die Fortsetzung der Meiose zu stimulieren und erste Teilungsstadien zu induzieren (Kap.2.7.).

Diese Eigenschaft wird z.B. zur Erleichterung der Teilungsinduktion nach ICSI genutzt,

indem die sogenannte Oozytenaktivierung induziert wird, die mit einer Erhöhung des

intrazellulären Kalziumgehaltes der Oozyte und der Exozytose kortikaler Granula einhergeht

(LEEMANS et al. 2015b). ALONSO et al. (2015) beschrieben die parthenogenetische

Teilung equiner Oozyten mit einer Rate von 22 % nach Aktivierung durch Spermienextrakte

und das Ionophor Ionomycin. Im Gegensatz dazu konnten HINRICHS et al. (2002) equine

Oozyten nicht mit CaIP aktivieren.

LEEMANS et al. (2015b) fanden heraus, dass durch Procain neben der Hyperaktivierung

equiner Spermien auch die Zytokinese equiner Oozyten mit einer Rate von 60% induziert

wird. Bei den zytokinetisch aktivierten Oozyten war der pH-Wert des Zytoplasmas erhöht und

es bildete sich kein zweiter Polkörper aus. Die Entwicklung setzte sich bis zum 16-

Zellstadium fort. Die Parthenogeneserate von ca. 60% entspricht etwa den Fertilisationsraten

(bewertet anhand der Pronukleusbildung), die von MC PARTLIN et al. (2009) und

AMBRUOSI et al. (2013) für durch Procain hyperaktivierte equine Spermien postuliert

wurden. GOUDET et al. (2016) beschrieben nach Procainzusatz eine Parthenogeneserate von

11% bei equinen Oozyten und eine Fertilisationsrate von 15% (zwei Vorkerne) für

Eselgameten. Diese Daten lassen die Vermutung zu, dass erhebliche Anteile der nach IVF mit

Procain-behandelten Spermien beobachteten frühembryonalen Entwicklungsstufen nicht

durch Fertilisation sondern durch Parthenogenese entstanden sind. Aufgrund dessen waren

diese Mehrzeller nicht in der Lage, sich weiter zu entwickeln und arretierten im 8–16-

DISKUSSION ___________________________________________________________________

90

Zellstadium. Des Weiteren wurden in Procain-aktivierten Oozyten DNA-Fragmentationen

nachgewiesen (LEEMANS et al. 2015b). Diese kommen als mögliche Ursache für die in der

vorliegenden Arbeit gefundenen morphologischen Abweichungen der Oozyten infrage.

Die Reduktion des CaIP- und Procaingehaltes in den Spermiensuspensionen durch

Zentrifugation und Resuspension hatte keinen Einfluss auf den Anteil der Oozyten mit

Ooplasmaveränderungen. Daher wird für weiterführende Untersuchungen eine

Kontrollgruppe empfohlen, in der die Inkubationsmedien ohne Spermien mit oder ohne CaIP

und Procain den Koinkubationstropfen mit den Oozyten zugegeben werden, um

parthenogenetische Prozesse evaluieren zu können.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

91

5.4. Schlussfolgerungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen

Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an porzine Oozyten

Die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien konnten

durch eine 60- bis 120-minütige Inkubation in MW in angefeuchteter Luft induziert werden.

Demnach kann die von MC PARTLIN et al. (2008) beschriebene Inkubationszeit von bis zu

sechs Stunden in Kapazitationsmedien zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei

equinen Spermien deutlich verkürzt werden.

Der Zusatz von 3 µM CaIP erhöhte den intrazellulären Kalziumgehalt präinkubierter equiner

Spermien. Das Abzentrifugieren des CaIP-haltigen Überstandes resultierte in einer

geringfügigen Steigerung der ALH und VCL. Somit zeigten die Spermien Anzeichen der

Hyperaktivierung. Dieser Effekt wurde nach derzeitigem Kenntnisstand zuvor nicht bei

Hengstspermien beobachtet. Procain induzierte in einer Konzentration von 2.5 mM die

Hyperaktivierung der Spermien. Durch Zentrifugation und Resuspension konnten CaIP und

Procain nicht vollständig aus den Medien entfernt werden.

Im heterologen Bindungsassay wurde deutlich, dass equine Spermien grundsätzlich in der

Lage sind, porzine Oozyten zu erkennen und an sie zu binden.

