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Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von intravenös und intranasal applizierten humanen Stammzellen

bei der Cuprizon induzierten Demyelinisierung

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Jasmin Neßler

Albstadt

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner,

Institut für Pathologie,

Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Martin Stangel,

Klinik für Neurologie,

Medizinische Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner,

Institut für Pathologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachterin: Prof. Dr. Andrea Tiplod

Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 29.Oktober 2013

Diese Arbeit wurde gefördert durch NEUROBID, Grant agreement Nummer:

HEALTH-F2-2009-241778 und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), FOR

1103.

Teile dieser Dissertation wurden in folgendem Artikel publiziert:

J. Nessler, K. Benardais, V. Gudi, A. Hoffmann, L. Salinas Tejedor, S. Janßen, C.

Kandiyil Prajeeth, W. Baumgärtner, A. Kavelaars, C. J. Heijnen, C. van

Velthoven, F. Hansmann, T. Skripuletz, M. Stangel

Effects of murine and human bone marrow-derived mesenchymal stem

cells on Cuprizone induced demyelination

PLoS One. 2013 Jul 26;8(7):e69795. doi: 0.1371/journal.pone.0069795.

Print 2013.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung --------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2. Literatur ----------------------------------------------------------------------------------------------- 3

2.1. Multiple Sklerose ----------------------------------------------------------------------------- 3

2.2. Stammzellen ----------------------------------------------------------------------------------- 3

2.2.1. Mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cells, MSC) ------------ 4

2.2.2. Effekte von mesenchymalen Stammzellen in neurologischen Tiermodellen ----------------------------------------------------------------------------------------- 7

2.2.3. In situ Detektion von mesenchymalen Stammzellen nach Applikation --- 8

2.3. Das Cuprizon-Modell ---------------------------------------------------------------------- 10

3. Material und Methoden ------------------------------------------------------------------------- 15

3.1. Tiere -------------------------------------------------------------------------------------------- 15

3.2. Stammzellen --------------------------------------------------------------------------------- 15

3.3. Demyelinisierung --------------------------------------------------------------------------- 18

3.3.1. Cuprizon-Fütterung ------------------------------------------------------------------- 18

3.4. Applikation der mesenchymalen Stammzellen ------------------------------------- 18

3.4.1. Intranasale Applikation der mesenchymalen Stammzellen ---------------- 19

3.4.2. Intravenöse Applikation der mesenchymalen Stammzellen --------------- 20

3.5. Probengewinnung -------------------------------------------------------------------------- 20

3.6. Durchflusszytometrie ---------------------------------------------------------------------- 21

3.6.1. Analyse der Oberflächenantigene (Cluster of differentiation, CD) ------- 21

3.6.2. Analyse PKH26-gefärbter mesenchymaler Stammzellen ------------------ 22

3.6.3. Analyse Anteil PKH26-positiver Zellen in der Lunge ------------------------ 22

3.7. Immunhistochemie ------------------------------------------------------------------------- 23

3.7.1. Immunhistochemie – DAB-Färbung ---------------------------------------------- 23

3.7.2. Immunhistochemie – Fluoreszenz-Färbung ----------------------------------- 24

3.7.3. Bestimmung der Demyelinisierung ----------------------------------------------- 25

3.7.4. Quantifizierung von Gliazellen ----------------------------------------------------- 26

3.7.5. Quantifizierung der Regeneration ------------------------------------------------ 27

Inhaltsverzeichnis

II

3.7.6. Quantifizierung von mesenchymalen Stammzellen im zentralen Nevensystem -------------------------------------------------------------------------------------- 27

3.8. Statistik ---------------------------------------------------------------------------------------- 28

4. Ergebnisse ----------------------------------------------------------------------------------------- 29

4.1. Mesenchymale Stammzellen in vitro vor Applikation ----------------------------- 29

4.1.1. Durchflusszytometrie in vitro ------------------------------------------------------- 29

4.1.3. Mikroskopische Kontrolle PKH26 markierter MSC --------------------------- 32

4.3. Mesenchymale Stammzellen in der Lunge ------------------------------------------ 33

4.3.1. Fluoreszenzmikroskopie ------------------------------------------------------------ 33

4.3.2. Durchflusszytometrie Lunge ------------------------------------------------------- 34

4.5. Immunhistochemie ------------------------------------------------------------------------- 36

4.5.1. Myelin ------------------------------------------------------------------------------------ 36

4.5.2. Oligodendrozyten --------------------------------------------------------------------- 41

4.5.3. Proliferierende Oligodendrozytenvorläuferzellen ----------------------------- 43

4.5.4. Mikroglia und Astrozyten ------------------------------------------------------------ 46

4.6. Mesenchymale Stammzellen im zentralen Nervensystem ---------------------- 51

4.6.1. Fluoreszenzmikroskopie ------------------------------------------------------------ 51

5. Diskussion ----------------------------------------------------------------------------------------- 54

5.1. Wirkung von intranasal und intravenös verabreichten mesenchymalen Stammzellen im murinen Cuprizon-Modell --------------------------------------------------- 55

5.2. Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach intranasaler Gabe im Cuprizon-Modell nicht im zentralen Nervensystem ---------------------------------------- 55

5.3. Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach intravenöser Gabe im Cuprizon-Modell nur vereinzelt im zentralen Nervensytem, aber nicht in der Läsion- -------------------------------------------------------------------------------------------------- 57

5.4. Mesenchymale Stammzellen scheinen in einem Modell ohne Beteiligung der Peripherie keinen Einfluss auf die Regeneration zu haben ----------------------------- 59

6. Zusammenfassung ------------------------------------------------------------------------------ 61

7. Summary ------------------------------------------------------------------------------------------- 62

8. Literaturangaben --------------------------------------------------------------------------------- 63

9. Anhang ---------------------------------------------------------------------------------------------- 79

Inhaltsverzeichnis

III

9.1. Tabellen --------------------------------------------------------------------------------------- 79

9.2. Abbildungsverzeichnis -------------------------------------------------------------------- 99

9.3. Tabellenverzeichnis ----------------------------------------------------------------------- 100

9.5. Abkürzungsverzeichnis ------------------------------------------------------------------ 101

10. Danksagungen -------------------------------------------------------------------------------- 105

Einleitung

1

1. Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine weltweit verbreitete neuroinflamatorische Erkrankung,

die vorwiegend junge Erwachsene betrifft (HAFLER 2004). Es wird angenommen,

dass äußere Einflüsse bei genetisch prädisponierten Individuen eine autoreaktive

Entzündung im zentralen Nervensystem (ZNS) auslösen (NYLANDER u. HAFLER

2012). Genaue Pathomechanismen sind bis heute nicht vollständig erforscht. Dies

erschwert es, geeignete Therapien zu entwickeln. Im Laufe der letzten Jahre rückten

dafür Stammzellen immer mehr in den Fokus der Wissenschaft, da sie

antiinflammatorische und regenerative Fähigkeiten besitzen (LI et al. 2002;

AGGARWAL u. PITTENGER 2005; RIVERA et al. 2006; VAN VELTHOVEN et al.

2009). Obwohl sie teilweise schon in frühen klinischen Studien bei MS-Patienten

Anwendung finden (DIMITRIOS KARUSSIS et al. 2010; CONNICK et al. 2012), ist

nicht geklärt, wie sie wirken. Eine Hypothese geht davon aus, dass die Stammzellen

im Gehirngewebe direkt ein Milieu schaffen, das die Reparation und Regeneration

anregt, sowie entzündliche Prozesse unterdrückt (VAN VELTHOVEN et al. 2009).

Eine andere vermutet, dass Stammzellen schon in der Peripherie verhindern, dass

Autoimmunzellen aktiviert werden und/oder daran gehindert werden, ins ZNS

überzutreten (ZAPPIA et al. 2005).

Um diese Frage zu klären, ist es nötig, Stammzellen nicht nur wie bisher in

Tiermodellen zu untersuchen, in denen die Bluthirnschranke geschädigt ist und

Immunzellen aus der Peripherie eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese spielen

(STROMNES u. GOVERMAN 2006), sondern auch in einem Modell, das keines

dieser Merkmale aufweist. Ein solches Modell ist das murine Cuprizon-Modell

Einleitung

2

(BAKKER u. LUDWIN 1987; MCMAHON et al. 2002). Um zu überprüfen, ob

mesenchymale Stammzellen (MSC) eine intakte Bluthirnschranke überwinden

können und ob sie einen positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf haben können,

wurden in der folgenden Arbeit MSC über die intranasal oder die Vena coccygealis

appliziert.

Literatur

Mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cells, MSC)

3

2. Literatur

2.1. Multiple Sklerose

Multiple Sklerose (MS) ist eine weltweit bedeutende neurologische Krankheit, von

der vor allem junge Erwachsene betroffen sind (HAFLER 2004; CONFAVREUX u.

VUKUSIC 2006). Es handelt sich dabei um eine multifokale demyelinisierende

Neuroinflammation (HAFLER 2004).

Pathophysiologisch wird davon ausgegangen, dass ein externer Auslöser bei

genetisch prädisponierten Individuen autoreaktive T-Zellen aktiviert, die die

Bluthirnschranke durchqueren und im zentralen Nervensystem (ZNS)

Myelinscheiden angreifen (HAFLER 2004; NYLANDER u. HAFLER 2012). Im akuten

Stadium stellen sich histologisch Plaques dar, die aus T-Zellen, B-Zellen, Monozyten,

Plasmazellen und mit Myelindebris beladenen Makrophagen bestehen (NYLANDER

u. HAFLER 2012). Die Bluthirnschranke ist gestört (NYLANDER u. HAFLER 2012).

Bis heute bleibt aber die genaue Pathogenese der MS unklar. Ebenso fehlen

adäquate Behandlungsmethoden. Es stehen nur vorbeugende Mittel zur

Immunsuppression und -modulation zur Verfügung. Therapien, die helfen einen

bestehenden Schaden zu reparieren, die zum Beispiel (z.B.) die Remyelinisierung

fördern, stehen nicht zur Verfügung (NYLANDER u. HAFLER 2012).

2.2. Stammzellen

Im Laufe der Jahre sind Stammzellen als mögliche Therapieoption bei MS in den

Fokus der Wissenschaft gerückt. Stammzellen sind Gewebevorläuferzellen, die die

Literatur


4

Fähigkeit besitzen, in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und sich über einen

langen Zeitraum selbst zu erneuern. Verschiedene Stammzelltypen unterscheiden

sich durch ihre Potenz in unterschiedliche Zellarten auszudifferenzieren. Embryonale

Stammzellen z.B. sind omni- oder pluripotent: Befindet sich der Embryo noch im 4-

bis 8-Zellstadium, sind die daraus gewonnenen Stammzellen in der Lage, sich in alle

Gewebe des Körpers weiterzuentwickeln. Doch schon die Differenzierung des

Embryos zur Blastozyste führt zur Spezialisierung der daraus generierten

Stammzellen und diese sind somit nur noch pluripotent. Stammzellen aus

erwachsenen Spendern sind in aller Regel multipotent: Physiologischerweise können

aus diesen sogenannten adulten Stammzellen nur noch wenige Zelltypen generiert

werden. So gehören dazu diejenigen, die aus Gehirnen toter Spender gewonnen

werden, oder auch Stammzellen, die aus dem Knochenmark oder Fettgewebe

lebendiger Spender stammen. Je nachdem, in welche Richtung sich Stammzellen

weiterentwickeln, spricht man zum Beispiel von myeloischen, hämatopoetischen oder

neuronale Stammzellen (zusammengefasst von KARUSSIS u. KASSIS 2008).

2.2.1. Mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cells, MSC)

Die am häufigsten verwendeten Stammzellen zur Transplantation sind

mesenchymale Stammzellen, auch multipotente Stromavorläuferzellen oder stromale

Stammzellen genannt. Diese multipotenten Zellen sind Stammzellen, die

physiologischerweise in vivo in Zellen des Mesenchyms, wie Chondrozyten,

Adipozyten oder Osteozyten, differenzieren können (FRIEDENSTEIN et al. 1974;

PITTENGER 1999).

Literatur


5

MSC können unter anderem aus Fettgewebe und Knochenmark gewonnen werden.

Dort kommen sie in einer geringen Konzentration vor. Um sie von den anderen dort

vorkommenden Zellen zu separieren, wird ihre Fähigkeit genutzt, an unbehandeltem

Plastik festwachsen zu können (Plastikadhärenz.) Das ist gleichzeitig eines der

Kriterien, die erfüllt sein müssen, damit die isolierten Zellen als MSC definiert werden

können. Phänotypisch werden sie anhand ihrer Oberflächenmarker (Cluster of

differentiation, CD) von anderen Zellpopulationen abgegrenzt. Sie exprimieren CD73,

CD90 und CD105. Gleichzeitig sind sie negativ für den Panleukozytenmarker CD45,

den Marker für primitive hämatopoetische Vorläufer und Endothelzellen CD34 und

die Marker für Monozyten und Makrophagen CD14 und CD11b (DOMINICI et al.

