Tierärztliche Hochschule Hannover · Epilepsie heilenden Pharmakotherapien. Auch im Hinblick...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Zerebrale Energie-Stoffwechsel-Veränderungen

im Kontext der Epileptogenese und als

therapeutisches Target zur Epilepsie-Prävention

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Ina Leiter Heidelberg

Hannover 2017

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Marion Bankstahl

Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. Marion Bankstahl

2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Karl-Heinz Esser

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2017

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Promotionsförderung der

Konrad-Adenauer-Stiftung gefördert.

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................................................................... 1

2 Literaturübersicht .................................................................................................. 3

2.1. Epilepsie .......................................................................................................... 3

2.1.1 Ätiologie, Klassifizierung und Bedeutung ................................................... 3

2.1.2 Temporallappenepilepsie ........................................................................... 6

2.2 Epileptogenese und Konzepte für Antiepileptogenese ...................................... 7

2.2.1 Definition und Bedeutung ........................................................................... 7

2.2.2 Tiermodelle für Epileptogenese .................................................................. 8

2.2.3 Energiestoffwechsel des Gehirns ............................................................. 11

2.2.4 Veränderungen während der Epileptogenese .......................................... 16

2.2.4.1 Glukosestoffwechselveränderungen ...................................................... 16

2.2.4.2 Blut-Hirn-Schranken-Veränderungen .................................................... 18

2.2.4.3 Inflammation .......................................................................................... 19

2.2.5 Konzepte für Antiepileptogenese .............................................................. 21

2.2.5.1 Energiestoffwechsel-beeinflussende Therapien chronischer Epilepsie . 22

2.2.5.2 Wirkungsweise der ketogenen Diät ....................................................... 23

2.2.5.3 Wirkungsweisen der 2-Desoxy-D-Glukose ............................................ 26

2.3 Positronen-Emissionstomographie und Epilepsie ........................................... 28

2.3.1 Prinzip und Bedeutung der Positronen-Emissionstomographie ................ 28

2.3.2 [18F]FDG und zerebraler Glukosemetabolismus ....................................... 30

2.3.3 [18F]GE-180 und TSPO ............................................................................. 32

2.3.4 [18F]Flumazenil und zentraler Benzodiazepinrezeptor .............................. 34

3 Ziele der Arbeit .................................................................................................... 36

4 Material und Methoden ........................................................................................ 38

4.1 Versuchstiere und Haltung .............................................................................. 38

4.2 Manuskript 1: Untersuchungen im kornealen Kindlingmodell .......................... 39

4.2.1 Corneales Kindling ................................................................................... 40

4.2.2 2-Desoxy-D-Glukose-Behandlung ............................................................ 41

4.2.3 [18F]FDG-PET und Datenauswertung ....................................................... 42

4.2.4 Immunhistochemische Färbungen GLUT-1, IBA-1, GFAP und Fluoro-Jade-

C-Färbung ......................................................................................................... 44

4.2.5. Statistik .................................................................................................... 47

4.3 Manuskript 2: Untersuchungen im Pilocarpinmodell ....................................... 47

4.3.1 Induktion des Status epilepticus ............................................................... 47

4.3.2 Magnetresonanztomographie ................................................................... 48

4.3.3 FITC-Albumin ........................................................................................... 48

4.3.4 Immunfluoreszenzfärbungen .................................................................... 50

4.3.5 Beurteilung der Neurodegeneration .......................................................... 50

4.3.6 Statistik ..................................................................................................... 51

4.4 Manuskript 3: Untersuchungen im intrahippokampalen Kainatmodell ............. 51

4.4.1 Intrahippokampale Kainatinjektion ............................................................ 52

4.4.2 Fütterung der ketogenen Diät ................................................................... 53

4.4.3 PET und Datenauswertung ...................................................................... 54

4.4.4 Irwin-Screen ............................................................................................. 55

4.4.5 Elektrodenimplantation ............................................................................. 55

4.4.6 Elektroenzephalographie, Video-Überwachung und Datenauswertung .... 56

4.4.7 ActiMot -Test ............................................................................................ 57

4.4.8 Statistik ..................................................................................................... 57

5 Manuskripte ......................................................................................................... 58

5.1 Attenuation of epileptogenesis by 2-deoxy-d-glucose treatment is reflected in 2-

deoxy-2-[18F]fluoroglucose brain kinetics .............................................................. 58

5.2 Blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis is associated with

rapid remodeling of the neurovascular unit ........................................................... 91

5.3 Pronounced and long-term disease-modifying effects of transient ketogenic diet

in the intrahippocampal kainate mouse model of epileptogenesis: a longitudinal

theranostic study ................................................................................................. 132

6 Diskussion ......................................................................................................... 169

6.1 Reflexion zur Methodik der Arbeit ................................................................. 169

6.2 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen während der Epileptogenese ........... 174

6.2.1 [18F]FDG-PET-Daten aus zwei Tiermodellen .......................................... 174

6.2.2 Befunde zum Kontext der Epileptogenese ............................................. 177

6.3 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen als therapeutisches Target .............. 186

6.3.1 Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät auf den zerebralen

Glukose-Stoffwechsel ...................................................................................... 186

6.3.2 Effekte der 2-Desoxy-D-Glukose und der ketogenen Diät auf

Epileptogenese und Inflammation ................................................................... 189

6.4 Schlussfolgerungen und Ausblick ................................................................. 191

7 Literaturverzeichnis........................................................................................... 193

8 Zusammenfassung ............................................................................................ 228

9 Summary ............................................................................................................ 230

10 Publikationen ................................................................................................... 232

11 Anhang ............................................................................................................. 234

11.1 Graphische Darstellung von Ergebnissen aus nicht in die Manuskripte

aufgenommenen Teilstudien ............................................................................... 234

11.2 Immunhistochemische Färbungen .............................................................. 242

12 Danksagung ..................................................................................................... 248

1 Einleitung

1

1 Einleitung

Epilepsie ist eine seit dem Altertum bekannte neurologische Erkrankung, die schon

von Hippokrates beschrieben wurde (Breitenfeld et al., 2014). Ihr liegt eine

Prädisposition zur Entwicklung epileptischer Anfälle zugrunde (Fisher et al., 2014). Die

spontan auftretenden, wiederkehrenden Anfälle entspringen exzessiven elektrischen

Entladungen von Neuronengruppen (WHO, 2017). Schätzungsweise haben allein in

Europa etwa sechs Millionen Menschen Epilepsie (Baulac et al., 2015). Mit den derzeit

verfügbaren Antiepileptika können allerdings nur in etwa zwei Drittel der Patienten

effektiv Anfälle unterdrückt werden (Brodie et al., 2012, Löscher, 2016).

Nach Informationen der Weltgesundheitsorganisation liegt in 60% der Fälle eine

idiopathische Epilepsie vor (WHO, 2017). Die Gruppe der symptomatischen Epilepsien

hat vielfältige Ätiologien, vor allem Gehirntumoren, gefolgt von subarachnoidalen

Blutungen, traumatischen Gehirnverletzungen, Encephalitiden und weiteren Ursachen

(Herman, 2002, Lowenstein, 2009). Eine typischerweise durch einen solchen

Gehirninsult ausgelöste Form der Epilepsie ist die mesiale Temporallappenepilepsie

(French et al., 1993), die zu den häufigsten Ausprägungen der Epilepsie im Menschen

gehört (Engel, 1996). Ein Insult des Gehirns führt allerdings nur bei einem Teil der

Patienten auch zur Entwicklung einer Epilepsie. Dieser als Epileptogenese

bezeichnete Vorgang besteht aus einer Kaskade von strukturellen und funktionellen

Veränderungen im Gehirn, die nach einer oft vorhandenen symptomlosen

sogenannten Latenzphase schließlich zu klinisch sichtbaren spontanen

wiederkehrenden Anfällen führen (Löscher und Brandt, 2010, Pitkänen et al., 2016).

Es fehlen bislang entsprechende Biomarker, um Risikopatienten für eine

Epileptogenese zu identifizieren. Bisher gibt es zudem keine präventiven oder

Epilepsie heilenden Pharmakotherapien. Auch im Hinblick darauf, dass die mesiale

Temporallappenepilepsie die häufigste pharmakoresistente partielle Epilepsie

darstellt, mit einem Versagen der medikamentösen Therapie in 75% der Patienten

(Spencer, 2002), besteht hier weiterer Forschungsbedarf.

1 Einleitung

2

Auf der Suche nach einer epilepsie-präventiven, also antiepileptogenen

Therapie, die in diesem sich bietenden Zeitfenster zwischen einem epileptogenen

Gehirninsult und den ersten klinischen Anfällen eingesetzt werden müsste, stellt sich

grundsätzlich die Frage nach ursächlichen Mechanismen. Der Fokus dieser Arbeit liegt

hierbei zum einen auf dem zerebralen Glukosestoffwechsel. Dass Veränderungen

desselben eine wichtige Rolle bei Epilepsie spielen, lassen erfolgreiche diätetische

Therapien einer bestehenden Epilepsie, wie die ketogene Diät, vermuten (Martin et al.,

2016, Felton und Cervenka, 2015). Unter Verwendung des Radiotracers 2-[18F]Fluoro-

desoxy-D-Glukose ([18F]FDG) mit Positronen-Emissionstomographie (PET) wurden in

ersten präklinischen Untersuchungen mit verschiedenen Tiermodellen Anfalls-

assoziierte hypermetabolische Veränderungen gefunden (Mirrione et al., 2006,

Mirrione et al., 2007, Kornblum et al., 2000), während schon ein bis zwei Tage später

und chronisch eher ein Hypometabolismus in Epilepsie-assoziierten Gehirnregionen

beobachtet wurde (Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012). Die [18F]FDG-PET wird beim

Patienten wegen ihrer Stärke, einen Anfallsherd anhand des interiktal vorkommenden

Hypometabolismus darzustellen, in der prächirurgischen Evaluation genutzt

(Theodore, 2017), wobei sie auch bei einem negativen Befund aus der Untersuchung

mit Magnetresonanztomographie (MRT) helfen kann. Zum anderen untersucht diese

Arbeit weitere Mechanismen der Epileptogenese, indem sie den Glukosestoffwechsel

im Kontext mit Entzündungsvorgängen und Störungen der Blut-Hirn-Schranke

untersucht. Entzündungen mit Aktivierung von Microglia und Astrozyten können durch

den initialen Gehirninsult ausgelöst werden, wobei eine verstärkte Expression

proinflammatorischer Moleküle zu einer veränderten neuronalen Erregbarkeit und

beeinträchtigter Kommunikation zwischen Neuronen und Glia (Vezzani et al., 2013)

und auch Beeinträchtigungen der Blut-Hirn-Schranke führen kann (Yu et al., 2013).

Eine gesteigerte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke kann wiederum ebenfalls

prokonvulsiv wirken (van Vliet et al., 2007).

In dieser Arbeit wurde neben immunhistochemischen Methoden,

Elektroenzephalographie und MRT schwerpunktmäßig die Positronen-

Emissionstomographie mit verschiedenen Radiotracern verwendet. Sie bietet die

Möglichkeit, verschiedenste Stoffwechselaspekte im zeitlichen Verlauf der

2 Literaturübersicht

3

Epileptogenese in vivo im selben Tier zu untersuchen. Ließe sich mittels eines oder

einer Kombination geeigneter PET-Tracer ein generelles Muster der Epileptogenese

in einem geeigneten Modell evaluieren, wäre diese Technik als potentieller Biomarker

in die klinische Forschung translatierbar.

Zwei Strategien zur Beeinflussung des zerebralen Glukosestoffwechsels

während der Epileptogenese wurden in dieser Arbeit als potentielle antiepileptogene

Therapiestrategien untersucht: Der pharmakologische Ansatz dieser Arbeit besteht in

der Gabe von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) während der Epileptogenese. Gegenwärtig

in der präklinischen Entwicklung zur Therapie einer chronischen Epilepsie (Bialer et

al., 2015), finden sich erste Hinweise auf eine potentielle antiepileptogene Wirkung

dieses Glukoseanalogons (Sutula und Franzoso, 2008, Garriga-Canut et al., 2006,

Yang et al., 2013). Die in dieser Arbeit verfolgte diätetische Strategie besteht in der

Verabreichung einer ketogenen Diät direkt nach der Induktion einer Epileptogenese.

Beide Methoden manipulieren den Energiestoffwechsel, aber über verschiedene

Mechanismen. Viele Details sind beschrieben worden, dennoch ist ihre Wirkungsweise

bisher unzureichend charakterisiert.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung Veränderungen des

zerebralen Glukosemetabolismus im Verlauf der Epileptogenese, auch im Kontext mit

epileptogenen Mechanismen, und der Eignung einer therapeutischen Beeinflussung

des Glukosestoffwechsels zur Prävention oder Abschwächung der Epileptogenese in

verschiedenen Tiermodelllen.


2.1. Epilepsie

2.1.1 Ätiologie, Klassifizierung und Bedeutung

In den Industrieländern liegt die Lebenszeitprävalenz für Epilepsie mit 5,8 von 1000

Personen deutlich niedriger als in den Entwicklungsländern mit 15,4 von 1000 (Ngugi

et al., 2010). Beim Hund wird die Prävalenz derzeit mit 0,62% - 0,75% angegeben


4

(Kearsley-Fleet et al., 2013, Heske et al., 2014). Damit ist Epilepsie weltweit eine der

häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Mensch und Hund. Epilepsie ist eine

Erkrankung des Gehirns unterschiedlichster Genese. Laut Definition ist sie

charakterisiert durch eine dauerhafte Prädisposition zur Generierung epileptischer

Anfälle, wie auch durch ihre neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und

sozialen Auswirkungen (Fisher et al., 2014). Zur Diagnosestellung „Epilepsie“

bestehen drei für sich allein stehend gültige Kriterien: eines beschreibt ein Minimum

von zwei nicht provozierten (oder reflektorischen) Anfällen, die in einem Abstand von

über 24 Stunden auftreten; ein anderes fordert einen nicht-provozierten (oder

reflektorischen) Anfall und eine dem generellen Rezidiv-Risiko nach zwei nicht-

provozierten Anfällen ähnliche Wahrscheinlichkeit für weitere Anfälle über die

nächsten 10 Jahre; ein weiteres stellt die Diagnose eines Epilepsiesyndroms dar. Eine

Epilepsie gilt als überwunden, wenn eine Person ohne antiepileptische Therapie über

die letzten fünf Jahre für 10 Jahre anfallsfrei geblieben ist, oder wenn eine Person ein

altersabhängiges Epilepsiesyndrom hatte und nun über das entsprechende Alter

hinaus ist. In der Veterinärmedizin hingegen wird durch die International Veterinary

Epilepsy Task Force dann von einer Epilepsie gesprochen, wenn ein Tier das erste

Kriterium – zumindest zwei nicht-provozierte epileptische Anfälle in mehr als 24

Stunden Abstand – erfüllt (Berendt et al., 2015).

Anfallstypen werden durch die International League Against Epilepsy (ILAE)

folgendermaßen klassifiziert: in fokale Anfälle, die weiterhin unterteilt werden in

motorisch oder nicht-motorisch, nach Vorhandensein des Bewusstseins, in fokal bis

zu bilateral tonisch-klonisch, und des Weiteren in Anfälle mit unbekanntem Anfang, die

ähnlich eingeteilt werden, sowie in generalisierte Anfälle (Fisher et al., 2016). Zur

Diagnosestellung werden nach einer neuen Richtlinie der International League Against

Epilepsy Diagnosen auf drei Ebenen getroffen (Scheffer et al., 2017): zum Anfallstyp,

zur Epilepsieart (generalisiert, fokal, kombiniert oder unbekannt) und zu einem

möglichen Epilepsiesyndrom. Auf allen drei Ebenen wird nach der Ätiologie gesucht,

die sich einteilen lässt in genetisch, strukturell, metabolisch, immunbedingt, infektiös

und unbekannt (Scheffer et al., 2013). Für Epilepsie gibt es in der Veterinärmedizin in

Anlehnung an die Humanmedizin zwei Arten der Klassifikation (Berendt et al., 2015):


5

in Bezug auf die Ätiologie wird zwischen idiopathischen Epilepsien, die genetisch

bedingt sein können, und strukturellen Epilepsien, die durch verschiedene Pathologien

verursacht werden, unterschieden. Eine Differenzierung der Anfalls-Symptomatologie

unterteilt in fokale, generalisierte und erst fokale, dann aber generalisierte epileptische

Anfälle, die die häufigste Ausprägung beim Hund darstellen.

Häufige Komorbiditäten bei Epilepsiepatienten sind psychische Erkrankungen,

die bei Epilepsiepatienten häufiger als in der gesamten Bevölkerung vorkommen

(Saha et al., 2017). Dabei werden Depressionen in epileptischen Patienten mit einer

vier- bis fünffach höheren Inzidenz gegenüber anderen Personen angegeben (Kanner

und Palac, 2000). Nicht nur bei Epilepsie besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit für

eine Depression, sondern auch bei Depression eine höhere Wahrscheinlichkeit für

eine Epilepsieentwicklung (Korczyn et al., 2013), wobei Pathomechanismen der

Depression teilweise möglichen epileptogenen Mechanismen entsprechen.

Angststörungen sind mit Angaben von bis zu 40% ähnlich häufig anzutreffen (Munger

Clary, 2014). Für kognitive Defizite werden ähnliche Häufigkeiten genannt (Vlooswijk

et al., 2010). Diese Komorbiditäten, aber auch eine mögliche soziale Ausgrenzung und

Stigmatisierung sowie Angst davor können die Lebensqualität stark beeinträchtigen

(Steiger und Jokeit, 2017). Epilepsiepatienten haben zudem ein dreifach erhöhtes

Selbstmordrisiko verglichen mit anderen Menschen (Korczyn et al., 2013). Die

Therapie dieser Komorbiditäten stellt eine Herausforderung dar, da beispielsweise

Antidepressiva im Hinblick auf die Epilepsie mit besonderer Sorgfalt eingesetzt werden

müssen und Antiepileptika je nach Wirkstoff stimmungsstabilisierende oder -

verändernde Effekte haben können (Kwon und Park, 2014). Im Hinblick auf die

vorliegende Arbeit sind deutliche Hinweise aus [18F]FDG-PET-Studien auf eine Rolle

des zerebralen Glukosemetabolismus bei Depression interessant, da Depression

allgemein, aber auch bei Patienten mit Temporallappenepilepsie mit einem fokalen

Hypometabolismus im Frontallappen assoziiert wird (Salzberg et al., 2006) und

zugleich ein Hypermetabolismus in limbischen Arealen auftritt, wobei beides durch

eine erfolgreiche Paroxetin-Therapie normalisiert werden kann (Kennedy et al., 2001).


6

2.1.2 Temporallappenepilepsie

Es wird angenommen, dass diese Form der Epilepsie bei Kindern und Erwachsenen

am häufigsten vorkommt (Engel, 1996). Episodische Gedächtnisdefizite im Alltag

stellen die häufigste kognitive Beeinträchtigung von Menschen mit

Temporallappenepilepsie und hippokampaler Sklerose dar (Rzezak et al., 2017).

Im Hinblick auf die hohe Pharmakoresistenzrate, die bis zu drei Viertel der Patienten

betrifft (Spencer, 2002) und die angesprochenen möglichen Komorbiditäten, die das

soziale Leben erschweren können, besteht ein Forschungsbedarf für weitere

Erkenntnisse zu Mechanismen der Epileptogenese und Therapiemethoden. Als

Hippokampussklerose wird das Auftreten von Gliose und Neuronenverlust bezeichnet

(Morimoto et al., 2004). Oft beinhaltet die Vorgeschichte bei mesialer

Temporallappenepilepsie Fieberanfälle oder einen Status epilepticus, also eine

andauernde Anfallsaktivität, die laut der gemeinhin verwendeten Definition über 30

Minuten andauert und damit irreparable neuronale Schädigungen verursacht (Trinka

et al., 2015). Histologisch und immunhistochemisch werden verschiedene

Erscheinungsformen des Hippokampus gesehen (de Lanerolle et al., 2003): Gewebe

von Patienten mit mesialer Temporallappenepilepsie kann typisch mit starkem

Neuronenverlust und neuronaler Reorganisation erscheinen, etwas weniger starkem

Neuronenverlust oder mit Neuronenverlust in der CA1 (Region 1 des Cornu ammonis).

Temporallappenepilepsie kann mit einer extrahippokampalen Massenläsion assoziiert

sein, wobei ein geringgradiger Neuronenverlust im Hippokampus vorkommt. Eine

paradoxe Temporallappenepilepsie ist ohne Hinweise auf eine Hippokampussklerose

im Elektroenzephalogramm nachweisbar und weist nur eine geringgradige

Neurodegeneration im Hippokampus auf. Der Anfallsherd ist bei der

Temporallappenepilepsie oft im Hippokampus, aber auch in der Amygdala oder in

beiden Strukturen gelegen (Engel, 1996). Um diesen Anfallsherd im Hinblick auf eine

chirurgische Therapie oder auch für die Planung invasiver Ableitung von

Elektroenzephalogrammen zu evaluieren, werden neben der neurologischen

Untersuchung, iktaler und interiktaler Elektroenzephalographie (EEG) nicht-invasive

Bildgebungstechniken wie simultane EEG- und fMRT-Untersuchungen (funktionelle

MRT), Einzel-Photonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) und [18F]FDG-PET


7

eingesetzt (Pittau et al., 2014). Zur Erforschung von Mechanismen, die zur

Epileptogenese führen und eine Temporallappenepilepsie ausmachen, und zur

Findung von Therapieansätzen wurden diverse Tiermodelle entwickelt. Auf die für die

vorliegende Arbeit relevanten Tiermodelle wird im Abschnitt 2.2.2 eingegangen.

2.2 Epileptogenese und Konzepte für Antiepileptogenese

2.2.1 Definition und Bedeutung

Mit dem Begriff Epileptogenese (siehe Abbildung 1) werden alle Abläufe beschrieben,

die vor dem ersten spontanen Anfall auftreten, aber auch die Prozesse, die der

Progression der Krankheit zu Grunde liegen (Goldberg und Coulter, 2013, Pitkänen

und Lukasiuk, 2011). Klassischerweise wird die Epileptogenese mit drei Phasen

beschrieben: zuerst geschieht der induzierende Gehirninsult, darauf folgt die

Latenzphase, in der die in Gang gesetzten Veränderungen das Gehirn in ein

epileptisches Gehirn umwandeln, woran sich dann die Phase der chronischen und

klinisch manifesten Epilepsie anschließt (Goldberg und Coulter, 2013). Nach dem

ersten klinischen Anfall kann sich dann mit den folgenden rekurrierenden Anfällen eine

Progression der Epileptogenese ergeben oder auch nicht. Während der

Epileptogenese und der chronischen Phase der Epilepsie ist auch mit den in Absatz

2.1.1 angesprochenen Komorbiditäten zu rechnen (Kanner et al., 2014). Eine

Diagnose wird im Patienten also erst nach der Latenzphase gestellt, wenn klinische

Symptome offenbar werden. Eine nun einsetzende medikamentöse Therapie mit

Antiepileptika zielt darauf ab, die Anfälle symptomatisch zu behandeln, um weitere

Schädigungen des Gehirngewebes einzugrenzen. Bei der Epileptogenese verändert

sich das Gehirngewebe funktionell dahingehend, dass abnorme elektrische Aktivitäten

auftreten und somit spontane Anfälle generiert werden können (Pitkänen und

Lukasiuk, 2011). Auf den initiierenden Insult kann eine Epileptogenese folgen, mit

Veränderungen wie Neurodegeneration, Neurogenese, Gliose, Axonschädigung,

Sprießen von Axonen, dendritischer Plastizität, Blut-Hirn-Schranken-Schädigung,

Einwanderung inflammatorischer Zellen in das Hirngewebe, Reorganisation der

extrazellulären Matrix, Dysregulierung von Ionenkanälen und


8

Neurotransmitterrezeptoren und Reorganisation neuronaler Schaltkreise (Gorter et al.,

2015, Pitkänen und Lukasiuk, 2011). Zusätzliche Details zu finden, das

Zusammenwirken und die Relevanz der einzelnen Mechanismen zu entdecken und zu

verstehen, ist nach wie vor Gegenstand der Forschung.

Abbildung 1: (Löscher und Brandt, 2010) Darstellung der Stufen der Epileptogenese und Progression

der Temporallappenepilepsie mit Angriffspunkten für therapeutische Interventionen

2.2.2 Tiermodelle für Epileptogenese

Tiermodelle sind in der Epilepsieforschung trotz umfangreicher Bemühungen, die

Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren, weiterhin unverzichtbar

(Dedeurwaerdere et al., 2014). Die Ethik verbietet einen sofortigen Test neuer

Therapien mit allen möglichen Risiken am Menschen. Von Patienten kann lediglich

reseziertes Gewebe im Rahmen von epilepsiechirurgischen Eingriffen für

Untersuchungen verwendet werden, nicht jedoch Kontrollgewebe. Zudem sind Studien

zur (Anti-) Epileptogenese am Patienten bisher nahezu undurchführbar, da nur ein

kleiner Teil nach einem primären Insult eine Epilepsie entwickelt und bisher keine


9

zuverlässigen Biomarker für ein erhöhtes Epileptogeneserisiko zur Verfügung stehen

(Lukasiuk und Becker, 2014). Zur Untersuchung der Epileptogenese gibt es jedoch gut

geeignete Tiermodelle für symptomatische Epilepsie, unter anderem Kindlingmodelle

und Post-Status-epilepticus-Modelle der Temporallappenepilepsie (Löscher und

Brandt, 2010). Kindling, als fortschreitender epileptogener Prozess mit täglichen

Stimulationen über Elektroden, bietet die Möglichkeit, potentiell anti-epileptogene

Therapien zu untersuchen. Durch wiederholte, zunächst subkonvulsive Stimulationen

über eine implantierte Tiefenhirnelektrode kommt es mit der Zeit zu einer chronisch

erniedrigten Anfallsschwelle und zu Anfällen von zunehmender Schwere und Dauer

(McIntyre et al., 2002). Es können wertvolle Kenntnisse darüber erlangt werden, ob die

Verabreichung von potentiell anti-epileptogen wirkenden Substanzen den Kindling-

Prozess verlangsamt bzw. verhindert oder die Ausprägung der Anfälle positiv

beeinflusst. Mit Post-Status-epilepticus-Modellen, die durch die Entwicklung

spontaner, wiederkehrender Anfälle der Erkrankung beim Menschen besonders

ähnlich sind, lassen sich durch die vorhandene Latenzzeit zwischen dem primären

Hirninsult und den ersten spontanen Anfällen ebenfalls anti-epileptogene Strategien

testen. Hierbei wird entweder elektrisch oder über ein systemisch verabreichtes

Konvulsivum wie Kainat oder Pilocarpin zunächst ein Status epilepticus ausgelöst.

Dieser setzt eine Kaskade von Veränderungen in Gang, die neben den späteren

spontanen Anfällen eine der Situation im Patienten vergleichbare Neuropathologie

(z.B. Hippokampussklerose), sowie Veränderungen im Verhalten und in kognitiven

Fähigkeiten der Tiere hervorruft. Alternativ kann Kainat oder Pilocarpin auch gezielt in

die Amygdala oder den Hippokampus injiziert werden (Riban et al., 2002, Liu et al.,

2013), wodurch das Modell bezüglich der nun lokal begrenzten Gehirnveränderungen

der Situation beim Patienten noch näherkommt.

Kindlingmodelle wie das in dieser Arbeit eingesetzte korneale Kindling beruhen

darauf, dass wiederholte elektrische Stimulationen zu fortschreitenden Veränderungen

in den Gehirnfunktionen führen, die man als „Kindling-Effekt“ bezeichnet. In dem von

Goddard et al. zuerst beschriebenen konventionellen Kindlingmodell bei der Ratte

werden Tiefenelektroden in Gehirnregionen des limbischen Systems (Amygdala,

Hippokampus) verwendet (Goddard et al., 1969). Anfangs wirkt der Stimulus noch


10

nicht konvulsiv. Durch die wiederholte Stimulation entwickeln sich zunächst partielle

und dann sekundär generalisierte Anfälle, die im Schweregrad weiter zunehmen, was

dem Prozess der Epileptogenese ähnelt. Ein gekindeltes Tier zeichnet sich durch eine

dauerhaft, über den Kindling-Verlauf hinweg gesenkte Anfallsschwelle aus (Racine,

1972), die auf chronische Veränderungen im Gehirn zurück zu führen sind (Löscher

und Brandt, 2010). Das konventionelle Kindlingmodell ist ein gut geeignetes Modell für

die Temporallappenepilepsie, doch durch die zu implantierenden Elektroden recht

arbeits- und kostenaufwändig (Potschka und Löscher, 1999). Das von Matagne und

Klitgaard charakterisierte und validierte transkorneale Kindlingmodell bei der Maus ist

in der Durchführung wesentlich weniger aufwändig (Matagne und Klitgaard, 1998,

Leclercq et al., 2014), weniger invasiv und wird mittlerweile vermehrt in vielen

Bereichen der Epilepsieforschung eingesetzt, auch in dem vom National Institute of

Neurological Disorders and Stroke der Vereinigten Staaten von Amerika geförderten

Anticonvulsant Screening Program (Wilcox et al., 2013).

Post-Status-epilepticus-Modelle werden genutzt, um die Pathophysiologie und

Therapie chronischer Temporallappenepilepsie zu untersuchen. Die Tiere zeigen

dabei nach einer Latenzphase spontan wiederkehrende Anfälle, wobei der Status

epilepticus die Epileptogenese primär in Gang setzt (Turski et al., 1989). Vergleichbar

mit den hier genannten Modellen besitzt die Temporallappenepilepsie mit

Hippokampussklerose oft ein auslösendes Ereignis in der frühen Kindheit, daraufhin

folgt eine Latenzzeit bis hin zum ersten Anfall, binnen derer die Epileptogenese

stattfindet (Bouilleret et al., 1999). Im Pilocarpinmodell wird zur Auslösung eines Status

epilepticus Pilocarpin, ein muscarinerger Agonist am Cholin-Rezeptor, genutzt. Die

Verabreichung von Lithiumchlorid tags zuvor erhöht die Empfänglichkeit der Ratten für

Anfälle durch Pilocarpin und verringert dadurch deutlich die Mortalität (Turski et al.,

1989, Glien et al., 2001). Das im intrahippokampalen Kainatmodell genutzte Kainat ist

ein Glutamat-Analogon mit exzitatorisch-toxischer Wirkung, das in der Rotalge

Digenea simplex vorkommt (Tanaka et al., 1992). Durch die intrahippokampale Kainat-

Injektion wird in Mäusen ein überwiegend nicht-konvulsiver Status epilepticus

ausgelöst (Gouder et al., 2003). Auf diesen folgen dann nach kurzer Latenzzeit

frequent wiederkehrende partielle Anfälle, die über die Ableitung eines


11

Elektroenzephalogramms (EEG) erkennbar sind. Diese Anfälle können wie bei der

Temporallappenepilepsie des Menschen sekundär generalisieren. Da

pathohistologische Veränderungen des kornealen Kindling- und des Pilocarpinmodells

in der übergreifenden Diskussion im Kontext der Ergebnisse aus den Teilstudien der

Arbeit noch zur Sprache kommen, möchte ich hier nur exemplarisch die des

Kainatmodells vorstellen. Im intrahippokampalen Kainat-Modell wie im Patienten ist

eine Neurodegeneration im ipsilateralen Hippokampus (Hilus des Gyrus dentatus, CA

1, CA 3c) mit Verlust von Pyramidenzellen und Interneuronen beschrieben, was als

Hippokampussklerose bezeichnet wird (Suzuki et al., 1995, Bouilleret et al., 1999, Le

Duigou et al., 2005). Es kommt zu einer Dispersion von Körnerzellen (Heinrich et al.,

2006), zum Sprießen der Moosfaser-Axone in der supragranulären Molekularschicht

des Gyrus dentatus und im infrapyramidalen Stratum oriens (Bouilleret et al., 1999).

Ipsilateral proliferieren Astrozyten. Histopathologisch wird im kontralateralen

Hippokampus chronisch kein Unterschied zu einem mit einer Mikroinjektion von

physiologischer Kochsalz-Lösung behandelten Hippokampus festgestellt, bis auf das

mögliche Vorkommen von Moosfaserwachstum. Durch die Kainatinjektion wird eine

erhöhte mitotische Aktivität im Hilus des Gyrus dentatus stimuliert, die ihr maximales

Ausmaß ipsilateral an Tag drei und kontralateral an Tag sieben aufweist (Kralic et al.,

2005). Die Neurogenese wird innerhalb der ersten Woche ipsilateral vermindert,

während sie kontralateral unbeeinflusst bleibt (Heinrich et al., 2006) und stagniert ganz

nach zwei Wochen.

2.2.3 Energiestoffwechsel des Gehirns

Allgemein anerkannt ist die Annahme, dass Glukose ein essentielles Substrat zur

Energiegewinnung im adulten Gehirn darstellt (Bouzier-Sore et al., 2006, Jakoby et al.,

2014). In besonderen Situationen wie Fasten, unkontrolliertem Diabetes,

andauerndem körperlichem Training oder in der Säuglingszeit werden Ketonkörper

wichtige Energielieferanten des Gehirns (Magistretti und Allaman, 2015). Die am

stärksten Energie konsumierenden Zellen sind Neuronen mit etwa 75 – 80% der

produzierten Energie.


12

Glukose scheint von Gliazellen im Vergleich zu Neuronen deutlich bevorzugt

aufgenommen und metabolisiert zu werden (Jakoby et al., 2014). Aerobe Glykolyse

und Laktatproduktion kommen vor allen in Astrozyten vor, jedoch kaum in Neuronen

(Magistretti und Allaman, 2015, Bélanger et al., 2011). Die Glykolyse ist in Neuronen

durch eine ständige Degradation des bifunktionellen Enzyms 6-Phosphofrukto-

2kinase/fructose-2,6-bishposphatase 3 stark begrenzt, wodurch in Neuronen eine

Erhöhung der glykolytischen Aktivität verhindert wird (Herrero-Mendez et al., 2009). In

Astrozyten sind diese vollständig aktiv. Dies ist anscheinend nötig, weil eine erhöhte

Glykolyse den Ablauf des Pentose-Phosphat-Weges in Neuronen einschränken (siehe

Abbildung 2), somit die Regeneration von reduziertem Glutathion verringern und damit

in oxidativen Stress und Apoptose führen würde. Somit scheint eine konstant

begrenzte neuronale Glykolyse sehr wichtig zu sein für ihre antioxidativen Fähigkeiten.

Abbildung 2: (Mergenthaler et al., 2013) Wege des

Glukosestoffwechsels. Bei Glukose-6-Phosphat (Glc-6-P) ist eine

Zweigstelle: hier kann das Molekül anstatt weiter zu gehen in der

direkten Glykolyse auch den Pentosephosphatweg (PPP)

einschlagen, der Glutathion regeneriert, oder aber bei Astrozyten

zur Glycogensynthese (Glyc) eingesetzt werden. Pyruvat aus der

Glykolyse wird entweder in Laktat umgewandelt und aus der Zelle

transportiert oder im Zitratzyklus oxidativ verstoffwechselt. Die

Glykolyse führt zur Gewinnung von zwei ATP-Molekülen, der

Zitratzyklus zu 30 weiteren. (MAS = Malat-Aspartat-Shuttle zur

Regeneration von NAD+ für die Pyruvatbildung, ETC =

Elektronen-Transport-Kette, GLUT = Glukosetransporter)

Neuronen und Astrozyten besitzen zwar vergleichbare Mengen an

Mitochondrien, jedoch ist die oxidative Verstoffwechslung von Laktat für Neuronen von

Vorteil, da sie auch mehr ATP liefert als die Glykolyse (Bélanger et al., 2011).

Astrozyten hingegen sind auf Glykolyse spezialisiert. Im Gegensatz zu Neuronen sind

Astrozyten in der Lage, Glykogen zu lagern (Magistretti und Allaman, 2015). Zwar sind

auch Neuronen mit den entsprechenden Enzymen zur Glykogenbildung ausgestattet,

die aber weitgehend inaktiv sind (Bélanger et al., 2011). Astrozytäres Glykogen wird


13

bei Bedarf, also bei synaptischer Stimulation, zu Laktat abgebaut, das auch an

Neuronen weitergegeben wird. Diese Laktatversorgung der Neuronen durch

Astrozyten ist unerlässlich für die Langzeit-Gedächtnisbildung (Suzuki et al., 2011). In

separaten Neuronenkulturen von neonatalen Wistar-Ratten mit gleicher Glukose- und

Laktatverfügbarkeit in jeweils physiologisch vorkommenden Konzentrationen wurde

mittels Modellrechnungen ermittelt, dass der neuronale oxidative Stoffwechsel zu

einem Viertel auf exogener Glukose und zu drei Vierteln auf exogenem Laktat beruht

(Bouzier-Sore et al., 2006). Neuronen besitzen im Gegensatz zu Astrozyten keine

Pyruvatcarboxylase (Pyruvat wird zu Oxalacetat), sondern nur die

Pyruvatdehydrogenase (Pyruvat wird zu Acetyl-CoA) zur Einführung von Pyruvat in

den Zitratzyklus, und können dementsprechend nur einen metabolischen Pfad nutzen.

1994 wurde eine Hypothese beschrieben (siehe Abbildung 3), die die Kopplung

zwischen synaptischer Aktivität und Energieverteilung über das sogenannte

Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle erklärt (Pellerin und Magistretti, 1994). Demnach

stimuliert Glutamat, das aus dem synaptischen Spalt im Symport mit Natrium in

Astrozyten aufgenommen wird und dann in Glutamin umgewandelt wird, die

Glukoseaufnahme und Laktatproduktion in Astrozyten, da sowohl der Transport

(Aufrechterhaltung des Natriumgradienten durch die Na+/K+ATPase) und die

Umwandlung ATP verbrauchen. Dies geschieht durch Enthemmung der glykolytischen

Schlüsselenzyme Hexokinase und Phosphofruktokinase. Überschüssiges Glutamat

wird in α-Ketoglutarat umgewandelt und fließt in den Zitratzyklus ein. Über die

Monocarboxylattransporter MCT1 (auch in anderen Gliazellen und Endothelzellen)

und MCT4 (nur in Astrozyten) wird das produzierte Laktat freigesetzt, dann über

neuronale MCT2 aufgenommen, in Pyruvat konvertiert und dann oxidativ im

Zitratzyklus metabolisiert (Magistretti und Allaman, 2015). Das hauptsächlich aus dem

Glutamat gewonnene Glutamin wird freigesetzt, von Neuronen aufgenommen und

wieder zu Glutamat recycelt. Zwei Mechanismen tragen dazu bei, dass mehr Glukose

durch die Glutamatstimulation in die Astrozyten aufgenommen wird und in Laktat

umgewandelt wird: zum einen wird die astrozytäre mitochondriale Kapazität zur

oxidativen Phosphorylierung durch Azidifizierung der mitochondrialen Matrix durch

Glutamat reduziert (Azarias et al., 2011), zum anderen führt glutamaterge Aktivität zur


14

Inhibition der Glukoseaufnahme in Neuronen bei gleichzeitig erhöhter

Glukoseaufnahme in Astrozyten (Porras et al., 2004). Damit wird der

Glukoseverbrauch verlagert hin zu den Astrozyten, während die Neuronen vermehrt

auf Laktat zurückgreifen.

Abbildung 3: (Magistretti und Allaman, 2015) Überblick zum Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle.

Erklärungen befinden sich im Text direkt oberhalb der Abbildung. (EAATs = Excitatory Amino Acid

Transporters, hier sind GLT-1 (Glutamat-Transporter 1) und GLAST (Glutamat-Aspartat-Transporter)

gemeint, GS = Glutaminsynthetase, GLS = Glutaminase, LDH = Laktatdehydrogenase).

Die Reduktion einer Substratverstoffwechslung durch die andere wird als

Redox-Switch-Hypothese beschrieben (Cerdan et al., 2006). Laktat- und

Glukosestoffwechsel konkurrieren um zytosolisches NAD+ (Laktatdehydrogenase

versus Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, die beide NAD+ verbrauchen.

NAD+ wird bei geringem Sauerstoffpartialdruck durch Konversion von Pyruvat zu

Laktat regeneriert). Wenn nun durch neuronale Aktivierung die Laktatverfügbarkeit

steigt, wird vorrangig dieses metabolisiert, während die Glykolyse abnimmt. Dies

geschieht sowohl in Neuronen wie auch Astrozyten. Bei dieser Hypothese gibt es also

je einen Pyruvat- und Glutamat-Pool in Astrozyten oder Neuronen, der von

extrazellulären Monocarboxylaten oder Glukose herrührt (Cruz et al., 2001). Damit

wird die Idee des Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttles erweitert (Garcia-Espinosa et

al., 2004). Die Reduktionsäquivalente Laktat und Pyruvat werden demnach abhängig


15

von der Thermodynamik reversibel zwischen Neuronen und Astrozyten ausgetauscht

und nicht unilateral transportiert (Cerdan et al., 2006). So kann der Zitratzyklus

während der Erregung wohl in Neuronen und Glia ablaufen. Es ist durchaus plausibel,

dass dies zu Beginn einer glutamatergen Erregung der Fall ist und dann die

Mechanismen des Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttles in den Vordergrund treten

(Magistretti und Allaman, 2015).

Eine weitere Überlegung zu einem möglichen Mechanismus der neuronalen

Bevorzugung von Laktat gegenüber Glukose bei glutamaterger Aktivierung ist ein

Ascorbinsäure-vermitteltes metabolisches Umschalten (Castro et al., 2009).

Abgegeben von Astrozyten (vermutlich in oxidierter Form über GLUT1 aus dem Blut

aufgenommen) infolge glutamaterger Aktivierung, wird Ascorbinsäure über SVCT2 in

Neuronen aufgenommen, trägt zum antioxidativen Schutz bei und verhindert weitere

Glukosekonsumierung mit zugleich gesteigerter Laktataufnahme.

Ketonkörper sind eine alternative Energiequelle des Gehirns (Morris, 2005).

Acetoacetat, Aceton und ß-Hydroxybutyrat werden in der Leber hauptsächlich aus

Fettsäuren gebildet. Aceton, das durch spontane Decarboxylierung aus Acetoacetat

entsteht, hat eine geringe physiologische Bedeutung für den Energiestoffwechsel. Der

Monocarboxylattransporter MCT1 ist verantwortlich für den Transport der Ketonkörper

durch die Blut-Hirn-Schranke (Gerhart et al., 1997). Durch eine sechswöchige

ketogene Diät in adulten Ratten war MCT1 achtfach stärker exprimiert (Leino et al.,

2001). Im Mausgehirn werden MCT1 und MCT2 exprimiert (Pellerin et al., 1998). Das

Gehirn selbst kann keine Fettsäuren oxidieren (Morris, 2005). Ketonkörper spielen

eine bevorzugte Rolle in der zerebralen Lipidsynthese (Webber und Edmond, 1977,

Lopes-Cardozo et al., 1986), scheinen dabei aber nicht unabdingbar zu sein (Morris et

al., 1998).

Generelle Übereinstimmung besteht darin, dass infolge neuronaler Aktivität sich

der zerebrale Blutfluss im Allgemeinen der metabolischen Nachfrage angepasst

steigert, und dass sowohl oxidativer und nichtoxidativer Stoffwechsel daran beteiligt

sind, den energetischen Anforderungen zu entsprechen (Bélanger et al., 2011).

Zerebraler Blutfluss und Glukoseverbrauch (CMRglc) ändern sich parallel (Gjedde et


16

al., 2002), obwohl der Glukosetransport unabhängig von Blutflussänderungen ist. Die

Laktatbildung ist das mögliche Bindeglied zwischen zerebralem Blutfluss und

Glukoseverbrauch (Vafaee et al., 2012). In Gehirnschnitten von Ratten konnte gezeigt

werden, dass bei einer verminderten Sauerstoffverfügbarkeit astrozytäre Glykolyse

und Laktatfreisetzung maximiert werden (Gordon et al., 2008). Extrazelluläres Laktat

trägt zur Prostaglandin E2-Ansammlung bei, wodurch eine Vasodilatation zustande

kommt. Entsprechend wurde auch beobachtet, dass das zytosolische NADH-NAD+-

Verhältnis und das Laktat-Pyruvat-Verhältnis den zerebralen Blutfluss während der

neuronalen Aktivität beeinflussen (Vlassenko et al., 2006).

Astrozyten sind in der Lage, Ketonkörper zu produzieren (Guzmán und

Blázquez, 2004). Dies scheint durch den Glutamattransport in Astrozyten gesteigert

zu werden, auch durch cAMP-induzierende Rezeptoren wie ß-Adrenozeptoren und

Vasoaktives Intestinalpeptid-Rezeptoren in Astrozyten und Endocannabinoide. Bei

neuronaler Aktivität wird also eine weitere Energieversorgung geschaffen. Hypoxie

induziert in vitro Ketonkörperbildung in Neuronen wie in Astrozyten (Takahashi et al.,

2014).

2.2.4 Veränderungen während der Epileptogenese

2.2.4.1 Glukosestoffwechselveränderungen

Neurotransmission, Stoffwechselkreisläufe und Hyperexzitabilität stehen in engem

Zusammenhang (Pan et al., 2008). In der Latenzphase der Epileptogenese im

Kainatmodell in Ratten zeigte sich mittels Magnetresonanzspektroskopie eine

Erhöhung nicht-metabolisierter [1-13C]Glukose in mesialen temporalen Strukturen als

Hinweis auf einen verringerten Glukosestoffwechsel (Alvestad et al., 2011). Von [1,2-

13C]Acetat wurde im Hippokampus weniger 13C in Glutamat, Glutamin und GABA

inkorporiert, was auf einen verminderten astrozytären Stoffwechsel hindeutet. In

hippokampalen Astrozyten nahm im Vergleich zu Kontrolltieren das Verhältnis von

Acetat zu Glukose als Ausgangssubstrate zur Glutamat-Synthese zu, wobei für die

GABA-Synthese ein vermindertes Verhältnis von Acetat zu Glukose als Ursprung zu

finden war. Mögliche Erklärungen für die Verringerung des Glutamat- und Glutamin-

Umsatzes, wie auch des Umsatzes von GABA (vor allem im mesialen


17

Temporallappen) sind eine Beeinträchtigung der Glykolyse, Neurodegeneration,

mitochondriale Dysfunktion in Astrozyten und Neuronen und beeinträchtigte Kreisläufe

von Glutamat, Glutamin und GABA während der Latenzphase in diesem Modell. In der

chronischen Phase fand man in diesem Tiermodell im Hippokampus und entorhinalen

Cortex weniger absolutes und mit 13C (aus intraperitonealer [1-13C]Glukose-Injektion

stammendes) gekennzeichnetes Glutamat und weniger markiertes Glutamin im

Hippokampus (Alvestad et al., 2008). Dies ging einher mit einer mitochondrialen

Dysfunktion im Hippokampus und Neuronenverlust. Im Neocortex hingegen war

vermehrt absolutes und radioaktiv markiertes GABA vorhanden. Allerdings wurde in

der Phase der chronischen Epilepsie im Lithium-Pilocarpinmodell in Ratten keine

Korrelation zwischen interiktalem (Glukose-)Hypometabolismus und Neuronenverlust

beobachtet (Dube et al., 2001). Der iktale Hypermetabolismus, der durch den Lithium-

Pilocarpin-induzierten Status epilepticus hervorgerufen wird, korrelierte dagegen mit

der neuronalen Schädigung in adulten Ratten (Fernandes et al., 1999). In reseziertem

Hippokampusgewebe von Patienten mit mesialer Temporallappenepilepsie fand man

eine verminderte Expression der Glutamin-Synthetase bei unverändertem

Expressionsniveau von EAAT2, dem hauptsächlichen Glutamattransporter in

Gliazellen des Hippokampus (Eid et al., 2004). Im epileptischen Hippokampus ist der

Gutamat-Glutamin-Kreislauf verlangsamt, es ist weniger Glutamin vorhanden bei

zugleich relativ mehr Glutamat (Petroff et al., 2002). Dies spricht für eine

beeinträchtigte Glutamatverstoffwechslung durch Astrozyten, die eine kontinuierliche

geringgradige Excitotoxizität begünstigen würde. Binnen Minuten nach Beginn von

Anfallsaktivität, induziert durch Pentylentetrazolinjektion in Ratten, wird die maximale

Geschwindigkeit der Glukosetransporter in der Blut-Hirn-Schranke und damit die

Glukosepermeabilität gesteigert (Cornford et al., 2000). Insulin kann Neuronen in

Zellkultur gegen Glutamattoxizität schützen und die in Folge von simultaner Sauerstoff-

und Glukosedeprivation stattfindende Internalisierung von GABAA-Rezeptoren

begrenzen (Mielke und Wang, 2005).


18

2.2.4.2 Blut-Hirn-Schranken-Veränderungen

Die Blut-Hirn-Schranke besteht aus Endothelzellen, die über Tight Junctions

verbunden sind (van Vliet et al., 2015). Zusammen mit den benachbarten Astrozyten,

Perizyten und Neuronen bilden sie die neurovaskuläre Einheit, die für die Homöostase

des Gehirnmilieus unerlässlich ist (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: (Rustenhoven et al., 2017) Schematische Darstellung der neurovaskulären Einheit aus

Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten und Neuronen, mit perivaskulärer Microglia.

Bei einem Status epilepticus ist eine gesteigerte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-

Schranke eine der ersten auftretenden pathologischen Folgen (Gorter et al., 2015), die

auch typisch für andere epileptogene Gehirninsulte ist. Diese Schädigung kann weitere

Prozesse nach sich ziehen, die vermutlich die Epileptogenese fördern (Weissberg et

al., 2011). Eine Studie konnte durch Induktion einer Blut-Hirn-Schranken-

Durchlässigkeit mittels Gallensalzen in Ratten einen epileptischen Fokus auslösen

(Seiffert et al., 2004). Eine Patientenstudie, die im Rahmen einer intraarteriellen

Chemotherapie zuvor mittels Mannitolinfusion eine Durchlässigkeit der Blut-Hirn-

Schranke induzierte, rief hierbei bei einem Viertel der Prozeduren akute Anfälle hervor,

was sich auch in einem angeschlossenen Experiment mit Schweinen bestätigte

(Marchi et al., 2007a). Anfälle wiederum können die Blut-Hirn-Schranke weiter

schädigen (van Vliet et al., 2015). Inwieweit eine Beeinträchtigung der Blut-Hirn-

Schranke zu Anfällen führt, wird kontrovers diskutiert aufgrund verschiedener

Studienergebnisse und auch der Tatsache, dass das Risiko für eine Epileptogenese


19

bei einer Blut-Hirn-Schranken-Schädigung im Zusammenhang mit einem Trauma oder

einem Status epilepticus deutlich höher ist als beispielsweise bei Alzheimer

(Rosenberg, 2012). Die Untersuchung von Mechanismen der Blut-Hirn-Schranken-

Störung im zeitlichen Verlauf stellt im Hinblick auf mögliche Ansätze für

antiepileptogene Therapiestrategien ein interessantes Feld dar, da sie offensichtlich

während der gesamten Epileptogenese und in geringerem Ausmaß auch später in der

chronischen Phase anzutreffen ist (Roch et al., 2002b, van Vliet et al., 2016) und auch

in dem zweiten Manuskript dieser Arbeit verfolgt wurde. Eine Koinzidenz mit

inflammatorischen Prozessen in denselben Gehirnarealen wurde beobachtet (van

Vliet et al., 2007, Librizzi et al., 2012, Roch et al., 2002b). Es ist hochwahrscheinlich,

dass Entzündungsgeschehen eine zentrale Rolle in der Epileptogenese spielt

(Pitkänen et al., 2016). Für ein Entzündungsgeschehen relevante Strukturen, wie die

Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1, E- und P-Selektin, werden als Biomarker für

eine Epileptogenese diskutiert (Vezzani und Friedman, 2011), da sie nach einem

Status epilepticus auf der Oberfläche von Endothelzellen vermehrt exprimiert sind.

Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke lässt sich mittels verschiedenster

Methoden untersuchen – elektronenmikroskopische und lichtmikroskopische

Protokolle mit Markern wie Meerrettichperoxidase, Evans Blue oder Fluoreszein

können eingesetzt werden. Für Untersuchungen in vivo eignen sich bildgebende

Verfahren, insbesondere kontrastmittelverstärkte MRT, aber auch [68Ga]DTPA-

Positronen-Emissionstomographie (PET) und [99mTc]DTPA-Einzelphotonen-

Emissionscomputertomographie (van Vliet et al., 2015, Breuer et al., 2016). In der

vorliegenden Arbeit wurde, wie in Abschnitt 4.3.2 beschrieben, die MRT verwendet.

Der besondere Vorteil dieser Bildgebungsmethoden liegt darin, dass ein Tier für die

Erfassung eines Zeitverlaufs wiederholt untersucht werden kann. Die MRT bietet von

den drei genannten Verfahren außerdem die beste Auflösung.

2.2.4.3 Inflammation

Untersuchungen in Gehirngewebe epileptischer Patienten und in Tiermodellen haben

gezeigt, dass Gliazellen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Wiederkehr von

Anfällen spielen (Vezzani et al., 2013, Gorter et al., 2015), und lassen darauf


20

schließen, dass ein positiver Feedback-Zyklus zwischen der Epileptogenese und

entzündlichen Prozessen im Gehirn besteht (Shimada et al., 2014). So können

systemische Immunantworten auf eine Infektion mit dem Influenza-A-Virus zu einer

Epileptogenese nach febrilen Anfällen führen (Kawada et al., 2003). Aber auch die

Induktion anfallsartiger Aktivität kann im isolierten Meerschweinchengehirn die

Produktion von IL-1ß in Astrozyten hervorrufen und die Integrität der Blut-Hirn-

Schranke stören (Gorter et al., 2015). Zu den physiologischen Aufgaben von Gliazellen

gehört unter anderem die Kontrolle extrazellulärer Neurotransmitterkonzentrationen

(Eulenburg und Gomeza, 2010), die astrozytenvermittelte neurovaskuläre Kopplung

zwischen Neuronen und zerebralen Blutgefäßen, wodurch die Perfusion an die

neuronale Aktivität angepasst werden kann (Petzold und Murthy, 2011) und die

bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten, die so die

synaptische Transmission und die Plastizität beeinflussen können (Santello et al.,

2012). Eine inflammatorische Reaktion auf eine Infektion oder andere Noxen ist per se

ein Verteidigungsmechanismus, der im Falle einer Beteiligung in der Epileptogenese

offenbar außer Kontrolle gerät und entsprechend fehlgeleitet Schaden anrichten kann

(Vezzani und Friedman, 2011). Gewebeproben aus Läsionen von Patienten mit

Temporallappenepilepsie und in Gewebe von chronisch epileptischen Ratten wurde

sowohl in Astrozyten, Microglia als auch in Neuronen eine verstärkte Expression von

IL-1ß und seinem Rezeptor IL-1R1 beschrieben (Ravizza et al., 2008). Proben aus

Läsionen von Patienten mit fokaler kortikaler Dysplasie zeigen neben der Aktiverung

der mTOR-Kaskade (Mammalian Target of Rapamycin) auch eine Aktivierung des

Komplementsystems (Iyer et al., 2010). Eine Überexpression des Toll-like Receptor 4

in Neuronen und Astrozyten und seines endogenen Liganden HMGB1 (High Mobility

Group Box 1) in Microglia und Astrozyten wurde in chronisch epileptischen Mäusen

wie in Patienten mit Temporallappenepilepsie, mesialer temporaler Sklerose und

fokaler kortikaler Dysplasie gefunden (Maroso et al., 2010, Zurolo et al., 2011). Es ist

anzunehmen, dass Microglia und Astrozyten eine wichtige Rolle bei der

Aufrechterhaltung der inflammatorischen Prozesse bei Epilepsie spielen, da sie auf

eine HMGB1-Stimulation hin eine Reihe verschiedener proinflammatorischer

Mediatoren produzieren (Vezzani et al., 2013). IL-1ß wirkt über eine Phosphorylierung


21

der NR2B-Unterheit des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors (NMDA-Rezeptor)

prokonvulsiv, da der NMDA-abhängige Ca2+-Influx gesteigert wird (Balosso et al.,

2008). Im Hinblick auf die im Abschnitt 2.2.4.1 beschriebenen Veränderungen im

Glukosemetabolismus während der Epileptogenese ist unter den in der Literatur

beschriebenen möglichen Interaktionen zwischen inflammatorischen Mechanismen

und der Epileptogenese die Inhibition der astrozytären Glutamataufnahme durch IL-1ß

zu nennen (Hu et al., 2000). Eine Entzündung kann die Blut-Hirn-Schranken-Integrität

beeinträchtigen (Ferrari et al., 2004). Die darauffolgende Albuminextravasation kann

über TGF-ß-Rezeptoren (Transforming Growth Factor ß) in Astrozyten die

Herabregulierung von Kalium-Kanälen (Kir 4.1) induzieren, wodurch extrazelluläres

Kalium durch die Astrozyten nicht mehr genügend gepuffert werden kann und eine

NMDA-Rezeptor-vermittelte neuronale Hyperexzitabilität folgt (Ivens et al., 2007). In

Gewebe von Patienten mit Temporallappenepilepsie senkt IL-1ß GABAA-Ströme, nicht

aber in gesundem Gewebe (Roseti et al., 2015). Verquickungen von

inflammatorischen Prozessen und der Epileptogenese sind hinsichtlich der Aktivierung

von Astrozyten und Microglia in dieser Arbeit immunhistochemisch untersucht worden

(siehe erstes und zweites Manuskript). Zudem wurde zur Untersuchung der

Aktivierung von Microglia in vivo die [18F]GE-180-Positronen-Emissionstomographie

eingesetzt (siehe Manuskript 3 und Abschnitt 2.3.3).

2.2.5 Konzepte für Antiepileptogenese

Im Hinblick auf die hohe Anzahl an pharmakoresistenten Epilepsiepatienten, die mit

einem Drittel beziffert wird (Brodie et al., 2012), wie auch auf die bisher fehlende

Möglichkeit, eine Epilepsie medikamentös zu heilen, liegt eine Hoffnung in dem

Konzept der Antiepileptogenese (Baulac et al., 2015). Durch den Eingriff in die

Veränderungen des Gehirns während der Epileptogenese soll damit eine

Epilepsieprävention erreicht werden, oder aber zumindest die Krankheit

abgeschwächt werden (Löscher und Brandt, 2010) (vergl. Abbildung 1 in Abschnitt

2.2.1). Weitere Zeitpunkte des Eingreifens sind generell denkbar – eine Therapie vor

Beginn der Epileptogenese im Sinne einer Insultmodifikation könnte diese verhindern

oder verzögern. Eine Behandlung nach der Diagnosestellung könnte die Progression


22

der Erkrankung verhindern oder einer Pharmakoresistenz entgegenwirken, und wäre

somit krankheitsmodifizierend (Galanopoulou et al., 2012, Lagae et al., 2003). Zugleich

wäre eine Beeinflussung der Komorbiditäten von Epilepsie durch eine antiepileptogene

Therapie denkbar.

Auf der Suche nach wirksamen antiepileptogenen Therapieansätzen werden

verschiedene Ansätze verfolgt. Unter anderem wurde untersucht, wie sich die Gabe

von Neuroprotektiva (Paradiso et al., 2009, Gu et al., 2015), antiinflammatorischer

Wirkstoffe (Jung et al., 2006, Holtman et al., 2009, Polascheck et al., 2010, Noe et al.,

2013, Russmann et al., 2016) oder Inhibitoren der Entzündungszelladhäsion an das

Endothel der Blut-Hirn-Schranke zur Blockade der Einwanderung peripherer

Immunzellen (Fabene et al., 2008) auf die Epileptogenese auswirken. In diesem

Zusammenhang besteht ein weiterer Ansatz, der nun auch in dieser Arbeit verfolgt

wird, darin, Veränderungen des Energiestoffwechsels durch die Epileptogenese

genauer zu erforschen und als möglichen Angriffspunkt für eine Therapie zu

untersuchen, wie in Abschnitt 4.2 und 4.4 genauer beschrieben.

2.2.5.1 Energiestoffwechsel-beeinflussende Therapien chronischer Epilepsie

Es gibt vier verbreitete Diäten zur Behandlung einer chronischen Epilepsie bei

Humanpatienten, die alle eine recht hohe und ähnliche Effizienz aufweisen, wobei die

klassische ketogene Diät etwas effektiver sein kann (Dhamija et al., 2013): Die

klassische ketogene Diät mit einem festgelegten Verhältnis von Fett zu Protein und

Kohlenhydraten besteht hauptsächlich aus langkettigen Triglyzeriden und wurde 1921

beschrieben (Wilder, 1921). Eine Variante mit Einsatz von Öl bestehend aus

mittelkettigen Triglyzeriden (MCT) bildet die von Huttenlocher et al. zuerst

beschriebene MCT-Diät (Huttenlocher, 1976). Für die modifizierte Atkins-Diät werden

die Kohlenhydrate begrenzt (Kossoff et al., 2006), für die Diät mit Beachtung eines

niedrigen glykämischen Index die Kohlenhydrate einzeln bewertet (Pfeifer und Thiele,

2005). Die Diäten bedeuten je nach Design besondere Einschränkungen für die

alltägliche Ernährung und erlauben unterschiedlich etwas mehr Freiheiten als die

klassische ketogene Diät, die zwar sehr strikt und aufwändig, dafür aber auch sehr

genau steuerbar ist. Am häufigsten wird eine ketogene Diät bei pharmakoresistenter


23

Epilepsie eingesetzt (Cervenka et al., 2016, Felton und Cervenka, 2015), wobei bisher

eine breit gefächerte Wirksamkeit bei Epilepsien unterschiedlicher Genese beobachtet

wurde (Haas et al., 1986, Kossoff et al., 2005, Crumrine, 2011, Kossoff et al.). In den

letzten Jahren hat die ketogene Diät zudem eine Art Renaissance erfahren, da sie im

Hinblick auf die Therapie pharmakoresistenter Epilepsien eine wertvolle Option bietet

und nun auch in adulten Patienten eingesetzt wird (Cervenka et al., 2016, Coppola et

al., 2002, Schoeler et al., 2014). Noch in der Erforschung ist die Supplementierung der

täglichen Nahrung mit Ketonestern (Ciarlone et al., 2016, Viggiano et al., 2016, Hashim

und VanItallie, 2014).

2.2.5.2 Wirkungsweise der ketogenen Diät

Die ketogene Diät wie auch das Fasten führt zu einer Umstellung des Stoffwechsels

von der hauptsächlichen Nutzung von Glukose hin zu Ketonkörpern als Substrat zur

Energiegewinnung, deren genaue antikonvulsive Wirkungsmechanismen noch

weitergehend zu erforschen sind (Boison et al., 2013, Masino et al., 2011). Studien

konnten schon einige mögliche relevante Mechanismen aufdecken, wie die Wirkung

an Adenosin-Rezeptoren, auf die Mitochondrienzahl, auf KATP-Kanäle, auf die

Synthese von Kynurensäure, auf die Konzentration von GABA, auf den vesikulären

Glutamattransport, und direkte Wirkungen von Ketonkörpern. Diese sollen im

Folgenden jeweils kurz angesprochen werden.

Nach einer Studie in Mäusen ist die Wirksamkeit der ketogenen Diät

offensichtlich abhängig vom Vorhandensein von Adenosin A1-Rezeptoren (A1R)

(Masino et al., 2011) und wirkt zugleich hemmend auf die Expression von

Adenosinkinase. Tiere mit einer Überexpression von Adenosinkinase (gesteigerte

Adenosin-Clearance) und Tiere mit einem oder zwei fehlenden A1R-Allelen zeigen

elekroenzephalographisches Anfallsgeschehen, das bei dreiwöchiger Fütterung einer

ketogenen Diät in Tieren mit Adenosinkinaseüberexpression fast vollständig, in Tieren

mit einem fehlenden A1R-Allel weniger stark und in Tieren ohne A1R-Allele supprimiert

wird (Masino et al., 2011). Dieser Effekt kann durch Glukosegabe oder A1R-Blockade

aufgehoben werden. Dazu passend wurde in Pyramidenzellen der CA3 entdeckt, dass

verringerte extrazelluläre Glukoseverfügbarkeit bei zugleich ausreichend oder


24

vermehrtem intrazellulären ATP (eine Situation wie bei einer ketogenen Diät) über

extrazelluläres Adenosin an A1R zu einer verringerten neuronalen Erregbarkeit führt

(Kawamura et al., 2010). Dieses Adenosin entsteht durch Dephosphorylierung von

ATP, das in dieser Situation autoregulatorisch über Pannexin-1 freigesetzt wird und

dann an A1R wirkt, die in funktioneller Verbindung mit KATP-Kanälen zu einer

Hyperpolarisierung der Neuronen führen. Durch eine chronische ketogene Diät wird in

der Ratte die Aktivität von glykolytischen und Zitratzyklus-assoziierten Enzymen nicht

verändert (Bough et al., 2006), wobei Energiestoffwechsel-assoziierte Enzyme und

mitochondriale Proteine verstärkt exprimiert werden. Elektronenmikroskopisch wurden

im Gyrus dentatus mehr Mitochondrien gezählt als bei mit Standarddiät gefütterten

Kontrollratten. In einem Mausmodell für Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-

Mangel konnte eine ketogene Diät die Zahl der hippokampalen Mitochondrien wieder

erhöhen und damit die ATP-Konzentration normalisieren (Nylen et al., 2009).

In einer Mikrodialysestudie in Ratten, die über 15 Tage eine ketogene Diät

erhielten, fand man im Vergleich zu Kontrolltieren einen Anstieg der GABA- und

Agmantin-Konzentration, wobei Glutamat unverändert blieb (Calderon et al., 2017). In

GABAergen Neuronen der Substantia nigra in Gehirnschnitten von noch gesäugten

Mäusen und Ratten verursachen ß-Hydroxybutyrat wie auch Azetoazetat die Öffnung

von KATP-Kanälen und damit eine Hemmung ihres Feuerns (Ma et al., 2007). Die

Autoren stellen die Hypothese auf, dass die ATP-Konzentration durch eine ketogene

Diät zwar global gesteigert wird, aber die glykolytische ATP-Bildung lokal an der

neuronalen Plasmamembran sinkt. Hierdurch werden die verbreitet vorkommenden

KATP-Kanäle enthemmt und es kommt zur Verminderung der neuronalen Aktivität.

Ein möglicher Wirkmechanismus von ß-Hydroxybutyrat könnte die Steigerung

der Synthese von Kynurensäure sein, die einen endogenen Antagonist von Glutamat-

und α7-nicotinergen Rezeptoren darstellt (Chmiel-Perzynska et al., 2011). In

kultivierten Astrozyten bewirkt ß-Hydroxybutyrat eine Unterdrückung der GABA-

Transaminase und der Expression von GABA-Transporter 1 (Suzuki et al., 2009).

Allerdings wird ein Einfluss auf die GABA-Konzentration kontrovers diskutiert, da es

sowohl positive als auch negative Studien hierzu gibt (McNally und Hartman, 2012).

Ein erhöhter Flux durch die Glutamatdehydrogenase könnte ursächlich für eine


25

vermehrte GABA-Synthese sein, wenn aus Glutamat mangels Oxalacetat (im Mangel

bei einer Ketose) weniger Aspartat entsteht (Yudkoff et al., 2005).