In Magermilchverdünner vorinkubierte Spermien zeigten eine signifikant bessere

Bindungsfähigkeit im Vergleich mit in NK oder MW bzw. mit CaIP oder Procain

aufbereiteten Spermien. 5.4% der porzinen Oozyten wiesen nach Koinkubation mit

vorinkubierten equinen Spermien morphologische Abweichungen auf, insbesondere wenn

CaIP oder Procain zugesetzt worden waren. Bei Koinkubation mit in Magermilchverdünner

vorinkubierten Spermien traten keine Oozytenveränderungen auf.

Diese Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass eine Inkubation in MW und der Zusatz von

CaIP und Procain geeignet sind, die fertilisationsassoziierten Reaktionen bei equinen

Spermien zu induzieren. Diese Induktionsbehandlungen zeigen allerdings nur isoliert an den

Spermien positive fertilisationsassoziierte Effekte, während der Koinkubation mit porzinen

Oozyten resultieren sie in geringen Bindungsraten der Spermien und gehen mit

Ooplasmaveränderungen der Oozyten einher. Aufgrund dessen stellt sich die Frage, ob mit

den angewendeten etablierten Analyseverfahren das Reproduktionspotential der equinen

Spermien tatsächlich ausreichend bewertet werden kann. Ebenso ist zu bezweifeln, dass die

DISKUSSION ___________________________________________________________________

92

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen in Vorbereitung auf die IVF überhaupt

gewinnbringend ist.

MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) stellten für equine Spermien die Gültigkeit der für

Säugetierspermien allgemein etablierten Erkenntnisse über die Wirkung der üblicherweise in

Inkubationsmedien verwendeten Komponenten Bikarbonat, Kalzium und BSA auf die

Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in Frage. Sie vermuteten eine

speziesspezifische Regulation der Kapazitationsprozesse equiner Spermien, weshalb

standardmäßig verwendete Kapazitationsmedien diese Prozesse nicht induzieren können.

Diese Zweifel wurden von den Beobachtungen von GONZALEZ-FERNANDEZ et al. (2012)

gestützt. Sie konnten zeigen, dass die kapazitationsassoziierte Protein-Tyrosin-

Phosphorylierung nicht, wie von MC PARTLIN et al. (2008) postuliert, vom BSA-,

Bikarbonat- und Kalziumgehalt, sondern allein vom pH-Wert im Medium abhängt und BSA

und Kalzium die PTP bei physiologischen pH-Werten sogar inhibieren. Folglich äußerten sie

Zweifel an der grundsätzlichen Eignung der PTP als Kapazitationsparameter, auf den sich die

meisten Untersuchungen zur Kapazitation equiner Spermien stützen.

Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Differenz zwischen dem Ausmaß der Induktion

fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen und der Oozytenbindungsrate bei equinen

Spermien führt zu der Empfehlung, weiterführende Untersuchungen weniger auf die

Erstellung von Protokollen zur Vorbereitung der Gameten auf die Fertilisation zu richten,

sondern den Fokus auf die Erfassung fertilisationsassoziierter Veränderungen von Spermien

und Oozyten während der Koinkubation, Bindung und Fertilisation zu legen. So können

möglicherweise weitere Erkenntnisse über die speziellen Anforderungen equiner Gameten an

In-Vitro-Bedingungen gewonnen und darauf abgestimmte IVF-Protokolle entwickelt werden.

DISKUSSION ___________________________________________________________________

93

5.5. In-Vitro-Fertilisation equiner Oozyten

In der vorliegenden Arbeit wurden fertilisationsassoziierte Prozesse im Wesentlichen

bei den Spermien beleuchtet, während die Seite der Oozyten diesbezüglich weniger

Beachtung fand. Daher werden im Folgenden noch einige Aspekte der IVF mit Blick auf die

equine Oozyte angeführt.

Wie eingangs erwähnt, ist die In-Vitro-Fertilisation beim Pferd eine noch nicht routinemäßig

durchgeführte Reproduktionstechnik mit sehr variablen Erfolgsraten. Seit 1992 (PALMER et

al. 1991; BÈZARD 1992) ist keine Geburt eines mittels IVF (ausgenommen ICSI)

entstandenen, lebenden Fohlens bekannt geworden. Darüber hinaus wurde seitdem kein

Protokoll entwickelt, welches die equinen Gameten so auf die IVF vorbereitet, dass sich

entstandene Embryonen über das 16-Zellstadium weiterentwickelten.