2006).

MSC sind in der Lage die Proliferation von CD4- und CD8-positiven T-Zellen zu

unterdrücken, indem sie verhindern, dass diese aus dem G0- bzw. G1-Stadium des

Zellzyklus in die S-Phase übertreten (DI NICOLA et al. 2002; GLENNIE et al. 2005).

Ebenso supprimieren MSC anderen Immunzellen, auch B-Zellen und NK-Zellen.

Außerdem wird durch MSC die Produktion von Gamma-Interferon (IFNγ) und

Interleukin-4 (IL-4) stimuliert und so wirken MSC anti-inflammatorisch (RASMUSSON

et al. 2003; UCCELLI et al. 2008). Die Produktion von transforming growth factor β1

(TGF-β1), colony-stimulating factor-1, stem cell factor, vascular endothelial growth

factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), nerve growth factor (NGF) und

brain-derived neurotrophic factor (BDNF) sowie von hepatocytic growth factor (HGF)

unterstützt Regeneration und Heilungsprozesse (LI et al. 2002; RIVERA et al. 2006;

UCCELLI et al. 2008).

Literatur


6

Es wurde zusätzlich gezeigt, dass MSC sich in vitro in fast alle Zellarten entwickeln

können, unter anderem auch in Neuronen-ähnliche oder Gliazell-ähnliche Zelltypen

(Transdifferenzieung) (SANCHEZ-RAMOS et al. 2000; WOODBURY et al. 2000; LU

et al. 2004; BOSSOLASCO et al. 2005).

MSC haben im Gegensatz zu anderen Stammzelltypen verschiedene Vorteile:

o Sie können einfach von lebenden Spendern gewonnen werden und geben so die

Möglichkeit autogener Transplantationen. Im Gegensatz dazu birgt eine Biopsie

von Nervengewebe aus dem ZNS eines lebendigen Spenders zur Gewinnung

neuronaler Stammzellen erheblich größere Risiken (KARUSSIS u. KASSIS 2008).

o Außerdem erfordert eine autogene Transplantation keine Immunsuppression des

Empfängers (KARUSSIS u. KASSIS 2008).

o Auch eine allogene Transplantation ist möglich, da humane MSC nicht

immunogen sind (MORANDI et al. 2008).

o Dadurch, dass sie von lebenden Spendern in einem relativ kleinen Eingriff oder

bei Routine-Operationen gewonnen werden können, steht ihre Gewinnung in

keinem ethischen Spannungsfeld wie z.B. bei embryonalen Stammzellen

(UCCELLI et al. 2011).

o Sie bilden selten Tumoren nach Applikation. Im Gegensatz dazu kommt es nach

Applikation von embryonalen Stammzellen häufig zu Teratomen (KARUSSIS u.

KASSIS 2008) .

o Die Kultivierung von MSC ist einfach durchzuführen und inzwischen routinemäßig

möglich (KASTEN et al. 2008).

Literatur

Effekte von mesenchymalen Stammzellen in neurologischen Tiermodellen

7

2.2.2. Effekte von mesenchymalen Stammzellen in neurologischen

Tiermodellen

MSC wurden in verschiedenen Tiermodellen auf ihre Fähigkeiten hin untersucht,

deren Krankheitsverlauf zu beeinflussen.

Nach Okklusion einer Hirnarterie, einem Modell für fokale ischämische Schädigung

und neonataler hypoxischer Ischämie , wurden nach intranasaler (i.n.)., intravenöser

(i.v.) und intraläsioneller Applikation von MSC eine klinische Besserung, ein Anstieg

von Wachstumsfaktoren, eine geringere Anzahl apoptotischer Neurone, sowie

Gliazellen und eine gesteigerte Regeneration gefunden (LI et al. 2002; VAN

VELTHOVEN et al. 2009, 2010, 2011).

Nach stereotaktischer Injektion von Oxidopamin (6-Hydroxipopamin, 6-OHDA) in das

Corpus striatum von Ratten, was dort einen sofortigen Verlust der dopaminergen

Terminals nach sich zieht (BOSSOLASCO et al. 2012), wurden bei den mit MSC

behandelten Tieren ähnlich positive Ergebnisse erzielt (DANIELYAN et al. 2011)

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) wird bei verschiedenen

Spezies induziert, indem die Tiere mit einem Myelin-spezifischen Peptid, Protein

oder dem gesamten Myelin immunisiert werden (STROMNES u. GOVERMAN 2006).

Daraufhin erfolgt eine Aktivierung von Myelin-geprägten T-Zellen aus der Peripherie.

Diese durchdringen die Bluthirnschranke und greifen dort Myelinscheiden an

(SEAMONS et al. 2003; O'CONNOR et al. 2008). So entsteht eine inflammatorisch

demyelinisierende oder hauptsächlich entzündliche ZNS Erkrankung. MSC zu

verschiedenen Zeitpunkten und über verschiedene Wege appliziert beeinflussten das

Krankheitsgeschehen positiv oder verhinderten es sogar (ZAPPIA et al. 2005).

Literatur

In situ Detektion von mesenchymalen Stammzellen nach Applikation

8

Im Gegensatz dazu, konnte nach Gabe von MSC nach einem kontrolliert gesetzten

Gehirntrauma in Ratten keine klinische Verbesserung gezeigt werden (HARTING et

al. 2009).

2.2.3. In situ Detektion von mesenchymalen Stammzellen nach

Applikation

Um die MSC nach der Applikation nachverfolgen zu können, werden in der Literatur

unterschiedliche Methoden beschrieben.

Zum einen können MSC mit Genen transfiziert werden, die fluoreszierende Proteine

z.B. grünfluoreszierendes Protein (GFP), kodieren. So produzieren die Zellen einen

fluoreszierenden Farbstoff, womit sie später in situ mit dem Fluoreszenzmikroskop

detektiert werden können (DANIELYAN et al. 2009).

Um Zellen länger markieren zu können, ohne in ihre Genstruktur eingreifen zu

müssen, werden häufig fluoreszierende Marker benutzt, die an verschiedene

Strukturen der Zellen binden. Diese Färbungen beeinflussen weder den Phänotyp

noch die Viabilität der Zellen (WALLACE et al. 2008). Dazu gehören unter anderem

Hoechst 33258 oder PKH26 (VELTHOVEN et al. 2010; BOSSOLASCO et al. 2012).

PKH26 bindet an lange aliphatische Ketten in den Lipidregionen der Membran und

bilden damit eine homogene, stabile und stark im orangenen Lichtspektrum

leuchtende Markierung, die noch nach mehreren Wochen detektiert werden kann

(WALLACE et al. 2008; BOLTON et al. 2010).

Darüber hinaus stehen Methoden zur Verfügung, die es erlauben applizierte MSC im

lebenden Tier nachzuverfolgen. Dafür werden Zellen mit Eisenoxid oder einer

Literatur

In situ Detektion von mesenchymalen Stammzellen nach Applikation

9

Infrarotfärbung markiert und deren Ausbreitung in vivo in der

Magnetresonanztomografie (MRT) bzw. mit Infrarotspektroskopie beobachtet

(BOSSOLASCO et al. 2012; QI et al. 2012).

Markierte Zellen wurden je nach Tiermodell und Applikationsart in verschiedenen

Strukturen und Organen gefunden. Nach i.v. Applikation von MSC wurden diese

Zellen bei gesunden Tieren hauptsächlich in der Lunge gefunden (GAO et al. 2001).

Nur sehr wenige Zellen konnten in andere Organe, wie das Gehirn, eindringen (LEE

et al. 2009). Eine Gruppe fand hohe Anzahlen injizierter Zellen im Rückenmark

gesunder Kontrolltiere (GORDON et al. 2010). Nach i.n. Gabe befanden sich

applizierte MSC im Bulbus olfactorius aber nicht im Gehirn selbst (DANIELYAN et al.

2009).

In Tieren mit geschädigtem ZNS weichen die Befunde ja nach verwendetem Modell

stark ab. Nach i.v. Gabe von MSC wurden im Modell der hypoxischen Ischämie viele

MSC im Parenchym des Gehirns gefunden, wobei die Zellen gehäuft in der

geschädigten Hemisphäre auftraten (VAN VELTHOVEN et al. 2011). Im Modell der

hypoxischen Ischämie wurden außerdem nach i.n. Applikation von MSC die Zellen

ebenfalls vermehrt in der geschädigten Hemisphäre und zusätzlich im Bulbus

olfactorius gefunden (VELTHOVEN et al. 2010). Im Rückenmark von Tieren mit EAE

befanden sich zwar im Vergleich zu Kontrolltieren nicht mehr MSC nach i.v. Injektion,

diese verblieben aber länger dort (GORDON et al. 2010). Im Gegensatz dazu fanden

sich nach einem Gehirn-Trauma wenige i.v. applizierte MSC im ZNS, die zusätzlich

schnell wieder verschwanden (HARTING et al. 2009).

Literatur

Das Cuprizon-Modell

10

2.3. Das Cuprizon-Modell

Um aber zu analysieren, inwiefern die Wirkung der MSC von einer gestörten

Bluthirnschranke oder dem peripheren Immunsystem abhängt, wird ein Modell

benötigt, bei dem die Läsionen im Gehirn von der Peripherie unbeeinflusst bleiben.

Ein solches Modell ist das Cuprizon-Modell.

Dabei wird in das Standard-Futter von jungen adulten Mäusen Cuprizon (CPZ, bis-

Zyklohexanon-Oxaldihydrazon) gemischt (MATSUSHIMA u. MORELL 2001). Bei

einer geringen Konzentration von 0,2% steht die demyelinisierende Wirkung im

Vordergrund, wobei ein leicht verschlechtertes Allgemeinbefinden meist die einzige

klinisch sichtbare Erscheinungen ist. Erst in höheren Konzentrationen (0,4-1%) oder

bei Tieren jünger als 8 Wochen treten Leberversagen, neurologische Ausfälle und

Tod gehäuft auf (PATTISON u. JEBBETT 1971; HIREMATH et al. 1998).

Da die Auswirkungen von CPZ bei Mäusen aus verschiedenen Stämmen oder

verschiedenen Geschlechts unterschiedlich ausfallen, werden normalerweise

männliche C57BL/6 Mäuse verwendet, um die Ergebnisse vergleichbar zu machen

(SKRIPULETZ et al. 2011).

Histologische Veränderungen im ZNS hängen von der Dauer der Behandlung ab,

sind aber im zeitlichen Ablauf und in der Lokalisation sehr homogen und einfach zu

quantifizieren. Da die Ausprägung der Auffälligkeiten in verschiedenen Strukturen

des Gehirns zeitlich unterschiedlich sichtbar werden (GUDI et al. 2009), hat sich das

Corpus callosum (Abbildung 1) als eine Struktur herausgestellt, die einfach

aufzufinden ist und bei der Abweichungen verlässlich quantifiziert und in ihrer

Qualität bestimmt werden können (SKRIPULETZ et al. 2011).

Literatur

Das Cuprizon-Modell

11

Abbildung 1: Das Corpus callosum als Zielstruktur im Cuprizon-Modell (modifiziert nach PAXINOS u.

FRANKLIN 2003)

Schematische Darstellung eines Transversalschnittes durch das Gehirn einer Maus auf Höhe des

Hippocampus.

Der rote Kasten markiert den Bereich des Corpus callosum (Bregma -0,94 mm) über dem

Hippocampus (roter Pfeil), der sich gut für die quantitative und qualitative Auswertung der

pathologischen Veränderungen im Cuprizon-Modell eignet.

Das Hauptaugenmerk dieses Modells liegt auf der Demyelinisierung (für den

zeitlichen Verlauf s. Abbildung 2). Diese tritt im Corpus callosum nach 3 Wochen auf

und nimmt bis Woche 5 weiter zu (MATSUSHIMA u. MORELL 2001; LINDNER et al.

2008). Schon bevor der Abbau von Myelin sichtbar wird, sterben die reifen

Oligodendrozyten nach 3-7 Tagen Cuprizon-Fütterung (MORELL et al. 1998).

Warum nur adulte Oligodendrozyten aber ansonsten keine Zellen des ZNS von

Zelltod betroffen sind, auch keine Oligodendrozytenvorläufer (oligodendrocyt

precursor cells, OPC), ist noch nicht bekannt (BLAKEMORE 1973; LUDWIN 1978;

KOMOLY et al. 1987; FUJITA et al. 1990; CAMMER 1999; BENARDAIS et al. 2013).