Vesikuläre Glutamattranporter (VGLUT1-3) spielen offenbar auch eine Rolle bei

den Wirkungsweisen einer ketogenen Diät (Juge et al., 2010). Acetoacetat kann den

vesikulären Glutamattransport reversibel hemmen, indem es die allosterische

Modulation durch Chloridionen inhibiert. Diese Inhibition geschieht vermutlich über

eine kompetitive Bindung an die Chlorid-Bindungsstellen. Eine glutamaterge

synaptische Übertragung würde so gehemmt.

Die ketogene Diät zeigt neuroprotektive Eigenschaften bei einer Kainatinjektion

in zuvor über vier Wochen mit der Diät gefütterten Ratten (Noh et al., 2008) und auch

bei Ratten, deren einwöchige Fütterung mit ketogener Diät erst direkt nach einer

kontrollierten traumatischen Gehirnverletzung begann (Prins et al., 2005). Ein

möglicher Mechanismus könnte hierbei eine Abschwächung der Glutamattoxizität

durch eine Verminderung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sein, wie

es in einer Zellkulturstudie mit Azetoazetat gesehen wurde (Noh et al., 2006). Eine

chronische ketogene Diät steigert in Ratten die antioxidative Kapazität mit einem

Anstieg der Glutathion-Peroxidase im Hippokampus (Ziegler et al., 2003).

Neuroprotektiv könnte die ketogene Diät auch über die Hemmung des Kalzium-

induzierten mitochondrialen Permeabilitätsüberganges MPT) wirken, worauf eine

Studie in epileptischen Kcna1-null Mäusen hindeutet (Kim et al., 2015). In einer

Untersuchung inhibiert ß-Hydroxybutyrat selektiv Histon-Deacetylasen, wodurch die

Transkription von Genen für die Resistenzfaktoren FOXO3A (Forkhead Box O3) und

MT2 (Metallothionein 2) gegen oxidativen Stress ansteigt und somit mit ß-

Hydroxybutyrat behandelte Mäuse vor oxidativem Stress geschützt werden (Shimazu

et al., 2013).

Die ketogene Diät kann die Glutathion-Synthese erhöhen, offenbar über den

Nrf2-Transkriptionsfaktor (Nuclear Factor 2), der am Anfang einer ketogenen Diät

durch den akut hervorgerufenen und später ausgeglichenen milden oxidativen Stress

aktiviert wird (Milder et al., 2010). Dies führt zu einer chronischen zellulären

Anpassung mit einem verbesserten mitochondrialen Redoxstatus. Eine Injektion des

Transkriptionsfaktors in viralen Vektoren in Mäusen zwei Wochen nach


26

pilocarpininduziertem Status epilepticus führte zu Neuroprotektion, weniger

generalisierten Anfällen und verminderter Microgliaaktivierung (Mazzuferi et al., 2013).

Eine ketogene Diät kann in Mäusen durch Aktivierung des mitochondrialen

Entkopplungsproteins (UCP) die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies senken (Sullivan

et al., 2004).

In Mäusen wurde durch ß-Hydroxybutyrat das NLRP3-Inflammosom (NLR

(Nucleotide-Binding Domain, Leucine-Rich Repeat) Family Pyrin Domain Containing

3) in verschiedenen Krankheitsmodellen inhibiert und somit die IL-1ß-Sekretion

vermindert (Youm et al., 2015). Dieses Inflammasom ist unter anderem Teil des

Entzündungsgeschehens bei Epilepsie (Zhou et al., 2016, Meng et al., 2014). Für

Azeton wurden direkte antikonvulsive Wirkungen in verschiedenen Tiermodellen

beschrieben (Likhodii et al., 2008), für ß-Hydroxybutyrat wurde eine Erhöhung der

Anfallsschwelle im Pilocarpinmodell in Mäusen gefunden (Yum et al., 2012).

Acetoacetat inhibiert spannungsabhängige Ca2+-Kanäle und vermindert

exzitatorische postsynaptische Potentiale in Gehirnschnitten mit epileptiformer

Aktivität (Kadowaki et al., 2017).

Somit sind für die ketogene Diät viele Teilaspekte der Wirkungsentfaltung gezeigt oder

postuliert worden. Dennoch sind hier noch viele Fragen offen. Beschreibungen einer

deutlich verminderten Anfallshäufigkeit bei Patienten noch über die Dauer der

ketogenen Diät hinaus (Hemingway et al., 2001, Marsh et al., 2006) geben Hinweise

darauf, dass die ketogene Diät krankheitsmodifizierende Effekte haben könnte. Eine

Studie im Kainatmodell in Ratten fand einen positiven Effekt im Hinblick auf die

späteren spontanen Anfälle (Muller-Schwarze et al., 1999).

2.2.5.3 Wirkungsweisen der 2-Desoxy-D-Glukose

2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) ist ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt (Xi et

al., 2014). Die 2-DG befindet sich derzeit in der präklinischen Entwicklung zum

therapeutischen Einsatz bei Epilepsie (Bialer et al., 2015). Bezüglich der Entwicklung

zur Verwendung von 2-DG in der Onkologie wurden schon Ergebnisse von klinischen

Phase I/II-Studien publiziert. Diese zeigen eine gute Verträglichkeit (Stein et al., 2010,

Singh et al., 2005, Raez et al., 2013). 2-DG führt in Brustkrebszellen dosisabhängig zu


27

einer verstärkten Expression von GLUT1, damit zu verstärkter Aufnahme in die Zelle,

zu Glukosedeprivation und schließlich zur Apoptose (Aft et al., 2002).

2-DG wird wie Glukose in Zellen aufgenommen und zu 2-DG-6-Phosphat

phosphoryliert (Kipnis und Cori, 1959), akkumuliert dann aber intrazellulär, weil sie nur

noch über den Pentosephosphatweg weiter verstoffwechselt werden kann (Zabos et

al., 1978, Forte et al., 2016) und damit zu vermehrt NADPH führt. 2-DG-6-Phosphat

inhibiert die Glukoseaufnahme über die Glukosetransporter (Kipnis und Cori, 1959)

und konkurriert mit Glukose-6-Phosphat um die Phosphoglukoseisomerase (Wick et

al., 1957, Nirenberg und Hogg, 1958). Außerdem scheint 2-DG-6-Phosphat die

Hexokinase allosterisch zu hemmen (Chen und Gueron, 1992). Durch die Blockade

der glykolytischen Energiegewinnung wird alternativ die Synthese von Ketonkörpern

stimuliert, was zu einer Verbesserung der Mitochondrienfunktion führt (Yao et al.,

2011). Diese Eigenschaften führen wahrscheinlich dazu, dass 2-DG sowohl

antikonvulsive, als auch prokonvulsive Wirkung haben kann (Gasior et al., 2010). Die

antikonvulsive Wirkung wird zu einem Teil der Hemmung der Glukoseaufnahme und

vor allem der Hemmung der Glykolyse und nachfolgender Verstärkung des

Pentosephosphatweges zugeschrieben, die prokonvulsive Wirkung vor allem der in

der jeweiligen Situation übermäßigen Hemmung der Glukoseaufnahme.

2-DG führt über eine verstärkte Neurosteroidproduktion (über den

Pentosephosphatweg) mit Wirkung auf extrasynaptische GABAA-Rezeptoren zu einer

verstärkten GABAergen tonischen Inhibition im Hippokampus (Forte et al., 2016). 2-

DG vermindert in einem Kindlingmodell die anfallsinduzierte Hochregulierung von

BDNF und TrkB im Hippokampus, die für das Kindling erforderlich sind (Garriga-Canut

et al., 2006). Dies geschieht über den Transkriptionsrepressor NRSF und seinen

NADH-sensitiven Ko-Repressor CtBP – durch die NADH-Verringerung im Rahmen der

Glykolyseinhibition bewirkt 2-DG die Dissoziation von CtBP von NRSF, wodurch die

Expression von BDNF und TrKB vermindert wird. Anderenfalls würde durch die

neuronale Aktivierung auch die Glykolyse gesteigert und folglich mehr NADH

produziert. Die Hochregulierung von den KATP-Kanaluntereinheiten Kir6.1 und Kir6.2

wird auch als antiepileptische Wirkungsweise der 2-DG beschrieben (Yang et al.,

2013). Es wäre möglich, dass durch eine Hemmung der Glykolyse in Membrannähe


28

weniger ATP vorhanden ist, wodurch sich die KATP-Kanäle öffnen und es zu einer

Hyperpolarisation der Zelle kommen würde (Ma et al., 2007). 2-DG wird von

metabolisch aktiven Zellen aufgenommen und wirkt somit aktivitätsabhängig (Masino,

2016). Eine Studie im Kainatmodell in Ratten zeigt, dass 2-DG

konzentrationsabhängig (in moderaten Dosen) neuroprotektiv wirkt, die Bildung

reaktiver Sauerstoffspezies hemmen und die intrazelluläre Kalzium-Homöostase

bewahren kann (Lee et al., 1999). Das Hitzeschockprotein HSP70 und das

glukoseregulierte Protein GRP78 werden in Gegenwart von 2-DG in hippokampalen

Neuronen vermehrt gebildet und führen wahrscheinlich zu der erhöhten Resistenz

gegenüber oxidativem und metabolischem Stress – durch die Unterdrückung von

ROS-Bildung, den Erhalt des Kalzium-Gleichgewichts und der mitochondrialen

Funktion. Entscheidend für die Verträglichkeit und positive Wirkung der 2-DG scheint

neben der Dosis auch das Behandlungsregime zu sein, da eine chronische Gabe

intrazerebroventrikulär pro-epileptogene Effekte in Ratten zeigt (Samokhina et al.,

2017). Die 2-DG könnte antiepileptogene Wirkungen haben, wie ein Tagungsbeitrag

zum Kindlingmodell in Ratten über den Tractus perforans (Sutula und Franzoso, 2008)

vermuten lässt, da die Gabe von 2-DG bis zu 10 Minuten nach den Anfällen zu einer

verlangsamten Kindlingprogression führt.

2.3 Positronen-Emissionstomographie und Epilepsie

2.3.1 Prinzip und Bedeutung der Positronen-Emissionstomographie

Die Positronen-Emissions-Tomographie ist eine Bildgebungsmethode, die seit den

1970er Jahren für den Einsatz am Menschen entwickelt (Bankstahl und Bankstahl,

2012) und klinisch in vielen Anwendungsgebieten eingesetzt wird. Beispielsweise dient

sie in der Onkologie zur Diagnose von Tumoren, in der Kardiologie zur Untersuchung

der myokardialen Perfusion und in der Neurologie unter anderem zur

Charakterisierung früher Stadien von Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson (Miller

et al., 2008). Die Entwicklung von Scannern mit einer besonders hohen Auflösung von

unter 1,5 mm, die zur Untersuchung von Ratten- und Mausmodellen geeignet sind,

begann allerdings erst Ende der 1990er Jahre (Bankstahl und Bankstahl, 2012) und

brachte damit ganz neue Möglichkeiten für die präklinische Forschung.


29

Die biologische Grundlage der PET liegt darin, dass ein zu untersuchendes

Molekül, der sogenannte Radiotracer, radioaktiv markiert in vivo auf der Ebene des

vollständigen lebenden Organismus detektiert und visualisiert wird (Cherry und

Gambhir, 2001). Der am häufigsten eingesetzte Radiotracer ist [18F]FDG

(Dedeurwaerdere et al., 2007), der sowohl für die Epilepsiediagnostik als auch die

Epilepsieforschung wichtig ist und im Abschnitt 2.3.2 charakterisiert wird. Mit der

Darstellung der Verteilung des Radiotracers können dessen Transport, seine

Verstoffwechselung und Ausscheidung, aber auch Interaktionen oder

Signaltransduktionen zwischen Organen untersucht werden. Bei dynamischen PET-

Untersuchungen kann nach intravenöser Radiotracer-Injektion die Tracerverteilung

über die Zeit hinweg direkt nachvollzogen werden. Einsatzgebiete sind beispielsweise

Untersuchungen von Blutfluss, Stoffwechsel von Substraten, Proteinsynthese,

Rezeptoren, Enzymaktivität und Genexpression (Cherry und Gambhir, 2001, Xi et al.,

2011).

Die Entdeckung der physikalischen Grundlage dieser Technik, die Emission von

Positronen aus radioaktiven Kernen, begann ab 1933 (Bailey et al., 2004). Beim ß+-

Zerfall besteht das emittierte Positron nur etwa für 10-9 s, bevor es mit einem Elektron

zusammentrifft und beide mit der Annihilation in zwei entgegengesetzt wegstrahlende

Photonen mit einer Energie von je 511 keV überführt werden (Geworski et al., 2005).

Der ß+-Zerfall kommt nur bei künstlich hergestellten Radionukliden vor. Bei der

Durchdringung von Materie wird diese Strahlung durch Photoabsorption und Compton-

Streuung abgeschwächt. Bei der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wird nun

die Annihilationsstrahlung des zuvor in Form eines Radiopharmakons inkorporierten

ß+-Strahlers mittels Koinzidenzmessung durch einen Detektorring erfasst (siehe

Abbildung 5). Die Koinzidenzauflösungszeit ist abhängig von Laufzeitunterschieden

der у-Quanten und der Güte des Detektormaterials. Ansonsten ist das Messergebnis

abhängig von der Detektorfläche, der Detektoranzahl, der Detektorendichte, den

Zählverlusten bei starker Strahlung und der Absorption der Strahlung auf dem Weg

zum Detektor. Die in den Organismus injizierte Dosis an Strahlung wie auch die

Aquisitionsdauer sind weitere entscheidende Bildparameter für das Signal-Rausch-

Verhältnis (Cherry und Gambhir, 2001).


30

Abbildung 5: (Miller et al., 2008)

Prinzip der PET: Der injizierte

Radiotracer zerfällt während

seiner Verteilung im Körper und

strahlt Positronen ab. Bei dem

Zusammentreffen mit Elektronen

im Gewebe kommt es zur

Annihilation und zwei diametral

voneinander wegstrahlende у-

Quanten entstehen, die dann als

Koinzidenz vom Detektorring

erfasst werden.

Ein großer Vorteil der PET ist, dass fast alle biologisch aktiven Strukturen aus

Elementen bestehen, zu denen passende Radioisotope verfügbar sind. Somit kann

man diese radioaktiv markieren, ohne ihre biologische Funktionsweise zu beeinflussen

(Schnöckel et al., 2010). Wichtig ist, dass die Menge an benötigtem Radiotracer

abhängig von seiner spezifischen Aktivität ist (= Radioaktivität / Masse des Tracers)

und meist deutlich unter einer für pharmakologische Wirkungen nötigen Konzentration

im Körper vorliegt (Virdee et al., 2012). Im Gegensatz zu möglichen anderen

Techniken wie Autoradiographie oder Immunhistochemie ist die Methode nicht final,

erfordert also verhältnismäßig geringe Tierzahlen, da longitudinale Studien

durchgeführt werden können und die Tiere teilweise zugleich als ihre eigene Kontrolle

dienen können (Bankstahl und Bankstahl, 2012, Schnöckel et al., 2010). Zudem

können die Entwicklung und der Verlauf einer Erkrankung mitsamt Therapiewirkungen

innerhalb ein und desselben Tieres verfolgt werden (Dedeurwaerdere et al., 2007).

2.3.2 [18F]FDG und zerebraler Glukosemetabolismus

Das Glukoseanalogon 2-[18F]Fluoro-desoxy-D-Glukose ([18F]FDG) ist der in Klinik und

Forschung am häufigsten eingesetzte Radiotracer (Dedeurwaerdere et al., 2007).

[18F]FDG dient der Untersuchung der Glukoseaufnahme und des

Glukosemetabolismus, mit hauptsächlichem Einsatz als Tracer in der Onkologie, der

Neurologie und der Kardiologie. Durch die [18F]FDG-PET kann damit zusätzlich zu


31

einer diagnostischen Beurteilung auch die Effektivität einer Tumor-Therapie überwacht

werden. [18F]FDG wird genau wie Glukose in die Zelle aufgenommen, dort aber nicht

wie Glukose letztlich in den Zitronensäure-Zyklus eingebracht, sondern als

Fehlmetabolit in der Zelle „gefangen“ („Trapping“). Insbesondere bei

pharmakoresistenten Epilepsiepatienten besteht ein klinischer Einsatz der [18F]FDG-

PET darin, die Position und Ausdehnung des epileptischen Fokus vor einer möglichen

chirurgischen Resektion näher einzugrenzen, wenn eine MRT kein oder kein

eindeutiges Ergebnis geliefert hat (Bankstahl und Bankstahl, 2012). Bei Patienten mit

Temporallappenepilepsie, der häufigsten Epilepsieform (Löscher und Brandt, 2010),

findet man durch die [18F]FDG-PET bei fast 20 % der Kinder und bei bis zu 50 % der

Erwachsenen mit kürzlich begonnenem Anfallsauftreten einen Hypometabolismus. Bei

Patienten mit subklinischen Anfällen oder interiktalen Spikes ist die [18F]FDG-PET

hingegen mit einem Hypermetabolismus assoziiert (Stefan und Theodore, 2012). Auch

präklinische PET-Untersuchungen in Nagermodellen zeigen, dass Veränderungen im

zerebralen Glukose-Stoffwechsel während der Epileptogenese auftreten.

Übereinstimmend mit den klinischen Befunden finden sich eine erhöhte Aufnahme von

[18F]FDG im Hippokampus in verschiedenen Anfalls- und Epilepsiemodellen bei Ratten

und Mäusen (Mirrione et al., 2006, Kornblum et al., 2000). Im Pilocarpinmodell der

Ratte zeigt die [18F]FDG-PET bereits in der frühen Latenzphase nach einem Status

epilepticus in diversen Gehirnregionen eine Abnahme des Glukosemetabolismus, die

während der chronischen Phase der Epilepsie im Hippokampus und Thalamus

bestehen bleibt (Guo et al., 2009). Eine weitere Studie an Ratten nach systemischer

Kainat-Injektion ergab, dass der hippokampale Hypometabolismus im Laufe der

Latenzphase etwas abnimmt und schließlich wieder deutlicher wird, sobald die ersten

spontanen Anfälle auftreten (Jupp et al., 2012). Anhand dieser und weiterer Arbeiten

lässt sich darauf schließen, dass Veränderungen des Glukosemetabolismus eine

wichtige Rolle bei der Entwicklung von Epilepsien spielen. Da nicht alle Patienten bzw.

Tiere nach einem Hirninsult auch eine Epilepsie entwickeln, werden die

glukometabolischen Veränderungen auch als prognostischer PET-Biomarker für ein

erhöhtes Risiko zur Epileptogenese diskutiert. Eine mögliche Hemmung oder

Normalisierung dieser glukometabolischen Veränderungen stellt eine


32

vielversprechende Strategie zur Epilepsie-Prävention oder Krankheitsmodifikation dar.

Bisher stehen Studien, die eine potentielle pharmakotherapeutische Beeinflussbarkeit

dieser metabolischen Veränderungen untersuchen, allerdings noch weitestgehend

aus.

2.3.3 [18F]GE-180 und TSPO

Der Radiotracer [18F]GE-180 (Flutriciclamid) ist ein Ligand des sogenannten

„Translocator Protein“ (TSPO). Dieses Protein hat ein Molekulargewicht von 18kDa

und kommt hauptsächlich in der äußeren Mitochondrienmembran vor (Papadopoulos

et al., 2006). Die TSPO-PET hat sich als geeignete Methode gezeigt, um longitudinal

Entzündungsverläufe während der Epileptogenese im Pilocarpinmodell in Ratten zu

untersuchen (Brackhan et al., 2016, Yankam Njiwa et al., 2016b). Ratten zeigten

während der frühen Epileptogenese im Kainatmodell ein erhöhtes TSPO-PET-Signal

im Hippokampus und der Amygdala (Dedeurwaerdere et al., 2012). Die

immunhistochemisch nachgewiesene Microglia-Aktiverung korrelierte mit der

Autoradiographie zur Untersuchung der TSPO-Expression. Eine weitere Studie im

Kainatmodell in Ratten zeigte ebenfalls eine deutlich erhöhte TSPO-Expression

während der Epileptogenese, die auch während der chronischen Epilepsie noch

detektierbar war, und mit Microglia-Aktivierung und Neurodegeneration korrelierte

(Amhaoul et al., 2015). In Ratten nach elektrisch induziertem Status epilepticus wurde

mit TSPO-PET ein stärkeres TSPO-Signal gefunden, wenn Anfälle nicht erfolgreich

mit Phenobarbital supprimiert werden konnten (Bogdanovic et al., 2014). Tiere mit

erfolgreicher Phenobarbitaltherapie zeigten hinsichtlich der TSPO-Expression keine

Unterschiede zu Kontrolltieren, obwohl beide Tiergruppen nach Status epilepticus

histologisch eine Neurodegeneration und eine Microglia-Aktivierung zeigten.

TSPO scheint bei verschiedensten pathologischen Geschehen eine Rolle zu

spielen, unter anderem bei Alzheimer, Parkinson, Metastasierung, Entzündung und

Angststörungen (Li et al., 2016). 1977 wurde es als ein Benzodiazepin-bindendes

Protein in peripheren Geweben entdeckt (Braestrup und Squires, 1977). Seitdem

wurde es als wichtig erachtet für den Cholesteroltransport von der äußeren zur

innneren Mitochondrienmembran (Krueger und Papadopoulos, 1990) und mit einer


33

regulierenden Funktion auf die Steroidgenese (Mukhin et al., 1989), einer

immunmodulatorischen Wirkung (Lenfant et al., 1986) und mit regulierendem Einfluss

auf die Zellatmung (Hirsch et al., 1989) beschrieben. Bis heute ist seine Rolle in der

Steroidsynthese nicht geklärt. TSPO kann allgemein als Orphan-Rezeptor

beschrieben werden, da unbekannt ist, welche Liganden physiologisch relevant sind

(Li et al., 2016). Allerdings gibt es erste Studien, die Liganden wie Etifoxin erfolgreich

gegen Angststörungen einsetzen konnten (Nguyen et al., 2006). Der Ligand Ro5-4864

zeigte sich als neuroprotektiv in einem Rattenmodell für periphere diabetische

Neuropathie (Giatti et al., 2009).

Es gibt mehrere Generationen von Tracern für die TSPO-PET. Der

antagonistische TSPO-Ligand [11C]PK11195 gehört zur ersten Generation und wird

als Tracer für Neuroinflammation bei der Forschung in vivo zu Schlaganfall,

Neurodegeneration, traumatischer Gehirnverletzung und Neoplasien eingesetzt

(Turkheimer et al., 2015). [18F]GE-180 als TSPO-Ligand der neueren Generation hat

den Vorteil, dass kein Zyklotron für die Produktion vor Ort nötig ist, da die Halbwertszeit

von 18F bei 109,8 Minuten liegt (bei 11C nur bei 20,4 Minuten). Es gibt wie bei

[11C]PK11195 zwei Enantiomere, die unterschiedliche Bindungseigenschaften

aufweisen (Chau et al., 2015). Auch zeigt es eine gute Lipophilität (Feeney et al.,

2016). [18F]GE-180 wurde als Entzündungsmarker während der Therapie in einem

chronischen Rattenmodell für multiple Sklerose eingesetzt (Airas et al., 2015) und des

Weiteren im PS2APP Alzheimer-Mausmodell (Brendel et al., 2016). Die Ergebnisse

bei der Verwendung dieses Radiotracers in der Bildgebung korrelieren gut mit

Autoradiographie und immunhistochemischen Methoden. Das Signal-Rausch-

Verhältnis zeigte sich als verbessert im Vergleich zum Einsatz von [11C]PK11195 in

einem Rattenmodell für Schlaganfall (Boutin et al., 2015) und einem akuten

Lipopolysaccharid-induzierten Modell für Entzündung des zentralen Nervensystems

(Dickens et al., 2014).

Erste TSPO-PET-Studien in einzelnen epileptischen Patienten sind

beschrieben und zeigen zum Teil gute Übereinstimmungen mit anderen Methoden bei

der Lokalisation von Anfallsherden (Theodore, 2017). Eine klinische Studie in einem


34

kleinen Patientenkollektiv konnte mit TSPO-PET Entzündungsvorgänge bei Epilepsie

darstellen (Gershen et al., 2015).

2.3.4 [18F]Flumazenil und zentraler Benzodiazepinrezeptor

Das Benzodiazepinderivat Flumazenil wurde 1981 mit einer hohen Bindungsaffinität

an den zentralen Benzodiazepinrezeptor beschrieben (Hunkeler et al., 1981).

Flumazenil wird klinisch hauptsächlich eingesetzt, um im Notfall die Depression von

Kreislauf und Respiration bei einer Benzodiazepin-Sedation zu antagonisieren (Neave

et al., 2000). Die Autoren zeigen, dass Flumazenil nicht wie ursprünglich angenommen

kaum intrinsische Wirkungen besitzt, sondern die Kognition, die Stimmung und den

Kreislauf beeinflussen kann. Flumazenil zeigte in Mäusen bei Injektion in die

Amygdala anxiolyseähnliche Effekte (Barbalho et al., 2009). Auch der Schlaf- und

Wachzustand können beeinflusst werden über agonistische, invers agonistische und

antagonistische Effekte auf den Benzodiazepinrezeptor (Steiger et al., 1994).

[18F]Flumazenil wurde als Alternative zu [11C]Flumazenil entwickelt, wiederum

mit dem Vorteil, unabhängig von einem Zyklotron in direkter räumlicher Nähe zu sein.

Es zeigt sich als dem [18F]Fluoroflumazenil durch ein besseres Signal-Rausch-

Verhältnis überlegen, mit einer langsameren Verstoffwechslung und geringeren

Metabolitenkonzentrationen im Gehirn (Dedeurwaerdere et al., 2009). Da Fluor schon

im Flumazenil-Molekül an sich vorliegt, gleichen die Bindungseigenschaften denen von

[11C]Flumazenil (Odano et al., 2009, Ryzhikov et al., 2005). Die Zeit-Aktivitätskurven

sind wie das kinetische Verhalten vergleichbar (Odano et al., 2009).

Im epileptischen Patienten konnten mit [11C]Flumazenil-PET epileptische Foki als

Areale verminderter Tracer-Bindung dargestellt werden (Savic et al., 1988). Die

Autoradiographie mit [11C]Flumazenil in Gewebe von Patienten mit

Temporallappenepilepsie ergab eine Abnahme der Tracer-Bindung in anterioren

mesialen temporalen Regionen, die mit dem Ausmaß der Neurodegeneration durch

die Hippokampussklerose korrelierte (Burdette et al., 1995). Eine Korrelation zwischen

verminderter [11C]Flumazenil-Bindung und Neurodegeneration, Astrogliose und

vermindertem Hippokampusvolumen wurde in einer Kombinationsstudie mit PET,

MRT und Histologie bei Patienten mit Temporallappenepilepsie gesehen (Lamusuo et


35

al., 2000). Bei einer Studie in Kindern mit Extratemporallappenepilepsie war

[11C]Flumazenil-PET sensitiver als [18F]FDG-PET in der Detektion von kortikalen

Anfallsursprungsregionen (Muzik et al., 2000). Der Einsatz der [11C]Flumazenil-PET in

der prä-chirurgischen Untersuchung zeigte sich in einer prospektiven Studie mit 100

epileptischen Patienten insofern positiv, als dass sie zu MRTund [18F]FDG-PET

zusätzliche nützliche Informationen zum Anfallsursprung liefern konnte (Ryvlin et al.,

1998). Eine Wiederholung der [11C]Flumazenil-PET eine Woche nach der ersten

Untersuchung kann ihre Sensitivität und Spezifität bezüglich der prächirurgischen

Lokalisierung eines Anfallherdes erhöhen (Bouvard et al., 2005). Interessanterweise

war in dieser Studie die im kinetischen Modeling berechnete totale Dichte von

Rezeptoren umso geringer, je kürzer das Inter-Anfalls-Intervall war. In einer Phase

I/IIa-Studie wurde gezeigt, dass [18F]Flumazenil-PET in Verbindung mit einem

kinetischen Modeling eine epileptogene Zone in Form eines reduzierten

Tracerbindungspotentials deutlich begrenzter anzeigt, als es bei der Verwendung von

[18F]FDG als PET-Tracer zur Darstellung des Hypometabolismus der Fall ist (Vivash

et al., 2013), was in einem weiteren Vergleich bestätigt werden konnte (Hodolic et al.,

2016). Im Rattenmodell zeigte sich fünf Wochen nach intraperitonealer Kainatinjektion

und nachfolgendem Status epilepticus mit [18F]Flumazenil-PET eine Abnahme der

intrahippokampalen Rezeptordichte bei gleichzeitiger Zunahme der berechneten

Affinität (Vivash et al., 2014). Dies stand nicht in direktem Zusammenhang mit

hippokampaler Volumenabnahme oder Zellverlust.

Der zentrale Benzodiazepinrezeptor wird durch α- und у-Untereinheiten der

GABAA-Rezeptoren, die als Heteropentamer angeordnet sind, gebildet (Leidenheimer,

2008, McKernan et al., 1995). In einem Modell für Status epilepticus aus kultivierten

hippokampalen Neuronen verringert sich die GABAerge synaptische Inhibition nach

andauernden epileptiformen Entladungen durch Internalisierung von GABA-

Rezeptoren (Goodkin et al., 2005). Verminderte postsynaptische GABA-Ströme

zusammen mit weniger nachweisbaren α-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors durch

verminderte Membranexpression des GABAA-Rezeptors werden auf den Membranen

kultivierter hippokampaler Neuronen in einem Modell für Epileptogenese beobachtet

(Blair et al., 2004). Eine Blockade der Internalisierung führt zu einem Sistieren der

3 Ziele der Arbeit

36

spontanen wiederkehrenden epileptiformen Entladungen. Die Internalisierung der

GABAA-Rezeptoren wird mit als Ursache für den Übergang von einzelnen Anfällen in

einen Status epilepticus und für dessen Resistenz gegenüber Benzodiazepinen

vermutet (Naylor et al., 2005). Eine autoradiographische Untersuchung im

Kainatmodell in Ratten fand 24 Stunden nach Status epilepticus eine Erhöhung der

Dichte des zentralen Benzodiazepinrezeptors im Hippokampus und im Cortex (Vivash

et al., 2011). Zwei, vier und sechs Wochen später war die Dichte der zentralen

Benzodiazepinrezeptoren im Hippokampus vermindert, nicht aber im Gyrus dentatus,

wobei die Rezeptorbindungsaffinität zu keinem Zeitpunkt verändert war. Eine

verminderte Rezeptordichte konnte auch zwei und sieben Tage nach Kainatinjektion

in Ratten mit [11C]Flumazenil-PET festgestellt werden (Syvänen et al., 2012), ebenso

in vollständig über die Amygdala gekindelten Ratten (Liefaard et al., 2009).

3 Ziele der Arbeit

Das übergeordnete Ziel der Arbeit war die longitudinale Untersuchung des zerebralen

Glukosestoffwechsels im Verlauf der Epileptogenese mittels [18F]FDG-PET in

geeigneten Tiermodellen. Zugleich auftretende zerebrale Veränderungen während der

frühen Epileptogenese sollten im Kontext untersucht werden. Zwei Therapieansätze,

die 2-DG und die ketogene Diät, sollten hinsichtlich ihrer potentiellen antiepileptogenen

Effektivität und ihres Einflusses auf die untersuchten Veränderungen des zerebralen

Glukosestoffwechsels untersucht werden.

Das spezifische Ziel der ersten Studie im kornealen Kindlingmodell war die

Untersuchung der antiepileptogenen Wirksamkeit von 2-DG in diesem Tiermodell.

[18F]FDG-PET sollte zur Untersuchung des Einflusses des kornealen Kindlings, der 2-

DG und der Kombination aus Kindling und 2-DG auf den zerebralen

Glukosestoffwechsel eingesetzt werden. Zugleich sollten durch immunhistochemische

Untersuchungen eine potentiell auftretende Inflammation und die Expression von

Glukosetransportern der Blut-Hirn-Schranke dargestellt werden, um gezeigte

3 Ziele der Arbeit

37

Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels und potentielle antiepileptogene

Wirkungen in einen Kontext einordnen zu können. Die Arbeitshypothesen waren:

- Korneales Kindling und die 2-DG haben Effekte auf den zerebralen

Glukosestoffwechsel, die mit [18F]FDG-PET darstellbar sind.

- Die quantitative Auswertung der [18F]FDG-PET-Daten mit einem kinetischen

Modeling gibt Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von 2-DG und kann

zugleich als theranostischer Marker eingesetzt werden.

- Die chronische Gabe von 2-DG wirkt anti-inflammatorisch und beeinflusst die

Expression von GLUT1.

In der zweiten Studie im Pilocarpinmodell sollten Veränderungen der Blut-Hirn-

Schranke und dabei involvierter Zellen im Verlauf der frühen Epileptogenese nach

einem Gehirninsult detailliert multimodal untersucht werden, um Hinweise darauf zu

erlangen, welche Mechanismen als mögliche therapeutische Angriffspunkte für eine

antiepileptogene Therapie in Frage kommen. Die Arbeitshypothesen waren:

- Kontrastmittelverstärkte MRT und histologische Untersuchung der FITC-

Albumin-Extravasation nach Status epilepticus ermöglichen eine präzise

Darstellung der zeitlich-räumlichen Ausprägung der gesteigerten

Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke während der frühen Epileptogenese

und damit eine Eingrenzung des therapeutischen Zeitfensters.

- Die Extravasation von FITC-Albumin führt zu veränderten Immunsignalen von

zellulären und strukturellen Komponenten der neurovaskulären Einheit.

In der dritten Studie im intrahippokampalen Kainatmodell wurde bewusst ein

Tiermodell für Epileptogenese nach initiierendem Gehirninsult und einer Latenzphase

ausgewählt, um potentielle antiepileptogene Eigenschaften und Mechanismen der

ketogenen Diät longitudinal zu untersuchen. Die Arbeitshypothesen waren:

- Die Fütterung einer ketogenen Diät über die Dauer der Latenzphase im

intrahippokampalen Kainatmodell wirkt antiepileptogen.

- Die Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell ist mit Veränderungen

im zerebralen Glukosemetabolismus, der GABAA-Rezeptordichte und mit

4 Material und Methoden

38

Microgliaaktivierung verbunden, welche mittels [18F]FDG-PET, [18F]GE-180-

PET bzw. [18F]Flumazenil-PET darstellbar sind.

- Die vorgenannten zerebralen Veränderungen werden durch die ketogene Diät

positiv beeinflusst, was mit den PET-Bildgebungsmarkern dargestellt werden

kann (theranostische Marker).


4.1 Versuchstiere und Haltung

Die im Folgenden beschriebenen Versuche wurden vom Niedersächsischen

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt und im

Einklang mit der EU-Richtlinie 86/609/EWG durchgeführt. Grundsätzlich wurde den

Tieren nach Ankunft im Labor mindestens eine Woche Adaptationszeit bis zum Beginn

der jeweiligen Studie gewährt. Die Ratten wurden wiederholt mittels Durchführung

gängiger Fixationsgriffe an das Handling gewöhnt. Die Mäuse konnten sich durch

wiederholtes Handling im Rahmen der Erhebung des Körpergewichts und der Ohr-

und Schwanzmarkierung (Ohrlochung in kurzer Isoflurannarkose beziehungsweise

wiederholte Filzstiftmarkierung der Schwanzwurzel) ebenfalls an den Experimentator

gewöhnen. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, das Leiden der Tiere auf ein

Minimum zu begrenzen. Die Haltungsbedingungen waren wie folgt: Die Tiere wurden

in isoliert ventilierten, zuvor autoklavierten Käfigen (Allentown, Neuss, Deutschland)

mit Einstreu und Nestbaumaterial gehalten. Autoklaviertes Trinkwasser und eine

Standard-Diät für Labornager (Altromin, Lage, Deutschland) wurden ad libitum zur

Verfügung gestellt. Die Raumtemperatur wurde konstant bei 20 – 22 °C gehalten, bei

einer Luftfeuchte von 40 – 70%. Der Tag-Nacht-Rhythmus wurde durch 14 Stunden

Hellphase (7:00 – 21:00 Uhr) und 10 Stunden Dunkelphase geregelt. Die Tiere

wurden, soweit möglich in Paaren von zwei Ratten oder in Gruppen von maximal neun

Mäusen pro Käfig gehalten.

Für die beiden Studien im kornealen Kindlingmodell und im intrahippokampalen

Kainatmodell (erstes und drittes Manuskript) wurden männliche NMRI-Mäuse von


39

Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet (Alter bei der Bestellung sechs bis

sieben Wochen). Für die Untersuchungen zur neurovaskulären Einheit (zweites

Manuskript) wurden adulte weibliche Sprague-Dawley-Ratten (200 – 220 g) von Harlan

(Horst, Niederlande) verwendet. Die Tiere wurden entweder (für den Bildgebungsteil)

zu zweit unter den oben beschriebenen Bedingungen gehalten oder für die

Verwendung in der Immunhistochemie in Gruppen von fünf Tieren in offenen Käfigen

(21 – 23 °C, 45 – 55% Luftfeuchte, Tag-Nacht-Rhythmus von 12 Stunden).

4.2 Manuskript 1: Untersuchungen im kornealen Kindlingmodell

Tiergruppen: Korneales Kindling + Vehikel n = 18

Korneales Kindling + 2-DG n = 18

2-DG n = 12

Abbildung 6: Übersicht zum Ablauf der Untersuchung im kornealen Kindlingmodell. Die Tiere wurden

für diesen Versuch über 21 Tage hinweg korneal gekindelt, um den Prozess der Epileptogenese

nachzustellen. Dies geschah zweimal täglich, mit einem Mindestabstand von sechs Stunden zwischen

beiden Stimulationen. Es wurden zwei Gruppen gekindelt, denen entweder 2-Desoxy-D-Glukose (2-

DG) oder das dazugehörige Vehikel (0,9%ige Natriumchloridlösung) jeweils eine Minute nach jeder

Stimulation verabreicht wurde, und eine ungekindelte Tiergruppe, die mit 2-DG entsprechend zweimal

täglich behandelt wurde. Die gestrichelte Linie stellt Behandlungsdauer dar. [18F]FDG-PET-Scans

wurden an drei Zeitpunkten durchgeführt: 18 – 20 Stunden nach der ersten Behandlung und vor

Beginn des Kindlings (am Abend des Scan-Tages), am 10. Tag des Kindlings und am 17. Tag des

Kindlings. Die Tiere wurden an Tag 21 nach Kindlingbeginn perfundiert, um die Gehirne für die

anschließende histologische Untersuchung zu entnehmen.


40

Nicht in der Abbildung inbegriffen, wie auch nicht in der finalen histologischen

Untersuchung und dem vorbereiteten Manuskript, ist eine zusätzliche Tiergruppe aus

12 Mäusen, die gekindelt und jeweils 30 min vor jeder Kindlingstimulation mit 2-DG

behandelt wurde (siehe Anhang).

4.2.1 Corneales Kindling

Für das korneale Kindling wurde ein Stimulator (ECT UNIT, 57800) der Firma Ugo

Basile, Italien, verwendet. Mit dem Kindling wurde am Abend des ersten PET-Scan-

Tages begonnen, also in etwa mit einem Tag Abstand zur ersten 2-DG-Behandlung.

Über die 21 Tage des kornealen Kindlings, das zweimal täglich an den Tieren mit

einem minimalen Inter-Stimulus-Intervall von sechs Stunden durchgeführt wurde,

waren die Stimulusparameter wie folgt: monopolar, drei Sekunden Dauer, Frequenz

von sechs Hertz, Stromstärke von 44 Milliampere, Pulsdauer von 0,2 Millisekunden.

Diese Parameter wurden einer vorherigen Beschreibung des kornealen Kindlings

entnommen (Leclercq et al., 2014). Mindestens eine Viertelstunde vor jedem

Stimulationsdurchgang wurde der Stimulator eingeschaltet, die mit Leder bezogenen

Korneaelektroden in sterile physiologische Kochsalzlösung getaucht und die

Funktionsfähigkeit des Stimulators getestet. Zuvor wurden die Tiere schon in den

Versuchsraum gebracht und die Käfigoberteile geöffnet, damit sich die Mäuse an die

Laborbedingungen gewöhnen konnten. Zwei Minuten vor jeder Stimulation wurden die

Augen der Tiere jeweils mit einem Tropfen zweiprozentiger Tetracainlösung behandelt.

Die Herstellung der Tetracainlösung wurde durch Lösung von Tetracain-Hydrochlorid

(Sigma-Aldrich, Deutschland, Steinheim, Deutschland) in Aqua ad injectabilia und

anschließender Filtrierung über sterile Spritzenvorsatzfilter (0,2 µm, VWR International

GmbH, Hannover, Deutschland) vorgenommen. Während der Stimulation wurde jedes

Tier manuell fixiert und danach augenblicklich aus dem Griff entlassen, um den Grad

der (Anfalls-)Reaktion zu beobachten. Eine Minute nach Ende des Stimulus erhielt das

Tier die jeweilige Behandlung (2-DG oder Vehikel) als intraperitoneale Injektion. Die

Zeiten zwischen Tetracainapplikation und Stimulation, sowie Stimulation und

Behandlung wurden mit einer Stoppuhr verfolgt. Der Grad der Anfalls-Antwort auf den


41

Stimulus wurde mittels des folgenden modifizierten Einstufungssystems nach Racine

(Racine, 1972) beurteilt (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Visualisierung

der Anfallsbewertung im

kornealen Kindlingmodell.

Nähere Erläuterungen finden

sich in der untenstehenden

Tabelle.

Anfallsgrad Klinisches Bild

0 Immobilität oder keine Reaktion oder Rennen und Springen

1 milder fazialer Klonus: Augenzwinkern, -schließen, Zucken der

Vibrissen, stereotypes Schnuppern

2 starker fazialer Klonus: Kauen, Kopfnicken, myoklonische

Zuckung der Vordergliedmaße

3 klonische Konvulsionen einer Vordergliedmaße ohne Aufrichten

4 klonische Konvulsionen beider Vordergliedmaßen mit oder ohne

Aufrichten

5 generalisierte klonische Konvulsionen mit sofortigem

Gleichgewichtsverlust (auch in Seitenlage)

6 tonischer Krampf der Vorder- und Hintergliedmaßen

Mäuse, bei denen mindestens acht von zehn aufeinanderfolgenden Stimulationen mit

einem Anfallsgrad von „fünf“ auftraten, galten als vollständig gekindelt und reagierten

damit zuverlässig auf einen Stimulus mit generalisierten Anfällen mit sofortigem

Gleichgewichtsverlust.

4.2.2 2-Desoxy-D-Glukose-Behandlung

Alle Behandlungen bestanden aus intraperitonealen Injektionen, die im Falle der

beiden Kindling-Gruppen jeweils eine Minute nach jeder Stimulusgabe verabreicht

0

I

II III IV

V

VI


42

wurden und im Falle der allein mit 2-DG behandelten Gruppe den Kindlingzeiten

entsprechend zweimal täglich über 21 Tage. Die Behandlung wurde am Abend vor

dem ersten PET-Scan begonnen, in einem Abstand von möglichst 18 - 20 Stunden vor

der jeweiligen Bildgebung. Am Vormittag eines jeden Bildgebungstages wurden die

Tiere nicht behandelt, um eine Messung von akuten Wirkstoff-bedingten Effekten zu

verhindern, da eine Untersuchung der Auswirkungen auf den Prozess der

Epileptogenese angestrebt war. Dementsprechend wurde auch die jeweilige Kindling-

Stimulation ausgesetzt, um das aktive Forcieren der nachgestellten Epileptogenese

nicht ohne Wirkstoff geschehen zu lassen. 2-DG (Sigma-Aldrich, Deutschland) wurde

in einer Dosierung von 250 mg/kg verabreicht, gelöst in 10 ml/kg steriler

physiologischer Kochsalzlösung als Vehikel. Die Vehikel-Behandlung geschah

entsprechend mit 10 ml/kg steriler physiologischer Kochsalzlösung. Für die Injektion

wurden Einweg-Spritzen mit einem Injektionsvolumen von einem Milliliter und Kanülen

der Größe 27 Gauge verwendet.

4.2.3 [18F]FDG-PET und Datenauswertung

Für die [18F]FDG-PET-Untersuchungen nach der ersten Behandlung und vor

Kindlingbeginn (Baseline), an Tag 10 und an Tag 17 des kornealen Kindlings wurde

ein spezifischer Kleintier-PET-Scanner verwendet (Inveon DPET, Siemens, Knoxville,

TN, USA). Zu Beginn der Prozedur wurde jedes Tier gewogen, dann mittels Isofluran

in Narkose versetzt (Einleitung mit drei Prozent Isofluran in drei Litern Sauerstoff pro

Minute). Zur Regulation der Narkosetiefe wurde die Atemfrequenz zur Orientierung

genutzt, wobei etwa 60 – 80 Atemzüge pro Minute erwünscht waren. Die

Atemfrequenz wurde mit einem Überwachungssystem gemessen (BioVet®, MILabs,

Utrecht, Niederlande). Direkt nach Anästhesiebeginn wurde ein Tropfen Blut zur

Messung der Blutglukosekonzentration mit einem Glukometer (Contour XT®, Bayer

Consumer Care, Basel, Schweiz) aus der Vena saphena oder der Vena femoralis

entnommen. Anschließend wurde ein Katheter für die spätere Radiotracerinjektion in

die laterale Schwanzvene gelegt (Katheterbestandteile: zwei 27 G Kanülen, stumpf

und spitz, ein medizinischer Mikrovolumenschlauch, Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,

Deutschland, Tygon S-54-JL, Nr. 9.205 504). Die Tiere wurden nun paarweise


43

nebeneinander in Bauchlage in die auf 37 °C geheizten Tierbetten (Minerve, Esternay,

Frankreich) verbracht. Dann wurde Augensalbe aufgetragen (Bepanthen®, Bayer Vital

GmbH, Leverkusen, Deutschland). Anschließend wurden die Tiere in definierter

Position im PET-Scanner platziert. Mit dem Start der [18F]FDG-Injektion wurde die

dynamische PET-Aufnahme gestartet. Auf die Tracer-Injektion (0,15 ml) folgte weiter

0,15 ml Spülung mit heparinisierter physiologischer Kochsalzlösung. Die

Aufnahmedauer betrug 60 Minuten. Die aufgenommenen List Mode Daten wurden in

32 Frames (5 x 2 s, 4 x 5 s, 3 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 60 s, 4 x 300 s, 3 x 600 s)

histogrammiert. Die Bildrekonstruktion in eine 128 x 128 x 159 Matrix (0,78 x 0,78 x

0,8 mm) wurde mittels eines dreidimensionalen ordered subset expectation

maximization (3D-OSEM) / maximum a posteriori (MAP) Algorithmus (β =1, OSEM

Iterationen = 2, MAP Iterationen = 18) durchgeführt. Eine Schwächungskorrektur

wurde mit Hilfe eines Transmissions-Scans durchgeführt (zwei 57 Cobalt-Quellen, 185

MBq, 20 min Aufnahmedauer). Auf den PET-Scan folgte jeweils ein zehnminütiger

Standardscan im Computertomographen (Siemens Inveon PET-CT, Knoxville, USA).

Die Scan-Prozedur endete jeweils mit einer weiteren Messung der

Blutglukosekonzentration, wobei Blut bei der Entfernung des Katheters aus der

Schwanzvene entnommen wurde. Im Anschluss wurde die Anästhesie beendet und

die Tiere konnten sich auf einer Wärmematte erholen.

Die PET-Daten wurden mit PMOD 3.6 (PMOD Technologies LLC, Schweiz)

ausgewertet. Zunächst wurde jedes CT-Bild mit dem in PMOD integrierten Standard-

MRT-Maus-Atlas (T2-gewichtet, (Ma et al., 2005)) überlagert. Daraufhin wurde das

CT-Bild mit dem jeweiligen PET-Bild koregistriert. Schließlich folgte die Transformation

mit der exakten Überlagerung von MRT-Atlas und PET-Bild.

Der [18F]FDG-Uptake wurde mittels des von PMOD angebotenen Maus-Atlas

(Mirrione et al., 2007) und einer das gesamte Gehirn einbeziehenden Region of

Interest quantifiziert. Von den durch den Atlas angebotenen Gehirnregionen wurden

folgende ausgewählt: Cortex (rechts, links), Hippokampus (dorsal, ventral, rechts,

links), Thalamus (rechts, links), Striatum (rechts, links), Amygdala (rechts, links) und

Cerebellum. Die Werte für den [18F]FDG-Uptake der einzelnen Gehirnregionen wurden


44

aus den beiden letzten Frames berechnet, also den letzten 20 Minuten der PET-

Aufnahme, und als Prozent injizierte Dosis pro Kubikzentimeter ausgedrückt. Für das

kinetische Modeling wurde das FDG 2-Compartment Model (Huang, 2008) aus dem

Modul Kinetic Modeling von PMOD verwendet. Für die Erstellung der hierfür

erforderlichen sogenannten Image-Derived Input Function (IDIF) wurde die Zeit-

Aktivitätskurve für das Gesamtblut in einer Region of Interest (2 x 2 x 4 mm) berechnet,

die in den frühen Frames der PET-Bild-Daten in die Vena cava caudalis positioniert

wurde (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). Die verwendete Lumped Constant LC

war 0,67 (Thorn et al., 2013). Diese Konstante beschreibt den Unterschied im

Verhalten des Tracers [18F]FDG zu Gukose in Bezug auf Uptake und

Phosphorylierung. Die Werte aus den beiden Messungen der Blut-Glukose-

Konzentration vor und nach jedem Scan wurden gemittelt und in das Modeling

integriert. Für die Auswertung der Modeling-Daten wurden die beiden Parameter Ki

(Net Influx Rate) und MRGlu (Glucose Metabolic Rate) eingesetzt.

4.2.4 Immunhistochemische Färbungen GLUT-1, IBA-1, GFAP und Fluoro-Jade-

C-Färbung

Zur Vorbereitung des Gehirngewebes für die histologischen Untersuchungen wurden

die Mäuse in tiefer Ketamin/Xylazin-Narkose transkardial mit 25 ml 0,01 M Phosphat-

gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und anschließend mit 25 ml vierprozentiger

Paraformaldehydlösung (Paraformaldehyd achtprozentig unter Erhitzung auf 70 °C

gelöst in destilliertem Wasser, geklärt mit 1 M Natronlauge, dann verdünnt in 0,2 M

Phosphatpuffer, pH = 7,4) perfundiert. Dies geschah mit einer peristaltischen Pumpe

(ISM596D, Ismatec, Wertheim, Deutschland), die auf eine Pumpgeschwindigkeit von

13,3 ml/min eingestellt war. Zur Perfusion wurde eine Knopfkanüle in die Spitze des

linken Ventrikels eingestochen, mit einer Klemme fixiert, die Perfusionspumpe

gestartet und sofort das rechte Atrium mit einem Scherenschnitt eröffnet. Die Gehirne

wurden entnommen, über 24 Stunden bei 4 °C in vierprozentiger

Paraformaldehydlösung gelagert und schließlich in einer Lösung aus 30% Saccharose

(AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) und 0,2% Natrium-Azid (Sigma Aldrich,

Steinheim, Deutschland) in 0,1 M Phosphatpuffer.


45

Die Gehirne wurden auf einem Gefriermikrotom in einer Schnittdicke von 40 µm

geschnitten (Frigomobil CM 1325, Leica. Wetzlar, Deutschland). Die Gewebeschnitte

wurden in 0,1 M PBS gelagert.

Grundsätzlich wurde bei jeder immunhistochemischen Anfärbung mit

freischwimmenden Schnitten wie folgt vorgegangen: Für die Färbeschritte wurden

Wellplatten verwendet. Bis zu acht Schnitte wurden in einem Well zugleich gefärbt. Für

die Spülschritte wurde die Lösung jeweils nach Augenmaß eingefüllt, für alle sonstigen

Schritte wurde ein Volumen von je einem Milliliter verwendet. Alle Inkubationen und

Spülungen wurden nach Möglichkeit auf einem Plattformschüttler durchgeführt

(Heidolph Titramax 1000, Heidolph Instruments Labortechnik, Schwabach,

Deutschland; S-3.16L, LTF-Labortechnik, Wasserburg, Deutschland; IKA-VIBRAX-

VXR, Staufen, Deutschland; je verwendetem Modell bei 60 bis 120 rpm, wobei

vorsichtig ein langsames Kreiseln der Schnitte in der jeweiligen Flüssigkeit angestrebt

wurde). Die Gewebeschnitte wurden jeweils je nach Stabilität mit einem Glashaken

oder einem feinen Pinsel in die Wells überführt. Vor jeder eigentlichen Färbung wurden

Testfärbungen mit verschiedenen in Frage kommenden Konzentrationen der

Primärantikörper angefertigt, um anschließend die optimale Konzentration verwenden

zu können. Negativkontrollen wurden grundsätzlich parallel bei jeder Färbung

angefertigt, indem der jeweilige Primärantikörper nicht zur Inkubationslösung

hinzugefügt wurde. Die Protokolle der im Folgenden genannten

immunhistochemischen Färbungen befinden sich im Anhang.

4.2.4.1 GLUT1

Der Glukosetransporter GLUT1 wurde immunhistochemisch angefärbt, entsprechend

eines modifizierten schon zuvor verwendeten Protokolls (Volk et al., 2004), das im

Anhang beschrieben wird. Der verwendete Antikörper bindet sowohl die 55 kDA- als

auch die 45 kDa-Form von GLUT1. Die erste Variante kommt in der Blut-Hirn-

Schranke vor (Gerhart et al., 1989), die zweite in Astrozyten und Oligodendrozyten (Yu

und Ding, 1998).


46

4.2.4.2 IBA1

Das Ionized Calcium-binding Adapter Molecule IBA1 wurde entsprechend dem von

Krueger et al. (2015) verwendeten Protokoll mit einer anschließenden Visualisierung

durch die Diaminobenzidin-Nickel-Methode angefärbt und zur Darstellung aktivierter

Microglia (Imai und Kohsaka, 2002) verwendet.

4.2.4.3 GFAP

Das Glial Fibrillary Acidic Protein GFAP wurde entsprechend der Methode von Härtig

et al. (2009) mit einer anschließenden Visualisierung durch die Diaminobenzidin-

Nickel-Methode angefärbt. GFAP diente zur Darstellung aktivierter Astrozyten (Yang

und Wang, 2015).

4.2.4.4 Fluoro-Jade-C-Färbung

Für die Fluoro-Jade C-Färbung wurde das selbe Protokoll verwendet wie in der Studie

(Gröticke et al., 2008). Sie dient der Darstellung degenerierender Neuronen

(Schmued, 2016).

4.2.4.5 Auswertung der Histologie

Für die IBA1- und die GFAP-Färbung wurden Schnitte der Ebenen Bregma -1,94 mm

und -3,16 / -3,28 mm verwendet (Paxinos und Franklin, 2004). In diesen Ebenen

wurden die folgenden Gehirnregionen lichtmikroskopisch (Leica, Wetzlar,

Deutschland) ausgewertet: CA1 (Cornu ammonis), CA3a/c, Hilus des Gyrus dentatus,

Thalamus und piriformer Cortex. Hier wurde eine verblindete Person eingesetzt, die

semiquantitativ die Expression von IBA1 und GFAP nach einer Skala beurteilte: 0 =

inaktive Microglia / Astrozyten, weniger als 10% aktivierte Zellen, 1 = vorwiegend

inaktive Microglia / Astrozyten mit etwa 30% aktivierten Zellen, 2 = etwa 60% aktivierte

Microglia / Astrozyten, 3 = über 90% aktivierte Microglia / Astrozyten. Die Schnitte mit

GLUT1-Anfärbung wurden zunächst unverblindet lichtmikroskopisch untersucht.

Hierbei ergaben sich keine Hinweise darauf, dass Unterschiede zwischen den

Gruppen bestanden, weshalb auf eine anschließende quantitative Analyse durch eine

verblindete Person verzichtet wurde. Die Schnitte der Fluoro-Jade-C-Färbung wurden


47

einzeln sorgfältig am Mikroskop durchgesehen, wobei sich eine weitere graduelle

Einteilung von Veränderungen ebenfalls erübrigte, da keinerlei degenerierende

Neuronen zu sehen waren (im Gegensatz als Positivkontrollen mitgeführten

Vergleichsfärbungen von Gehirnschnitten mit bekanntem Absterben von Neuronen

von Tieren nach Status epilepticus).

4.2.5. Statistik

Für die statistische Auswertung wurde GraphPad Prism 7 für Windows verwendet

(GraphPad Software, San Diego California USA). Unterschiede in den

Anfallsantworten während der Kindling-Progression und in der histologischen

Auswertung wurden mit einem Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Dunn’s

Multiple Comparison Test erfasst. Eine einfache Varianzanalyse mit Bonferroni post

hoc wurde für Vergleiche der PET-Daten zwischen den Gruppen eingesetzt, eine

Varianzanalyse mit wiederholten Messungen kombiniert mit Bonferroni post hoc

wurde Vergleichen zwischen Scan-Zeitpunkten innerhalb einer Gruppe eingesetzt.

Eine einfache ANOVA mit Bonferroni post hoc wurde auch bei weiteren Vergleichen

zwischen drei Tiergruppen eingesetzt. Für Vergleiche von zwei Datensätzen

(Anfallsschwere, Kindlingdauer) wurde ein t-Test angewendet.

4.3 Manuskript 2: Untersuchungen im Pilocarpinmodell

4.3.1 Induktion des Status epilepticus

Der Status epilepticus wurde in den Ratten wie schon zuvor beschrieben (Bankstahl

et al., 2012, Brackhan et al., 2016) induziert. 127 mg/kg Lithiumchlorid (Sigma Aldrich,

Schnelldorf, Deutschland) wurden hierzu in 3 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung

peroral am Vorabend (14 – 16 Stunden vor) der Status-Induktion verabreicht. 30

Minuten vor der Pilocarpingabe wurde Methylscopolamin (Sigma Aldrich, Schnelldorf,

Deutschland; 1 mg/kg in 2 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung) intraperitoneal

injiziert. Pilocarpin (Sigma Aldrich, Schnelldorf, Deutschland) wurde fraktioniert nach

Bedarf in einem Abstand von 30 Minuten (bis zu dreimal) injiziert: die erste Injektion


48

bestand aus 30 mg/kg in 1ml/kg physiologischer Kochsalzlösung, die weiteren nur aus

einem Drittel der Dosierung. Nach 90 Minuten wurde der Status epilepticus mit

Diazepam (Diazepam-Ratiopharm, Ratiopharm, Ulm, oder Faustan, Temmler Pharma

GmbH, Marburg, Deutschland; 10 mg/kg in 2 ml/kg, intraperitoneal) abgebrochen,

wobei zwei Wiederholungen im Abstand von 15 Minuten und 30 Minuten durchgeführt

wurden (zweite Wiederholung nur mit der halben Dosierung).

4.3.2 Magnetresonanztomographie

Die Ratten wurden vor Induktion des Status epilepticus (Baseline, n = 13), sowie zwei

Tage (n = 5), vier Tage (n = 6) und zehn Tage (n = 5) nach Status epilepticus mittels

MRT untersucht. Das Prozedere für diese Untersuchungen wurde zuvor schon

beschrieben (Breuer et al., 2016). Verwendet wurde ein 7-Tesla-MRT-System für

Kleintiere (Bruker Pharmascan 70/16) mit der Aufnahme-Software ParaVision 5.1

(Bruker, Ettlingen, Deutschland). Zur Untersuchung einer Ödembildung wurden T2-

gewichtete 2D-MSME-Aufnahmen durchgeführt (Multi Slice Multi Echo; Repetitionszeit

2500 ms, Echozeit 11 ms, 96 Schichten von 0,8 mm, 256 x 256 Matrix, 35 x 35 x 25,6

mm3 Messfeld). T1-gewichtete 3D-MDEFT-Aufnahmen (Repetitionszeit 2500 ms,

Echozeit 11 ms, 96 Schichten von 0,8 mm, 256 x 256 Matrix, 35 x 35 x 25,6 mm3

Messfeld) zur Diagnostik einer erhöhten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke wurden

vor und nach intravenöser Infusion von Gadopentetat-Dimeglumin (Magnevist, 0,5

mmol/l, Bayer HealthCare, Leverkusen, Deutschland) durchgeführt.

Die MRT-Daten wurden mit PMOD 3.6 Software ausgewertet wie schon zuvor

beschrieben (Breuer et al., 2016). T1- und T2-Signale wurden dabei relativ zur Pons

normalisiert. Die Aufnahmen vom Zeitpunkt 48 Stunden nach SE wurden voxelweise

mit den Baseline-Aufnahmen verglichen (MATLAB Software und SPM12).

4.3.3 FITC-Albumin

Zu den Zeitpunkten fünf (n = 6), 24 (n = 5) und 48 (n = 16) Stunden nach Status

epilepticus wurden jeweils Ratten mit bovinem Albumin-Fluoreszein-Isothiocyanat-

Konjugat (FITC-Albumin), verdünnt in 10 ml/kg 0,1 molarer PBS, unter


49

Isoflurannarkose infundiert, ebenso 10 Kontrolltiere. Die Perfusion mit 125 ml 0,1 M

PBS und 250 ml vierprozentigem Paraformaldehyd (in 0,1 M PBS) in tiefer Narkose

folgte zwei Stunden später (Breuer et al., 2016). Die Gehirne wurden entnommen, über

24 Stunden in 4%iger Paraformaldehydlösung gelagert, schließlich in eine 30%ige

Saccharoselösung (0,1 M PBS mit 0,2% Natriumazid) überführt und bei vier Grad

Celsius aufbewahrt. Die Gehirne wurden koronal mit einem Gefriermikrotom

(Frigomobil 1205; Jung, Heidelberg, Deutschland) geschnitten (Schnittdicke 30 µm).

Jeder zehnte Schnitt wurde nun dreifach mit TBS für je mindestens 10 Minuten

gewaschen, kurz mit destilliertem Wasser gespült und auf Objektträger aufgezogen

(Menzel, Braunschweig, Deutschland). Nach Lufttrocknung wurden die Objektträger

mit Entellan (Merck, Darmstadt, Deutschland) eingedeckt.

Zur semiquantitativen Auswertung von extra- und intrazellulärem FITC-Albumin

wurden die Schnitte in 40facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop mit

integrierter Kamera (Biorevo, BZ-9000E, Keyence) fotografiert. Je Tier wurden vier

Schnittebenen analysiert: -0,36 mm, -1,56 mm, -3,72 mm und -4,90 mm in Bezug auf

Bregma (Paxinos und Watson, 2007). Dabei wurden die Regionen Hippokampus,

Thalamus, Amygdala, piriformer Cortex, entorhinaler Cortex und Striatum unter

Verwendung eines semiquantitativen Scoring-Systems beurteilt. Ein Mittelwert wurde

aus den bilateralen Bewertungen, wie auch aus den einzelnen Ebenen, für jede

Gehirnregion berechnet. Für die zelluläre FITC-Albumin-Aufnahme war die

Bewertungsskala wie folgt: Score 0 für keine, Score 1 für sporadische, Score 2 für

mittlere und Score 3 für hochgradige zelluläre FITC-Albumin-Aufnahme. Für die

extrazelluläre FITC-Albumin-Ansammlung war die Bewertung entsprechend, wobei

Score 1 eine geringgradige Menge extrazellulären FITC-Albumins oft nahe der

Blutgefäße beschrieb, Score 2 eine mittelgradige Menge und Score 3 wiederum eine

hochgradige extrazelluläre FITC-Albumin-Ansammlung beschrieb.

Zusätzlich wurde die Albumin-Extravasation auch lichtmikroskopisch ausgewertet,

indem eine Konvertierung des Fluoreszenzsignals mittels Diaminobenzidin-Nickel-

Färbung (DAB-Nickel) durchgeführt wurde, wie schon zuvor beschrieben (Michalski et

al., 2010) (siehe Anhang). Für die Auswertung wurden nach dem oben bereits


50

beschriebenen Verfahren die Schnitte der relevanten Schnittebenen fotografiert.

Daran schloss sich eine computergestützte Auswertung mittels einer

Bildauswertungssoftware an (Volocity 4.3.2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA), die die

Größe der gefärbten Areale relativ zur Größe des gesamten Gehirnschnittes

berechnete (Michalski et al., 2010).

4.3.4 Immunfluoreszenzfärbungen

NeuN, GFAP, IBA1, STL, Laminin, Collagen IV, AQP4, S100ß, CD45c, CD8b

In Kooperation mit Wolfgang Härtig (Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung der

Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig) wurden Immunfluoreszenzfärbungen

angefertigt. Die durchgeführten Doppelfärbungen und die verwendeten Antikörper sind

im Anhang aufgelistet. Die untersuchten Zielstrukturen waren das Neuron-specific

Nuclear Protein (NeuN) für Neuronen, das Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) für

Astrozyten, Ionized Calcium-binding Adapter Molecule 1 (IBA1) für Microglia,

Endothelzellen mit Anfärbung durch Solanum-Tuberosum-Lektin (STL), die vaskuläre

Basalmembran des Endothels mit Laminin und Collagen IV, astrozytäre Endfüßchen

mit Aquaporin 4 (AQP4), astrozytäre Somata mit S100ß, aktivierte Microglia mit CD45c

und T-Zellen mit CD8b.

4.3.5 Beurteilung der Neurodegeneration

Zur Beurteilung des Ausmaßes der Neurodegeneration wurde eine Nissl-Färbung

durchgeführt und mit einem Beurteilungssystem bewertet, wie schon beschrieben

(Bankstahl et al., 2012). Score 0 beschreibt keine ersichtlichen Schäden, Score 1 eine

leichte Veränderung der normalen Erscheinung ohne klar ersichtlichen

Neuronenverlust, Score 2 Läsionen, die 20 – 50% der Neuronen betreffen, und Grad

3 Läsionen, die über 50% der Neuronen betreffen. Hierbei wurden pro Tier vier

Schnittebenen bezüglich CA1, CA3a, Amygdala, piriformem und entorhinalem Cortex

beurteilt (−2,4 mm, −3,36 mm, -4,68 mm und −5,64 mm in Bezug auf Bregma (Paxinos

und Watson, 2007)). Die erhaltenen Werte beider Seiten wurden gemittelt. Wie schon

beschrieben (Polascheck et al., 2010), wurde die Zahl polymorpher Neuronen im Hilus

des Gyrus dentatus computergestützt mit der AxioVision Software (Zeiss) erfasst.


51

Hierzu wurden die Schnittebenen −2,4 mm, −3,36 mm und −4,68 mm herangezogen

und die erhaltenen Werte wiederum gemittelt.

4.3.6 Statistik

Mit Prism 7 Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) wurden alle Daten aus

Bewertungsskalen mit einem Kruskal-Wallis-Test mit Dunn’s Multiple Comparison

post-hoc im Vergleich zur Kontrollgruppe untersucht. MRT-Daten und Daten aus der

quantitativen histologischen Auswertung wurden hierbei mit einer einfachen

Varianzanalyse und Dunnett‘s Multiple Comparison Test post-hoc analysiert, die für

den Vergleich aller Gruppen zu Baseline-Werten diente. P-Werte < 0.05 wurden als

statistisch signifikant eingestuft.