Demnach wird deutlich, dass sowohl die In-Vitro-Vorbereitung der Gameten auf die

Fertilisation mit Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen und Oozytenreifung

als auch die Fertilisation selbst und die nachfolgende In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler

Stadien unvollständig oder fehlerhaft verliefen. IVF-Raten waren nach Anwendung

erfolgversprechender Protokolle bisher kaum reproduzierbar. Dies war sowohl der

unterschiedlichen Vorbereitung der Gameten auf die Fertilisation, als auch in der inter- und

intraindividuell sehr unterschiedlichen Fertilisationspotenz der aufbereiteten Gameten

geschuldet. Im Vergleich erreichten bei der In-Vitro-Produktion boviner Embryonen

durchschnittlich 40% das Blastozystenstadium (LONERGAN u. FAIR 2008).

In Bezug auf die equine IVF wird immer wieder diskutiert, dass die Penetration der Zona

pellucida durch die Spermien einen der herausforderndsten Verfahrensschritte darstellt. So

konnten nach partieller Dissektion oder Säurebehandlung der ZP gute Fertilisationsraten und

sogar Polyspermie nachgewiesen werden (CHOI et al. 1993). Auch durch ZP-Verdau mit

Pronase kann das Eindringen von Spermien erleichtert werden (TABENER et al. 2010).

MUGNIER et al. (2009a,b) stellten keine Penetration equiner Spermien durch die intakte ZP

in vitro maturierter equiner Oozyten fest, wohingegen ZP-freie Oozyten penetriert wurden.

Sie vermuteten, dass es bei der IVM equiner Oozyten zu einem frühzeitigen `Zona-hardening´

kommt, welches das Eindringen der Spermien verhinderte. Dafür spricht auch, dass unreife

und in vivo maturierte equine Oozyten eine dünnere ZP und eine andere Oberflächenstruktur

aufweisen als in vitro maturierte Eizellen (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al. 2014).

DISKUSSION ___________________________________________________________________

94

Dagegen spricht jedoch, dass in vitro maturierte equine Oozyten in den Eileitern besamter

Stuten in vivo befruchtet wurden (HINRICHS et al. 2002).

Die Methode der Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI), bei der ein einzelnes

Spermium direkt in die Oozyte injiziert wird und auf diese Weise sowohl das Hindernis der

ZP als auch die Notwendigkeit der Hyperaktivierung und Akrosomreaktion der Spermien

umgangen wird, wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen als Positivkontrolle ihres IVF-

Protokolls eingesetzt (SESSION-BRASNAHAN et al. 2014; LEEMANS et al. 2015b). Durch

ICSI erzielte Befruchtungsraten von 33% (Blastozystenstadium aus in vitro maturierten

Oozyten) (JACOBSON et al. 2010) und eine Trächtigkeitsrate von 62% (HINRICHS 2012)

zeigen, dass zumindest die Verfahrensschritte der Gametengewinnung und –aufbereitung

sowie der In-Vitro-Maturation der Oozyten und der In-Vitro-Kultivierung der Blastozysten

erfolgreich abliefen. ICSI ist mittlerweile ein etabliertes Verfahren, das allerdings nur mit

hohem technischen Aufwand durch spezialisiertes Personal durchgeführt werden kann.

SESSIONS-BRESNAHAN et al. (2014) konnten nachweisen, dass die perivitelline Injektion

(PVI) equiner Spermien in bovine Oozyten nicht zur Fertilisation führte und somit neben der

Unfähigkeit equiner Spermien eine ZP zu durchdringen weitere Faktoren für die schlechten

IVF-Raten beim Pferd verantwortlich sein dürften. So vermuteten MUGNIER et al. (2009b),

dass auch das Oolemm der equinen Oozyte ein Hindernis für die Spermien darstellen kann.