Etwa zum Zeitpunkt des Oligodendrozytensterbens werden Astrozyten aktiviert

(SKRIPULETZ et al. 2008; GUDI et al. 2009). Sie erreichen ihre maximale Anzahl

nach etwa 3,5 Wochen CPZ-Fütterung und bleiben dann auf einem konstant hohen

Literatur

Das Cuprizon-Modell

12

Niveau. Durch die Astrozyten werden Mikroglia aktiviert, die den Myelindebris

abräumen (SKRIPULETZ et al. 2013). Während dieser Zeit proliferieren OPC und

differenzieren zu reifen Oligodendrozyten aus, was eine Remyelinisierung der Axone

zur Folge hat. Dies geschieht trotz anhaltendem Insult durch CPZ. Gleichzeitig

werden weiterhin reife Oligodendrozyten zerstört (GUDI et al. 2009). Erst nach

Absetzen des toxischen Futters kann sich das Gehirn vollständig erholen und

remyelinisieren (SKRIPULETZ et al. 2011).

Die Charakteristika dieses Modells sind seine Zuverlässigkeit, eine intakte

Bluthirnschranke (BAKKER u. LUDWIN 1987; KONDO et al. 1987) und die fehlende

Beteiligung von Zellen aus der Peripherie, wie z.B. T-Zellen oder B-Zellen

(HIREMATH et al. 1998; MCMAHON et al. 2002; REMINGTON et al. 2007).

Literatur

Das Cuprizon-Modell

13

Abbildung 2: Relative Zellzahlenzunahme im Corpus callosum während 0,2%iger Cuprizon-Fütterung

(modifiziert nach SKRIPULETZ et al. 2011)

Auf der x-Achse ist der Zeitraum der kontinuierlichen Cuprizon-Fütterung aufgetragen, auf der y-

Achse die relative Zellzahlveränderung bzw. das Vorhandensein von PLP als Hinweis auf

Demyelinisierung.

Die Zerstörung von Oligodendrozyten im Corpus callosum wird 1 Woche nach der ersten Gabe von

Cuprizon deutlich sichtbar, auf die später ein Maximum an glialen Zellen folgt. Erst in Folge darauf

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Literatur

Das Cuprizon-Modell

14

zeigen sich ein vermehrter Abbau von Proteolipid-Protein (PLP) und ein Anstieg von

Oligodendrozytenvorläuferzellen.

Material und Methoden

Tiere

15

3. Material und Methoden

3.1. Tiere

Die für die Versuche verwendeten Tiere waren männliche C57BL/6 Mäuse (Charles

River, Sulzfeld, Deutschland). Bei Anlieferung waren die Tiere 8 Wochen alt. Nach 2

Wochen zur Eingewöhnung begann das Experiment. Die Käfige der Tiere durchliefen

einmal wöchentlich eine Reinigung und die Tiere wurden mikrobiologisch kontrolliert

entsprechend der Empfehlung der Föderation der Europäischen wissenschaftlichen

Labortier-Verbände. Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. Das

niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

genehmigte alle Versuche und die gesamte Tierpflege (AZ 33.14-42502-04-11/0450).

3.2. Stammzellen

Humane mesenchymale Stammzellen aus dem Beckenkamm eines gesunden

Spenders (Ethik-Antrag Nr. 565 vom 28.08.2009 "Verwendung von humanem

Knochenmark zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen", Arbeitsgruppe Prof.

Andrea Hoffmann, Unfallchirurgie, Medizinische Hochschule Hannover) der Passage

4 wurden aufgetaut und expandiert. Zur Kultivierung wurde ein Medium verwendet,

das aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Biochrom AG, Berlin

Deutschland), 10 % nicht hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS; Thermo

Fisher Scientific „Hyclone“, Schwerte, Deutschland), 20 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)- 1-

piperazinyl]-ethansulfonsäure (HEPES; Biochrom AG), 100 internationale Einheiten

(I.E.)/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin (beides Biochrom AG, Berlin


Stammzellen

16

Deutschland) und 2 ng/ml humanem rekombinantem fibroblast growth factor-2 (FGF-

2, Peprotech, Hamurg, Deutschland) besteht. Die MSC wurden bei 37 °C, 5 % CO 2,

und 85 % Feuchtigkeit in unbehandelten Zellkulturflaschen aus Polysterol inkubiert.

Für das Experiment wurden MSC aus Passage 6-8 benutzt.

Es wurden 1x106 MSC aus einem Kryovial im 37°C warmen Wasserbad un ter

Schwenken auf, bis fast der komplette Inhalt flüssig war. Der Inhalt wurde in eine 175

cm² Zellkulturflasche (Biochrom AG, Berlin Deutschland) überführt, die bereits 22 ml

Komplettmedium enthielt. Nach sanftem Mischen wurde die Kultur ca. 3 Std bei 37°C

inkubiert. Hatten sich danach die meisten Zellen am Flaschenboden abgesetzt, was

unter dem Lichtmikroskop geprüft wurde, wurden nicht adhärente Zellen zusammen

mit dem Medium vorsichtig abgesaugt und 23 ml neues Komplettmedium zugesetzt.

Nach 2-3 Tagen erneuter Inkubation wurde nochmals das Medium gewechselt. Bei

einer Konfluenz der MSC von ca. 70-80% wurden diese aufgeteilt. Das Medium

wurde aus der Zellkulturflasche entfernt, die immer noch adhärenten Zellen sanft mit

phosphatgepufferter Salzlösung (phosphat bufferd saline, PBS) gespült, das PBS

abgesaugt und die MSC mit Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung (Trypsin

(1:250) / EDTA-Lösung (0,5% / 0,2%) Biochrom AG, Berlin Deutschland) 5 Min bei

37°C inkubiert. Nach sanftem Abklopfen der MSC, die nun im Trypsin suspendiert

waren, wurden der Flaschenboden 2-3 mal mit 10 ml Medium gespült und das

Medium mit den MSC in ein Röhrchen überführt. Mit einer Neubauer-Zählkammer

wurde die Anzahl MSC in der Mediumsuspension bestimmt. Je 6x105 MSC wurden in

eine neue 300 cm² Zellkulturflasche (Biochrom AG, Berlin Deutschland) ausgesät,

Medium bis zu einem Volumen von 60 ml aufgefüllt und wie oben beschrieben weiter

kultiviert.


Stammzellen

17

Vor der Applikation in die Mäuse wurden die MSC mit dem Fluoreszenzmarker

PKH26 (Sigma-Aldrich Chemical Co., Steinheim, Deutschland), wie vom Hersteller

vorgegeben, markiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wurden die MSC für 10 Min bei

400xg zu einem Pellet zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in

Medium gelöst und auf eine Konzentration von 1x106 MSC/ ml eingestellt. 1 ml dieser

Zellsuspension wurde nochmals wie oben beschrieben zentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Zellpellet in 1 ml Medium ohne FCS gelöst. Nach erneuter

Zentrifugation bei 400xg für 5 Min wurde wieder der Überstand abgesaugt und die

verbleibenden Zellen in 1 ml Diluent C (im Kit enthalten) mit einer Pipette

suspendiert.

In einem neuen Ansatz wurden 4 µl PKH26 in 1 ml Diluent C (im Kit enthalten) gelöst

und sanft geschüttelt. Dazu wurde die Zellsuspension gegeben und 2 bis 5 Min bei

Raumtemperatur (RT) unter Lichtabschluss inkubiert. Die Zugabe von 2 ml FCS und

Inkubation für 1 Min stoppte die Färbereaktion. Nach Zugabe von 4 ml

Komplettmedium wurde die Suspension 4 mal bei 400xg für 5 min zentrifugiert, der

Überstand verworfen, die Zellen erneut in Komplettmedium und in ein neues

Röhrchen verbracht, um eventuell am Plastik haftende Farbreste nicht erneut in

Lösung zu bringen. Danach wurden die MSC in PBS überführt und bis zur Injektion

bzw. bis zur Bestätigung der korrekten Färbung mit dem Durchflusszytometer gekühlt

(VELTHOVEN et al. 2010).

Die Zellen wurden außerdem auf human MSC-spezifische Oberflächenmarker

getestet (s. Kapitel 3.6.1).


Cuprizon-Fütterung

18

3.3. Demyelinisierung

3.3.1. Cuprizon-Fütterung

Um eine Demyelinisierung herbeizuführen, wurden 10 Wochen alte Mäuse (9.1

Anhang, Tabelle 1) über 5 Wochen mit einer Standardfutterration gefüttert, die 0,2%

Cuprizon (bis-Cyclohexanon-oxaldihydrazon, Sigma Alderich, Chemical Co,

Steinheim, Deutschland) enthielt (Abbildung 3). Kontrollgruppen erhielten unten

aufgeführte MSC-Behandlung, wurden aber nicht mit Cuprizon gefüttert. Eine

zusätzliche Kontrollgruppe bekam keine MSC-Applikation, aber Cuprizon (9.1

Anhang, Tabelle 1). Eine Sham-Applikation war bereits zuvor im Rahmen dieses

Projektes durchgeführt worden. Dabei zeigte sich kein Unterschied bei der

Anwendung von Stammzellen und Fibroblasten (NESSLER et al. 2013).

3.4. Applikation der mesenchymalen Stammzellen

Nach 4 Wochen Cuprizon-Fütterung wurden den Tieren humane MSC appliziert. Es

wurde zwei Applikationswege getestet: intranasale Verabreichung und intravenöse

Injektion. Die Analyse erfolgte nach weiteren 3,5 bzw. 7 Tagen Cuprizon-Fütterung.


Intranasale Applikation der mesenchymalen Stammzellen

19

Abbildung 3: Zeitlicher Ablauf des Versuchs

Dem Futter von 10 Wochen alten männlichen C67BL/6J Mäusen wurde für 5 Wochen 0,2% Cuprizon

zugemischt. Nach 4 Wochen erhielten die Mäuse eine intranasale oder intravenöse Applikation mit

humanen mesenchymalen Stammzellen. Nach weiteren 3,5 oder 7 Tagen, das entspricht 4,5 bzw. 5

Wochen Cuprizon-Fütterung, wurden die Gehirne der Tiere analysiert und auf Gliazellen, Myelin und

das Vorhandensein von MSC untersucht.

3.4.1. Intranasale Applikation der mesenchymalen Stammzellen

Einer Gruppe Mäusen, gefüttert mit Cuprizon, und einer Kontrollgruppe wurden MSC

über die Nase appliziert. Dafür erhielten die nicht anästhesierten Tiere zweimalig je

60 I.E. Hyaloronidase (Sigma-Alderich) in 6 µl Aqua dest. je Nasenloch im Abstand

von 10 Min. Nach weiteren 30 Min wurden den Tieren 1x106 MSC in insgesamt 24 µl

PBS verabreicht, aufgeteilt auf 2 Portionen pro Nasenloch (VELTHOVEN et al.

2010).


Intravenöse Applikation der mesenchymalen Stammzellen

20

3.4.2. Intravenöse Applikation der mesenchymalen Stammzellen

Weiteren Mäusen wurden 1x106 MSC in 250 µl PBS als Bolus in eine Schwanzvene

appliziert. Die Mäuse wurden dafür zuerst unter eine Rotlichtlampe gesetzt. Durch

die erhöhte Umgebungstemperatur dilatierten hautnahe Venen und waren somit

leichter zu punktieren.

3.5. Probengewinnung

Nach 4,5 bzw. 5. Wochen Cuprizon-Fütterung wurden die Tiere nach einer tiefen

Anästhesie mit 10% Ketamin (Albrecht, Aulendorf, Germany) und 2% Xylazin

(Rompun®, Bayer, Leverkusen, Germany) in einer Natriumchlorid-Lösung durch

Perfusion mit PBS über den linken Ventrikel getötet. Nach Dekapitation wurde die

Schädeldecke vorsichtig entfernt, das Gehirn entnommen und für die

Kryokonservierung 24 Stunden (Std) in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) in PBS und

anschließend für 1-2 Tage in 30 %iger Succroselösung gelagert. Ebenso wurde die

Lunge entnommen. Ein Teil der Lunge wurde wie das Gehirn in PFA und

Succroselösung gelagert, die andere Hälfte wurde für die direkte Weiterverarbeitung

und folgende Durchflusszytometrie in eiskaltem PBS aufbewahrt. Das Rückenmark

wurde nach Entfernung der Wirbelkörper aus dem Rückenmarkskanal entnommen

und wie oben beschrieben für die Kryokonservierung vorbereitet.

Gehirn, Rückenmark und ein Teil der Lunge wurden im Anschluss in

Kryoeinbettmedium (O.C.T.™ Compound, Tissue Tek®, Sakura Finetek Germany

GmbH, Staufen, Germany) auf Trockeneis in vorbereiteten Formen aus

Aluminiumfolie eingefroren, bei -20°C gelagert und später mit dem Kryostat (Leica


Analyse der Oberflächenantigene (Cluster of differentiation, CD)

21

CM3050S,Wetzlar, Deutschland) in 10 µm dünne Scheiben auf Objektträger

gezogen. Dabei wurde der Einfluss von Licht so weit wie möglich vermieden.

