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Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von exogenem Progesteron auf die uterine, luteale und follikuläre

Durchblutung sowie die Genexpression im lutealen Gewebe bei zyklischen Kühen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

vorgelegt von

Phuong Do Duc

Longxuyen-Angiang/Vietnam

Hannover 2015

( Dr. med. vet.)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein

Klinik für Reproduktionsmedizin

Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich

Priv.-Doz. Dr. Kathrin Herzog

Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Sieme

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2015

Sabrina

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .................................................................................................................... 1

2 Literatur ....................................................................................................................... 3

2.1 Progesteron .................................................................................................................. 3

2.2 Uteriner Blutfluss ...................................................................................................... 20

2.3 Follikuläre Durchblutung .......................................................................................... 21

2.4 Luteale Durchblutung ................................................................................................ 22

2.5 Genexpression im Corpus luteum ............................................................................. 24

3 Material und Methode ............................................................................................... 28

3.1 Tiere .......................................................................................................................... 28

3.2 Versuchsanordnung ................................................................................................... 28

3.3 Durchführung der Farbdoppler- und B-Mode-Sonographie ..................................... 31

3.4 Auswertung der Farbdoppler- und B-Mode Bilder ................................................... 32

3.5 Plasmagewinnung und hormonanalytische Methoden .............................................. 36

3.6 Transvaginale Corpus luteum Biopsie unter Ultraschallkontrolle ............................ 37

3.7 Genexpressionsanalyse .............................................................................................. 39

3.8 Statistische Auswertung ............................................................................................ 41

4 Ergebnisse ................................................................................................................. 42

4.1 Zykluslänge ............................................................................................................... 42

4.2 Progesteronkonzentration im Plasma ........................................................................ 43

4.3 Größe des Corpus luteum .......................................................................................... 44

4.4 Durchblutung des Corpus luteum .............................................................................. 45

4.5 Größe des präovulatorischen Follikels ...................................................................... 46

4.6 Durchblutung des präovulatorischen Follikels .......................................................... 47

4.7 Uteriner Blutfluss ...................................................................................................... 48

5 Diskussion ................................................................................................................. 52

5.1 Progesteron ................................................................................................................ 53

5.2 Genexpression der an der lutealen P4 Synthese beteiligten Enzyme ........................ 54

5.3 Größe des Corpus luteum .......................................................................................... 56

5.4 Durchblutung des Corpus luteum .............................................................................. 57

5.5 Größe und Perfusion des Follikels ............................................................................ 59

5.6 Uterine Perfusion ....................................................................................................... 61

5.7 Zykluslänge ............................................................................................................... 62

6 Zusammenfassung ..................................................................................................... 65

7 Summary ................................................................................................................... 67

8 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 69

9 Anhang ...................................................................................................................... 84

Abkürzungsverzeichnis

A luteale Querschnittsfläche

A. ut. Arteria uterina

Aa. ut Arteriae uterinae

ad us. vet. ad usum veterinare

BCS Body Condition Score

cDNA komplementäre DNA (codierende DNA)

CIDR Controlled Intravaginal Drug Release

CL Corpus luteum (Gelbkörper)

CYP11A1 cytochrome-P450-side-chain-cleavage-enzyme-complex

DF dominanter Follikel

DNA Desoxyribonucleic acid

eNOS endotheliale Stickstoffoxid-Synthase

E2 Östrogen

FDB follikuläre Durchblutung

FS Follikular Size (follikuläre Größe)

FSH Follikelstimulierendes Hormon

GH Growth Hormone

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

GnRH Gonadotropin Releasing Hormone

GOI Gene of Interest

hCG human Chorionic Gonadotropin

HSD-3β 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase

IE Internationale Einheit

IFNT Interferon- Tau (Interferon- τ)

LDB luteale Durchblutung

LH Luteinisierendes Hormon

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

MHz Megahertz

ml/min Milliliter pro Minute

MM Master-Mix

µM Mikromol

mM Millimol

mRNA Messenger Ribonucleic Acid

m/s Meter pro Sekunde

MW arithmetischer Mittelwert

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid-Lösung

ng Nanogramm

P4 Progesteron

PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion)

PDI-Mode Power Doppler Imaging Mode

PGF2α Prostaglandin F2 alpha

PGFM Prostaglandin F2 alpha-Metabolit

PI Pulsatility Index

p.i. post inseminationem (nach der Besamung)

PRID® Progesteron release intravaginal device

qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction

r Korrelationskoeffizient

RI Resistance Index

RIA Radioimmunoassay

ROI Region of Interest

RT Reverse Transkription

RT-qPCR Reverse Transkriptase Quantitative Polymerase Chain Reaction

s Sekunde

SD Standardabweichung

SEM Standardfehler

StAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein

TAMV Time Average Maximum Velocity (Mittlere Blutflussgeschwindigkeit)

TR Trächtigkeitsrate

U Enzymeinheit

UBF uteriner Blutfluss

U/min Umdrehungen pro Minute

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Rezeptor

vs. versus

Mittelwert

Einleitung

1

1 Einleitung

In den letzten Jahrzehnten wurde dank des schnellen züchterischen Fortschritts bei

Milchkühen und der Veränderungen im Management eine deutliche Steigerung der

Laktationsleistung erreicht (BELL et al. 2011). Im Gegensatz dazu ist eine stetige

Verschlechterung der Fruchtbarkeit erkennbar (DISKIN und MORRIS 2008). Die erhöhte

Stoffwechselbelastung im Zuge der hohen Milchproduktion hat einen negativen Einfluss auf

die Follikelreifung und auf den Zeitpunkt des ersten Zyklus post partum (p.p.) (BEAM und

BUTLER 1998).