4.4 Manuskript 3: Untersuchungen im intrahippokampalen Kainatmodell

Tiergruppen: Status epilepticus + ketogene Diät (n = 11)

Status epilepticus + Standarddiät (n =10)

Sham-Operation + Standarddiät (n = 10 )

Baseline-Untersuchungen: n = 10 bzw. 6

Abbildung 8: Übersicht zum Ablauf der Studie im intrahippokampalen Kainatmodell. Hier wurde

longitudinal die Entwicklung der Epileptogenese nach einer intrahippokampalen Kainatinjektion mit

sich anschließender vierwöchiger (gestrichelte graue Linie) ketogener Diät im Vergleich zu einer

Standarddiät untersucht. Sieben und 14 Tage nach der Mikroinjektion wurden [18F]GE-180-PET-Scans

durchgeführt, nach vier Wochen und schließlich neun bis zehn Wochen [18F]FDG- und

[18F]Flumazenil-PET-Scans. In der elften Woche wurden Elektroden zum anschließenden Monitoring

mit Elektroenzephalogramm-Ableitung (EEG) und simultaner Videoaufnahme implantiert. Nicht im


52

Schema abgebildet sind die durchgeführten Verhaltensuntersuchungen (modifizierter Irwin Screen vor

jeder PET-Untersuchung; ActivityCage 13-14 Wochen post Status epilepticus).

Nicht in der Abbildung inbegriffen, wie auch nicht im dritten vorbereiteten Manuskript,

sind weitere [18F]FDG-PET-Untersuchungen an Mäusen, die im Rahmen einer

vorbereitenden Untersuchung zur Ermittlung des Zeitverlaufs potentieller

glukometabolischer Veränderungen zu den Zeitpunkten 48 Stunden, fünf Tage, 21

Tage und 49 Tage nach Status epilepticus untersucht wurden (Darstellung der

Ergebnisse im Anhang). Ebenfalls nicht in der Abbildung inbegriffen ist eine Gruppe

von 10 gesunden Tieren, die in einem vorbereitenden Versuch chronisch mit ketogener

Diät gefüttert wurden. Diese Mäuse wurden ebenfalls zu mehreren Zeitpunkten einer

[18F]FDG-PET-Untersuchung unterzogen (Baseline, Tag 10, 17, 25, 35 und 49 der

Fütterung der ketogenen Diät (Darstellung der Ergebnisse im Anhang).

4.4.1 Intrahippokampale Kainatinjektion

Die stereotaktische Operation zur intrahippokampalen Injektion von Kainat gleicht im

Prinzip der ersten Beschreibung dieses Tiermodells (Suzuki et al., 1995). Die Narkose

wurde mit einer Bolus-Injektion von Chloralhydrat eingeleitet (500 mg/kg

intraperitoneal, gelöst in 10 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung) und mit

Nachinjektionen von 0,05 ml derselben Lösung nach Bedarf aufrechterhalten.

Die Koordinaten der anvisierten Injektionsstelle (siehe Abbildung 9) im rechten

dorsalen Hippokampus (Cornu ammonis 1) waren bezogen auf Bregma anterior-

posterior -2,1 mm, laterolateral -1,6 mm und dorso-ventral -2,3 mm entsprechend einer

früheren histologischen Validierung für männliche NMRI-Mäuse (Twele et al., 2016b).

als Positivkontrollen mitgeführten Vergleichsfärbungen von Gehirnschnitten mit

bekanntem Absterben von Neuronen von Tieren nach Status epilepticus


53

Abbildung 9: (Paxinos and Franklin, 2004)

Darstellung der Kainatinjektionsstelle im

Gehirnatlas (Pfeil).

Zur Herstellung der Kainat-Lösung wurden 10 mg Kainat (Sigma Aldrich, Deutschland)

in 2345 µl steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Ein Volumen von 50 nl wurde

mit einer 0,5 µl umfassenden Spritze (VWR International, Hannover, Deutschland)

über eine Minute hinweg injziert, wobei die Kanüle für jeweils zwei Minuten vor und

nach der eigentlichen Injektion im Gewebe belassen wurde, um zum einen das richtige

Vordringen der Kanüle im Gewebe zu erlauben, und zum anderen, um einen Reflux

zu vermeiden (Twele et al., 2016a, Gröticke et al., 2008, Klein et al., 2015b). Direkt im

Anschluss an die Operation wurden 0,5 ml einer 5%igen Glukoselösung mit

Elektrolyten (Sterofundin® HEG-5 Infusionslösung, ½ E, G-5%; B. Braun Melsungen

AG, Melsungen, Deutschland) subkutan verabreicht, wie weitere 10 ml/kg

intraperitoneal. Bis zur Erholung von der Operation wurden, falls nötig, subkutane

Injektionen mit physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Die Tiere wurden nun

entweder mit ketogener Diät oder mit der Standarddiät gefüttert, wobei über die ersten

Tage die Pellets der letzteren zuvor in Wasser eingeweicht wurden.

4.4.2 Fütterung der ketogenen Diät

Die ketogene Diät wurde von Harlan Laboratories GmbH bezogen (TD.96355, Venray,

Niederlande). Mit ihrer gekühlt marzipanähnlichen Konsistenz wurde sie jeden Tag

frisch zu kleinen „Pellets“ geformt ad libitum in der üblichen Futterraufe der Käfige

angeboten. Täglich wurde der Verbrauch ermittelt, um einen durchschnittlichen

Futteraufnahmewert berechnen zu können. Das Verhältnis von Fett zu Protein und

Kohlenhydraten betrug 4,25 (6,7 kcal/g, 9,1% kcal aus Proteinen, 0,4% kcal aus

Kohlenhydraten, 90,5% kcal aus Fetten). Die Inhaltstoffe der Diät waren:


54

hydrogeniertes pflanzliches Fett (586,4 g/kg), Kasein (173,3 g/kg), Zellulose (87,97

g/kg), Maisöl (86,2 g/kg), Mineralmischung (Kalzium-Phosphor-defizient, 79055, 20

g/kg), dibasisches Kalziumphosphat (19,3 g/kg), Vitaminmischung (40060, 13 g/kg),

Kalziumkarbonat (8,2 g/kg), DL-Methionin (2,6 g/kg), Cholin-Bitartrat (2,5 g/kg),

Magnesiumoxid (0,4 g/kg), Antioxidans 2-tert-Butylhydrochinon (0,13 g/kg).

4.4.3 PET und Datenauswertung

4.4.3.1 [18F]FDG

Die [18F]FDG-PET zur Darstellung des zerebralen Glukosemetabolismus wurde vier

und neun bis zehn Wochen nach der (Sham-)Operation durchgeführt, entsprechend

dem in Abschnitt 4.2.3 beschriebenen Prozedere. Im Rahmen der Blutentnahme für

die Glukosemessung vor dem Scan wurde auch die Blutkonzentration von ß-

Hydroxybutyrat mit einem Teststreifen gemessen (GlucoMen® LX ß ketone sensors,

A. Menarini Diagnostics, Firenze, Italy). Eine zweite Messung der

Blutglukosekonzentration wurde nach dem Scan durchgeführt. Pro Maus wurde eine

Aktivitätsdosis von 10,17 ± 2,224 MBq injiziert. Die Bilddatenverarbeitung in PMOD

3.6 für die anschließende Auswertung wurde wie in 3.2.3 durchgeführt, ebenso die

Auswertung der [18F]FDG-Daten mit Uptake und FDG 2-Compartment Model.

4.4.3.2 [18F]GE-180

Die [18F]GE-180-PET zur Darstellung von TSPO (Translocator Protein 18 kDa) wurde

entsprechend dem Prozedere bei der [18F]FDG-PET durchgeführt, mit nur der ersten

Messung der Blutglukosekonzentration. Die injizierte Aktivitätsdosis pro Maus war

11,08 ± 3,450 MBq. Die Auswertung der [18F]GE-180-Daten bestand aus der

Berechnung des Uptake entsprechend der Methode für [18F]FDG, wobei die letzten

drei Bildframes verwendet wurden. Des Weiteren wurde getestet, ob das 2-

Compartment Model (PMOD 3.6) auch in der Maus mit ihrer geringen Größe eine

geeignete Möglichkeit bietet, das Verteilungsvolumen (Vt) des Tracers im Gewebe zu

ermitteln. Die dazu benötigte IDIF (Image-derived Input Function) wurde durch

Platzierung einer Region of Interest (2 x 2 x 4 mm) in den frühen Bildframes in die

vorzugsweise rechte Arteria carotis gewonnen.


55

4.4.3.3 [18F]Flumazenil

Die [18F]Flumazenil-PET zur Darstellung der zentralen Benzodiazepin-Rezeptoren

wurde entsprechend dem Prozedere der [18F]GE-180-PET durchgeführt.

Den Mäusen wurde eine Aktivitätsdosis von 12,61 ± 1,128 MBq injiziert. Für die

Auswertung der [18F]Flumazenil-Daten wurde das Simplified Reference Tissue Model

von PMOD 3.6 herangezogen, das auf den Beschreibungen von Lammertsma und

Hume (Lammertsma und Hume, 1996), sowie Gunn et al. (Gunn et al., 1997) beruht.

Der Hirnstamm wurde als Referenzregion ausgewählt, um das geschätzte Binding

Potential PBND zu ermitteln (Ergebnisse siehe Anhang).

4.4.4 Irwin-Screen

In dieser Arbeit wurde eine modifizierte und gekürzte Version der ursprünglich von

Irwin et al. beschriebenen ausführlichen Verhaltensbeobachtung (Irwin, 1968)

verwendet. Die Experimente wurden immer zur selben Zeit am Morgen des Vortages

der Operation für die Mikroinjektion, eines jeden PET-Scans und schließlich noch final

durchgeführt. Jede Maus wurde in einem leeren offenen Käfig getestet, der zwischen

den einzelnen Tieren mit 0,1%iger Essigsäure ausgewischt wurde. Dabei wurden die

folgenden Parameter erfasst und mit einer Skala beurteilt: Körperposition, Haltung des

Schwanzes, Geschwindigkeit der Vorwärtsbewegung, Aktivität (Aufrichten),

stereotypes Verhalten, Neugierverhalten (Reaktion auf die Annäherung eines Stiftes),

Fluchtantwort auf Berührung mit einem feinen Pinsel, Schreckhaftigkeit (Reaktion auf

einen Klicker) und Verhalten während des Fangens der Maus am Schwanz. Bei dieser

Skala reichten die Werte meist von 0 bis 4, wobei zwei eine normale Reaktion und 0

keine Reaktion oder keine Bewegung bezeichnete und 4 eine starke Reaktion oder

Hyperaktivität (siehe Tabelle im dritten Manuskript)).

4.4.5 Elektrodenimplantation

Die Elektrodenimplantation wurde elf Wochen nach der Mikroinjektion durchgeführt,

unter Aufsuchen derselben Koordinaten wie für die vorherige Operation und

entsprechend der zuvor beschriebenen Methode (Twele et al., 2016a, Gröticke et al.,


56

2008, Klein et al., 2015b). Mögliche elektrodenbedingte Artefakte in der Bildgebung

wurden auf diese Weise ausgeschlossen. Allerdings wurde für die bessere

Steuerbarkeit der Anästhesie nun Isofluran verwendet. Zur Fixation der bipolaren

Elektrode wurde Zahnzement (Paladur®) verwendet, der die Elektrode nicht nur mit

der gereinigten und getrockneten Schädeloberfläche verband, sondern auch mit drei

weiteren Metallschrauben, unter denen zwei reine Halteschrauben und eine weitere

die mit der Erdung direkt verbundene Erdungsschraube darstellte. Dazu wurden zwei

Schrauben in jedes Os frontale gedreht und die dritte in das Os parietale sinistrum.

4.4.6 Elektroenzephalographie, Video-Überwachung und Datenauswertung

Die Überwachungskäfige für die Mäuse wurden für einen besseren Kontrast mit

dunkler Einstreu ausgestattet (Cellu Dri®). Besonders leichte, speziell für diese

Anwendung hergestellte Elektroenzephalogramm EEG-Ableitkabel, sorgten für eine

geringstmögliche Bewegungsbeeinträchtigung der Tiere während der EEG-

Aufzeichnung. EEG und Video (NyctoVision, Wunstorf, Deutschland) wurden simultan

und kontinuierlich aufgezeichnet. Dazu wurde die Software LabChart in den Versionen

6 und 8 (ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) eingesetzt. Während der

Dunkelphase wurden die Käfige durch Infrarot-Dioden beleuchtet. Die gesamte

Aufnahmezeit betrug 96 bis 148 Stunden. Nach etwa drei Tagen wurde die Aufnahme

für eine Pause von etwa zwei Tagen unterbrochen, um den Mäusen eine Erholung

vom Tragen des Kabelgewichtes zu ermöglichen. Die EEG-Datei wurde zu folgenden

Uhrzeiten genau auf elektroenzephalographische Ereignisse ausgewertet: 8:00 - 9:00

Uhr, 14:00 - 15:00 Uhr, 20:00 - 21:00 Uhr und 02:00 – 03:00 Uhr. Damit waren es

jeweils zwei Stunden in der Dunkel- und zwei in der Hellphase.

Elektroenzaphalographische Ereignisse wurden in High Voltage Sharp Waves

(HVSW), Hippocampal Paroxysmal Discharges (HPD) und Mixed Events (ME)

kategorisiert, wie zuvor beschrieben (Twele et al., 2016a). Das gesamte EEG-Material

wurde außerdem auf generalisiertes Anfallsgeschehen untersucht.


57

4.4.7 ActiMot -Test

Abschließend wurde in der 13. bis 14. Woche nach der Mikroinjektion jede Maus für

10 Minuten im sogenannten Activity Cage (ActiMot, TSE Systems GmbH, Bad

Homburg, Deutschland) getestet. In diesem Versuch wurde jede Maus in eine

quadratische Test-Arena aus Plexiglas gesetzt, die von einem auf Infrarot-

Lichtschranken basiertem Detektionssystem umgeben und mit einem Computer und

der zugehörigen ActiMot Software (TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Deutschland)

verbunden war. Damit wurden automatisch Geschwindigkeit, aktive Zeit,

zurückgelegte Strecke, Besuche im Zentrum, Aufenthaltsdauer im Zentrum, Anzahl

des Aufrichtens, Aufenthaltsdauer am Rand und ein Laufbild aufgezeichnet. Zwischen

zwei Tieren wurde die Arena mit verdünnter Essigsäure (0,1%) geruchsneutralisiert.

4.4.8 Statistik

GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego California USA) wurde für die

statistischen Berechnungen verwendet. Eine einfache Varianzanalyse kombiniert mit

Dunnett’s Multiple Comparison Test oder Sidak’s Test post-hoc wurde für Vergleiche

zwischen den Gruppen bei den PET-Bild-Daten durchgeführt. Ein Kruskal-Wallis-

Test mit Dunn’s Multiple Comparison Test post-hoc wurde für die Vergleiche bei

skalierten Ergebnissen verwendet. Der Mann-Whitney U-Test wurde für die

Vergleiche von gezählten elektroenzephalographischen Ereignissen verwendet. Der

Barnard‘s Test (http://scistatcalc.blogspot.de/2013/11/barnards-test-calculator.html)

wurde für die Analyse von Kontingenztabellen eingesetzt. P-Werte < 0.05 wurden als

statistisch signifikant eingestuft. Alle Graphen zeigen Mittelwerte mit Standardfehler.

5 Manuskripte

58

5 Manuskripte

5.1 Attenuation of epileptogenesis by 2-deoxy-d-glucose treatment is reflected

in 2-deoxy-2-[18F]fluoroglucose brain kinetics

Ina Leiter1,2, Pablo Bascuñana2, Frank Michael Bengel2, Jens Peter Bankstahl2#,

Marion Bankstahl1#*

1 Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary

Medicine Hannover and Center for Systems Neuroscience, Bünteweg 17, 30559

Hannover, Germany

2 Department of Nuclear Medicine, Hannover Medical School, 30625 Hannover,

Germany

*Corresponding author: Marion Bankstahl, University of Veterinary Medicine

Hannover, Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, Bünteweg 17,

D-30559 Hannover, Germany, Tel: +49-511-9538729, Fax: +49-511-9538581, E-

mail: [email protected]

#These authors contributed equally to this study.

Key words: cerebral glucometabolism, mouse model, PET imaging, epilepsy,

microglia

Abstract

Rationale: Hitherto, processes leading to acquired epilepsy cannot be prevented.

Modulation of cerebral glucose metabolism by 2-deoxy-D-glucose treatment (2-DG, an

inhibitor of glycolysis) might exert anti-epileptogenic effects. 2-Deoxy-2-

5 Manuskripte

59

[18F]fluoroglucose positron emission tomography ([18F]FDG PET) was used to

investigate effects of 2-DG treatment during epileptogenesis.

Methods: 6 Hz-corneal kindling model was performed to imitate epileptogenesis in

male NMRI mice by twice daily electrical corneal stimulation for 21 days. Kindling

groups received intraperitoneal injections of 250 mg/kg 2-DG (n = 18) or saline (n=12)

1 min after each stimulation. Further, twelve unstimulated mice were treated with 2-

DG. Dynamic 60-min [18F]FDG PET/CT scans were acquired at baseline and inter-

ictally on days 10 and 17. [18F]FDG uptake (%ID/cc) was quantified using a MRI-based

brain atlas. Kinetic modelling (FDG-2-compartment model, image-derived input

function out of the vena cava caudalis) was performed to evaluate glucose metabolic

rate MRGlu and net influx rate Ki. Immuno-histochemical stainings of glucose

transporter 1 (GLUT1), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding

adapter molecule 1 (IBA1), as well as a Fluoro-Jade-C staining were performed.

Results: 2-DG treatment resulted in attenuated kindling progression, mainly in the early

phase (up to 29.3 ± 11.8%, p<0.01), in less fully-kindled mice and in lower overall

percentage of shown type five seizures. 2-DG treated mice during kindling had an

regionally increased [18F]FDG uptake at day 10, and higher uptake levels compared to

pure 2-DG treatment at days 10 and 17. Further, 2-DG treatment during kindling

caused higher MRGlu values compared to vehicle-treatment in thalamus and

hippocampus at day 17. The Ki was increased partly at days 10 and 17, and was higher

than that of the only 2-DG treated group at day 10. Kindling progression without

treatment neither altered [18F]FDG uptake nor kinetic parameters. In unstimulated

mice, 2-DG treatment resulted in decreased [18F]FDG uptake at day 17 in several brain

regions, whereas MRGlu and Ki values were globally increased. Kindling caused

activation of astrocytes, but not neurodegeneration. Surprisingly, 2-DG treatment led

to microglial activation (independent of kindling). Impact of kindling or 2-DG treatment

on GLUT1 staining was not observed.

Conclusions: 2-DG treatment exerts disease-modifying effects in the 6 Hz mouse

corneal kindling model of difficult to treat seizures. Both the alleviation of astroglial

5 Manuskripte

60

activation and the unexpected activation of microglia by 2-DG might contribute to its

positive interference with epileptogenesis. While [18F]FDG PET does not seem to be a

promising marker for active epileptogenic processes during 6 Hz corneal kindling, it

facilitates specific insight into the drug-disease interaction in combination with 2-DG

treatment.

Introduction

To date, there is no evidence-based epilepsy-preventive therapy known (Baulac et al.,

2015). In view of the one-third of pharmacoresistant epilepsy patients (Brodie et al.,

2012), it is a major medical need to develop a practicable treatment after a potentially

epilepsy-inducing brain insult interfering with epileptogenesis or modifying the disease

progression (Löscher and Brandt, 2010).

Previous and ongoing research has shed further light on cerebral processes following

epileptogenic brain insults potentially contributing to epilepsy development. 2-Deoxy-

2-[18F]fluoroglucose positron emission tomography ([18F]FDG PET) studies show that

changes in brain glucose metabolism occur in several animal models of epilepsy during

epileptogenesis. Whereas a cerebral hypermetabolism is described for the acute

phase of epilepsy induction (Mirrione et al., 2007, Mirrione et al., 2006, Kornblum et

al., 2000), the occurrence of cerebral hypometabolism represents a common finding

during subacute and subsequent stages of epileptogenesis (Jupp et al., 2012, Liu et

al., 2010, Lee et al., 2012, Goffin et al., 2009, Zhang et al., 2015). This is consistent

with the hypometabolic appearance of epileptic foci in interictal [18F]FDG PET imaging

used for pre-surgical evaluation in patients (Burneo et al., 2015, Drzezga et al., 1999).

In view of these glucometabolic alterations as a typical feature of epileptogenesis and

chronic epilepsy, we hypothesize that targeting cerebral energy metabolism already

during disease development might exert positive influence on later disease outcome.

2-Deoxy-D-glucose (2-DG), a candidate anti-seizure drug under preclinical evaluation

(Bialer et al., 2015), impedes the glycolytic pathway (Xi et al., 2014) and represents an

eligible compound for influencing cerebral glucose metabolism. After penetration into

the cell and transformation to 2-DG-6-phosphate by hexokinase, it cannot be further

metabolized and accumulates in the cell (Kipnis and Cori, 1959). As a result, 2-DG-6-

5 Manuskripte

61

phosphate blocks cellular glucose uptake by glucose transporters (Kipnis and Cori,

1959) and competes with glucose-6-phosphate for phosphoglucose isomerase (Wick

et al., 1957, Nirenberg and Hogg, 1958). Furthermore, 2-DG-6-phosphate seems to

inhibit hexokinase non-competitively (Chen and Gueron, 1992). Further, ketogenesis

is stimulated as a consequence of reduced glycolysis and ketone bodies as an

alternative energy source then enhance mitochondrial energy metabolism (Yao et al.,

2011).

2-DG exerts acute anticonvulsant effects in the 6-Hz psychomotor seizure test in

mice (Gasior et al., 2010, Stafstrom et al., 2009), the rat pilocarpine model (Lian et

al., 2007), the mouse pilocarpine model (Yang et al., 2013) and in Fring’s mice with

audiogenic stimulation (Stafstrom et al., 2008). Sustained anticonvulsant effects were

seen in terms of increased afterdischarge thresholds in the perforant path kindling

model in rats (Stafstrom et al., 2009). Beyond this, impeded kindling progression was

reported in three rat kindling models (amygdala kindling, perforant path kindling, and

olfactory bulb kindling) (Garriga-Canut et al., 2006, Stafstrom et al., 2009),

suggesting also anti-epileptogenic properties of 2-DG. In this regard, it is of particular

relevance that a retardation in perforant path kindling progression was also described

with a 2-DG treatment administered up to ten minutes after each stimulation (Sutula

and Franzoso, 2008), hereby excluding acute anticonvulsant activity as a major

reason for kindling deceleration.

Aim of this study was to evaluate the impact of 2-DG treatment on epileptogenesis in

the mouse 6 Hz corneal kindling model, a model characterized by resistance to

several anti-seizure drugs (Leclercq et al., 2014). Moreover, using [18F]FDG PET and

complementary histological analyses, effects of kindling with and without chronic 2-

DG treatment on cerebral glucose metabolism, astro- and microglial activation,

glucose transporter 1 (GLUT1) expression and neuronal viability were investigated.

Materials and methods

Animals

Male NMRI mice from Charles River (Sulzfeld, Germany) were used in all experiments.

They were purchased at an age of about six weeks, weighing 30 – 35 g. Experiments

5 Manuskripte

62

commenced after one week of adaptation. Animals were housed in groups of 10

animals in individually ventilated cages (Allentown, Neuss, Germany) with bedding and

nesting material, under constant laboratory conditions: 20 – 22°C, air humidity of 40-

70%, 14 hours light phase (7 am to 9 pm) and 10 hours dark phase. Autoclaved water

and a standard rodent diet (Altromin, Lage, Germany) was offered ad libitum. Any

efforts were made to diminish suffering of the experimental animals at the best. All

experiments were performed in conformity with the EU directive 86/609/EWG and the

German animal welfare act (Tierschutzgesetz), with the permission of the Lower

Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety (LAVES).

Drugs

For the intraperitoneal (i.p.) injections, 250 mg/kg 2-DG (Sigma-Aldrich, Steinheim,

Germany, D8375) were freshly dissolved in 10 ml/kg 0.9% sterile saline. Vehicle-

treated animals received i.p. injections of 10 ml/kg 0.9% sterile saline. Tetracaine

hydrochloride (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany, T7508) was dissolved in aqua ad

injectabilia to produce a two percent tetracaine eye drops solution.

Animal groups and treatment

During the experiment, two groups of mice were kindled: A 2-DG-treated group (2-

DG+kindling, n=18), injected i.p. with 250 mg/kg 2-DG one minute after each

stimulation, and a vehicle-treated group (vehicle+kindling, n=18) receiving i.p.

injections of saline one minute after each stimulation. An additional group of mice (2-

DG w/o kindling, n=12) was not stimulated, but was injected with 250 mg/kg 2-DG i.p.

at the same time points as the kindled animals. The last treatment before each PET

scanning was performed on the evening before, i.e. 18 - 20 h prior [18F]FDG PET, to

avoid concealing of kindling-medidated effects on brain glucometabolism by acute

influence of 2-DG. The next kindling stimulation and treatment was performed in the

evening after PET scanning.

5 Manuskripte

63

Corneal kindling

A stimulator (ECT UNIT, 57800, Ugo Basile, Comerio, Italy) with leather-covered

corneal electrodes was used to deliver the corneal kindling stimuli twice daily for 21

days. The stimuli were monopolar, lasted for 3 s, had a frequency of 6 Hz, a current

intensity of 44 mA, and a pulse duration of 0.2 ms (Leclercq et al., 2014). The inter-

stimulation interval was at least six hours. At least 15 min before start of the first

stimulation, the stimulator was switched on, the electrodes’ leather covers were soaked

with saline and the stimulator performance was thereupon tested. Before this

procedure, the animal cage tops were opened and the animals could adapt to the

environment during the experimental course. Two minutes prior to stimulation, the

individual animal received a drop of the tetracaine eye drops solution in both eyes. A

stop watch was used to ensure the appropriate timeperiod to induce the local

anesthesia. During stimulation, the animals were manually restrained. Immediately

afterwards, the mice were unclasped and closely observed for the expression of motor

seizures within the first minute after stimulation. The seizure severity was scored using

a modified Racine scale (Racine, 1972): score 0, immobility or no reaction, running

and bouncing; score 1, mild facial clonus: eye blinking / closing, twitching of the

vibrissae, stereotyped sniffing; score 2, severe facial clonus: chewing, head nodding,

and/or myoclonic twitches of the forelimbs; score 3, clonic convulsions of one forelimb

without rearing; score 4, clonic convulsions of both forelimbs with / without rearing;

score 5, generalized clonic convulsions with immediate loss of balance (also in lateral

position); score 6, tonic seizure of fore- and hindlimbs. Mice showing at least eight of

ten consecutive stage five seizures were declared fully kindled. Body weight was

determined each day in order to deliver the appropriate treatment dosage and to

control the health status of the animals. The first corneal kindling stimulation was done

in the evening after the first [18F]FDG PET scan.

Image acquisition

A dedicated small animal PET-CT scanner was used for imaging brain glucose

metabolism (Inveon DPET, Siemens, Knoxville, TN, USA). Mice were scanned at three

timepoints: At day 1 (baseline), i.e. after first 2-DG or vehicle treatment but before first

5 Manuskripte

64

kindling stimulation, at day 10, and at day 17 of kindling. Anesthesia induction was

performed with three percent isoflurane in three liters oxygen per minute. During the

scanning procedure, the isoflurane concentration (in 0.6 liters of oxygen per minute)

was adapted to each animal to maintain a respiration frequency of about 60 – 80 /min.

Prior to tracer injection, blood glucose was measured from the vena saphena (Contour

XT® meter, Bayer Consumer Care, Basel, Switzerland). Animals were then placed

side-by-side in a double mouse scan bed (Minerve, Esternay, France). During

anesthesia, respiration frequency was monitored and bed temperature was maintained

at 37 °C. The head of the mice was positioned in the center field of view. The tracer

(8.38 ± 0.46 MBq (mean ± SD) [18F]FDG in a volume of 0.15 ml) was injected into the

lateral tail vain using a catheter made of two 27 G cannulas and a medical micro

volume tube (Kleinfeld Labortechnik, Gehrden, Germany, Tygon S-54-JL, no. 9.205

504). Dynamic acquisitions of 60 min were obtained starting with tracer injection. The

acquired list mode data were histogrammed to 32 frames. The image reconstruction

to a 128 x 128 x 159 matrix (0.78 x 0.78 x 0.8 mm3) was done with a three-dimensional

ordered subset expectation maximization (3D-OSEM) / maximum a posteriori (MAP)

algorithm (β =1, OSEM iterations =2, MAP iterations =18) with scanner-applied scatter

correction. Attenuation was corrected using a 57Co transmission scan. After each

[18F]FDG PET scan, a standard CT acquisition followed. After the scanning procedure,

blood glucose levels were measured again, in blood drops taken from the tail vein after

removal of the catheter. Average duration of anesthesia was 114.9 ± 9.56 min (mean

± SD).

Image data processing and kinetic modelling

Image data were processed using PMOD 3.6 software (PMOD Technologies,

Switzerland). First, each CT image was co-registered to the standard mouse MRI atlas

of PMOD (T2-weighted, (Ma et al., 2005)). Second, each CT image was co-registered

to the correlating PET image. Finally, the transformation followed with the exact

overlap of MRI atlas and PET image. The [18F]FDG uptake was analysed using the

Mirrione mouse atlas provided in this PMOD version (Mirrione et al., 2007). The tracer

uptake values of the analyzed brain regions were calculated from the last two frames

5 Manuskripte

65

(i. e. the last twenty minutes of the acquisition) and expressed as percent injected dose

per cubic centimetre. The kinetic modelling was performed using the FDG 2-

compartiment model offered in the kinetic modelling tool of the PMOD 3.6 version. For

this, an image-derived input function (IDIF) was obtained by calculation of the whole

blood time-activity-curve for a region of interest (2 x 2 x 4 mm3) positioned in the early

frame images on the vena cava caudalis (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). The

used lumped constant LC (which delineates the different properties of glucose and

[18F]FDG concerning the uptake and the phosphorylation) was 0.67 (Thorn et al.,

2013). Individual blood glucose values of both measurements (before and after each

scan) were averaged and then introduced in the modelling process.

Immunohistochemistry

On day 22 after start of kindling, mice were deeply anesthetized using ketamine and

xylazine. They were transcardially perfused with 25 ml 0.01 M phosphate buffered

saline and thereafter with 25 ml 4% paraformaldehyde solution (dissolved in 0.1 M

phosphate buffer, pH = 7.4). Brains were removed, transferred into 4%

paraformaldehyde solution for 24 h and stored in a solution of 30% sucrose and 0.2%

sodium azide in 0.1 M phosphate buffer until slicing. Brains of six mice randomly

chosen per group were sliced on a sliding microtome (Frigomobil CM 1325, Leica,

Wetzlar). Slices (40 µm thickness) were stored in 0.1 M phosphate buffered saline until

used for immunohistochemical staining (free-floating method). Rabbit anti-mouse

glucose transporter 1 (GLUT1) antibody (diluted 1:1000; Biotrend Chemikalien GmbH,

Cologne, Germany, GT-11A, lot no. 1105859A 1.3-P) was used as primary antibody.

Endogenous peroxidase activity was inhibited using 0.5% hydrogen peroxide.

Unspecific antibody binding sites were blocked with 10% donkey serum. Slices were

incubated for 20 h in the primary antibody solution at 7°C. Slices were exposed to the

secondary antibody (biotin-SP-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG, 1:500;

Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, UK, code no. 711-065-152)

for 1 h at room temperature. Vectastain ABC kit (Burlingame, CA, USA) provided the

avidin-biotin complex for the final visualization reaction with 3,3’-diaminobenzidine

solution and hydrogen peroxide. Stainings of microglia and astrocytes were performed

5 Manuskripte

66

according to a protocol varying in the following steps: Endogenous peroxidase activity

was inhibited using 0.6% hydrogen peroxide and the blocking step was done using 5%

normal goat serum. Brain slices were exposed to the primary antibody, anti-ionized

calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1) antibody (diluted 1:500; Synaptic Systems,

Göttingen, Germany, cat. no. 234 003) or the anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)

antibody (1:5000; Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Germany, Z 0334, lot no.

20013978) for 18 h at room temperature. Peroxidase affinipure goat anti-rabbit IgG

(1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, UK, code no. 111-

035-144) was used as secondary antibody. Slices were mounted on glass slides

(Menzel-Gläser, Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) and cover-slipped with

mounting medium (Entellan, Merck, Darmstadt, Germany).

GLUT1-stained sections of the four groups were visually inspected using a light

microscope. GLUT-1-staining intensity in the regions of interest mentioned above was

compared between groups. Microglial (IBA1) and astroglial (GFAP) activation was

semi-quantitatively scored in a blinded fashion as recently described (Brackhan et al.,

2016); score 0 = inactive cells, less than 10% activated, score 1 = predominantly

inactive cells, about 30% activated, score 2 = some inactive cells, about 60% activated,

score 3 = more than 90% activated cells). At section levels -1.94 mm and -3.16/-3.28

mm relative to bregma (Paxinos and Franklin, 2007), the following brain regions were

assessed: hippocampal cornu ammonis (CA)1, CA3a, and dentate hilus, as well as

thalamus, amygdala, and piriform cortex. Microglial and astroglial scores were each

averaged for the two assessed brain section levels. To visualize neurodegeneration,

Fluoro-Jade C staining was performed as described by Gröticke et al. (Gröticke et al.,

2007). Briefly, brain slices were mounted on protein glycerol coated glass slides and

air-dried. Directly before staining, the slides were bathed twice in ethanol (80%, five

minutes, and 70%, two minutes) and in destilled water to remove the latter. Staining

was performed with 0.0001% Fluoro-Jade C solution for 30 minutes. Slices were cover-

slipped with mounting medium (DPX mountant for histology, Sigma-Aldrich, Steinheim,

Germany). The stained slices (-1.94 mm relative to bregma) were microscopically

screened for fluorescence-positive neurons concerning the target regions described

above.

5 Manuskripte

67

Statistical analysis

All statistical tests were calculated using GraphPad Prism version 5.00 for Windows

(GraphPad Software, San Diego California USA). For comparison of only two data sets

(seizure severity, kindling duration) a Student’s t-test was used. Inter-group differences

concerning seizure response during kindling progression and histological evaluation

were analyzed performing a Kruskal-Wallis analysis of variance (ANOVA) followed by

Dunn’s Multiple Comparison Test. One-way ANOVA with Bonferroni testing was

conducted regarding the inter-group comparisons of all PET imaging data and

repeated-measures ANOVA with Bonferroni testing was used concerning intra-group

and inter-time point comparisons of imaging data. All graphs show mean values with

standard error of the mean.

Results

Corneal kindling

The 6 Hz corneal kindling course started with seizure responses of type two to three

in most animals (Figure 1A). On days three, four and five of kindling, the 2-DG-treated

animals showed significantly attenuated seizure responses (p<0.05; Figure 1C). On

days eight and nine, the duration of the seizure response was shorter in the 2-DG

treated group (p=0.023 and p=0.030). Over the course of the kindling process, 2-DG-

treated mice showed less seizures of type five than vehicle-treated mice (p=0.0004;

Figure 1C). According to our definition of a fully-kindled state, the percentage of

completely kindled mice per group after 39 stimulations was 88.9% in the vehicle group

and 50% in the 2-DG group. The arithmetic mean number of stimulations needed to

achieve a fully-kindled state was increased by 2-DG treatment (20.81 vs. and 29.11

stimulations, vehicle group vs. 2-DG group, p=0.0058; Figure 2D). No mortality

occurred during corneal kindling. However, five mice had to be killed before end of

kindling due to recurrent penis prolapse (Fig. 1C, indicated in grey). The highest stage

of shown seizures was type five (Figure 1A). Body weight of corneally-kindled mice

remained stable over time (34.36 ± 0.4576 vs. 33.98 ± 0.4784 g, mean ± SEM, day 1

vs. day 21, vehicle-treated group, p= 0.5761; 34.46 ± 0.4961 vs. 33.41 ± 0.5332 g,

mean ± SEM, day 1 vs. day 21, 2-DG-treated group, p= 0.1607), and the mean body

5 Manuskripte

68

weight did not differ between kindled groups at any investigated time point (not shown).

Unstimulated mice treated with 2-DG generally gained about three grams of body

weight over the treatment period of 21 days (35.77 ± 0.5245 vs. 38.58 ± 0.5371 g,

mean ± SEM, day 1 vs. day 21, p= 0.0045).

Imaging

[18F]FDG uptake: The 2-DG-treated unstimulated group showed a reduced [18F]FDG

uptake on day 17 compared to baseline in thalamus, amygdala, cortex, and striatum

(Figure 2 B-E). While tracer uptake did not change in vehicle-treated kindled mice

(Figure 2 A-F), an increased [18F]FDG uptake was detected in 2-DG-treated kindled

mice on day 10 in thalamus and cerebellum (Figure 2 B, F). On day 10 of 2-DG

treatment, a higher [18F]FDG uptake was seen in kindled versus unstimulated mice in

all analyzed brain regions except for the amygdala (Figure 2 A-F), whereas on day 17

this was found in amygdala and striatum (Figure 2 C,F).

[18F]FDG two compartment modeling: The metabolic rate MRGlu as well as the influx

rate Ki increased in the 2-DG-treated unstimulated group on day 17 compared to

baseline in all analyzed brain regions apart from amygdala (Figure 3 A-F, Figure 4 A-

F). While kindling alone did neither alter Ki nor MRGlu (Figure 3 A-F, Figure 4 A-F),

MRGlu was higher in hippocampus and thalamus of the 2-DG-treated kindled mice

compared to the vehicle-treated kindled mice at day 17 (Figure 4 A, B). Raised Ki

values were detected on days 10 and 17 in the 2-DG-treated kindled group compared

to baseline in hippocampus, thalamus, amygdala, and cerebellum. Ki in 2-DG-treated

kindled mice was also higher than in 2-DG-treated unstimulated mice at day 10 in all

analyzed brain regions as well as on day 17 in amygdala.

Blood glucose levels measured directly before each scan remained stable in the

vehicle-treated kindled animals compared to baseline values before start of kindling

(not shown). Treatment with 2-DG led to a decrease of blood glucose levels at day 17

in the unstimulated group, while reduced levels were found on days 10 and 17 in the

kindled group (not shown).

5 Manuskripte

69

Immunohistochemistry

GLUT1 staining did not reveal any obvious differences between groups (not shown).

Activation of microglia (IBA1) and astrocytes (GFAP) was occasionally seen in brain

sections of control mice. While vehicle-treated kindled mice did not differ from naïve

controls (Figure 5A,B), distinctly elevated microglial activation was found in the CA3a

region, dentate hilus, and thalamus of 2-DG-treated kindled mice. The CA1 region and

the piriform cortex showed a tendency towards increased microglial activation

(p=0.0711 and 0.0521, respectively; Figure 5B). In amygdala, no group differences

were found. Unexpectedly, IBA1 staining revealed prominent microglial activation also

in the 2-DG-treated unstimulated group in all analyzed hippocampal subregions (CA1,

CA3a, dentate hilus) and the thalamus (Figure 5A,B). GFAP staining revealed raised

astroglial activation in the vehicle-treated kindled group in the CA3a region, dentate

hilus, and piriform cortex, whereas in the 2-DG-treated kindled group this was only

seen in the dentate hilus (Figure 6A,B). 2-DG treatment alone did lead to astroglial

activation higher than in naïve controls (Figure 6A,B). Fluorojade-C-positive neurons

were not detected in any group (not shown).

Discussion

Glucometabolic changes during epileptogenesis represent a target for therapeutic

intervention. This study was designed to evaluate potential anti-epileptogenic or

disease-modifying effects of the glycolysis inhibitor 2-DG in the 6 Hz corneal kindling

model and how this might be reflected in brain glucometabolism as assessed by

translational [18F]FDG PET. Our main findings are: 1. Chronic 2-DG treatment reduces

epileptogenesis progression and seizure severity during 6 Hz corneal kindling. 2.

Kindling-mediated epileptogenesis indeed results in prominent astroglial activation, but

does not alter interictal brain glucometabolism, neuronal viability, or activation state of

microglia. 3. Kindling-mediated epileptogenesis in combination with 2-DG treatment,

however, leads to increased cerebral glucose turnover, as well as to microglial

activation. 4. Chronic 2-DG treatment unexpectedly also results in microglial activation

in unstimulated mice, but partially alleviates astroglial activation in kindled mice.

5 Manuskripte

70

Disease-modifying effects of 2-DG in the 6 Hz corneal kindling model

Kindling-decelerating effects of 2-DG treatment have been shown before in rat models

of kindling-mediated epileptogenesis (Garriga-Canut et al., 2006, Stafstrom et al.,

2009). We here applied the recently described 6 Hz corneal kindling model, which

seems advantageous over the 50 Hz corneal kindling model (Matagne et al., 2008,

Matagne and Klitgaard, 1998, Potschka and Löscher, 1999, Willis et al., 2010, Rowley

and White, 2010) because it displays robust kindling development and is not

associated with mortality (Leclercq et al., 2014). Both seizures induced in healthy and

fully kindled mice by 6 Hz stimulation are characterized by limited response to anti-

seizure drugs (Bankstahl et al., 2013, Barton et al., 2001, Leclercq et al., 2014). We

here show, that despite this treatment resistance of 6 Hz seizures, a positive influence

of 2-DG on kindling progression and outcome could be achieved. Although seizure

responses were positively influenced mainly in the early phase of kindling, the overall

outcome shows less fully-kindled animals and less type-five seizures in the 2-DG-

treated group.

Beyond demonstrating that the epileptogenesis-modifying effects of 2-DG extent to

another species, i.e. mice, we here provide further evidence that 2-DG can manipulate

epileptogenesis also when administered after rather than before kindling stimulations.

Epileptogenesis progression during kindling is based on growing susceptibility to the

same seizure-inducing stimulus, reflected by increasing seizure severity during

kindling course. Therefore, a true anti-epileptogenic effect in terms of preventive

activity against epileptogenesis-promoting consequences of seizures is difficult to be

separated from a merely anticonvulsant action of a test compound (or a mixture of

both). We aimed to account for this obstacle by choosing a treatment time point of one

minute after each stimulation, hereby minimizing a direct anticonvulsant action of 2-

DG as far as possible. To our knowledge, pharmacokinetic data for mice are not

available in the literature, but pharmacokinetics of 2-DG have been studied in humans

and rats. In humans, chronic oral 2-DG treatment did result in an elimination half-life

of about 5 h and was not associated with accumulation (Gounder et al., 2012, Raez et

al., 2013). For rats, a biphasic decrease of 2-DG blood concentration after intravenous

injection is described (first half-life 0.7 h, second half-life 2.9 h) (Umegae et al., 1990).

5 Manuskripte

71

Assuming a similar pharmacokinetic profile of 2-DG in mice and considering a reported

peak of 2-DG’s anticonvulsant action against 6 Hz seizures in mice at 1 h post

administration (Stafstrom et al., 2009), it seems unlikely that 2-DG should still exert a

distinct direct anticonvulsant effect on the next stimulation, which was applied at least

6 h later.

The starting point in seizure severity was higher in the present study compared to

findings of Leclercq et al. (2014) (mean seizure score of 2.56 vs. 1.8, present study vs.

study by Leclercq et al.). It has been described before, that seizure susceptibility can

depend on rodent strain (Ferraro et al., 1995, Borges et al., 2003), but can even be

influenced by intrastrain differences (Bankstahl et al., 2012, Brandt et al., 2016, Müller

et al., 2009). Taking into account that we used male NMRI mice from Charles River

Germany and not France like Leclercq and colleagues, such a substrain difference

could explain this slightly deviating finding.

Importantly, we show that the disease-modifying effect of 2-DG was not associated

with any obvious side effects, but confirm tolerability of chronic 2-DG treatment, as

shown before in rats and in a dose escalation study in human patients (Singh et al.,

2005, Ockuly et al., 2012), also in mice. At the chosen 2-DG dosage (250 mg/kg twice

daily), we did neither observe behavioral abnormalities nor other obvious systemic side

effects during daily handling and observation of mice. Monitoring of bodyweight in two

additional groups of unstimulated vehicle- or 2-DG-treated mice (n=8 per group, 250

mg/kg 2-DG twice daily over 21 days) showed a comparable slight increase in

bodyweight over time in both groups. Body weight of 2-DG-treated mice was higher on

days 15 to 17 of treatment compared to baseline and to vehicle-treated mice (p<0.05,

not shown).

Effects of kindling and 2-DG treatment on cerebral glucometabolism

To our knowledge, this is the first study investigating whether kindling-mediated

epileptogenesis in mice is associated with cerebral glucometabolic alterations.

[18F]FDG PET represents a reliable and translational in vivo method to examine brain

glucose metabolism (Goffin et al., 2008, O'Brien and Jupp, 2009). According to an

increasingly accepted concept, energy supply for neurons in the healthy brain is mainly

5 Manuskripte

72

provided by astroglia (Magistretti and Allaman, 2015). Glucose is taken up via GLUT1

expressed in astroglial endfeet covering the blood-brain barrier (BBB), and energy is

then transferred to neurons in the form of lactate by the so-called astrocyte-neuron-

lactate-shuttle (Magistretti, 2006, Pellerin and Magistretti, 2012). In the brain

undergoing epileptogenesis, increased energy demand of neurons for synaptic

transmission might lead to astroglial activation. Astroglial activation might play a crucial

role during epileptogenesis, e.g. as a consequence of extravasated albumin

(Weissberg et al., 2015) or resulting from genetically-mediated induction (Robel et al.,

2015). Indeed, we here also discovered astroglial activation in several limbic brain

regions (Figure 6), which is in agreement with recent findings in the 50 Hz corneal

kindling model (Loewen et al., 2016).

Unexpectedly, however, we found that kindling alone did not influence [18F]FDG

turnover (Fig. 2, 3, and 4), neither during nor at the end of epileptogenesis, which

corresponds to results of a [14C]2-DG autoradiography study in a rat rapid kindling

model (Lothman et al., 1985). One explanation for not finding glucose

hypermetabolism during kindling progression could be that we performed PET

interictally. This was done to rule out detecting increased [18F]FDG uptake as a mere

result of convulsions itself (Blackwood et al., 1981) instead of imaging energy-

demanding processes associated with epileptogenesis itself. In the interictal phase

during epileptogenesis in the 6 Hz kindling model, however, astroglial (and neuronal)

activation state might not be pronounced enough to be detected by FDG PET.

In patients with temporal lobe epilepsy as well as in rodent models of chronic epilepsy,

a glucose hypometabolism is typically observed (Kim et al., 2003, Jupp et al., 2012,

Zhang et al., 2015), which might partially be attributable to neuronal loss occurring in

conjunction with hippocampal sclerosis or a general reduction in neuronal activity due

to epilepsy-associated functional impairment (Guo et al., 2009). However, we here

report for the first time that 6 Hz corneal kindling is not associated with degenerating

neurons in kindled mice, which is in line with data from the 50 Hz corneal kindling

model (Loewen et al., 2016) and with data from amygdala and audiogenic kindling

models, in which neuronal loss is not observed or present only to a minor degree

(Khurg

5 Manuskripte

73

el et al., 1995, Osawa et al., 2001, Romcy-Pereira and Garcia-Cairasco, 2003). This

lack of distinct neurodegeneration might explain why no hypometabolism was detected

in fully- kindled mice. Supporting this idea, a recently published study using

pentylentetrazole-mediated kindling in rats, which is accompanied by

neurodegeneration indeed (Pavlova et al., 2006, Park et al., 2006, Fang and Lei, 2010),

found reduced [18F]FDG uptake in the hippocampus being predictive for positive

kindling response (Bascunana et al., 2016).

To the best of our knowledge, impact of chronic 2-DG treatment on cerebral

glucometabolism has not been evaluated in vivo before. Chronic 2-DG treatment led

to reduction of [18F]FDG uptake in brain tissue (day 17 of treatment, Fig. 2), whereas

cerebral glucose turnover (influx rate constant Ki, Figure 3, and metabolic rate MRGlu,

Figure 4) was concurrently raised globally in the brain (apart from amygdala).

Maximum Ki and MRGlu values were reached only on day 17, suggesting that prolonged

2-DG treatment is necessary to evolve its complete effectiveness.

Interestingly, kindling seemed to enhance the effects of 2-DG on glucose influx,

especially during kindling progression (day 10; Figure 3). As neuronal firing due to

seizing leads to a higher energy demand, glucose uptake, but also uptake of [18F]FDG

and 2-DG, is expected to increase. This combination effect was still present when part

of the 2-DG-treated mice were already fully kindled (day 17). A combined effect of 2-

DG and kindling was also reflected by an increase of MRGlu at day 17 in hippocampus

and thalamus, i.e. in brain regions relevant for seizure origin and spread, whose

neurons might be especially energy demanding due to seizure responses of increasing

severity during the kindling course.

Effects of kindling and 2-DG treatment on constituents of the neurovascular unit and

blood glucose

We wondered whether the altered glucose turnover could be explained by an altered

expression of GLUT1 transporters, being responsible for glucose uptake by astrocytes

across the BBB. Expression of glucose transporters can be influenced by blood

glucose levels. Changes concerning the 55-kDa GLUT1 due to chronic hypoglycemia

have been described before (Simpson et al., 1999), whereas chronic hyperglycemia

5 Manuskripte

74

had no impact (Simpson et al., 1999). In our study, 2-DG led to reduced blood glucose

values at day 17 of treatment in unstimulated mice and already at day 10 in mice

undergoing kindling, suggesting that seizure activity might enhance the reduction in

blood glucose levels. Other studies with chronic 2-DG supplementation via daily diet

also detected a chronic decrease of blood glucose levels using higher dosages of 2-

DG than we did (Minor et al., 2010, Yao et al., 2011). However, the

immunohistochemical staining did not reveal any influence of kindling or 2-DG

treatment on GLUT1 expression. As the used antibody binds GLUT1 transporters at a

C-terminal epitope, different glycosylation patterns should not hamper the detection of

the different GLUT1 types (45-kDa GLUT1 and 55-kDa GLUT1) (Choeiri et al., 2002).

Apart from changes in GLUT1 expression, cerebral glucose uptake might also be

influenced by altered transporter activity. In this regard, pentylenetetrazole-induced

seizures resulted in an upregulation of BBB glucose transporter activity within three

minutes as determined by an increased Vmax and glucose permeability (Cornford et al.,

2000). A higher intrinsic activity of GLUT1 transporters seems to be the underlying

factor. A similar induction of GLUT1 activity by 6 Hz induced seizures seems possible,

but might be only of short duration and therefore not be detectable with interictal

[18F]FDG PET. Nevertheless, it might have partially contributed to the increased

glucose influx and metabolism observed in 2-DG-treated mice undergoing kindling.

According to our results, a higher glucose uptake seems only to occur as a combined

effect of 2-DG and kindling, whereas 2-DG per se reduces [18F]FDG uptake, but

nevertheless leads to increased glucose influx. 2-DG itself was shown to increase

blood flow in a variety of brain regions within 30 minutes after intravenous

administration (Breier et al., 1993, Horinaka et al., 1997). In addition, electrical

stimulation per se temporary increases cerebral microcirculation (Leniger-Follert and

Lubbers, 1976). It therefore seems plausible that increased blood flow contributed to

the increase in glucose uptake and turnover observed in 2-DG-treated mice

undergoing kindling.

As the Fluoro-Jade- C staining did not reveal dying neurons, positive effects of 2-DG

on corneal kindling progress cannot be attributed to a possible neuroprotective action.

Rather, 2-DG treatment partially alleviated astroglial activation as seen in the

5 Manuskripte

75

hippocampal CA3 region and the piriform cortex. Stimulation of IL-ß production by

induced astrocytes is described to be associated with kindling epileptogenesis

(Ravizza et al., 2008). An indirect mitigation of the IL-ß system therefore might be a

possible mechanism of 2-DG effects on kindling progression.

IBA1 staining did not reveal microglial activation induced by kindling higher than in

brain slices of naïve control mice (Figure 5), which is in line with data from 50-Hz-

kindled mice (Loewen et al., 2016). IBA1 is a protein specifically expressed in

monocytic cell lines (Imai et al., 1996) and increased in activated

macrophages/microglia where it is necessary for membrane ruffles in order to change

cell shape (Ito et al., 1998). Surprisingly, however, we found that 2-DG led to microglial

activation both in mice undergoing kindling and in unstimulated mice. Cumulating

evidence suggests that microglial activation plays a crucial role in epileptogenesis

(Vezzani, 2015, Amhaoul et al., 2015, Brackhan et al., 2016). However, different

activation states of microglia can be distinguished, which are often referred to as pro-

inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) microglia. While microglia of the M1

activation state is more likely to negatively contribute to the epileptogenic process, e.g.

by producing pro-inflammatory cytokines, microglia of the M2 activation state might

exert beneficial or neuroprotective effects, e.g. by expressing anti-inflammatory

cytokines (Boche et al., 2013, Colton, 2009). It has been shown that both phenotypes

are subject to alterations during epileptogenesis in mice (Benson et al., 2015).

Immunostaining with IBA1 is not suitable for differentiation of the M1 and M2 state.

Therefore, it remains to be elucidated in future investigations whether 2-DG might

preferentially induce the reparative anti-inflammatory M2 phenotype and whether this

might contribute to the disease-modifying effects of 2-DG found in the present study.

Conclusion

Taken together, we show that chronic 2-DG treatment in mice is well tolerated and

exerts true disease-modifying effects in a kindling model of difficult-to-treat seizures.

As revealed by [18F]FDG PET, 2-DG leads to increased glucose supply in the mouse

brain undergoing kindling-mediated epileptogenesis. Further, both the alleviation of

astroglial activation and the unexpected activation of microglia by 2-DG might

5 Manuskripte

76

contribute to its positive interference with epileptogenesis. While [18F]FDG PET does

not seem to be a promising marker for active epileptogenic processes during 6 Hz

corneal kindling, it facilitates specific insight into the drug-disease interaction in

combination with 2-DG treatment.

Abbreviations

2-DG: 2-deoxy-D-glucose; 3D-OSEM: three-dimensional ordered subset expectation

maximization; [18F]FDG: 2-Deoxy-2-[18F]fluoroglucose; GFAP: glial fibrillary acidic

protein; GLUT1: glucose transporter 1; IBA1: ionized calcium-binding adapter molecule

1; ID: injected dose; IDIF: image-derived input function; Ki: net influx rate; LC: lumped

constant; MAP algorithm: maximum a posteriori algorithm; MRGlu: glucose metabolic

rate; MRI: magnetic resonance imaging; PET: positron emission tomography.

Acknowledgements

This study was funded by the European Union Seventh’s Framework Programme

(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Ina Leiter was

supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are grateful

to Silvia Eilert, Petra Felsch, Alexander Kanwischer, Dr Tobias Ross, Simone Mehler,

Michael Weißing, Nathalie Hildebrandt, and Annika Thomer for excellent technical

assistance. Dr. Wolfgang Härtig is kindly acknowledged for help with

immunohistochemical staining. We thank Dr. Helge Frieling for providing the stimulator

used for corneal kindling.

Competing Interests

The authors have declared that no competing interest exists.

5 Manuskripte

77

Figures

Figure 1: Effects of 2-DG (2-deoxy-D-glucose) treatment on corneal kindling

(A) Heat map (purple to red) indicating seizure responses to each stimulation in mice treated with vehicle

(left, n=18) or 2-DG (right, n=18) one minute after each stimulation. (B) Seizure responses of vehicle-

and 2-DG-treated mice over the kindling course of 21 days. (C) Percentage of overall shown type-5

seizures in vehicle- and 2-DG-treated mice. (D) Number of stimulations needed to achieve a fully kindled

state, defined as at least 8 of 10 consecutive type 5 seizures, in vehicle- and 2-DG-treated mice. Mean

± SEM; Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test (B), Student’s t-test (C, D);

p<0.05. Asterisk indicates significant difference between treatment groups.

5 Manuskripte

78

Figure 2: [18F]FDG uptake

2-deoxy-D-glucose (2-DG)-treated, unstimulated mice (2-DG w/o kindling, n=12), vehicle-treated mice

undergoing kindling (vehicle+kindling, n=18), and 2-DG- treated mice undergoing kindling (2-

DG+kindling, n=18) were subjected to [18F]FDG PET at baseline (Bl; after first treatment, before start of

kindling) and at days 10 and 17 of kindling. Regional [18F]FDG uptake in (A) hippocampus, (B) thalamus,

(D) cortex, (E) striatum and (F) cerebellum, was quantified as percent injected dose per cubic centimeter

(%ID/cc). Mean ± SEM; one-way ANOVA, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant

difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For details

about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.

5 Manuskripte

79

Figure 3: Ki values of the [18F]FDG-2-compartment model

Regional Ki in (A) hippocampus, (B) thalamus, (D) cortex, (E) striatum und (F) cerebellum are shown.

The input function for the 2-compartment model was calculated directly from the image data of the three

PET scan timepoints by positioning a volume of interest in the caudal vena cava. Mean ± SEM; one-

way ANOVA, Bonferroni post hoc, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant

difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For details

about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.

5 Manuskripte

80

Figure 4: MRGlu values of the [18F]FDG-2-compartment model

Regional MRGlu values in (A) hippocampus, (B) thalamus, (D) cortex, (E) striatum and (F) cerebellum

are shown. The input function for the 2-compartment model was calculated directly from the image data

of the three PET scan timepoints by positioning a volume of interest in the caudal vena cava. Mean ±

SEM; one-way ANOVA, Bonferroni post hoc, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates

significant difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For

details about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.

5 Manuskripte

81

Figure 5: Results of the IBA1 immunostaining

(A) Representative images of the right hippocampal area showing IBA1-positive microglia of each

experimental group at day 22 after start of experiment. (B) Data of semi-quantitative assessment of

microglial activation in hippocampal subregions, thalamus, amygdala and piriform cortex. Naïve,

untreated and unstimulated control group, n=6; 2-DG w/o kindling, 2-deoxy-D-glucose-treated,

unstimulated mice, n=6; vehicle+kindling, vehicle-treated mice undergoing kindling, n=6; 2-DG+kindling,

2-DG- treated mice undergoing kindling, n=6; CA, cornu ammonis. Mean ± SEM; Kruskal-Wallis

ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant difference to

baseline. Bar in (A) indicates 50 µm and 10 µm (magnified detail), respectively.

5 Manuskripte

82

Figure 6: Results of the GFAP immunostaining

(A) Representative images of the right hippocampal area showing GFAP-positive astroglia of each

experimental group at day 22 after start of experiment. (B) Data of semi-quantitative assessment of

astroglial activation in hippocampal subregions, thalamus, amygdala and piriform cortex. Mean ± SEM;

Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant

difference to baseline. Bar in (A) indicates 50 µm and 10 µm (magnified detail), respectively. For details

about treatment groups and abbreviations see legend of Figure 5.

5 Manuskripte

83

References

AMHAOUL, H., HAMAIDE, J., BERTOGLIO, D., REICHEL, S. N., VERHAEGHE, J.,

GEERTS, E., VAN DAM, D., DE DEYN, P. P., KUMAR-SINGH, S., KATSIFIS, A.,

VAN DER LINDEN, A., STAELENS, S. & DEDEURWAERDERE, S. 2015. Brain

inflammation in a chronic epilepsy model: Evolving pattern of the translocator protein

during epileptogenesis. Neurobiol Dis, 82, 526-39.

BANKSTAHL, M., BANKSTAHL, J. P. & LÖSCHER, W. 2013. Pilocarpine-induced epilepsy

in mice alters seizure thresholds and the efficacy of antiepileptic drugs in the 6-Hertz

psychomotor seizure model. Epilepsy Res, 107, 205-16.

BANKSTAHL, M., MÜLLER, C. J., WILK, E., SCHUGHART, K. & LÖSCHER, W. 2012.

Generation and characterization of pilocarpine-sensitive C57BL/6 mice as a model of

temporal lobe epilepsy. Behav Brain Res, 230, 182-91.

BARTON, M. E., KLEIN, B. D., WOLF, H. H. & WHITE, H. S. 2001. Pharmacological

characterization of the 6 Hz psychomotor seizure model of partial epilepsy. Epilepsy

Res, 47, 217-27.

BASCUNANA, P., JAVELA, J., DELGADO, M., FERNANDEZ DE LA ROSA, R., SHIHA, A.

A., GARCIA-GARCIA, L. & POZO, M. A. 2016. [(18)F]FDG PET Neuroimaging

Predicts Pentylenetetrazole (PTZ) Kindling Outcome in Rats. Mol Imaging Biol, 18,

733-40.

BAULAC, M., DE BOER, H., ELGER, C., GLYNN, M., KALVIAINEN, R., LITTLE, A.,

MIFSUD, J., PERUCCA, E., PITKANEN, A. & RYVLIN, P. 2015. Epilepsy priorities in

Europe: A report of the ILAE-IBE Epilepsy Advocacy Europe Task Force. Epilepsia,

56, 1687-95.

BENSON, M. J., MANZANERO, S. & BORGES, K. 2015. Complex alterations in microglial

M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models. Epilepsia,

56, 895-905.

BIALER, M., JOHANNESSEN, S. I., LEVY, R. H., PERUCCA, E., TOMSON, T. & WHITE, H.

S. 2015. Progress report on new antiepileptic drugs: A summary of the Twelfth Eilat

Conference (EILAT XII). Epilepsy Res, 111, 85-141.

BLACKWOOD, D. H., KAPOOR, V. & MARTIN, M. J. 1981. Regional changes in cerebral

glucose utilization associated with amygdaloid kindling and electroshock in the rat.

Brain Res, 224, 204-8.

BOCHE, D., PERRY, V. H. & NICOLL, J. A. R. 2013. Review: Activation patterns of microglia

and their identification in the human brain. Neuropathol Appl Neurobiol, 39, 3-18.

5 Manuskripte

84

BORGES, K., GEARING, M., MCDERMOTT, D. L., SMITH, A. B., ALMONTE, A. G.,

WAINER, B. H. & DINGLEDINE, R. 2003. Neuronal and glial pathological changes

during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol, 182, 21-34.

BRACKHAN, M., BASCUNANA, P., POSTEMA, J. M., ROSS, T. L., BENGEL, F. M.,

BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016. Serial Quantitative TSPO-Targeted

PET Reveals Peak Microglial Activation up to 2 Weeks After an Epileptogenic Brain

Insult. J Nucl Med, 57, 1302-8.

BRANDT, C., BANKSTAHL, M., TOLLNER, K., KLEE, R. & LOSCHER, W. 2016. The

pilocarpine model of temporal lobe epilepsy: Marked intrastrain differences in female

Sprague-Dawley rats and the effect of estrous cycle. Epilepsy Behav, 61, 141-152.

BREIER, A., CRANE, A. M., KENNEDY, C. & SOKOLOFF, L. 1993. The effects of

pharmacologic doses of 2-deoxy-d-glucose on local cerebral blood flow in the awake,

unrestrained rat. Brain Res, 618, 277-282.

BRODIE, M. J., BARRY, S. J., BAMAGOUS, G. A., NORRIE, J. D. & KWAN, P. 2012.

Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology, 78, 1548-54.

BURNEO, J. G., POON, R., KELLETT, S. & SNEAD, O. C. 2015. The Utility of Positron

Emission Tomography in Epilepsy. Can J Neurol Sci, 6, 1-12.

CHEN, W. & GUERON, M. 1992. The inhibition of bovine heart hexokinase by 2-deoxy-D-

glucose-6-phosphate: characterization by 31P NMR and metabolic implications.

Biochimie, 74, 867-73.

CHOEIRI, C., STAINES, W. & MESSIER, C. 2002. Immunohistochemical localization and

quantification of glucose transporters in the mouse brain. Neuroscience, 111, 19-34.

COLTON, C. A. 2009. Heterogeneity of Microglial Activation in the Innate Immune Response

in the Brain. J Neuroimmune Pharmacol, 4, 399-418.

CORNFORD, E. M., NGUYEN, E. V. & LANDAW, E. M. 2000. Acute upregulation of blood-

brain barrier glucose transporter activity in seizures. Am J Physiol Heart Circ Physiol,

279, H1346-54.

DRZEZGA, A., ARNOLD, S., MINOSHIMA, S., NOACHTAR, S., SZECSI, J., WINKLER, P.,

ROMER, W., TATSCH, K., WEBER, W. & BARTENSTEIN, P. 1999. 18F-FDG PET

studies in patients with extratemporal and temporal epilepsy: evaluation of an

observer-independent analysis. J Nucl Med, 40, 737-46.

FANG, F. & LEI, H. 2010. Increased hippocampal T2 in a rat model of pentylenetetrazol-

induced kindling correlates with seizure scores. J Neurol Sci, 292, 16-23.

5 Manuskripte

85

FERRARO, T. N., GOLDEN, G. T., SMITH, G. G. & BERRETTINI, W. H. 1995. Differential

susceptibility to seizures induced by systemic kainic acid treatment in mature DBA/2J

and C57BL/6J mice. Epilepsia, 36, 301-7.

GARRIGA-CANUT, M., SCHOENIKE, B., QAZI, R., BERGENDAHL, K., DALEY, T. J.,

PFENDER, R. M., MORRISON, J. F., OCKULY, J., STAFSTROM, C., SUTULA, T. &

ROOPRA, A. 2006. 2-deoxy-D-glucose reduces epilepsy progression by NRSF-CtBP-

dependent metabolic regulation of chromatin structure. Nat. Neurosci, 9, 1382-1387.

GASIOR, M., YANKURA, J., HARTMAN, A. L., FRENCH, A. & ROGAWSKI, M. A. 2010.

Anticonvulsant and proconvulsant actions of 2-deoxy-d-glucose. Epilepsia, 51, 1385-

1394.

GOFFIN, K., DEDEURWAERDERE, S., VAN LAERE, K. & VAN PAESSCHEN, W. 2008.

Neuronuclear assessment of patients with epilepsy. Semin Nucl Med, 38, 227-39.

GOFFIN, K., VAN PAESSCHEN, W., DUPONT, P. & VAN LAERE, K. 2009. Longitudinal

microPET imaging of brain glucose metabolism in rat lithium-pilocarpine model of

epilepsy. Exp Neurol, 217, 205-9.

GOUNDER, M. K., LIN, H., STEIN, M., GOODIN, S., BERTINO, J. R., KONG, A. N. &

DIPAOLA, R. S. 2012. A validated bioanalytical HPLC method for pharmacokinetic

evaluation of 2-deoxyglucose in human plasma. Biomed Chromatogr, 26, 650-4.

GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K. & LÖSCHER, W. 2007. Behavioral alterations in the

pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Exp Neurol, 207, 329-49.

GUO, Y., GAO, F., WANG, S., DING, Y., ZHANG, H., WANG, J. & DING, M. P. 2009. In vivo

mapping of temporospatial changes in glucose utilization in rat brain during

epileptogenesis: an 18F-fluorodeoxyglucose-small animal positron emission

tomography study. Neuroscience, 162, 972-9.

HORINAKA, N., ARTZ, N., JEHLE, J., TAKAHASHI, S., KENNEDY, C. & SOKOLOFF, L.

1997. Examination of potential mechanisms in the enhancement of cerebral blood

flow by hypoglycemia and pharmacological doses of deoxyglucose. J Cereb Blood

Flow Metab, 17, 54-63.

IMAI, Y., IBATA, I., ITO, D., OHSAWA, K. & KOHSAKA, S. 1996. A Novel Gene iba1in the

Major Histocompatibility Complex Class III Region Encoding an EF Hand Protein

Expressed in a Monocytic Lineage. Biochem Biophys Res Commun, 224, 855-862.