Der andere Teil der Lunge wurde durch ein 70 µm Zellsieb (BDscience, Franklin

Lakes, New Jersey, USA) gedrückt und mit PBS nachgespült, um eine

Zellsuspension zu erhalten. Diese Suspension wurde bei 100xg für 2 Min

zentrifugiert (Heraeus Megafuge 2.0R, ThermoScientific, Deutschland). Das

Zellpellet wurde verworfen. Der Überstand wurde gesammelt und erneut bei 400xg

für 5 Min zentrifugiert. Das gewonnene Pellet wurde in 500 µl PBS mit 1% FCS

gesammelt und sofort mit dem Durchflusszytometer analysiert.

3.6. Durchflusszytometrie

3.6.1. Analyse der Oberflächenantigene (Cluster of differentiation, CD)

Um sicher zu stellen, dass die MSC nach Kultivierung noch ihre

Stammzelleigenschaften haben, wurden sie vor Applikation mit einem FACScalibur

(BDscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA) auf stammzellspezifische

Oberflächenmarker getestet. Folgenden Antikörper (AK) in einer Konzentration von

1:100 wurden dafür benutzt: PE-markierte anti-human CD73 AK, APC-markierte anti-

human CD90, PE/cy7-markierte anti-human CD105 (alle BioLegend, San Diego,

Kalifornien, USA) und FITC-markierte anti-human CD14b (eBioscience, San Diego,

Kalifornien, USA). Zum Ausschluss unspezifische Antigen-Antikörperbindung wurde

ein Teil der MSC mit einem FITC-markiertem anti-mouse IgG1, κ Isotype Kontroll-AK

gefärbt (Biolegend).


Analyse PKH26-gefärbter mesenchymaler Stammzellen

22

Zu 250 µl einer MSC-in-PBS-Suspension mit einer MSC-Konzentration von ca. 1000

MSC/µl wurden je 2,5 µl eines Antikörpers gegeben. Hier konnten alle 4 AK

zusammen analysiert werden, da jeder AK mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff

gekoppelt war. Die Mischung wurde für 30 Min bei RT im Dunkeln inkubiert, danach

zweimal bei 400xg für 7 Min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet

erneut in PBS gelöst. Nach einem zusätzlichen Zentrifugationsvorgang bei 400xg für

7 Min wurden die Zellen in 1 ml PBS mit 1% FCS suspendiert und sofort per

Durchflusszytometrie analysiert. Es wurden jeweils von den ungefärbten, den CD-

markierten und den Isotype-gefärbten MSC 5x104 Events gemessen.

3.6.2. Analyse PKH26-gefärbter mesenchymaler Stammzellen

MSC, die wie oben beschrieben mit PKH26 markiert wurden, wurden sofort nach der

Färbung in PBS mit 1% FCS in Suspension gebracht und zur Kontrolle der Färbung

mittels Durchflusszytometrie auf rote Fluoreszenz kontrolliert. Dafür wurden 5x104

Events gemessen.

3.6.3. Analyse Anteil PKH26-positiver Zellen in der Lunge

Um die korrekte Applikation der MSC und deren Vorhandensein im Körper nach

Injektion zu überprüfen, wurde die aus der Lunge gewonnene Zellsuspension (s.

Kapitel 3.5) jedes Tieres einzeln per Durchflusszytometrie auf PKH26-positive Zellen

untersucht. Es wurden 1x105 -1x106 Events untersucht.


Immunhistochemie – DAB-Färbung

23

3.7. Immunhistochemie

3.7.1. Immunhistochemie – DAB-Färbung

Kryokonservierte Schnitte aller Gehirne aus dem Bereich zwischen 0,94 mm bis 1,34

mm vor dem Bregma (PAXINOS u. FRANKLIN 2003) wurden zur Untersuchung von

Myelin, reifen Oligodendrozyten, Astrozyten und aktivierten Mikroglia mittels

Immunhistochemie gefärbt. Die Schnitte wurden für 30 Min aufgetaut und für 10 Min

in PBS rehydriert. Um Proteine zu demaskieren, wurden die Schnitte 10 Min in

Citratpuffer in der Mikrowelle gekocht, für 20 Min bei RT abgekühlt und einmal in

PBS gespült. Die endogene Peroxidase wurde mit 100 µl PBS mit 1% H2O2 für 30

Min im Dunkeln bei RT geblockt und danach dreimal in PBS gespült. Die Schnitte

wurden mit hydrophobem PAP-Stift eingekreist, um die benötigte AK-Menge zu

beschränken. Unspezifische Bindungen wurden für 1 Std mit 200 µl von 3 %

Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 in PBS gesättigt. Über Nacht wurden die

Schnitte bei 4°C mit 100 µl einer Lösung von Primär antikörpern (9.1 Anhang,

Tabelle 2) inkubiert.

Nachdem am nächsten Tag ungebundene primäre AK dreimal mit PBS von den

Schnitten gespült worden waren, wurden sie für 1 Std bei RT mit 100 µl biotinyliertem

Sekundärantikörper in der Konzentration 1:500 in 0,1% Triton X-100 inkubiert.

Folgende sekundären Antikörper wurden benutzt: Anti-mouse IgG (H+L), anti-rat IgG

(H+L), anti-rabbit (H+L) (alle Vector Laboratories, Burlingame, UK). Nach erneutem

dreimaligem Spülen mit PBS wurde die spätere Farbreaktion mit einem Avidin-Biotin-

Komplex (Avidin biotin complex, ABC) verstärkt, indem die Schnitte für 1 Std bei RT


Immunhistochemie – Fluoreszenz-Färbung

24

mit einer ABC-Lösung inkubiert wurden. Nochmals wurden die Schnitte dreimal in

PBS gespült, um dann die AK-Bindung mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Vector

Laboraties Inc.) sichtbar zu machen. Dafür diente 100 µl je Schnitt einer Lösung aus

5 ml Aqua dest. mit 2 Tropfen der im Kit enthaltenen Puffer-Lösung mit 4 Tropfen

DAB Stammlösung, die nach 10Min wieder von den Schnitten gewaschen wurde. Um

die Zellkerne sichtbar zu machen, wurden die Schnitte in Meyers Hämalaun 15 Sek

gefärbt und anschließend unter fließendem Wasser abgespült.

Nachdem die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 80%, 90% Ethanol

je 5 Min., 100% Ethanol 2x 10 Min., Xylol 2x 10 Min.) wieder dehydriert worden

waren, wurden sie mit Corbit (I. Hecht, Kiel-Hassee, Deutschland) eingedeckt

(SKIPULETZ et al. 2008).

3.7.2. Immunhistochemie – Fluoreszenz-Färbung

Um die Proliferation der Oligodendrozyten zu untersuchen wurden Zellen der

gesamten Oligodendrozytenreihe und proliferierende Zellen in kryokonservierten

Schnitten aller Gehirne aus dem Bereich zwischen 0,94 mm bis 1,34 mm vor dem

Bregma (PAXINOS u. FRANKLIN 2003) mittels Immunfloureszenz-Doppelfärbung

sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden für 30 Min aufgetaut und für 10 Min in PBS

rehydriert. Um Proteine zu demaskieren wurden die Schnitte 10 Min in Citratpuffer in

der Mikrowelle gekocht, für 20 Min bei RT abgekühlt und einmal in PBS gespült. Die

endogene Peroxidase wurde mit 100 µl PBS mit 1% H2O2 für 30 Min im Dunkeln bei

RT geblockt und danach dreimal in PBS gespült. Die Schnitte wurden mit

hydrophobem PAP-Stift eingekreist, um die benötigte AK-Menge zu beschränken.


Bestimmung der Demyelinisierung

25

Unspezifischen Bindungen wurden für 1 Std mit 200 µl von 3% Ziegenserum und

0,1% Triton X-100 in PBS gesättigt. Über Nacht wurden die Schnitte bei 4°C mit 100

µl einer Lösung von Primärantikörper OLIG2 (9.1 Anhang, Tabelle 2) in PBS mit

0,1% Triton X-100 in der Feuchtkammer inkubiert.

Nachdem am nächsten Tag ungebundene primäre AK dreimal mit PBS von den

Schnitten gespült worden waren, wurde der zweite primäre Antikörper Ki-67 in einer

Konzentration von 1:100 in PBS mit 0,1% Triton X-100 für 1 Std in der

Feuchtkammer inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Spülen in PBS wurden die

Schnitte für 1 Std bei RT mit 100 µl Sekundärantikörper, beide zusammen in der

Konzentration 1:500 in 0,1 % Triton X-100 in PBS inkubiert. Folgende

Sekundärantikörper wurden benutzt: Alexa Fluor 555 goat anti mouse und Alexa

Fluor 488 goat anti rabbit (beides von Invitrogen, Camarillo, CA, USA). Alle Zellkerne

wurden mit 0,1% DAPI (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) in Mowiol

(Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) sichtbar gemacht und die Schnitte mit

Deckgläschen bedeckt (GUDI et al. 2009).

3.7.3. Bestimmung der Demyelinisierung

Das Ausmaß der Demyelinisierung wurde mit einer immunhistochemischen Färbung

eines myelinspezifischen Proteins (Proteolipid-Protein, PLP) im Corpus callosum

über dem Hippocampus und im Kortex derselben Schnitte ermittelt. Dafür wurde die

Myeliniserung mit einem Score von 0-3 im Corpus callosum bzw. 0-4 im Kortex

beurteilt, wobei 3 bzw. 4 für eine physiologische Myelinisierung steht und 0 für die

vollständige Demyelinisierung. Im Corpus callosum beschreibt Score 2 eine


Quantifizierung von Gliazellen

26

Aufhellung der Farbintensität mit beginnender Auflösung der gleichmäßig parallelen

Myelinstruktur. Score 1 zeigt eine fast vollständige Demyelinisierung im zentralen

Bereich während in den ventralen und dorsalen Anteilen des Corpus callosum noch

eine deutliche Färbung sichtbar ist. Score 3 im Kortex zeigt sich als beginnende

Aufhellung der Färbung. Bei Score 2 sind inselförmig stark demyelinisierte Anteile

sichtbar, während bei Score 1 nur noch vereinzelt zum Teil inselförmig myelinisierte

Fasern zu sehen sind (LINDNER et al. 2008, SKIPULETZ et al. 2011, GUDI et al.

2009).

Die Schnitte wurden von drei Institutsmitgliedern (Karelle Bénardais, Thomas

Skripuletz, Viktoria Gudi) verblindet analysiert. Für die Auswertung wurde für jedes

Tier der Mittelwert aus den drei Scorings gebildet.

3.7.4. Quantifizierung von Gliazellen

Um die gliale Reaktion im Corpus callosum zu quantifizieren, wurden in

immunhistochemisch gefärbten Schnitten Oligodendrozyten, aktivierte Mikroglia und

Astrozyten lichtmikroskopisch (Olympus BX61, Hamburg, Deutschland) gezählt. Als

positive galten die Zellen, wenn sie in der jeweiligen Färbung deutlich braun gefärbt

waren und mit einem violetten Zellkern vergesellschaftet waren. Gezählt wurden die

Zellen in einem Ausschnitt im Corpus callosum über dem Hippocampus. Die Fläche

des Ausschnitts wurde gemessen (cell^F imaging software, Olympus Soft Imaging

Solutions GmbH, Münster, Deutschland) und daraus die Anzahl der Zellen pro mm²

errechnet. Astrozyten und Oligodendrozyten wurden in einer 200fachen


Quantifizierung der Regeneration

27

Vergrößerung gezählt, Mikroglia aufgrund ihrer geringeren Größe und dem teilweise

dichteren Aufkommen in einer 400fachen Vergrößerung.

3.7.5. Quantifizierung der Regeneration

Um die Regeneration von Oligodendrozyten zu quantifizieren, wurden proliferierende

OPC ausgewertet und mittels des Markers OLIG2 und des Proliferationsmarkers Ki-

67 per Fluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Zellen, die für beide Strukturen positiv

und mit einem DAPI-gefärbten Zellkern assoziiert waren, wurden in einem Ausschnitt

des Corpus callosum über dem Hippocampus mit einer 200fachen Vergrößerung mit

dem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Die Fläche des Ausschnitts wurde gemessen

(cell^F imaging software, Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster,

Deutschland) und daraus die Anzahl der Zellen pro mm² errechnet.

3.7.6. Quantifizierung von mesenchymalen Stammzellen im zentralen

Nevensystem

Pro Tier wurden 10 mit 0,1% DAPI (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) in Mowiol

(Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) gefärbte Serienschnitte aus dem Bulbus

olfactorius, dem rostralen Gehirn und dem Rückenmark nach MSC durchsucht. Als

MSC wurden rot fluoreszierende Zellen betrachtet, die keine grüne Autofluoreszenz

aufwiesen und mit einem DAPI positiven Zellkern assoziiert waren. Dazu wurde ein

Fluorenszenzmikroskop benutzt.