Es ist weiterhin bekannt, dass eine vermehrte Leberdurchblutung infolge der gesteigerten

Trockenmasseaufnahme mit einer erhöhten Metabolisierung des Progesterons (P4)

(SANGSRITAVONG et al. 2002) und damit einem verzögerten P4-Anstieg sowie einer

verminderten P4-Konzentration einhergeht (FOLMAN et al. 1973). Progesteron (P4) ist

entscheidend für die Ovulation eines Follikels mit guter Eizellqualität und die

Aufrechterhaltung der Trächtigkeit (INSKEEP 2004). Eine niedrige systemische P4-Konzen-

tration vor und nach der Besamung ist eine der Ursachen für eine verminderten

Konzeptionsrate bei laktierenden Milchkühen (MANN und LAMMING 1999). Ferner hat ein

niedriger P4-Spiegel negative Auswirkungen auf die Follikelentwicklung (SAVIO et al.

1993a; SAVIO et al. 1993b).

In engem Zusammenhang mit den systemischen P4-Konzentrationen stehen des Weiteren die

zyklusbedingten Veränderungen sowohl der lutealen Größe (LS) (KASTELIC et al. 1990a)

als auch des lutealen Gewichtes (ROBINSON et al. 2006) sowie der lutealen Durchblutung

(HERZOG et al. 2010). Zudem scheint eine Korrelation zwischen der Größe des CL und

seiner Funktionalität zu bestehen (KASTELIC et al. 1990a). Dementsprechend weist ein

kleineres CL eine geringere P4-Sekretion auf als ein größeres CL (ROBINSON et al. 2005).

Es ist bekannt, dass eine frühzeitige exogene P4-Supplementation die periphere P4-Kon-

zentration steigern kann (COLAZO et al. 2013; LARSON et al. 2007; WALTON et al. 1990)

und dass sie die Follikelentwicklung beeinflusst (ADAMS et al. 1992), sowie dass die erhöhte

LH-Pulsfrequenz infolge einer P4-Supplementation die Dominanzphase des Follikels (von

zwei bis sieben Tagen auf 14 Tage) verlängert und diese Verlängerung die Fertilität der

Oozyte beeinflusst (DISKIN et al. 2002). Ferner wird vermutet, dass das in der frühen

Lutealphase exogen verabreichte P4 zu einer negativen Rückkopplung der lutealen

Einleitung

2

Entwicklung führt (MUNRO und MOORE 1985; GINTHER 1970a; WOODY et al. 1967;

LOY et al. 1959) und die Funktion des CL hemmt (STEVENSON und MEE 1991; HARMS

und MALVEN 1969).

Seit Jahren stellt in der Tiermedizin die Farb-Doppler-Sonographie eine häufig eingesetzte,

nicht invasive Methode zur Untersuchung der Durchblutung u.a. des inneren Genitales dar

(HERZOG und BOLLWEIN 2007). Es ist denkbar, über die dopplersonographische

Erfassung der genitalen Perfusion das Abortrisiko einzuschätzen (BOLLWEIN et al. 2002a).

Ziel dieser Dissertation war es, mittels Farb-Doppler-Sonographie den Einfluss von

intravaginal verabreichtem Progesteron während der frühen Phase des Zyklus (Tag 1 bis 8

post ovulationem) auf die uterine Perfusion, das CL und damit auf das Zyklusgeschehen

sowie die Entwicklung des präovulatorischen DF zu untersuchen. Da die Durchblutung des

inneren Genitales Auswirkungen auf die Fertilität hat, können die erhaltenen Ergebnisse

Hinweise auf fertilitätsrelevante Effekte der exogenen P4-Supplementation bei Kühen liefern.

Dafür sollten sowohl die Größe und die Durchblutung des jeweiligen CL und des DF, als auch

der beiden Arteriae uterinae über den gesamten Brunstzyklus erfasst werden. Ferner wurde

durch transvaginale Corpus luteum-Biopsie in vivo an den Tagen 8 und 15 luteales Gewebe

gewonnen. Dieses konnte zur Bestimmung der Genexpression verschiedener

Schlüsselenzyme im lutealen Gewebe untersucht werden, um Rückschlüsse zu ziehen, ob und

in welchem Ausmaß exogenes P4 Einfluss auf die Entwicklung des Gelbkörpers nimmt.

Literatur

3

2 Literatur

2.1 Progesteron

Progesteron (P4) ist ein Steroidhormon bestehend aus 21 Kohlenstoffatomen. Ausgehend von

Cholesterol stellt es eine Zwischenstufe in der Biosynthese der Androgene, Östrogene und

Kortikosteroide dar.

2.1.1 Endogenes Progesteron

Neben der Placenta, die für die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit ausreichende Mengen an

P4 beim Rind nur zwischen dem 180. und 250. Graviditätstag produziert (VON

ENGELHARDT 2010; MEINECKE 2005a; GRUNERT 1999), wird P4 hauptsächlich im

Corpus luteum (CL) synthetisiert und sezerniert (GRUNERT 1999). Die P4-Sekretion stellt

die primäre Aufgabe des CLs dar (NISWENDER et al. 2000). Nach der Ovulation entwickelt

sich das CL aus den restlichen follikulären Theka- und Granulosazellen, wobei das

Luteinisierende Hormon (LH) einen entscheidenden Beitrag für die Entwicklung und

Funktion des CLs, welches überwiegend aus zwei steroidogenen Zelltypen, den großen und

kleinen Luteinzellen besteht, leistet. Die großen Luteinzellen bilden sich aus den Granulosa-

und die kleinen aus den Thekazellen (HOFFMANN 1994). Über die direkte Aktivierung der