ITO, D., IMAI, Y., OHSAWA, K., NAKAJIMA, K., FUKUUCHI, Y. & KOHSAKA, S. 1998.

Microglia-specific localisation of a novel calcium binding protein, Iba1. Mol Brain Res,

57, 1-9.

5 Manuskripte

86

JUPP, B., WILLIAMS, J., BINNS, D., HICKS, R. J., CARDAMONE, L., JONES, N., REES, S.

& O'BRIEN, T. J. 2012. Hypometabolism precedes limbic atrophy and spontaneous

recurrent seizures in a rat model of TLE. Epilepsia, 53, 1233-44.

KHURGEL, M., SWITZER, R. C., 3RD, TESKEY, G. C., SPILLER, A. E., RACINE, R. J. &

IVY, G. O. 1995. Activation of astrocytes during epileptogenesis in the absence of

neuronal degeneration. Neurobiol Dis, 2, 23-35.

KIM, Y. K., LEE, D. S., LEE, S. K., KIM, S. K., CHUNG, C. K., CHANG, K. H., CHOI, K. Y.,

CHUNG, J. K. & LEE, M. C. 2003. Differential features of metabolic abnormalities

between medial and lateral temporal lobe epilepsy: quantitative analysis of (18)F-

FDG PET using SPM. J Nucl Med, 44, 1006-12.

KIPNIS, D. M. & CORI, C. F. 1959. Studies of tissue permeability. V. The penetration and

phosphorylation of 2-deoxyglucose in the rat diaphragm. J Biol Chem, 234, 171-7.

KORNBLUM, H. I., ARAUJO, D. M., ANNALA, A. J., TATSUKAWA, K. J., PHELPS, M. E. &

CHERRY, S. R. 2000. In vivo imaging of neuronal activation and plasticity in the rat

brain by high resolution positron emission tomography (microPET). Nat Biotechnol,

18, 655-60.

LANZ, B., POITRY-YAMATE, C. & GRUETTER, R. 2014. Image-derived input function from

the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. J Nucl Med, 55, 1380-8.

LECLERCQ, K., MATAGNE, A. & KAMINSKI, R. M. 2014. Low potency and limited efficacy

of antiepileptic drugs in the mouse 6Hz corneal kindling model. Epilepsy Res, 108,

675-83.

LEE, E. M., PARK, G. Y., IM, K. C., KIM, S. T., WOO, C. W., CHUNG, J. H., KIM, K. S., KIM,

J. S., SHON, Y. M., KIM, Y. I. & KANG, J. K. 2012. Changes in glucose metabolism

and metabolites during the epileptogenic process in the lithium-pilocarpine model of

epilepsy. Epilepsia, 53, 860-9.

LENIGER-FOLLERT, E. & LUBBERS, D. W. 1976. Behavior of microflow and local PO2 of

the brain cortex during and after direct electrical stimulation. A contribution to the

problem of metabolic regulation of microcirculation in the brain. Pflugers Arch, 366,

39-44.

LIAN, X. Y., KHAN, F. A. & STRINGER, J. L. 2007. Fructose-1,6-bisphosphate has

anticonvulsant activity in models of acute seizures in adult rats. J Neurosci, 27,

12007-12011.

LIU, Y. R., CARDAMONE, L., HOGAN, R. E., GREGOIRE, M. C., WILLIAMS, J. P., HICKS,

R. J., BINNS, D., KOE, A., JONES, N. C., MYERS, D. E., O'BRIEN, T. J. &

5 Manuskripte

87

BOUILLERET, V. 2010. Progressive metabolic and structural cerebral perturbations

after traumatic brain injury: an in vivo imaging study in the rat. J Nucl Med, 51, 1788-

95.

LOEWEN, J. L., BARKER-HALISKI, M. L., DAHLE, E. J., WHITE, H. S. & WILCOX, K. S.

2016. Neuronal Injury, Gliosis, and Glial Proliferation in Two Models of Temporal

Lobe Epilepsy. J Neuropathol Exp Neurol, 75, 366-78.

LÖSCHER, W. & BRANDT, C. 2010. Prevention or modification of epileptogenesis after

brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacol Rev,

62, 668-700.

LOTHMAN, E. W., HATLELID, J. M. & ZORUMSKI, C. F. 1985. Functional mapping of limbic

seizures originating in the hippocampus: a combined 2-deoxyglucose and

electrophysiologic study. Brain Res, 360, 92-100.

MA, Y., HOF, P. R., GRANT, S. C., BLACKBAND, S. J., BENNETT, R., SLATEST, L.,

MCGUIGAN, M. D. & BENVENISTE, H. 2005. A three-dimensional digital atlas

database of the adult C57BL/6J mouse brain by magnetic resonance microscopy.

Neuroscience, 135, 1203-1215.

MAGISTRETTI, P. J. 2006. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity. J Exp Biol, 209,

2304-11.

MAGISTRETTI, P. J. & ALLAMAN, I. 2015. A cellular perspective on brain energy

metabolism and functional imaging. Neuron, 86, 883-901.

MATAGNE, A. & KLITGAARD, H. 1998. Validation of corneally kindled mice: a sensitive

screening model for partial epilepsy in man. Epilepsy Res, 31, 59-71.

MATAGNE, A., MARGINEANU, D. G., KENDA, B., MICHEL, P. & KLITGAARD, H. 2008.

Anti-convulsive and anti-epileptic properties of brivaracetam (ucb 34714), a high-

affinity ligand for the synaptic vesicle protein, SV2A. Br J Pharmacol, 154, 1662-71.

MINOR, R. K., SMITH JR, D. L., SOSSONG, A. M., KAUSHIK, S., POOSALA, S.,

SPANGLER, E. L., ROTH, G. S., LANE, M., ALLISON, D. B., DE CABO, R.,

INGRAM, D. K. & MATTISON, J. A. 2010. Chronic ingestion of 2-deoxy-d-glucose

induces cardiac vacuolization and increases mortality in rats. Toxicol Appl Pharmacol,

243, 332-339.

MIRRIONE, M. M., SCHIFFER, W. K., FOWLER, J. S., ALEXOFF, D. L., DEWEY, S. L. &

TSIRKA, S. E. 2007. A novel approach for imaging brain-behavior relationships in

mice reveals unexpected metabolic patterns during seizures in the absence of tissue

plasminogen activator. NeuroImage, 38, 34-42.

5 Manuskripte

88

MIRRIONE, M. M., SCHIFFER, W. K., SIDDIQ, M., DEWEY, S. L. & TSIRKA, S. E. 2006.

PET imaging of glucose metabolism in a mouse model of temporal lobe epilepsy.

Synapse, 59, 119-21.

MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K., SCHUGHART, K. & LÖSCHER, W. 2009.

Differences in sensitivity to the convulsant pilocarpine in substrains and sublines of

C57BL/6 mice. Genes Brain Behav, 8, 481-92.

NIRENBERG, M. W. & HOGG, J. F. 1958. Inhibition of anaerobic glycolysis in Ehrlich ascites

tumor cells by 2-deoxy-D-glucose. Cancer Res, 18, 518-21.

O'BRIEN, T. J. & JUPP, B. 2009. In-vivo imaging with small animal FDG-PET: a tool to

unlock the secrets of epileptogenesis? Exp Neurol, 220, 1-4.

OCKULY, J. C., GIELISSEN, J. M., LEVENICK, C. V., ZEAL, C., GROBLE, K., MUNSEY, K.,

SUTULA, T. P. & STAFSTROM, C. E. 2012. Behavioral, cognitive, and safety profile

of 2-deoxy-2-glucose (2DG) in adult rats. Epilepsy Research, 101, 246-252.

OSAWA, M., UEMURA, S., KIMURA, H. & SATO, M. 2001. Amygdala kindling develops

without mossy fiber sprouting and hippocampal neuronal degeneration in rats.

Psychiatry Clin Neurosci, 55, 549-57.

PARK, J. H., CHO, H., KIM, H. & KIM, K. 2006. Repeated brief epileptic seizures by

pentylenetetrazole cause neurodegeneration and promote neurogenesis in discrete

brain regions of freely moving adult rats. Neuroscience, 140, 673-84.

PAVLOVA, T. V., YAKOVLEV, A. A., STEPANICHEV, M. Y. & GULYAEVA, N. V. 2006.

Pentylenetetrazol kindling in rats: Is neurodegeneration associated with

manifestations of convulsive activity? Neurosci Behav Physiol, 36, 741-8.

PAXINOS, G. & FRANKLIN, K. 2007. The mouse brain in stereotaxic coordinates, San

Diego, Academic Press.

PELLERIN, L. & MAGISTRETTI, P. J. 2012. Sweet sixteen for ANLS. J Cereb Blood Flow

Metab, 32, 1152-66.

POTSCHKA, H. & LÖSCHER, W. 1999. Corneal kindling in mice: behavioral and

pharmacological differences to conventional kindling. Epilepsy Res, 37, 109-20.

RACINE, R. J. 1972. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor

seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 32, 281-294.

RAEZ, L. E., PAPADOPOULOS, K., RICART, A. D., CHIOREAN, E. G., DIPAOLA, R. S.,

STEIN, M. N., ROCHA LIMA, C. M., SCHLESSELMAN, J. J., TOLBA, K.,

LANGMUIR, V. K., KROLL, S., JUNG, D. T., KURTOGLU, M., ROSENBLATT, J. &

LAMPIDIS, T. J. 2013. A phase I dose-escalation trial of 2-deoxy-D-glucose alone or

5 Manuskripte

89

combined with docetaxel in patients with advanced solid tumors. Cancer Chemother

Pharmacol, 71, 523-30.

RAVIZZA, T., NOÉ, F., ZARDONI, D., VAGHI, V., SIFRINGER, M. & VEZZANI, A. 2008.

Interleukin Converting Enzyme inhibition impairs kindling epileptogenesis in rats by

blocking astrocytic IL-1β production. Neurobiology of Disease, 31, 327-333.

ROBEL, S., BUCKINGHAM, S. C., BONI, J. L., CAMPBELL, S. L., DANBOLT, N. C.,

RIEDEMANN, T., SUTOR, B. & SONTHEIMER, H. 2015. Reactive astrogliosis

causes the development of spontaneous seizures. J Neurosci, 35, 3330-45.

ROMCY-PEREIRA, R. N. & GARCIA-CAIRASCO, N. 2003. Hippocampal cell proliferation

and epileptogenesis after audiogenic kindling are not accompanied by mossy fiber

sprouting or Fluoro-Jade staining. Neuroscience, 119, 533-46.

ROWLEY, N. M. & WHITE, H. S. 2010. Comparative anticonvulsant efficacy in the corneal

kindled mouse model of partial epilepsy: Correlation with other seizure and epilepsy

models. Epilepsy Res, 92, 163-9.

SIMPSON, I. A., APPEL, N. M., HOKARI, M., OKI, J., HOLMAN, G. D., MAHER, F.,

KOEHLER-STEC, E. M., VANNUCCI, S. J. & SMITH, Q. R. 1999. Blood-brain barrier

glucose transporter: effects of hypo- and hyperglycemia revisited. J Neurochem, 72,

238-47.

SINGH, D., BANERJI, A., DWARAKANATH, B., TRIPATHI, R., GUPTA, J., MATHEW, T. L.,

RAVINDRANATH, T. & JAIN, V. 2005. Optimizing Cancer Radiotherapy with 2-

Deoxy-D-Glucose. Strahlentherapie und Onkologie, 181, 507-514.

STAFSTROM, C. E., OCKULY, J. C., MURPHREE, L., VALLEY, M. T., ROOPRA, A. &

SUTULA, T. P. 2009. Anticonvulsant and Antiepileptic Actions of 2-Deoxy-D-Glucose

in Epilepsy Models. Ann Neurol, 65, 435-447.

STAFSTROM, C. E., ROOPRA, A. & SUTULA, T. P. 2008. Seizure suppression via

glycolysis inhibition with 2-deoxy-D-glucose (2DG). Epilepsia, 8, 97-100.

SUTULA, T. & FRANZOSO, S. 2008. Dose-response and time course of action of disease-

modifying effects of 2DG on kindling progression: effectiveness of administration after

seizures. Epilepsia, 49 (suppl. 7), 1-498.

THORN, S. L., DEKEMP, R. A., DUMOUCHEL, T., KLEIN, R., RENAUD, J. M., WELLS, R.

G., GOLLOB, M. H., BEANLANDS, R. S. & DASILVA, J. N. 2013. Repeatable

noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG:

evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med, 54, 1637-44.

5 Manuskripte

90

UMEGAE, Y., NOHTA, H. & OHKURA, Y. 1990. Simultaneous Determination of 2-Deoxy-D-

glucose and D-Glucose in Rat Serum by High-Performance Liquid Chromatography

with Post-Column Fluorescence Derivatization. Chem Pharm Bull, 38, 963-965.

VEZZANI, A. 2015. Anti-inflammatory drugs in epilepsy: does it impact epileptogenesis?

Expert Opinion on Drug Safety, 14, 583-592.

WEISSBERG, I., WOOD, L., KAMINTSKY, L., VAZQUEZ, O., MILIKOVSKY, D. Z.,

ALEXANDER, A., OPPENHEIM, H., ARDIZZONE, C., BECKER, A., FRIGERIO, F.,

VEZZANI, A., BUCKWALTER, M. S., HUGUENARD, J. R., FRIEDMAN, A. &

KAUFER, D. 2015. Albumin induces excitatory synaptogenesis through astrocytic

TGF-beta/ALK5 signaling in a model of acquired epilepsy following blood-brain barrier

dysfunction. Neurobiol Dis, 78, 115-25.

WICK, A. N., DRURY, D. R., NAKADA, H. I. & WOLFE, J. B. 1957. Localization of the

primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. J Biol Chem, 224, 963-9.

WILLIS, S., STOLL, J., SWEETMAN, L. & BORGES, K. 2010. Anticonvulsant effects of a

triheptanoin diet in two mouse chronic seizure models. Neurobiol Dis, 40, 565-72.

XI, H., KURTOGLU, M. & LAMPIDIS, T. J. 2014. The wonders of 2-deoxy-D-glucose. IUBMB

Life, 66, 110-21.

YANG, H., GUO, R., WU, J. X., PENG, Y. F., XIE, D. J., ZHENG, W., HUANG, X., LIU, D.,

LIU, W., HUANG, L. H. & SONG, Z. 2013. The Antiepileptic Effect of the Glycolytic

Inhibitor 2-Deoxy-d-Glucose is Mediated by Upregulation of K-ATP Channel Subunits

Kir6.1 and Kir6.2. Neurochem. Res, 38, 677-685.

YAO, J., CHEN, S. H., MAO, Z. S., CADENAS, E. & BRINTON, R. D. 2011. 2-Deoxy-D-

Glucose Treatment Induces Ketogenesis, Sustains Mitochondrial Function, and

Reduces Pathology in Female Mouse Model of Alzheimer's Disease. Plos One, 6.

ZHANG, L., GUO, Y., HU, H., WANG, J., LIU, Z. & GAO, F. 2015. FDG-PET and NeuN-

GFAP immunohistochemistry of hippocampus at different phases of the pilocarpine

model of temporal lobe epilepsy. Int J Med Sci, 12, 288-94.

5 Manuskripte

91

5.2 Blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis is associated with

rapid remodeling of the neurovascular unit

Marion Bankstahl1*, Heike Breuer1,2, Ina Leiter1,2, Martin Märkel3, Pablo Bascuñana2,

Dominik Michalski4, Frank M. Bengel2, Wolfgang Löscher1, Martin Meier5, Jens P.

Bankstahl2#, Wolfgang Härtig3#



Hannover, Germany


Germany

3 Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Liebigstr. 19,

04103 Leipzig, Germany

4 Department of Neurology, University of Leipzig, Liebigstr. 20, 04103 Leipzig,

Germany

5 Preclinical Imaging Labs, Central Laboratory Animal Facility & Institute for

Laboratory Animal Science, Hannover Medical School, 30625 Hannover, Germany






Abstract

Increased permeability of the blood-brain barrier (BBB) following cerebral injury results

in regional extravasation of plasma proteins and can critically contribute to the

pathogenesis of epilepsy. Here, we comprehensively explored the spatiotemporal

evolution of a main extravasation component, albumin, and illuminate associated

responses of the neurovascular unit (NVU) contributing to early epileptogenic

mailto:[email protected]

5 Manuskripte

92

neuropathology. Applying translational in vivo MR imaging and complementary

immunohistochemical analyses in the widely used rat pilocarpine-post status

epilepticus (SE) model, we demonstrate rapid BBB leakage affecting major

epileptogenesis-associated brain regions, peaking between 1 and 2 days post SE, and

rapidly declining thereafter, accompanied by cerebral edema generally following the

same time course. At peak of BBB leakage, albumin colocalized with NVU

constituents, like vascular components, neurons and brain immune cells. Surprisingly,

astroglial markers did not colocalize with albumin and aquaporin-4 was clearly reduced

in areas of leaky BBB, indicating a severe disturbance of astrocyte-mediated

endothelial-neuronal coupling. In addition, a distinct adaptive reorganization process

of the NVU vasculature apparently takes place at sites of albumin presence,

substantiated by reduced immunoreactivity of endothelial and changes in vascular

basement membrane markers. Taken together, degenerative events at the level of the

NVU, affecting vessels, astrocytes and neurons, seem to outweigh reconstructive

processes. Considering the rapidly occurring BBB leakage and subsequent substantial

degenerative events at the NVU level, our data support the necessity of a prompt BBB-

restoring treatment as one component of rational therapeutic intervention to prevent

epileptogenesis and the development of other detrimental sequelae of SE.

Significance statement

Blood-brain barrier (BBB) leakage is critically involved in brain insult-mediated epilepsy

development. Here, we demonstrate rapid but transient BBB damage within hours after

experimental status epilepticus (SE), an epileptogenic insult, and subsequent

degenerative events at the level of the so called neurovascular unit (NVU), which

reflects the anatomical and functional interplay between brain vasculature, glial cells

and neurons. Analysis at tissue level revealed degeneration of various NVU

components, which seem to outweigh reconstructive processes, thus providing

potential targets for protective pharmacotherapy. The findings emphasize the

requirement and expedience of rapid BBB-stabilizing treatment as a primary element

of epilepsy-preventive therapeutic intervention.

5 Manuskripte

93

Introduction

Different kinds of cerebral injury, like head trauma, stroke, cerebral infection, or status

epilepticus (SE) may lead to the development of epilepsy in a certain proportion of

affected patients (Pitkänen and Immonen, 2014, Schmidt and Sillanpää, 2016). The

mechanisms subjacent to the process of epileptogenesis following brain insults,

though, are not well understood. One common characteristic of epileptogenic brain

insults is an impairment of the blood-brain barrier (BBB). A leakage of the BBB results

in extravasation of albumin and subsequent activation of glia and inflammatory

responses and is considered as one likely key factor triggering epileptogenesis

(Marcon et al., 2009, van Vliet et al., 2007, Seiffert et al., 2004, Ivens et al., 2007).

Albumin extravasation into the brain, eventually resulting in recurrent electrographic

seizures (Weissberg et al., 2015, Bar-Klein et al., 2014), is observed in various post-

SE models of epileptogenesis (Breuer et al., 2016, Michalak et al., 2013, van Vliet et

al., 2007). Importantly, increased BBB permeability is currently under investigation as

potential prognostic biomarker for stratifying individuals at risk to develop epilepsy

following epileptogenic brain insults (Pitkänen et al., 2016, Walker et al., 2016) and as

treatment target for attenuation or prevention of epileptogenesis by applying drugs

stabilizing or restoring BBB function during the latency phase preceding appearance

of the first clinical seizure (van Vliet et al., 2016, Janigro, 2012, Friedman and

Heinemann, 2012). For both objectives, it is crucial to reveal the in vivo spatiotemporal

pattern of BBB leakage following cerebral injury. Furthermore, elucidating its cellular

and parenchymal distribution pattern of extravasated albumin and associated changes

in the neurovascular unit (NVU) will be beneficial for better understanding of

pathological cascades finally leading to chronic seizure generation.

Therefore, we here i) present detailed data on the in vivo spatiotemporal pattern of

BBB leakage during epileptogenesis in the lithium-pilocarpine-post-SE model of

epileptogenesis in rats assessed by contrast-enhanced MR imaging for which we

recently published a methodological paper identifying the most suitable translational

imaging approach (Breuer et al., 2016), ii) determined the cellular uptake and

extracellular distribution pattern of fluorescein-linked albumin, and iii) applied multiple

fluorescence staining to identify colocalization of extravasated albumin with various

5 Manuskripte

94

histochemical markers for cellular and acellular constituents of the extended NVU, i.e.

BBB endothelium, the vascular basement membranes, the glia-endothelial interface,

astrocytes, microglia, and neurons.

Material and Methods

Animals

Adult female Sprague Dawley rats (200-220 g, n = 60) were obtained from Harlan

Laboratories. They were housed in pairs under controlled climate conditions (22±1°C,

humidity 45-55%) in individually ventilated cages under a 14/10 h light-dark cycle (rats

used for imaging experiments), or in groups of 5 in open cages (22±1°C, humidity 45-

55%) under a 12/12 h light-dark cycle (rats used for immunohistochemistry). Standard

diet (Altromin 1324; Altromin, Lage, Germany) and water were accessible ad libitum.

After delivery, animals were allowed to adapt to the new conditions, were repetitively

handled for at least one week before being subjected to experiments, and randomized

to experimental groups. Experiments were conducted in accordance with European

Communities Council Directives 86/609/EEC and 2010/63/EU and were formally

approved by the responsible local authority. Experiments were reported according to

ARRIVE (Animal Research: Reporting in Vivo Experiments) guidelines.

Chemicals, drugs, and antibodies

Isoflurane (Isofluran Baxter) was obtained from Baxter (Unterschleißheim, Germany)

and CP-Pharma (Burgdorf, Germany), diazepam as commercial solution (Faustan or

Diazepam-ratiopharm) from Temmler Pharma GmbH (Marburg, Germany) or

Ratiopharm (Ulm, Germany), respectively, and glucose electrolyte solution

(Sterofundin HEG-5) from B. Braun (Melsungen, Germany). Gadolinium-DTPA (Gd-

DTPA, Magnevist 0.5 mmol/ml) was purchased from Bayer HealthCare (Leverkusen,

Germany). All immunoreagents were obtained from Dianova (Hamburg, Germany) as

supplier for Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Unless stated

otherwise, all further chemicals were of analytic grade and purchased from Sigma-

Aldrich (Schnelldorf, Germany).

5 Manuskripte

95

Induction of status epilepticus

SE was induced in rats (n=42) as described elsewhere (Bankstahl et al., 2012). Shortly,

14–16 h after the administration of lithium chloride (127 mg/kg in 3 ml/kg 0.9% saline,

p.o.) and 30 min after methyl scopolamine (1 mg/kg in 2 ml/kg 0.9% saline, i.p.),

injection of pilocarpine (10 mg/kg, repeated up to 5 times, in 1 ml/kg 0.9% saline, i.p.)

was repeated until SE, which was characterized by the onset of repetitive generalized

convulsive seizures (stage 4 or 5) without intermediate recovery of normal behavior.

SE was interrupted after 90 min by administration of diazepam (10 mg/kg in 2 ml/kg,

i.p.). Diazepam injection was repeated after 15 min (10 mg/kg), and, if needed, after

30 min using half of the first dose (5 mg/kg). Self-sustaining SE successfully

established in 90.5% of animals, which required an average pilocarpine dose of 35.4

± 9.6 mg/kg (mean ± SD). Three rats in which SE could not be induced served as

additional control group for albumin extravasation. The overall mortality rate was zero.

Age-matched control rats (n = 10) for histological analysis were treated identically but

received saline instead of pilocarpine. After SE, rats were hand-fed with mashed

laboratory chow and received injections of glucose-electrolyte solution until they

resumed normal feeding behavior.

Magnetic resonance imaging

Rats were scanned before (baseline, n = 13) and 48 h (n = 5), 4 days (n = 6), and 10

days (n = 5) following SE. MRI was conducted as described recently (Breuer et al.,

2016) on a 7 T (300 MHz) small animal MRI system (Bruker Pharmascan) using

ParaVision 5.1 acquisition software (Bruker, Ettlingen, Germany). Rats were

anesthetized with isoflurane and a catheter was placed in a lateral tail vein for contrast

agent infusion. Following transfer of rats into the imaging chamber, which was

constantly kept at 37°C, the rat maxilla was placed in a tooth bar for comparable

positioning. The receive coil was placed at a defined position over the rat head.

Breathing rate of rats during image acquisition was kept at 40 to 60 breaths/min. T2-

weighted 2D multi slice multi echo images (MSME; repetition time=2500 ms, echo

time=11 ms, 96 slices of 0.8 mm, 256x256 matrix, 35x35x25.6 mm3 field of view) were

acquired for detection of brain edema. T1-weighted images were acquired using a 3D

5 Manuskripte

96

modified driven equilibrium Fourier transform method (MDEFT; 0.8 mm slice thickness,

256x256x32 matrix, 35x35x25.6 mm3 field of view) before and 30 min after start of

contrast agent infusion. The resulting voxel size was 0.136x0.136x0.8 mm3. Gd-DTPA

was intravenously infused via a syringe pump (PHD Ultra, Harvard Apparatus, South

Natick, MA, USA) utilizing a 20 min step-down infusion schedule as described recently

(Breuer et al., 2016).

Image analysis

MRI data were co-registered to a rat brain atlas published by Schwarz et al. (2006)

using PMOD software (PMOD Technologies Ltd., Zurich, Switzerland), and data from

six brain regions (hippocampus, thalamus, amygdala, piriform cortex, entorhinal

cortex, and cerebellum) were extracted. T1- and T2 signals were normalized to pons,

for which no alterations in contrast agent uptake or T2 MRI signal was observed after

SE (Breuer et al., 2016). Voxelwise comparison to baseline (two-sample unpaired t-

test, significance level threshold: 0.001, minimum cluster size: 100 voxels) led to Gd-

DTPA leakage t-maps using MATLAB software (MathWorks, Natick, MA, USA) and

SPM12 (UCL, London, UK) as described earlier (Breuer et al., 2016).

FITC-albumin infusion and brain slicing

For histological analysis of albumin extravasation, rats were infused with 100 mg/kg

bovine albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-albumin) diluted in 10

ml/kg 0.1 M phosphate buffered saline (PBS) at a rate of 1 ml/min under short

isoflurane anesthesia without prior SE (control, n = 10), and 5 h (n = 6), 24 h (n = 5),

or 48 h following SE (n = 16). Two hours later, rats were perfused with 125 ml 0.01 M

PBS followed by 250 ml of 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS at a flow rate of 16.6

ml/min. Following removal, brains were kept for 24 h in 4% phosphate-buffered

paraformaldehyde for post-fixation and were then stored in 30% sucrose in 0.1 M PBS

with 0.2% sodium azide at 4°C until sectioning. Coronal sectioning of the forebrain of

each rat was performed using a freezing microtome (Frigomobil 1205; Jung,

Heidelberg, Germany) and a slice thickness of 30 µm. For analysis of FITC-albumin

extravasation patterns, series comprising each 10th coronal serial section from the

5 Manuskripte

97

forebrains of all rats were washed 3 times with TBS for at least 10 min, briefly rinsed

with distilled water, mounted onto fluorescence-free slides (Menzel, Braunschweig,

Germany), air-dried and cover-slipped with Entellan (Merck, Darmstadt, Germany).

Semi-quantitative analysis of extra- and intracellular FITC-albumin

The extent of extracellular and cellular FITC-albumin uptake was scored blinded to

experimental groups. Whole brain slice images were acquired using an all-in-one

fluorescence microscope (Biorevo, BZ-9000E, Keyence). Four coronal brain sections

were analyzed per animal (-0.36 mm, -1.56 mm, -3.72 mm and -4.9 mm relative to

bregma) (Paxinos and Watson, 2007). Target regions were hippocampus, thalamus,

amygdala, piriform cortex, entorhinal cortex, and caudate putamen. Scoring was

performed separately for cellular and extracellular FITC-albumin occurrence: (1)

cellular FITC-albumin uptake: score 0, no cellular uptake, score 1, sporadic cellular

uptake, score 2, medium amount of labeled cells, brain region is only affected in parts,

score 3, high amount of labeled cells, brain region is globally affected; (2) extracellular

FITC-albumin uptake: score 0, no extracellular FITC-albumin, score 1, minimal

extracellular uptake, often near to blood vessels, score 2, medium extracellular FITC-

albumin accumulation, rather focal, score 3, high-grade extracellular FITC-albumin

accumulation, rather global. Target regions were scored in both hemispheres and

means of left and right and of the four section levels were calculated.

Quantification of albumin extravasation following conversion into a light

microscopically visible adduct

The immunohistochemical conversion of the FITC-albumin signal into a light

microscopically visible adduct based on an anti-fluorescein-horseradish peroxidase

(HRP) conjugate (Dianova) and nickel-enhanced diaminobenzidine (DAB-Ni) as

chromogen for the marker enzyme. For this conversion, serial sections were

extensively rinsed with TBS followed by abolishing of endogenous peroxidase activity

within the tissue by treatment with 0.6% hydrogen peroxide in TBS for 30 min. After 3

further rinses with TBS for 10 min each, non-specific binding sites for the

immunoreagent were blocked with TBS containing 2% bovine serum albumin and 0.3%

5 Manuskripte

98

Triton X-100 (TBS-BSA-T) for 30 min. Subsequently, all sections were incubated with

anti-fluorescein-HRP (1:2000 in TBS-BSA-T) for 2 h. Next, the sections were rinsed

twice with TBS and once with 0.05 M Tris buffer, pH 8, for 10 min each. The sections

were then stained by reacting for 4 min with a DAB-Ni solution (containing 40 mg nickel

ammonium sulfate, 2 mg DAB tetrahydrochloride and 5 µl of hydrogen peroxide (30%)

in 10 ml of 0.05 M Tris buffer, pH 8).

For quantification of FITC-albumin extravasation, images of whole brain sections were

acquired at -0.36 mm, -1.56 mm, -3.72 mm, and -4.90 mm relative to bregma by a

Keyence microscope and analyzed with an image quantification software (Volocity

4.3.2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Stained areas were calculated by the total

number of pixels in the stained area relative to the total area of the respective brain

section as described recently (Michalski et al., 2010).

Multiple fluorescence staining

Furthermore, selected FITC-albumin-pre-labeled sections were applied to double

fluorescence staining. For this purpose, the sections were extensively rinsed with TBS

prior to blocking of unspecific binding sites with TBS containing 5% normal donkey

serum and 0.3% Triton X-100 (TBS-NDS-T). The sections were then applied to

mixtures of antibodies or of antibodies and lectins as listed in Table 1. Thereby, all

markers were diluted in TBS-NDS-T, and in general the incubation time was 20 h at

room temperature. Three rinses with TBS for 10 min each were followed by incubation

with cocktails of carbocyanine (Cy)3- and Cy5-conjugated immunoreagents, which

were used at 20 µg/ml TBS-BSA for 1 h. The omission of primary antibodies and lectins

in histological control experiments resulted in the expected absence of any cellular

fluorescence labeling. Pictures at lower magnifications for Fig. 2 B and D were

acquired with a Keyence microscope BZ 9000, all other pictures with a confocal laser

scanning microscope LSM 510 Meta from Zeiss (Göttingen, Germany).

Assessment of neurodegeneration

Assessment of neurodegeneration was performed in Nissl-stained coronal brain

sections in a blinded fashion with respect to the time point following SE. First, severity

5 Manuskripte

99

of neuronal damage was semi-quantitatively assessed by a grading system as

previously described (Bankstahl et al., 2012): score 0, no obvious damage; score 1,

slightly abnormal appearance of the structure without clear evidence of visible neuronal

loss; score 2, lesions involving 20–50% of neurons; score 3, lesions involving >50% of

neurons. Scoring was performed in hippocampal subregions (CA1, CA3a), amygdala,

and piriform and entorhinal cortex in four sections per rat (−2.4 mm, −3.36 mm, -4.68

mm, and −5.64 mm relative to bregma according to Paxinos and Watson, 2007).

Averaged scores from these sections of both hemispheres in each rat were used for

calculation of group data. Second, the amount of polymorph neurons in the dentate

hilus was quantified as described earlier (Polascheck et al., 2010) using AxioVision

software (Zeiss). The dentate hilus was defined as the inner border of the granule cell

layer and two straight lines connecting the tips of the granule cell layer and the proximal

end of the CA3c region. Only cells of neuronal morphology and a diameter larger than

8 μm were counted. Per rat, three sections (at −2.4 mm, −3.36 mm, and −4.68 mm

relative to bregma) were analyzed and number of neurons were averaged from these

sections.


Statistical analyses were performed using Prism 7 software (GraphPad Software, La

Jolla, CA, USA). Depending on whether data were normally distributed or not, either

parametric or non-parametric tests were used for statistical evaluation. All rank or

score data were analyzed by non-parametric tests. MRI data and data resulting from

quantitative histological analysis were analyzed by one-way analysis of variance

(ANOVA), followed by Dunnett’s multiple-comparison test comparing baseline to each

time point after SE. Non-parametric data resulting from semi-quantitative analysis of

immunohistochemical staining were analyzed by Kruskal–Wallis ANOVA, followed by

Dunn’s post-hoc test comparing the control group with the SE groups at each time

point. All tests were used two-sided. If not stated otherwise, values of p < 0.05 were

considered statistically significant.

5 Manuskripte

100

Results

In vivo spatiotemporal pattern of blood-brain barrier leakage during early

epileptogenesis

To determine the time course of BBB impairment during epileptogenesis, rats were

scanned prior to and at 5 h, 48 h, 4 days, and 10 days post SE using recently published

contrast-enhanced T1-weighted as well as T2-weighted MRI sequences (Breuer et al.,

2016). Gd-DTPA extravasation, resulting in elevated T1 values and indicating BBB

leakage, was absent at baseline and at 5 h post SE in all investigated brain regions

(Fig. 1 A, B). Strongly increased T1 values vs. baseline were present 48 h post SE in

epileptogenesis-associated brain regions (p < 0.0001 for all brain regions), but not in

the cerebellum (Fig. 1 B). The maximal signal increase occurred in the amygdala with

a T1 intensity increase of 221%. At 4 and 10 days post SE, a much lower but still

significant Gd-DTPA leakage was only detected in the amygdala (day 4, p = 0.040),

piriform (day 4, p = 0.016, day 10, p = 0.0036) and entorhinal (day 10, p = 0.030)

cortex, proposing a recovery of BBB integrity in the other formerly affected brain

regions (Fig. 1 B). Elevated T2 values, indicative of brain edema, were present at 48 h

post SE in all investigated brain regions including cerebellum (p < 0.045 for all brain

regions) with the highest T2 value increase of 23% in the amygdala (Fig. 1 C, D). At 4

days post SE, T2 values were still increased in hippocampus (p = 0.035), thalamus (p

= 0.011), and entorhinal cortex (p = 0.021). Subsequently, edema further decreased

and no significantly changed T2 values were present at 10 days following SE (Fig. 1D).

Extent and spatiotemporal pattern of FITC-albumin extravasation following status

epilepticus evaluated by histological analyses

Histological analysis of DAB-converted FITC-albumin signals revealed distinct

extravasation in thalamic areas, amygdala, piriform and entorhinal cortices (Fig. 2A).

Quantification of stained area showed significantly elevated extravasation in thalamus

at 24 (p = 0.0017) and 48 h post SE (p = 0.0028), whereas in amygdala and

piriform/entorhinal cortex, significantly increased values were found at all investigated

time points (5 h, p = 0.038, 24 h, p = 0.0001, 48 h, p = 0.013; Fig. 2B). The

hippocampus was moderately affected only in individual animals, but signal

5 Manuskripte

101

quantification did not reach statistical significance on group level (data not shown).

Comparison of ex vivo extravasation pattern (Fig. 2A) with in vivo contrast-enhanced

MRI leakage map revealed a very comparable spatial distribution of albumin 48 h post

SE (Fig. 2C). Intra- and extracellular distribution of extravasated FITC-albumin differed

between individuals (Fig. 2D), but semiquantitative histological group analysis of native

FITC-albumin signal revealed extracellular FITC-albumin in thalamus (p = 0.025),

amygdala (p = 0.0019), piriform cortex (p = 0.034), entorhinal cortex (p = 0.014), and

caudate putamen (p = 0.0063) already at 5 h following SE (Fig. 2E). At 24 h post SE,

extracellular FITC-albumin reached its maximum in all analyzed brain regions (p ≤

0.0011), and declined again at 48 h post SE (Fig. 2E). At 5 h following SE, intracellular

FITC-albumin was observed only in amygdala (p = 0.0015) and entorhinal cortex (p =

0.045), whereas it was found in all analyzed brain regions (p ≤ 0.022) at 24 h following

SE (Fig. 2F). At 48 h following SE, it still reached significance in hippocampus (p =

0.0048), thalamus (p = 0.0017), and piriform cortex (p = 0.0006; Fig. 2F). In brain slices

of control rats, neither extra- nor intracellular FITC-albumin was observed.

Furthermore, we did not observe FITC-albumin leakage in pilocarpine-treated rats

without SE development (data not shown).

Time course and extent of neurodegeneration following status epilepticus

Semi-quantitative analysis of neurodegeneration in hippocampal and cortical

subregions as well as amygdala revealed neuronal loss already at 24 h following SE

in the amygdala (24 h, p = 0.018, 48 h, p = 0.0018) and the piriform and entorhinal

cortices (24 h, p = 0.0097; Fig. 2H). At 48 h after SE, also hippocampal pyramidal cells

of CA3c subregion reached statistical significance (p = 0.017; Fig. 2H). Moreover, the

number of hilar mossy cells and interneurons as assessed by cell counting was

significantly reduced at 48 h following SE (p = 0.026; Fig. 2G).

Colocalization of FITC-albumin with cellular or extracellular cerebral markers

Randomly selected sections from rats 24 h and 48 h after SE were applied to multiple

fluorescence labeling. FITC-albumin, counterstained with biotinylated anti-NeuN (Fig.

3A’), displayed only minor colocalization (Fig. 3A’’’), despite intracellular location of

5 Manuskripte

102

FITC-albumin in cells of obvious neuronal morphology (Figure 3A), exemplarily shown

for pyramidal cell layer of hippocampal CA1 region. In contrast to NeuN-positive

neurons, FITC-albumin-positive cells of neuronal morphology exhibited only limited

spatial overlap with endothelial basement membranes visualized by laminin

immunolabeling (Figure 3A’’). It was described before that neurons can lose NeuN

immunoreactivity despite preservation of nuclear membrane integrity after an ischemic

brain insult (Ünal-Cevik et al., 2004). Ünal-Cevik and colleagues suggest that this loss

of NeuN antigenicity might be caused by severe insult-induced metabolic perturbations

of neurons, or by depletion or alteration of the antigen. Therefore, the colocalization of

FITC-albumin with NeuN-negative cells of neuronal morphology, as described here,

indicates FITC-albumin uptake by damaged, but morphologically integer neurons. This

assumption is supported by findings from another group who found extravasated

albumin-bound Evans Blue after SE often in Fluoro-Jade B-positive, i.e. dying, neurons

(van Vliet et al., 2007).

Spatial relationships between FITC-albumin and vascular markers with GFAP-

expressing astroglia are shown in the hippocampal pyramidal cell layer at lower

magnification (Fig. 4A-A’’’) and higher magnified (Fig. 4B-B’’’). FITC-albumin was again

predominantly found in pyramidal cells, and to a lower extent in close vicinity to laminin-

positive vascular structures (Fig. 4A), which becomes more obvious in the merged

staining patterns (arrow in Fig. 4A’’’). In parallel, GFAP-immunopositive structures (Fig.

4A’’,B’’) appeared separated in the overlays of staining patterns, but with astrocytic

endfeet contacting endothelial cells stained with biotinylated STL (arrow in Fig. 4B’’’).

Thalamic FITC-albumin apparently within cells (Fig. 5A) was additionally

counterstained with anti-collagen IV in basal membranes (Fig. 5A’) and biotinylated

STL detecting endothelial cells (Fig. 5A’’). The even distribution of STL-stained vessels

contrasted with the local upregulation of collagen IV expression. The overlay of staining

patterns (Fig. 5A’’’) revealed that FITC-albumin-positive areas concomitantly displayed

up-regulated vascular collagen IV-immunoreactivity which was frequently allocated

with STL-binding sites also in thinned vessels.

Next, FITC-albumin and STL staining were combined with the immunolabeling of

aquaporin-4 known as marker for astrocytic endfeet. This triple staining is exemplarily

5 Manuskripte

103

shown in the thalamus at lower magnification (Fig. 6A-A’’’) and higher magnified (Fig.

6B-B’’’). SE-affected regions as indicated by intracellular FITC-albumin (Fig. 6A,B)

were largely devoid of immunosignals for AQP4 (asterisks in Fig. 6A’,B’) whereas

adjacent tissue within the affected areas displayed much higher levels of vessel-

associated AQP4. In parallel, STL staining in the affected regions was either

diminished (Fig. 6A’’, arrow) or appeared unaltered (Fig. 6B’’,B’’’).

To analyze the spatial relationships between astroglial markers as well as between

astrocytes and FITC-albumin deposition, the immunolabeling of AQP4 was combined

with the detection of GFAP (Fig. 7A-A’’’) or S100β (Fig. 7B-B’’’) in SE-affected thalamic

tissue containing FITC-albumin-filled cells. FITC-albumin (Fig. 7A) was observed in

regions lacking apparent AQP4-immunoreactivity (Fig. 7A’) and with weakened GFAP-

immunodecoration (Fig. 7A’’). Merged staining patterns (Fig. 7A’’’) indicated a nearly

complementary occurrence of FITC-albumin and AQP4 expression together with

remnants of mostly punctate GFAP immunoreactive structures. Subsequently, FITC-

albumin-positive areas (Fig. 7B) were counterstained with anti-S100β (Fig. 7B’) which

predominantly reveals astroglial somata with numerous processes, whereas the

immunodetection of GFAP with Cy5 (Fig. 7B’’, color-coded in blue) visualizes astrocytic

intermediate filaments. The merged staining patterns (Fig. 7B’’’) clearly demonstrated

numerous astrocytes co-expressing both astroglia-specific markers, but lacking

allocated FITC-albumin.

For the simultaneous detection of astroglia and microglia/ macrophages, FITC-albumin

was counterstained with GFAP and Iba which is exemplified for the thalamus (Fig. 8A-

A’’’). SE-induced leakage of the BBB again led to extravasation of FITC-albumin

followed by its internalization by neuron-like cells (Fig. 8A). Numerous Iba-

immunopositive amoeboid microglial cells were seen in the same tissue (Fig. 8A’) and

were intermingled by active, proliferating astrocytes (Fig. 8A’’). The overlay of staining

patterns (Fig. 8A’’’) only rarely indicated FITC-albumin-filled glial cells (Fig. 8A’’’). Cy3-

immunodetection of Iba (Fig. 8B’) was combined with the Cy5-staining of STL-binding

sites which were found in vessels as well as in amoeboid perivascular

microglia/macrophages (Fig. 8B’’). A majority of perivascular Iba-positive activated

microglia displayed in the overlay of staining patterns (Fig. 8B’’’) both lectin- and

5 Manuskripte

104

immunohistochemical labeling. FITC-albumin was occasionally also found in Iba-

positive microglia (arrowhead).

For specifying immune cells exemplified in the thalamus 48 h after SE, Iba was

counterstained either with anti-CD45c in activated microglia (Fig. 9A-A’’’) or with anti-

CD8b in T lymphocytes (Fig. 9B-B’’’). FITC-albumin-filled cells (Fig. 9A) were observed

in a clearly delineated zone with reduced Cy3-immunolabeling of CD45c (Fig. 9A’),

while Iba-immunoreactivity (Fig. 9A’’) was found in ameboid immune cells

accumulating close to FITC-albumin-positive cells. Merged staining patterns (Fig. 9A’’’)

elucidated several cells co-expressing both microglial markers (arrow in Fig. 9A’’’). At

higher magnification, FITC-albumin (Fig. 9B) was occasionally found in immune cells

expressing CD8b (Fig. 9B’) as well as Iba (Fig. 9B’’) which is exemplified in the overlay

(Fig. 9B’’’) by the arrow-marked cell.

In brain slices of control rats, neither extra- nor intracellular FITC-albumin was

observed. Further, none of the alterations in immunosignals or abnormal staining

patterns described above were seen in slices of control rats which underwent the

identical staining procedures (not shown).

Discussion

SE and prolonged febrile seizures represent clear risk factors for developing temporal

lobe epilepsy which is strongly supported by data from human and animal studies

(French et al., 1993, Mathern et al., 1995, Scott et al., 2003, Patterson et al., 2014),

and BBB leakage is proposed to represent a crucial event contributing to

epileptogenesis (Marchi et al., 2007a, Friedman et al., 2009). Purpose of this study

was to provide comprehensive data of the spatiotemporal evolution of SE-induced BBB

leakage in vivo by translational MR imaging and ex vivo by complementary

immunohistochemical analyses characterizing the response of NVU components to

the epileptogenic brain insult. Our data provide important information for therapeutic

intervention after epileptogenic brain insults and suggest that a very prompt BBB-

stabilizing intervention will be necessary to prevent distinct albumin extravasation and

subsequent pro-epileptogenic consequences following SE. The main findings are: (i)

SE-induced BBB leakage peaks between 1 and 2 days post SE affecting main

5 Manuskripte

105

epileptogenesis-associated brain regions, and rapidly declines thereafter; (ii) increase

in T2-weighted MRI mainly follows the time course of contrast agent extravasation; (iii)

at the time of maximum BBB leakage, extravasated albumin colocalizes with the

perivascular basement membranes, neurons, and brain immune cells, but not with

astrocytes; (iv) albumin-positive areas are characterized by reduced immunoreactivity

for astroglial markers (GFAP, AQP4), as well as endothelial STL-binding sites,

whereas collagen IV, a marker of perivascular basement membranes, is elevated.

Uncovering the time course of BBB leakage is of particular relevance for timing

therapeutic intervention during epileptogenesis. Although the temporal evolution of

increased BBB permeability was lately determined for another post-SE model of

epileptogenesis (van Vliet et al., 2016), respective data for the pilocarpine model,

which is often applied to examine therapeutic intervention during epileptogenesis

(Löscher, 2012), were not available so far. Here, we applied a translational MRI-based

imaging method, which we recently identified to be the method of choice for detection

and quantification of BBB leakage (Breuer et al., 2016). After peak leakage about two

days after SE, BBB leakage clearly declined on day 4 suggesting a partial recovery of

BBB integrity in formerly affected brain regions like hippocampus and thalamus (Fig.

1).

Additionally, we evaluated T2-weighted MRI to spatiotemporally assess SE-induced

brain edema and inflammation, as T2-weighted MRI was suggested also as an

indicator of active inflammation (Michoux et al., 2015, Peixoto-Santos et al., 2017). T2-

signal increase was found to a lesser extent than T1-signal increase, but with a similar

spatiotemporal profile (Fig. 1), suggesting cerebral edema to appear predominantly

early after SE and to resolve soon thereafter. Our findings correspond to those of

previous pre-clinical studies by Roch et al. (2002), Choy et al. (2010) and Duffy et al.

(2014) who detected peaks of T2 intensity around 2 to 4 days following pilocarpine-

induced SE. Importantly, our data are also in line with clinical data on hippocampal

edema to occur within 48 h after SE in human subjects, too (Scott et al., 2002,

VanLandingham et al., 1998). In a recent study, we longitudinally assessed the time

course of microglia activation after pilocarpine-induced SE by [11C]PK11195 positron

emission tomography (Brackhan et al., 2016). We found inflammation peaking

5 Manuskripte

106

between 1 and 2 weeks post SE, i.e. distinctly later than T2-signal increase observed

in the present study, suggesting that T2-weighted MRI does not reflect microglia

activation but other aspects of post-SE neuroinflammation.

To substantiate our analysis, we performed additional histological assessment of FITC-

albumin extravasation. Importantly, extravasation pattern analyzed ex vivo was

generally congruent with in vivo MRI findings (Fig. 1 and 2). Our results corroborate

peak albumin extravasation between 24 and 48 h after SE. Whereas converting the

albumin signal into a light-microscopically visible adduct (Michalski et al., 2010)

provides quantitative values even at electron microscopic level (Krueger et al., 2015),

the score-based analysis gives similar results and allows to differentiate between

extra- and intracellular appearance of green fluorescence. Detection of intracellular

FITC-albumin at 5 h post SE demonstrates that cells of neuron-like shape are

pathologically affected at this time point to allow albumin uptake.

Histological examinations were performed to evaluate consequences of albumin

extravasation for the NVU in further detail. Areas with albumin extravasation and

uptake in neuron-like cells also showed loss of NeuN-immunoreactivity and

colocalization with the vascular basement membrane marker laminin (Fig. 3). We

interpret the loss of NeuN-immunoreactivity as being indicative for injured neurons

containing extravasated albumin (Ünal-Cevik et al., 2004). This is also in line with the

distinct neurodegeneration found on days one and two after SE in Nissl-stained

temporal lobe subregions (Fig. 2). In concordance with our data, neurons were

reported to be the only or major cell type containing albumin following acute seizures

or SE, i.e. in an affected brain (Marchi et al., 2007b, van Vliet et al., 2007). Accordingly,

neuronal uptake was frequently observed in regions of Evans Blue extravasation in the

porcine hippocampus following osmotic BBB impairment and adherent acute seizures

(Marchi et al., 2007a). Interestingly, however, in vitro exposure of naïve rat cortical

brain slices to FITC-albumin or prolonged (72 h) infusion of albumin into the lateral

ventricle of naïve mice did not result in colocalization of albumin with neurons (Ivens

et al., 2007, Weissberg et al., 2015). These conflicting findings suggest that albumin

behaves different in the seizing versus the naïve brain, and that albumin uptake into

neurons might be favored by an impaired environment. This assumption is also

5 Manuskripte

107

supported by Michalak et al. (2012) who tracked the uptake of extravasated IgG into

neurons in chronic TLE patients and rats during epileptogenesis.

Assessment of albumin colocalization with a variety of further cellular markers exposed

spatial overlap of albumin also with microglia and CD8b-positive T cells (Figs. 3-9).

Surprisingly and despite the use of three markers labeling different astrocytic

compartments, i.e. intermediate filaments (GFAP), predominantly somata (S100ß),

and endfeet (AQP4), astroglia were devoid of detectable FITC-albumin in the present

study. This is in contrast to the reported selective transport of albumin into astrocytes

in vitro in cortical brain slices or cultured astrocytes (Ivens et al., 2007, Bar-Klein et al.,

2014), but in general accordance with observations after electrically-induced SE (van

Vliet et al., 2007) and after acute seizures (Marchi et al., 2007b). Furthermore, we

report that in FITC-albumin-positive areas after SE, staining intensity of astrocytic

markers was reduced (GFAP) or lacking (AQP4), indicating a severe disturbance of

the endothelial-neuronal coupling mediated by astrocytes. Importantly, partial loss of

perivascular AQP4 was also found in hippocampi of epilepsy patients (Eid et al., 2005,

Peixoto-Santos et al., 2017). Additionally, our observations suggest that at sites of

albumin leakage components of endothelial cells (Solanum tuberosum lectin) are less

present than in areas without visible FITC-albumin. In combination with the reduced

AQP4 and increased collagen IV-immunoreactivity, these alterations point to a distinct

adaptive reorganization process of the NVU vasculature taking place within 48 h after

SE. The obvious impairment of astrocytes (reduced GFAP and AQP4) might entail

disordered or dying neurons, e.g. by reduced glutamate uptake from the extracellular

space resulting in neurotoxic concentrations, or by impaired astrocytic energy supply

for neurons, an assumption supported by in vivo PET imaging studies demonstrating

cerebral glucose hypometabolism shortly after SE (Goffin et al., 2009, Guo et al., 2009,

Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012, Zhang et al., 2015). As collagen IV is a stabilizing

constituent in the endothelial architecture of the NVU/BBB and part of the

immunological BBB (Dyrna et al., 2013), the observed increase in collagen IV-

immunoreactivity at sides of BBB leakage could represent the beginning of local repair

processes to re-establish BBB integrity. Interestingly, increased collagen IV expression

was also observed following other brain insults leading to NVU/BBB injury like

5 Manuskripte

108

experimental stroke (Hawkes et al., 2013). Moreover, colocalization of FITC-albumin

with brain immune cell markers (Iba, CD45c for activated microglia) and CD8b (for T

cells) did not reveal any obvious cellular preference, suggesting involvement of the

entire brain immune system in epileptogenesis-associated remodeling of the NVU.

In conclusion, we provide a detailed in vivo and ex vivo analysis of the spatiotemporal

course of BBB leakage and associated NVU alterations focusing on the early time

period post SE in a widely used rat model of epileptogenesis. Our data demonstrate

that BBB damage is an important triggering factor for epileptogenesis-associated

changes and arises very soon after SE. Subsequent degenerative events at the level

of the NVU, including degeneration of brain vessels, astrocytes and neurons, seem to

outweigh reconstructive processes. In conjunction with other studies we further

conclude that the seizing brain with leaky BBB seems to promote predominantly

neuronal albumin uptake, an observation requiring further investigation to define its

role in epilepsy development. Taken together, our data strongly support the necessity

of early BBB-restoring treatment, such as isoflurane (Bar-Klein et al., 2016),

glucocorticoids (Marchi et al., 2012) or levetiracetam (Itoh et al., 2016), as one

component of rational therapeutic intervention to ameliorate the development of

temporal lobe epilepsy and other detrimental sequelae of SE.

Acknowledgements:


(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Heike Breuer was

supported by a scholarship from the Studienstiftung des Deutschen Volkes. Ina Leiter

was supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are

grateful to Johannes Kacza, Jens Grosche, Bianca Mages, Christian Bergen,

Nathalie Hildebrandt, Annika Thomer, and Friederike Twele for excellent assistance.

Competing Interests:

The authors have declared that no competing interest exists.

5 Manuskripte

109

Tables

Table 1

Double fluorescence staining of FITC-albumin pre-labeled rat forebrain tissue

sections

First

primary antibodies

First

visualising

immunoreagent

s

Second

primary antibodies

Second

visualising

immunoreagents

biotinylated mouse-

anti-NeuN (1:100;

Merck Millipore,

Billerica, MA,USA)

Cy3-streptavidin

rabbit-anti-laminin (1:200;

Dakocytomation, Hamburg,

Germany)

Cy5-donkey-anti-

rabbit IgG

rabbit-anti-laminin

(1:400;

Dakocytomation)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG

guinea pig-anti-GFAP

(1:200; Synaptic Systems,

Göttingen, Germany)

Cy5-donkey-anti-

guinea pig IgG

biotinylated STL (10

µg/ml; Vector,

Burlingame, CA,

USA)

Cy3-streptavidin guinea pig-anti-GFAP

(1:200; Synaptic Systems)

Cy5-donkey-anti-

guinea pig IgG

rabbit-anti-collagen

IV (1:100; Merck

Millipore

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG

biotinylated STL (20 µg/ml;

Vector) Cy5-streptavidin

rabbit-anti-AQP4

(1:100; Alomone,

Jerusalem, Israel)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG



rabbit-anti-AQP4

(1:100; Alomone)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG



Cy5-donkey-anti-

guinea pig IgG

rabbit-anti-S100β

(1:600; Synaptic

Systems)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG



Cy5-donkey-anti-

guinea pig IgG

rabbit-anti-Iba

(1:400; Synaptic

Systems)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG


(1:200; Synaptic Systems

Cy5-donkey-anti-

guinea pig IgG

rabbit-anti-Iba

(1.200; Synaptic

Systems)

Cy3-donkey-

anti-rabbit IgG



biotinylated mouse-

anti-CD45c (1:20;

Serotec, Oxford,UK)

Cy3-streptavidin rabbit-anti-Iba (1:200;

Synaptic Systems)

Cy5-donkey-anti-

rabbit IgG

biotinylated mouse-

anti-CD8b (1:25;

Serotec)

Cy3-streptavidin rabbit-anti-Iba (1:200;

Synaptic Systems)

Cy5-donkey-anti-

rabbit IgG

5 Manuskripte

110

All fluorescent immunoreagents were obtained from Dianova (Hamburg, Germany)

and used at 20 µg/ml for 1 h. Abbreviations: NeuN neuronal nuclei; GFAP – glial

fibrillary acidic protein; STL – Solanum tuberosum agglutinin (= potato lectin); AQP4 –

aquaporin-4; Iba – ionized calcium binding adapter molecule-1.

Table 2

Summary of results gained by analysis of fluorescence staining after SE

Marker Target Colocalization with

FITC-albumin?

Altered

immunosignal in

FITC-albumin-

positive compared

to FITC-albumin-

negative areas?

NeuN Neurons Yes (but also

colocalization with

NeuN-negative cells of

neuronal morphology)

n.d.

GFAP Astroglia No Reduced

Iba1 Microglia Yes n.d.

STL Vasculature/

endothelial cells,

perivascular

microglia

No Reduced

Laminin Vascular basement

membranes of

endothelium

Yes No

Collagen IV Vascular basement

membranes of

endothelium

No Elevated

AQP4 Astroglial endfeet No Reduced

S100ß Astroglial somata No No

CD45c Activated microglia No Reduced

CD8b Subset of T cells Yes No

AQP4, aquaporin-4, GFAP, glial fibrillary acidic protein, Iba1, ionized calcium binding

adaptor molecule 1, n.d., not determined, NeuN, neuronal nuclei, STL, Solanum

tuberosum lectin

5 Manuskripte

111

Figures

Figure 1

Figure 1: Spatiotemporal course of blood-brain barrier (BBB) impairment and cerebral edema following

status epilepticus (SE) as assessed in vivo by 7T MRI. (A) Exemplary contrast-enhanced T1-weighted

coronal brain images in identical grey scale displaying region-dependent severity of blood-brain barrier

(BBB) leakage during epileptogenesis at 5 h, 48 h, 4 days and 10 days post status epilepticus (SE). (B)

Quantified T1-modified driven equilibrium Fourier transform (MDEFT) values measured after infusion of

gadolinium-diethylenetriamine pentaacetic acid (Gd-DTPA) as surrogate marker for BBB leakage prior

to (n = 13), 5 h (n = 5), 48 h (n = 5), 4 days (n = 6) and 10 days (n = 5) post SE. (C) Exemplary T2-

weighted coronal brain images displaying region-dependent severity of cerebral edema during

epileptogenesis. (D) Quantified T2 multi-slice-multi-echo (MSME) values measured prior to (n = 13), 5

h (n = 4), 48 h (n = 5), 4 days (n = 6) and 10 days (n = 5) post SE. Data in (B) and (D) are normalized

to pons and illustrated as mean ± SEM. *p < 0.05 vs. baseline (B), one-way ANOVA, Dunnett’s post-

hoc test.

5 Manuskripte

112

Figure 2

Figure 2: Histological evaluation of albumin extravasation and neurodegeneration during early

epileptogenesis. (A) Distribution of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) after its conversion into a light

5 Manuskripte

113

microscopically visible adduct with anti-FITC-HRP and nickel-enhanced DAB in a representative section

from a rat 48 h following status epilepticus (SE). The extravasation marker indicating leakage of

allocated BBB is predominantly visible in the thalamus and the piriform cortex. Scale bar = 1 mm. (B)

Quantification of DAB-positive area relative to the total section area in control rats (n = 10), and rats at

5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 16) following SE. *p<0.05 compared to control, one-way ANOVA,

Dunnett’s multiple comparison test. (C) Coronal Gd-DTPA-enhanced T1 MRI leakage map resulting

from comparison between baseline and 48 h post SE. Note the striking similarity of BBB leakage pattern

in the ex-vivo DAB-converted FITC-albumin slice (A) and in vivo contrast-enhanced MRI (C). Leakage

t-map was calculated by SPM12 software (two-sample unpaired t-test, p<0.001, and a minimum cluster

size of 100 voxels; scale bar displays t-values). (D) Exemplary whole brain sections and a higher

magnified image of the thalamus from two rats, predominantly showing extracellular distribution (left, 48

h post SE) or intracellular uptake (right, 24 h post SE) of extravasated FITC-labeled albumin. (E) Semi-

quantitative analysis of extracellular FITC-labeled albumin in control rats (n = 10), and rats at 5 h (n =

6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 14) following SE. (F) Semi-quantitative analysis of intracellular FITC-

labeled albumin in control rats (n = 10), and rats at 5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 14) following

SE. (E) and (F) show peak values of FITC-albumin presence at 24 h post SE. (G) Number of hilar

neurons in control rats (n = 6), and rats at 5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 4) following SE,

revealing neurodegeneration only at 48 h post SE. (H) Semi-quantitative analysis of neurodegeneration

in hippocampal subregions, amygdala, as well as cortical subregions in control rats (n = 6), and rats at

5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 4) following SE. *p<0.05 compared to control, (B,E,F,H) Kruskal-

Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison test. (G) One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison

test. Data are illustrated as box-and-whisker plots. CA, cornu ammonis. Co, control, Pir./entorh.,

piriform/entorhinal.

5 Manuskripte

114

Figure 3

Figure 3: Concomitant detection of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) (A) in the pyramidal layer of the

hippocampal CA1 region 48 h after SE shows predominantly intracellular FITC-Alb. Neuronal somata

are stained with biotinylated anti-NeuN and red fluorescent Cy3-streptavidin (A’), while vascular

basement membranes are visualized with rabbit-anti-laminin and Cy5-donkey anti-rabbit (A’’,

immunosignals color-coded in blue). The overlay of staining patterns (A’’’) elucidates only rare

colocalization of FITC-Alb and NeuN-positive neurons. Scale bar = 50 µm.

5 Manuskripte

115

Figure 4

5 Manuskripte

116

Figure 4: Hippocampal pyramidal cell layer in the CA1 region with FITC-labeled albumin (FITC-Alb)

(A,B) 48 h following SE and (A’) laminin-immunoreactivity (vascular basement membranes, Cy3, red) or

(B’) binding sites for biotinylated Solanum tuberosum lectin (STL; endothelial cells, Cy3, red), each

combined with immunolabeling of astroglial GFAP (A’’, B’’, Cy5, color-coded in blue) at lower

magnification (A-A’’’) and higher magnified (B-B’’’). Merged staining patterns (A’’’, B’’’) elucidate FITC-

Alb in close vicinity to laminin-immunopositive structures (arrow in A’’’), but no obvious colocalization of

FITC-Alb and GFAP-positive astrocytes (A’’’, B’’’). Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 100 µm, A’’’ =

50 µm, B’’ (also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.

5 Manuskripte

117

Figure 5

Figure 5: Simultaneous demonstration of thalamic FITC-labeled albumin (FITC-Alb) 24 h following SE

combined with the detection of the vascular marker collagen IV and binding sites for Solanum tuberosum

lectin (STL). FITC-Alb (A) is seen in neuron-like cells in SE-affected regions, mainly marked by

apparently up-regulated collagen IV (Coll IV)-immunoreactivity (A’, Cy3, red). Concomitant lectin-

histochemical staining with STL (A’’, Cy5, color-coded in blue) reveals vessels which appear thinner and

of lower STL signal in tissue with detectable FITC-Alb. Vascular structures containing both Coll IV and

STL-binding sites appear purple in (A’’’). Scale bar = 75 µm.

5 Manuskripte

118

Figure 6

5 Manuskripte

119

Figure 6: Concomitant visualization of thalamic FITC-labeled albumin (FITC-Alb) 24 h after SE with

astroglial aquaporin-4 (AQP4, astrocytic endfeet) and endothelial Solanum tuberosum lectin (STL)

binding as overview (A-A’’’) and at higher magnification (B-B’’’). FITC-Alb is seen in numerous neuron-

like cell somata (A, B). AQP4 immunolabeling (A’, B’) is largely absent in FITC-Alb-positive tissue

marked by asterisks in A’, but distinctly expressed in adjacent areas. STL staining in the same area

appears diminished (A’’, arrow). The overlay of staining patterns (A’’’, B’’’) elucidates allocated AQP4-

immunoreactive astrocytic endfeet and endothelial STL-binding sites appearing as purple vessels in

close vicinity to many FITC-Alb-filled cells. Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 200 µm, A’’’ = 100 µm,

B’’ (also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.

5 Manuskripte

120

Figure 7

5 Manuskripte

121

Figure 7: Detection of GFAP and cellular FITC-labeled albumin (FITC-Alb) in SE-affected thalamus 48

h after SE onset combined with immunolabeling of aquaporin-4 (AQP4; A-A’’’) or of S100β (B-B’’’). FITC-

Alb in (A) is seen in region devoid of Cy3-staining for AQP4 (A’) and diminished GFAP-immunosignals

(A’’). The overlay of staining patterns (A’’’) reveals a nearly complementary occurrence of FITC-Alb and

AQP4 expression, but also shows remnants of mostly punctuate GFAP-immunoreactive structures. At

higher magnification, in another thalamic area from the same animal Cy3-counterstaining of S100β (B’)

predominantly reveals astroglial somata with numerous processes, whereas the immunodetection of

GFAP with Cy5 (B’’, color-coded in blue) visualizes astrocytic intermediate filaments. The merge of

staining patterns (B’’’) clearly demonstrates numerous astrocytes co-expressing both astroglia-specific

markers, but lacking allocated FITC-Alb. Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 100 µm, A’’’ = 50 µm, B’’

(also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.

5 Manuskripte

122

Figure 8

5 Manuskripte

123

Figure 8: Demonstration of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) and Iba-immunoreactive

microglia/macrophages combined with thalamic GFAP immunolabeling 48 h after SE onset (A-A’’’) and

the detection of hippocampal Solanum tuberosum lectin (STL)-binding sites 24 h after SE onset

(endothelial cells, B-B’’’). FITC-Alb in the thalamus is predominantly visible within neuron-like cells (A).

The same region contains Iba-immunopositive ameboid microglia which is even stronger labelled in

adjacent tissue with less FITC-Alb (A’). In parallel, proliferating astrocytes are revealed by GFAP-

immunostaining (A’’). The merge of staining patterns (A’’’) allows for the identification of single FITC-

Alb-filled immune cells displaying the mixed color yellow (arrow in A’’’). Additionally, hippocampal FITC-

Alb-positive cells are allocated with Cy5-staining of STL-binding sites and Cy3-immunolabeling of Iba

(arrowhead, B’’’). Scale bars: A’’, B’’ (also valid for A, A’, B, B’) = 100 µm, A’’’, B’’’ = 50 µm.

5 Manuskripte

124

Figure 9

5 Manuskripte

125

Figure 9: Triple fluorescence labeling of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) and Iba combined with the

immunodetection either of immune cells expressing CD45c (A-A’’’) or CD8b (B-B’’’) in thalamic regions

48 h after SE. FITC-Alb-filled cells are here restricted to a clearly delineated zone (A), whereas CD45c-

immunodetection (A’) visualizing the leukocyte common antigen is stronger in tissue devoid visible FITC-

Alb and Iba (A’’), which is seen in more evenly distributed ameboid immune cells. The overlay of staining

patterns (A’’’) clearly shows several cells co-expressing both microglial markers (exemplified by arrows

in A’’’), whereas all FITC-Alb-stained cells appear mono-labeled. At higher magnification, one cell

displays not only a cytoplasmic label with FITC-Alb (B), but also a small, round compartment with a

much stronger fluorescence signal. This cell and three other cells with similar ameboid appearance are

additionally Cy3-labeled for CD8b indicating a subset of lymphoyctes, whereas Cy5-immunostaining of

Iba (B’’, color-coded in blue) is also present in apparently CD8b-immunonegative cells. The overlay of

staining patterns clearly demonstrates two cells co-expressing both immune cell markers either

containing FITC-Alb (arrow) or being devoid of FITC-Alb (arrowhead). Scale bars: A’’ (also valid for A,

A’) = 100 µm, A’’’ = 50 µm, B’’ (also valid for B, B’) = 25 µm, B’’’ = 10 µm.