Quantifizierung von mesenchymalen Stammzellen im zentralen Nevensystem

28

3.8. Statistik

Für die statistische Analyse wurde eine One-Way Analysis of Variance benutzt und

für die post hoc Analyse wurden alle Gruppen einzeln mit dem Bonferroni-Test

miteinander verglichen. Aufgrund der Gruppengrößen kann eine Gauß´sche

Normalverteilung nur angenommen werden. Daraus resultierende P-Werte werden

im Ergebnissteil angegeben und in den Grafiken gezeigt (*P<0,05; **P<0,01;

***P<0,001). Alle Daten sind als arithmetisches Mittel angegeben. Für die Erstellung

der Statistik und der dazugehörigen Grafiken wurde GraphPad Prism 5 (GraphPad

Software, Inc., La Jolla, CA USA) verwendet.

Ergebnisse

Durchflusszytometrie in vitro

29

4. Ergebnisse

4.1. Mesenchymale Stammzellen in vitro vor Applikation

4.1.1. Durchflusszytometrie in vitro

Durchflusszytometrisch wurden die MSC vor Applikation auf human-spezifische

MSC-Oberflächenmarker getestet (Abbildung 4). Die MSC waren positiv für CD73,

CD90, CD105 und negativ für CD14. Eine unspezifische Bindung der Antikörper

konnte ausgeschlossen werden, da keine Bindung von IgG stattfand.

Ebenso wurden die MSC nach Markierung mit PKH26 auf eine adäquate Färbung

getestet. Über 99% der MSC waren mit der Fluoreszenzfarbe markiert (Abbildung 5).

Ergebnisse


30

Abbildung 4: Analyse von MSC-spezifischen Oberflächenmarkern per Durchflusszytometrie

Die Angaben unter den Plots geben die Anzahl der Events an, die sich im oberen rechten Quadranten

befinden. Diese Zellen wurden als Fluoreszenz-positiv gewertet.

Eine unspezifische Bindung der Fluoreszenz-Antikörper an die MSC wurde ausgeschlossen (A).

Ungefärbte MSC (B) zeigen kaum Fluoreszenz. Mit Fluoreszenz-Antikörpern markierte MSC (C)

zeigen, dass diese negativ für CD 14 und positiv für CD 73, CD 90, CD 105 waren.

B)

C)

A)

Ergebnisse

31

Abbildung 5: Kontrolle der PKH26-Färbung der MSC per Durchflusszytometrie gleich nach Färbung

und kurz vor Applikation

Die Angaben unter den Plots geben die Anzahl der Events an, die sich im oberen rechten Quadranten

befinden. Diese Zellen wurden als Fluoreszenz-positiv gewertet.

Ungefärbte MSC (A) zeigen keine Fluoreszenz, während fast alle MSC nach Färbung mit PKH26 eine

rote Fluoreszenz zeigen (B).

A) B)


Ergebnisse

Mikroskopische Kontrolle PKH26 markierter MSC

32

4.1.3. Mikroskopische Kontrolle PKH26 markierter MSC

Nachdem die MSC mit dem Fluoreszenzfarbstoff markiert waren, wurde ein Teil von

ihnen für 24 Std in vitro weiter kultiviert, um die Verteilung der Fluoreszenz auf der

Zelle mikroskopisch beurteilen zu können. Es zeigte sich ein gleichmäßiges bis

granuläres Verteilungsmuster auf der gesamten Zelle bei 100% der Zellen

(Abbildung 6).

Abbildung 6: PKH26 markierte MSC in vitro

Zellen der Passage 6 wurden mit PKH26 gefärbt und erneut für 24 Std kultiviert. Danach zeigen alle

angewachsenen MSC eine rote Färbung.

(rot: PKH26, blau: DAPI Kernfärbung)

Ergebnisse

Fluoreszenzmikroskopie

33

4.3. Mesenchymale Stammzellen in der Lunge

Zur Kontrolle der adäquaten Applikation wurden die Lungen aller Mäuse am Tag 3,5

bzw. Tag 7 nach Applikation nach MSC durchsucht.

4.3.1. Fluoreszenzmikroskopie

Ein Teil der Lunge aller Tiere wurde nach Kryokonservierung

fluoreszenzmikroskopisch nach MSC durchsucht. Nach i.v. sowie nach i.n. Gabe von

MSC fanden sich in den Lungen rot fluoreszierende Zellen (Abbildung 7), die in den

Kontrolltieren nicht vorhanden waren. Es bestand kein Unterschied zwischen Tieren,

die CPZ erhalten hatten und Kontroll-Tieren.

Abbildung 7: MSC in der Lunge nach i.v. Injektion

In den kryokonservierten Lungen von Tieren, denen MSC i.v. oder i.n. appliziert worden waren,

konnten rot fluoreszierende (PKH26-positive) Zellen im Lungengewebe gesehen werden. Diese Zellen

konnten nicht bei Tieren gefunden werden, die keine MSC erhalten hatten. Hier exemplarisch

dargestellt an einer Maus ohne Cuprizon-Behandlung am Tag 3,5 nach i.v. Applikation von PKH26-

markierten MSC (rot: PKH26, blau: DAPI Kernfärbung).

Ergebnisse

Durchflusszytometrie Lunge

34

4.3.2. Durchflusszytometrie Lunge

Um die Anzahl der MSC in den Lungen quantifizieren zu können, wurde die

Lungenzellsuspension des anderen Lungenteils aller Mäuse mit

Durchflusszytometrie auf rot fluoreszierende Zellen untersucht.

3,5 Tage nach MSC Applikation wurde ein erhöhter Anteil von PKH26-positiven

Zellen in den Lungen der Tiere gefunden, sowohl nach i.v. als auch nach i.n. Gabe

(Abbildung 8, Abbildung 9). Eine rechnerische Signifikanz konnte nicht gezeigt

werden.

Nach weiteren 3,5 Tagen, also 7 Tage nach Applikation, hatte die Anzahl der

PKH26-positiven Zellen augenscheinlich abgenommen, konnte aber statistisch nicht

belegt werden. Es konnten sowohl nach i.v. Gabe als auch nach i.n. Applikation der

MSC immer noch eine Erhöhung der PKH26-positiven Zellen gefunden werden,

wobei es schien als verblieben nach i.v. Injektion der MSC noch mehr PKH26-

positive Zellen in den Lungen (Abbildung 8).

0.0

0.2

0.4

0.6

keine intranasal intravenös

Tag 3,5 nach MSC Applikation

Tag 7 nach MSC Applikation

MSC Gabe

% M

SC

Abbildung 8: Anteil der MSC in der Lunge, ermittelt durch Durchflusszytometrie

Ergebnisse

Durchflusszytometrie Lunge

35

Nach Gabe von MSC wurde deren Anteil in der Lunge durch Durchflusszytometrie ermittelt. Nach

Applikation der MSC über die Nase und über die Vena coccygealis wurden jeweils erhöhte Anteile an

PKH26-positiven Zellen in den Lungen gefunden, die nach 3,5 Tagen weniger wurden. Jeder Balken

repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung.

Abbildung 9: MSC in der Lunge 3,5 Tage nach Applikation, Durchflusszytometrie

Nach Gabe von MSC wurde deren Vorhandensein in der Lunge durch Durchflusszytometrie ermittelt.

Es wurden nach der intravenösen Gabe von MSC mehr PKH26-positive Zellen in den Lungen

gefunden als nach der intranasalen Applikation. Hier exemplarisch die Zellen der Lunge je eines

Tieres pro Applikationsart 3,5 Tage nach Applikation der MSC.

Intensität Fluoreszenz PKH26

Ergebnisse

Myelin

36

4.5. Immunhistochemie

Immunhistochemisch wurde die Auswirkung der MSC-Behandlung auf die

Myelinisierung, die Anzahl und Proliferation von Oligodendrozyten und die

Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten untersucht.

4.5.1. Myelin

Um den Einfluss der MSC-Applikation auf die Demyelinisierung zu untersuchen,

wurden kryokonservierte Gehirnschnitte immunhistologisch auf PLP untersucht und

so auf die Myelinisierung zurückgeschlossen. Die Gehirne der Mäuse, die mit

normalem Futter gefüttert wurden, wiesen im Corpus callosum eine physiologische

Myelinisierung auf. Bei Cuprizon gefütterten Tieren zeigte sich nach 4,5 Wochen eine

Demyeliniserung (P<0,001), die in der 5. Woche augenscheinlich zugenommen

hatte. Dabei zeigte sich zwischen MSC behandelten und unbehandelten Tieren kein

Unterschied (Abbildung 10, Abbildung 11 A1-3).

Aufgrund der Lokalisation der MSC wurde auch die Myelinisierung im Kortex

untersucht, was ähnliche Ergebnisse brachte: Bei allen Cuprizon gefütterten Tieren

zeigte sich offenkundig ein starker Myelinverlust zu beiden Zeitpunkten (P<0,001)

(Abbildung 11 B1-2), der sich aber zwischen MSC-behandelten und –unbehandelten

Tieren nicht unterschied. Somit wurde weder im Corpus callosum noch im Kortex ein

Effekt der MSC-Gabe auf die Myelinisierung festgestellt.

Ergebnisse

Myelin

37

Proteolipid-Protein (PLP)Kortex

0

1

2

3

4

NF CPZ

Woche 4,5

NF CPZ

Woche 5

keine MSC Gabeintranasale Gabeintravenöse Gabe

NFCPZ

NormalfutterCuprizon

*** ***

Sco

re

0

1

2

3

NF CPZ

Woche 4,5

NF CPZ

Woche 5


NFCPZ


Proteolipid-Protein (PLP)Corpus callosum

*** ***

Sco

re

Abbildung 10: Proteolipid-Protein im Corpus callosum und im Kortex

Ergebnisse

Myelin

38

PLP, ein Protein in den Myelinscheiden, zeigt den Grad der Demyelinisierung an. Eine physiologische

Myeliniserung wird im Corpus callosum mit einem Score von 3 beschrieben, Score 2 zeigt eine

Aufhellung der Farbintensität mit beginnender Auflösung der gleichmäßig parallelen Myelinstruktur.

Score 1 steht für eine fast vollständige Demyelinisierung im zentralen Bereich während in den

ventralen und dorsalen Anteilen des Corpus callosum noch eine deutliche Färbung sichtbar ist.

Im Kortex steht ein Score von 4 für eine physiologische Myelinisierung, ein Score von 3 zeigt sich als

beginnende Aufhellung der Färbung. Bei Score 2 sind inselförmig stark demyelinisierte Anteile

sichtbar, während bei Score 1 nur noch vereinzelt, zum Teil inselförmige myelinisierte Fasern zu

sehen sind. In beiden Arealen, Kortex und Corpus callosum, bedeutet ein Score 0 eine vollständige

Demyelinisierung.

Durch die Fütterung von CPZ ist augenscheinlich ein deutlicher Rückgang von PLP im Kortex und im

Corpus callosum zu sehen, worauf die i.v. oder i.n. Applikation von MSC keine Auswirkung hat.

Woche 4,5 bzw. 5 der CPZ-Fütterung entspricht Tag 3,5 bzw. 7 nach Applikation der MSC.

Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001).

Abb

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Proteolipid-Protein (PLP) Corpus callosum

Proteolipid-Protein (PLP) Kortex

39

Ergebnisse

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40

Ergebnisse

Myelin

Ergebnisse

Oligodendrozyten

41

4.5.2. Oligodendrozyten

Um die Auswirkung der MSC-Behandlung auf den Verlust der reifen

Oligodendrozyten zu untersuchen, wurde für die immunhistochemische Färbung der

Primärantikörper gegen das Adenomatous-polyposis-coli (APC)-Protein benutzt. In

Mäusen, die kein Cuprizon erhalten hatten, war eine hohe Anzahl von

Oligodendrozyten sichtbar, die sich in physiologischer, perlschnurartiger Anordnung

zeigten. Tiere, die mit Cuprizon gefüttert wurden, zeigten offensichtlich einen starken

Verlust von reifen Oligodendrozyten (P<0,01 nach 4,5 Wochen CPZ-Fütterung,

zwischen P<0,05 und P<0,001 nach 5 Wochen CPZ-Fütterung) (Abbildung 13). Auch

hier fand sich zwischen MSC behandelten Tieren und den Kontrollgruppen kein

signifikanter Unterschied (Abbildung 12).