Proteinkinase A, einem sekundären Botenstoff, stimuliert LH über LH-spezifische Rezeptoren

die P4-Sekretion in den kleinen Luteinzellen. Die große Ansammlung von glattem

endoplasmatischem Retikulum und die Dichte der Mitochondrien der großen Luteinzellen

charakterisieren sie als den Ort, der mehr P4 produziert als die kleinen Luteinzellen (FIELDS

und FIELDS 1996). Weiterhin enthalten die großen Luteinzellen Rezeptoren für

Prostaglandin F2α (PGF2α) und scheinen somit eine entscheidende Rolle bei der Luteolyse zu

spielen (NISWENDER et al. 2000). Neben diesen beiden lutealen Zelltypen spielen

Fibroblasten, verschiedene Arten von Immunzellen und Endothelzellen eine wichtige Rolle in

der Funktion des CL, haben jedoch keine direkte Bedeutung in der P4-Synthese (FIELDS und

FIELDS 1996). Über die Endothelzellen wird das sezernierte P4 in die Zirkulation gebracht.

Literatur

4

2.1.2 Exogenes Progesteron

Die exogene Applikation von P4 wird bereits lange in der Praxis während des Zyklus und der

Trächtigkeit des Rindes eingesetzt und ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (LARSON

et al. 2007; VILLARROEL et al. 2004; STEVENSON und MEE 1991; VAN CLEEF 1991;

ROBINSON et al. 1989; WOODY und GINTHER 1968; WOODY et al. 1967; SLACK 1963;

RAY et al. 1961; ZIMBELMAN et al. 1959). In den verschiedenen Studien unterscheidet sich

die Supplementation dieses Hormons in der Methodik, der Konzentration, im Zeitpunkt und

in der Dauer der Administration. Es ergaben sich durch exogene P4-Supplementation

unterschiedliche Effekte auf die Trächtigkeit (LARSON et al. 2007; MANN et al. 2006;

ROBINSON et al. 1989; SLACK 1963; JOHNSON 1958), auf die Zykluslänge (GARRETT

et al. 1988a; SREENAN und MULVEHILL 1977; WOODY et al. 1967), auf die Funktion des

CL (SREENAN und MULVEHILL 1977; WOODY und GINTHER 1968; ZIMBELMAN et

al. 1959) und auf die Entwicklung des DF (SAWYER et al. 1995; ADAMS et al. 1992;

SIROIS und FORTUNE 1990).

2.1.2.1 Einfluss von exogenem P4 auf die periphere P4-Konzentration

Während des Proöstrus und des Östrus sind die P4-Konzentrationen beim Rind niedrig. Ihre

basalen Werte liegen unter 1 ng/ml (DIAZ et al. 1986; HENRICKS et al. 1970). Nach der

Ovulation steigt die P4-Konzentration mit der Ausbildung eines funktionsfähigen CL im

Metöstrus und im Diöstrus im Blut an (BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998;

SCHALLENBERGER et al. 1985; TERBLANCHE und LABUSCHAGNE 1981;

HENRICKS et al. 1970). Die höchsten P4-SPiegel werden zwischen den Tagen 11 und 16

erreicht (DIAZ et al. 1986).

SREENAN et al. (1977) behandelten Färsen 10 Tage mit P4-imprägnierten Vaginalzäpfchen

(Schwämme), die an Tag 2 (Tag 1 = Ovulation) eingesetzt wurden. Sie beobachteten einen

steilen Konzentrationsanstieg des Hormons im Blut innerhalb von 24h nach der Insertion,

während sich der P4-Spiegel in der Kontrollgruppe zwischen Tag 2 und Tag 3 nicht

veränderte. Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigten die supplementierten Tiere erhöhte

Literatur

5

periphere P4-Konzentrationen während der gesamten Behandlungsdauer. Der P4-Peak

manifestierte sich bei den behandelten Tieren am Tag 8 des Zyklus. Bereits in einer früheren

Studie konnten SREENAN und GOSLING (1977) einen positiven Effekt dieser

Supplementation auf die P4-Konzentration im Plasma während einer Behandlungsdauer von 4

Tagen beobachten. Auch hier zeigte sich, dass die P4-Supplementation in dem Zeitraum von

Tag 3 bis 6 des Zyklus, also in der frühlutealen Phase in einer signifikant höheren P4-

Konzentration (3,3 ± 0,5 ng/ml versus 0,3 ± 0,5 ng/ml) resultierte. Eine Steigerung zeigte

sich ebenfalls bei einem Applikationszeitraum von Tag 10 bis 13. Die Differenz zwischen

beiden Versuchsgruppen war jedoch nicht signifikant (8,0 ± 0,7 ng/ml versus 6,6 ± 1,0 ng/ml)

(SREENAN und MULVEHILL 1977).

Einen schnellen Anstieg der P4-Konzentration in der Milch konnten LARSON et al. (2007)

ebenfalls durch eine P4-Substitution in der frühen Phase des Zyklus beobachten. Laktierenden

besamten Kühen wurde von Tag 3 bis 9 (Tag 1 = Ovulation) eine CIDR®-Spange eingesetzt.

Die P4-Konzentration wurde an Tag 2, 3 und 21 bestimmt. Zwölf Stunden nach dem

Einsetzen der Spange wurde eine signifikante Erhöhung der P4-Konzentration in der Milch

bei CIDR®-Kühen um 0,7 ng/ml (1,13 ng/ml für CIDR®-Kühe versus 0,43 ng/ml für

Kontrolltiere) nachgewiesen. Dieser Unterschied zeigte sich vor Tag 21 gleichermaßen bei

graviden und nicht graviden Kühen. Die Gravidität wurde per transrektaler Palpation nach

Tag 39 diagnostisiert.