5 Manuskripte

126

References

BANKSTAHL, M., BANKSTAHL, J. P. & LÖSCHER, W. 2012. Inter-individual variation in the

anticonvulsant effect of phenobarbital in the pilocarpine rat model of temporal lobe


BAR-KLEIN, G., CACHEAUX, L. P., KAMINTSKY, L., PRAGER, O., WEISSBERG, I.,

SCHOKNECHT, K., CHENG, P., KIM, S. Y., WOOD, L., HEINEMANN, U., KAUFER,

D. & FRIEDMAN, A. 2014. Losartan prevents acquired epilepsy via TGF-beta

signaling suppression. Ann Neurol, 75, 864-75.

BAR-KLEIN, G., KLEE, R., BRANDT, C., BANKSTAHL, M., BASCUNANA, P., TÖLLNER, K.,

DALIPAJ, H., BANKSTAHL, J. P., FRIEDMAN, A. & LÖSCHER, W. 2016. Isoflurane

prevents acquired epilepsy in rat models of temporal lobe epilepsy. Ann Neurol, 80,

896-908.


BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016. Serial quantitative TSPO-targeted PET

reveals peak microglial activation up to two weeks after an epileptogenic brain insult.

J Nucl Med, 57, 1302-1308.

BREUER, H., MEIER, M., SCHNEEFELD, S., HÄRTIG, W., WITTNEBEN, A., MÄRKEL, M.,

ROSS, T. L., BENGEL, F. M., BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016.

Multimodality imaging of blood-brain barrier impairment during epileptogenesis. J

Cereb Blood Flow Metab, DOI: 10.1177/0271678x16659672.

CHOY, M., CHEUNG, K. K., THOMAS, D. L., GADIAN, D. G., LYTHGOE, M. F. & SCOTT,

R. C. 2010. Quantitative MRI predicts status epilepticus-induced hippocampal injury

in the lithium-pilocarpine rat model. Epilepsy Res, 88, 221-30.

DUFFY, B. A., CHUN, K. P., MA, D., LYTHGOE, M. F. & SCOTT, R. C. 2014.

Dexamethasone exacerbates cerebral edema and brain injury following lithium-

pilocarpine induced status epilepticus. Neurobiol Dis, 63, 229-36.

DYRNA, F., HANSKE, S., KRUEGER, M. & BECHMANN, I. 2013. The blood-brain barrier. J

Neuroimmune Pharmacol, 8, 763-73.

EID, T., LEE, T. S., THOMAS, M. J., AMIRY-MOGHADDAM, M., BJORNSEN, L. P.,

SPENCER, D. D., AGRE, P., OTTERSEN, O. P. & DE LANEROLLE, N. C. 2005.

Loss of perivascular aquaporin 4 may underlie deficient water and K+ homeostasis in

the human epileptogenic hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 1193-8.

5 Manuskripte

127

FRENCH, J. A., WILLIAMSON, P. D., THADANI, V. M., DARCEY, T. M., MATTSON, R. H.,

SPENCER, S. S. & SPENCER, D. D. 1993. Characteristics of medial temporal lobe

epilepsy: I. Results of history and physical examination. Ann Neurol, 34, 774-80.

FRIEDMAN, A. & HEINEMANN, U. 2012. Role of Blood-Brain Barrier Dysfunction in

Epileptogenesis. In: NOEBELS, J. L., AVOLI, M., ROGAWSKI, M. A., OLSEN, R. W.

& DELGADO-ESCUETA, A. V. (eds.) Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies.

Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US)

Michael A Rogawski, Antonio V Delgado-Escueta, Jeffrey L Noebels, Massimo Avoli and

Richard W Olsen.

FRIEDMAN, A., KAUFER, D. & HEINEMANN, U. 2009. Blood-brain barrier breakdown-

inducing astrocytic transformation: novel targets for the prevention of epilepsy.

Epilepsy Res, 85, 142-9.








HAWKES, C. A., MICHALSKI, D., ANDERS, R., NISSEL, S., GROSCHE, J., BECHMANN, I.,

CARARE, R. O. & HARTIG, W. 2013. Stroke-induced opposite and age-dependent

changes of vessel-associated markers in co-morbid transgenic mice with Alzheimer-

like alterations. Exp Neurol, 250, 270-81.

ITOH, K., ISHIHARA, Y., KOMORI, R., NOCHI, H., TANIGUCHI, R., CHIBA, Y., UENO, M.,

TAKATA-TSUJI, F., DOHGU, S. & KATAOKA, Y. 2016. Levetiracetam treatment

influences blood-brain barrier failure associated with angiogenesis and inflammatory

responses in the acute phase of epileptogenesis in post-status epilepticus mice. Brain

Res, 1652, 1-13.

IVENS, S., KAUFER, D., FLORES, L. P., BECHMANN, I., ZUMSTEG, D., TOMKINS, O.,

SEIFFERT, E., HEINEMANN, U. & FRIEDMAN, A. 2007. TGF-beta receptor-

mediated albumin uptake into astrocytes is involved in neocortical epileptogenesis.

Brain, 130, 535-47.

JANIGRO, D. 2012. Are you in or out? Leukocyte, ion, and neurotransmitter permeability

across the epileptic blood-brain barrier. Epilepsia, 53 Suppl 1, 26-34.

5 Manuskripte

128




KRUEGER, M., BECHMANN, I., IMMIG, K., REICHENBACH, A., HÄRTIG, W. &

MICHALSKI, D. 2015. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of

vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. J Cereb

Blood Flow Metab, 35, 292-303.





LÖSCHER, W. 2012. Strategies for antiepileptogenesis: Antiepileptic drugs versus novel

approaches evaluated in post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. In:

NOEBELS, J. L., AVOLI, M., ROGAWSKI, M. A., OLSEN, R. W. & DELGADO-

ESCUETA, A. V. (eds.) Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. Bethesda MD:

Michael A Rogawski, Antonio V Delgado-Escueta, Jeffrey L Noebels, Massimo Avoli

and Richard W Olsen.

MARCHI, N., ANGELOV, L., MASARYK, T., FAZIO, V., GRANATA, T., HERNANDEZ, N.,

HALLENE, K., DIGLAW, T., FRANIC, L., NAJM, I. & JANIGRO, D. 2007a. Seizure-

promoting effect of blood-brain barrier disruption. Epilepsia, 48, 732-42.

MARCHI, N., GRANATA, T., GHOSH, C. & JANIGRO, D. 2012. Blood-brain barrier

dysfunction and epilepsy: pathophysiologic role and therapeutic approaches.

Epilepsia, 53, 1877-86.

MARCHI, N., OBY, E., BATRA, A., UVA, L., DE CURTIS, M., HERNANDEZ, N., VAN

BOXEL-DEZAIRE, A., NAJM, I. & JANIGRO, D. 2007b. In vivo and in vitro effects of

pilocarpine: relevance to ictogenesis. Epilepsia, 48, 1934-46.

MARCON, J., GAGLIARDI, B., BALOSSO, S., MAROSO, M., NOE, F., MORIN, M.,

LERNER-NATOLI, M., VEZZANI, A. & RAVIZZA, T. 2009. Age-dependent vascular

changes induced by status epilepticus in rat forebrain: implications for

epileptogenesis. Neurobiol Dis, 34, 121-32.

MATHERN, G. W., PRETORIUS, J. K. & BABB, T. L. 1995. Influence of the type of initial

precipitating injury and at what age it occurs on course and outcome in patients with

temporal lobe seizures. J Neurosurg, 82, 220-7.

5 Manuskripte

129

MICHALAK, Z., LEBRUN, A., DI MICELI, M., ROUSSET, M. C., CRESPEL, A., COUBES, P.,

HENSHALL, D. C., LERNER-NATOLI, M. & RIGAU, V. 2012. IgG leakage may

contribute to neuronal dysfunction in drug-refractory epilepsies with blood-brain

barrier disruption. J Neuropathol Exp Neurol, 71, 826-38.

MICHALAK, Z., SANO, T., ENGEL, T., MILLER-DELANEY, S. F., LERNER-NATOLI, M. &

HENSHALL, D. C. 2013. Spatio-temporally restricted blood-brain barrier disruption

after intra-amygdala kainic acid-induced status epilepticus in mice. Epilepsy Res,

103, 167-79.

MICHALSKI, D., GROSCHE, J., PELZ, J., SCHNEIDER, D., WEISE, C., BAUER, U.,

KACZA, J., GARTNER, U., HOBOHM, C. & HARTIG, W. 2010. A novel quantification

of blood-brain barrier damage and histochemical typing after embolic stroke in rats.

Brain Res, 1359, 186-200.

MICHOUX, N., GUILLET, A., ROMMEL, D., MAZZAMUTO, G., SINDIC, C. & DUPREZ, T.

2015. Texture Analysis of T2-Weighted MR Images to Assess Acute Inflammation in

Brain MS Lesions. PLoS One, 10, e0145497.

PATTERSON, K. P., BARAM, T. Z. & SHINNAR, S. 2014. Origins of temporal lobe epilepsy:

febrile seizures and febrile status epilepticus. Neurotherapeutics, 11, 242-50.

PAXINOS, G. & WATSON, C. 2007. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Elsevier.

PEIXOTO-SANTOS, J. E., KANDRATAVICIUS, L., VELASCO, T. R., ASSIRATI, J. A.,

CARLOTTI, C. G., SCANDIUZZI, R. C., SALMON, C. E., SANTOS, A. C. & LEITE, J.

P. 2017. Individual hippocampal subfield assessment indicates that matrix

macromolecules and gliosis are key elements for the increased T2 relaxation time

seen in temporal lobe epilepsy. Epilepsia, 58, 149-159.

PITKÄNEN, A. & IMMONEN, R. 2014. Epilepsy related to traumatic brain injury.

Neurotherapeutics, 11, 286-96.

PITKÄNEN, A., LÖSCHER, W., VEZZANI, A., BECKER, A. J., SIMONATO, M., LUKASIUK,

K., GROHN, O., BANKSTAHL, J. P., FRIEDMAN, A., ARONICA, E., GORTER, J. A.,

RAVIZZA, T., SISODIYA, S. M., KOKAIA, M. & BECK, H. 2016. Advances in the

development of biomarkers for epilepsy. Lancet Neurol, 15, 843-56.

POLASCHECK, N., BANKSTAHL, M. & LÖSCHER, W. 2010. The COX-2 inhibitor parecoxib

is neuroprotective but not antiepileptogenic in the pilocarpine model of temporal lobe


5 Manuskripte

130

ROCH, C., LEROY, C., NEHLIG, A. & NAMER, I. J. 2002. Magnetic resonance imaging in

the study of the lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in adult rats.

Epilepsia, 43, 325-35.

SCHMIDT, D. & SILLANPÄÄ, M. 2016. Prevention of Epilepsy: Issues and Innovations. Curr

Neurol Neurosci Rep, 16, 95.

SCHWARZ, A. J., DANCKAERT, A., REESE, T., GOZZI, A., PAXINOS, G., WATSON, C.,

MERLO-PICH, E. V. & BIFONE, A. 2006. A stereotaxic MRI template set for the rat

brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas:

application to pharmacological MRI. Neuroimage, 32, 538-50.

SCOTT, R. C., GADIAN, D. G., KING, M. D., CHONG, W. K., COX, T. C., NEVILLE, B. G. &

CONNELLY, A. 2002. Magnetic resonance imaging findings within 5 days of status

epilepticus in childhood. Brain, 125, 1951-9.

SCOTT, R. C., KING, M. D., GADIAN, D. G., NEVILLE, B. G. & CONNELLY, A. 2003.

Hippocampal abnormalities after prolonged febrile convulsion: a longitudinal MRI

study. Brain, 126, 2551-7.

SEIFFERT, E., DREIER, J. P., IVENS, S., BECHMANN, I., TOMKINS, O., HEINEMANN, U.

& FRIEDMAN, A. 2004. Lasting blood-brain barrier disruption induces epileptic focus

in the rat somatosensory cortex. J Neurosci, 24, 7829-36.

ÜNAL-CEVIK, I., KILINC, M., GURSOY-OZDEMIR, Y., GURER, G. & DALKARA, T. 2004.

Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal

cell loss: a cautionary note. Brain Res, 1015, 169-74.

VAN VLIET, E. A., DA COSTA ARAUJO, S., REDEKER, S., VAN SCHAIK, R., ARONICA, E.

& GORTER, J. A. 2007. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of

temporal lobe epilepsy. Brain, 130, 521-34.

VAN VLIET, E. A., OTTE, W. M., WADMAN, W. J., ARONICA, E., KOOIJ, G., DE VRIES, H.

E., DIJKHUIZEN, R. M. & GORTER, J. A. 2016. Blood-brain barrier leakage after

status epilepticus in rapamycin-treated rats I: Magnetic resonance imaging. Epilepsia,

57, 59-69.

VANLANDINGHAM, K. E., HEINZ, E. R., CAVAZOS, J. E. & LEWIS, D. V. 1998. Magnetic

resonance imaging evidence of hippocampal injury after prolonged focal febrile

convulsions. Ann Neurol, 43, 413-26.

WALKER, L. E., JANIGRO, D., HEINEMANN, U., RIIKONEN, R., BERNARD, C. & PATEL,

M. 2016. WONOEP appraisal: Molecular and cellular biomarkers for epilepsy.

Epilepsia, 57, 1354-62.

5 Manuskripte

131










5 Manuskripte

132

5.3 Pronounced and long-term disease-modifying effects of transient ketogenic

diet in the intrahippocampal kainate mouse model of epileptogenesis: a

longitudinal theranostic study

Ina Leiter1,2, Pablo Bascuñana2, Jens Peter Bankstahl2#, Marion Bankstahl1#*



Hannover, Germany


Germany






Key words (3-6): cerebral energy metabolism, neuroinflammation, PET imaging,

epilepsy

Abstract

Rationale: Alterations in cerebral glucometabolism during insult-mediated

epileptogenesis represent a potential treatment target for prophylactic intervention.

The ketogenic diet (KD) has shown disease-modifying potential in animal models of

epileptogenesis before, and the underlying mechanism of action being not fully

understood to date might partially be based on KD’s interference with cerebral energy

metabolism. This study was designed to meet the following aims: 1. To evaluate the

short- and long-term effects of a transient KD on brain glucose metabolism, microglial

activation and GABAA receptor density during epileptogenesis and the chronic disease

5 Manuskripte

133

phase by translational nuclear imaging. 2. To evaluate the long-term impact of transient

KD on seizure outcome and behavior.

Methods: Male NMRI mice were used for induction of status epilepticus (SE) by

intrahippocampal kainate injection. A group of eleven animals received a KD for four

weeks starting directly after surgery (SE+KD group). A second SE group (SE+SD

group) of ten mice as well as a third, sham-operated mouse group (sham control, n=10)

received a standard diet (SD). Positron emission tomography (PET) was performed

with [18F]GE-180 (microglial activation) at days 7 and 14 post surgery as well as with

[18F]fludeoxyglucose ([18F]FDG; glucose metabolism) and [18F]flumazenil (GABAA

receptor density) at 4 and 9-10 weeks after surgery. For analysis of [18F]FDG PET

data, a pharmacokinetic modeling was applied. A modified Irwin screen was performed

at baseline, the day prior to each PET scan and after three months. Electrodes were

implanted eleven weeks post SE for seizure monitoring with video-combined

electroencephalography. Mice were finally tested in the 13th week post SE concerning

activity and exploration in an open field test.

Results: KD feeding after SE induction resulted in increased blood ß-hydroxybutyrate

levels and faster weight gain compared to SD feeding. Focal inflammation (TSPO

expression) was observed in terms of an elevated [18F]GE-180 uptake in the dorsal

ipsilateral hippocampus on day seven in the SE+KD group and on day 14 in the SE+SD

group compared to baseline or sham controls. [18F]FDG uptake was decreased at

week four in sham controls and SE+SD mice, but not in mice fed with KD. Six weeks

later, i.e. after discontinuation of KD, global hypometabolism was seen in all groups.

Glucose metabolic rate MRGlu time course revealed a decreased glucose turnover in

the SE+SD group and sham controls both at 4 and 10 weeks, while MRGlu values in

the SE+KD group did not differ from baseline values at any time point. Glucose influx

rate constant Ki was not affected by KD. The binding potential BPnd calculated from the

[18F]Flumazenil PET data did not differ between SE+KD and SE+SD mice. At 2 weeks

post SE, the Irwin screen revealed an increased summation score in the SE+SD group,

while the SE+KD group did not differ from baseline and sham control values. The open

field test in week 13 did not uncover any differences among the groups. The number

of mice developing seizure-like events was significantly lower in the SE+KD group.

5 Manuskripte

134

Further, KD-fed mice showed significantly less and shorter seizure-like events than

SD-fed mice.

Conclusion: This study revealed short- and long-term disease-modifying effects of an

intermittent KD on epileptogenesis. PET imaging allows therapeutic monitoring of KD

effects and demonstrates that both microglial activation and cerebral glucose

metabolism are positively affected by KD.

Introduction

Chronic epilepsy in human patients but also in rodent epilepsy models is associated

with cerebral glucose hypometabolism (Theodore et al., 2004, Zhang et al., 2015). As

cerebral energy metabolism is also subject to alterations during epileptogenesis (Goffin

et al., 2009, Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012), it might represent a target for

therapeutic intervention following epileptogenic brain insults. The ketogenic diet (KD)

represents a long-established alternative or add-on treatment to anti-seizure drugs with

effectiveness also in pharmacoresistant epilepsy patients (Felton and Cervenka, 2015,

Coppola et al., 2002). Consisting of high-fat, low-protein and low-carbohydrate

nutrition, it induces ketosis. KD has been shown to be associated with increased brain

uptake of both glucose and ketone bodies using positron emission tomography (PET)

with the radiolabeled glucose analogon [18F]fluorodeoxyglucose [18F]FDG (Roy et al.,

2012, Pifferi et al., 2011). Besides its successful application in children (Lambrechts et

al., 2017), the therapeutic value of KD (and related diets) has recently also been

demonstrated for adult epilepsy patients (Ye et al., 2015, Cervenka et al., 2016, Klein

et al., 2010). Furthermore, KD is efficient in diverse types of epilepsy (Stenger et al.,

2017, Felton and Cervenka, 2015, Zhang et al., 2016). Preclinically, KD has shown

anticonvulsive effects in different rodent models of acute seizures (Samala et al., 2008,

Bough et al., 2002, Hori et al., 1997). Importantly, besides the acute anticonvulsive

activity, findings in rodent models of epileptogenesis, i.e. kindling and post statues

epilepticus (SE) models, also suggest a potential disease-modifying or even anti-

epileptogenic effect of KD (Jiang et al., 2012, Hansen et al., 2009, Muller-Schwarze et

al., 1999, Dustin and Stafstrom, 2016, Lusardi et al., 2015). This idea is supported by

data from a patient study with 150 children showing that a KD can have long-lasting

5 Manuskripte

135

positive effects on seizure outcome even after discontinuation of the diet (Marsh et al.,

2006).

The present study aimed at assessing potential long-term anti-epileptogenic effects of

transient KD in the intrahippocampal mouse model of epileptogenesis. Translational

non-invasive PET imaging of cerebral glucometabolism, neuroinflammation and

GABAA receptor density was performed for monitoring of therapeutic response and for

getting further insight into the mechanisms of action of KD.

Materials and methods

Animals

Male NMRI mice (Charles River, Germany) were used. They were purchased at an

age of seven weeks and allowed to adapt to the laboratory for at least one week.

Animals were housed in groups of up to nine animals in individually ventilated cages

(Allentown, Neuss, Germany), under controlled room conditions: 20 – 22°C, air

humidity of 40-70%, 14 h light phase (7 am to 9 pm) and 10 h dark phase. Autoclaved

water and a standard rodent diet (Altromin, Lage, Germany) was offered ad libitum to

all animals before start of experiments, as well as an appropriate amount of autoclaved

bedding and nesting material. The study was carried out according to EU directive

86/609/EWG and the German animal welfare act (Tierschutzgesetz), with the

permission of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety

(LAVES).

Diet

The ketogenic diet (KD) was purchased from Harlan Laboratories GmbH (TD.96355,

Venray, Netherlands). The ratio of fat to protein and carbohydrates was 4.25 (6.7

kcal/g, 9.1% kcal from protein, 0.4% kcal from carbohydrate, 90.5% kcal from fat). The

formula consisted of: hydrogenated vegetable shortening (586.4 g/kg), casein (173.3

g/kg), cellulose (87.97 g/kg), corn oil (86.2 g/kg), mineral mix (Ca-P deficient, 79055,

20 g/kg), dibasic calcium phosphate (19.3 g/kg), vitamin mix (40060, 13 g/kg), calcium

carbonate (8.2 g/kg), DL-methionine (2.6 g/kg), choline bitartrate (2.5 g/kg),

magnesium oxide (0.4 g/kg), antioxidant TBHQ (0.13 g/kg). Formed to small portions

5 Manuskripte

136

of cylindrical shape by hand, KD was offered to the animals every day freshly prepared

and ad libitum in the usual feeder and weighed to calculate the averaged daily feed

intake. The control diet was the standard rodent diet (SD) described above, also fed at

libitum.

Kainate microinjection and electrode implantation

The surgery for status epilepticus (SE) induction resembles the first description of this

model (Suzuki et al., 1995). Mice were anesthetized with a bolus injection of chloral

hydrate (500 mg/kg i. p., dissolved in 10 ml sterile saline), with re-injections of 0.05 ml

of the chloral hydrate solution for maintaining anaesthesia. The injection site for the

kainate in the right dorsal hippocampus (CA1 region) was determined using a

stereotactic frame (coordinates from Bregma: anterior-posterior: -2.1, latero-lateral: -

1.6, dorso-ventral: -2.3). A volume of 0.05 µl kainate solution was injected (20 mM, 10

mg kainate (Sigma Aldrich, Germany) dissolved in 2345 µl sterile saline) with a 0.5 µl

syringe (VWR International, Hannover, Germany). After the surgery, mice received one

injection of 0.5 ml electrolyte solution with five percent glucose subcutaneously and

another of 10 ml/kg intraperitoneally. Until complete recovery from surgery, smashed

food pellets were provided and subcutaneous saline injections were repeated if

necessary.

Electrode implantation was performed eleven weeks later to avoid imaging artefacts,

with the same coordinates under isoflurane anaesthesia. Two screws were inserted in

each os frontale for the fixation of the electrode with dental cement (Paladur®, Heraeus

Kulzer GmbH, Hanau, Germany), one further screw in the os parietale sinistrum served

as grounding for the bipolar electrode.

Animal groups, treatment and study design

Three groups of mice underwent surgery: eleven mice (SE+KD) were fed KD for four

weeks directly starting after SE induction (KD), ten mice (SE+SD) were fed standard

diet (SD) after kainate injection and ten mice were sham-operated (saline instead of

kainate injection) and fed a SD (Sham). The study was designed as follows (for an

overview, see figure 1): Directly after stereotaxic surgery in order to induce SE or mimic

5 Manuskripte

137

the microinjection, mice were fed according to the different diet groups (after four

weeks, the KD group received SD again). PET scans were performed at seven and 14

days to image brain translocator protein 18 kDa (TSPO) ([18F]GE-180), in weeks four

and nine to ten in order to evaluate brain glucose metabolism ([18F]FDG) and in weeks

four and ten to analyse central benzodiazepine receptor density ([18F]Flumazenil), as

detailed later. On the day before surgery, before each PET scan timepoint and finally

after 12 to 13 weeks before killing the animals, a modified Irwin Screen was performed

(Irwin, 1968) as described later. In the eleventh week, electrodes were implanted in a

second stereotaxic surgery for EEG and video monitoring (see below), which started

about three days later. Beta-hydroxybutyrate concentrations in blood were measured

before surgery, directly before each PET scan and before killing the animals using

whole blood and commercial test strips (GlucoMen® LX ß ketone sensors, A. Menarini

Diagnostics, Firenze, Italy).

Before the experiments started, we first evaluated the influence of a chronic KD on

brain glucose metabolism in a group of ten healthy mice. These mice received KD for

72 days. [18F]FDG PET scans were performed at baseline, 10 days, 17 days, 25 days,

35 days and 49 days of feeding the diet. Blood ß-hydroxybutyrate concentrations were

measured in naive control mice of the same age (n=7) and in the KD mice at days 35

and 54.

Image acquisition

For imaging brain translocator protein 18 kDa (TSPO) ([18F]GE-180), glucose

metabolism ([18F]FDG) and central benzodiazepine receptor density ([18F]Flumazenil),

a small animal PET-CT scanner (Inveon DPET, Siemens, Knoxville, TN, USA) was

used. Isoflurane anaesthesia was induced with three percent isoflurane in three litres

oxygen per minute. Subsequently, the isoflurane concentration was adjusted

individually to maintain a respiration frequency of about 60 – 80 /min (monitored

continuously). Directly before catheterization (self-made catheters out of 27 G

cannulas and a medical micro volume tube (Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,

Germany, Tygon S-54-JL, no. 9.205 504)) of the lateral tail for later tracer application,

a drop of blood was taken preferably from the vena saphena to measure blood glucose

5 Manuskripte

138

levels (Contour XT meter, Bayer Consumer Care, Basel, Switzerland). Mice were

scanned side-by-side in a double mouse scan bed (Minerve, Esternay, France) being

warmed to 37°C. Mouse brains were at the centre field of view. Tracers were injected

simultaneously with the start of the 60 minutes dynamic acquisitions. The mean

injected radioactivity per mouse was 11.08 ± 3.450 MBq (mean ± SD) [18F]GE-180,

10.17 ± 2.224 MBq (mean ± SD) [18F]FDG, or 12.61 ± 1.128 MBq (mean ± SD)

[18F]Flumazenil. For histogrammation of the acquired list mode data, 32 frames were

chosen. The image reconstruction to a 128 x 128 x 159 matrix (0.78 x 0.78 x 0.8 mm3)

was done with a three-dimensional ordered subset expectation maximization (3D-

OSEM) / maximum a posteriori (MAP) algorithm (β = 1, OSEM iterations = 2, MAP

iterations = 18) with scanner-applied scatter correction. Attenuation was corrected

using a 57Co transmission scan. A CT acquisition followed each PET scan. In the case

of [18F]FDG scans, blood glucose levels were measured again afterwards, with blood

taken from the tail vein after the catheter removal. Finally, the animals were allowed to

awake again.

Image data processing and kinetic modelling

For image data processing, PMOD 3.6 software (PMOD Technologies, Zurich,

Switzerland) was used. After co-registration of each CT image to the standard T2-

weighed mouse MRI atlas of PMOD 3.6 (Ma et al., 2005), the step was repeated with

its corresponding PET image. Then, the transformation ensured the accurate overlap

of MRI atlas and PET image.

[18F]FDG: The Mirrione mouse atlas provided by PMOD (Mirrione et al., 2007) and a

region of interest covering the whole brain was applied for semi-quantitative analysis

of [18F]FDG uptake. Calculation of the standardized uptake values (percent injected

dose per cubic centimetre) took account of the last three frames (i.e. the last thirty

minutes of the acquisition). The FDG 2-compartment model in PMOD was chosen for

kinetic modelling. The required image-derived input function (IDIF) was calculated

using a region of interest (2 x 2 x 4 mm3) positioned in the early image frames of the

vena cava caudalis (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). The lumped constant LC

5 Manuskripte

139

was set 0.67 (Thorn et al., 2013). The averaged values of the two blood glucose

measurements per scan timepoint were entered into the modelling process.

[18F]GE-180: The [18F]GE-180 uptake in each brain region was calculated as described

above for the [18F]FDG uptake.

[18F]Flumazenil: Here was the simplified reference tissue model of PMOD 3.6 used,

based on the descriptions of Lammertsma and Hume (Lammertsma and Hume, 1996)

and Gunn et al. (Gunn et al., 1997), with the brain stem as reference region to

determine the estimated binding potential BPnd.

Irwin screen

This test was a modified version of the comprehensive observational assessment

originally described by Irwin et al. (Irwin, 1968) and adapted by Klee et al. (Klee et al.,

2015). The experiments were timed always in the morning at the same time. Each

mouse was tested in an empty and clean open cage. The following parameters were

evaluated: body position, tail elevation, spatial locomotion (speed), transfer arousal

(activity), stereotyped behaviour, curiosity behaviour as a reaction to the approach of

a pen, touch escape, startle response (the sound was evoked using a clicker) and

behaviour whilst picking up the mouse by the tail. A scoring system described each

test parameter (see table 1). A score of 2 represented the normal condition.

Activity cage

In the 13th week post SE, each mouse was put for a ten-minute trial into a square test

arena surrounded by an infrared light based activity detection system (ActiMot, TSE

Systems GmbH, Bad Homburg, Germany) as described before (Bankstahl et al.,

2013). The parameters velocity, active time, covered distance, stops in the middle,

time spent in the middle, number of rearings and time spent at the margin were

measured automatically by the system.

EEG and video monitoring

EEG and video monitoring was performed as described before (Klein et al., 2015).

Mice were kept singly on dark bedding material (Cellu Dri®, LBS, Limburgerhof,

5 Manuskripte

140

Germany) in special cages with swivels. EEG and video was simultaneously and

continuously recorded using LabChart6 and LabChart8 software (ADInstruments

GmbH, Spechbach). During dark phases, cages were illuminated by infrared diodes.

Total recording time was about 100 hours, with a break of two days to let animals

recover from bearing the weight of the cable. Four hours per day of EEG were analysed

for seizure-like events (8:00 am - 9:00 am, 02:00 pm - 03:00 pm, 8:00 pm - 9:00 pm,

02:00 am - 03:00 am). Seizure-like events were categorized into high voltage sharp

waves (HVSW) and hippocampal paroxysmal discharges (HPD) as already described

by Twele et al. (Twele et al., 2016a). The whole monitoring data were screened for

generalized seizures.


All statistical tests were calculated using GraphPad Prism version 7.00 for Windows

(GraphPad Software, San Diego California USA). One-way ANOVA with Dunnett’s

Multiple Comparison Test or Sidak’s Test was conducted regarding the comparisons

of all PET imaging data versus baseline or between groups. A Kruskal-Wallis test in

combination with a Dunn’s Multiple Comparison test was used for comparing scoring

results and with Mann-Whitney U-Test for comparing seizure-like events. Barnard‘s

Test (http://scistatcalc.blogspot.de/2013/11/barnards-test-calculator.html) was applied

for analysis of contingency tables. P-values of < 0.05 were considered statistically

significant. All graphs show mean values with standard error of the mean.

Results

Development of body weight, ketogenic diet intake and blood parameters

Mice under KD gained weight faster than mice being fed the SD (Figure 2B). Starting

from day 13, their weights were significantly higher than those of the Sham group. On

day 31, there was a mean difference between mice fed the two different diets of about

five grams. Mice needed about five days to adapt to the KD meaning to find their usual

daily consumption, which comprised on average 3.4 grams per mouse per day (Figure

2A). There was no difference in body weight development between both SD groups –

the Sham and the SD group. In the chronic phase with SD in all groups, the KD induced

5 Manuskripte

141

difference vanished (Figure 2B). Based on the measurements at the scan days, no

effects by KD on blood glucose concentrations were observed, except for the

measurement on day 14, when blood glucose levels were significantly higher in the KD

group compared to the SD group, but similar to the Sham group (Figure 2D). The KD

group had elevated blood ß-hydroxybutyrate concentrations compared to baseline

measurements as well as compared to the SD group at two and four weeks after start

of KD (Figure 2C).

PET imaging

[18F]GE-180 PET

The quantification of regional tracer uptake by calculation of the standardized uptake

values showed no differences among the groups on day seven except for the dorsal

right hippocampus: here, the KD group had an increased uptake compared to baseline

values (Figure 3A). The outcome of the fourteen days scan showed a decrease of the

tracer uptake in the KD group compared to the seven days timepoint in the ventral

ipsilateral hippocampus, the ipsilateral striatum and the ipsilateral thalamus (Figure

3B,D,E). The dorsal hippocampus had ipsilateral a higher tracer uptake in the SD group

than in the Sham group on day 14. In the dorsal ipsilateral hippocampus, the tracer

uptake was elevated in the SD group compared to baseline and compared to the

contralateral side (Figure 3A).

[18F]FDG PET

The tracer uptake decreased generally in the Sham and SD group at four weeks (SD

group not in the amygdala) compared to baseline values and compared to the KD

group that did not change (Figure 4A-E). At the chronic time point of nine weeks, the

Sham and SD groups still had a decreased uptake (SD group not in the amygdala),

and the KD group assimilated at this time point, i.e. ~ 10 weeks after end of KD feeding

(Figure 4A-F). The influx rate Ki did not change four weeks after surgery (Figure 5A-

F). The metabolic rate MRGlu (Figure 6A-F) resembled the image of the tracer uptake:

In almost all analyzed brain regions, a decrease at four weeks could be seen in the SD

and Sham group (not ventral hippocampus, amygdala) compared to baseline values

5 Manuskripte

142

und to the KD group that did not change (if SD and KD compared, not in amygdala,

and if Sham and KD compared, not in dorsal left hippocampus). This decrease was

still manifest in all analyzed brain regions but in the amygdala regarding at the later

time point. The KD group did not show a significant difference compared to baseline,

but it also did not differ any more from both other groups (Figure 6A-F).

The preliminary experiment with healthy mice fed the KD for 72 days revealed an

increase in tracer uptake on day 35 in hippocampus, thalamus and cerebellum and on

day 49 in thalamus. Ki values did not change over time. The MRGlu was increased on

day 25 in hippocampus.

[18F]Flumazenil PET

The estimated binding potential BPnd had comparable levels in all three groups in week

four post surgery. An increase comparing both time points was seen in the Sham group

in cortex, right striatum, right thalamus and whole brain as a region. Sham mice and

SD mice differed at the later time point in ventral left hippocampus and right striatum

(see appendix of thesis).

EEG and video monitoring

The KD feeding for four weeks directly starting after SE induction did not lead to

differences in the amount of shown generalized seizures at any time point. Due to

animal loss, electrode loss or practicability issues, nine KD, nine SD and three Sham

animals could be monitored electroencephalographically. Noticeably, there were no

significant differences concerning the amount of seizure-like events shown by KD mice

and Sham mice (not shown). A significantly higher amount of HVSW, ME, as well as

ME and HPD or all electroencephalographic events in total, could be observed in SD

mice compared to KD animals (Figure 10D). Regarding the average cumulative

duration of seizure-like events (HVSW, ME, total events) per hour and the average

duration of those events, SD mice differed from KD and Sham mice (Figure 10E,F).

KD mice had on average less and less long electroencephalographic events than SD

mice (Figure 10D-F). Sham mouse EEGs did not have any of the three events but rare

and isolated spikes.

5 Manuskripte

143

Behavioral tests

The activity cage experiment could not reveal any differences in behavior among the

three groups. The Irwin screen results were evaluated by calculating an average score

per group and time point (Figure 8) or a summation score for every animal, including

score values for speed, activity, startle response, finger approach, touch escape, and

elevating at tail (Figure 9). This resulted in elevated scores for the SD group in week

two (startle response) compared to baseline. In week 4, the KD group displayed a

higher speed compared to Sham animals. The summation score reveals distinct

abnormalities at 2 weeks post SE (Figure 9). Directly after the EEG monitoring period,

meaning three months after SE induction, the Irwin screen did not result in any

differences among the groups.

Discussion

The main finding of our study, the electroencephalographic outcome with no significant

differences between KD and Sham animals but evidently more seizure-like events

shown by SD animals than by Sham or KD, supports the fundamental hypothesis of a

disease-modifying efficacy of the KD. Furthermore, the average cumulative duration

as well as the average duration of electroencephalographic events was higher in SD

than in KD (and Sham) animals. One of nine SE+SD mice, but five of nine SE+KD

mice had no seizure-like events at all during the monitoring period. Symptoms of SE

shown after awakening from anesthesia were transient immobility, intermittent head

tilt, chewing and in some cases circling, which is in line with observations described

earlier (Bouilleret et al., 2000, Bouilleret et al., 1999, Riban et al., 2002). Only rarely,

the evoked SE has convulsive parts (Gröticke et al., 2008). Spontaneous generalized

seizures were observed during daily routine or EEG/video monitoring in five out of ten

SE+SD mice but only three of eleven SE+KD mice.

Individual animals were followed-up during the anticipated time-course of

epileptogenesis by PET imaging and the Irwin Screen. The higher additive score in the

Irwin Screen at week two in the SE+SD group compared to baseline and Sham controls

can be considered as a general indicator for epileptogenesis-associated alterations in

the brains of those mice. Later, in the chronic phase, no difference among groups was

5 Manuskripte

144

observed, which is in line with an earlier study in the mouse intrahippocampal kainate

model (Gröticke et al., 2008).

With regard to evaluate epileptogenesis by PET imaging, the tracers [18F]FDG and

[18F]flumazenil have been shown to be useful in epilepsy diagnostics (Burneo et al.,

2015) and epilepsy research (Dedeurwaerdere et al., 2007, Dedeurwaerdere et al.,

2009, Juhasz et al., 2000). [18F]FDG PET is described to reveal a hypometabolic state

in chronic epilepsy in several animal models (Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012, Liu et

al., 2010, Zhang et al., 2015). Four weeks after surgery, mice are supposed to have

developed already spontaneous recurrent seizures (Twele et al., 2016b). As rats

injected with kainate also showed a global decrease in cerebral [18F]FDG uptake at

that time (Jupp et al., 2007), the reduced tracer uptake in the SE+SD group observed

here was as expected. Strikingly, the [18F]FDG PET images showed a similar pattern

in the sham control group. As the sham surgery represented the very same mechanical

trauma with the microinjection of sterile saline instead of kainate, one could argue that

the main part of the [18F]FDG signal is trauma- and not epileptogenesis-associated in

this model. Mild traumatic brain injury was shown to induce similar hypometabolic

patterns in rats (Vallez Garcia et al., 2016), whereby, in contrast to our experiment,

also inflammation was seen. It was observed before that prolonged depth electrode

implantation led to a more pronounced SE caused by electrical stimulation (Bankstahl

et al., 2014) or a faster kindling (Blackwood et al., 1982). As electrode implantation in

the hippocampus of mice led to micro-haemorrhages with iron deposition (Boast et al.,

1976), one might assume that this is also the case when lowering a cannula in the

tissue. Unpublished data from our group show that the blood-brain barrier can be

impaired by sham surgery. The induction of focal ischemia due to damage and clotting

caused by leaving of the cannula for five minutes in the tissue is also conceivable.

Having these obvious changes in brain glucose metabolism in mind, it is impressive

that the KD seems to help the brain tissue to recover after this insult as can be seen in

the unaltered [18F]FDG uptake values at the time point of four weeks later. The effect

of the KD could also be interpreted as an assistance to counterbalance the insult

consequences, with regard to the assimilated uptake values more than a month after

the end of the KD treatment. The results for the [18F]FDG uptake of the preliminary

5 Manuskripte

145

experiment in healthy animals receiving KD go into the same direction as an increase

in tracer uptake could be seen on day 35 in hippocampus, thalamus and cerebellum

and also on day 49 in thalamus (see appendix of the thesis). Interestingly, the MRGlu

values of the SE+KD mice at 10 weeks post SE still did not differ from the baseline

values. This could be a hint for an effectiveness of the KD outlasting the treatment

period.

[18F]Flumazenil-PET did not reveal any difference between SE+KD and SE+SD mice

or SE+KD and Sham controls. There were no changes seen between the two

timepoints in the chronic phase after surgery in both SE groups. Only the Sham group

showed increases in binding potential PBnd bilaterally in cortex, in whole brain as one

VOI and in the right striatum and thalamus. As a baseline value is missing in our study,

one can only conclude that the KD did not seem to directly influence the GABAergic

system. Possibly, the results reflect the regeneration of the sham animals after the

insult. Decreased [11C]flumazenil binding in PET studies in epileptic patients or

autoradiography can correlate with neurodegeneration (Lamusuo et al., 2000, Burdette

et al., 1995) but does not have to, as seen with [18C]flumazenil in a rat model five

weeks after kainate (Vivash et al., 2014). Increases in GABAA receptor subunit

expression were shown in the dentate gyrus in the mouse kainate model (four weeks

after kainate injection under isoflurane anaesthesia), but not in CA1 or CA3

(Stamboulian-Platel et al., 2016). That our results differed from these findings could be

due to the anaesthetic used during SE induction or based on the relatively small size

of the dentate gyrus as a subregion in the whole hippocampal VOI. Concerning

[18F]GE-180 uptake, at the timepoint seven days, an elevated expression of TSPO was

only visible in the SE+KD group in the dorsal hippocampus, whereas the inflammation-

associated signal was not seen in the two other groups. After two weeks, the situation

changed: the SE+SD group had an increased uptake in the region of the former kainate

injection, being ipsilaterally higher than that of the Sham controls. Simultaneously, the

tracer signal of the SE+KD group decreased again in some brain regions (ventral right

hippocampus, right striatum and left thalamus). TSPO-signal is mainly associated with

microglial activation and macrophage immigration as described for animal models of

epileptogenesis (Brackhan et al., 2016), multiple sclerosis (Airas et al., 2015), stroke

5 Manuskripte

146

(Boutin et al., 2015), acute LPS-induced CNS inflammation (Dickens et al., 2014) and

Alzheimer disease (Brendel et al., 2016). TSPO was linked to pro-inflammatory

microglial activation as increases in [11C]PBR28 uptake correlated with rises in serum

levels of IL-1ß and IL-6 in baboons following LPS administration (Hannestad et al.,

2012). Analyzing microglial polarization, TSPO was colocalized to CD86 in a multiple

staining, but interestingly also to CD206-microglia close to Aß-positive plaques, but not

to afar CD206-positive microglia in an AD mouse model (Liu et al., 2015). Microglial

activation does not depend on TSPO as TSPO knock-out mice also have activated

microglia (Banati et al., 2014). TSPO PET signal is also caused by astrocytes

overexpressing TSPO (Lavisse et al., 2012). Thus, histology at the seven and fourteen

days timepoints would be interesting to see the most probable origin of the TSPO

signal. Since its discovery in 1977 (Braestrup and Squires, 1977) as a benzodiazepine

binding protein in peripheral tissue, TSPO has been linked to cholesterol transport,

steroidogenesis, immunomodulation and cellular respiration (Liu et al., 2014). The

primarily intra-mitochondrial location of TSPO is ensured. It was described as being

localized in the outer mitochondrial membrane (Chen and Guilarte, 2008). Increased

TSPO expression in cerebral injury and inflammation could be caused by production

of reactive oxygen species (ROS), IL-1 or TNF α (Batarseh and Papadopoulos, 2010).

However, there are several observations of a KD increasing mitochondrial biogenesis

in hippocampal tissue (Bough et al., 2006, Lauritzen et al., 2016). Yet, it was shown,

that a KD fed to rats causes transient mild oxidative stress driving the activation of the

Nrf2 pathway und leading finally to a better mitochondrial redox state (Milder et al.,

2010). Thus, it is possible that the increasing amount of mitochondria in combination

with the mild production of ROS caused the TSPO signal in the KD group on day seven.

The only in the dorsal right hippocampus significant TSPO signal would therefore be

the result of the exacerbation of the mild oxidative stress by the aftermath of the

intrahippocampal microinjection. In this regard, a [18F]GE-180-PET-Scan of healthy

mice being fed KD would be interesting. TSPO does not seem to be indispensable for

mitochondrial function, but in case of metabolic challenges like during inflammation, it

becomes relevant (Gut et al., 2015), perhaps even with a direct influence on energy

metabolism (Gut et al., 2013). As glial activation and the activated state is highly

5 Manuskripte

147

energy-consuming, TSPO shifts from a low baseline to an upregulated expression.

Concerning the time course of increased TSPO detectability after kainate injection, a

study with [3H]Ro5-4864 binding in homogenized rat striatal tissue (kainate was

injected in this target region) found an incline in tracer binding already two days after

kainate injection, becoming maximal after one week and remaining on a plateau for at

least six weeks after the brain insult (Schoemaker et al., 1982). This severe increase

in TSPO might have been measured due to a pre-selection of rats concerning

behavioral response. General anti-inflammatory effects of a KD were seen in

lipopolysaccharide-induced cerebral inflammation in rats (Dupuis et al., 2015) with less

IL1ß in hippocampus and less IL1ß and TNFα in blood four hours after LPS injection

in comparison with controls. In contrast to our study, the diet had been started two

weeks before the insult, whereas in our study, the KD needed first time until onset of

efficacy.

Blood ß-hydroxybutyrate concentration was elevated latest on day 14 after starting the

diet. To evaluate the efficacy of a KD treatment, the resulting synthesis of ketone

bodies is often taken account of. Nevertheless, there is evidence that ketosis does not

matter for efficacy of a KD (Dhamija et al., 2013). Representing the ketone body

synthesis during a KD, blood ß-hydroxybutyrate concentration is usually quantified in

animal studies: One report about KD in male Swiss mice (Zarnowska et al., 2016)

mentions higher blood ß-hydroxybutyrate levels than in our study (2.3 ± 0.3 mM/ml).

Mice also showed hypoglycemia. A study in male EL mice also describes an enormous

variation of blood ß-hydroxybutyrate levels resulting from a KD fed ad libitum

(Todorova et al., 2000). At most of the measurement time points in our mice, blood

glucose levels were not influenced by the KD. Both working groups fasted the mice

before initiating the KD. Fasting at the diet initiation in combination with a calorie-

restricted feeding also led to higher blood ß-hydroxybutyrate levels than ad libitum

administration (Bough et al., 2000). Required pentylenetetrazole doses to evoke

seizures were significantly elevated in restrictively KD fed mice compared to

restrictively SD fed, whereas this difference was not seen between both ad libitum

groups. Today, it is usual to start a KD with a non-fasting protocol (Schoeler and Cross,

2016). There is evidence for a better efficacy in patients after three months of diet if it

5 Manuskripte

148

was initiated at full calories, even if the development of ketosis is minimally retarded

(Bansal et al., 2014). Extra fasting was avoided in our study because mice had to adapt

to the new diet. One study concluded that the efficacy of a KD does not depend on the

blood ketone concentration, but on the diet itself with its ketogenic ratio (Bough et al.,

1999).

Conclusion

As observed by electroencephalographic monitoring and the repeated Irwin screen

during the course of epileptogenesis, there is evidence for disease-modifying effects

of an intermittent KD. If there are more effective ways of designing the diet or if there

is a more effective time period for dietary treatment remains to be determined.

Conflict of interest

The authors declare no conflicts of interest.

Acknowledgements


(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Ina Leiter was

supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are grateful

to Silvia Eilert, Petra Felsch and Alexander Kanwischer for their skillful assistance.

5 Manuskripte

149

Table 1

Score Body

position

Tail

elevation

Spatial

loco-

motion

Transfer

arousal

Stereo-

typed

behavior

Startle Curiosity

behavior

Touch

escape and

elevating at

tail

0 flattened no tone none

none

- no reaction

no reaction

no escape /

freezing

1 partially

flattened

slight tone

slow hypo-active

yes barely noticed

only head

movement

slow escape

2 typical horizontal normal

active none

immediate

moderate

freezing

whole body

movement,

whisker-

contact

moderate

escape

3 rearing 45° rapid

hyper-active - immediate

strong

freezing,

jumping,

strong escape

nose-contact run escape

4 rigid posture 90° extremely

rapid

- - -

aggressive Strong

escape,

towards the

hand

5 - retrograde - - - - - -

Table 1: Scoring system used for the Irwin Screen.

5 Manuskripte

150

Figures

Figure 1 Experimental Design

Figure 1: Experimental Design. Epileptogenesis after kainate-induced status epilepticus (SE) with or

without a four-week ketogenic diet (dashed grey line) was longitudinally assessed. [18F]GE180 PET

scans were performed at baseline and seven and 14 days after microinjection. [18F]FDG PET scans

were performed at baseline and, like [18F]Flumazenil PET scans, 4 and 9-10 weeks post SE. Electrodes

were implanted at 11 weeks post SE for EEG and video monitoring. A modified Irwin Screen was

performed at the day before each PET scan as well as in the 13th week, when an open field test was

also done.

5 Manuskripte

151

Figure 2

Figure 2: Consumption of ketogenic diet (A) Daily diet intake. (B) Body weight development. # =

SE+SD vs. SE+KD, ° = SE+KD vs. Sham, one-way ANOVA + Tukey's test. (C) Blood ß-hydroxybutyrate

levels. * = one-way ANOVA + Dunnett‘s test vs. baseline (BL), # = Student‘s t-test, SE+SD vs. SE+KD.

(D) Blood glucose levels. # = SE+SD vs. SE+KD, Student‘s t-test. SE = status epilepticus, KD =

ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.

5 Manuskripte

152

Figure 3

Figure 3: [18F]GE180 uptake. Results for left (contra) and right (ipsi) sides of (A) dorsal and (B) ventral

hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala are shown for the scan

timepoints BL (baseline), seven and 14 days after microinjection. [18F]GE180 uptake was increased in

ipsilateral dorsal hippocampus seven days post status epilepticus in mice fed a ketogenic diet (A), but

not on day 14, in contrast to mice fed a standard diet. A decrease in [18F]GE180 uptake values between

both timepoints during KD feeding was observed in ventral hippocampus, striatum and thalamus. * =

ipsilateral vs. BL, one-way ANOVA + Dunnett's test, ° = SE+SD/SD+KD/Sham ipsilateral, one-way

ANOVA + Dunnett's test, # = contra- vs. ipsilateral, one-way ANOVA + Sidak's test, ∆ = one-way ANOVA

(ipsilateral) + Sidak's test. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham =

sham-operated.

5 Manuskripte

153

Figure 4

Figure 4: [18F]FDG uptake. Results for left (contra) and right (ipsi) sides of (A) dorsal and (B) ventral

hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala are shown for the scan

timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. In week four, mice fed with ketogenic

diet differ from mice fed with standard diet, but not from baseline measurements. * = one-way ANOVA

+ Dunnett's test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way ANOVA +

Sidak's test, Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham

= sham-operated.

5 Manuskripte

154

Figure 5

Figure 5: Ki values of the [18F]FDG-2-compartiment model. Results for left (contra) and right (ipsi)

sides of (A) dorsal and (B) ventral hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala

are shown for the scan timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. Ki values were

neither influenced by epileptogenesis or sham operation, nor by ketogenic diet feeding. * = one-way

ANOVA + Dunnett's test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way

ANOVA + Sidak's test, Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard

diet, Sham = sham-operated.

5 Manuskripte

155

Figure 6

Figure 6: MRGlu values of the [18F]FDG-2-compartiment model. Results for left (contra) and right (ipsi)

sides of (A) dorsal and (B) ventral hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala

are shown for the scan timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. MRGlu values

of baseline measurement were maintained in mice fed a ketogenic diet. * = one-way ANOVA + Dunnett's

test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way ANOVA + Sidak's test,

Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-

operated.

5 Manuskripte

156

Figure 7 ActiMot

Figure 7: Open field test (ActiMot). Results for each parameter are shown for sham-operated mice

(grey), mice fed a standard diet (red) and mice fed a ketogenic diet (green). No differences were

observed concerning the travelled distance, the velocity, the activity, the time spent at margin and in

center, the visits in center, the time spent active and hyperactive, and the number of rearings. KD =

ketogenic diet, SD = standard diet.

S h a m S E + S D S E + K D

0

5 0

1 0 0

1 5 0

D is ta n c e t ra v e lle d

Dis

tan

ce

[m

]


0

1 0

2 0

3 0

4 0

V e lo c ity

[cm

/s]


0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T im e s p e n t a c t iv e

[s]


0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

A c tiv ity

[%

]


0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T im e s p e n t a t m a rg in

[s]


0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T im e s p e n t in c e n te r

[s]


0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

V is its in c e n te r

Nu

mb

er


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R e a r in g s

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0

2 0 0

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6 0 0

T im e s p e n t h y p e r a c t iv e

[s]

5 Manuskripte

157

Figure 8 Irwin Screen

Figure 8: Irwin Screen: results of single parameters. The analyzed parameters speed, activity, startle

response, finger approach, touch escape and elevating at tail are shown for the timepoints baseline

(BL), one, two, four, 10 and 12 weeks after induction of status epilepticus (SE) or sham-operation. ° =

Kruskal-Wallis ANOVA + Dunn's test, SE+KD vs. Sham, * = Kruskal Wallis ANOVA + Dunn's test vs.

BL. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.

A c tiv ity

0

1

2

3

T im e p o in t

Sc

ore

B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1

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B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1

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B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1

*

B a s e lin e

S h a m

S E + S D

S E + K D

5 Manuskripte

158

Figure 9 Irwin Screen

Figure 9: Irwin Screen: total sum score. Sum score was calculated from the scores of the parameters

speed, activity, startle response, finger approach, touch escape and elevating at tail. The sum score

was higher in mice fed a standard diet during epileptogenesis than in sham-operated mice. * = Kruskal-

Wallis ANOVA + Dunn's test vs. BL, ∆ = Kruskal-Wallis ANOVA + Dunn's test, SE+SD vs. Sham. SE =

status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.

0

1

2

3

4

T o ta l S u m S c o r e

T im e p o in t

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B L 2 4 10 1 2 -1 4 w k s p o s t S E1

*

B a s e lin e

S h a m

S E + S D

S E + K D

5 Manuskripte

159

Figure 10

Figure 10: Results of the EEG analysis. (A) Less mice showed HVSW (high voltage sharp waves) in

the group fed a ketogenic diet (KD) than in the group fed a standard diet (SD) after induction of status

epilepticus. (B) Less mice showed ME+HPD (mixed events and hippocampal paroxysmal discharges)

in the group fed a ketogenic diet (KD) than in the group fed a standard diet (SD). (C) The number of

mice showing SRS (spontaneous recurrent seizures) did not differ significantly between both groups.

Only SRS shown during the EEG monitoring period were included in statistical analysis. (D) Mice fed a

ketogenic diet after status epilepticus (SE+KD) showed less HVSW, ME, and ME+HPD per hour than

mice fed a standard diet after status epilepticus (SE+SD). (E) SE+KD mice had seizure-like events of

shorter duration than SE+SD mice. (F) SE+KD mice showed a shorter cumulative duration of seizure-

like events per hour in EEG than SE+SD mice (not concerning HPD). (A-C) Barnard‘s test, (D-F) Mann-

Whitney U-Test. # = SE+SD vs. SE+KD.

0

1 0

2 0

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1 0

1 5

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f m

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S R S n o S R S

5 Manuskripte

160

References

AIRAS, L., DICKENS, A. M., ELO, P., MARJAMAKI, P., JOHANSSON, J., ESKOLA, O.,

JONES, P. A., TRIGG, W., SOLIN, O., HAAPARANTA-SOLIN, M., ANTHONY, D. C.

& RINNE, J. 2015. In vivo PET imaging demonstrates diminished microglial activation

after fingolimod treatment in an animal model of multiple sclerosis. J Nucl Med, 56,

305-10.

BANATI, R. B., MIDDLETON, R. J., CHAN, R., HATTY, C. R., KAM, W. W., QUIN, C.,

GRAEBER, M. B., PARMAR, A., ZAHRA, D., CALLAGHAN, P., FOK, S., HOWELL,

N. R., GREGOIRE, M., SZABO, A., PHAM, T., DAVIS, E. & LIU, G. J. 2014. Positron

emission tomography and functional characterization of a complete PBR/TSPO

knockout. Nat Commun, 5.

BANKSTAHL, J. P., BRANDT, C. & LÖSCHER, W. 2014. Prolonged depth electrode

implantation in the limbic system increases the severity of status epilepticus in rats.


BANKSTAHL, M., BANKSTAHL, J. P. & LÖSCHER, W. 2013. Pilocarpine-induced epilepsy

in mice alters seizure thresholds and the efficacy of antiepileptic drugs in the 6-Hertz

psychomotor seizure model. Epilepsy Res, 107, 205-16.

BANSAL, S., CRAMP, L., BLALOCK, D., ZELLEKE, T., CARPENTER, J. & KAO, A. 2014.

The ketogenic diet: initiation at goal calories versus gradual caloric advancement.

Pediatr Neurol, 50, 26-30.

BATARSEH, A. & PAPADOPOULOS, V. 2010. Regulation of translocator protein 18 kDa

(TSPO) expression in health and disease states. Mol Cell Endocrinol, 327, 1-12.

BLACKWOOD, D. H. R., MARTIN, M. J. & MCQUEEN, J. K. 1982. Enhanced rate of kindling

after prolonged electrode implantation into the amygdala of rats. J Neurosci Methods,

5, 343-348.

BOAST, C. A., REID, S. A., JOHNSON, P. & ZORNETZER, S. F. 1976. A caution to brain

scientists: unsuspected hemorrhagic vascular damage resulting from mere electrode

implantation. Brain Res, 103, 527-534.

BOUGH, K. J., CHEN, R. S. & EAGLES, D. A. 1999. Path analysis shows that increasing

ketogenic ratio, but not beta-hydroxybutyrate, elevates seizure threshold in the Rat.

Dev Neurosci, 21, 400-6.

BOUGH, K. J., GUDI, K., HAN, F. T., RATHOD, A. H. & EAGLES, D. A. 2002. An

anticonvulsant profile of the ketogenic diet in the rat. Epilepsy Res, 50, 313-25.

5 Manuskripte

161

BOUGH, K. J., MATTHEWS, P. J. & EAGLES, D. A. 2000. A ketogenic diet has different

effects upon seizures induced by maximal electroshock and by pentylenetetrazole

infusion. Epilepsy Res, 38, 105-14.

BOUGH, K. J., WETHERINGTON, J., HASSEL, B., PARE, J. F., GAWRYLUK, J. W.,

GREENE, J. G., SHAW, R., SMITH, Y., GEIGER, J. D. & DINGLEDINE, R. J. 2006.

Mitochondrial biogenesis in the anticonvulsant mechanism of the ketogenic diet. Ann

Neurol, 60, 223-35.

BOUILLERET, V., BOYET, S., MARESCAUX, C. & NEHLIG, A. 2000. Mapping of the

progressive metabolic changes occurring during the development of hippocampal

sclerosis in a model of mesial temporal lobe epilepsy. Brain Res, 852, 255-62.

BOUILLERET, V., RIDOUX, V., DEPAULIS, A., MARESCAUX, C., NEHLIG, A. & LE GAL LA

SALLE, G. 1999. Recurrent seizures and hippocampal sclerosis following

intrahippocampal kainate injection in adult mice: electroencephalography,

histopathology and synaptic reorganization similar to mesial temporal lobe epilepsy.


BOUTIN, H., MURRAY, K., PRADILLO, J., MAROY, R., SMIGOVA, A., GERHARD, A.,

JONES, P. A. & TRIGG, W. 2015. 18F-GE-180: a novel TSPO radiotracer compared

to 11C-R-PK11195 in a preclinical model of stroke. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 42,

503-11.


BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016. Serial Quantitative TSPO-Targeted

PET Reveals Peak Microglial Activation up to 2 Weeks After an Epileptogenic Brain

Insult. J Nucl Med, 57, 1302-8.

BRAESTRUP, C. & SQUIRES, R. F. 1977. Specific benzodiazepine receptors in rat brain

characterized by high-affinity (3H)diazepam binding. Proc Natl Acad Sci U S A, 74,

3805-9.

BRENDEL, M., PROBST, F., JAWORSKA, A., OVERHOFF, F., KORZHOVA, V., ALBERT,

N. L., BECK, R., LINDNER, S., GILDEHAUS, F. J., BAUMANN, K., BARTENSTEIN,

P., KLEINBERGER, G., HAASS, C., HERMS, J. & ROMINGER, A. 2016. Glial

Activation and Glucose Metabolism in a Transgenic Amyloid Mouse Model: A Triple-

Tracer PET Study. J Nucl Med, 57, 954-60.

BURDETTE, D. E., SAKURAI, S. Y., HENRY, T. R., ROSS, D. A., PENNELL, P. B., FREY,

K. A., SACKELLARES, J. C. & ALBIN, R. L. 1995. Temporal lobe central

5 Manuskripte

162

benzodiazepine binding in unilateral mesial temporal lobe epilepsy. Neurology, 45,

934-41.

BURNEO, J. G., POON, R., KELLETT, S. & SNEAD, O. C. 2015. The Utility of Positron

Emission Tomography in Epilepsy. Can J Neurol Sci, 6, 1-12.

CERVENKA, M. C., HENRY, B. J., FELTON, E. A., PATTON, K. & KOSSOFF, E. H. 2016.

Establishing an Adult Epilepsy Diet Center: Experience, efficacy and challenges.

Epilepsy Behav, 58, 61-8.

CHEN, M. K. & GUILARTE, T. R. 2008. Translocator protein 18 kDa (TSPO): molecular

sensor of brain injury and repair. Pharmacol Ther, 118, 1-17.

COPPOLA, G., VEGGIOTTI, P., CUSMAI, R., BERTOLI, S., CARDINALI, S., DIONISI-VICI,

C., ELIA, M., LISPI, M. L., SARNELLI, C., TAGLIABUE, A., TORALDO, C. &

PASCOTTO, A. 2002. The ketogenic diet in children, adolescents and young adults

with refractory epilepsy: an Italian multicentric experience. Epilepsy Res, 48, 221-7.

DEDEURWAERDERE, S., GREGOIRE, M. C., VIVASH, L., ROSELT, P., BINNS, D.,

FOOKES, C., GREGURIC, I., PHAM, T., LOC'H, C., KATSIFIS, A., HICKS, R. J.,

O'BRIEN, T. J. & MYERS, D. E. 2009. In-vivo imaging characteristics of two

fluorinated flumazenil radiotracers in the rat. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 36, 958-65.

DEDEURWAERDERE, S., JUPP, B. & O'BRIEN, T. J. 2007. Positron Emission Tomography

in Basic Epilepsy Research: A View of the Epileptic Brain. Epilepsia, 48, 56-64.

DHAMIJA, R., ECKERT, S. & WIRRELL, E. 2013. Ketogenic diet. Can J Neurol Sci, 40, 158-

67.

DICKENS, A. M., VAINIO, S., MARJAMAKI, P., JOHANSSON, J., LEHTINIEMI, P., ROKKA,

J., RINNE, J., SOLIN, O., HAAPARANTA-SOLIN, M., JONES, P. A., TRIGG, W.,

ANTHONY, D. C. & AIRAS, L. 2014. Detection of microglial activation in an acute

model of neuroinflammation using PET and radiotracers 11C-(R)-PK11195 and 18F-

GE-180. J Nucl Med, 55, 466-72.

DUPUIS, N., CURATOLO, N., BENOIST, J.-F. & AUVIN, S. 2015. Ketogenic diet exhibits

anti-inflammatory properties. Epilepsia, n/a-n/a.

DUSTIN, S. M. & STAFSTROM, C. E. 2016. Ketogenic Diet, but Not Polyunsaturated Fatty

Acid Diet, Reduces Spontaneous Seizures in Juvenile Rats with Kainic Acid-induced

Epilepsy. J Epilepsy Res, 6, 1-7.

FELTON, E. A. & CERVENKA, M. C. 2015. Dietary therapy is the best option for refractory

nonsurgical epilepsy. Epilepsia, 56, e95-8.

5 Manuskripte

163




GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K. & LÖSCHER, W. 2008. Behavioral alterations in a mouse

model of temporal lobe epilepsy induced by intrahippocampal injection of kainate.

Exp Neurol, 213, 71-83.

GUNN, R. N., LAMMERTSMA, A. A., HUME, S. P. & CUNNINGHAM, V. J. 1997. Parametric

imaging of ligand-receptor binding in PET using a simplified reference region model.

NeuroImage, 6, 279-87.

GUT, P., BAEZA-RAJA, B., ANDERSSON, O., HASENKAMP, L., HSIAO, J., HESSELSON,

D., AKASSOGLOU, K., VERDIN, E., HIRSCHEY, M. D. & STAINIER, D. Y. 2013.

Whole-organism screening for gluconeogenesis identifies activators of fasting

metabolism. Nat Chem Biol, 9, 97-104.

GUT, P., ZWECKSTETTER, M. & BANATI, R. B. 2015. Lost in translocation: the functions of

the 18-kD translocator protein. Trends Endocrinol Metab, 26, 349-56.

HANNESTAD, J., GALLEZOT, J.-D., SCHAFBAUER, T., LIM, K., KLOCZYNSKI, T.,

MORRIS, E. D., CARSON, R. E., DING, Y.-S. & COSGROVE, K. P. 2012. Endotoxin-

induced systemic inflammation activates microglia: [11C]PBR28 positron emission

tomography in nonhuman primates. NeuroImage, 63, 232-239.

HANSEN, S. L., NIELSEN, A. H., KNUDSEN, K. E., ARTMANN, A., PETERSEN, G.,

KRISTIANSEN, U., HANSEN, S. H. & HANSEN, H. S. 2009. Ketogenic diet is

antiepileptogenic in pentylenetetrazole kindled mice and decrease levels of N-

acylethanolamines in hippocampus. Neurochem Int, 54, 199-204.

HORI, A., TANDON, P., HOLMES, G. L. & STAFSTROM, C. E. 1997. Ketogenic diet: Effects

on expression of kindled seizures and behavior in adult rats. Epilepsia, 38, 750-758.

IRWIN, S. 1968. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative

procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.

Psychopharmacologia, 13, 222-257.

JIANG, Y., YANG, Y., WANG, S., DING, Y., GUO, Y., ZHANG, M. M., WEN, S. Q. & DING,

M. P. 2012. Ketogenic diet protects against epileptogenesis as well as neuronal loss

in amygdaloid-kindling seizures. Neuroscience Letters, 508, 22-26.

JUHASZ, C., CHUGANI, D. C., MUZIK, O., WATSON, C., SHAH, J., SHAH, A. & CHUGANI,

H. T. 2000. Electroclinical correlates of flumazenil and fluorodeoxyglucose PET

abnormalities in lesional epilepsy. Neurology, 55, 825-35.

5 Manuskripte

164




JUPP, B., WILLIAMS, J., BINNS, D., HICKS, R. J. & O'BRIEN, T. J. 2007. Imaging small

animal models of epileptogenesis. Neurology Asia, 12 (Supplement 1), 51 - 54.

KLEE, R., TÖLLNER, K., RANKOVIC, V., RÖMERMANN, K., SCHIDLITZKI, A.,

BANKSTAHL, M. & LÖSCHER, W. 2015. Network pharmacology for

antiepileptogenesis: Tolerability of multitargeted drug combinations in nonepileptic vs.

post-status epilepticus mice. Epilepsy Res, 118, 34-48.

KLEIN, P., JANOUSEK, J., BARBER, A. & WEISSBERGER, R. 2010. Ketogenic diet

treatment in adults with refractory epilepsy. Epilepsy Behav, 19, 575-9.