Trotz der bisher schlechten Erfolgsraten ist die klassische IVF ein erstrebenswertes Verfahren

der assistierten Reproduktion, da es Lösungsansätze für Fertilitätsprobleme auf der

männlichen und weiblichen Seite bereithält. So können Embryonen aus Stuten erzeugt

werden, bei denen aufgrund von Erkrankungen der Ovarien, der Eileiter oder des Uterus eine

Befruchtung nicht möglich ist, deren Oozyten nicht ausreichend heranreifen bzw. nicht

ovuliert werden oder die zum Austragen eines Fohlens nicht mehr in der Lage sind. Zudem

kann die IVF mit quantitativ und qualitativ eingeschränkten Spermaproben erfolgen. IVF-

Raten können zudem zur Beurteilung der Fertilisationspotenz der Spermien eines bestimmten

Hengstes herangezogen werden. Außerdem ist das Verfahren für die Arterhaltung gefährdeter

Equiden (v.a Zebra- und Wildeselarten), für die gezielte Anpaarung besonders wertvoller

Elterntiere und nicht zuletzt für die Erforschung der Physiologie, Kultivierung und

Konservierung equiner Embryonen sinnvoll einsetzbar, da Embryonen in großer Anzahl

erzeugt werden können.

ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________________________

95

6 ZUSAMMENFASSUNG

Janina Rau (2016)


Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) wird beim Pferd mit mäßigem Erfolg durchgeführt.

Abgesehen von einem Fall in den frühen neunziger Jahren wurde bisher kein durch IVF

entstandenes Fohlen geboren. Mit den zur Verfügung stehenden Protokollen zur Vorbereitung

der equinen Spermien und Oozyten auf die IVF konnten bisher keine frühembryonalen

Stadien erzeugt werden, die sich über das 16-Zellstadium hinaus entwickelten.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit der

fertilisationsassoziierten Reaktionen Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion

bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen. In Bezug darauf wurde die Effektivität der

Inkubation equiner Spermien in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen

modifizierten Whittens-Medium (MW) evaluiert. Zudem wurde untersucht, ob die Induktion

der Spermienreaktionen nach Vorinkubation in MW durch die Reagenzien Kalzium-Ionophor

A23187 (CaIP) und Procain verstärkt werden kann. Zur Beurteilung der

fertilisationsassoziierten Reaktionen wurden mittels computerassistierter Spermienanalyse

Motilitätsparameter erfasst, wobei die Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (VCL) und

die Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (ALH) der Spermien als Maße für die

hyperaktivierte Bewegung herangezogen wurden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden

nach Anfärbung mit spezifischen Farbstoffen der intrazelluläre Kalziumgehalt (Fluo-3) sowie

die Plasma- (Propidium-Iodid) und Akrosommembranintegrität (FITC-PNA) als Parameter

für die Kapazitation, Viabilität und Akrosomreaktion der Spermien durchflusszytometrisch

analysiert. Weiterhin wurde ein heterologer Bindungsassay mit vorinkubierten equinen

Spermien und in vitro maturierten porzinen Oozyten durchgeführt. Dafür wurden zunächst

eine angemessene Spermienkonzentration und Inkubationszeit für die Koinkubation der

Gameten bestimmt. Darauf wurde der Einfluss der Präinkubation equiner Spermien in

Magermilchverdünner, Kontroll- und modifiziertem Whittens-Medium sowie die

Auswirkungen der Spermienbehandlung mit CaIP und Procain auf die Oozyten-

Bindungsfähigkeit der equinen Spermien und auf die Oozytenmorphologie untersucht.


96

Die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien konnten nach

Inkubation für 60–120 min in MW in angefeuchteter Luft bei 37°C induziert werden. Dies

war ersichtlich an einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, gesteigerten VCL- und

ALH-Werten sowie einer Verminderung des Anteils akrosomintakter Spermien. Im Vergleich

wurden die fertilisationsassoziierten Reaktionen durch die Inkubation der Spermien in einem

Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA nicht induziert.

Die Zugabe von CaIP zu Spermien, die 60 min in MW präinkubiert worden waren, resultierte

in einer kapazitationsassoziierten Steigerung des intrazellulären Kalziumgehaltes mit einem

Maximum bei einer CaIP-Konzentration von 3 µM. Nach Anwendung eines Zentrifugations-

verfahrens zur Reduktion des Kalzium-Ionophorgehaltes in der Spermiensuspension zeigten

die Spermien Anzeichen hyperaktivierter Bewegung. Die Zugabe von Procain förderte die

Hyperaktivierung deutlich mit einem maximalen Effekt bei einer Konzentration von 2.5–5

mM.