SHAHAM-ALBALANCY et al. (2001) führten diöstrischen Kühen mit intaktem CL und

Kühen ohne funktionelles CL über CIDR®-Spangen exogenes P4 zu. Jedes Tier beider

Versuchsgruppen erhielt am Tag 6 des Zyklus je zwei CIDR®-Spangen (1,2 g), die am Tag 9

durch zwei neue, die für drei weitere Tage intravaginal blieben, ersetzt wurden. Die Autoren

ermittelten dabei einen signifikanten Unterschied in der peripheren P4-Konzentration

zwischen beiden Gruppen. Diöstrische Tiere mit intaktem CL wiesen während des

behandelten Brunstzyklus höhere P4-Konzentrationen im Plasma auf als die Tiere ohne

funktionelles CL. Der P4-Spiegel bei diesen Tieren war während der Behandlung hoch und

stieg kontinuierlich an, während der P4-Spiegel der Tiere ohne funktionelles CL in dem

Supplementationszeitraum niedrig war und auch konstant niedrig blieb. Die

Literatur

6

durchschnittlichen P4-Konzentrationen im Plasma der beiden Gruppen lagen am Tag 12 des

Zyklus bei 5,8 ng/ml für Tiere mit einem funktionsfähigen CL bzw. 1,4 ng/ml für Tiere ohne

funktionsfähiges CL.

Einen ähnlichen Unterschied in der peripheren P4-Konzentration zwischen P4- und

Kontrollgruppe unter dem Einfluss von exogenem P4 stellten ADAMS et al. (1992) fest. Die

Autoren injizierten Färsen täglich in Distelöl aufgelöstes P4 s.c. von Tag 1 bis 6 (Tag 1 =

Ovulation) in abnehmender Dosierung (150, 150, 100, 75, 50 und 25 mg/Tag). Die täglichen

Dosen wurden auf zwei Injektionen, die alle zwölf Stunden verabreicht wurden, aufgeteilt.

Kontrolltiere erhielten nach dem gleichen Prozedere ein äquivalentes Volumen (0,5 - 1,5 ml)

von Distelöl s.c.. Die P4-Tiere zeigten bereits an Tag 2 einen erhöhten P4-Spiegel. Dieser

war und blieb von Tag 3 an dem P4-Spiegel in der mittleren lutealen Phase (Tage 10-11) bei

den Kontrolltieren äquivalent. Auch in dieser Studie konnten die Autoren nachweisen, dass

eine in der frühlutealen Phase durchgeführte P4-Applikation die systemische P4-

Konzentration steigerte.

Zu ähnlichen Ergebnissen kamen MANN und LAMMING (1995), die in ihrem Experiment

eine positive Korrelation zwischen der Menge des verabreichten Hormons und der peripheren

P4-Konzentration beobachteten. Kühe, die eine höhere P4-Dosis erhielten, wiesen im

gleichen Zeitraum höhere P4-Konzentrationen im Plasma auf als Kühe, welche ohne oder mit

einer geringeren Dosis behandelt wurden. Die Autoren injizierten ovarektomierten Kühen von

zwei Versuchsgruppen intramuskulär (i.m.) von Tag 1 bis 16 zweimal täglich exogenes P4 in

steigender Dosis. Die hohen Dosierungen waren 0, 40, 80, 160, 240, 320 und von Tag 8 an

erhielt jede Kuh täglich 400 mg P4. Die niedrigen Dosierungen betrugen 0, 40, 80 und von

Tag 9 an wurden jeder Kuh 160 mg P4 pro Tag verabreicht. Diese Dosis wurde in zwei

Injektionen aufgeteilt und verabreicht. Die P4-Konzentrationen im Plasma waren in beiden

Gruppen bis zum Tag 6 gering und unterschieden sich nicht voneinander. Von Tag 7 an lagen

jedoch die Konzentrationen in der Gruppe mit hoher Dosis des supplementierten P4

signifikant höher als die Konzentrationen der mit einer geringeren Dosis behandelten Gruppe.

Zwischen den Tagen 10 und 17 maßen die P4-Konzentrationen im Plasma 12,4 ± 0,8 ng/ml

Literatur

7

bei der mit hohen und 6,0 ± 0,4 ng/ml bei der mit niedrigen P4- Dosierungen

supplementierten Gruppe.

In der Studie von STEVENSON und MEE (1991) wiesen besamte Kühe, welche von Tag 5

bis 13 eine PRID®-Spirale erhielten, am Tag 13 keinen P4-Konzentrationsunterschied im

Serum im Vergleich zu Kontrolltieren auf. Die Supplementierung von Tag 13 bis 21 führte

jedoch zu einer höheren P4-Konzentration am Tag 21 im Serum ungeachtet des

Graviditätsstatus als die Supplementation von Tag 5 bis 13. Die Autoren vermuteten, dass das

in der früheren Lutealphase substituierte P4 die Entwicklung des CL beeinträchtigte und

damit die endogene P4-Synthese inhibierte.

2.1.2.2 Einfluss von exogenem P4 auf die luteale P4-Synthese

In der Literatur existieren widersprüchliche Aussagen über eine mögliche Beeinflussung der

lutealen Syntheseleistung durch exogenes P4.