Oligodendrozyten (APC)

0

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200

300

NF CPZ

Woche 4,5

NF CPZ

Woche 5


NFCPZ


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Abbildung 12: Oligodendrozyten, Corpus callosum Woche 4,5 bzw. 5 der CPZ-Fütterung entspricht Tag 3,5 bzw. 7 nach Applikation der MSC. Es zeigt sich, dass die i.v. und i.n. Gabe von MSC keine Veränderung der Oligodendrozytenanzahl im Corpus callosum nach sich zieht. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001).

Abb

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42

Ergebnisse

Oligodendrozyten

Ergebnisse

Proliferierende Oligodendrozytenvorläuferzellen

43

4.5.3. Proliferierende Oligodendrozytenvorläuferzellen

Um zu untersuchen, ob die Applikation von MSC einen Einfluss auf die Proliferation

von Oligodendrozytenvorläuferzellen und somit einen Einfluss auf die Regenration

haben, wurden doppelt positive OLIG2 / Ki-67 Zellen ausgewertet. Ein Unterschied

zwischen MSC behandelten Tieren und unbehandelten Tieren war nicht feststellbar

(Abbildung 14): In den Gruppen, die mit Cuprizon gefüttert worden waren, zeigte sich

ein Anstieg der proliferierenden Oligodendrozytenvorläuferzellen in Woche 4,5

(zwischen P<0,05 und P<0,01) (Abbildung 15). Nach weiteren 3,5 Tagen sank die

Anzahl der proliferierenden Oligodendrozyten wieder leicht ab, was an einem

leichten Abfall des errechneten P-Wertes sichtbar war (P<0,05 bis P>0,05).

proliferierende Oligodendrozyten(OLIG2 + Ki-67)

0

20

40

60

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NFCPZ


NF CPZ

Woche 4,5

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Abbildung 14: Proliferierende Oligodendrozyten, Corpus callosum Woche 4,5 bzw. 5 der CPZ-Fütterung entspricht Tag 3,5 bzw. 7 nach Applikation der MSC.

Ergebnisse


44

Nach der Fütterung von CPZ proliferierten Zellen der Oligodendrozytenreihe vermehrt. Die i.v. und i.n. Gabe von MSC hatten darauf keinen Einfluss. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001).

Ergebnisse


45

Abbildung 15: proliferierende Oligodendrozyten im Corpus callosum Immunhistochemische Fluoreszenzfärbung mit Olig2 (Zellen der Oligodendrozytenreihe, grün) und mit Ki-67 (proliferierende Zellen, rot). Zellkerne wurden mit DAPI sichtbar gemacht (blau) Hier exemplarisch nach 4,5 Wochen (3,5 Tage nach MSC-Gabe) bzw. ohne Cuprizon-Fütterung. Vor der Fütterung mit CPZ (Spalte A) befanden sich Oligodendrozyten in hoher Anzahl und in physiologischer perlschnurartiger Aufreihung im Corpus callosum (A1), die keine Proliferation zeigten (A2-4). Nach der Fütterung mit CPZ (nach MSC i.v. Spalte B, ohne MSC-Gabe Spalte C) nahm die Anzahl an Oligodendrozyten (B1, C1) ab, während vermehrt proliferiernde Zellen (B2-4, C2-4) sichtbar wurden. Zwischen Tieren, die MSC i.v. erhalten hatten (Spalte B) und Tieren ohne MSC-Applikation (Spalte C) zeigte sich kein Unterschied. Der Messbalken zeigt 15 µm.

Ergebnisse

Mikroglia und Astrozyten

46

4.5.4. Mikroglia und Astrozyten

Die gliale Aktivierung wurde mit GFAP und Mac-3 visualisiert. In allen Cuprizon-

Gruppen konnte ein klar erkennbarer starker Anstieg der Mikrogliaaktivität gezeigt

werden (P<0,001 und P<0,01). Es war kein Unterschied sichtbar zwischen Mäusen,

die MSC erhalten hatten, und denen, die unbehandelt blieben (Abbildung 16,

Abbildung 18, A1-3).

Mikroglia (Mac-3)

0

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Woche 4,5

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Abbildung 16: Aktivierte Mikroglia, Corpus callosum Woche 4,5 bzw. 5 der CPZ-Fütterung entspricht Tag 3,5 bzw. 7 nach Applikation der MSC. Nach der Fütterung von CPZ fanden sich in hohen Zahlen Mikrogliazellen im Corpus callosum. Die i.v. und i.n. Gabe von MSC hatten darauf keinen Einfluss. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001).

Ergebnisse


47

Auch die Zahl der Astrozyten stieg nach Cuprizon-Fütterung (P<0,001). Zwischen

Gruppen, die MSC erhalten hatten, und den Kontrollgruppen zeigte sich jedoch kein

Unterschied (Abbildung 17). Die Zellen zeigten eine Hypertrophie und die Bildung

von Fortsätzen (Abbildung 18, B1-3).

Astrozyten (GFAP)

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Woche 4,5

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Abbildung 17: Astrozyten, Corpus callosum Woche 4,5 bzw. 5 der CPZ-Fütterung entspricht Tag 3,5 bzw. 7 nach MSC-Gabe. Nach der Fütterung von CPZ fanden sich in erhöhtem Maße aktivierte Astrozyten im Corpus callosum. Die i.v. und i.n. Gabe von MSC hatten darauf keinen Einfluss. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001).

Abb

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Ergebnisse


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49

Ergebnisse


Ergebnisse


50

Ergebnisse


51

4.6. Mesenchymale Stammzellen im zentralen Nervensy stem

4.6.1. Fluoreszenzmikroskopie

Humane MSC wurden in sehr geringen Mengen im ZNS gefunden, konnten aber

offensichtlich nicht bis zu den Läsionen im Corpus callosum durchdringen. Im

rostralen Gehirn fanden sich in den Tieren, denen MSC i.v. injiziert wurden, zwischen

0 und 3 MSC in je 10 Serienschnitten pro Tier (Abbildung 19). Diese Zellen befanden

sich sehr peripher im Gewebe oder sogar in bzw. unter den Hirnhäuten (Abbildung

19, A1). Einige wenige Zellen machten den Eindruck, als wären sie an einer

Gefäßwand adhärent (Abbildung 19, A2). Die Anzahl und die Verteilung der MSC

unterschieden sich nicht offensichtlich zwischen Cuprizon gefütterten Tieren und

solchen, die normales Futter erhielten. In den Gehirnen und Riechkolben der Tiere,

die die Zellen über die Nase erhalten hatten, ebenso wie in den Kontrolltieren ohne

MSC-Behandlung fanden sich keine solchen Zellen. Ebenso konnten in den i.v.

injizierten Tieren keine MSC im Bulbus olfactorius gefunden werden.

Im Rückenmark fanden sich ebenso geringe Mengen an MSC nach i.v. Applikation

(Abbildung 19, C1). Genau wie im Gehirn wurden keine MSC im Rückenmark nach

intranasaler Gabe oder bei Kontrolltieren gefunden.

Ergebnisse


52

Abbildung 19: MSC im ZNS

MSC sind nach i.v. Gabe im Gehirn (A1, A2) sichtbar. Die meisten der MSC fanden sich in oder in der

Nähe der Meningen (A1). Eine kleine Anzahl der gefundenen MSC machte den Anschein, als wären

sie in einen Gefäß (A2). Zur besseren Sichtbarkeit wurden hier Parenchymgrenzen mit einer

gestrichelten Linie gekennzeichnet (A1,2). Im Bulbus olfactorius zeigte sich bei MSC i.n. behandelten

(B2) und unbehandelten Tieren (B1) die gleiche Menge an roter Fluoreszenz. Es wird hier von einer

Ergebnisse


53

physiologischen Autofluoreszenz einiger körpereigener Zellen ausgegangen, die nicht von der Gabe

von MSC abhängt. Im Rückenmark hingegen konnten einige wenige MSC gefunden werden (C1).

Messbalken zeigen 20 µm (A1, A2, C1) bzw. 50µm (B1, B2).

rot: PKH26 (A1-A2, C1), Autofluoreszenz (B1-B2), blau: DAPI Kernfärbung

Diskussion

54

5. Diskussion

Für MS besteht zu diesem Zeitpunkt keine Therapiemöglichkeit, die eine

Regeneration des geschädigten Nervengewebes unterstützt (NYLANDER u.

HAFLER 2012). Deshalb sind in den letzten Jahren Stammzellen in den Fokus der

Wissenschaft gerückt (DEANS u. MOSELEY 2000). Ihre Fähigkeiten, die T-

Zellreifung und eine Entzündungsreaktion zu unterdrücken, sowie Chemokine und

Wachstumsfaktoren zu produzieren, die Wachstum und Regeneration fördern

(RASMUSSON et al. 2003, UCELLI et al. 2008, LI et al. 2002, RIVERA et al. 2006),

sowie die Möglichkeit einer autologen Transplantation (MORANDI et al. 2008)

würden sie zu einer idealen Therapieoption machen. In verschiedenen Tiermodellen

wie EAE (GORDON et al. 2010), konnte die positive Wirkung von MSC auf

regenerative Prozesse gezeigt werden.

Um zu verstehen, ob MSC in der Peripherie oder im ZNS selbst ihre Wirkung

entfalten, wird ein Tiermodell benötigt, das im Gegensatz zu den bisher

verwendeten, ohne eine Beteiligung des peripheren Immunsystems abläuft. Dafür

eignet sich das Cuprizon-Modell. In diesem Mausmodell bleibt die Bluthirnschranke

intakt (BAKKER u. Ludwin 1987) und in das demyelinisierende Geschehen im Gehirn

sind nur ZNS-ansässige Immunzellen involviert (HIREMATH et al. 1998; MCMAHON

et al. 2002; REMINGTON et al. 2007).

Diskussion

Wirkung von intranasal und intravenös verabreichten mesenchymalen Stammzellen im murinen Cuprizon-Modell

55

5.1. Wirkung von intranasal und intravenös verabrei chten

mesenchymalen Stammzellen im murinen Cuprizon-Model l

Diese Arbeit zeigt, dass MSC, die nach 4 Wochen CPZ-Fütterung nasal oder über

die Vena coccygealis appliziert werden, in den folgenden 3,5 bzw. 7 Tagen keine

Auswirkung auf die Regeneration von Oligodendrozyten haben, die durch Cuprizon

zerstört wurden. Passend dazu blieb auch eine vermehrte Aktivierung von Mikroglia

aus.

In Abhandlungen, die sich mit dem Modell des Hirntraumas bei Ratten beschäftigen,

konnten Forscher ähnliche Ergebnisse zeigen. Dort fand sich nach Applikation von

MSC keine klinischen Verbesserungen (HARTING et al. 2009). Auch in vitro-Arbeiten

bestätigen, dass MSC keine direkte Auswirkung auf die Myelinisierung haben

(LINDSAY et al. 2013).

Ein anderes Bild zeigt sich jedoch in Modellen, in denen das periphere Immunsystem

involviert ist. Gruppen, die sich mit EAE oder einem Ischämie-Modell des Gehirns

beschäftigen, konnten zeigen, dass in diesen Modellen sowohl intranasal als auch

intravenös oder direkt intraläsionell applizierte MSC einen positiven Effekt haben, der

sich sowohl in einer funktionell-klinischen Verbesserung als auch in einer

histologisch sichtbaren Regeneration zeigt (ZAPPIA et al. 2005; VAN VELTHOVEN

et al. 2010; WAKABAYASHI et al. 2010).

5.2. Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach in tranasaler

Gabe im Cuprizon-Modell nicht im zentralen Nervensy stem

Nach intransaler Gabe von MSC konnten diese im Curpizonemodell 3,5 und 7 Tage

nach Applikation nicht im Bulbus olfactorius oder im Gehirn gefunden werden.

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach intranasaler Gabe im Cuprizon-Modell nicht im zentralen Nervensystem

56

Andere Gruppen konnten ihre MSC nur bis 30 Min nach intranasaler Applikation per

Nah-Infrarot Live Tracking im Bulbus olfactorius detektieren. Schon nach 1 Std waren

mit dieser Methode keine Zellen mehr auszumachen (BOSSOLASCO et al. 2012).

Ebenso wenig waren MSC im Gehirn in koronaren Schnitten sichtbar (VELTHOVEN

et al. 2010; DANIELYAN et al. 2011). VELTHOVEN et al. 2010 zeigten, dass nach

intranasaler Gabe von MSC, die mit PKH26 markiert waren, nach 18 Tagen noch im

Bulbus olfactorius zu sehen waren. Die veröffentlichten Bilder, auf denen die rote

Fluoreszenz zu sehen ist, ähneln denen, die hier von den Mäusen gemacht wurden,

denen nur Hyaloronidase und PBS ohne MSC appliziert wurden (Abbildung 19, B1).

Hier wird angenommen, dass es sich um eine physiologische Autofluoreszenz

einiger Zellen handelt, da diese auch unter einem grünen Filter sichtbar sind. Die in

der hier vorliegenden Arbeit verwendeten MSC jedoch leuchten nur unter dem roten

Filter.