In dem heterologen Bindungsassay konnte gezeigt werden, dass die equinen Spermien in der

Lage sind, an in vitro maturierte porzine Oozyten zu binden. Für diesen Versuch wurden

2.5×105

Spermien mit 20 Oozyten für 120 min koinkubiert. Spermien, die vor der

Koinkubation eine Behandlung zur Induktion der fertilisationsassoziierten Reaktionen

durchlaufen hatten, wiesen unabhängig von einer Reduktion des CaIP- oder Procaingehaltes

in den Spermiensuspensionen durch Zentrifugation und Resuspension eine eingeschränkte

Bindungsfähigkeit an den Oozyten auf. Die besten Bindungsraten wurden mit Spermien

erreicht, die zuvor in Magermilchverdünner präinkubiert worden waren. Nach Koinkubation

mit equinen Spermien, die in einem anderen Medium als Magermilchverdünner vorinkubiert

worden waren und denen insbesondere CaIP oder Procain zugesetzt wurde, wies ein erhöhter

Anteil (bis 8.5%) der porzinen Oozyten morphologische Abweichungen auf.

Unabhängig von der Induktionsbehandlung war eine starke inter- und intraindividuelle

Variation sowohl im zeitlichen Verlauf als auch in dem Ausmaß der fertilisationsassoziierten

Reaktionen equiner Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an die Zona pellucida porziner

Oozyten zu beobachten.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die fertilisationsassoziierten Reaktionen equiner

Spermien in vitro durch Inkubation in modifiziertem Whittens-Medium induziert werden


97

können, nicht aber in einem Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA. Auch durch

Zugabe von Procain und Kalzium-Ionophor A23187 zu präinkubierten equinen Spermien

können die Kapazitation und Hyperaktivierung, nicht aber die Akrosomreaktion induziert

werden. Der heterologe Bindungsassay ermöglicht die Beurteilung der Auswirkungen

unterschiedlicher Spermienbehandlungen sowohl auf die Bindungsfähigkeit der Spermien als

auch auf die Oozytenmorphologie. Dies kann zur Beurteilung der Fertilisationspotenz equiner

Spermien im Hinblick auf die Entwicklung von IVF-Protokollen herangezogen werden.

SUMMARY ___________________________________________________________________

98

7 SUMMARY

Janina Rau (2016)

Induction of fertilization-associated reactions in equine spermatozoa in vitro

In horses, no great successes have been obtained with in vitro fertilization (IVF). Since

the early nineties no foal originating from IVF has been born. With the current protocols for

preparing equine spermatozoa and oocytes for IVF, early embryonic development typically

arrests before the 16-cell stage.

The aim of this study was to examine induction of the fertilization-associated reactions

capacitation, hyperactivation and acrosome reaction in equine sperm in vitro. The efficacy of

incubating sperm in modified Whittens medium (MW) containing bicarbonate, calcium and

BSA was evaluated. Special emphasis was on effects of addition of calcium ionophore

A23187 (CaIP) and procaine after pre-incubation of sperm in MW, to further induce

fertilization-associated reactions in sperm. In order to study fertilization-associated reactions

computer assisted sperm analysis was used for determining sperm motility characteristics,

including the curved line velocity (VCL) and amplitude of lateral head displacement (ALH)

related to hyperactivated motility. Using specific dyes and flow cytometry the intracellular

calcium content of sperm (fluo-3) as well as plasma (propidium-iodide) and acrosomal

membrane integrity (FITC-PNA) were determined as indicators for sperm capacitation,

viability and the acrosome reaction. Furthermore, a heterologous sperm-zona-binding assay

was performed, using induced equine spermatozoa and in vitro matured porcine oocytes.

First, a suitable sperm concentration and incubation time for co-incubation studies were

determined. Then, effects of pre-incubating sperm in skim milk extender, control or MW and

effects of CaIP and procaine treatment were determined on the number of sperm bound per

oocyte and oocyte morphology.

Incubation in MW in humidified air at 37°C resulted in initiation of stallion sperm

capacitation, hyperactivated motility and the acrosome reaction in vitro within 60–120 min.

This was evident as an increase in the intracellular calcium content, increased VCL and ALH

values and a decrease in acrosomal membrane intactness, respectively. Incubation in medium

SUMMARY ___________________________________________________________________

99

lacking bicarbonate, calcium and BSA did not result in initiation of fertilization-associated

reactions.