MANN et al. (2001) überprüften die Hypothese, dass die endogene P4-Synthese durch die P4-

Supplementation negativ beeinflusst wird. Um mögliche Beeinträchtigungen der endogenen

P4-Sekretion zu minimieren, verwendeten sie eine spezielle CIDR®-Spange, welche nur 50 %

des regulären P4-Gehaltes (z.B. 0,95 g statt 1,9 g pro Spange) enthielt. Diese wurde wenig

fertilen Kühen, welche nach der ersten Besamung nicht aufgenommen hatten, intravaginal für

die Dauer von sieben Tagen (Tag 10 bis 17 des Zyklus) eingesetzt. Während dieser Periode

lagen die durchschnittlichen P4-Konzentrationen im Plasma der CIDR®- Tiere bei 10,3 ± 0,8

ng/ml und der Kontrolltiere bei 7,4 ± 0,6 ng/ml. Dieser Wert von 10,3 ± 0,8 ng/ml lag

innerhalb des zu erwartenden physiologischen Bereiches. Am Tag 18, einen Tag nach der

CIDR®-Entfernung, fiel die Plasma-P4-Konzentration der CIDR®- Tiere auf den Wert der

Kontrolltiere zurück. Diese Ergebnisse ließen die Autoren zu der Schlussfolgerung kommen,

dass das während der mittleren Lutealphase substituierte P4 die endogene P4-Produktion und

-Sekretion nicht beeinträchtigte (MANN et al. 2001). Im Einklang mit den oben genannten

Ergebnissen standen die von SREENAN und MULVEHILL (1977) gemachten

Beobachtungen. In ihrem Experiment wurden P4-imprägnierte Vaginalzäpfchen bei Färsen in

Literatur

8

der frühen Phase (Tag 3) oder in der mittleren Phase (Tag 13) des Zyklus (Tag 1 = Ovulation)

eingesetzt und blieben dort für zehn Tage. Eine höhere P4-Konzentration konnte während der

gesamten Behandlungsdauer bei Tieren, denen am Tag 3 P4 supplementiert wurde,

nachgewiesen werden. Die Autoren konnten keinen Effekt des während der frühen Phase des

Zyklus zugeführten P4 auf die endogene P4-Sekretion aus dem CL beobachten. Bei den

Tieren, die am Tag 13 des Zyklus P4-Zäpfchen bekamen, war ein Abfall der peripheren P4-

Konzentration nach Tag 18 des Zyklus zu beobachten. Dies deutet auf eine physiologische

Regression des CLs hin. Diese Beobachtungen stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen

von LOY et al. (1960). Die Autoren berichteten über eine Reduktion der Anzahl funktioneller

Luteinzellen und damit auch der P4-Konzentration durch eine einmalige subkutane P4-

Injektion von 2 mg pro kg Köpergewicht in der frühen Phase (Tag 1 und Tag 5) des Zyklus

bei Färsen.

ROBINSON et al. (1989) kamen in ihrer Studie bezüglich der Auswirkung der exogenen P4-

Supplementation zu unterschiedlichen Ergebnissen. Die Differenz war abhängig vom

Zeitpunkt des Supplementationsbeginns. So zeigten Kühe, welche in der frühen Lutealphase

(Tag 6) eine PRID®-Spirale (1,55 g P4) erhielten, an den Tagen 7 bis 9 höhere P4-

Konzentrationen als Kontrolltiere. Dagegen führte die am Tag 11, also in der mittleren

Lutealphase, eingesetzte PRID®-Spirale mit der gleichen P4-Kozentration lediglich am Tag

nach der Insertion zu einem P4-Anstieg. Weiterhin gaben die Autoren an, dass in beiden

Experimenten die P4-supplementierten Tiere tendenziell höhere P4-Konzentrationen während

der siebentägigen Behandlungsdauer aufwiesen als die Kontrolltiere. Über einen Vergleich

der P4-Spiegel zwischen ovarektomierten Tieren unter PRID®-Behandlung und

ovarektomierten Tieren ohne Behandlung konnten sie die freigesetzte P4-Menge bestimmen

und vermuteten infolge dessen, dass die endogene P4-Synthese bei supplementierten Kühen

durch exogenes P4 an den Tagen 11 bis 18 signifikant reduziert wurde , nachdem sie die

exogen zugeführte P4-Menge von der gesamten P4-Konzentration subtrahiert hatten. Im

Einklang mit den Ergebnissen von SREENAN und MULVEHILL (1977) konnten die

Autoren nachweisen, dass die P4-Substitution während der frühen Phase des Zyklus (Tag 6

bis 13) keinen Einfluss auf die P4-Freisetzung aus dem CL hat.

Literatur

9

2.1.2.3 Einfluss von exogenem P4 auf die Gravidität

Progesteron (P4) gilt als das entscheidende Hormon für die Aufrechterhaltung der Gravidität.

Zahlreiche Studien haben die P4-Konzentrationen im Blut mit der Trächtigkeitsrate und mit

dem Wachstum der Embryonen in Verbindung gebracht. Niedrige systemische P4-Konzen-

trationen können die embryonale Entwicklung während der Frühgravidität (FORDE et al.

2011; LONERGAN 2011; FOLMAN et al. 1973) beeinträchtigen oder Trächtigkeitsverluste

zur Folge haben (MANN und LAMMING 1999). Höhere P4-Werte stehen dagegen im

Zusammenhang mit gesteigertem embryonalem Wachstum und damit erhöhter Interferon-τ-

Produktion sowie mit verbesserten Trächtigkeitsraten (FORDE et al. 2011; MANN et al.

2006; MANN und LAMMING 2001; MANN et al. 2001; MANN und LAMMING 1999).