Es scheint, MSC können nicht über den Bulbus olfactorius in das ZNS eindringen.

Entweder sind sie aus diversen Gründen nicht in der Lage, zentripedal an den Nervi

olfactorii entlang und durch die Regio olfactoria in das ZNS zu gelangen oder bei der

Applikation gelangen die meisten MSC über den Pharynx in den Larynx und werden

dort abgeschluckt bzw. gelangen von dort in die Lunge. Die restlichen noch an der

Regio olfactorius haftenden MSC scheinen zu wenige zu sein, um sie nach mehreren

Tagen gezielt im ZNS wieder auffinden zu können. Unterstützt wird diese Vermutung

von den hier gezeigten Daten der Durchflusszytometrie, die zeigen, dass viele der

MSC in der Lunge auffindbar sind.

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach intravenöser Gabe im Cuprizon-Modell nur vereinzelt im zentralen Nervensystem, aber nicht in der Läsion

57

5.3. Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach in travenöser

Gabe im Cuprizon-Modell nur vereinzelt im zentralen

Nervensystem, aber nicht in der Läsion

Nur sehr wenige MSC sind nach intravenöser Gabe im ZNS zu finden. Sowohl im

Gehirn als auch im Rückenmark ist nur eine marginale Anzahl der PKH26 markierten

Zellen wieder aufzufinden. Dass diese hauptsächlich in der grauen Substanz und in

den Meningen zu sehen sind, sowie der Anschein, dass manche an den Endothelien

der Blutgefäße adhärent sind, deutet auf eine hämatogene Verteilung der Zellen hin.

Keine der MSC konnte in den Läsionen der weißen Substanz nachgewiesen werden.

In EAE konnten i.v. applizierte MSC im ZNS nachgewiesen werden(BOSSOLASCO

et al. 2012). Bei Ratten mit einer ischämischen Läsion präsentierten sich die MSC

sogar vermehrt in der ipsilateralen Hemisphäre der Läsion (GAO et al. 2001).

Die Ergebnisse hier im Cuprizon-Modell hingegen ähneln eher der Verteilung von i.v.

injizierten Zellen in gesunden Tieren: Die meisten MSC konnten in der Lunge

nachgewiesen werden (LEE et al. 2009). Nur wenige Zellen wurden in anderen

Organen, wie z.B. dem ZNS, gefunden (DANIELYAN et al. 2009).

Eine Ursache dafür könnte eine mangelnde Produktion von chemotaktisch

wirksamen Faktoren im ZNS sein. Dadurch würden die MSC nicht zum Übertritt ins

ZNS aus dem Blut stimuliert werden. Das scheint jedoch nicht der Fall zu sein, da

der inflammatorische Stimulus gegeben sein sollte, um MSC potentiell in die Läsion

zu dirigieren. Die MSC wurden zu einem Zeitpunkt angewendet, an dem die stärkste

Aktivierung der Mikroglia stattfindet (SKRIPULETZ et al. 2011). Und zusätzlich wurde

belegt, dass im Curizonemodell zu diesem Zeitpunkt im Corpus callosum vermehrt

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen befinden sich nach intravenöser Gabe im Cuprizon-Modell nur vereinzelt im zentralen Nervensystem, aber nicht in der Läsion

58

Substanzen exprimiert werden (NESSLER et al. 2013), die eine Migration von MSC

auslösen (FIEDLER et al. 2005; MISHIMA u. LOTZ 2008; VOGEL et al. 2010; XU et

al. 2010; MAIJENBURG et al. 2012).

Eine andere Erklärung wäre die Toxizität von Cuprizon auf MSC selbst, so dass

diese im Körper absterben. Aber auch hier konnte unsere Gruppe zeigen, dass das

nicht die Ursache für das Fehlen der MSC in der Läsion zu sein scheint. Es stellt sich

dar, als wäre Cuprizon sehr spezifisch nur für mature Oligodendrozyten toxisch

(BENARDAIS et al. 2013; NESSLER et al. 2013).

Die Heterogenität der Ergebnisse in der Verteilung der MSC nach Applikation könnte

außer an unterschiedlichen Methoden zur Nachverfolgung und Auswertung auch an

der Heterogenität der verwendeten Stammzellen liegen. Die Art der Kultivierung

sowie die Herkunft der MSC spielen eine Rolle bei der Ausdifferenzierung der Zellen

und somit bei deren Fähigkeiten (WAGNER et al. 2005; DOMINICI et al. 2006).

Zum anderen beeinflusst die Art des verwendeten Tiermodells die Verteilung der

Stammzellen erheblich. In Modellen mit einer gestörten Bluthirnschranke fällt es

Zellen leichter, in das ZNS einzudringen, als in Systemen, die diese Pathologie nicht

zeigen. So scheint es, MSC sind nicht in der Lage, die intakte Bluthirnschranke zu

überwinden.

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen scheinen in einem Modell ohne Beteiligung der Peripherie keinen Einfluss auf die Regeneration zu haben

59

5.4. Mesenchymale Stammzellen scheinen in einem Mod ell ohne

Beteiligung der Peripherie keinen Einfluss auf die Regeneration zu

haben

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass MSC im Cuprizon-Modell, einem

Model, in dem das periphere Immunsystem keine Rolle bei der Pathogenese spielt

und die Bluthirnschranke nicht verletzt ist, auf regenerative Prozesse im ZNS keinen

Einfluss zu haben scheinen. Eine Aussage über die Auswirkung der MSC-Gabe auf

langfristige Remyeliniserungsprozesse kann diese Arbeit zwar nicht treffen, aber im

Hinblick darauf, dass eine Woche nach Applikation der MSC keine Vermehrung der

glialen Zellen im Corpus callosum sichtbar ist und dass kaum MSC in der Läsion

selbst gefunden wurden, scheint es unwahrscheinlich, dass eine Untersuchung der

Remyelinisierung zu einem späteren Zeitpunkt zu einem gegenteiligen Ergebnis

kommt.

Ebenso kann aufgrund der hier gezeigten Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden,

dass es möglich ist, die durch CPZ hervorgerufenen Schädigung zu minimieren,

indem MSC vor Einsetzten der chronischen Noxe, also vor CPZ-Gabe, appliziert

werden, da die Oligodendrozyten zum Zeitpunkt der MSC-Anwendung schon zerstört

waren.

Trotzdem könnte diese Arbeit ein weiterer Hinweis darauf sein, dass MSC ihre

protektive oder regenerative Wirkung bei z.B. EAE nicht im Gehirn selbst entfalten,

sondern dass sie in der Peripherie mit Immunzellen interagieren. Es wurde gezeigt,

dass MSC nach i.v. Injektion einem First-Pass-Effekt in der Lunge unterliegen und

dort festgehalten werden (FISCHER et al. 2009). Dort werden gleichzeitig

autoreaktive T-Zellen dazu befähigt, in das ZNS einzudringen (ODOARDI et al.

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen scheinen in einem Modell ohne Beteiligung der Peripherie keinen Einfluss auf die Regeneration zu haben

60

2012). Dort oder in Lymphkonten, wo MSC in unmittelbarer Nachbarschaft mit T-

Zellen gefunden wurden (ZAPPIA et al. 2005), könnten MSC mit diesen Immunzellen

in Kontakt treten und autoreaktive T-Zellen daran hindern auszureifen, ins ZNS zu

migrieren und so den Pathomechanismus der T-Zell-induzierten Demyeliniserung

verhindern. Dieser Ansatz könnte bei der Bekämpfung von MS ein weiterer Schritt

weg von der symptomatischen hin zu einer kurative Therapie sein.

Zusammenfassung

61

6. Zusammenfassung

Jasmin Neßler, Einfluss von intravenös und intranas al applizierten humanen

Stammzellen in der Cuprizon-induzierten Demyelinisi erung

Bis dato ist keine Behandlung von Multiple Sklerose (MS) bekannt, die die

Regeneration und Remyelinisierung des Nervengewebes unterstütz. Es wird

angenommen, dass mesenchymale Stammzellen (MSC) diese Regeneration

unterstützen können. In Tiermodellen für MS wie experimentelle autoimmune

Enzephalomyelitis (EAE) konnten bereits erste klinische Besserungen nach

intravenöser Gabe von MSC gezeigt werden. Trotzdem ist es noch nicht geklärt, ob

dieser Effekt im Gewebe des zentralen Nervensystems selbst stattfindet oder ob

MSC einen Einfluss auf Immunzellen in der Peripherie ausüben und damit den

Heilungsverlauf verbessern. Um dieser Frage nachzugehen, wurde in dieser Arbeit

die Auswirkung von über die Schwanzvene oder über die Nase applizierten MSC auf

die Demyelinisierung im Cuprizon-Modell untersucht. In diesem toxischen Modell

spielen periphere Immunzellen keine Rolle und die Bluthirnschranke ist intakt. Im

Unterschied zu anderen Arbeiten konnte hier kein Effekt von MSC auf die De- und

Remyelinisierung sowie auf die Aktivierung von Gliazellen gezeigt werden. Zusätzlich

drangen die MSC nicht in die Läsion im Gehirn ein.

Summary

62

7. Summary

Jasmin Neßler, Impact of intranasally and intraveno usly applied human

mesenchymal stem cells on Cuprizone induced demyeli nation

For the treatment of patients with multiple sclerosis there are no regenerative

therapies in order to enhance remyelination. Mesenchymal stem cells (MSC) have

been proposed to exert such regenerative functions. Intravenous administration of

human MSC reduced the clinical severity of experimental autoimmune

encephalomyelitis (EAE), an animal model mimicking some aspects of multiple

sclerosis. However, it is not clear if this effect was achieved by systemic

immunomodulation or if there is an active neuroregeneration in the central nervous

system (CNS). In order to investigate remyelination and regeneration in the CNS the

author analyzed the effects of intravenously and intranasally applied human bone

marrow-derived MSC on Cuprizone induced demyelination, a toxic animal model that

allows analysis of remyelination without the influence of the peripheral immune

system. In contrast to EAE no effects of MSC on de- and remyelination and glial cell

reactions were found. In addition, human MSC did not enter the lesions in the CNS in

this toxic model. In conclusion, MSC are not directed into CNS lesions in the

Cuprizone model where the blood-brain-barrier is intact.

Literaturangaben

63

8. Literaturangaben

AGGARWAL, S. u. M. F. PITTENGER (2005):

Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.

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Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis

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Anhang

Tabellen

79

9. Anhang

9.1. Tabellen

Tabelle 1: Anzahl der Mäuse pro Gruppe

Tabelle 1 zeigt die Anzahl der Tiere pro Gruppe. Die Versuchsgruppen (hier fett

hervorgehoben) wurden mit Cuprizon gefüttert und erhielten MSC über die Nase

oder die Vena coccygealis, Kontrollgruppen erhielten entweder nur Cuprizon-Futter

oder nur MSC i.v. oder i.n.