Addition of CaIP after pre-incubating sperm for 60 min in MW resulted in an additional

increase in the intracellular calcium content associated with sperm capacitation, exhibiting a

maximum when using a concentration of 3 µM. Sperm exhibited signs of hyperactivation

after subsequent removal of CaIP by centrifugation. Addition of procain induced a higher

level of hyperactivation, exhibiting a maximum effect when adding 2.5−5 mM.

In a heterologous sperm-zona binding assay equine sperm were able to bind in vitro matured

porcine oocytes. For these assays 2.5×105

sperm were coincubated with 20 oocytes for 120

min. Sperm treated for induction of fertilization-associated reactions prior to coincubation

showed poor binding to oocytes, irrespective of removal of CaIP or procaine via

centrifugation. Sperm pre-incubated in skim milk extender prior to binding assays showed the

highest rates of binding to oocytes. Increased numbers of oocytes (up to 8.5%) with abnormal

morphology were observed after coincubation with sperm treated in medium different from

skim milk extender, especially in case of presence of CaIP and procaine.

It was found that there was great inter- and intraindividual variation, both in the timing and

extent of fertilization-associated reactions in equine sperm and sperm-zona binding capacity,

irrespective of treatment with inducers.

In conclusion fertilization-associated reactions in equine sperm can be induced in vitro by

incubation in modified Whittens medium, but not in medium lacking BSA, bicarbonate and

calcium. The inducers calcium-ionophore A23187 and procaine can be added after pre-

incubation to further increase levels of sperm capacitation and hyperactive motility but not the

acrosome reaction.

Heterologous sperm-zona-binding assays can be used to study effects of sperm treatments on

the oocyte-binding capacity as well as oocyte morphology. This might be helpful for testing

fertilization potential of equine sperm with respect to development of IVF protocols.

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ________________________________________________________________

100

8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 3.1.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur

Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien im Verlauf der 240-

minütigen Inkubation in Kontrollmedium (NK) oder Kapazitationsmedium (MW) ……….. 42


Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach

Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain in unterschiedlichen Konzentrationen

……………………………………………………………………………………………….. 43


Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach

Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain und nachfolgender Anwendung eines

Zentrifugationsverfahrens zur Verringerung des Reagenziengehaltes im Medium .………... 45

Abbildung 3.4.: Stereomikroskopische Bilder porziner Oozyten …………...…………….... 51


Erfassung der Motilitätsparameter, des pH-Wertes sowie zur Beurteilung von Aussehen und

Geruch der Proben im Verlauf der 240-minütigen Inkubation präinkubierter equiner Spermien

in offenen oder geschlossenen Röhrchen ………..………………………………………….. 54

Abbildung 3.6.: Schematische Darstellung der Objektträger zur fluoreszenzmikroskopischen

Auszählung der an der Zona pellucida in vitro maturierter porziner Oozyten gebundenen

equinen Spermien ……..……………..……………………………………………………… 56

Abbildung 3.7.: Schematische Darstellung der Gametenaufbereitung, Inkubations- und

Verfahrensschritte sowie der Analysemethode für den heterologen Bindungsassay mit equinen

Spermien und porzinen Oozyten ……………………….…………………………………… 57

Abbildung 4.1.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität, des

akrosomalen Status und des intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien während der

240-minütigen Inkubation in Kapazitationsmedium (MW) oder Kontrollmedium (NK) ..… 61

Abbildung 4.2.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität und des

intrazellulären Kalzium-gehaltes equiner Spermien nach 60-minütiger Präinkubation in

Kapazitationsmedium (MW) und nachfolgendem Zusatz von CaIP oder Procain für 30 min in

unterschiedlichen Konzentrationen ……………………………………………...………….. 63

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ________________________________________________________________

101

Abbildung 4.3.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Akrosomintegrität und des

intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien nach Anwendung eines

Zentrifugationsverfahrens im Anschluss an eine 60-minütige Präinkubation in

Kapazitationsmedium (MW) und Zusatz von 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM Procain für 10 min

……………………………………………………………………………………………..… 66

Abbildung 4.4: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten

nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien ……………………………………..….. 67

Abbildung 4.5.: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten

nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich konzentrierten equinen Spermien

(Phasenkontrastmikroskopie nach HOECHST-Färbung) ……...………………………….... 70

Abbildung 4.6.: Anteil progressiv motiler Spermien und pH-Wert in Spermiensuspensionen

mit unterschiedlicher Konzentration bei geschlossener und offener Inkubation in

Kapazitationsmedium (MW) oder Kontrollmedium (NK) über 240 min …...……………… 72

Abbildung 4.7.:

A: Anzahl gebundener equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten nach 120 min

Koinkubation.