Dementsprechend kann ein früher und höherer Anstieg der P4-Konzentration in den ersten

drei bis vier Tagen post inseminationem (p.i.) eine wichtige Voraussetzung für die

Etablierung der Trächtigkeit darstellen (LONERGAN 2011; LUTTGENAU et al. 2011b;

BELTMAN et al. 2009b). Eine P4-Supplementation in der frühen Phase (Tag 1 bis 7 p.i.) der

Gravidität führte bei einigen Studien zur Steigerung der Trächtigkeitsrate (FORRO et al.

2012; LARSON et al. 2007; MANN und LAMMING 1999; ROBINSON et al. 1989;

GARRETT et al. 1988a), während andere einen solchen Effekt dementieren (VAN CLEEFF

et al. 1996; SLACK 1963). Eine Übersicht über die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen

ist in Tab. 1 dargestellt.

Literatur

10

Tab. 1:

Zusammenfassung verschiedener Studien über den Einfluss einer Substitution exogenen

Progesterons auf die Trächtigkeit. Dargestellt sind Tiergruppen, Methodik der P4-Supple-

mentation sowie der Einfluss auf die Trächtigkeitsrate.

Quelle Tiere Methodik Einfluss auf Trächtigkeitsrate

WILTBANK et al. 1956

Nicht laktierende Tiere unterschied-licher Rassen (n = 136)

P4 = 50 mg/Tag bzw. P4 = 200 mg/Tag 31 Tage (s.c., Beginn am Tag 2 p.i.)

↑11,1% (44,4% vs. 33,3%) ↑12,9% (38,7% vs. 25,8%)

JOHNSON et al. 1958

Jersey- und Holstein-Färsen (n = 139)

P4 (100 mg/Tag, i.m.) (Tag 2, 3, 4, 6 und 9 p.i.)

↑18,3% (72,2% vs. 53,9%)

SLACK et al. 1963

Holstein (n = 594) (H)- bzw. Guernsey (n = 282) (G)-Kühe

P4 (500mg /Tag, i.m.) (Tag 0, 2, 10 oder 14 p.i.)

↓20,7% (H) (31,4% vs. 52,1%) bzw. ↓13,5% (G) (25,0% vs. 38,5%) (Tag 0) ↓3,1% (H) (49,0% vs. 52,1%) bzw. ↓15% (23,5% vs. 38,5%) (G) (Tag 2) kein Einfluss (Tag 10 und 14)

SREENAN,J.M. 1975

Hereford-Kreuzung-Färsen (n = 273)

P4-imprägnierte Schwämme 20 Tage (Verweildauer)

keine signif. Verbesserung

STEVENSON, J.S., M.O. MEE 1991

Lakt. Holsteinkühe (n = 179)

PRID®-Spirale (Tag 5-13 oder Tag 13-20 p.i.)

kein Einfluss bei der ersten Besamung ↑21% (60% vs. 39%) bei der zweiten Besamung

Literatur

11

Quelle Tiere Methodik Einfluss auf Trächtigkeitsrate

VAN CLEEF et al. 1991 VAN CLEEF et al. 1996

Färsen (n = 314) Färsen (n = 396)

CIDR®-Spange (1,9 g) (Tag 7-13 p.i.) CIDR®-Spange (1,9 g) (Tag 1-8 oder 2-9 p.i.)

↑4,3% (57,9% vs. 53,6%) ↓28,2% (18,2% vs. 46,4%)

VILLARROEL, A. et al. 2004

Lakt. Holsteinkühe – Repeat breeder (n = 291)

PRID®-Spirale (Tag 5-19 p.i.)

↑2,6% (36,4% vs. 33,8%)

LARSON et al. 2007 Lakt. Holsteinkühe (n = 130)

CIDR®-Spange (Tag 3,5-10 p.i.)

↑13% (48% vs. 35%) bzw. ↑18% (51% vs. 33%) in der 1. bzw. 2. Laktation

ARNDT, W.J. et al. 2009

Lakt. Holsteinkühe (n = 84) und Färsen (n = 16)

CIDR®-Spange

↓3,9% (29,1% vs. 33%)

BELTMAN, M.E. et al. 2009

Kreuzungs-fleischrassen (n = 197)

CIDR®-Spange keine signif. Verbesserung

FORRO, A. et al. 2012

Lakt. Holsteinkühe (n = 398)

PRID®-Spirale (Tag 4-18 p.i.)

↑5,3% (44,4% vs. 38,1%) (signif. Anstieg nur bei BCS ≥ 3,25)

COLAZO, M.G. et al. 2013

Lakt. Milchkühe (n = 223)

PRID®-Spirale (Tag 4,5-11,5 p.i.)

↑16,2% (41,3% vs. 25,1%) (bei Spontan-ovulation)

Literatur

12

In verschiedenen Studien konnte durch regelmäßige P4-Injektionen eine Steigerung der

Konzeptions- bzw. Trächtigkeitsrate beobachtet werden. WILTBANK et al. (1956)

applizierten nicht laktierenden Kühen verschiedener Rassen 50 mg P4 s.c. täglich von Tag 2

p.i. bis zur Schlachtung an Tag 34. Diese Tiere galten als Repeat-Breeder, da sie mehr als

dreimal erfolglos besamt worden waren. Die Autoren erzielten eine Verbesserung der

Trächtigkeitsrate um 11,1 % (44,4 % vs. 33,3 %; Tab. 1). Eine Steigerung um 12,9 % (38,7 %

vs. 25,8 %) wurde bei einer Dosis von 200 mg/Tag erzielt. Ähnliche Ergebnisse

veröffentlichten JOHNSON et al. (1958). Sie injizierten 100 mg P4 i.m. an den Tagen 2, 3, 4,

6, und 9 p.i. und konnten eine Trächtigkeitsrate bei den behandelten Milchkühen von 70 %

erzielen, während die nicht behandelten Tiere eine Trächtigkeitsrate von 42 % aufwiesen. Die

Steigerung in der Trächtigkeitsrate erklärten die Verfasser damit, dass die P4-Administration

die Sekretion der sogenannten uterinen Milch anregt, welche die Nidation unterstützen und

somit die Inzidenz der Embryomortalität reduzieren kann. Dass das Wachstum der

Embryonen durch exogen verabreichtes P4 positiv beeinflusst wird, konnten GARRETT et al.