KLEIN, S., BANKSTAHL, M. & LOSCHER, W. 2015. Inter-individual variation in the effect of

antiepileptic drugs in the intrahippocampal kainate model of mesial temporal lobe

epilepsy in mice. Neuropharmacology, 90, 53-62.

LAMANNA, J., SALEM, N., PUCHOWICZ, M., EROKWU, B., KOPPAKA, S., FLASK, C. &

LEE, Z. 2009. Ketones Suppress Brain Glucose Consumption. In: LISS, P.,

HANSELL, P., BRULEY, D. & HARRISON, D. (eds.) Oxygen Transport to Tissue

XXX. Springer US.

LAMBRECHTS, D. A., DE KINDEREN, R. J., VLES, J. S., DE LOUW, A. J., ALDENKAMP,

A. P. & MAJOIE, H. J. 2017. A randomized controlled trial of the ketogenic diet in

refractory childhood epilepsy. Acta Neurol Scand, 135, 231-239.

LAMMERTSMA, A. A. & HUME, S. P. 1996. Simplified reference tissue model for PET

receptor studies. NeuroImage, 4, 153-8.

LAMUSUO, S., PITKANEN, A., JUTILA, L., YLINEN, A., PARTANEN, K., KALVIAINEN, R.,

RUOTTINEN, H. M., OIKONEN, V., NAGREN, K., LEHIKOINEN, P., VAPALAHTI, M.,

VAINIO, P. & RINNE, J. O. 2000. [11 C]Flumazenil binding in the medial temporal

lobe in patients with temporal lobe epilepsy: correlation with hippocampal MR

volumetry, T2 relaxometry, and neuropathology. Neurology, 54, 2252-60.



LAURITZEN, K. H., HASAN-OLIVE, M. M., REGNELL, C. E., KLEPPA, L., SCHEIBYE-

KNUDSEN, M., GJEDDE, A., KLUNGLAND, A., BOHR, V. A., STORM-MATHISEN,

J. & BERGERSEN, L. H. 2016. A ketogenic diet accelerates neurodegeneration in

5 Manuskripte

165

mice with induced mitochondrial DNA toxicity in the forebrain. Neurobiol Aging, 48,

34-47.

LAVISSE, S., GUILLERMIER, M., HERARD, A. S., PETIT, F., DELAHAYE, M., VAN CAMP,

N., BEN HAIM, L., LEBON, V., REMY, P., DOLLE, F., DELZESCAUX, T.,

BONVENTO, G., HANTRAYE, P. & ESCARTIN, C. 2012. Reactive astrocytes

overexpress TSPO and are detected by TSPO positron emission tomography

imaging. J Neurosci, 32, 10809-18.





LIU, B., LE, K. X., PARK, M. A., WANG, S., BELANGER, A. P., DUBEY, S., FROST, J. L.,

HOLTON, P., REISER, V., JONES, P. A., TRIGG, W., DI CARLI, M. F. & LEMERE,

C. A. 2015. In Vivo Detection of Age- and Disease-Related Increases in

Neuroinflammation by 18F-GE180 TSPO MicroPET Imaging in Wild-Type and

Alzheimer's Transgenic Mice. J Neurosci, 35, 15716-30.

LIU, G. J., MIDDLETON, R. J., HATTY, C. R., KAM, W. W., CHAN, R., PHAM, T.,

HARRISON-BROWN, M., DODSON, E., VEALE, K. & BANATI, R. B. 2014. The 18

kDa translocator protein, microglia and neuroinflammation. Brain Pathol, 24, 631-53.

LIU, Y. R., CARDAMONE, L., HOGAN, R. E., GREGOIRE, M. C., WILLIAMS, J. P., HICKS,

R. J., BINNS, D., KOE, A., JONES, N. C., MYERS, D. E., O'BRIEN, T. J. &

BOUILLERET, V. 2010. Progressive metabolic and structural cerebral perturbations

after traumatic brain injury: an in vivo imaging study in the rat. J Nucl Med, 51, 1788-

95.

LUSARDI, T. A., AKULA, K. K., COFFMAN, S. Q., RUSKIN, D., MASINO, S. A. & BOISON,

D. 2015. Ketogenic Diet Prevents Epileptogenesis and Disease Progression in Adult

Mice and Rats. Neuropharmacology, 6, 30053-8.





MARSH, E. B., FREEMAN, J. M., KOSSOFF, E. H., VINING, E. P., RUBENSTEIN, J. E.,

PYZIK, P. L. & HEMINGWAY, C. 2006. The outcome of children with intractable

5 Manuskripte

166

seizures: a 3- to 6-year follow-up of 67 children who remained on the ketogenic diet

less than one year. Epilepsia, 47, 425-30.

MILDER, J. B., LIANG, L. P. & PATEL, M. 2010. Acute oxidative stress and systemic Nrf2

activation by the ketogenic diet. Neurobiol Dis, 40, 238-44.





MULLER-SCHWARZE, A. B., TANDON, P., LIU, Z., YANG, Y., HOLMES, G. L. &

STAFSTROM, C. E. 1999. Ketogenic diet reduces spontaneous seizures and mossy

fiber sprouting in the kainic acid model. Neuroreport, 10, 1517-22.

PIFFERI, F., TREMBLAY, S., CROTEAU, E., FORTIER, M., TREMBLAY-MERCIER, J.,

LECOMTE, R. & CUNNANE, S. C. 2011. Mild experimental ketosis increases brain

uptake of 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose: a dual-tracer PET imaging

study in rats. Nutr Neurosci, 14, 51-8.

RIBAN, V., BOUILLERET, V., PHAM-LE, B. T., FRITSCHY, J. M., MARESCAUX, C. &

DEPAULIS, A. 2002. Evolution of hippocampal epileptic activity during the

development of hippocampal sclerosis in a mouse model of temporal lobe epilepsy.


ROY, M., NUGENT, S., TREMBLAY-MERCIER, J., TREMBLAY, S., COURCHESNE-

LOYER, A., BEAUDOIN, J. F., TREMBLAY, L., DESCOTEAUX, M., LECOMTE, R. &

CUNNANE, S. C. 2012. The ketogenic diet increases brain glucose and ketone

uptake in aged rats: a dual tracer PET and volumetric MRI study. Brain Res, 1488,

14-23.

SAMALA, R., WILLIS, S. & BORGES, K. 2008. Anticonvulsant profile of a balanced

ketogenic diet in acute mouse seizure models. Epilepsy Research, 81, 119-127.

SCHOELER, N. E. & CROSS, J. H. 2016. Ketogenic dietary therapies in adults with epilepsy:

a practical guide. Pract Neurol, 16, 208-14.

SCHOEMAKER, H., MORELLI, M., DESHMUKH, P. & YAMAMURA, H. I. 1982. [3H]Ro5-

4864 benzodiazepine binding in the kainate lesioned striatum and Huntington's

diseased basal ganglia. Brain Res, 248, 396-401.

STAMBOULIAN-PLATEL, S., LEGENDRE, A., CHABROL, T., PLATEL, J. C., PERNOT, F.,

DUVEAU, V., ROUCARD, C., BAUDRY, M. & DEPAULIS, A. 2016. Activation of

5 Manuskripte

167

GABAA receptors controls mesiotemporal lobe epilepsy despite changes in chloride

transporters expression: In vivo and in silico approach. Exp Neurol, 284, 11-28.

STENGER, E., SCHAEFFER, M., CANCES, C., MOTTE, J., AUVIN, S., VILLE, D.,

MAUREY, H., NABBOUT, R. & DE SAINT-MARTIN, A. 2017. Efficacy of a ketogenic

diet in resistant myoclono-astatic epilepsy: A French multicenter retrospective study.


SUZUKI, F., JUNIER, M. P., GUILHEM, D., SORENSEN, J. C. & ONTENIENTE, B. 1995.

Morphogenetic effect of kainate on adult hippocampal neurons associated with a

prolonged expression of brain-derived neurotrophic factor. Neuroscience, 64, 665-74.

THEODORE, W. H., KELLEY, K., TOCZEK, M. T. & GAILLARD, W. D. 2004. Epilepsy

duration, febrile seizures, and cerebral glucose metabolism. Epilepsia, 45, 276-9.





TODOROVA, M. T., TANDON, P., MADORE, R. A., STAFSTROM, C. E. & SEYFRIED, T. N.

2000. The ketogenic diet inhibits epileptogenesis in EL mice: a genetic model for

idiopathic epilepsy. Epilepsia, 41, 933-40.

TWELE, F., TÖLLNER, K., BANKSTAHL, M. & LÖSCHER, W. 2016a. The effects of

carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy

depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open, 1, 45-60.

TWELE, F., TÖLLNER, K., BRANDT, C. & LÖSCHER, W. 2016b. Significant effects of sex,

strain, and anesthesia in the intrahippocampal kainate mouse model of mesial

temporal lobe epilepsy. Epilepsy Behav, 55, 47-56.

VALLEZ GARCIA, D., OTTE, A., DIERCKX, R. A. & DOORDUIN, J. 2016. Three Month

Follow-Up of Rat Mild Traumatic Brain Injury: A Combined [18F]FDG and

[11C]PK11195 Positron Emission Study. J Neurotrauma, 33, 1855-1865.

VIVASH, L., GREGOIRE, M. C., BOUILLERET, V., BERARD, A., WIMBERLEY, C., BINNS,

D., ROSELT, P., KATSIFIS, A., MYERS, D. E., HICKS, R. J., O'BRIEN, T. J. &

DEDEURWAERDERE, S. 2014. In vivo measurement of hippocampal GABAA/cBZR

density with [18F]-flumazenil PET for the study of disease progression in an animal

model of temporal lobe epilepsy. Plos One, 9.

5 Manuskripte

168

YE, F., LI, X. J., JIANG, W. L., SUN, H. B. & LIU, J. 2015. Efficacy of and patient compliance

with a ketogenic diet in adults with intractable epilepsy: a meta-analysis. J Clin

Neurol, 11, 26-31.

ZARNOWSKA, I., LUSZCZKI, J. J., ZARNOWSKI, T., WLAZ, P., CZUCZWAR, S. J. &

GASIOR, M. 2016. Proconvulsant effects of the ketogenic diet in electroshock-

induced seizures in mice. Metab Brain Dis, 20, 20.




ZHANG, Y., WANG, Y., ZHOU, Y., ZHANG, L., YU, L. & ZHOU, S. 2016. Therapeutic effects

of the ketogenic diet in children with Lennox-Gastaut syndrome. Epilepsy Res, 128,

176-180.

6 Diskussion

169

6 Diskussion

6.1 Reflexion zur Methodik der Arbeit

Kleintierbildgebung mit PET – Auflösungsvermögen und Translationalität

Die Kleintierbildgebung mit PET bietet die Möglichkeit, Stoffwechselgeschehen in vivo

zu untersuchen. Im Hinblick auf die Epilepsieforschung bietet das die Möglichkeit, die

komplette Epileptogenese und die chronische Phase longitudinal in einem Tier zu

untersuchen, was einen enormen Vorteil gegenüber Studien mit histologischen,

immunhistochemischen oder autoradiographischen Untersuchungen darstellt. Dies ist

im Sinne des Tierschutzes (3R-Konzept), da weniger Versuchstiere benötigt werden

(Bankstahl und Bankstahl, 2012). Als Aufnahmeprotokolle sind statische Akquisitionen

mit Injektion des Radiotracers vor Beginn des eigentlichen PET-Scans möglich oder

dynamische mit gleichzeitiger Injektion des Radiotracers zum Start des PET-Scans.

Letzteres bietet die Möglichkeit, ein kinetisches Modeling der erhaltenen PET-Daten

durchzuführen, um Aussagen über die Kinetik des Tracers im Tierkörper treffen zu

können. Das Auflösungsvermögen des in dieser Arbeit verwendeten PET-Scanners,

ein Siemens Inveon PET-CT, liegt bei 1,4 mm FWHM für die PET-Komponente und

bei 40 µm für die CT-Komponente, die die CT-Bilder für die Koregistrierung der PET-

Daten liefert. Bei diesen Größenordnungen gestalten sich Untersuchungen in Ratten

weniger herausfordernd als in Mäusen, wobei letztere dennoch unersetzlich sind, auch

im Hinblick auf mögliche Speziesunterschiede. Der Aspekt der Translationalität dieser

Methodik liegt auf der Hand: Allgemein können Radiotracer nach der präklinischen

Evaluierung weiter klinisch getestet werden und bereits zugelassene Radiotracer

können präklinisch für weitere Anwendungsgebiete getestet werden. In Bezug auf die

vorliegende Arbeit wurde zum Beispiel das klinisch für Anwendung in der

prächirurgischen Evaluierung bei Epilepsie etablierte [18F]FDG (Capraz et al., 2015)

zur Untersuchung der Epileptogenese und ihrer Beeinflussung durch die beiden

Therapieansätze 2-DG und ketogene Diät untersucht.

6 Diskussion

170

Tiermodelle

Als Modell zur Imitation einer Epileptogenese wurde in der ersten Studie das korneale

Kindlingmodell der Maus gewählt. Eine zugrundeliegende Stimulusfrequenz von sechs

Hertz wurde verwendet, weil sie als tierschonend (Leclercq et al., 2014) und bezüglich

der Effektivität der zuvor verwendeten Stimulusfrequenz von 50 Hertz (Matagne et al.,

2008, Matagne und Klitgaard, 1998, Potschka und Löscher, 1999, Willis et al., 2010,

Rowley und White, 2010) als ebenbürtig beschrieben wurde. Die hiesigen

Untersuchungen bestätigen dies. Die im Mittel schon recht stark ausgeprägte

Anfallsantwort auf den ersten Kindlingstimulus sowie die schnelle Kindling-

Progression in unserer Studie erschweren allerdings die Interpretation der Ergebnisse.

Ersteres wurde möglicherweise durch den anderen Herkunftsort der männlichen

NMRI-Mäuse als in der Erstbeschreibung des Modells verursacht (Charles River

Deutschland anstatt Charles River Frankreich). Die schnelle Kindlingprogression wie

auch das Ergebnis stehen im Einklang mit dem schon beschriebenen Kindlingverlauf

und der verminderten Wirksamkeit von Antiepileptika in diesem Tiermodell (Leclercq

et al., 2014). Die Versuche wurden in dieser Erwartung, die Wirkung von 2-DG in einem

Modell für pharmakoresistente Epilepsie zu untersuchen, durchgeführt. Außerdem

wird das korneale Kindling als ein Modell betrachtet, das die Charakteristika humaner

partieller Epilepsie mit einem ähnlichen pharmakologischen Profil gut wiederspiegelt

(Rowley und White, 2010).

Neben dem kornealen Kindlingmodell wurde in dieser Arbeit das

intrahippokampale Kainat-Modell der Maus für Temporallappenepilepsie verwendet.

Dieses zeichnet sich sowohl durch einen auch im Patienten vorkommenden Epilepsie

auslösenden Gehirninsult, den Status epilepticus, als auch durch pathohistologische

Parallelen zur Temporallappenepilepsie im Patienten aus (Duveau et al., 2016,

Houser, 1990). Hingegen wurde im kornealen Kindlingmodell bisher (wie auch durch

die vorliegenden Daten bestätigt) keinerlei Neurodegeneration beschrieben (Loewen

et al., 2016). Das intrahippokampale Kainatmodell wie auch das korneale

Kindlingmodell sind Modelle für pharmakoresistente Epilepsie (Klein et al., 2015a,

Klein et al., 2015b). Die elektroenzephalographischen Muster der im

intrahippokampalen Kainatmodell auftretenden spontanen rekurrierenden Anfälle und

6 Diskussion

171

anfallsähnlicher Ereignisse sind den durch Tiefenelektroden im Patienten messbaren

Entladungen ähnlich (Stamboulian-Platel et al., 2016).

Behandlungszeiträume während der Epileptogenese

Im kornealen Kindlingmodell wurde während der Kindling-Progression behandelt, also

während der imitierten Epileptogenese. Der erste Behandlungszeitpunkt wurde

festgelegt auf 18 – 20 Stunden vor der ersten PET-Untersuchung, um auch den

Baseline-Scan in dem definierten Abstand zu einer vorherigen Behandlung

durchzuführen und Effekte einer einmaligen Gabe von 2-DG auf den

Glukosestoffwechsel zu untersuchen. Die Tiere wurden nach dieser Untersuchung

zusammen am Abend desselben Tages zum ersten Mal korneal stimuliert.

Infolgedessen lag zwischen Behandlung und Kindlingstimulus eine Zeitspanne von

über 24 Stunden. Zur Pharmakokinetik von 2-DG gibt es wenige Studien. Im Menschen

wird eine Halbwertszeit zur Elimination von etwa fünf Stunden beschrieben, bei einer

Dosis von 60mg/kg und einer maximalen Plasmakonzentration nach einer Stunde

(Gounder et al., 2012, Raez et al., 2013), ohne Akkumulation. Bei Ratten wird ein

biphasischer Abfall der 2-DG-Konzentration im Blut gezeigt (Umegae et al., 1990).

Nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg liegt die Serumkonzentration von 2-DG

nach fünf Stunden nur noch bei 0,2 µmol/ml Serum (kurz nach Injektion wurden 1,5

µmol/ml gemessen). Aufgrund dieser Daten und weiteren experimentellen

Dosierungen anderer Studien mit und ohne Effekt (siehe Abschnitt „Dosierung und

Verabreichungswege von 2-DG und ketogener Diät“) kann man auch trotz möglicher

Speziesunterschiede annehmen, dass hiermit kein direkter Einfluss auf den ersten

Kindlingstimulus erfolgte. Der Abstand zwischen Behandlung und PET-Untersuchung

beziehungsweise Kindlingstimulation wurde auch bei den folgenden zwei Zeitpunkten

beibehalten. Bei den übrigen Stimulationen erfolgte die Behandlung der Tiere bewusst

genau eine Minute nach jeder Einzelstimulation, da ein direkter antikonvulsiver Effekt

möglichst ausgeschlossen werden sollte.

Im intrahippokampalen Kainatmodell wurde die Behandlung in Form der

ketogenen Diät direkt im Anschluss an die Induktion des Status epilepticus begonnen.

Der Behandlungsbeginn wurde auch deshalb so gewählt, weil er im Patienten in dieser

6 Diskussion

172

Art durchführbar wäre. In diesem Modell wird für den nicht konvulsiven Status

epilepticus eine Länge von mehreren Stunden angegeben, eine Studie nennt bis zu

fünf Stunden (Bouilleret et al., 1999), eine andere etwa 18 Stunden (Twele et al.,

2016b). Diese Dauer wurde in der vorliegenden Arbeit nicht gesondert durch

elektroenzephalographische Überwachung geprüft. Die Tiere benötigten meist über

eine Stunde, um aus der Chloralhydrat-Narkose nach der Kainat-Mikroinjektion wieder

zu erwachen. Bis zur ersten, sehr kurzen Futteraufnahme mit wenigen Bissen

(ketogene Diät beziehungsweise Standarddiät in Brei- und Pellettform) vergingen

zumeist weitere Stunden. Die Aufnahme an ketogener Diät lag am ersten

Fütterungstag durchschnittlich bei 1,8 g pro Tier (das Fressen fand nachts statt,

tagsüber waren nur minimale Zahnspuren am Futter erkennbar) und nicht bei 3,4 g wie

in den folgenden Tagen, nachdem sich die Tiere an das Futter gewöhnt hatten.

Zugleich gab es keine signifikanten Unterschiede im Gewichtsverlust zwischen den

unterschiedlichen Tiergruppen, der auf die Operation folgte. Also lässt sich davon

ausgehen, dass eine direkte Beeinflussung des Gehirninsultes durch die ketogene Diät

minimal ist. Der Behandlungszeitraum von vier Wochen wurde festgelegt auf Grund

der bestehenden Daten zum intrahippokampalen Kainat-Modell. Es wird allgemein

davon ausgegangen, dass spontane rekurrierende Anfälle im Falle einer

anschließenden Epileptogenese nach dieser Zeit zuverlässig auftreten und somit die

Epileptogenese weitestgehend fortgeschritten ist (Riban et al., 2002, Kralic et al., 2005,

Maroso et al., 2011). Eine bestehende Epilepsie zu behandeln, war nicht Ziel der

Arbeit.

Dosierung und Verabreichungswege von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät

Zur Dosisfindung für die Verabreichung von 2-DG wurden andere Studien

herangezogen. Es gibt mehrere Publikationen, in denen 2-DG bei der Ratte während

des Kindlings über den Tractus perforans eingesetzt wurde (Stafstrom et al., 2009,

Garriga-Canut et al., 2006, Sutula und Franzoso, 2008). Hier wurden akut

antikonvulsive Wirkungen mit einer Dosis von 250 mg/kg gesehen. Andere Studien in

weiteren Tiermodellen, auch in der Maus, legen ebenfalls diese Dosierung nahe. Es

wurden antikonvulsive Effekte gefunden in Fring’s Mäusen und im 6 Hz-Modell bei der

6 Diskussion

173

Maus (Stafstrom et al., 2009, Gasior et al., 2010), im Maus-Pilocarpinmodell (Yang et

al., 2013) und im Pilocarpinmodell in Ratten und bei Pentylentetrazol-Injektion in

Ratten (Lian et al., 2007). Laut diesen Studien scheint eine zweimal tägliche Gabe von

2-DG angebracht zu sein. Es traten jeweils keine besonderen unerwünschten

Wirkungen bei Anwendung dieser Dosierung in den Tieren auf. Im Hinblick auf eine

mögliche Übertragbarkeit auf den Menschen lässt sich eine Dosis-Eskalationsstudie

nennen, die eine oral verabreichte Dosis von bis zu 250 mg/kg als sicher eingestuft

hat (Singh et al., 2005).

EEG- und Video-Monitoring

Das intrahippokampale Kainatmodell wurde bezüglich des Vorkommens spontaner

rekurrierender Anfälle und den elektroenzephalographisch nachweisbaren

anfallsähnlichen Entladungen mit Subtypenunterscheidung bisher recht gut

charakterisiert und bietet somit mit der Ableitung eines Elektroenzephalogramms eine

gute Möglichkeit, Effekte einer zu untersuchenden Therapiestrategie nicht nur im

Hinblick auf klinisch sichtbare Anfälle, sondern auch auf abnorme elektrische

Entladungen auszuwerten. Bei den chronisch auftretenden elektroenzephalographisch

sichtbaren anfallsähnlichen Entladungen (Bouilleret et al., 1999) wurde in der

vorliegenden Arbeit zwischen High Voltage Sharp Waves (HVSW), Mixed Events (ME)

und Hippocampal Paroxysmal Discharges (HPD) unterschieden, wie anderweitig

schon beschrieben (Heinrich et al., 2011, Riban et al., 2002, Arabadzisz et al., 2005,

Maroso et al., 2011, Twele et al., 2016a). Die in der Veröffentlichung von Twele et al.

beschriebenen Unterscheidungskriterien der Ereignistypen wurden verwendet. Ein

Vorteil dieser strikten Kriterien zur Beschreibung der Ereignisse und damit zur

Auswertung eines Elektroenzephalogramms liegt in der weitgehenden Objektivierung

des manuellen Analysevorganges. Nachteilig ist allerdings eine hohe Zeitintensivität

der Auswertung nach dieser Methodik. Daher wurden für diese Arbeit pro Tier und

Aufnahme-Tag jeweils vier zuvor zeitlich festgelegte, gleichmäßig über den Tag

verteilte, Stunden der EEG-Aufnahme detailliert analysiert. Das gesamte EEG-

Material (bis auf die für die Tiere notwendigen Unterbrechungen von etwa zwei Tagen

über jeweils zwei bis drei Tage ununterbrochen aufgenommen) wurde mit dem Ziel der

6 Diskussion

174

Erfassung und Klassifizierung der sekundären generalisierenden Anfälle gesichtet. Zur

Anfallsklassifizierung auf der Grundlage der ursprünglichen Beschreibung von R. J.

Racine (Racine, 1972) ist die parallele Video-Überwachung der Tiere unerlässlich.

Automatisierte EEG-Auswertungsverfahren, die abstrahierte Merkmale wie

beispielsweise die Signallinienlänge nach Wavelet-Zerlegung (Bergstrom et al., 2013)

oder Kontinuierliche Wavelet-Transformation in Kombination mit einer adaptierten

Mother Wavelet (Tieng et al., 2016) nutzen, erkennen zuverlässig Abnormalitäten im

EEG, klassifizieren diese aber nicht. Es kommt dabei leicht zu falsch-positiven oder

falsch-negativen Ergebnissen. Bei der Auswertung der Daten für das dritte Manuskript

wurde Wert daraufgelegt, den Zugang zu allen analysierbaren Informationen über

potentielle Auswirkungen der ketogenen Diät und der Epileptogenese auf einzelne

Muster im EEG wie die untersuchten High Voltage Sharp Waves, Mixed Events und

Hippocampal Paroxysmal Discharges nicht zu verlieren.

6.2 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen während der Epileptogenese

6.2.1 [18F]FDG-PET-Daten aus zwei Tiermodellen

Untersuchungen mit [18F]FDG-PET im kornealen Kindlingmodell wurden bisher nicht

publiziert. Die Untersuchungen zum kornealen Kindlingmodell, beschrieben im ersten

Manuskript, zeigen, dass in den [18F]FDG-PET-Daten keine Anhaltspunkte für eine

Beeinflussung des interiktalen Glukosestoffwechsels durch die Epileptogenese

vorhanden sind. Weder die Quantifizierung des Tracer-Uptake, noch die beiden

Parameter MRGlu und Ki aus dem [18F]FDG-2-Tissue Compartiment Model führen im

Laufe der drei PET-Untersuchungszeitpunkte zu veränderten Werten. Diese Befunde

passen zu einer Autoradiographie-Studie mit [14C]2-DG in einem Rattenmodell für ein

schnelles Kindling innerhalb weniger Stunden (Lothman et al., 1985), bei der interiktal

der Glukosemetabolismus nicht erkennbar verändert war, wohl aber iktal. Vollständig

über die Amygdala gekindelte Ratten zeigten ebenfalls interiktal keine Unterschiede

im Glukosemetabolismus verglichen mit Tieren, die nur eine Elektrode implantiert

hatten (Blackwood et al., 1981), was darauf hindeutet, dass die Anfälle selbst

entscheidend für Veränderungen sind. Daten aus konventionellen Kindlingmodellen

6 Diskussion

175

sind allerdings nur bedingt mit dem kornealen Kindling vergleichbar, unter anderem da

in letzterem die Fluoro-Jade-Färbung keinerlei neuronale Schädigung offenbarte

(siehe erstes Manuskript) und da im kornealen Kindling keine implantierten Elektroden

vorhanden sind, wodurch es nicht invasiv ist. Im Patienten mit

Temporallappenepilepsie zeigt sich dagegen mit der [18F]FDG-PET bei fast 20 % der

Kinder und bei bis zu 50 % der Erwachsenen mit kürzlich begonnenem Anfallsauftreten

ein Hypometabolismus (Stefan und Theodore, 2012), wohingegen subklinische Anfälle

oder interiktale Spikes mit einem Hypermetabolismus assoziiert sind.

Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) hingegen fand

sich in der chronischen Phase der Epilepsie ein globaler Hypometabolismus, der auch

schon nach vier Wochen zugegen war, also einem Zeitpunkt, an dem in diesem Modell

spontane rekurrierende Anfälle auftreten (Twele et al., 2016b). Somit liegen beide

Untersuchungszeitpunkte bereits hinter der eigentlichen Epileptogenese, wobei auch

das größte Ausmaß neuronaler Schädigung bereits einen Monat nach der

Kainatinjektion zu erwarten ist (Bouilleret et al., 1999). Die MRGlu-Werte (Glucose

Metabolic Rate) sind hier dem Tracer-Uptake-Verhalten entsprechend verändert,

wohingegen die Ki-Werte (Influx-Konstante) weitestgehend unverändert bleiben. Die

Formeln zur Berechnung beider Parameter enthalten zwar die drei

Transportkonstanten (K1 und k2 für den Transport aus dem Blut in das Gewebe bzw.

zurück und k3 für die Phosphorylierung von [18F]FDG), in die Berechnung von MRGlu

fließen aber noch zusätzlich die arterielle Plasmakonzentration und eine weitere

Konstante, die sogenannte Lumped Constant (LC) zur Beschreibung der Unterschiede

zwischen [18F]FDG und Glukose ein (Alf et al., 2013). In der statistischen

Untersuchung der Glukosekonzentrationen im Blut waren signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen oder den Zeitpunkten nicht erkennbar, außer einer höheren

Blutglukosekonzentration zwei Wochen nach der Mikroinjektion in der Gruppe mit

ketogener Diät im Vergleich zur Standarddiät. Dennoch werden diese Ergebnisse für

die MRGlu erhalten, da jede Glukosemessung als Faktor in die Formel einfließt, der

durch dieselbe LC dividiert wird (Alf et al., 2013). Nach diesem kinetischen Modell

scheint also der Glukosetransport weitgehend unverändert. In der Literatur findet sich

eine autoradiographische Untersuchung mit [14C]2-DG im intrahippokampalen

6 Diskussion

176

Kainatmodell, die hypermetabole Veränderungen ipsilateral im Hippokampus (nicht

kontralateral) beschreibt, beginnend während des Status epilepticus bis zu 30 Tagen

danach (Bouilleret et al., 1999). Nach 120 Tagen fanden sich hippokampale fokale

hypo- oder hypermetabolische Veränderungen unabhängig von der Läsionsgröße und

ein Hypermetabolismus in den thalamischen Kernen. Zum Zeitpunkt 30 Tage nach

Kainatinjektion war der Glukosestoffwechsel, gemessen durch die [14C]2-DG-Technik

zur Berechnung des lokalen zerebralen Glukoseverbrauchs (LCMRglc), im

ipsiliateralen entorhinalen Cortex und partiell im Thalamus vermindert, was sich

chronisch nach 120 Tagen auch bilateral auf die zentrale Amygdala ausdehnte

(Bouilleret et al., 2000). Zwar wurde in der vorliegenden Arbeit dieselbe Kainatdosis

verwendet wie bei diesen Autoren, nicht aber Swiss Albino-Mäuse. Dies könnte

zusammen mit der Beobachtung, dass in diesem Mausstamm keine anfallsfreie

Latenzzeit auftrat, was beim Kainatmodell mit männlichen NMRI-Mäusen aber der Fall

ist (Twele et al., 2016b), die etwas abweichenden Ergebnisse bezüglich der

Ausdehnung der hypometabolischen Areale erklären. Diese war deutlich begrenzter

als in unseren Ergebnissen aus der [18F]FDG-PET-Studie. Auch die andere Anästhesie

während der Kainatinjektion wäre eine mögliche Erklärung. Allerdings könnte man

auch die Hypothese aufstellen, das [18F]FDG Veränderungen im Glukosestoffwechsel

sensibler erfasst als [14C]-2-DG, da eine Arbeitsgruppe für [18F]FDG in vitro eine

deutlich bessere Glykolyseinhibition beobachtete als für 2-DG (Lampidis et al., 2006).

Eine präoperative [18F]FDG-PET-Studie in Patienten mit mesialer

Temporallappenepilepsie fand zumeist einen Hypometabolismus im mesialen und

lateralen Temporallappen, wie auch im Thalamus, in einzelnen Patienten auch weiter

ausgedehnt (Henry et al., 1994).

Nicht in die drei Manuskripte eingeschlossene Daten aus einem Versuch im

intrahippokampalen Kainatmodell mit multiplen [18F]FDG-PET-Untersuchungen

zeigen chronisch zum Zeitpunkt sieben Wochen keinen Hypometabolismus, sondern

in einzelnen Regionen wie dem ventralen Hippokampus sogar einen

Hypermetabolismus (siehe Anhang). Allerdings wurde chronisch in der schon oben

erwähnten Studie nach 120 Tagen auch teilweise ein Hypermetabolismus gesehen

(Bouilleret et al., 2000). Eine mögliche Erklärung für dieses abweichende Ergebnis

6 Diskussion

177

innerhalb der Untersuchungen zu dieser Dissertationsarbeit stellt die Art der Narkose

während der Induktion des Status epilepticus dar, die in den vorbereitenden

Untersuchungen mit Isofluran anstatt Chloralhydrat durchgeführt wurde. Während die

Chloralhydratnarkose deutlich über das Ende der Operation hinaus wirkte, waren die

Tiere nach der Isoflurannarkose schnell wiedererwacht. Es ist beobachtet worden,

dass der Status epilepticus mit Isoflurannarkose schwerer ausfällt und es zu einer

verkürzten Latenzzeit kommen kann (Twele et al., 2016b). Inwiefern dies sich auf die

chronische Phase der Epilepsie im Vergleich zum Chloralhydrat-Einsatz auswirkt, ist

noch offen. Im Hinblick auf das intrahippokampale Kainatmodell lässt sich

offensichtlich nicht von Ergebnissen in Ratten auf mögliche Ergebnisse in Mäusen

extrapolieren, da Studien zeigen konnten, dass Isofluran Ratten vor einer

Epileptogenese nach Kainatinjektion bewahren kann (Bar-Klein et al., 2016, Klee et

al., 2017) und sich bei Ratten andere elektroenzephalographische Muster sowie

Anfallsfrequenzen finden (Klee et al., 2017).

6.2.2 Befunde zum Kontext der Epileptogenese

Die Untersuchungen im Pilocarpin-Modell zur neurovaskulären Einheit (zweites

Manuskript) zeigen in den MRT-Ergebnissen mit Gadolinium-DTPA eine erhöhte

Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zwei Tage und in geringerem Maße vier und

10 Tage nach Status epilepticus. Das für die Untersuchungen in vivo verwendete MRT-

Protokoll zeigte sich zuvor im Vergleich mit [68Ga]DTPA-PET und [99mTc]DTPA-SPECT

vorteilhaft (Breuer et al., 2016), weshalb es hier eingesetzt wurde.

Kontrastmittelverstärkte MRT zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke wurde auch in

einer anderen Studie in Ratten, allerdings mit systemischer Kainatgabe, eingesetzt

(van Vliet et al., 2016). Hier zeigte sich schon einen Tag nach Status epilepticus eine

erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke in Bereichen des Cortex und

Temporallappens, die zum Teil auch noch nach sechs Wochen durch eine ähnlich

starke Kontrastmittelextravasation sichtbar war. Dieser chronische Befund könnte

durch das Tiermodell verursacht sein, der akute Befund weist in dieselbe Richtung wie

bei unseren Daten im Pilocarpinmodell.

6 Diskussion

178

Immunhistochemisch wurde eine FITC-Albumin-Extravasation schon fünf Stunden

nach dem Gehirninsult gefunden, mit einer maximalen Ausprägung nach 24 Stunden,

die nach 48 Stunden wieder weniger stark vorhanden war. Diese Befunde scheinen

nur im Zusammenhang mit der Entwicklung eines Status epilepticus vorzukommen

und daher nicht durch Pilocarpin an sich verursacht zu sein, da keines der Tiere ohne

Status epilepticus eine FITC-Albumin-Extravasation zeigte. Pilocarpin selbst zeigt

systemisch eine proinflammatorische Wirkung, es führt zu einer erhöhten

Konzentration an IL-1ß und einer Verminderung des Verhältnisses von CD4- zu CD8-

T-Zellen (Marchi et al., 2007b). Die beobachtete Durchlässigkeit der Blut-Hirn-

Schranke nach zwei und zehn Tagen entspricht den Ergebnissen einer Studie mit IgG-

Anfärbung im Pilocarpinmodell (Ndode-Ekane et al., 2010) und einer mit Evans Blue

und Albumin in einem elektrisch induzierten Modell für Status epileptus in Ratten (van

Vliet et al., 2007). Die histologische Untersuchung verdeutlicht, dass ein negatives

MRT-Ergebnis nach einem Gehirninsult eine geringgradige Störung der Blut-Hirn-

Schranke nicht ausschließt.

Ödematöse Veränderungen waren in den entsprechenden Gehirnregionen

ebenfalls an Tag zwei in der T2-gewichteten Sequenz sichtbar, die an Tag vier wieder

abnahmen und schließlich an Tag 10 nicht mehr nachweisbar waren. Dieser

Zeitverlauf ähnelt den Befunden zur gesteigerten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke

aus den kontrastmittelverstärkten T1-gewichteten MRT-Untersuchungen, wobei die

Veränderungen schon früher wieder abklingen. Ein ähnlicher Verlauf von ödematösen

Veränderungen wurde von Roch et al. (2002a) gefunden. Unsere Ergebnisse

entsprechen auch einer weiteren Studie im Pilocarpinmodell, die ebenso an Tag zwei

das Maximum der Veränderungen in T1- und T2-gewichteten MRT-Aufnahmen fand

(Choy et al., 2010), wobei die Höhe dieser Veränderungen am zweiten Tag mit der

späteren Hippokampus-Volumenänderung in Zusammenhang stand. Dies wurde auch

von Duffy et al. (2014) bestätigt. Klinische Daten von Kindern nach Status epilepticus

(Scott et al., 2002) bzw. langen fokalen Fieberanfällen (VanLandingham et al., 1998)

zeigen ebenfalls diesen Zeitverlauf für Ödembildung.

In der anschließenden erweiterten histologischen Untersuchung zeigten FITC-

Albumin-positive Areale im Thalamus einen Anstieg an Kollagen IV-Expression als

6 Diskussion

179

Marker für Basalmembranen, die teilweise im Zusammenhang mit STL-gefärbten

Endothelzellen standen. Sonst war das Muster der STL-Immunreaktivität sehr

gleichmäßig. In den vom Status epilepticus betroffenen Regionen war die STL-

Färbung entweder unverändert oder verringert, während Laminin, ein Marker für die

vaskuläre Basalmembran des Endothels, auch vermindert zu sein schien. Da die

Menge an Kollagen IV anstieg, sprechen diese Veränderungen für einen wieder

stabilisierenden Umbau der neurovaskulären Einheit zwei Tage nach Status

epilepticus. Kollagen IV hat stabilisierende Eigenschaften für die Blut-Hirn-Schranke

(Dyrna et al., 2013) und wurde auch in einem Modell für Schlaganfall als vermehrt

exprimiert beschrieben (Hawkes et al., 2013). Aquaporin 4 als Marker für astrozytäre

Endfüßchen war in Arealen mit intrazellulärer FITC-Albumin-Aufnahme reduziert,

ebenso GFAP als Marker für intermediäre Filamente in Astrozyten. Dies spricht für

eine geschwächte Vermittlung von Astrozyten zwischen Endothelzellen und

Neuronen. In den Arealen mit FITC-Albumin-Aufnahme waren vereinzelt sowohl

aktivierte Microglia, als auch T-Zellen mit intrazellulärer FITC-Aufnahme nachweisbar.

FITC-Albumin zeigte keine Kolokalisation mit den drei astrozytären Markern GFAP,

S100ß und Aquaporin 4. In einer anderen Studie mit Ratten nach elektrisch

induziertem Status epilepticus konnte Albumin dagegen immunhistochemisch auch in

Astrozyten nachgewiesen werden (van Vliet et al., 2007). In einer weiteren Studie mit

direkter Albumin-Exposition von Gehirnschnitten in vitro konnte auch Albumin-

Aufnahme in Astrozyten gezeigt werden (Ivens et al., 2007), ebenso nach Exposition

gegenüber mit Alexa 488 markiertem bovinen Serumalbumin (Bar-Klein et al., 2014).

Allerdings fand auch eine Studie keine nachweisbare Aufnahme von FITC-Albumin in

GFAP-positiven Astrozyten, wohl aber eine gesteigerte IL-1ß-Produktion derer

(Frigerio et al., 2012). Methodische Ursachen wie das verwendete Tier- oder In-vitro-

Modell oder die Art der Albuminmarkierung wären denkbar. Für die intrazelluläre

Aufnahme von Albumin nach Schädigung der Blut-Hirn-Schranke in Neuronen scheint

eine beeinträchtigte Umgebung wichtig zu sein, da im Gegensatz zu einer

Untersuchung mit osmotischer Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke und

resultierender akuter Anfallsaktivität im Schwein (Marchi et al., 2007a) Studien mit

direkter FITC-Albumin-Exposition von kortikalem Gewebeschnitten aus naiven Ratten

6 Diskussion

180

oder mit Infusion von Albumin in den lateralen Ventrikel in naiven Mäusen über 72

Stunden keine Aufnahme von Albumin in Neuronen zeigte (Ivens et al., 2007,

Weissberg et al., 2015).

Eine Neurodegeneration war bei den Untersuchungen zur Blut-Hirn-Schranke

nach 24 Stunden zunächst in der Amygdala und im piriformen wie im entorhinalen

Cortex zu sehen, wobei Pyramidenzellen in der CA3c und Interneuronen des Hilus

nach 48 Stunden signifikant verringert waren. FITC-Albumin-positive Zellen mit

deutlicher neuronaler Morphologie waren nur zu einem geringen Anteil zugleich NeuN-

positiv. Ein Verlust der NeuN-Immunreaktivität zeigt nicht zwingend eine zerstörte

Kernmembran an, wie im Falle einer Studie nach einem ischämischen Gehirninsult

beschrieben (Ünal-Cevik et al., 2004), wobei aber von verletzten Neuronen

ausgegangen werden kann. Zellen mit neuronaler Morphologie und FITC-Albumin-

Aufnahme zeigten stellenweise eine Kolokalisation mit Laminin. Diese Kolokalisation

von Neuronen mit der Basalmembran der Blut-Hirn-Schranke lässt sich als Folge der

beschädigten Morphologie der neurovaskulären Einheit infolge von

Neurodegeneration interpretieren. Die Daten zeigen, dass auf eine Schädigung der

Blut-Hirn-Schranke schon früh nach einem Gehirninsult die Degeneration der

neurovaskulären Einheit folgt. Diese Vorgänge sind nach aktuellem Wissenstand

wichtige auslösende Faktoren für eine Epileptogenese. So wurde in der Studie von

van Vliet et al. (2007) gezeigt, dass die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke mit der

Anfallsfrequenz korreliert, wobei eine Öffnung der Blut-Hirn-Schranke mit Mannitol

selbst Anfälle hervorrufen kann. Ein möglicher Mechanismus hierfür wurde

beschrieben (Ivens et al., 2007): eine über TGF-ß-Rezeptoren vermittelte Aufnahme

von Albumin in Astrozyten induziert eine Herabregulierung von Kalium-Kanälen (Kir

4.1), wodurch extrazelluläres Kalium aktivitätsabhängig nicht mehr genügend gepuffert

werden kann und eine N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor-vermittelte neuronale

Hyperexzitabilität folgt. Eine weitere Untersuchung derselben Arbeitsgruppe zeigte

auch, das Albumin über die Bindung an TGF-ß-Rezeptoren diese Wirkung hat

(Cacheaux et al., 2009). Den Ergebnissen von Frigerio et al. (2012) zufolge scheint

eine intrazelluläre Aufnahme von Albumin nicht nötig für die Aktivierung der TGF-ß-

Signalkette mit folgenden Effekten auf die Kaliumkanäle. Die Aktivierung der TGF-ß-

6 Diskussion

181

Signalkette in Astrozyten führt außerdem zur exzitatorischen Synaptogenese, nicht zur

inhibitorischen (Weissberg et al., 2015). Eine gesteigerte neuronale Erregung bzw.

Anfallsgeschehen verbraucht verstärkt Glukose, was sich in einem iktal sichtbaren

Hypermetabolismus zeigt (Lothman und Collins, 1981). Dieser korreliert im Fall eines

Status epilepticus im Lithium-Pilocarpinmodell mit einer neuronalen Schädigung

(Fernandes et al., 1999). Die in der Immunhistochemie im Pilocarpinmodell gefundene

verminderte Kolokalisation von Markern für Astrozyten mit Arealen mit FITC-Albumin-

Extravasation könnte auch bedeuten, dass die Energieversorgung der Neuronen oder

auch das Recycling von Glutamat über das Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle (siehe

Abschnitt 2.2.3) beeinträchtigt sind.

Im kornealen Kindlingmodell (siehe erstes Manuskript) wurde in dieser Arbeit

keine Neurodegeneration gefunden, was im Hinblick auf die nur provoziert

auftretenden und kurzen Anfälle mit einer (klinischen) Dauer von meist deutlich unter

einer Minute zu erklären sein könnte. In der klinischen Praxis wird entsprechend einem

Konsensus der Task Force der Internationalen Liga gegen Epilepsie davon

ausgegangen, dass ab einer Anfallsdauer von fünf Minuten ein zu behandelnder

prolongierter Anfall vorliegt, der irreversible neuronale Schädigungen nach sich ziehen

könnte (Trinka et al., 2015). Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes

Manuskript) steht die histologische Untersuchung der Gehirne noch aus. Allerdings ist

beschrieben, dass im intrahippokampalen Kainat-Modell wie im Patienten eine

Neurodegeneration im ipsilateralen Hippokampus (Hilus des Gyrus dentatus, CA 1,

CA 3c), mit Verlust von Pyramidenzellen und Interneuronen, als Hippokampussklerose

bezeichnet, stattfindet (Suzuki et al., 1995, Bouilleret et al., 1999, Le Duigou et al.,

2005). Ebenso kommt es zu einer Dispersion von Körnerzellen (Heinrich et al., 2006)

und zum Sprießen von Moosfaser-Axonen im Gyrus dentatus (Bouilleret et al., 1999);

ipsilateral kommt es zu einer Astrozytenproliferation, wobei die Astrozyten

hauptsächlich zwischen den Körnerzellen liegen. Histopathologisch wird im

kontralateralen Hippokampus kein Unterschied zu einem mit einer Mikroinjektion von

physiologischer Kochsalz-Lösung behandelten Hippokampus festgestellt, bis auf das

mögliche Vorkommen von Moosfaserwachstum (Bouilleret et al., 1999), wobei eine

6 Diskussion

182

vorrübergehende Astrozyten- und Microgliaaktivierung ohne Neurodegeneration auch

kontralateral gefunden wurde (Pernot et al., 2011).

Eine Astrozytenaktivierung findet sich auch im kornealen Kindlingmodell mit

dem Stimulusparameter von 50 Hertz (Loewen et al., 2016), allerdings nicht begleitet

von einer Microgliaaktivierung, die in dem in dieser Dissertationsarbeit verwendeten

kornealen Kindling mit einer Stimulusfrequenz von sechs Hertz gefunden wurde. Für

dieses hinsichtlich der Astrozytenaktivierung und der fehlenden Neurodegeneration

pathohistologisch ähnlich erscheinende Kindling wurde bisher unseres Wissens nach

keine diese Eigenschaften beschreibende histologische Untersuchung publiziert. Für

eine Untersuchung von Folgen einer Blut-Hirn-Schranken-Störung sind sowohl das

Pilocarpin- als auch das Kainat-Modell geeignet. Eine Arbeit im Kainatmodell in

Mäusen zeigt eine verstärkte Angiogenese an Tag drei und fünf nach Status

epilepticus (Zhai et al., 2016). Dies wird auf einen gesteigerten Ablauf des Jagged1-

Signalweges in Astrozyten ab einem Tag nach Status epilepticus zurückgeführt, der

den Notch1-Pfad in Endothelzellen induziert. Allerdings wurde für das Pilocarpinmodell

zwei Tage nach Status epilepticus eine verminderte hippokampale Blutgefäßdichte mit

Anfärbung des Endothelial Barrier Antigen und des Rat Endothelial Cell Antigen 1

gemessen (Ndode-Ekane et al., 2010), was zu unseren Befunden bezüglich der

Ödembildung an Tag zwei und der verringerten STL- und Lamininimmunreaktivität

passt, die auf eine Zerstörung der Integrität von Blutgefäßen hindeuten. Die

verminderte Blutgefäßdichte erholte sich nach zwei Wochen wieder bis hin zu oder

über die Ausgangwerte hinaus, wobei die Zahl proliferierender Endothelzellen an Tag

vier nach Status epilepticus schon maximal war (Ndode-Ekane et al., 2010). Ebenfalls

im Pilocarpinmodell in Ratten wurde gezeigt, dass Astrozyten bald nach dem Status

epilepticus progressiv VEGF überexprimieren (Rigau et al., 2007), wobei VEGF

(Vascular Endothelial Growth Factor) mit dem Notch-Pfad in Verbindung steht (Liu et

al., 2003). In Gewebe aus dem Anfallsherd von Patienten mit Temporallappenepilepsie

wurde auch eine verstärkte VEGF-Expression gefunden, zusammen mit einer

erhöhten Dichte an Blutgefäßen (Rigau et al., 2007). Es stellt sich die Frage, ob dies

als eine Adaptation auf das Anfallsgeschehen hin geschieht, da ein erhöhter zerebraler

Blutfluss und Metabolismus iktal im Menschen (Fernandez et al., 2015, Ergun et al.,

6 Diskussion

183

2016, da Silva et al., 1997), wie auch in Tiermodellen beschrieben ist (Cornford et al.,

2000, Cremer et al., 1983, Makino et al., 1988). VEGF bewirkt allerdings durch seine

Hypoxie- oder Inflammations-bedingte Induktion über den VEGF-Rezeptor 2 von

Endothelzellen die Proteolyse der Basalmembran, Endothelzellproliferation und

Unterbrechung der Tight Junctions (Morin-Brureau et al., 2012). Als Randnotiz ist im

Zusammenhang mit Beobachtungen von Blutgefäßen zu sagen, dass wir mit bloßer

Betrachtung der indirekten Anfärbung der Blutgefäße durch die Glukosetransporter-1-

Färbung (in der Blut-Hirn-Schranke) im kornealen Kindlingmodell keine

Veränderungen in der Erscheinung der Gefäße zwischen naiven und vollständig

gekindelten Tieren finden konnten. Dies steht im Einklang mit den vorherigen

Ausführungen.

Der Status epilepticus im Pilocarpinmodell führt schon innerhalb weniger

Stunden zu einer Aktivierung von Microglia und Astrozyten mit folgender Interleukin

1ß-Expression (Ravizza et al., 2008), das in der benannten Studie als Marker für

Inflammation verwendet und als sehr stark exprimiert im Bereich der astrozytären

Endfüßchen in Arealen mit FITC-Albumin-Extravasation vorgefunden wurde. Das

Ausmaß des Entzündungsgeschehens wurde in dieser Arbeit für die Untersuchung der

Blut-Hirn-Schranke im Pilocarpinmodell nicht quantitativ oder im Verlauf erfasst.

Deutlich wurde allerdings, dass unterschiedlichste Zelltypen beteiligt waren.

Die Untersuchung von entzündlichen Vorgängen im Verlauf der Latenzphase in

Form von [18F]GE-180-PET-Untersuchungen war Teil der Untersuchungen im

intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript). Die [18F]GE-180-PET

zeigt die Ausprägung der TSPO-Expression an, wobei das Signal hauptsächlich mit

der Aktivierung von Microglia (Airas et al., 2015, Boutin et al., 2015, Brendel et al.,

2016, Dedeurwaerdere et al., 2012) bzw. Makrophagen (Benavides et al., 1990)

assoziiert ist, aber in geringerem Ausmaß auch mit Astrozytenaktivierung (Lavisse et

al., 2012), siehe auch Absatz 2.3.3. Die [18F]GE-180-PET zeigte im

intrahippokampalen Kainatmodell einen Anstieg des Tracer-Uptake im ipsilateralen

dorsalen Hippocampus an Tag 14 nach Status epilepticus, mit einem deutlichen

Unterschied auch gegenüber den Werten in der Sham-Gruppe. Im Vergleich mit einer

Arbeit mit subkutaner Kainatinjektion zeigt sich, dass dort mit [18F]PBR111-PET die

6 Diskussion

184

verstärkte TSPO-Expression erwartungsgemäß deutlich ausgedehnter in mehreren

Gehirnregionen zu finden war (Amhaoul et al., 2015). Allerdings ist der zeitliche Verlauf

ähnlich der vorliegenden Arbeit mit einem Maximum 14 Tage nach Status epilepticus.

Die Ergebnisse der [18F]PBR111-PET nach zwei und vier Wochen zur TSPO-

Expression korrelierten des Weiteren mit den Ergebnissen von chronisch

durchgeführten Tests zu Komorbiditäten, zudem konnte eine

Hauptkomponentenanalyse der PET-Daten aus der zweiten, nicht aber der vierten

Woche den Bereich der Häufigkeit der chronisch gezeigten spontanen Anfälle

vorhersagen (Bertoglio et al., 2017). Dies spricht ebenfalls dafür, dass dieses

Maximum der gezeigten Entzündung relevant für den späteren Krankheitsverlauf ist.

Die Ergebnisse aus dem Irwin-Test in unserer Studie konnten zu diesem Zeitpunkt

einen deutlichen Unterschied zwischen den Tieren nach Status epilepticus mit

Standarddiät im Vergleich zu den Sham-Tieren und auch den Tieren mit ketogener

Diät nach Status epilepticus ausmachen. Im Pilocarpinmodell in Ratten konnte schon

ab fünf bis sieben Tagen eine deutlich erhöhte TSPO-Expression mit PET dargestellt

werden, die in schwächerer Ausprägung auch noch drei Wochen später vorhanden

war (Yankam Njiwa et al., 2016a, Brackhan et al., 2016). In der Arbeit von Brackhan

et al. zeigte interessanterweise die autoradiographische Untersuchung mit [18F]GE-

180 nach 14 Tagen die stärkste Tracerbindung. Sowohl die Ergebnisse aus der

[18F]GE-180-Autoradiographie als auch die der [11C]PK11195-PET korrelierten gut mit

der histologisch nachgewiesenen Aktivierung von Microglia und Astrozyten. In beiden

Arbeiten wurde auch ein kinetisches Modeling durchgeführt, das mit den Parametern

Volume of Distribution und Binding Potential plausible und dem Tracer-Uptake

ähnliche Ergebnisse lieferte. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Modelle

(Simplified Reference Tissue Model und Two Tissue Compartment Model) für ein

kinetisches Modeling getestet, die jedoch keine ausreichend validen Daten erbrachten

(Daten daher nicht gezeigt). Es zeigte sich als schwierig, eine gute Input-Funktion aus

den Bilddaten von der Vena cava caudalis oder der Arteria carotis zu entnehmen, was

vermutlich an der geringen Tiergröße und dem Partial Volume Effect, wie auch den

Tracer-Eigenschaften liegt. Hier sind Studien in Ratten im Vorteil, da sowohl die

Blutgefäßstrukturen größer sind, als auch die Tracerapplikation zügig vonstattengehen

6 Diskussion

185

kann, da auch ein relativ kleinerer Anteil von Lösungsmitteln wie Ethanol in der

Tracerlösung besser vertragen wird. Allerdings führt die Quantifizierung des [18F]GE-

180-Uptake in Mäusen zu zuverlässigen Ergebnissen, wie oben im Vergleich mit der

Literatur dargestellt.

Mit dem Gedanken, dass [18F]Flumazenil-PET auch einen Anfallsherd im

Patienten (Vivash et al., 2013) als Areal verringerter Tracerbindung darstellen kann,

und eine ketogene Diät die Expression von α1-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors

beeinflussen kann (Lauritzen et al., 2016), wurde dieser Tracer ebenfalls in die Studie

im intrahippokampalen Kainatmodell integriert. Zur Auswertung der PET-Daten wurde

in unserer Untersuchung als Referenzregion für das Simplified Reference Tissue

Model der Hirnstamm genutzt. Für [3H]Flumazenil wurde in Mäusen gezeigt, dass etwa

fünf Minuten nach intravenöser Injektion der maximale Tracer-Uptake in

Gehirnregionen erscheint, der über die weitere Zeit hinweg wieder deutlich abnimmt

(Sakiyama et al., 2006). In Ratten wurde für Flumazenil eine Eliminationshalbwertszeit

von etwa acht Minuten nach intravenöser Gabe ermittelt (Mandema et al., 1991). Für

das Modeling wurden in einer anderen Studie in Mäusen mit [18F]Flumazenil-PET Teile

der Stammhirn-Region verwendet (Müller Herde et al., 2017), wobei von allen

untersuchten Gehirnregionen die Traceraufnahme im Stammhirn am geringsten war.

Unsere Daten konnten zum Zeitpunkt neun Wochen nach Status epilepticus ein

vermindertes Binding Potential BPnd im rechten Striatum und ventralen linken

Hippokampus verglichen mit Sham-Tieren ausmachen. Hier könnte man noch eine

Baseline-Untersuchung anschließen oder auch die Referenzregion wie bei der Studie

von Müller Herde et al. weiter eingrenzen bzw. voxelweise die beiden Zeitpunkte vier

und neun Wochen und die Gruppen untereinander vergleichen, um nicht über die

Definition größerer Regionen kleinere Unterschiede zu übersehen. In Bezug auf den

zerebralen Energiestoffwechsel ist zu sagen, dass mit der bisherigen Auswertung

keine Auswirkungen auf das Tracerverhalten durch die ketogene Diät eindeutig

festzustellen waren, wenngleich auch nicht die gleichen Unterschiede zu dem der

Sham-Gruppe bestanden.

6 Diskussion

186

6.3 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen als therapeutisches Target

6.3.1 Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät auf den zerebralen

Glukose-Stoffwechsel

Ein Ziel der Arbeit war die Untersuchung von zwei den Energiestoffwechsel

beeinflussenden Therapie-Ansätzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf den

Glukosemetabolismus, auch im Vergleich. Zwar wird die 2-DG oft im Zusammenhang

mit dem Thema der ketogenen Diät genannt, hat jedoch andere Wirkmechanismen

(siehe Abschnitte 2.2.5.2 und 2.2.5.3). 2-DG verursachte in den Untersuchungen im

kornealen Kindlingmodell (siehe erstes Manuskript) bei der Behandlung gesunder

Tiere an Tag 17 eine Verringerung des [18F]FDG-Uptake in Thalamus, Cortex, Striatum

und Amygdala. Zugleich stiegen im Two-Tissue Compartiment Model die Ki (Influx-

Konstante) und die MRGlu (Metabolic Rate) an. Einen [18F]FDG-Uptake-steigernden

Effekt durch die 2-DG-Behandlung konnte man während der Epileptgenese nur an Tag

10 des Kindlings für den Thalamus und das Cerebellum beobachten, wobei an diesem

Zeitpunkt der [18F]FDG-Uptake oft signifikant höher war als der der Tiere ohne

Epileptogenese. An Tag 17 gab es diesen Unterschied nur noch in der Amygdala und

im Striatum. Wenn man die offensichtlich größte Wirkung von 2-DG auf den

Glukosestoffwechsel an Tag 17 in gesunden Mäusen betrachtet, stellt sich die Frage,

weshalb an Tag 10 dieser gegenteilige den Tracer-Uptake steigernde Effekt zu sehen

ist. Im Verlauf dieser Zeit wandelt sich das gesunde Gehirn hin zu einem gekindelten

Zustand. Zugleich wird 2-DG von metabolisch aktiven Zellen aufgenommen (Masino,

2016), also den Zellen in für die Anfallsaktivität verantwortlichen Arealen und

Schaltkreisen. Wichtig für den Kindlingprozess ist eine strukturelle und synaptische

Plastizität, die von TrkB (Tyrosine Receptor Kinase B) abhängig zu sein scheint (He et

al., 2004, Kotloski und McNamara, 2010). Dieser wird durch das Neurotrophin BDNF

(Brain-Derived Neurotrophic Factor) aktiviert, dessen mRNA nach limbischen Anfällen

vermehrt exprimiert wird (Isackson et al., 1991) und die vermehrt auch in

Hippokampusgewebe von Patienten mit pharmakoresistenter

Temporallappenepilepsie gefunden wird (Murray et al., 2000). Es konnte gezeigt

werden, dass 2-DG die anfallsinduzierte vermehrte Expression von BDNF und TrkB

vermindern kann, was über die Wirkung von weniger vorhandenem NADH aus der

6 Diskussion

187

Glykolyse auf die Aktivität des Transkriptionsrepressors NRSF und seinen NADH-

sensitiven Ko-Repressor CtBP geschieht (Garriga-Canut et al., 2006). Eine durch die

neuronale Aktivität gesteigerte Glykolyse würde zu höherer NADH-Verfügbarkeit

führen, die die Dissoziation des Ko-Repressors von NRSF ermöglicht, wodurch die

Transkriptionsrepression von BDNF und TrkB vermindert wird (Huang und McNamara,

2006). Auch die beschriebene Steigerung der Expression der KATP-

Kanaluntereinheiten Kir6.1 und Kir6.2 durch 2-DG wäre ein möglicher Mechanismus

für eine anfallsunterdückende Wirkung von 2-DG, wenn eine Hemmung der Glykolyse

vor allen in den aktiven Neuronen zu weniger ATP in Membrannähe führen und somit

die Öffnung der KATP-Kanäle verursachen würde (Yang et al., 2013). Eine gesteigerte

Nachfrage nach Glukose durch metabolisch aktive Zellen, die zugleich vermehrt in

ihrer Glykolyse inhibiert werden, würde eine Steigerung des Tracer-Uptakes erklären,

ebenso die Ergebnisse zur Influx-Konstante und der Metabolic Rate. Auf die Ki war die

Wirkung von 2-DG während der Epileptogenese ähnlich wie im gesunden Tier, wobei

ein Anstieg der Werte auch schon an Tag 10 gefunden werden konnte. Gleichzeitig

bestand an Tag 10 wieder eine deutliche Differenz zwischen beiden 2-DG-Gruppen.

Das Kindling scheint in Bezug auf Ki die Wirkung der 2-DG zu verstärken. Die MRGlu

wurde durch die 2-DG während der Epileptogenese kaum beeinflusst, nur im Vergleich

mit der Vehikel-Kindling-Gruppe zeigten sich an Tag 17 höhere MRGlu-Werte. Passend

zu der genannten Theorie zur Verstärkung der Wirkung von 2-DG durch das Kindling,

das zu einem erhöhten Glukosebedarf metabolisch aktiver Zellen führt, war an Tag 10

und 17 in der gekindelten und 2-DG-behandelten Gruppe die Blutglukosekonzentration

im Vergleich zum Anfang verringert, bei der nur mit 2-DG behandelten Gruppe erst an

Tag 17. Um den gesteigerten Glukosetransport weiter zu erklären, haben wir

immunhistochemisch den Glukosetransporter 1 als den für den Glukosetransport über

die Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen Glukosetransporter untersucht, allerdings

ohne Unterschiede in den Färbeintensitäten zwischen den Gruppen oder im Vergleich

mit naiven Tieren zu festzustellen. Eine chronische Hypoglykämie kann die Expression

von 55-kDa GLUT1, welcher in der Blut-Hirn-Schranke vorkommt, beeinflussen

(Simpson et al., 1999), wobei die Expression von 45-kDa GLUT1, der in Astrozyten

und Oligodendrozyten, aber nicht in Microglia vorkommt (Yu und Ding, 1998) und der

6 Diskussion

188

neuronale 45-kDa GLUT3 unverändert bleibt. Allerdings fand eine andere Studie einen

geringen, aber signifikanten Anstieg von GLUT3 (Uehara et al., 1997). Aber auch eine

höhere intrinsische Aktivität von Glukosetransportern könnte für eine Steigerung des

Glukosetransportes im Zusammenhang mit Anfällen ursächlich sein (Cornford et al.,

2000).

Hinsichtlich der Wirkung der ketogenen Diät auf den Glukosestoffwechsel

konnten wir in einer Gruppe von 10 gesunden Tieren feststellen, dass der [18F]FDG-

Uptake am 35. Tag der Fütterung in Hippokampus, Thalamus und Cerebellum erhöht

war und an Tag 49 auch noch im Thalamus. Gleichzeitig war keine Veränderung der

Blutglukosekonzentration messbar. Hier wurde im Unterschied zur Studie im

intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) die Blut-ß-

Hydroxybutyratkonzentration nicht gemessen. Die Metabolic Rate war im

Hippokampus am 35. Tag erhöht und ebenso im gesamten Gehirn, wenn es als eine

große Region of Interest betrachtet wurde, während die Influx-Konstante über die Zeit

hinweg unverändert blieb. Eine Studie in Ratten konnte schon nach zwei Wochen der

Fütterung ketogener Diät mit einer milden Ketonämie einen Anstieg des [18F]FDG-

Uptake erkennen, ebenso eine erhöhte Konzentration von Monocarboxylattransporter

1 (MCT1), der unter anderem für den Transport von Ketonkörpern über die Blut-Hirn-

Schranke verantwortlich ist (Pifferi et al., 2011). Die Expression von GLUT1 war

unverändert. Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) wurde der

Glukosestoffwechsel in dieser Arbeit nach vier Wochen, also zu einem Zeitpunkt

untersucht, an dem das Auftreten spontaner Anfälle zu erwarten ist, und nach zehn

Wochen und damit in der chronischen Phase der Epilepsie in diesem Modell (Twele et

al., 2016b). Die ketogene Diät wirkte während ihrer Verabreichung der Entwicklung der

schon beschriebenen Verminderung des Glukosestoffwechsels durch die

Epileptogenese entgegen, da keine Veränderung des [18F]FDG-Uptake zu erkennen

war, wohl aber ein Unterschied zu der Standarddiät-Gruppe nach Status epilepticus

und auch zu den Sham-Tieren. In der chronischen Phase der Epilepsie, also über fünf

Wochen nach Beendigung der Diät, konnte dieser Effekt für den [18F]FDG-Uptake nicht

mehr beobachtet werden. Allerdings war bezüglich der Metabolic Rate nach wie vor

kein signifikanter Unterschied zwischen Ausgangsniveau und den Werten der zehnten

6 Diskussion

189

Woche erkennbar. Passend zu den Ergebnissen für die Influx-Konstante aus unseren

Voruntersuchungen in den gesunden Tieren hatte die ketogene Diät auch in

epileptischen Tieren keinen Einfluss auf diese. Die ketogene Diät führte wiederum

nicht zu Veränderungen in der Blutglukosekonzentration.

6.3.2 Effekte der 2-Desoxy-D-Glukose und der ketogenen Diät auf

Epileptogenese und Inflammation

Sowohl bei dem Einsatz der 2-DG als ein die Glykolyse hemmender Faktor als auch

der ketogenen Diät als eine die Glykolyse umgehende und alternative

Energiesubstrate liefernder Faktor während der Epileptogenese in einem Tiermodell

konnten in dieser Dissertationsarbeit Hinweise auf eine mögliche antiepileptogene

Wirksamkeit gefunden werden. Auf die Beeinflussung des Glukosestoffwechsels

wurde schon eingegangen, noch nicht aber auf die Ergebnisse der Untersuchungen

hinsichtlich inflammatorischer Prozesse: Die 2-DG-Behandlung per se und in

Kombination mit dem Kindling führte zur Aktivierung von Microglia in limbischen

Gehirnregionen. Zugleich konnte sie die Aktivierung von Astrozyten in der CA3a und

dem piriformen Cortex zumindest eingrenzen. In vitro konnte eine zytotxische Wirkung

von 2-DG auf Microglia beobachtet werden (Vilalta und Brown, 2014), in vivo wurden

bei mindestens doppelt so hoher Dosierung wie in der vorliegenden Arbeit

dosisabhängig eine vermehrte Leukozytenzahl in der Milz, eine vermehrte T-

Lymphozytenzahl im Thymus und in vitro eine geringere Proliferation von T-

Lymphozyten als Antwort auf Lipopolysaccharide beschrieben (Dréau et al., 1998).

Somit zeigt die 2-DG Auswirkungen auf das Immunsystem. Auch eine erhöhte

Corticosteron-Konzentration im Blut wurde bei hohen Dosierungen von 2-DG

festgestellt (Dréau et al., 2000). In dieser Dissertationsarbeit stellt sich die Frage, ob

der aktivierte Zustand von Microglia in diesem Fall auch anti-inflammatorischer Natur

sein könnte, da es Microglia eher pro- und eher anti-inflammatorischer Aktivität gibt.