B: Spermienbindungsraten an in vitro maturierte porzine Oozyten für zwei verschiedene

Ejakulate desselben Hengstes ………………...…………………………………………….. 74

Abbildung 4.8.: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten

mit verändertem Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien

(Phasenkontrast-Dunkelfeld nach HOECHST-Färbung) .…………………………………... 75

Abbildung 4.9.: Anteil (%) in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem Ooplasma

nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien …………76

TABELLENVERZEICHNIS ___________________________________________________________________

102

9 TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 2.1.: Zusammensetzung von Inkubationsmedien zur Induktion

fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro ...…………………………………….. 25

Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden

Spermien ………………………………………………………………………………… 37-39

Tabelle 3.1.: Zusammensetzung des Maturationsmediums nach TIEDEMANN (2015);

Mengenangaben für 1 ml Medium ……….…………………………………………………. 50

Tabelle 4.1.: Mittlere Anzahl der gebundenen equinen Spermien pro in vitro gereifter

Schweineoozyte in Abhängigkeit von der Spermienkonzentration und dem Präinkubations-

medium ………..…………………………………………………………………………….. 69

Tabelle 4.2.: Anzahl und prozentualer Anteil in vitro maturierter porziner Oozyten mit

verändertem Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen

Spermien ………………………………………….………………………………………… 76

LITERATURVERZEICHNIS ___________________________________________________________________

103

10 LITERATURVERZEICHNIS

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DANKSAGUNG

Das zweijährige Lebensabschnittsprojekt „Doktorarbeit“ ist nun abgeschlossen. Ich bin

glücklich, dass mich auch auf diesem Weg Menschen begleitet haben, die auf verschiedenste

Weise zum Gelingen dieses Projektes beigetragen haben.

Ein besonderer Dank gilt:

Prof. Dr. Harald Sieme: für die Überlassung dieses interessanten und herausfordernden

Dissertationsthemas, für produktive und auch amüsante Gespräche mit Ratschlägen für alle

Lebenslagen, für all die fachliche Unterstützung sowie die sowohl wissenschaftliche als auch

klinische Förderung. Ich freue mich auf Weiteres.

Jet Oldenhof: für das Weisen des richtigen Weges, die gute Zusammenarbeit, die kompetente

und geduldige Beantwortung all meiner Fragen sowie für nette Worte und Nervennahrung

wenn sie gebraucht wurden.

Prof. Dr. J. Hahn: für die finanzielle Unterstützung, den wissenschaftlichen und persönlichen

Austausch sowie für motivierende und zielgerichtete Ratschläge, die das Erreichen meiner

Ziele erleichterten.

Der Pferdeabteilung: Franzi, für alles was du mir beigebracht hast und gutes Teamwork mit

Power und Glitzerstaub. Hanna, Ana, Judith und Rahel für die Unterstützung im Labor und

mit den Gäulen sowie die gute Stimmung. Danni, für die Hilfe mit den „Schnuffis“ und einer

Tages-Überdosis an guter Laune. Dr. Karl Rohn für den Weg durch den Statistikwald.

Dank geht ebenfalls an das Landgestüt Celle für die Bereitstellung der Samenproben und

(re-)produktive Zusammenarbeit sowie an das FLI-Mariensee (insbes. AG Prof. Dr. D.

Rath) für die kompetente Zusammenarbeit und Hilfestellung.

Meinen lieben Freunden und Geschwistern: für ein Leben außerhalb der Repro, ohne euch

wäre es nichts. Und ja, vielleicht erscheint auch mal ein Artikel von mir in der „Wendy“.

Toni: Danke für all das Verständnis für die dir so fremden Dinge, die bedingungslose

Unterstützung in allem und dein großes Herz für mich.

Meiner Familie: Wenn die Wurzeln tief sind, braucht man den Wind nicht zu fürchten.

Mama und Papa, Danke für die Wurzeln und Flügel die ihr uns gebt.

Tierärztliche Hochschule Hannover · 2019-01-10 · Tierärztliche Hochschule Hannover Induktion...

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