(1988b) in ihrer Studie zeigen. In ihrem Experiment wurden Kühen in der frühen Phase (Tag

1 bis 4 p.i.) der Trächtigkeit täglich 100 mg P4 injiziert. Sie stellten zum einen fest, dass die

Embryonen, die an Tag 14 der Gravidität den supplementierten Tieren entnommen wurden,

weiter in ihrer Entwicklung im Vergleich zu Embryonen der Kontrolltiere waren. Zum

anderen konnten die Autoren durch Kultivierung embryonaler und endometrialer Explantate

aus den Uterinlavagen an Tag 5 und Tag 14 nachweisen, dass die mit der Aufrechterhaltung

der Trächtigkeit assoziierten Polypeptide erhöht waren. Sie kamen zu der Ansicht, dass der

P4-Anstieg durch eine P4-Supplementation Veränderungen in der uterinen Sekretion

hervorrief, welche ihrerseits direkt oder indirekt das Wachstum und die Entwicklung des

Embryos stimulierte. Weiterhin regte exogenes P4 die Sekretion verschiedener Polypeptide

des uterinen Endometriums an, welche Entwicklung und Wachstum frühzeitig in einer Weise,

wie es bei älteren Embryonen zu beobachten ist, begünstigten. Des Weiteren konnten sie

aufgrund der größeren Konzeptuslänge am Tag 14 der Gravidität nachweisen, dass

Embryonen P4-substituierter Kühe länger überleben konnten und dass sie morphologisch

weiter entwickelt waren als die der Kontrollkühe. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass

exogenes P4 die Synthese und Freisetzung der Polypeptide aus dem Endometrium moduliert

und somit eine wichtige Rolle in der maternalen Regulation von Embryonenwachstum und -

Literatur

13

entwicklung in der Frühträchtigkeit indiziert. Dieser indirekte, positive Einfluss der P4-

Supplementation auf die frühembryonale Entwicklung und somit eine Verbesserung der

Trächtigkeitsrate konnte ebenfalls in weiteren Studien (LARSON et al. 2007; LOPEZ-

GATIUS et al. 2004; RHODES et al. 2001) beobachtet werden. Die Wirkung der exogenen

P4-Substitution trat besonders deutlich bei Tieren auf, die zuvor suboptimale P4-

Konzentrationen aufwiesen.

MANN et al. (1998) berichteten, dass vor allem der Zeitpunkt des Behandlungsbeginns eine

wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Trächtigkeit spielte. So führte die Applikation

von exogenem P4 an den Tagen 5 bis 9 sowohl zu einer Verbesserung der embryonalen

Entwicklung als auch zu einer signifikanten Steigerung der Interferon-τ-Produktion. Zudem

beobachteten die Autoren einen engen Zusammenhang zwischen Embryonengröße und

uteriner Interferon-τ-Konzentration. Im Gegensatz hierzu zeigte eine P4-Administration an

den Tagen 12 bis 16 keine solche Wirkung. Anhand der Analyse der Daten mehrerer Studien,

die sich mit der P4-Supplementation beschäftigten, beschrieben MANN et al. (1999) einen

Anstieg der Trächtigkeitsrate um 10 %, wenn die P4-Behandlung vor Tag 6 p.i. stattfand.

Ferner konnten MANN und LAMMING (1999) in einem Vergleich einiger Studien eine

durchschnittliche Erhöhung der Trächtigkeitsrate um 19 % feststellen, wenn die

durchschnittliche Trächtigkeitsrate der Herde unter 50 % lag. Lag dagegen die

Trächtigkeitsrate über 50 %, dann hatte die P4-Zufuhr keinen Effekt auf die Fertilität

(MANN und LAMMING 1999). Zu guter Letzt postulierten die Verfasser, dass die P4-

Konzentration ein wichtiger Determinant für den Ausgang der Trächtigkeit, aber nicht so

wichtig wie der Zeitpunkt des postovulatorischen P4-Anstiegs zu sein scheint.

LARSON et al. (2007), die eine intravaginale P4-Applikation (über CIDR®-Spange) von Tag

4 bis 10 p.i. durchführten, kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Sie beobachteten mit Hilfe dieser

Substitution einen hohen Anstieg der Trächtigkeitsrate bei den behandelten gegenüber den

unbehandelten Tieren. Besonders deutlich zeigte sich diese Steigerung bei den Probanden, die

sich in der ersten und in der zweiten Laktation befanden (von 33 % auf 51 %).

Literatur

14

Übereinstimmend mit den oben erwähnten Beobachtungen von MANN et al. (1999) konnten

MACMILLIAN et al. (1991) bei laktierenden Kühen eine Steigerung der Konzeptionsrate von

65,7 % auf 79,2 % erreichen, obwohl den Tieren exogenes P4 via CIDR®-Spangen erst am

Tag 6 bis 8 p.i. für eine Dauer von sechs oder 12 Tagen supplementiert wurde und trotz der

Tatsache, dass die initiale Trächtigkeitsrate bereits bei über 60 % lag.