Die ketogene Diät führte interessanterweise zunächst zu einer gesteigerten Aufnahme

von [18F]GE-180 spezifisch im dorsalen rechten Hippokampus an Tag sieben, wobei

in mehreren Gehirnregionen an Tag 14 wieder eine Verringerung auf das

Augangsniveau gesehen werden konnte. Diesen Effekt können die Ergebnisse der

6 Diskussion

190

Arbeit von Milder et al. (2010) erklären, die einen vorrübergehenden milden oxidativen

Stress in der frühen Phase einer ketogenen Diät zeigen, der durch den Nrf2-Signalweg

(Nuclear Factor) zu einem besseren mitochondrialen Redoxstatus führte. Die Bildung

reaktiver Sauerstoffspezies kann die TSPO-Expression steigern, was mit einer

vermehrten Anzahl von Mitochondrien durch die ketogene Diät (Bough et al., 2006,

Lauritzen et al., 2016) zu einem gesteigerten TSPO-PET-Signal führen würde.

Von allen Ergebnissen zu den beiden Therapieansätzen sind die beobachteten

Auswirkungen auf die sichtbare Epileptogenese im kornealen Kindlingmodell und die

chronische Phase im intrahippokampalen Kainatmodell als eigentliche Hinweise auf

eine antiepileptogene Effektivität am wichtigsten: Die 2-DG-Behandlung führte

während des kornealen Kindlings zu anfangs weniger starken Anfallsantworten,

insgesamt zu weniger Anfälllen von Typ 5 und einer deutlichen Erhöhung der

benötigten Stimulationen, um ein Tier in den vollständig gekindelten Zustand zu

bringen, im Vergleich mit vehikelbehandelten Tieren. Die ketogene Diät führte nach

einem Status epilepticus zu weniger elektroenzephalographisch sichtbaren

anfallsähnlichen Entladungen (High Voltage Sharp Waves und Mixed Events) im

Vergleich mit den Standarddiät-Tieren, obwohl zwischen dem Beginn der EEG-

Ableitung und dem Ende der ketogenen Diät zwei Monate lagen. Dies spricht für einen

Langzeit-Effekt. Des Weiteren war die durchschnittliche Dauer aller gezeigten

elektroenzephalographisch sichtbaren Events kürzer, ebenso ihre kumulative

stündliche Dauer. Zwar unterschied sich nicht die Zahl der klinischen generalisierten

spontanen Anfälle, aber es kann durchaus sein, dass die Überwachungszeit zu kurz

war, um Behandlungsunterschiede valide bestimmen zu können. Eine Untersuchung

im Kainatmodell in Ratten zeigte weniger und kürzere spontane Anfälle, wenn eine

ketogene Diät im Anschluss an die Induktion eines Status epilepticus gefüttert wurde

(Muller-Schwarze et al., 1999). Ein großer Unterschied zu der in dieser

Dissertationsarbeit durchgeführten Studie bestand darin, dass die ketogene Diät über

die komplette Zeit der Anfallsüberwachung gefüttert wurde (acht Wochen), weshalb

antiepileptogene Effekte nicht von antikonvulsiven Effekten zu unterscheiden sind, und

die Anfallsüberwachung nicht nur in der chronischen Phase stattfand.

6 Diskussion

191

Beide Behandlungen zeigten sich als gut verträglich, wobei die 2-DG-

Injektionen per se keinen Einfluss auf die Körpergewichtsentwicklung zeigten. In allen

gekindelten Gruppen waren die Körpergewichte niedriger und zwischen den Gruppen

dabei ähnlich, was man auf den Stress durch die zwei zusätzlichen Fixierungen mit

jeweils Augentropfengabe bzw. Kindlingstimulation oder die Epileptogenese

zurückführen kann. Tiere unter ketogener Diät nahmen schneller zu, wie auch in

Ratten beobachtet wurde (Calderon et al., 2017), wobei sich das Körpergewicht schon

bald nach Absetzen der Diät wieder dem der anderen Tiere anglich. Im

intrahippokampalen Kainatmodell zeigte der Irwin Screen zur Einschätzung von

Unterschieden im Verhalten in der additiven Auswertung der Einzelbeurteilungen, dass

durch die Epileptogenese bedingte auftretende Abweichungen von Ausgangswerten

in der zweiten Woche nicht in der Gruppe mit ketogener Diät zu finden waren. Nach

deutlich längerer Fütterung einer ketogenen Diät in Ratten wurde eine höhere

lokomotorische Aktivität beschrieben (Ziegler et al., 2005), die wir allerdings im

ActiMot-Test nicht finden konnten.

6.4 Schlussfolgerungen und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die [18F]FDG-PET die Untersuchungen der

Behandlungs-assoziierten Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels

ermöglichte. Allerdings wurden Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels

durch die eigentliche Epileptogenese nicht im kornealen Kindlingmodell, sondern nur

im intrahippokampalen Kainatmodell beobachtet. Eine mögliche zukünftige alleinige

Verwendung von [18F]FDG zur Evaluation des Verlaufes einer Epileptogenese im

Patienten, auch unter Therapie, scheint unwahrscheinlich, da die Tiermodelle wie

vermutlich auch die potentiell epileptogenen Gehirninsulte in den Patienten in den

Ergebnissen variieren und die Einschätzung des Fortschrittes der Epileptogenese nur

bedingt möglich ist. Eine Kombination der bildgebenden Untersuchungen von

Glukosestoffwechsel, Inflammation und Blut-Hirn-Schranken-Integrität stellt hingegen

einen vielversprechenden Ansatz dar.

Beide untersuchten Strategien, die 2-DG wie die ketogene Diät, zeigten Potential zum

Einsatz als antiepileptogene Therapie. Die nächste spannende Frage zur 2-DG ist die

6 Diskussion

192

Rolle und die Art ihrer Wirkung auf Microglia, um die Mechanismen der Wirkung weiter

zu erforschen. Zur ketogenen Diät ist im Hinblick auf diese Arbeit noch die

histologische Auswertung für eine weiter verbesserte Einschätzbarkeit der Ergebnisse

interessant.

7 Literaturverzeichnis

193


AFT, R. L., ZHANG, F. W. & GIUS, D. 2002. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a

chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. Br J Cancer, 87, 805-12.

AIRAS, L., DICKENS, A. M., ELO, P., MARJAMAKI, P., JOHANSSON, J., ESKOLA, O.,

JONES, P. A., TRIGG, W., SOLIN, O., HAAPARANTA-SOLIN, M., ANTHONY, D. C.

& RINNE, J. 2015. In vivo PET imaging demonstrates diminished microglial activation

after fingolimod treatment in an animal model of multiple sclerosis. J Nucl Med, 56,

305-10.

ALF, M., MARTIC-KEHL, M., SCHIBLI, R. & KRAMER, S. 2013. FDG kinetic modeling in

small rodent brain PET: optimization of data acquisition and analysis. EJNMMI

Research, 3, 61.

ALVESTAD, S., HAMMER, J., EYJOLFSSON, E., QU, H., OTTERSEN, O. P. &

SONNEWALD, U. 2008. Limbic Structures Show Altered Glial–Neuronal Metabolism

in the Chronic Phase of Kainate Induced Epilepsy. Neurochem Res, 33, 257-266.

ALVESTAD, S., HAMMER, J., QU, H., HÅBERG, A., OTTERSEN, O. P. & SONNEWALD, U.

2011. Reduced astrocytic contribution to the turnover of glutamate, glutamine, and

GABA characterizes the latent phase in the kainate model of temporal lobe epilepsy.

J Cereb Blood Flow Metab, 31, 1675-1686.

AMHAOUL, H., HAMAIDE, J., BERTOGLIO, D., REICHEL, S. N., VERHAEGHE, J.,

GEERTS, E., VAN DAM, D., DE DEYN, P. P., KUMAR-SINGH, S., KATSIFIS, A.,

VAN DER LINDEN, A., STAELENS, S. & DEDEURWAERDERE, S. 2015. Brain

inflammation in a chronic epilepsy model: Evolving pattern of the translocator protein

during epileptogenesis. Neurobiol Dis.

ARABADZISZ, D., ANTAL, K., PARPAN, F., EMRI, Z. & FRITSCHY, J.-M. 2005.

Epileptogenesis and chronic seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy are

associated with distinct EEG patterns and selective neurochemical alterations in the

contralateral hippocampus. Exp Neurol, 194, 76-90.

AZARIAS, G., PERRETEN, H., LENGACHER, S., POBURKO, D., DEMAUREX, N.,

MAGISTRETTI, P. J. & CHATTON, J.-Y. 2011. Glutamate Transport Decreases

Mitochondrial pH and Modulates Oxidative Metabolism in Astrocytes. J Neurosci, 31,

3550.

BAILEY, D. L., TOWNSEND, D. W., VALK, P. E. & MAISEY, M. N. 2004. Positron Emission

Tomography: Basic Sciences, Springer London.


194

BALOSSO, S., MAROSO, M., SANCHEZ-ALAVEZ, M., RAVIZZA, T., FRASCA, A.,

BARTFAI, T. & VEZZANI, A. 2008. A novel non-transcriptional pathway mediates the

proconvulsive effects of interleukin-1beta. Brain, 131, 3256-65.

BANKSTAHL, J. P. & BANKSTAHL, M. 2012. Präklinische Positronen-Emissions-

Tomographie-Studien in Epilepsiemodellen: Fenster zur Zukunft in der

Epilepsieforschung. Zeitschrift für Epileptologie, 25, 200-207.

BANKSTAHL, M., BANKSTAHL, J. P. & LÖSCHER, W. 2012. Inter-individual variation in the

anticonvulsant effect of phenobarbital in the pilocarpine rat model of temporal lobe


BAR-KLEIN, G., CACHEAUX, L. P., KAMINTSKY, L., PRAGER, O., WEISSBERG, I.,

SCHOKNECHT, K., CHENG, P., KIM, S. Y., WOOD, L., HEINEMANN, U., KAUFER,

D. & FRIEDMAN, A. 2014. Losartan prevents acquired epilepsy via TGF-beta

signaling suppression. Ann Neurol, 75, 864-75.

BAR-KLEIN, G., KLEE, R., BRANDT, C., BANKSTAHL, M., BASCUNANA, P., TÖLLNER, K.,

DALIPAJ, H., BANKSTAHL, J. P., FRIEDMAN, A. & LÖSCHER, W. 2016. Isoflurane

prevents acquired epilepsy in rat models of temporal lobe epilepsy. Ann Neurol, 80,

896-908.

BARBALHO, C. A., NUNES-DE-SOUZA, R. L. & CANTO-DE-SOUZA, A. 2009. Similar

anxiolytic-like effects following intra-amygdala infusions of benzodiazepine receptor

agonist and antagonist: evidence for the release of an endogenous benzodiazepine

inverse agonist in mice exposed to elevated plus-maze test. Brain Res, 1267, 65-76.

BAULAC, M., DE BOER, H., ELGER, C., GLYNN, M., KALVIAINEN, R., LITTLE, A.,

MIFSUD, J., PERUCCA, E., PITKANEN, A. & RYVLIN, P. 2015. Epilepsy priorities in

Europe: A report of the ILAE-IBE Epilepsy Advocacy Europe Task Force. Epilepsia,

56, 1687-95.

BÉLANGER, M., ALLAMAN, I. & MAGISTRETTI, PIERRE J. 2011. Brain Energy

Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metab, 14, 724-

738.

BENAVIDES, J. S., CAPDEVILLE, C., DAUPHIN, F. O., DUBOIS, A., DUVERGER, D.,

FAGE, D., GOTTI, B., MACKENZIE, E. T. & SCATTON, B. 1990. The quantification

of brain lesions with anω3 site ligand: a critical analysis of animal models of cerebral

ischaemia and neurodegeneration. Brain Res, 522, 275-289.

BERENDT, M., FARQUHAR, R., MANDIGERS, P., PAKOZDY, A., BHATTI, S., DE RISIO,

L., FISCHER, A., LONG, S., MATIASEK, K., MUNANA, K., PATTERSON, E.,


195

PENDERIS, J., PLATT, S., PODELL, M., POTSCHKA, H., PUMAROLA, M.,

RUSBRIDGE, C., STEIN, V., TIPOLD, A. & VOLK, H. 2015. International veterinary

epilepsy task force consensus report on epilepsy definition, classification and

terminology in companion animals. BMC Veterinary Research, 11, 182.

BERGSTROM, R. A., CHOI, J. H., MANDUCA, A., SHIN, H. S., WORRELL, G. A. & HOWE,

C. L. 2013. Automated identification of multiple seizure-related and interictal

epileptiform event types in the EEG of mice. Sci Rep, 3.

BERTOGLIO, D., VERHAEGHE, J., SANTERMANS, E., AMHAOUL, H., JONCKERS, E.,

WYFFELS, L., VAN DER LINDEN, A., HENS, N., STAELENS, S. &

DEDEURWAERDERE, S. 2017. Non-invasive PET imaging of brain inflammation at

disease onset predicts spontaneous recurrent seizures and reflects comorbidities.

Brain Behav Immun, 61, 69-79.

BIALER, M., JOHANNESSEN, S. I., LEVY, R. H., PERUCCA, E., TOMSON, T. & WHITE, H.

S. 2015. Progress report on new antiepileptic drugs: A summary of the Twelfth Eilat

Conference (EILAT XII), Epilepsy Res. 2015 Mar;111:85-141. doi:

10.1016/j.eplepsyres.2015.01.001. Epub 2015 Jan 19.

BLACKWOOD, D. H., KAPOOR, V. & MARTIN, M. J. 1981. Regional changes in cerebral

glucose utilization associated with amygdaloid kindling and electroshock in the rat.

Brain Res, 224, 204-8.

BLAIR, R. E., SOMBATI, S., LAWRENCE, D. C., MCCAY, B. D. & DELORENZO, R. J. 2004.

Epileptogenesis causes acute and chronic increases in GABAA receptor endocytosis

that contributes to the induction and maintenance of seizures in the hippocampal

culture model of acquired epilepsy. J Pharmacol Exp Ther, 310, 871-80.

BOGDANOVIC, R. M., SYVANEN, S., MICHLER, C., RUSSMANN, V., ERIKSSON, J.,

WINDHORST, A. D., LAMMERTSMA, A. A., DE LANGE, E. C., VOSKUYL, R. A. &

POTSCHKA, H. 2014. (R)-[11C]PK11195 brain uptake as a biomarker of

inflammation and antiepileptic drug resistance: evaluation in a rat epilepsy model.

Neuropharmacology, 85, 104-12.

BOISON, D., SANDAU, U. S., RUSKIN, D. N., KAWAMURA, M. & MASINO, S. A. 2013.

Homeostatic control of brain function – new approaches to understand

epileptogenesis. Front Cell Neurosci, 7.

BOUGH, K. J., WETHERINGTON, J., HASSEL, B., PARE, J. F., GAWRYLUK, J. W.,

GREENE, J. G., SHAW, R., SMITH, Y., GEIGER, J. D. & DINGLEDINE, R. J. 2006.


196

Mitochondrial biogenesis in the anticonvulsant mechanism of the ketogenic diet. Ann

Neurol, 60, 223-35.

BOUILLERET, V., BOYET, S., MARESCAUX, C. & NEHLIG, A. 2000. Mapping of the

progressive metabolic changes occurring during the development of hippocampal

sclerosis in a model of mesial temporal lobe epilepsy. Brain Res, 852, 255-62.

BOUILLERET, V., RIDOUX, V., DEPAULIS, A., MARESCAUX, C., NEHLIG, A. & LE GAL LA

SALLE, G. 1999. Recurrent seizures and hippocampal sclerosis following

intrahippocampal kainate injection in adult mice: electroencephalography,

histopathology and synaptic reorganization similar to mesial temporal lobe epilepsy.


BOUTIN, H., MURRAY, K., PRADILLO, J., MAROY, R., SMIGOVA, A., GERHARD, A.,

JONES, P. A. & TRIGG, W. 2015. 18F-GE-180: a novel TSPO radiotracer compared

to 11C-R-PK11195 in a preclinical model of stroke. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 42,

503-11.

BOUVARD, S., COSTES, N., BONNEFOI, F., LAVENNE, F., MAUGUIERE, F., DELFORGE,

J. & RYVLIN, P. 2005. Seizure-related short-term plasticity of benzodiazepine

receptors in partial epilepsy: a [11C]flumazenil-PET study. Brain, 128, 1330-43.

BOUZIER-SORE, A. K., VOISIN, P., BOUCHAUD, V., BEZANCON, E., FRANCONI, J. M. &

PELLERIN, L. 2006. Competition between glucose and lactate as oxidative energy

substrates in both neurons and astrocytes: a comparative NMR study. Eur J

Neurosci, 24, 1687-94.

BRACKHAN, M., BASCUÑANA, P., POSTEMA, J. M., ROSS, T. L., BENGEL, F. M.,

BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016. Serial quantitative TSPO-targeted PET

reveals peak microglial activation up to two weeks after an epileptogenic brain insult.

J Nucl Med, 7, 172494.

BRAESTRUP, C. & SQUIRES, R. F. 1977. Specific benzodiazepine receptors in rat brain

characterized by high-affinity (3H)diazepam binding. Proc Natl Acad Sci U S A, 74,

3805-9.

BREITENFELD, T., JURASIC, M. J. & BREITENFELD, D. 2014. Hippocrates: the forefather

of neurology. Neurol Sci, 35, 1349-1352.

BRENDEL, M., PROBST, F., JAWORSKA, A., OVERHOFF, F., KORZHOVA, V., ALBERT,

N. L., BECK, R., LINDNER, S., GILDEHAUS, F. J., BAUMANN, K., BARTENSTEIN,

P., KLEINBERGER, G., HAASS, C., HERMS, J. & ROMINGER, A. 2016. Glial


197

Activation and Glucose Metabolism in a Transgenic Amyloid Mouse Model: A Triple-

Tracer PET Study. J Nucl Med, 57, 954-60.

BREUER, H., MEIER, M., SCHNEEFELD, S., HARTIG, W., WITTNEBEN, A., MARKEL, M.,

ROSS, T. L., BENGEL, F. M., BANKSTAHL, M. & BANKSTAHL, J. P. 2016.

Multimodality imaging of blood-brain barrier impairment during epileptogenesis. J

Cereb Blood Flow Metab, 19.

BRODIE, M. J., BARRY, S. J., BAMAGOUS, G. A., NORRIE, J. D. & KWAN, P. 2012.

Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology, 78, 1548-54.

BURDETTE, D. E., SAKURAI, S. Y., HENRY, T. R., ROSS, D. A., PENNELL, P. B., FREY,

K. A., SACKELLARES, J. C. & ALBIN, R. L. 1995. Temporal lobe central

benzodiazepine binding in unilateral mesial temporal lobe epilepsy. Neurology, 45,

934-41.

CACHEAUX, L. P., IVENS, S., DAVID, Y., LAKHTER, A. J., BAR-KLEIN, G., SHAPIRA, M.,

HEINEMANN, U., FRIEDMAN, A. & KAUFER, D. 2009. Transcriptome Profiling

Reveals TGF-β Signaling Involvement in Epileptogenesis. J Neurosci, 29, 8927-8935.

CALDERON, N., BETANCOURT, L., HERNANDEZ, L. & RADA, P. 2017. A ketogenic diet

modifies glutamate, gamma-aminobutyric acid and agmatine levels in the

hippocampus of rats: A microdialysis study. Neurosci Lett, 642, 158-162.

CAPRAZ, I. Y., KURT, G., AKDEMIR, O., HIRFANOGLU, T., ONER, Y., SENGEZER, T.,

KAPUCU, L. O., SERDAROGLU, A. & BILIR, E. 2015. Surgical outcome in patients

with MRI-negative, PET-positive temporal lobe epilepsy. Seizure, 29, 63-8.

CASTRO, M. A., BELTRAN, F. A., BRAUCHI, S. & CONCHA, II 2009. A metabolic switch in

brain: glucose and lactate metabolism modulation by ascorbic acid. J Neurochem,

110, 423-40.

CERDAN, S., RODRIGUES, T. B., SIERRA, A., BENITO, M., FONSECA, L. L., FONSECA,

C. P. & GARCIA-MARTIN, M. L. 2006. The redox switch/redox coupling hypothesis.

Neurochem Int, 48, 523-30.

CERVENKA, M. C., HENRY, B. J., FELTON, E. A., PATTON, K. & KOSSOFF, E. H. 2016.

Establishing an Adult Epilepsy Diet Center: Experience, efficacy and challenges.

Epilepsy Behav, 58, 61-8.

CHAU, W. F., BLACK, A. M., CLARKE, A., DURRANT, C., GAUSEMEL, I., KHAN, I.,

MANTZILAS, D., OULIE, I., ROGSTAD, A., TRIGG, W. & JONES, P. A. 2015.

Exploration of the impact of stereochemistry on the identification of the novel

translocator protein PET imaging agent [(18)F]GE-180. Nucl Med Biol, 42, 711-9.


198

CHEN, W. & GUERON, M. 1992. The inhibition of bovine heart hexokinase by 2-deoxy-D-

glucose-6-phosphate: characterization by 31P NMR and metabolic implications.

Biochimie, 74, 867-73.

CHERRY, S. R. & GAMBHIR, S. S. 2001. Use of positron emission tomography in animal

research. Ilar j, 42, 219-32.

CHMIEL-PERZYNSKA, I., KLOC, R., PERZYNSKI, A., RUDZKI, S. & URBANSKA, E. M.

2011. Novel aspect of ketone action: beta-hydroxybutyrate increases brain synthesis

of kynurenic acid in vitro. Neurotox Res, 20, 40-50.

CHOY, M., CHEUNG, K. K., THOMAS, D. L., GADIAN, D. G., LYTHGOE, M. F. & SCOTT,

R. C. 2010. Quantitative MRI predicts status epilepticus-induced hippocampal injury

in the lithium-pilocarpine rat model. Epilepsy Res, 88, 221-30.

CIARLONE, S. L., GRIECO, J. C., D'AGOSTINO, D. P. & WEEBER, E. J. 2016. Ketone ester

supplementation attenuates seizure activity, and improves behavior and hippocampal

synaptic plasticity in an Angelman syndrome mouse model. Neurobiol Dis, 96, 38-46.

COPPOLA, G., VEGGIOTTI, P., CUSMAI, R., BERTOLI, S., CARDINALI, S., DIONISI-VICI,

C., ELIA, M., LISPI, M. L., SARNELLI, C., TAGLIABUE, A., TORALDO, C. &

PASCOTTO, A. 2002. The ketogenic diet in children, adolescents and young adults

with refractory epilepsy: an Italian multicentric experience. Epilepsy Res, 48, 221-7.

CORNFORD, E. M., NGUYEN, E. V. & LANDAW, E. M. 2000. Acute upregulation of blood-

brain barrier glucose transporter activity in seizures. Am J Physiol Heart Circ Physiol,

279, H1346-54.

CREMER, J. E., CUNNINGHAM, V. J. & SEVILLE, M. P. 1983. Relationships between

extraction and metabolism of glucose, blood flow, and tissue blood volume in regions

of rat brain. J Cereb Blood Flow Metab, 3, 291-302.

CRUMRINE, P. K. 2011. Management of Seizures in Lennox-Gastaut Syndrome. Pediatr

Drugs, 13, 107-118.

CRUZ, F., VILLALBA, M., GARCIA-ESPINOSA, M. A., BALLESTEROS, P., BOGONEZ, E.,

SATRUSTEGUI, J. & CERDAN, S. 2001. Intracellular compartmentation of pyruvate

in primary cultures of cortical neurons as detected by (13)C NMR spectroscopy with

multiple (13)C labels. J Neurosci Res, 66, 771-81.

DA SILVA, E. A., CHUGANI, D. C., MUZIK, O. & CHUGANI, H. T. 1997. Identification of

frontal lobe epileptic foci in children using positron emission tomography. Epilepsia,

38, 1198-208.


199

DE LANEROLLE, N. C., KIM, J. H., WILLIAMSON, A., SPENCER, S. S., ZAVERI, H. P.,

EID, T. & SPENCER, D. D. 2003. A retrospective analysis of hippocampal pathology

in human temporal lobe epilepsy: evidence for distinctive patient subcategories.


DEDEURWAERDERE, S., CALLAGHAN, P. D., PHAM, T., RAHARDJO, G. L., AMHAOUL,

H., BERGHOFER, P., QUINLIVAN, M., MATTNER, F., LOC'H, C., KATSIFIS, A. &

GRÉGOIRE, M.-C. 2012. PET imaging of brain inflammation during early

epileptogenesis in a rat model of temporal lobe epilepsy. EJNMMI Research, 2, 60-

60.

DEDEURWAERDERE, S., GREGOIRE, M. C., VIVASH, L., ROSELT, P., BINNS, D.,

FOOKES, C., GREGURIC, I., PHAM, T., LOC'H, C., KATSIFIS, A., HICKS, R. J.,

O'BRIEN, T. J. & MYERS, D. E. 2009. In-vivo imaging characteristics of two

fluorinated flumazenil radiotracers in the rat. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 36, 958-65.

DEDEURWAERDERE, S., JUPP, B. & O'BRIEN, T. J. 2007. Positron Emission Tomography

in Basic Epilepsy Research: A View of the Epileptic Brain. Epilepsia, 48, 56-64.

DEDEURWAERDERE, S., SHULTZ, S. R., FEDERICO, P. & ENGEL, J., JR. 2014.

Workshop on Neurobiology of Epilepsy appraisal: New systemic imaging

technologies to study the brain in experimental models of epilepsy. Epilepsia, 16,

12642.

DHAMIJA, R., ECKERT, S. & WIRRELL, E. 2013. Ketogenic diet. Can J Neurol Sci, 40, 158-

67.

DICKENS, A. M., VAINIO, S., MARJAMAKI, P., JOHANSSON, J., LEHTINIEMI, P., ROKKA,

J., RINNE, J., SOLIN, O., HAAPARANTA-SOLIN, M., JONES, P. A., TRIGG, W.,

ANTHONY, D. C. & AIRAS, L. 2014. Detection of microglial activation in an acute

model of neuroinflammation using PET and radiotracers 11C-(R)-PK11195 and 18F-

GE-180. J Nucl Med, 55, 466-72.

DRÉAU, D., FOSTER, M., MORTON, D. S., FOWLER, N., KINNEY, K. & SONNENFELD, G.

2000. Immune alterations in three mouse strains following 2-deoxy-d-glucose

administration. Physiol Behav, 70, 513-520.

DRÉAU, D., MORTON, D. S., FOSTER, M., FOWLER, N. & SONNENFELD, G. 1998.

Effects of 2-deoxy-D-glucose administration on immune parameters in mice.

Immunopharmacology, 39, 201-13.

DUBE, C., BOYET, S., MARESCAUX, C. & NEHLIG, A. 2001. Relationship between

neuronal loss and interictal glucose metabolism during the chronic phase of the


200

lithium-pilocarpine model of epilepsy in the immature and adult rat. Exp Neurol, 167,

227-41.

DUFFY, B. A., CHUN, K. P., MA, D., LYTHGOE, M. F. & SCOTT, R. C. 2014.

Dexamethasone exacerbates cerebral edema and brain injury following lithium-

pilocarpine induced status epilepticus. Neurobiol Dis, 63, 229-36.

DUVEAU, V., POUYATOS, B., BRESSAND, K., BOUYSSIERES, C., CHABROL, T.,

ROCHE, Y., DEPAULIS, A. & ROUCARD, C. 2016. Differential Effects of Antiepileptic

Drugs on Focal Seizures in the Intrahippocampal Kainate Mouse Model of Mesial

Temporal Lobe Epilepsy. CNS Neurosci Ther, 22, 497-506.

DYRNA, F., HANSKE, S., KRUEGER, M. & BECHMANN, I. 2013. The blood-brain barrier. J

Neuroimmune Pharmacol, 8, 763-73.

EID, T., THOMAS, M. J., SPENCER, D. D., RUNDEN-PRAN, E., LAI, J. C., MALTHANKAR,

G. V., KIM, J. H., DANBOLT, N. C., OTTERSEN, O. P. & DE LANEROLLE, N. C.

2004. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus:

possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe

epilepsy. Lancet, 363, 28-37.

ENGEL, J., JR. 1996. Introduction to temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res, 26, 141-50.

ERGUN, E. L., SAYGI, S., YALNIZOGLU, D., OGUZ, K. K. & ERBAS, B. 2016. SPECT-PET

in Epilepsy and Clinical Approach in Evaluation. Semin Nucl Med, 46, 294-307.

EULENBURG, V. & GOMEZA, J. 2010. Neurotransmitter transporters expressed in glial cells

as regulators of synapse function. Brain Res Rev, 63, 103-12.

FABENE, P. F., NAVARRO MORA, G., MARTINELLO, M., ROSSI, B., MERIGO, F.,

OTTOBONI, L., BACH, S., ANGIARI, S., BENATI, D., CHAKIR, A., ZANETTI, L.,

SCHIO, F., OSCULATI, A., MARZOLA, P., NICOLATO, E., HOMEISTER, J. W., XIA,

L., LOWE, J. B., MCEVER, R. P., OSCULATI, F., SBARBATI, A., BUTCHER, E. C. &

CONSTANTIN, G. 2008. A role for leukocyte-endothelial adhesion mechanisms in

epilepsy. Nat Med, 14, 1377-83.

FEENEY, C., SCOTT, G., RAFFEL, J., ROBERTS, S., COELLO, C., JOLLY, A., SEARLE,

G., GOLDSTONE, A. P., BROOKS, D. J., NICHOLAS, R. S., TRIGG, W., GUNN, R.

N. & SHARP, D. J. 2016. Kinetic analysis of the translocator protein positron emission

tomography ligand [18F]GE-180 in the human brain. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 43,

2201-2210.

FELTON, E. A. & CERVENKA, M. C. 2015. Dietary therapy is the best option for refractory

nonsurgical epilepsy. Epilepsia, n/a-n/a.


201

FERNANDES, M. J., DUBE, C., BOYET, S., MARESCAUX, C. & NEHLIG, A. 1999.

Correlation between hypermetabolism and neuronal damage during status epilepticus

induced by lithium and pilocarpine in immature and adult rats. J Cereb Blood Flow

Metab, 19, 195-209.

FERNANDEZ, S., DONAIRE, A., SERES, E., SETOAIN, X., BARGALLO, N., FALCON, C.,

SANMARTI, F., MAESTRO, I., RUMIA, J., PINTOR, L., BOGET, T., APARICIO, J. &

CARRENO, M. 2015. PET/MRI and PET/MRI/SISCOM coregistration in the

presurgical evaluation of refractory focal epilepsy. Epilepsy Res, 111, 1-9.

FERRARI, C. C., DEPINO, A. M., PRADA, F., MURARO, N., CAMPBELL, S., PODHAJCER,

O., PERRY, V. H., ANTHONY, D. C. & PITOSSI, F. J. 2004. Reversible

demyelination, blood-brain barrier breakdown, and pronounced neutrophil recruitment

induced by chronic IL-1 expression in the brain. Am J Pathol, 165, 1827-37.

FISHER, R., ACEVEDO, C., ARZIMANOGLOU, A., BOGACZ, A., CROSS, J. & ELGER, C.

2014. ILAE Official Report: A practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia, 55, 475

- 482.

FISHER, R. S., CROSS, J. H., FRENCH, J. A., HIGURASHI, N., HIRSCH, E., JANSEN, F.

E., LAGAE, L., MOSHÉ, S. L., PELTOLA, J., ROULET PEREZ, E., SCHEFFER, I. E.

& ZUBERI, S. M. 2016. Operational classification of seizure types by the International

League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification

and Terminology. Epilepsia, DOI: 10.1111/epi.13670.

FORTE, N., MEDRIHAN, L., CAPPETTI, B., BALDELLI, P. & BENFENATI, F. 2016. 2-

Deoxy-d-glucose enhances tonic inhibition through the neurosteroid-mediated

activation of extrasynaptic GABAA receptors. Epilepsia, 13, 13578.

FRENCH, J. A., WILLIAMSON, P. D., THADANI, V. M., DARCEY, T. M., MATTSON, R. H.,

SPENCER, S. S. & SPENCER, D. D. 1993. Characteristics of medial temporal lobe

epilepsy: I. Results of history and physical examination. Ann Neurol, 34, 774-80.

FRIGERIO, F., FRASCA, A., WEISSBERG, I., PARRELLA, S., FRIEDMAN, A., VEZZANI, A.

& NOE, F. M. 2012. Long-lasting pro-ictogenic effects induced in vivo by rat brain

exposure to serum albumin in the absence of concomitant pathology. Epilepsia, 53,

1887-97.

GALANOPOULOU, A. S., BUCKMASTER, P. S., STALEY, K. J., MOSHE, S. L., PERUCCA,

E., ENGEL, J., JR., LOSCHER, W., NOEBELS, J. L., PITKANEN, A., STABLES, J.,

WHITE, H. S., O'BRIEN, T. J. & SIMONATO, M. 2012. Identification of new epilepsy

treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia, 53, 571-82.


202

GARCIA-ESPINOSA, M. A., RODRIGUES, T. B., SIERRA, A., BENITO, M., FONSECA, C.,

GRAY, H. L., BARTNIK, B. L., GARCIA-MARTIN, M. L., BALLESTEROS, P. &

CERDAN, S. 2004. Cerebral glucose metabolism and the glutamine cycle as

detected by in vivo and in vitro 13C NMR spectroscopy. Neurochem Int, 45, 297-303.

GARRIGA-CANUT, M., SCHOENIKE, B., QAZI, R., BERGENDAHL, K., DALEY, T. J.,

PFENDER, R. M., MORRISON, J. F., OCKULY, J., STAFSTROM, C., SUTULA, T. &

ROOPRA, A. 2006. 2-deoxy-D-glucose reduces epilepsy progression by NRSF-CtBP-

dependent metabolic regulation of chromatin structure. Nat Neurosci, 9, 1382-1387.

GASIOR, M., YANKURA, J., HARTMAN, A. L., FRENCH, A. & ROGAWSKI, M. A. 2010.

Anticonvulsant and proconvulsant actions of 2-deoxy-d-glucose. Epilepsia, 51, 1385-

1394.

GERHART, D. Z., ENERSON, B. E., ZHDANKINA, O. Y., LEINO, R. L. & DREWES, L. R.

1997. Expression of monocarboxylate transporter MCT1 by brain endothelium and

glia in adult and suckling rats. Am J Physiol, 273, E207-13.

GERHART, D. Z., LEVASSEUR, R. J., BRODERIUS, M. A. & DREWES, L. R. 1989. Glucose

transporter localization in brain using light and electron immunocytochemistry. J

Neurosci Res, 22, 464-72.

GERSHEN, L. D., ZANOTTI-FREGONARA, P., DUSTIN, I. H., LIOW, J. S., HIRVONEN, J.,

KREISL, W. C., JENKO, K. J., INATI, S. K., FUJITA, M., MORSE, C. L., BROUWER,

C., HONG, J. S., PIKE, V. W., ZOGHBI, S. S., INNIS, R. B. & THEODORE, W. H.

2015. Neuroinflammation in Temporal Lobe Epilepsy Measured Using Positron

Emission Tomographic Imaging of Translocator Protein. JAMA Neurol, 72, 882-8.

GEWORSKI, L., KNOOP, B. O. & MUNZ, D. L. 2005. Bildgebende Messtechnik in der

Nuklearmedizin, München, W. Zuckerschwerdt Verlag GmbH.

GIATTI, S., PESARESI, M., CAVALETTI, G., BIANCHI, R., CAROZZI, V., LOMBARDI, R.,

MASCHI, O., LAURIA, G., GARCIA-SEGURA, L. M., CARUSO, D. & MELCANGI, R.

C. 2009. Neuroprotective effects of a ligand of translocator protein-18 kDa (Ro5-

4864) in experimental diabetic neuropathy. Neuroscience, 164, 520-9.

GJEDDE, A., MARRETT, S. & VAFAEE, M. 2002. Oxidative and nonoxidative metabolism of

excited neurons and astrocytes. J Cereb Blood Flow Metab, 22, 1-14.

GLIEN, M., BRANDT, C., POTSCHKA, H., VOIGT, H., EBERT, U. & LÖSCHER, W. 2001.

Repeated low-dose treatment of rats with pilocarpine: low mortality but high

proportion of rats developing epilepsy. Epilepsy Res, 46, 111-9.


203

GODDARD, G. V., MCINTYRE, D. C. & LEECH, C. K. 1969. A permanent change in brain

function resulting from daily electrical stimulation. Exp Neurol, 25, 295-330.

GOLDBERG, E. M. & COULTER, D. A. 2013. Mechanisms of epileptogenesis: a

convergence on neural circuit dysfunction. Nat Rev Neurosci, 14, 337-349.

GOODKIN, H. P., YEH, J. L. & KAPUR, J. 2005. Status epilepticus increases the intracellular

accumulation of GABAA receptors. J Neurosci, 25, 5511-20.

GORDON, G. R., CHOI, H. B., RUNGTA, R. L., ELLIS-DAVIES, G. C. & MACVICAR, B. A.

2008. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.

Nature, 456, 745-9.

GORTER, J. A., VAN VLIET, E. A. & ARONICA, E. 2015. Status epilepticus, blood-brain

barrier disruption, inflammation, and epileptogenesis. Epilepsy Behav, 49, 13-6.

GOUDER, N., FRITSCHY, J. M. & BOISON, D. 2003. Seizure suppression by adenosine A1

receptor activation in a mouse model of pharmacoresistant epilepsy. Epilepsia, 44,

877-85.

GOUNDER, M. K., LIN, H., STEIN, M., GOODIN, S., BERTINO, J. R., KONG, A. N. &

DIPAOLA, R. S. 2012. A validated bioanalytical HPLC method for pharmacokinetic

evaluation of 2-deoxyglucose in human plasma. Biomed Chromatogr, 26, 650-4.

GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K. & LÖSCHER, W. 2008. Behavioral alterations in a mouse

model of temporal lobe epilepsy induced by intrahippocampal injection of kainate.

Exp Neurol, 213, 71-83.

GU, B., HUANG, Y. Z., HE, X. P., JOSHI, R. B., JANG, W. & MCNAMARA, J. O. 2015. A

Peptide Uncoupling BDNF Receptor TrkB from Phospholipase Cgamma1 Prevents

Epilepsy Induced by Status Epilepticus. Neuron, 13, 00821-1.

GUNN, R. N., LAMMERTSMA, A. A., HUME, S. P. & CUNNINGHAM, V. J. 1997. Parametric

imaging of ligand-receptor binding in PET using a simplified reference region model.

NeuroImage, 6, 279-87.





GUZMÁN, M. & BLÁZQUEZ, C. 2004. Ketone body synthesis in the brain: possible

neuroprotective effects. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 70, 287-292.


204

HAAS, R. H., RICE, M. A., TRAUNER, D. A., MERRITT, T. A., OPITZ, J. M. & REYNOLDS,

J. F. 1986. Therapeutic effects of a ketogenic diet in rett syndrome. American Journal

of Medical Genetics, 25, 225-246.

HÄRTIG, W., REICHENBACH, A., VOIGT, C., BOLTZE, J., BULAVINA, L., SCHUHMANN,

M. U., SEEGER, J., SCHUSSER, G. F., FREYTAG, C. & GROSCHE, J. 2009. Triple

fluorescence labelling of neuronal, glial and vascular markers revealing pathological

alterations in various animal models. J Chem Neuroanat, 37, 128-38.

HASHIM, S. A. & VANITALLIE, T. B. 2014. Ketone body therapy: from the ketogenic diet to

the oral administration of ketone ester. J Lipid Res, 55, 1818-26.

HAWKES, C. A., MICHALSKI, D., ANDERS, R., NISSEL, S., GROSCHE, J., BECHMANN, I.,

CARARE, R. O. & HARTIG, W. 2013. Stroke-induced opposite and age-dependent

changes of vessel-associated markers in co-morbid transgenic mice with Alzheimer-

like alterations. Exp Neurol, 250, 270-81.

HE, X. P., KOTLOSKI, R., NEF, S., LUIKART, B. W., PARADA, L. F. & MCNAMARA, J. O.

2004. Conditional deletion of TrkB but not BDNF prevents epileptogenesis in the

kindling model. Neuron, 43, 31-42.

HEINRICH, C., LAHTEINEN, S., SUZUKI, F., ANNE-MARIE, L., HUBER, S., HAUSSLER,

U., HAAS, C., LARMET, Y., CASTREN, E. & DEPAULIS, A. 2011. Increase in BDNF-

mediated TrkB signaling promotes epileptogenesis in a mouse model of mesial

temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis, 42, 35-47.

HEINRICH, C., NITTA, N., FLUBACHER, A., MULLER, M., FAHRNER, A., KIRSCH, M.,

FREIMAN, T., SUZUKI, F., DEPAULIS, A., FROTSCHER, M. & HAAS, C. A. 2006.

Reelin deficiency and displacement of mature neurons, but not neurogenesis,

underlie the formation of granule cell dispersion in the epileptic hippocampus. J

Neurosci, 26, 4701-13.

HEMINGWAY, C., FREEMAN, J. M., PILLAS, D. J. & PYZIK, P. L. 2001. The ketogenic diet:

a 3- to 6-year follow-up of 150 children enrolled prospectively. Pediatrics, 108, 898-

905.

HENRY, T. R., BABB, T. L., ENGEL, J., MAZZIOTTA, J. C., PHELPS, M. E. & CRANDALL,

P. H. 1994. Hippocampal neuronal loss and regional hypometabolism in temporal

lobe epilepsy. Annals of Neurology, 36, 925-927.

HERMAN, S. T. 2002. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology, 59,

S21-6.


205

HERRERO-MENDEZ, A., ALMEIDA, A., FERNANDEZ, E., MAESTRE, C., MONCADA, S. &

BOLANOS, J. P. 2009. The bioenergetic and antioxidant status of neurons is

controlled by continuous degradation of a key glycolytic enzyme by APC/C-Cdh1. Nat

Cell Biol, 11, 747-752.

HESKE, L., NODTVEDT, A., JADERLUND, K., BERENDT, M. & EGENVALL, A. 2014. A

cohort study of epilepsy among 665,000 insured dogs: incidence, mortality and

survival after diagnosis. Vet J, 202, 471 - 6.

HIRSCH, J. D., BEYER, C. F., MALKOWITZ, L., BEER, B. & BLUME, A. J. 1989.

Mitochondrial benzodiazepine receptors mediate inhibition of mitochondrial

respiratory control. Mol Pharmacol, 35, 157-63.

HODOLIC, M., TOPAKIAN, R. & PICHLER, R. 2016. (18)F-fluorodeoxyglucose and (18)F-

flumazenil positron emission tomography in patients with refractory epilepsy. Radiol

Oncol, 50, 247-53.

HOLTMAN, L., VAN VLIET, E. A., VAN SCHAIK, R., QUEIROZ, C. M., ARONICA, E. &

GORTER, J. A. 2009. Effects of SC58236, a selective COX-2 inhibitor, on

epileptogenesis and spontaneous seizures in a rat model for temporal lobe epilepsy.


HOUSER, C. R. 1990. Granule cell dispersion in the dentate gyrus of humans with temporal

lobe epilepsy. Brain Res, 535, 195-204.

HU, S., SHENG, W. S., EHRLICH, L. C., PETERSON, P. K. & CHAO, C. C. 2000. Cytokine

effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation, 7, 153-

9.

HUANG, S.-C. 2008. Role of Kinetic Modeling in Biomedical Imaging. J Med Sci (Taipei,

Taiwan), 28, 57-63.

HUANG, Y. Z. & MCNAMARA, J. O. 2006. Inhibiting glycolysis to reduce seizures: how it

might work, Nat Neurosci. 2006 Nov;9(11):1351-2.

HUNKELER, W., MOHLER, H., PIERI, L., POLC, P., BONETTI, E. P., CUMIN, R.,

SCHAFFNER, R. & HAEFELY, W. 1981. Selective antagonists of benzodiazepines.

Nature, 290, 514-516.

HUTTENLOCHER, P. R. 1976. Ketonemia and seizures: metabolic and anticonvulsant

effects of two ketogenic diets in childhood epilepsy. Pediatr Res, 10, 536-40.

IMAI, Y. & KOHSAKA, S. 2002. Intracellular signaling in M-CSF-induced microglia activation:

role of Iba1. Glia, 40, 164-74.


206

IRWIN, S. 1968. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative

procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.

Psychopharmacologia, 13, 222-257.

ISACKSON, P. J., HUNTSMAN, M. M., MURRAY, K. D. & GALL, C. M. 1991. BDNF mRNA

expression is increased in adult rat forebrain after limbic seizures: temporal patterns

of induction distinct from NGF. Neuron, 6, 937-48.

IVENS, S., KAUFER, D., FLORES, L. P., BECHMANN, I., ZUMSTEG, D., TOMKINS, O.,

SEIFFERT, E., HEINEMANN, U. & FRIEDMAN, A. 2007. TGF-beta receptor-

mediated albumin uptake into astrocytes is involved in neocortical epileptogenesis.

Brain, 130, 535-47.

IYER, A., ZUROLO, E., SPLIET, W. G., VAN RIJEN, P. C., BAAYEN, J. C., GORTER, J. A.

& ARONICA, E. 2010. Evaluation of the innate and adaptive immunity in type I and

type II focal cortical dysplasias. Epilepsia, 51, 1763-73.

JAKOBY, P., SCHMIDT, E., RUMINOT, I., GUTIERREZ, R., BARROS, L. F. & DEITMER, J.

W. 2014. Higher transport and metabolism of glucose in astrocytes compared with

neurons: a multiphoton study of hippocampal and cerebellar tissue slices. Cereb

Cortex, 24, 222-31.

JUGE, N., GRAY, J. A., OMOTE, H., MIYAJI, T., INOUE, T., HARA, C., UNEYAMA, H.,

EDWARDS, R. H., NICOLL, R. A. & MORIYAMA, Y. 2010. Metabolic control of

vesicular glutamate transport and release. Neuron, 68, 99-112.

JUNG, K. H., CHU, K., LEE, S. T., KIM, J., SINN, D. I., KIM, J. M., PARK, D. K., LEE, J. J.,

KIM, S. U., KIM, M., LEE, S. K. & ROH, J. K. 2006. Cyclooxygenase-2 inhibitor,

celecoxib, inhibits the altered hippocampal neurogenesis with attenuation of

spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus.

Neurobiol Dis, 23, 237-46.




KADOWAKI, A., SADA, N., JUGE, N., WAKASA, A., MORIYAMA, Y. & INOUE, T. 2017.

Neuronal inhibition and seizure suppression by acetoacetate and its analog, 2-

phenylbutyrate. Epilepsia, 11, 13718.

KANNER, A. M., MAZARATI, A. & KOEPP, M. 2014. Biomarkers of epileptogenesis:

psychiatric comorbidities (?). Neurotherapeutics, 11, 358-72.


207

KANNER, A. M. & PALAC, S. 2000. Depression in Epilepsy: A Common but Often

Unrecognized Comorbid Malady. Epilepsy Behav, 1, 37-51.

KAWADA, J., KIMURA, H., ITO, Y., HARA, S., IRIYAMA, M., YOSHIKAWA, T. &

MORISHIMA, T. 2003. Systemic cytokine responses in patients with influenza-

associated encephalopathy. J Infect Dis, 188, 690-8.

KAWAMURA, M., JR., RUSKIN, D. N. & MASINO, S. A. 2010. Metabolic autocrine regulation

of neurons involves cooperation among pannexin hemichannels, adenosine

receptors, and KATP channels. J Neurosci, 30, 3886-95.

KEARSLEY-FLEET, L., O'NEILL, D., VOLK, H., CHURCH, D. & BRODBELT, D. 2013.

Prevalence and risk factors for canine epilepsy of unknown origin in the UK. Vet Rec,

172, 338.

KENNEDY, S. H., EVANS, K. R., KRUGER, S., MAYBERG, H. S., MEYER, J. H., MCCANN,

S., ARIFUZZMAN, A. I., HOULE, S. & VACCARINO, F. J. 2001. Changes in regional

brain glucose metabolism measured with positron emission tomography after

paroxetine treatment of major depression. Am J Psychiatry, 158, 899-905.

KIM, D. Y., SIMEONE, K. A., SIMEONE, T. A., PANDYA, J. D., WILKE, J. C., AHN, Y.,

GEDDES, J. W., SULLIVAN, P. G. & RHO, J. M. 2015. Ketone Bodies Mediate Anti-

Seizure Effects Through Mitochondrial Permeability Transition. Ann Neurol, 20,

24424.

KIPNIS, D. M. & CORI, C. F. 1959. Studies of tissue permeability. V. The penetration and

phosphorylation of 2-deoxyglucose in the rat diaphragm. J Biol Chem, 234, 171-7.

KLEE, R., BRANDT, C., TÖLLNER, K. & LÖSCHER, W. 2017. Various modifications of the

intrahippocampal kainate model of mesial temporal lobe epilepsy in rats fail to resolve

the marked rat-to-mouse differences in type and frequency of spontaneous seizures

in this model. Epilepsy Behav, 68, 129-140.

KLEIN, S., BANKSTAHL, J. P., LOSCHER, W. & BANKSTAHL, M. 2015a. Sucrose

consumption test reveals pharmacoresistant depression-associated behavior in two

mouse models of temporal lobe epilepsy. Exp Neurol, 263, 263-71.

KLEIN, S., BANKSTAHL, M. & LOSCHER, W. 2015b. Inter-individual variation in the effect of

antiepileptic drugs in the intrahippocampal kainate model of mesial temporal lobe

epilepsy in mice. Neuropharmacology, 90, 53-62.

KORCZYN, A. D., SCHACHTER, S. C., BRODIE, M. J., DALAL, S. S., ENGEL, J., JR.,

GUEKHT, A., HECIMOVIC, H., JERBI, K., KANNER, A. M., JOHANNESSEN

LANDMARK, C., MARES, P., MARUSIC, P., MELETTI, S., MULA, M., PATSALOS,


208

P. N., REUBER, M., RYVLIN, P., STILLOVA, K., TUCHMAN, R. & REKTOR, I. 2013.

Epilepsy, cognition, and neuropsychiatry (Epilepsy, Brain, and Mind, part 2). Epilepsy

Behav, 28, 283-302.

KORNBLUM, H. I., ARAUJO, D. M., ANNALA, A. J., TATSUKAWA, K. J., PHELPS, M. E. &

CHERRY, S. R. 2000. In vivo imaging of neuronal activation and plasticity in the rat

brain by high resolution positron emission tomography (microPET). Nat Biotechnol,

18, 655-60.

KOSSOFF, E. H., HENRY, B. J. & CERVENKA, M. C. Efficacy of dietary therapy for juvenile

myoclonic epilepsy. Epilepsy Behav, 26, 162-164.

KOSSOFF, E. H., MCGROGAN, J. R., BLUML, R. M., PILLAS, D. J., RUBENSTEIN, J. E. &

VINING, E. P. 2006. A modified Atkins diet is effective for the treatment of intractable

pediatric epilepsy. Epilepsia, 47, 421-4.

KOSSOFF, E. H., THIELE, E. A., PFEIFER, H. H., MCGROGAN, J. R. & FREEMAN, J. M.

2005. Tuberous Sclerosis Complex and the Ketogenic Diet. Epilepsia, 46, 1684-1686.

KOTLOSKI, R. & MCNAMARA, J. O. 2010. Reduction of TrkB expression de novo in the

adult mouse impairs epileptogenesis in the kindling model. Hippocampus, 20, 713-23.

KRALIC, J. E., LEDERGERBER, D. A. & FRITSCHY, J. M. 2005. Disruption of the

neurogenic potential of the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy

with focal seizures. Eur J Neurosci, 22, 1916-27.

KRUEGER, K. E. & PAPADOPOULOS, V. 1990. Peripheral-type benzodiazepine receptors

mediate translocation of cholesterol from outer to inner mitochondrial membranes in

adrenocortical cells. J Biol Chem, 265, 15015-22.

KRUEGER, M., BECHMANN, I., IMMIG, K., REICHENBACH, A., HÄRTIG, W. &

MICHALSKI, D. 2015. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of

vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. J Cereb

Blood Flow Metab, 35, 292-303.

KWON, O. Y. & PARK, S. P. 2014. Depression and anxiety in people with epilepsy. J Clin

Neurol, 10, 175-88.

LAGAE, L., BUYSE, G., CEULEMANS, B., CLAEYS, P., DEDEURWAERDERE, S., DE

MEIRLEIR, L., HAUMAN, R., JANSSEN, A., SCHMEDDING, E., VERHELST, H. &

VONCK, K. 2003. Anti-epileptogenesis research: the clinical relevance. Acta Neurol

Belg, 103, 78-82.

LAMMERTSMA, A. A. & HUME, S. P. 1996. Simplified reference tissue model for PET

receptor studies. NeuroImage, 4, 153-8.


209

LAMPIDIS, T. J., KURTOGLU, M., MAHER, J. C., LIU, H., KRISHAN, A., SHEFT, V.,

SZYMANSKI, S., FOKT, I., RUDNICKI, W. R., GINALSKI, K., LESYNG, B. &

PRIEBE, W. 2006. Efficacy of 2-halogen substituted D-glucose analogs in blocking

glycolysis and killing "hypoxic tumor cells". Cancer Chemother Pharmacol, 58, 725-

34.

LAMUSUO, S., PITKANEN, A., JUTILA, L., YLINEN, A., PARTANEN, K., KALVIAINEN, R.,

RUOTTINEN, H. M., OIKONEN, V., NAGREN, K., LEHIKOINEN, P., VAPALAHTI, M.,

VAINIO, P. & RINNE, J. O. 2000. [11 C]Flumazenil binding in the medial temporal

lobe in patients with temporal lobe epilepsy: correlation with hippocampal MR

volumetry, T2 relaxometry, and neuropathology. Neurology, 54, 2252-60.



LAURITZEN, K. H., HASAN-OLIVE, M. M., REGNELL, C. E., KLEPPA, L., SCHEIBYE-

KNUDSEN, M., GJEDDE, A., KLUNGLAND, A., BOHR, V. A., STORM-MATHISEN,

J. & BERGERSEN, L. H. 2016. A ketogenic diet accelerates neurodegeneration in

mice with induced mitochondrial DNA toxicity in the forebrain. Neurobiol Aging, 48,

34-47.

LAVISSE, S., GUILLERMIER, M., HERARD, A. S., PETIT, F., DELAHAYE, M., VAN CAMP,

N., BEN HAIM, L., LEBON, V., REMY, P., DOLLE, F., DELZESCAUX, T.,

BONVENTO, G., HANTRAYE, P. & ESCARTIN, C. 2012. Reactive astrocytes

overexpress TSPO and are detected by TSPO positron emission tomography

imaging. J Neurosci, 32, 10809-18.

LE DUIGOU, C., WITTNER, L., DANGLOT, L. & MILES, R. 2005. Effects of focal injection of

kainic acid into the mouse hippocampus in vitro and ex vivo. J Physiol, 569, 833-47.

LECLERCQ, K., MATAGNE, A. & KAMINSKI, R. M. 2014. Low potency and limited efficacy

of antiepileptic drugs in the mouse 6Hz corneal kindling model. Epilepsy Res, 108,

675-83.





LEE, J., BRUCE-KELLER, A. J., KRUMAN, Y., CHAN, S. L. & MATTSON, M. P. 1999. 2-

Deoxy-D-glucose protects hippocampal neurons against excitotoxic and oxidative

injury: evidence for the involvement of stress proteins. J Neurosci Res, 57, 48-61.


210

LEHMANN, J., HARTIG, W., SEIDEL, A., FULDNER, C., HOBOHM, C., GROSCHE, J.,

KRUEGER, M. & MICHALSKI, D. 2014. Inflammatory cell recruitment after

experimental thromboembolic stroke in rats. Neuroscience, 279, 139-54.

LEIDENHEIMER, N. J. 2008. Regulation of excitation by GABA(A) receptor internalization.

Results Probl Cell Differ, 44, 1-28.

LEINO, R. L., GERHART, D. Z., DUELLI, R., ENERSON, B. E. & DREWES, L. R. 2001. Diet-

induced ketosis increases monocarboxylate transporter (MCT1) levels in rat brain.


LENFANT, M., HAUMONT, J. & ZAVALA, F. 1986. In vivo immunomodulating activity of PK

1195, a structurally unrelated ligand for "peripheral" benzodiazepine binding sites--I.

Potentiation in mice of the humoral response to sheep red blood cells. Int J

Immunopharmacol, 8, 825-8.

LI, F., LIU, J., LIU, N., KUHN, L. A., GARAVITO, R. M. & FERGUSON-MILLER, S. 2016.

Translocator Protein 18 kDa (TSPO): An Old Protein with New Functions?

Biochemistry, 55, 2821-31.

LIAN, X. Y., KHAN, F. A. & STRINGER, J. L. 2007. Fructose-1,6-bisphosphate has

anticonvulsant activity in models of acute seizures in adult rats. J Neurosci, 27,

12007-12011.

LIBRIZZI, L., NOÈ, F., VEZZANI, A., DE CURTIS, M. & RAVIZZA, T. 2012. Seizure-induced

brain-borne inflammation sustains seizure recurrence and blood–brain barrier

damage. Ann Neurol, 72, 82-90.

LIEFAARD, L. C., PLOEGER, B. A., MOLTHOFF, C. F., DE JONG, H. W., DIJKSTRA, J.,

VAN DER WEERD, L., LAMMERTSMA, A. A., DANHOF, M. & VOSKUYL, R. A.

2009. Changes in GABAA receptor properties in amygdala kindled animals: in vivo

studies using [11C]flumazenil and positron emission tomography. Epilepsia, 50, 88-

98.

LIKHODII, S., NYLEN, K. & BURNHAM, W. M. 2008. Acetone as an anticonvulsant.

Epilepsia, 8, 83-6.

LIU, G., GU, B., HE, X. P., JOSHI, R. B., WACKERLE, H. D., RODRIGUIZ, R. M., WETSEL,

W. C. & MCNAMARA, J. O. 2013. Transient inhibition of TrkB kinase after status

epilepticus prevents development of temporal lobe epilepsy. Neuron, 79, 31-8.

LIU, Z. J., SHIRAKAWA, T., LI, Y., SOMA, A., OKA, M., DOTTO, G. P., FAIRMAN, R. M.,

VELAZQUEZ, O. C. & HERLYN, M. 2003. Regulation of Notch1 and Dll4 by vascular


211

endothelial growth factor in arterial endothelial cells: implications for modulating

arteriogenesis and angiogenesis. Mol Cell Biol, 23, 14-25.

LOEWEN, J. L., BARKER-HALISKI, M. L., DAHLE, E. J., WHITE, H. S. & WILCOX, K. S.

2016. Neuronal Injury, Gliosis, and Glial Proliferation in Two Models of Temporal

Lobe Epilepsy. J Neuropathol Exp Neurol, 75, 366-78.

LOPES-CARDOZO, M., LARSSON, O. M. & SCHOUSBOE, A. 1986. Acetoacetate and

glucose as lipid precursors and energy substrates in primary cultures of astrocytes

and neurons from mouse cerebral cortex. J Neurochem, 46, 773-8.

LÖSCHER, W. 2016. Fit for purpose application of currently existing animal models in the

discovery of novel epilepsy therapies. Epilepsy Research, 126, 157-184.

LÖSCHER, W. & BRANDT, C. 2010. Prevention or modification of epileptogenesis after

brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacol Rev,

62, 668-700.

LOTHMAN, E. W. & COLLINS, R. C. 1981. Kainic acid induced limbic seizures: metabolic,

behavioral, electroencephalographic and neuropathological correlates. Brain Res,

218, 299-318.

LOTHMAN, E. W., HATLELID, J. M. & ZORUMSKI, C. F. 1985. Functional mapping of limbic

seizures originating in the hippocampus: a combined 2-deoxyglucose and

electrophysiologic study. Brain Res, 360, 92-100.

LOWENSTEIN, D. H. 2009. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia, 2, 4-9.

LUKASIUK, K. & BECKER, A. J. 2014. Molecular biomarkers of epileptogenesis.

Neurotherapeutics, 11, 319-23.

MA, W., BERG, J. & YELLEN, G. 2007. Ketogenic diet metabolites reduce firing in central

neurons by opening K(ATP) channels. J Neurosci, 27, 3618-25.





MAGISTRETTI, PIERRE J. & ALLAMAN, I. 2015. A Cellular Perspective on Brain Energy

Metabolism and Functional Imaging. Neuron, 86, 883-901.

MAKINO, K., TANAKA, T. & YONEMASU, Y. 1988. Regional cerebral blood flow and kainic

acid-induced focal limbic seizures in cats. Epilepsy Res, 2, 260-268.

MANDEMA, J. W., GUBBENS-STIBBE, J. M. & DANHOF, M. 1991. Stability and

pharmacokinetics of flumazenil in the rat. Psychopharmacology (Berl), 103, 384-7.


212

MARCHI, N., ANGELOV, L., MASARYK, T., FAZIO, V., GRANATA, T., HERNANDEZ, N.,

HALLENE, K., DIGLAW, T., FRANIC, L., NAJM, I. & JANIGRO, D. 2007a. Seizure-

promoting effect of blood-brain barrier disruption. Epilepsia, 48, 732-42.

MARCHI, N., OBY, E., BATRA, A., UVA, L., DE CURTIS, M., HERNANDEZ, N., VAN

BOXEL-DEZAIRE, A., NAJM, I. & JANIGRO, D. 2007b. In vivo and in vitro effects of

pilocarpine: relevance to ictogenesis. Epilepsia, 48, 1934-46.

MAROSO, M., BALOSSO, S., RAVIZZA, T., IORI, V., WRIGHT, C. I., FRENCH, J. &

VEZZANI, A. 2011. Interleukin-1beta biosynthesis inhibition reduces acute seizures

and drug resistant chronic epileptic activity in mice. Neurotherapeutics, 8, 304-15.

MAROSO, M., BALOSSO, S., RAVIZZA, T., LIU, J., ARONICA, E., IYER, A. M., ROSSETTI,

C., MOLTENI, M., CASALGRANDI, M., MANFREDI, A. A., BIANCHI, M. E. &

VEZZANI, A. 2010. Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in

ictogenesis and can be targeted to reduce seizures. Nat Med, 16, 413-9.

MARSH, E. B., FREEMAN, J. M., KOSSOFF, E. H., VINING, E. P., RUBENSTEIN, J. E.,

PYZIK, P. L. & HEMINGWAY, C. 2006. The outcome of children with intractable

seizures: a 3- to 6-year follow-up of 67 children who remained on the ketogenic diet

less than one year. Epilepsia, 47, 425-30.

MARTIN, K., JACKSON, C. F., LEVY, R. G. & COOPER, P. N. 2016. Ketogenic diet and

other dietary treatments for epilepsy. Cochrane Database Syst Rev, 9.

MASINO, S. A. 2016. Ketogenic Diet and Metabolic Therapies: Expanded Roles in Health

and Disease, Oxford University Press, Incorporated.

MASINO, S. A., LI, T., THEOFILAS, P., SANDAU, U. S., RUSKIN, D. N., FREDHOLM, B. B.,

GEIGER, J. D., ARONICA, E. & BOISON, D. 2011. A ketogenic diet suppresses

seizures in mice through adenosine A(1) receptors. J Clin Invest, 121, 2679-83.

MATAGNE, A. & KLITGAARD, H. 1998. Validation of corneally kindled mice: a sensitive

screening model for partial epilepsy in man. Epilepsy Res, 31, 59-71.

MATAGNE, A., MARGINEANU, D. G., KENDA, B., MICHEL, P. & KLITGAARD, H. 2008.

Anti-convulsive and anti-epileptic properties of brivaracetam (ucb 34714), a high-

affinity ligand for the synaptic vesicle protein, SV2A. Br J Pharmacol, 154, 1662-71.

MAZZUFERI, M., KUMAR, G., VAN EYLL, J., DANIS, B., FOERCH, P. & KAMINSKI, R. M.

2013. Nrf2 defense pathway: Experimental evidence for its protective role in epilepsy.

Ann Neurol, 74, 560-8.

MCINTYRE, D. C., POULTER, M. O. & GILBY, K. 2002. Kindling: some old and some new.



213

MCKERNAN, R. M., WAFFORD, K., QUIRK, K., HADINGHAM, K. L., HARLEY, E. A.,

RAGAN, C. I. & WHITING, P. J. 1995. The pharmacology of the benzodiazepine site

of the GABA-A receptor is dependent on the type of gamma-subunit present. J

Recept Signal Transduct Res, 15, 173-83.

MCNALLY, M. A. & HARTMAN, A. L. 2012. Ketone bodies in epilepsy. J Neurochem, 121,

28-35.

MENG, X.-F., TAN, L., TAN, M.-S., JIANG, T., TAN, C.-C., LI, M.-M., WANG, H.-F. & YU, J.-

T. 2014. Inhibition of the NLRP3 inflammasome provides neuroprotection in rats

following amygdala kindling-induced status epilepticus. J Neuroinflammation, 11, 212.

MERGENTHALER, P., LINDAUER, U., DIENEL, G. A. & MEISEL, A. 2013. Sugar for the

brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends

Neurosci, 36, 587-597.

MICHALSKI, D., GROSCHE, J., PELZ, J., SCHNEIDER, D., WEISE, C., BAUER, U.,

KACZA, J., GARTNER, U., HOBOHM, C. & HARTIG, W. 2010. A novel quantification

of blood-brain barrier damage and histochemical typing after embolic stroke in rats.

Brain Res, 1359, 186-200.

MIELKE, J. G. & WANG, Y. T. 2005. Insulin exerts neuroprotection by counteracting the

decrease in cell-surface GABA receptors following oxygen-glucose deprivation in

cultured cortical neurons. J Neurochem, 92, 103-13.

MILDER, J. B., LIANG, L. P. & PATEL, M. 2010. Acute oxidative stress and systemic Nrf2

activation by the ketogenic diet. Neurobiol Dis, 40, 238-44.

MILLER, P. W., LONG, N. J., VILAR, R. & GEE, A. D. 2008. Synthesis of 11C, 18F, 15O,

and 13N radiolabels for positron emission tomography. Angew Chem Int Ed Engl, 47,

8998-9033.





MIRRIONE, M. M., SCHIFFER, W. K., SIDDIQ, M., DEWEY, S. L. & TSIRKA, S. E. 2006.

PET imaging of glucose metabolism in a mouse model of temporal lobe epilepsy.

Synapse, 59, 119-21.

MORIMOTO, K., FAHNESTOCK, M. & RACINE, R. J. 2004. Kindling and status epilepticus

models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology, 73, 1-60.


214

MORIN-BRUREAU, M., RIGAU, V. & LERNER-NATOLI, M. 2012. Why and how to target

angiogenesis in focal epilepsies. Epilepsia, 53 Suppl 6, 64-8.

MORRIS, A. A., LASCELLES, C. V., OLPIN, S. E., LAKE, B. D., LEONARD, J. V. & QUANT,

P. A. 1998. Hepatic mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a synthase

deficiency. Pediatr Res, 44, 392-6.

MORRIS, A. A. M. 2005. Cerebral ketone body metabolism. J Inherit Metab Dis, 28, 109-121.