Tabelle 2: Primärantikörper für immunhistochemische Färbung

DAB-Immunhistochemie

Primär -

antikörper Zielstruktur

Art und Herkunft

Antikörper

verwendete

Konzentration

PLP Myelin

Proteolipid-Protein

Maus

monoklonaler IgG2a,

MorphoSys AbD GmbH,

Düsseldorf, Deutschland

1:500

Applikationsart MSC i.v. MSC i.n. Keine MSC

Zeitpunkt 4,5

Wochen

5

Wochen

4,5

Wochen

5

Wochen

4,5

Wochen

5

Wochen

Cuprizon-Fütterung 4 Tiere 4 Tiere 5 Tiere 5 Tiere 4 Tiere 4 Tiere

Normalfutter 5 Tiere 5 Tiere 4 Tiere 4 Tiere

Anhang

Tabellen

80

Mac-3 Aktivierte Mikroglia

Ratte

monoklonaler IgG1,

BD Pharmingen,

Heidelberg, Deutschland

1.500

GFAP

Astrozyten

glial fibrillary acidic

protein

Kaninchen

polyklonaler IgG,

Dako Deutschland GmbH,

Hamburg, Deutschland

1:200

APC

Reife

Oligodendrozyten

Adenomatous

polyposis coli

Maus

monoklonale IgG2b,

Merck KGaA, Darmstadt,

Deutschland

1:200

Fluoreszenz-Immunhistochemie

Primär -

antikörper Zielstruktur

Art und Herkunft

Antikörper

verwendete

Konzentration

Olig2

Zellen aus der

gesamten

Oligodengrozytenreihe

oligodendrocyte

transcription factor 2

Kaninchen

polyklonaler IgG

Millipore,

Temiculla, CA, USA

1:100

Tabelle 2: Primärantikörper für immunhistochemische Färbung, Fortsetzung

Anhang

Tabellen

81

Ki-67 Proliferierende Zellen

Maus

monoklonaler IgG1, κ

BD Pharmingen,

Heidelberg, Deutschland

1:100

Tabelle 2 zeigt die für die Immunhistochemie (DAB-Methode oder

Immunfluoreszenz) verwendeten Pimärantikörper, deren Zielzellen, die Herkunft und

die verwendete Verdünnung (s. Kapitel 4.5 und 4.6)

Tabelle 2: Primärantikörper für immunhistochemische Färbung, Fortsetzung

Anhang

Tabellen

82

Tabelle 3: Daten MSC in Lunge, Durchflusszytometrie

MSC-Applikation Zeitpunkt Fütterung Tier % PKH26 positiver Zellen

keine MSC Applikation

Woche 4,5

Cuprizon-Fütterung 1 0,01

2 0,00

3 0,00

4 0,00

Woche 5 5 0,02

6 0,00

7 0,00

8 0,00

intranasale MSC

Applikation

Woche 4,5


10 0,01

11 0,03

12 0,01

13 0,01

Normalfutter 14 0,11

15 0,02

16 0,31

17 0,05

Woche 5

Cuprizon-Fütterung

18 0,03

19 0,01

20 0,02

Anhang

Tabellen

83


intranasale MSC

Applikation

Woche 5 Cuprizon-Fütterung 21 0,01

22 0,03


24 0,01

25 0,01

26 0,01

Intravenöse MSC

Applikation

Woche 4,5


28 0,11

29 0,02

30 0,06


32 0,07

33 0,05

34 2,12

35 0,05

Woche 5


37 0,05

38 0,02

39 0,03

Normalfutter

40 0,13

41 0,07

Tabelle 3: Daten MSC in Lunge, Durchflusszytometrie, Fortsetzung

Anhang

Tabellen

84


Intravenöse MSC

Applikation

Woche 5 Normalfutter 42 0,18

43 0,09

44 0,06

Tabelle 3 zeigt den Prozentsatz der PKH26-positiven Zellen in den Lungen nach i.n.

oder i.v. Applikation von MSC, die mit PKH26 markiert waren, 3,5 Tage (entspricht

dem Zeitpunkt von 4,5 Wochen CPZ-Fütterung) bzw. 7 Tage (entspricht dem

Zeitpunkt von 5 Wochen CPZ-Fütterung) nach Applikation der MSC.

Tabelle 4: Daten MSC im Gehirn nach Applikation

MSC-Applikation Fütterung Zeitpunkt Tier

Anzahl MSC pro 10 Serienschnitte

Bulbus olfactorius

Gehirn Rücken -mark

keine MSC Applikation

Cuprizon Woche 4,5 1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

Woche 5 5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

intranasale MSC

Applikation

Normal-futter

Woche 4,5

14 0 0 0

15 0 0 0

16 0 0 0

Tabelle 3: Daten MSC in Lunge, Durchflusszytometrie, Fortsetzung

Anhang

Tabellen

85



Bulbus olfactorius


intranasale MSC

Applikation

Normal-futter

Woche 4,5 17 0 0 0

Woche 5

23 0 0 0

24 0 0 0

25 0 0 0

26 0 0 0


10 0 0 0

11 0 0 0

12 0 0 0

13 0 0 0

Woche 5 18 0 0 0

19 0 0 0

20 0 0 0

21 0 0 0

22 0 0 0

Intravenöse MSC

Applikation

Normal-futter

Woche 4,5 31 0 0 0

32 0 1 0

33 0 3 1

34 0 0 0

35 0 0 0

Woche 5 40 0 1 0

Tabelle 4: Daten MSC im Gehirn nach Applikation, Fortsetzung

Anhang

Tabellen

86



Bulbus olfactorius


Intravenöse MSC

Applikation

Normal- futter

Woche 5 41 0 1 0

42 0 1 2

43 0 2 0

44 0 0 0


28 0 2 1

29 0 0 0

30 0 1 0

Woche 5 36 0 0 0

37 0 0 0

38 0 0 1

39 0 1 0

Tabelle 3 zeigt die Anzahl der PKH26-positiven Zellen im Bulbus olfactorius, Gehirn

und im Rückenmark nach i.n. oder i.v. Applikation von MSC, die mit PKH26 markiert

waren, 3,5 Tage (entspricht dem Zeitpunkt von 4,5 Wochen CPZ-Fütterung) bzw. 7

Tage (entspricht dem Zeitpunkt von 5 Wochen CPZ-Fütterung) nach Applikation der

MSC. Die Zellen wurden in 10 hintereinander folgenden Schnitten von je 10 µm

Dicke gezählt.

Tabelle 4: Daten MSC im Gehirn nach Applikation, Fortsetzung

Tab

elle

5: D

aten

Imm

unhi

stoc

hem

ie

Z

eitp

unkt

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Anhang

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92

Anhang

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93

Anhang

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3 35

,65

43,4

0 1,

675

0,0

24,2

5 18

,25

29, 8

8

Med

ian

18,1

5 0,

0 62

,85

58,5

0 63

,05

13,2

5 0,

0 44

,40

38,0

0 46

,15

75%

Per

zent

il 21

,88

21,8

0 76

,88

73,0

5 81

,88

19,9

5 5,

800

63,5

8 56

,55

67,8

3

Max

imum

22

,60

24,9

0 77

,40

77,7

0 85

,20

20,0

0 11

,60

65,3

0 72

,10

70,0

0

Tab

elle

8: S

tatis

tik O

ligod

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ozyt

en, F

orts

etzu

ng

94

Anhang

Tabellen

Mitt

elw

ert

16,7

5 8,

720

56,1

5 55

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62,7

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Tab

elle

10:

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1 15

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Tab

elle

8: S

tatis

tik p

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rend

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ligod

endr

ozyt

en, F

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ng

95

Anhang

Tabellen

25%

Per

zent

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66,7

5 22

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218,

2 21

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5 68

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7 16

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192,

9

Med

ian

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0 69

,15

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0,5

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3 75

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77,0

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5,6

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8 19

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75%

Per

zent

il 89

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77,4

8 27

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231,

6 24

9,0

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5 82

,00

217,

7 27

1,9

257,

3

Max

imum

96

,00

79,9

0 27

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231,

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0,2

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7 29

1,5

278,

0

Mitt

elw

ert

73,5

3 71

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eich

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Tab

elle

10:

Sta

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Ast

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96

Anhang

Tabellen

Tab

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11:

Sta

tistik

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Max

imum

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Mitt

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Sta

ndar

d A

bwei

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Sta

ndar

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97

Anhang

Tabellen

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98

Tab

elle

11:

Sta

tistik

akt

ivie

rte

Mik

rogl

ia, F

orts

etzu

ng

Anhang

Tabellen

Anhang

Abbildungsverzeichnis

99

9.2. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Das Corpus callosum als Zielstruktur im Cuprizon-Modell .................. 11

Abbildung 2: Relative Zellzahlenzunahme im Corpus callosum während 0,2%iger Cuprizon-Fütterung ................................................................................................... 13

Abbildung 3: Zeitlicher Ablauf des Versuchs ............................................................ 19

Abbildung 4: Analyse von MSC-spezifischen Oberflächenmarkern per Durchflusszytometrie ................................................................................................ 30

Abbildung 5: Kontrolle der PKH26-Färbung der MSC per Durchflusszytometrie gleich nach Färbung und kurz vor Applikation .................................................................... 31

Abbildung 6: PKH26 markierte MSC in vitro ............................................................. 32

Abbildung 7: MSC in der Lunge nach i.v. Injektion ................................................... 33

Abbildung 8: Anteil der MSC in der Lunge, ermittelt durch Durchflusszytometrie ..... 34

Abbildung 9: MSC in der Lunge 3,5 Tage nach Applikation, Durchflusszytometrie .. 35

Abbildung 10: Proteolipid-Protein im Corpus callosum und im Kortex ...................... 37

Abbildung 11: Proteolipid-Protein (PLP) nach 5 Wochen CPZ-Fütterung (entspricht 7 Tage nach MSC-Gabe) bzw. ohne CPZ, Immunhistochemie ................................... 39

Abbildung 12: Oligodendrozyten, Corpus callosum .................................................. 41

Abbildung 13: Oligodendrozyten (APC) nach 5 Wochen CPZ-Fütterung (entspricht 7 Tage nach MSC-Gabe) bzw. ohne CPZ, Immunhistochemie ................................... 42

Abbildung 14: Proliferierende Oligodendrozyten, Corpus callosum .......................... 43

Abbildung 15: proliferierende Oligodendrozyten im Corpus callosum ...................... 45

Abbildung 16: Aktivierte Mikroglia, Corpus callosum ................................................ 46

Abbildung 17: Astrozyten, Corpus callosum ............................................................. 47

Abbildung 18: Gliale Reaktion nach 5 Wochen CPZ-Fütterung (7 Tage nach MSC-Gabe) bzw. ohne CPZ, Immunhistochemie .............................................................. 48

Abbildung 19: MSC im ZNS ...................................................................................... 52

Anhang

Tabellenverzeichnis

100

9.3. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Anzahl der Mäuse pro Gruppe ................................................................. 79

Tabelle 2: Primärantikörper für immunhistochemische Färbung............................... 79

Tabelle 3: Daten MSC in Lunge, Durchflusszytometrie ............................................ 82

Tabelle 4: Daten MSC im Gehirn nach Applikation ................................................... 84

Tabelle 5: Daten Immunhistochemie ........................................................................ 87

Tabelle 6: Statistik Myelin im Corpus callosum ......................................................... 90

Tabelle 7: Statistik Myelin im Kortex ......................................................................... 91

Tabelle 8: Statistik Oligodendrozyten ....................................................................... 93

Tabelle 9: Statistik proliferierende Oligodendrozyten ............................................... 94

Tabelle 10: Statistik Astrozyten ................................................................................ 95

Tabelle 11: Statistik aktivierte Mikroglia .................................................................... 97

Anhang

Abkürzungsverzeichnis

101

9.5. Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

µl Mikroliter

6-OHDA 6-Hydroxipopamin

AK Antikörper

APC Adenomatous-polyposis-coli

BDNF brain-derived neurotrophic factor

bFGF basic fibroblast growth factor

bzw. beziehungsweise

ca zirka

CD Cluster of differentiation, Oberflächenantigene

CNS central nervous system

CPZ Cuprizon

DAB 3,3'-Diaminobenzidin

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

Anhang


102

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FCS fetales Kälberserum

FGF fibroblast growth factor

g Normfallbeschleunigung

GFAP glial fibrillary acidic protein, Saures Gliafaserprotein

GFP Grün floureszierendes Protein

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

HGF hepatocytic growth factor

I.E. International Einheit(en)

i.n. intranasal

i.v. intravenös

IFN Interferon

IL Interleukin

Min Minute(n)

Anhang


103

ml Milliliter

mm Millimeter

mM Millimol

mm² Quadratmillimeter

MS Multiple Skelose

MSC Mesenchymale Stammzellen

ng Nanogramm

NGF nerve growth factor

NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen

Olig2 oligodendrocyte transcription factor 2

OPC oligodendrocyt precursor cell,

Oligodendrozytenvorläuferzellen

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PFA Paraformaldehyd

PLP Proteolipid-Protein

RT Raumtemperatur

Anhang


104

s. siehe

Sek Sekunde(n)

Std Stunde(n)

TGF transforming growth factor

VEGF vascular endothelial growth factor

z.B. zum Beispiel

ZNS zentrales Nerven System

Danksagungen


105

10. Danksagungen

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner für die reibungslose,

schnelle, gewissenhafte und ausgesprochen angenehme wissenschaftliche

Betreuung.

Außerdem möchte ich der gesamten Arbeitsgruppe Stangel der Abteilung

Neuroimmunologie der Medizinischen Hochschule Hannover danken. Im Besonderen

danke ich Prof. Dr. Martin Stangel für die wissenschaftliche Betreuung, Dr. Thomas

Skripuletz und Viktoria Gudi, PhD, die immer ein offenes Ohr hatten und immer noch

haben, und Karelle Bénardais und allen anderen Mitdoktoranden, die mir mit Rat und

Tat zur Seiten standen. Außerdem möchte ich für die technische Unterstützung im

ganz Speziellen Andreas Niesel danken, der immer für jedes Problem das passende

Werkzeug hatte, sowie Sabine Lang und Ilona Cierpka-Leja, die mir mit viel Geduld

die praktischen Fähigkeiten für diese Arbeit an die Hand gaben.

Ich danke Prof. Dr. Andrea Hoffmann und ihrer Arbeitsgruppe aus der Klinik für

Unfallchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover dafür, dass sie mir die

Stammzellen und das nötige Wissen darum zur Verfügung stellten.

Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss von intravenös ...€¦ · Tierärztliche Hochschule...

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