MUKHIN, A. G., PAPADOPOULOS, V., COSTA, E. & KRUEGER, K. E. 1989. Mitochondrial

benzodiazepine receptors regulate steroid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A,

86, 9813-6.

MULLER-SCHWARZE, A. B., TANDON, P., LIU, Z., YANG, Y., HOLMES, G. L. &

STAFSTROM, C. E. 1999. Ketogenic diet reduces spontaneous seizures and mossy

fiber sprouting in the kainic acid model. Neuroreport, 10, 1517-22.

MÜLLER HERDE, A., BENKE, D., RALVENIUS, W. T., MU, L., SCHIBLI, R., ZEILHOFER,

H. U. & KRÄMER, S. D. 2017. GABAA receptor subtypes in the mouse brain:

Regional mapping and diazepam receptor occupancy by in vivo [18F]flumazenil PET.

Neuroimage, 150, 279-291.

MUNGER CLARY, H. M. 2014. Anxiety and epilepsy: what neurologists and epileptologists

should know. Curr Neurol Neurosci Rep, 14, 014-0445.

MURRAY, K. D., ISACKSON, P. J., ESKIN, T. A., KING, M. A., MONTESINOS, S. P.,

ABRAHAM, L. A. & ROPER, S. N. 2000. Altered mRNA expression for brain-derived

neurotrophic factor and type II calcium/Calmodulin-dependent protein kinase in the

hippocampus of patients with intractable temporal lobe epilepsy. J Comp Neurol, 418,

411-422.

MUZIK, O., DA SILVA, E. A., JUHASZ, C., CHUGANI, D. C., SHAH, J., NAGY, F., CANADY,

A., VON STOCKHAUSEN, H. M., HERHOLZ, K., GATES, J., FROST, M., RITTER,

F., WATSON, C. & CHUGANI, H. T. 2000. Intracranial EEG versus flumazenil and

glucose PET in children with extratemporal lobe epilepsy. Neurology, 54, 171-9.

NAYLOR, D. E., LIU, H. & WASTERLAIN, C. G. 2005. Trafficking of GABA A Receptors,

Loss of Inhibition, and a Mechanism for Pharmacoresistance in Status Epilepticus. J

Neurosci, 25, 7724.

NDODE-EKANE, X. E., HAYWARD, N., GROHN, O. & PITKANEN, A. 2010. Vascular

changes in epilepsy: functional consequences and association with network plasticity

in pilocarpine-induced experimental epilepsy. Neuroscience, 166, 312-32.


215

NEAVE, N., REID, C., SCHOLEY, A. B., THOMPSON, J. M., MOSS, M., AYRE, G.,

WESNES, K. & GIRDLER, N. M. 2000. Sedation: Dose-dependent effects of

Flumazenil on cognition, mood, and cardio-respiratory physiology in healthy

volunteers. Br Dent J, 189, 668-674.

NGUGI, A. K., BOTTOMLEY, C., KLEINSCHMIDT, I., SANDER, J. W. & NEWTON, C. R.

2010. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: A meta-analytic

approach. Epilepsia, 51, 883-890.

NGUYEN, N., FAKRA, E., PRADEL, V., JOUVE, E., ALQUIER, C., LE GUERN, M. E.,

MICALLEF, J. & BLIN, O. 2006. Efficacy of etifoxine compared to lorazepam

monotherapy in the treatment of patients with adjustment disorders with anxiety: a

double-blind controlled study in general practice. Hum Psychopharmacol, 21, 139-49.

NIRENBERG, M. W. & HOGG, J. F. 1958. Inhibition of anaerobic glycolysis in Ehrlich ascites

tumor cells by 2-deoxy-D-glucose. Cancer Res, 18, 518-21.

NOE, F. M., POLASCHECK, N., FRIGERIO, F., BANKSTAHL, M., RAVIZZA, T., MARCHINI,

S., BELTRAME, L., BANDERÓ, C. R., LÖSCHER, W. & VEZZANI, A. 2013.

Pharmacological blockade of IL-1beta/IL-1 receptor type 1 axis during

epileptogenesis provides neuroprotection in two rat models of temporal lobe epilepsy.

Neurobiol Dis, 59, 183-93.

NOH, H. S., HAH, Y. S., NILUFAR, R., HAN, J., BONG, J. H., KANG, S. S., CHO, G. J. &

CHOI, W. S. 2006. Acetoacetate protects neuronal cells from oxidative glutamate

toxicity. J Neurosci Res, 83, 702-9.

NOH, H. S., KIM, Y. S. & CHOI, W. S. 2008. Neuroprotective effects of the ketogenic diet.

Epilepsia, 49, 120-123.

NYLEN, K., VELAZQUEZ, J. L., SAYED, V., GIBSON, K. M., BURNHAM, W. M. & SNEAD,

O. C., 3RD 2009. The effects of a ketogenic diet on ATP concentrations and the

number of hippocampal mitochondria in Aldh5a1(-/-) mice. Biochim Biophys Acta,

1790, 208-12.

ODANO, I., HALLDIN, C., KARLSSON, P., VARRONE, A., AIRAKSINEN, A. J.,

KRASIKOVA, R. N. & FARDE, L. 2009. [18F]flumazenil binding to central

benzodiazepine receptor studies by PET--quantitative analysis and comparisons with

[11C]flumazenil. NeuroImage, 45, 891-902.

PAN, J. W., WILLIAMSON, A., CAVUS, I., HETHERINGTON, H. P., ZAVERI, H., PETROFF,

O. A. & SPENCER, D. D. 2008. Neurometabolism in human epilepsy. Epilepsia, 3,

31-41.


216

PAPADOPOULOS, V., BARALDI, M., GUILARTE, T. R., KNUDSEN, T. B., LACAPERE, J.

J., LINDEMANN, P., NORENBERG, M. D., NUTT, D., WEIZMAN, A., ZHANG, M. R.

& GAVISH, M. 2006. Translocator protein (18kDa): new nomenclature for the

peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and molecular

function. Trends Pharmacol Sci, 27, 402-9.

PARADISO, B., MARCONI, P., ZUCCHINI, S., BERTO, E., BINASCHI, A., BOZAC, A.,

BUZZI, A., MAZZUFERI, M., MAGRI, E., NAVARRO MORA, G., RODI, D., SU, T.,

VOLPI, I., ZANETTI, L., MARZOLA, A., MANSERVIGI, R., FABENE, P. F. &

SIMONATO, M. 2009. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-

derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc

Natl Acad Sci U S A, 106, 7191-6.

PAXINOS, G. & FRANKLIN, K. B. J. 2004. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates,

Elsevier Academic Press.

PAXINOS, G. & WATSON, C. 2007. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Elsevier.

PELLERIN, L. & MAGISTRETTI, P. J. 1994. Glutamate uptake into astrocytes stimulates

aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proc

Natl Acad Sci U S A, 91, 10625-9.

PELLERIN, L., PELLEGRI, G., MARTIN, J. L. & MAGISTRETTI, P. J. 1998. Expression of

monocarboxylate transporter mRNAs in mouse brain: support for a distinct role of

lactate as an energy substrate for the neonatal vs. adult brain. Proc Natl Acad Sci U

S A, 95, 3990-5.

PERNOT, F., HEINRICH, C., BARBIER, L., PEINNEQUIN, A., CARPENTIER, P., DHOTE,

F., BAILLE, V., BEAUP, C., DEPAULIS, A. & DORANDEU, F. 2011. Inflammatory

changes during epileptogenesis and spontaneous seizures in a mouse model of

mesiotemporal lobe epilepsy. Epilepsia, 52, 2315-25.

PETROFF, O. A., ERRANTE, L. D., ROTHMAN, D. L., KIM, J. H. & SPENCER, D. D. 2002.

Glutamate-glutamine cycling in the epileptic human hippocampus. Epilepsia, 43, 703-

10.

PETZOLD, G. C. & MURTHY, V. N. 2011. Role of astrocytes in neurovascular coupling.

Neuron, 71, 782-97.

PFEIFER, H. H. & THIELE, E. A. 2005. Low-glycemic-index treatment: a liberalized

ketogenic diet for treatment of intractable epilepsy. Neurology, 65, 1810-2.

PIFFERI, F., TREMBLAY, S., CROTEAU, E., FORTIER, M., TREMBLAY-MERCIER, J.,

LECOMTE, R. & CUNNANE, S. C. 2011. Mild experimental ketosis increases brain


217

uptake of 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose: a dual-tracer PET imaging

study in rats. Nutr Neurosci, 14, 51-58.

PITKÄNEN, A., LÖSCHER, W., VEZZANI, A., BECKER, A. J., SIMONATO, M., LUKASIUK,

K., GROHN, O., BANKSTAHL, J. P., FRIEDMAN, A., ARONICA, E., GORTER, J. A.,

RAVIZZA, T., SISODIYA, S. M., KOKAIA, M. & BECK, H. 2016. Advances in the

development of biomarkers for epilepsy. Lancet Neurol, 15, 843-56.

PITKÄNEN, A. & LUKASIUK, K. 2011. Mechanisms of epileptogenesis and potential

treatment targets. Lancet Neurol, 10, 173-86.

PITTAU, F., GROUILLER, F., SPINELLI, L., SEECK, M., MICHEL, C. M. & VULLIEMOZ, S.

2014. The Role of Functional Neuroimaging in Pre-Surgical Epilepsy Evaluation,

Front Neurol. 2014 Mar 24;5:31. eCollection 2014.

POLASCHECK, N., BANKSTAHL, M. & LÖSCHER, W. 2010. The COX-2 inhibitor parecoxib

is neuroprotective but not antiepileptogenic in the pilocarpine model of temporal lobe


PORRAS, O. H., LOAIZA, A. & BARROS, L. F. 2004. Glutamate Mediates Acute Glucose

Transport Inhibition in Hippocampal Neurons. J Neurosci, 24, 9669.

POTSCHKA, H. & LÖSCHER, W. 1999. Corneal kindling in mice: behavioral and

pharmacological differences to conventional kindling. Epilepsy Res, 37, 109-20.

PRINS, M. L., FUJIMA, L. S. & HOVDA, D. A. 2005. Age-dependent reduction of cortical

contusion volume by ketones after traumatic brain injury. J Neurosci Res, 82, 413-20.

RACINE, R. J. 1972. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor

seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 32, 281-294.

RAEZ, L. E., PAPADOPOULOS, K., RICART, A. D., CHIOREAN, E. G., DIPAOLA, R. S.,

STEIN, M. N., ROCHA LIMA, C. M., SCHLESSELMAN, J. J., TOLBA, K.,

LANGMUIR, V. K., KROLL, S., JUNG, D. T., KURTOGLU, M., ROSENBLATT, J. &

LAMPIDIS, T. J. 2013. A phase I dose-escalation trial of 2-deoxy-D-glucose alone or

combined with docetaxel in patients with advanced solid tumors. Cancer Chemother

Pharmacol, 71, 523-30.

RAVIZZA, T., GAGLIARDI, B., NOE, F., BOER, K., ARONICA, E. & VEZZANI, A. 2008.

Innate and adaptive immunity during epileptogenesis and spontaneous seizures:

evidence from experimental models and human temporal lobe epilepsy. Neurobiol

Dis, 29, 142-60.

RIBAN, V., BOUILLERET, V., PHAM-LE, B. T., FRITSCHY, J. M., MARESCAUX, C. &

DEPAULIS, A. 2002. Evolution of hippocampal epileptic activity during the


218

development of hippocampal sclerosis in a mouse model of temporal lobe epilepsy.


RIGAU, V., MORIN, M., ROUSSET, M.-C., DE BOCK, F., LEBRUN, A., COUBES, P.,

PICOT, M.-C., BALDY-MOULINIER, M., BOCKAERT, J., CRESPEL, A. & LERNER-

NATOLI, M. 2007. Angiogenesis is associated with blood–brain barrier permeability in


ROCH, C., LEROY, C., NEHLIG, A. & NAMER, I. J. 2002a. Magnetic resonance imaging in

the study of the lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in adult rats.


ROCH, C., LEROY, C., NEHLIG, A. & NAMER, IZZIE J. 2002b. Magnetic Resonance

Imaging in the Study of the Lithium–Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy in

Adult Rats. Epilepsia, 43, 325-335.

ROSENBERG, G. A. 2012. Neurological diseases in relation to the blood-brain barrier. J

Cereb Blood Flow Metab, 32, 1139-51.

ROSETI, C., VAN VLIET, E. A., CIFELLI, P., RUFFOLO, G., BAAYEN, J. C., DI CASTRO,

M. A., BERTOLLINI, C., LIMATOLA, C., ARONICA, E., VEZZANI, A. & PALMA, E.

2015. GABAA currents are decreased by IL-1beta in epileptogenic tissue of patients

with temporal lobe epilepsy: implications for ictogenesis. Neurobiol Dis, 82, 311-20.

ROWLEY, N. M. & WHITE, H. S. 2010. Comparative anticonvulsant efficacy in the corneal

kindled mouse model of partial epilepsy: Correlation with other seizure and epilepsy

models. Epilepsy Res, 92, 163-9.

RUSSMANN, V., GOC, J., BOES, K., ONGERTH, T., SALVAMOSER, J. D., SIEGL, C. &

POTSCHKA, H. 2016. Minocycline fails to exert antiepileptogenic effects in a rat

status epilepticus model. Eur J Pharmacol, 771, 29-39.

RUSTENHOVEN, J., JANSSON, D., SMYTH, L. C. & DRAGUNOW, M. 2017. Brain

Pericytes As Mediators of Neuroinflammation. Trends Pharmacol Sci, 38, 291-304.

RYVLIN, P., BOUVARD, S., LE BARS, D., DE LAMÉRIE, G., GRÉGOIRE, M. C., KAHANE,

P., FROMENT, J. C. & MAUGUIÈRE, F. 1998. Clinical utility of flumazenil-PET

versus [18F]fluorodeoxyglucose-PET and MRI in refractory partial epilepsy. A

prospective study in 100 patients. Brain, 121, 2067-2081.

RYZHIKOV, N. N., SENECA, N., KRASIKOVA, R. N., GOMZINA, N. A., SHCHUKIN, E.,

FEDOROVA, O. S., VASSILIEV, D. A., GULYAS, B., HALL, H., SAVIC, I. &

HALLDIN, C. 2005. Preparation of highly specific radioactivity [18F]flumazenil and its


219

evaluation in cynomolgus monkey by positron emission tomography. Nucl Med Biol,

32, 109-16.

RZEZAK, P., LIMA, E. M., GARGARO, A. C., COIMBRA, E., DE VINCENTIIS, S.,

VELASCO, T. R., LEITE, J. P., BUSATTO, G. F. & VALENTE, K. D. 2017. Everyday

memory impairment in patients with temporal lobe epilepsy caused by hippocampal

sclerosis. Epilepsy Behav, 69, 31-36.

SAHA, R., MOHAPATRA, S., KAR, S. K., TEKKALAKI, B. & ANAND, K. S. 2017. Causative

factors and phenomenology of depression in EPILEPSY—A review. International

Journal of Epilepsy.

SAKIYAMA, Y., SAITO, M. & INOUE, O. 2006. Acute treatment with pentobarbital alters the

kinetics of in vivo receptor binding in the mouse brain. Nuclear Medicine and Biology,

33, 535-541.

SALZBERG, M., TAHER, T., DAVIE, M., CARNE, R., HICKS, R. J., COOK, M., MURPHY,

M., VINTON, A. & O'BRIEN, T. J. 2006. Depression in temporal lobe epilepsy surgery

patients: an FDG-PET study. Epilepsia, 47, 2125-30.

SAMOKHINA, E., POPOVA, I., MALKOV, A., IVANOV, A. I., PAPADIA, D., OSYPOV, A.,

MOLCHANOV, M., PASKEVICH, S., FISAHN, A., ZILBERTER, M. & ZILBERTER, Y.

2017. Chronic inhibition of brain glycolysis initiates epileptogenesis. J Neurosci Res,

2, 24019.

SANTELLO, M., CALI, C. & BEZZI, P. 2012. Gliotransmission and the tripartite synapse. Adv

Exp Med Biol, 970, 307-31.

SAVIC, I., PERSSON, A., ROLAND, P., PAULI, S., SEDVALL, G. & WIDEN, L. 1988. In-vivo

demonstration of reduced benzodiazepine receptor binding in human epileptic foci.

Lancet, 2, 863-6.

SCHEFFER, I. E., BERKOVIC, S., CAPOVILLA, G., CONNOLLY, M. B., FRENCH, J.,

GUILHOTO, L., HIRSCH, E., JAIN, S., MATHERN, G. W., MOSHÉ, S. L., NORDLI,

D. R., PERUCCA, E., TOMSON, T., WIEBE, S., ZHANG, Y.-H. & ZUBERI, S. M.

2017. ILAE classification of the epilepsies: Position paper of the ILAE Commission for

Classification and Terminology. Epilepsia, n/a-n/a.

SCHEFFER, I. E., BERKOVIC, S. F., CAPOVILLA, G., CONNOLLY, M. B., GUILHOTO, L.,

HIRSCH, E., MOSHE, S. L., NORDLI, D., ZHANG, Y.-H. & ZUBERI, S. M. 2013. The

Organization of the Epilepsies: Report of the ILAE Commission on Classification and

Terminology. http://www.ilae.org/Visitors/Centre/Documents/OrganizationEpilepsy.pdf

(Zugriff: 30.03.2017).


220

SCHMUED, L. C. 2016. Development and application of novel histochemical tracers for

localizing brain connectivity and pathology. Brain Res, 1645, 31-5.

SCHNÖCKEL, U., HERMANN, S., STEGGER, L., LAW, M., KUHLMANN, M., SCHOBER,

O., SCHÄFERS, K. & SCHÄFERS, M. 2010. Small-animal PET: a promising, non-

invasive tool in pre-clinical research. Eur J Pharm Biopharm, 74, 50-4.

SCHOELER, N. E., WOOD, S., ALDRIDGE, V., SANDER, J. W., CROSS, J. H. &

SISODIYA, S. M. 2014. Ketogenic dietary therapies for adults with epilepsy: feasibility

and classification of response. Epilepsy Behav, 37, 77-81.

SCOTT, R. C., GADIAN, D. G., KING, M. D., CHONG, W. K., COX, T. C., NEVILLE, B. G. &

CONNELLY, A. 2002. Magnetic resonance imaging findings within 5 days of status

epilepticus in childhood. Brain, 125, 1951-9.

SEIFFERT, E., DREIER, J. P., IVENS, S., BECHMANN, I., TOMKINS, O., HEINEMANN, U.

& FRIEDMAN, A. 2004. Lasting Blood-Brain Barrier Disruption Induces Epileptic

Focus in the Rat Somatosensory Cortex. J Neurosci, 24, 7829.

SHIMADA, T., TAKEMIYA, T., SUGIURA, H. & YAMAGATA, K. 2014. Role of Inflammatory

Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators Inflamm, 2014, 8.

SHIMAZU, T., HIRSCHEY, M. D., NEWMAN, J., HE, W., SHIRAKAWA, K., LE MOAN, N.,

GRUETER, C. A., LIM, H., SAUNDERS, L. R., STEVENS, R. D., NEWGARD, C. B.,

FARESE, R. V., JR., DE CABO, R., ULRICH, S., AKASSOGLOU, K. & VERDIN, E.

2013. Suppression of oxidative stress by beta-hydroxybutyrate, an endogenous

histone deacetylase inhibitor. Science, 339, 211-4.

SIMPSON, I. A., APPEL, N. M., HOKARI, M., OKI, J., HOLMAN, G. D., MAHER, F.,

KOEHLER-STEC, E. M., VANNUCCI, S. J. & SMITH, Q. R. 1999. Blood-brain barrier

glucose transporter: effects of hypo- and hyperglycemia revisited. J Neurochem, 72,

238-47.

SINGH, D., BANERJI, A., DWARAKANATH, B., TRIPATHI, R., GUPTA, J., MATHEW, T. L.,

RAVINDRANATH, T. & JAIN, V. 2005. Optimizing Cancer Radiotherapy with 2-

Deoxy-D-Glucose. Strahlentherapie und Onkologie, 181, 507-514.

SPENCER, S. S. 2002. When should temporal-lobe epilepsy be treated surgically? Lancet

Neurol, 1, 375-82.

STAFSTROM, C. E., OCKULY, J. C., MURPHREE, L., VALLEY, M. T., ROOPRA, A. &

SUTULA, T. P. 2009. Anticonvulsant and Antiepileptic Actions of 2-Deoxy-D-Glucose

in Epilepsy Models. Ann Neurol, 65, 435-447.


221

STAMBOULIAN-PLATEL, S., LEGENDRE, A., CHABROL, T., PLATEL, J. C., PERNOT, F.,

DUVEAU, V., ROUCARD, C., BAUDRY, M. & DEPAULIS, A. 2016. Activation of

GABAA receptors controls mesiotemporal lobe epilepsy despite changes in chloride

transporters expression: In vivo and in silico approach. Exp Neurol, 284, 11-28.

STEFAN, H. & THEODORE, W. H. 2012. Epilepsy part I: basic principles and diagnosis,

Amsterdam, Elsevier.

STEIGER, A., GULDNER, J., LAUER, C. J., MESCHENMOSER, C., POLLMACHER, T. &

HOLSBOER, F. 1994. Flumazenil exerts intrinsic activity on sleep EEG and nocturnal

hormone secretion in normal controls. Psychopharmacology (Berl), 113, 334-8.

STEIGER, B. K. & JOKEIT, H. 2017. Why epilepsy challenges social life. Seizure, 44, 194-

198.

STEIN, M., LIN, H., JEYAMOHAN, C., DVORZHINSKI, D., GOUNDER, M., BRAY, K.,

EDDY, S., GOODIN, S., WHITE, E. & DIPAOLA, R. S. 2010. Targeting tumor

metabolism with 2-deoxyglucose in patients with castrate-resistant prostate cancer

and advanced malignancies. Prostate, 70, 1388-94.

SULLIVAN, P. G., RIPPY, N. A., DORENBOS, K., CONCEPCION, R. C., AGARWAL, A. K. &

RHO, J. M. 2004. The ketogenic diet increases mitochondrial uncoupling protein

levels and activity. Ann Neurol, 55, 576-80.

SUTULA, T. & FRANZOSO, S. 2008. Dose-response and time course of action of disease-

modifying effects of 2DG on kindling progression: effectiveness of administration after

seizures. Epilepsia, 49 (suppl. 7), 1-498.

SUZUKI, A., STERN, S. A., BOZDAGI, O., HUNTLEY, G. W., WALKER, R. H.,

MAGISTRETTI, P. J. & ALBERINI, C. M. 2011. Astrocyte-neuron lactate transport is

required for long-term memory formation. Cell, 144, 810-23.

SUZUKI, F., JUNIER, M. P., GUILHEM, D., SORENSEN, J. C. & ONTENIENTE, B. 1995.

Morphogenetic effect of kainate on adult hippocampal neurons associated with a

prolonged expression of brain-derived neurotrophic factor. Neuroscience, 64, 665-74.

SUZUKI, Y., TAKAHASHI, H., FUKUDA, M., HINO, H., KOBAYASHI, K., TANAKA, J. &

ISHII, E. 2009. Beta-hydroxybutyrate alters GABA-transaminase activity in cultured

astrocytes. Brain Res, 1268, 17-23.

SYVÄNEN, S., LABOTS, M., TAGAWA, Y., ERIKSSON, J., WINDHORST, A. D.,

LAMMERTSMA, A. A., DE LANGE, E. C. & VOSKUYL, R. A. 2012. Altered GABA(A)

Receptor Density and Unaltered Blood Brain Barrier Transport in a Kainate Model of


222

Epilepsy: An In Vivo Study Using C-11-Flumazenil and PET. J Nuc Med, 53, 1974-

1983.

TAKAHASHI, S., IIZUMI, T., MASHIMA, K., ABE, T. & SUZUKI, N. 2014. Roles and

regulation of ketogenesis in cultured astroglia and neurons under hypoxia and

hypoglycemia. ASN Neuro, 6.

TANAKA, T., TANAKA, S., FUJITA, T., TAKANO, K., FUKUDA, H., SAKO, K. &

YONEMASU, Y. 1992. Experimental complex partial seizures induced by a

microinjection of kainic acid into limbic structures. Progr Neurobiol, 38, 317-334.

THEODORE, W. H. 2017. Presurgical Focus Localization in Epilepsy: PET and SPECT.

Semin Nucl Med, 47, 44-53.





TIENG, Q. M., KHARATISHVILI, I., CHEN, M. & REUTENS, D. C. 2016. Mouse EEG spike

detection based on the adapted continuous wavelet transform. J Neural Eng, 13,

1741-2560.

TRINKA, E., COCK, H., HESDORFFER, D., ROSSETTI, A. O., SCHEFFER, I. E., SHINNAR,

S., SHORVON, S. & LOWENSTEIN, D. H. 2015. A definition and classification of

status epilepticus - Report of the ILAE Task Force on Classification of Status

Epilepticus. Epilepsia, 56, 1515-23.

TURKHEIMER, F. E., RIZZO, G., BLOOMFIELD, P. S., HOWES, O., ZANOTTI-

FREGONARA, P., BERTOLDO, A. & VERONESE, M. 2015. The methodology of

TSPO imaging with positron emission tomography. Biochem Soc Trans, 43, 586-92.

TURSKI, L., IKONOMIDOU, C., TURSKI, W. A., BORTOLOTTO, Z. A. & CAVALHEIRO, E.

A. 1989. Review: Cholinergic mechanisms and epileptogenesis. The seizures

induced by pilocarpine: A novel experimental model of intractable epilepsy. Synapse,

3, 154-171.

TWELE, F., TÖLLNER, K., BANKSTAHL, M. & LÖSCHER, W. 2016a. The effects of

carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy

depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open, 1, 45-60.

TWELE, F., TÖLLNER, K., BRANDT, C. & LÖSCHER, W. 2016b. Significant effects of sex,

strain, and anesthesia in the intrahippocampal kainate mouse model of mesial

temporal lobe epilepsy. Epilepsy Behav, 55, 47-56.


223

UEHARA, Y., NIPPER, V. & MCCALL, A. L. 1997. Chronic insulin hypoglycemia induces

GLUT-3 protein in rat brain neurons. Am J Physiol, 272, E716-9.

UMEGAE, Y., NOHTA, H. & OHKURA, Y. 1990. Simultaneous Determination of 2-Deoxy-D-

glucose and D-Glucose in Rat Serum by High-Performance Liquid Chromatography

with Post-Column Fluorescence Derivatization. Chem Pharm Bull, 38, 963-965.

ÜNAL-CEVIK, I., KILINC, M., GURSOY-OZDEMIR, Y., GURER, G. & DALKARA, T. 2004.

Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal

cell loss: a cautionary note. Brain Res, 1015, 169-74.

VAFAEE, M. S., VANG, K., BERGERSEN, L. H. & GJEDDE, A. 2012. Oxygen consumption

and blood flow coupling in human motor cortex during intense finger tapping:

implication for a role of lactate. J Cereb Blood Flow Metab, 32, 1859-68.

VAN VLIET, E. A., ARONICA, E. & GORTER, J. A. 2015. Blood–brain barrier dysfunction,

seizures and epilepsy. Sem Cell Dev Biol, 38, 26-34.

VAN VLIET, E. A., DA COSTA ARAÚJO, S., REDEKER, S., VAN SCHAIK, R., ARONICA, E.

& GORTER, J. A. 2007. Blood–brain barrier leakage may lead to progression of


VAN VLIET, E. A., OTTE, W. M., WADMAN, W. J., ARONICA, E., KOOIJ, G., DE VRIES, H.

E., DIJKHUIZEN, R. M. & GORTER, J. A. 2016. Blood-brain barrier leakage after

status epilepticus in rapamycin-treated rats I: Magnetic resonance imaging. Epilepsia,

57, 59-69.

VANLANDINGHAM, K. E., HEINZ, E. R., CAVAZOS, J. E. & LEWIS, D. V. 1998. Magnetic

resonance imaging evidence of hippocampal injury after prolonged focal febrile

convulsions. Ann Neurol, 43, 413-26.

VEZZANI, A., ARONICA, E., MAZARATI, A. & PITTMAN, Q. J. 2013. Epilepsy and brain

inflammation. Exp Neurol, 244, 11-21.

VEZZANI, A. & FRIEDMAN, A. 2011. Brain inflammation as a biomarker in epilepsy.

Biomarkers Med, 5, 607-614.

VIGGIANO, A., PILLA, R., ARNOLD, P., MONDA, M., D'AGOSTINO, D., ZEPPA, P. &

COPPOLA, G. 2016. Different calorie restriction treatments have similar anti-seizure

efficacy. Seizure, 35, 45-49.

VILALTA, A. & BROWN, G. C. 2014. Deoxyglucose prevents neurodegeneration in culture

by eliminating microglia. J Neuroinflammation, 11, 1742-2094.

VIRDEE, K., CUMMING, P., CAPRIOLI, D., JUPP, B., ROMINGER, A., AIGBIRHIO, F. I.,

FRYER, T. D., RISS, P. J. & DALLEY, J. W. 2012. Applications of positron emission


224

tomography in animal models of neurological and neuropsychiatric disorders.

Neurosci Biobehav Rev, 36, 1188-1216.

VIVASH, L., GREGOIRE, M. C., BOUILLERET, V., BERARD, A., WIMBERLEY, C., BINNS,

D., ROSELT, P., KATSIFIS, A., MYERS, D. E., HICKS, R. J., O'BRIEN, T. J. &

DEDEURWAERDERE, S. 2014. In vivo measurement of hippocampal GABAA/cBZR

density with [18F]-flumazenil PET for the study of disease progression in an animal

model of temporal lobe epilepsy. Plos One, 9.

VIVASH, L., GREGOIRE, M. C., LAU, E. W., WARE, R. E., BINNS, D., ROSELT, P.,

BOUILLERET, V., MYERS, D. E., COOK, M. J., HICKS, R. J. & O'BRIEN, T. J. 2013.

18F-flumazenil: a gamma-aminobutyric acid A-specific PET radiotracer for the

localization of drug-resistant temporal lobe epilepsy. J Nucl Med, 54, 1270-7.

VIVASH, L., TOSTEVIN, A., LIU, D. S., DALIC, L., DEDEURWAERDERE, S., HICKS, R. J.,

WILLIAMS, D. A., MYERS, D. E. & O'BRIEN, T. J. 2011. Changes in hippocampal

GABAA/cBZR density during limbic epileptogenesis: relationship to cell loss and

mossy fibre sprouting. Neurobiol Dis, 41, 227-36.

VLASSENKO, A. G., RUNDLE, M. M., RAICHLE, M. E. & MINTUN, M. A. 2006. Regulation

of blood flow in activated human brain by cytosolic NADH/NAD+ ratio. Proc Natl Acad

Sci USA, 103, 1964-1969.

VLOOSWIJK, M. C., JANSEN, J. F., DE KROM, M. C., MAJOIE, H. M., HOFMAN, P. A.,

BACKES, W. H. & ALDENKAMP, A. P. 2010. Functional MRI in chronic epilepsy:

associations with cognitive impairment. Lancet Neurol, 9, 1018-27.

VOLK, H. A., POTSCHKA, H. & LOSCHER, W. 2004. Increased expression of the multidrug

transporter P-glycoprotein in limbic brain regions after amygdala-kindled seizures in

rats. Epilepsy Res, 58, 67-79.

WEBBER, R. J. & EDMOND, J. 1977. Utilization of L(+)-3-hydroxybutyrate, D(-)-3-

hydroxybutyrate, acetoacetate, and glucose for respiration and lipid synthesis in the

18-day-old rat. J Biol Chem, 252, 5222-6.

WEISSBERG, I., REICHERT, A., HEINEMANN, U. & FRIEDMAN, A. 2011. Blood-Brain

Barrier Dysfunction in Epileptogenesis of the Temporal Lobe. Epilepsy Res Treat,

2011, 10.






225



WHO 2017. Epilepsy Fact Sheet.

WICK, A. N., DRURY, D. R., NAKADA, H. I. & WOLFE, J. B. 1957. Localization of the

primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. J Biol Chem, 224, 963-9.

WILCOX, K. S., DIXON-SALAZAR, T., SILLS, G. J., BEN-MENACHEM, E., WHITE, H. S.,

PORTER, R. J., DICHTER, M. A., MOSHÉ, S. L., NOEBELS, J. L., PRIVITERA, M.

D. & ROGAWSKI, M. A. 2013. Issues related to development of new anti-seizure

treatments. Epilepsia, 54, 24-34.

WILDER, R. M. 1921. The effects of ketonemia on the course of epilepsy. Mayo Clin Bull 2,

307–8.

WILLIS, S., STOLL, J., SWEETMAN, L. & BORGES, K. 2010. Anticonvulsant effects of a

triheptanoin diet in two mouse chronic seizure models. Neurobiol Dis, 40, 565-72.

XI, H., KURTOGLU, M. & LAMPIDIS, T. J. 2014. The wonders of 2-deoxy-D-glucose. IUBMB

Life, 66, 110-21.

XI, W., TIAN, M. & ZHANG, H. 2011. Molecular imaging in neuroscience research with small-

animal PET in rodents. Neurosci Res, 70, 133-43.

YANG, H., GUO, R., WU, J. X., PENG, Y. F., XIE, D. J., ZHENG, W., HUANG, X., LIU, D.,

LIU, W., HUANG, L. H. & SONG, Z. 2013. The Antiepileptic Effect of the Glycolytic

Inhibitor 2-Deoxy-d-Glucose is Mediated by Upregulation of K-ATP Channel Subunits

Kir6.1 and Kir6.2. Neurochem Res, 38, 677-685.

YANG, Z. & WANG, K. K. 2015. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament

assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci, 38, 364-74.

YANKAM NJIWA, J., COSTES, N., BOUILLOT, C., BOUVARD, S., FIEUX, S., BECKER, G.,

LEVIGOUREUX, E., KOCEVAR, G., STAMILE, C., LANGLOIS, J. B., BOLBOS, R.,

BONNET, C., BEZIN, L., ZIMMER, L. & HAMMERS, A. 2016a. Quantitative

longitudinal imaging of activated microglia as a marker of inflammation in the

pilocarpine rat model of epilepsy using [11C]-( R)-PK11195 PET and MRI. J Cereb

Blood Flow Metab, 271678x16653615.

YANKAM NJIWA, J., COSTES, N., BOUILLOT, C., BOUVARD, S., FIEUX, S., BECKER, G.,

LEVIGOUREUX, E., KOCEVAR, G., STAMILE, C., LANGLOIS, J. B., BOLBOS, R.,

BONNET, C., BEZIN, L., ZIMMER, L. & HAMMERS, A. 2016b. Quantitative

longitudinal imaging of activated microglia as a marker of inflammation in the


226

pilocarpine rat model of epilepsy using [11C]-(R)-PK11195 PET and MRI. J Cereb

Blood Flow Metab, 5.

YAO, J., CHEN, S. H., MAO, Z. S., CADENAS, E. & BRINTON, R. D. 2011. 2-Deoxy-D-

Glucose Treatment Induces Ketogenesis, Sustains Mitochondrial Function, and

Reduces Pathology in Female Mouse Model of Alzheimer's Disease. Plos One, 6.

YOUM, Y.-H., NGUYEN, K. Y., GRANT, R. W., GOLDBERG, E. L., BODOGAI, M., KIM, D.,

D'AGOSTINO, D., PLANAVSKY, N., LUPFER, C., KANNEGANTI, T. D., KANG, S.,

HORVATH, T. L., FAHMY, T. M., CRAWFORD, P. A., BIRAGYN, A., ALNEMRI, E. &

DIXIT, V. D. 2015. The ketone metabolite [beta]-hydroxybutyrate blocks NLRP3

inflammasome-mediated inflammatory disease. Nat Med, 21, 263-269.

YU, N., LIU, H. & DI, Q. 2013. Modulation of Immunity and the Inflammatory Response: A

New Target for Treating Drug-resistant Epilepsy. Curr Neuropharmacol, 11, 114-27.

YU, S. & DING, W. G. 1998. The 45 kDa form of glucose transporter 1 (GLUT1) is localized

in oligodendrocyte and astrocyte but not in microglia in the rat brain. Brain Res, 797,

65-72.

YUDKOFF, M., DAIKHIN, Y., NISSIM, I., HORYN, O., LAZAROW, A., LUHOVYY, B.,

WEHRLI, S. & NISSIM, I. 2005. Response of brain amino acid metabolism to ketosis.


YUM, M. S., KO, T. S. & KIM, D. W. 2012. beta-Hydroxybutyrate increases the pilocarpine-

induced seizure threshold in young mice. Brain Dev, 34, 181-4.

ZABOS, P., KYNER, D., MENDELSOHN, N., SCHREIBER, C., WAXMAN, S., CHRISTMAN,

J. & ACS, G. 1978. Catabolism of 2-deoxyglucose by phagocytic leukocytes in the

presence of 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. Proc Natl Acad Sci USA, 75,

5422-5426.

ZHAI, X., LIANG, P., LI, Y., LI, L., ZHOU, Y., WU, X., DENG, J. & JIANG, L. 2016. Astrocytes

Regulate Angiogenesis Through the Jagged1-Mediated Notch1 Pathway After Status

Epilepticus. Mol Neurobiol, 53, 5893-5901.

ZHOU, K., SHI, L., WANG, Y., CHEN, S. & ZHANG, J. 2016. Recent Advances of the

NLRP3 Inflammasome in Central Nervous System Disorders. J Immunol Res, 2016,

9.

ZIEGLER, D. R., GAMARO, G. D., ARAUJO, E., BASSANI, M. G., PERRY, M. L., DALMAZ,

C. & GONCALVES, C. A. 2005. Nociception and locomotor activity are increased in

ketogenic diet fed rats. Physiol Behav, 84, 421-7.


227

ZIEGLER, D. R., RIBEIRO, L. C., HAGENN, M., SIQUEIRA, I. R., ARAUJO, E., TORRES, I.

L., GOTTFRIED, C., NETTO, C. A. & GONCALVES, C. A. 2003. Ketogenic diet

increases glutathione peroxidase activity in rat hippocampus. Neurochem Res, 28,

1793-7.

ZUROLO, E., IYER, A., MAROSO, M., CARBONELL, C., ANINK, J. J., RAVIZZA, T.,

FLUITER, K., SPLIET, W. G., VAN RIJEN, P. C., VEZZANI, A. & ARONICA, E. 2011.

Activation of Toll-like receptor, RAGE and HMGB1 signalling in malformations of

cortical development. Brain, 134, 1015-32.

8 Zusammenfassung

228

8 Zusammenfassung

Ina Leiter

Zerebrale Energie-Stoffwechsel-Veränderungen im Kontext der Epileptogenese

und als therapeutisches Target zur Epilepsie-Prävention

Epilepsien, die infolge eines Hirninsults entstehen, machen einen hohen Anteil unter

den verschiedenen Epilepsieformen aus. Bisher gibt es keine epilepsiepräventiven

Therapien, um die durch einen Insult des Gehirns ausgelöste Epileptogenese zu

verhindern oder zu beschränken. Zur Entwicklung epilepsiepräventiver Therapien

müssen die einer Epileptogenese zugrundeliegenden Mechanismen besser

verstanden werden. Veränderungen im zerebralen Energiestoffwechsel scheinen eine

wichtige Rolle bei der Epilepsieentwicklung zu spielen, ebenso auch

Entzündungsgeschehen und Beeinträchtigungen der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.

Translationale Bildgebungsverfahren wie die Positronen-Emissionstomographie (PET)

und die Magnetresonanztomographie (MRT), die in vivo eine longitudinale

Untersuchung der Epileptogenese ermöglichen, wurden in dieser Arbeit eingesetzt,

um den zerebralen Glukosestoffwechsel im Kontext mit anderen relevanten Aspekten

der Epileptogenese zu untersuchen. Die PET mit den Tracern [18F]FDG zur

Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels und [18F]GE-180 zur Darstellung

von Entzündungsgeschehen (Microgliaaktivierung) wurde während der

Epileptogenese wiederholt angewendet, um den Verlauf hinsichtlich beider Aspekte

und Effekte von Therapieansätzen zugleich in vivo analysieren zu können. Im Rahmen

dieser Untersuchungen wurden die Effekte der beiden in den Energiestoffwechsel

eingreifenden Therapieansätze 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) und ketogene Diät (KD)

im Hinblick auf eine potentielle antiepileptogene Wirkung getestet.

In der ersten Teilstudie wurde der zerebrale Glukosestoffwechsel mit [18F]FDG-

PET während der Epileptogenese und unter Beeinflussung durch eine Behandlung mit

2-DG im kornealen Kindlingmodell in Mäusen untersucht. Ein kinetisches Modeling der

PET-Daten wurde durchgeführt. Die Kindlingprogression war in den mit 2-DG-

8 Zusammenfassung

229

behandelten Tieren in der frühen Phase abgeschwächt und es wurden insgesamt

weniger Anfälle vom höchsten Schweregrad gezeigt. Die [18F]FDG-PET ließ erkennen,

dass die 2-DG-Behandlung während der kindlingvermittelten Epileptogenese die

Glukoseversorgung im Mausgehirn steigert. Das Kindling verursachte eine Aktivierung

von Astrozyten, die durch 2-DG abgeschwächt wurde. Zusammen mit der zugleich

durch 2-DG bewirkten Aktivierung von Microglia könnte dies einen Teil des positiven

Einflusses auf die Epileptogenese ausmachen. Eine veränderte Expression des

Glukosetransporter 1 war in keiner Tiergruppe ersichtlich, ebenso wenig eine

Neurodegeneration. Die 2-DG-Behandlung zeigte damit Hinweise auf antiepileptogene

Eigenschaften im kornealen Kindlingmodell in der Maus. Behandlungseffekte auf den

zerebralen Glukosestoffwechsel konnten während der Kindlingprogression mit der

[18F]FDG-PET nachvollzogen werden.

In der zweiten Teilstudie wurde der Verlauf und die Ausprägung der

Albuminextravasation im Kontext mit der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke in der

frühen Epileptogenese nach einem Status epilepticus (SE) im Pilocarpinmodell in

Ratten mit Immunhistochemie und MRT untersucht. Damit assoziierte und zur frühen

epileptogenen Neuropathologie beitragende Reaktionen der neurovaskulären Einheit

(NVU) wurden immunhistochemisch untersucht. Die Blut-Hirn-Schranken-Integrität

zeigte sich am ersten bis zweiten Tag nach dem SE in epileptogeneseassoziierten

Gehirnregionen am stärksten beeinträchtigt und erholte sich dann, begleitet von einem

zerebralen Ödem, das in einem ähnlichen Zeitverlauf auftrat. Auf dem Höhepunkt der

Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke wurde Albumin mit Teilen der NVU

kolokalisiert, nicht aber mit Astrozyten. Die Immunreaktivität eines Markers für

astrozytäre Endfüßchen war in Arealen mit Albumin-Extravsation reduziert. Anzeichen

für adaptive Reorganisationsvorgänge in Gefäßen waren eine verminderte

Immunreaktivität des Endothels und Veränderungen von Markern für die

Basalmembran. Die frühe Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke und die folgenden

degenerativen Effekte auf die NVU unterstreichen die Notwendigkeit einer sofortigen

therapeutischen Intervention, wenn die Blut-Hirn-Schranken-Integrität im Rahmen

einer potentiellen antiepileptogenen Therapie wiederhergestellt werden soll.

9 Summary

230

In der dritten Teilstudie wurde die Epileptogenese im intrahippokampalen

Kainatmodell in Mäusen während und nach einer vierwöchigen, sich direkt an die

Induktion des SE anschließenden ketogenen Diät untersucht. Dazu wurden mehrfach

[18F]GE-180- und [18F]FDG-PET-Scans durchgeführt. Elf Wochen nach SE wurden

intrahippokampal Elektroden zur folgenden Ableitung eines Elektroenzephalogramms

(EEG) bei gleichzeitiger Videoüberwachung implantiert. Im Gegensatz zu mit

Standarddiät gefütterten Tieren zeigten mit KD gefütterte Tiere zwei Wochen nach SE

keine Entzündung im [18F]GE-180-PET und vier Wochen nach SE einen

unveränderten Glukosestoffwechsel. Erst sechs Wochen nach dem Absetzen der KD

fand sich auch ein Hypometabolismus. Das EEG der Tiere mit KD zeigte weniger und

durchschnittlich kürzere anfallsähnliche elektrische Entladungen als das der Tiere mit

Standarddiät. Dies deutet auf eine mögliche antiepileptogene Wirksamkeit der KD in

diesem Tiermodell mit einem Langzeiteffekt hin.

9 Summary

Ina Leiter

Changes in cerebral energy metabolism in the context of epileptogenesis and

as therapeutic target for epilepsy prevention

Epilepsies induced by a brain insult constitute a significant proportion among the

various forms of epilepsy. Hitherto, there are no epilepsy-preventive therapies

established to suppress or modify epileptogenesis after brain insult. In order to develop

epilepsy-preventive therapies, mechanisms of epileptogenesis need to be better

understood. Changes in cerebral glucose metabolism seem to play a key role in

epileptogenesis, as well as inflammation and blood-brain barrier leakage. Translational

imaging techniques allowing longitudinal studies of epileptogenesis in vivo like positron

9 Summary

231

emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) were used for the

evaluation of cerebral glucose metabolism in the context of other relevant aspects of

epileptogenesis. PET with the tracers [18F]FDG for imaging cerebral glucose

metabolism and [18F]GE-180 for measuring inflammation was used repeatedly during

epileptogenesis to concurrently analyze the time courses of both aspects and effects

of therapeutic strategies in vivo. Within the scope of these investigations, the effects

of two therapeutic strategies influencing energy metabolism, 2-deoxy-d-glucose (2-

DG) and ketogenic diet (KD), were assessed in view of a potential anti-epileptogenic

efficacy.

The first substudy investigated cerebral glucose metabolism during

epileptogenesis and during 2-DG treatment in the mouse corneal kindling model using

[18F]FDG PET. Kinetic modeling of PET data was performed. Kindling progression was

attenuated in 2-DG treated animals during the early phase and less seizures of the

most severe type occurred. [18F]FDG PET revealed that 2-DG treatment during

kindling-mediated epileptogenesis increases glucose supply in the mouse brain.

Kindling induced astroglial activation, which was alleviated by 2-DG. Together with the

simultaneous induction of microglial activation by 2-DG, this could contribute to the

positive interference with epileptogenesis. Altered expression of glucose transporter 1

was not seen in any group, as well as any sign of neurodegeneration. Thus, 2-DG

treatment showed hints of anti-epileptogenic effects in the mouse corneal kindling

model. Treatment effects on cerebral glucose metabolism can be monitored during

kindling progression using [18F]FDG PET.

The second substudy analyzed the time course and characteristics of albumin

extravasation in the context of blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis

post status epilepticus (SE) in the rat pilocarpine model using immunohistochemistry

and MRI. Associated reactions of the neurovascular unit (NVU), contributing to early

epileptogenic pathology, were assessed immunohistochemically. Blood-brain barrier

leakage peaked between days one and two post SE in epileptogenesis-associated

brain regions and declined thereafter, accompanied by cerebral edema occurring in a

similar time course. At the peak of blood-brain barrier leakage albumin was colocalized

with parts of the NVU but not with astrocytes. Immunoreactivity of a marker for

10 Publikationen

232

astrocytic endfeet was reduced in areas of albumin extravasation. Signs of adaptive

reorganization processes of the NVU vasculature were seen in terms of decreased

immunoreactivity of endothelium and in changes of basement membrane markers.

Early impairment of blood-brain barrier and following degenerative events at the level

of the NVU show the need for a prompt therapeutic intervention in order to restore

blood-brain barrier integrity during a potential antiepileptogenic therapy.

The third substudy assessed epileptogenesis in the mouse intrahippocampal

kainic acid model during and after a four-week KD treatment directly starting after

induction of SE. Therefore, multiple [18F]GE-180 and [18F]FDG PET scans were

performed. At eleven weeks after SE, electrodes for the following

electroencephalography (EEG) with simultaneous video monitoring were

intrahippocampally implanted. In contrast to animals being fed a standard diet, KD fed

mice did not show inflammation with [18F]GE-180 PET at two weeks after SE and an

unchanged glucose metabolism at four weeks after SE. As late as at six weeks after

the end of the KD, a hypometabolism was also found. EEG of KD fed animals showed

less and generally shorter seizure-like events than those of animals fed a standard

diet. This is an evidence for a potential anti-epileptogenic efficacy of the ketogenic diet

in this animal model with a long-term effect.

10 Publikationen

Kongressbeiträge:

I. Leiter, F. M. Bengel, J. Bankstahl, M. Bankstahl, (2015). „2-Deoxy-D-glucose alters

brain F-18-FDG uptake during corneal kindling in mice.” Poster (P 75) vorgestellt auf

der 53. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Nuklearmedizin in Hannover,

http://www.nuklearmedizin.de/jahrestagungen/abstr_online2015/abstract_detail.php?

navId=162&aId=173 (abgerufen am 27.03.2017).

10 Publikationen

233

I. Leiter, P. Bascuñana Almarcha, A. Thomer, F.M. Bengel, J.P. Bankstahl, M.

Bankstahl (2015). “Attenuation of corneal kindling progression by 2-deoxy-d-glucose

treatment is reflected in 18-F-fluoro-deoxy-d-glucose brain kinetics.” Poster

(Präsentationsnummer 497.27) vorgestellt auf dem jährlichen Treffen der Society for

Neuroscience in Chicago, 2015, https://www.sfn.org/annual-meeting/neuroscience-

2015/sessions-and-events/program/abstract-pdfs-2015 (abgerufen am 27.03.2017).

I. Leiter, P. Bascuñana Almarcha, S. Peter, F.M. Bengel, J.P. Bankstahl, M.

Bankstahl (2016). “2-deoxy-D-glucose-mediated deceleration of kindling-induced

epileptogenesis is reflected by 18-F-FDG brain kinetics.” Poster vorgestellt auf dem

Europäischen Kongress für Epileptologie der Internationalen Liga gegen Epilepsie in

Prag, 2016, Epilepsia, 57(Suppl. 2):6–225, 2016, DOI: 10.1111/epi.13609.

Vorträge:

I. Leiter (2015). „Zerebrale Glukose‐Stoffwechsel‐Veränderungen als Biomarker der

Epileptogenese und therapeutisches Target zur Epilepsie‐Prävention.“ Vorgetragen

in der Veranstaltungsreihe „Pharmakologisches Kolloquium“ des Instituts für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover.

I. Leiter (2016). “Manipulation and imaging of cerebral energy metabolism during

epileptogenesis.” Vorgetragen als Seminar im Arbeitsgruppentreffen „MITRe

Rounds“ der Klinik für Nuklearmedizin, Medizinische Hochschule Hannover.

I. Leiter, P. Bascuñana, S. Peter, F. M. Bengel, J. P. Bankstahl, M. Bankstahl (2016).

“Manipulation and imaging of cerebral energy metabolism during epileptogenesis.”

Vorgetragen auf dem VetPharm-Symposium in München.

11 Anhang

234

11 Anhang

11.1 Graphische Darstellung von Ergebnissen aus nicht in die Manuskripte

aufgenommenen Teilstudien

Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im

Verlauf der Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen

(Kainatinjektion unter Isoflurannarkose)

Abbildung 10: [18F]FDG-Uptake zu verschiedenen Zeitpunkten während der Epileptogenese. Die

Epileptogenese zeigte sich im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von Kainat unter

Isoflurannarkose als kaum den zerebralen Glukosestoffwechsel beeinflussend. In der chronischen

Phase war ein Normometabolismus zu sehen, nur in der Amygdala war kontralateral ein

Hypermetabolismus auffällig. Bl = Baseline. * one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.

11 Anhang

235




Abbildung 11: MRGlu (FDG Two-Tissue Compartiment Model) zu verschiedenen Zeitpunkten während

der Epileptogenese. Die Epileptogenese zeigte im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von

Kainat unter Isoflurannarkose nur zum Teil ähnliche Auswirkungen auf MRGlu wie bei Kainatinjektion

unter Chloralhydratnarkose (siehe drittes Manuskript): die teilweise erniedrigte MRGlu zum Zeitpunkt drei

Wochen passt zu den MRGlu-Daten im Manuskript zum Zeitpunkt vier Wochen. Der chronische Zeitpunkt

unterscheidet sich. Bl = Baseline. * one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.

11 Anhang

236




Abbildung 12: Ki (FDG Two-Tissue Compartiment Model) zu verschiedenen Zeitpunkten während der

Epileptogenese. Die Epileptogenese zeigte im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von

Kainat unter Isoflurannarkose ähnlich wie unter Chloralhydratnarkose (siehe drittes Manuskript) keine

Auswirkungen auf Ki. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.

Abbildung 13: Blutglukosekonzentration, gemessen zu

jedem Scan-Zeitpunkt. Hier sind keine Unterschiede zu

erkennen. one-way ANOVA + Bonferroni Test, vs. Bl. n=7-

10.

Glucose levels

Bl 2d 5d 21d 49d0

5

10

15

Scan timepoint (days post OP)

Glu

co

se [

mm

ol/l]

11 Anhang

237


Verlauf einer chronischen Fütterung ketogener Diät in gesunden Mäusen

Abbildung 14: [18F]FDG-Uptake von gesunden Mäusen im Verlauf einer chronisch gefütterten

ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.

Abbildung 15: MRGlu (FDG Two-Tissue Compartiment Model) von gesunden Mäusen im Verlauf einer

chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.

11 Anhang

238


Verlauf einer chronischen Fütterung ketogener Diät in gesunden Mäusen

Abbildung 16: Ki (FDG Two-Tissue Compartiment Model) von gesunden Mäusen im Verlauf einer

chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.

Abbildung 17: Blutglukosekonzentrationen und ß-Hydroxybutyratkonzentration im Blut von

gesunden Mäusen im Verlauf einer chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way

ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.

11 Anhang

239

Untersuchung des zentralen Benzodiazepinrezeptors mit [18F]Flumazenil-PET im

intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen (nicht im dritten Manuskript

gezeigte Daten)

Abbildung 18: BPnd (Simplified Reference Tissue Model mit Gehirnstamm als Referenzregion). one-

way ANOVA + Bonferroni-Test, # = Vergleich zwischen Zeitpunkten in einer Gruppe, o = Vergleich

zwischen zwei Gruppen.

11 Anhang

240

Untersuchung der Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose auf den zerebralen

Glukosestoffwechsel mit [18F]FDG-PET und auf die Epileptogenese im

kornealen Kindlingmodell in der Maus – zusätzliche Darstellung der Gruppe,

die 2-DG 30 Minuten vor jeder Kindlingstimulation erhielt

Abbildung 19: Anfallsantworten im Verlauf der Epileptogenese im kornealen Kindlingmodell, mit

Stimulation über 21 Tage. Mittelwert mit Standardfehler, Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s Multiple

Comparison Test post hoc, * Vergleich zwischen den 2-DG-Gruppen und der Vehikel-Gruppe. 2-DG

30 min before (Behandlung mit 2-DG vor jeder Stimulation): n=12. Sonst n=18.

A

Kindling progress

3 6 9 12 15 18 210

2

4

6

Vehicle

2-DG 30 min before

2-DG 1 min after

* ***

* * *

Stimulation day

Seiz

ure

severi

ty [

Sco

re]

11 Anhang

241

B

C

Abbildung 20: (A) [18F]FDG-Uptake. (B) Ki ([18F]FDG-Two-Tissue Compartiment Model). (C) MRGlu

([18F]FDG-Two-Tissue Compartiment Model). 2-DG w/o kindling = Tiere mit nur 2-DG-Behandlung, 2-

DG before + kindling = 2-DG-Behandlung 30 Minuten vor jeder Einzelstimulation, 2-DG after + kindling

= 2-DG-Behandlung eine Minute nach jeder Einzelstimulation. Mittelwert mit Standardfehler, one-way

ANOVA, Bonferroni Test post hoc. # = Vergleich mit Bl (Baseline), *=Vergleich innerhalb eines

Zeitpunktes.

11 Anhang

242

1.2 Immunhistochemische Färbungen

Protokoll zur Anfärbung des Glukosetransporters GLUT1 (freischwimmende

Schnitte):

- Herstellung der Trägerlösung: 100 ml TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS),

1 ml Eselserum, 1 g bovines Serum-Albumin (BSA), 1,5 ml 20%iges Triton X

100

- Viermaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten

- Hemmung endogener Peroxidasen: 30 Minuten in 0,5% Wasserstoffperoxid

- Dreimaliges Spülen für jeweils 10 Minuten in TBS

- Blockade unspezifischer Antikörperbindungsstellen: eine Stunde in

Trägerlösung mit 10% Eselserum und mit 20 mg/ml BSA

- Inkubation mit Primärantikörper über 20 Stunden bei Raumtemperatur,

Verdünnung 1:1000 in Trägerlösung: Kaninchen-anti-Maus-GLUT1-Antikörper

(Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland, GT-11A, Lot-Nummer

1105859A 1.3-P)

- Dreimaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten

- Eine Stunde Inkubation mit sekundärem Antikörper bei Raumtemperatur,

Verdünnung 1:500 in Trägerlösung: Biotin-SP-konjugiertes Esel-anti-

Kaninchen Immunglobulin G (IgG) (AffiniPure, Jackson ImmunoResearch

Laboratories Europe, Suffolk, England, 711-065-152)

- Herstellung der TRIS-Nickel-Lösung: 0,3 g Nickelammoniumsulfat in 50 ml

TBS (pH 7,6 kontrollieren beziehungsweise korrigieren)


- Eine Stunde Inkubation in Lösung aus Vectastain-Kit (Vectastain ABC Kit,

Burlingame, CA, USA), die mindestens 30 Minuten zuvor angesetzt wurde,

und einen Avidin-Biotin-Komplex enthält: 100 µl Lösung A, 100 µl Lösung B

und 25 ml TBS

- 15 Minuten Inkubation in 8 µl DAB-Lösung (3,3’-Diaminobenzidin) pro Milliliter

TRIS-Nickel-Lösung

11 Anhang

243

- 10 Minuten Reaktion mit 4 µl Wasserstoffperoxid-Lösung (50 µl 35%iges

Wasserstoffperoxid in 150 µl TBS)


- Aufziehen der Schnitte mit Chromgelatine, Trocknen über Nacht, Eindecken

Protokoll zur Anfärbung von IBA1 (Ionized Calcium-binding Adapter Molecule

1) in Microglia / Makrophagen, freischwimmende Gewebeschnitte:

- Viermaliges Spülen der Schnitte in TBS für je 10 Minuten

- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit 0,6% Wasserstoffperoxid in

TBS über 30 min

- Spülen mit TBS, 3 x 10 min

- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 5% Ziegen-

Normalserum in TBS, 0,3% Triton X-100 enthaltend = NGS-TBS-T) für eine

Stunde

- Inkubation mit Primärantikörper über 18 Stunden bei Raumtemperatur, 1:500

Verdünnung mit Trägerlösung (= Blockierlösung): Kaninchen-anti-Iba1, von

Synaptic Systems (Göttingen, www.sysy.com; Art.-Nr. 234003; „affinitäts-

gereinigt“)


- Inkubation mit Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur,

Verdünnung 1:500 in 2% BSA in TBS: biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen IgG

(AffiniPure, Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, England,

111-035-144)


- Inkubation für eine Stunde mit Vectastain Kit (mindestens 30 min vor

Gebrauch ansetzen): 4 µl jeder Lösung pro Milliliter TBS


- Waschen mit ml 0,05 M TRIS-Puffer, pH 8,0, 10 min

- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (in 100 ml 0,05 M

TRIS-Puffer sind 20 mg Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 551 mg

11 Anhang

244

Nickelammoniumsulfat-Hexahydrat gelöst, mit 1 M Natronlauge auf pH 8

eingestellt, bei einer Temperatur von etwa 25 – 30 °C zum Lösen)

- Visualisierungsreaktion mit 0,5 µl 30%iger Wasserstoffperoxid-Lösung je Well


- Aufziehen der Schnitte auf Objektträger mit Chromgelatine, Lufttrocknung

über Nacht, Eindecken der Schnitte

Protokoll zur Anfärbung GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) in Astrozyten

(freischwimmende Gewebeschnitte):

- Viermaliges Spülen der Schnitte in TBS für je 10 Minuten

- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit 0,6% Wasserstoffperoxid in

TBS über 30 min


- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 5% Ziegen-

Normalserum in TBS, 0,3% Triton X-100 enthaltend = NGS-TBS-T) für eine

Stunde

- Inkubation mit Primärantikörper über 18 Stunden bei Raumtemperatur,

Verdünnung 1:5000 in Trägerlösung (= Blockierlösung): Kaninchen-Anti-GFAP

(Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland, Z 0334, Lotnr. 20013978)


- Inkubation mit Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur,

Verdünnung 1:500 in 2% BSA in TBS: biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen IgG

(AffiniPure, Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, England,

111-035-144)


- Inkubation für eine Stunde mit Vectastain Kit (mindestens 30 min vor

Gebrauch ansetzen): 4 µl jeder Lösung pro Milliliter TBS


- Waschen mit ml 0,05 M TRIS-Puffer, pH 8,0, 10 min

- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (in 100 ml 0,05 M

TRIS-Puffer sind 20 mg Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 551 mg

11 Anhang

245

Nickelammoniumsulfat-Hexahydrat gelöst, mit 1 M Natronlauge auf pH 8

eingestellt, bei einer Temperatur von etwa 25 – 30 °C zum Lösen)





Protokoll zur Fluoro-Jade-C-Färbung zur Anfärbung degenerierender

Neuronen:

Grundsätzlich wurde ab dem Schritt mit dem Eintauchen der Glasgondel in die

Kaliumpermanganat-Lösung die jeweilige Flüssigkeit gerührt. Für die Färbung wurde

eine Glasgondel verwendet, die jeweils in die verschiedenen Färbetröge getaucht

wurde. Die für die Fluoro-Jade-C-Färbung nötige Dunkelheit wurde mit der

Umhüllung aller Färbetröge mit Alufolie erreicht.

- Aufziehen der zu färbenden Gewebeschnitte aus destilliertem Wasser auf mit

Eiweiß-Glycerin beschichtete Objektträger und Trocknen über Nacht

- Spülen der Schnitte für drei Minuten in 100% Ethanol

- Spülen der Schnitte für drei Minuten in 80% Ethanol

- Spülen der Schnitte für zwei Minuten in 70% Ethanol

- Spülen der Schnitte mit destilliertem Wasser für zwei Minuten

- 10 Minuten 0,06%ige Kaliumpermanganat-Lösung (60 mg in 100 ml

destilliertem Wasser)

- Eine bis zwei Minuten spülen mit destilliertem Wasser

- In Dunkelheit: 30 Minuten in 0,0001% Fluoro-Jade C in 0,1% Essigsäure

- In Dunkelheit: dreimal eine Minute mit destilliertem Wasser spülen

- In Dunkelheit über Nacht trocknen lassen

- Eindecken der Schnitte mit Xylol und DPX Mounting Medium

11 Anhang

246

DAB-Nickel-Färbung zur Konvertierung des FITC-Albumin-Fluoreszenzsignals:

- Viermaliges Spülen der Schnitte mit TBS für je 10 Minuten

- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit in einer 0,6%igen

Wasserstoffperoxidlösung für 30 Minuten

- Dreimaliges Spülen mit TBS für jeweils 10 Minuten

- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen in 2%igem Rinderserum-

Albumin mit 0,3% Triton X-100 in TBS über 30 Minuten

- Inkubation mit Anti-Fluoreszein-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Dianova,

1:2000, in der vorherigen Blockierlösung) über zwei Stunden

- Zweimaliges Spülen mit TBS für je 10 Minuten

- Spülen mit 0,05 M TRIS-Puffer (pH = 8) für 10 Minuten

- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (40 mg Nickel-

Ammonium-Sulfat, 2 mg DAB-Tetrahydrochlorid, 10 ml 0,05 M TRIS-Puffer)





In Kooperation angefertigte Doppelfärbungen zur Untersuchung der

neurovaskulären Einheit:

Die Immunfluoreszenzfärbungen wurden jeweils als Doppelfärbungen durchgeführt,

wie in den folgenden Publikationen beschrieben, mit den jeweils genannten Primär-

(jeweils 20 Stunden Inkubationszeit) und Sekundärantikörpern / -Reagenzien (jeweils

von Dianova, Hamburg; eine Stunde Inkubationszeit mit 20 µl/ml):

- NeuN = neuron-specific nuclear protein, biotinyliertes Maus-anti-NeuN (1:100;

Merck Millipore, Billerica, MA, USA) mit Cy3-Streptavidin (Härtig et al., 2009)

und Laminin, Kaninchen-anti-Laminin (1:200; Dakocytomation, Hamburg,

Germany) mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG (Krueger et al., 2015)

- STL = Solanum-Tuberosum-Lektin, Kaninchen-anti-Laminin (1:400;

Dakocytomation) mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Härtig et al., 2009)

und GFAP = glial fibrillay acidic protein, Meerschweinchen anti-GFAP (1:200;

11 Anhang

247

Synaptic Systems, Göttingen, Deutschland) mit Cy5-Esel-anti-

Meerschweinchen IgG (Härtig et al., 2009)

- STL, biotinyliertes STL (10 µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy3-

Streptavidin, und GFAP, mit Cy5-Esel-anti-Meerschweinchen IgG

- Kollagen IV, Kaninchen-anti-Kollagen IV (1:100; Merck Millipore), mit Cy3-

Esel-anti-Kaninchen IgG (Hawkes et al., 2013) und STL, biotinyliertes STL (20

µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy5-Streptavidin

- AQP4 = Aquaporin 4, Kaninchen-anti-Aquaporin 4 (1:100; Alomone,

Jerusalem, Israel), mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Hawkes et al., 2013),

und STL, biotinyliertes STL (20 µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy5-

Streptavidin

- S100ß, Kaninchen-anti-S100ß (1:600; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-

Kaninchen IgG, und GFAP, Meerschweinchen-anti-GFAP (1:200; Synaptic

Systems), mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG (Härtig et al., 2009)

- IBA1 = ionized calcium binding adapter molecule-1, Kaninchen-anti-IBA1

(1:400; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Krueger et al.,

2015), und GFAP, Meerschweinchen-anti-GFAP (1:200; Synaptic Systems),

mit Cy5-Esel-anti-Meerschweinchen IgG

- IBA1, Kaninchen-anti-IBA1 (1:200; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-

Kaninchen IgG, und STL, biotinyliertes STL (20 µg/ml; Vector, Burlingame,

CA, USA), mit Cy5-Streptavidin

- CD45c, biotinyliertes Maus-anti-CD45c (1:20; Serotec, Oxford, England), mit

Cy3-Streptavidin (Lehmann et al., 2014), und IBA1, Kaninchen-anti-IBA1

(1:200; Synaptic Systems), mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG

- CD8b, biotinyliertes Maus-anti-CD8b (1:25; Serotec), mit Cy3-Streptavidin,

und IBA1, Kaninchen-anti-IBA1 (1:200; Synaptic Systems), mit Cy5-Esel-anti-

Kaninchen IgG

12 Danksagung

248

12 Danksagung

Ich möchte ganz herzlich allen Menschen danken, die mich unterstützt haben, sei es

durch fachkundigen Rat, Hilfe bei den Experimenten, oder durch ihre wunderbare

Gesellschaft.

Tierärztliche Hochschule Hannover · Epilepsie heilenden Pharmakotherapien. Auch im Hinblick...

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