ROBINSON et al. (1989) berichten über eine signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um

30 %, nachdem sie laktierenden Kühen mittels PRID®-Spiralen (1,55 g) exogenes P4 an Tag 5

oder an Tag 10 p.i. für sieben Tage verabreicht hatten. Tiere beider supplementierten Gruppen

wiesen dabei eine Trächtigkeitsrate von 60 % auf, während lediglich 30 % der nicht

behandelten Kühe tragend wurden.

FORRO et al. (2012) konnten bei laktierenden Holsteinkühen, die nach der Durchführung

eines OvSynch Programms besamt worden waren, und die mittels PRID®-Spiralen von Tag 4

bis Tag 18 p.i. exogenes P4 erhalten hatten, einen positiven Effekt auf die Trächtigkeitsrate

feststellen. Diese Wirkung war aber nur bei Tieren mit einem BCS ≥ 3,25 zu beobachten.

Im Gegensatz zur letztgenannten Arbeit konnten COLAZO et al. (2013) durch die P4-

Substitution mittels PRID®-Spiralen im Anschluss an eine OvSynch keine positive

Auswirkung auf die Trächtigkeitsrate feststellen. In ihrer Studie führte eine P4-

Supplelmentation von Tag 4 bis 11 p.i. bei Kühen mit einem BCS ≥ 2,75 zu keiner Steigerung

der Trächtigkeitsrate (44,4 % mit PRID® vs. 49,8 % ohne PRID®). Eine Interaktion zwischen

PRID®-Behandlung vor- und nach der Besamung konnten die Autoren ebenfalls nicht

feststellen.

In einer späteren Phase der Trächtigkeit und für eine längere Dauer supplementierten

LOPEZ-GATIUS et al. (2004) hoch laktierenden Kühen P4. Die Autoren setzten PRID®-

Spiralen über einen Zeitraum von 28 Tagen ab Tag 36 bis 42 der Trächtigkeit ein und

erzielten auf diese Weise eine Reduktion des Trächtigkeitsverlusts um 6,7 % (5,3 % bei

PRID®-Tieren versus 12 % bei Kontrolltieren). Daraus schlussfolgerten sie, dass eine

intravaginale P4-Supplementation das Potenzial besitzt, die Inzidenz von

Literatur

15

Trächtigkeitsverlusten auch während der spätembryonalen oder frühfetalen Periode zu

reduzieren.

Im Widerspruch zu den obengenannten Arbeiten hatte die Applikation von exogenem P4 in

einigen anderen Studien keinen Einfluss auf die Trächtigkeitsrate (BELTMAN et al. 2009a;

VILLARROEL et al. 2004; STEVENSON und MEE 1991; VAN CLEEF 1991). VAN

CLEEF et al. (1991) konnten keine signifikante Verbesserung der Konzeptionsrate von

behandelten Tieren (56,2 %) gegenüber der unbehandelten Tiere (55,3 %) beobachten. In

ihrer Studie war Färsen exogenes P4 via CIDR®-Spange (1,9 g) an Tag 7 p.i. substituiert

worden. Diese Spange wurde nach sechs Tagen wieder entfernt. Es zeigte sich, dass einige

Färsen trotz initialer Anzeichen einer Gravidität wieder in Östrus kamen. Die Autoren

vermuteten, dass eine frühembryonale Mortalität bei diesen Tieren stattgefunden hatte. Als

Grund hierfür nahmen sie an, dass eine Störung oder Asynchronizität des maternalen

Uterusmilieus und der Embryonalentwicklung durch den übermäßigen und rapiden Anstieg

der P4-Konzentration auftrat. In einer späteren Studie, in der sie (VAN CLEEFF et al. 1996)

Färsen P4 über eine CIDR®-Spange (1,9 g) in der frühen Phase der Gravidität (Tag 1 oder 2

p.i.) für sieben Tage supplementierten, stellten sie eine Trächtigkeitsrate bei substituierten

Färsen von 18,2 % fest, während die Kontrollfärsen eine Trächtigkeitsrate von 46,4 %

aufwiesen. Die Verfasser schlossen daraus, dass eine P4-Supplementation innerhalb der ersten

beiden Tage nach der Besamung für eine Dauer von sieben Tagen die Fertilität supprimierte.

Das Ergebnis bestätigte die Beobachtungen einer anderen Studie (SLACK 1963), in der von

einem negativen Effekt auf die Trächtigkeitsrate durch exogenes P4 berichtet wurde. In dieser

Studie wurde P4 (500 mg/Tier/Tag i.m.) einmalig an Tag 0, 2, 10 oder 14 p.i. injiziert. Die

Behandlung führte zur Senkung der Konzeptionsrate in unterschiedlicher Ausprägung. Die

P4-Supplementation am Tag der Insemination senkte die Trächtigkeitsrate bei Holstein-

Kühen um 20,7 %, während die Supplementation an Tag 2 p.i. eine Senkung der

Trächtigkeitsrate um 3,1 % zur Folge hatte. Dagegen hatte die P4-Supplementation an den

Tagen 10 und 14 keine Auswirkungen auf die Trächtigkeitsrate (Tab. 1).

Literatur

16

2.1.2.4 Einfluss von exogenem P4 auf das Follikelwachstum

Die ovarielle Follikelentwicklung ist ein dynamischer Prozess. Sie beginnt bereits im

Fetalalter und setzt sich bis zur zyklisch wiederkehrenden Ovulation des dominanten Follikels

oder bis zu Erschöpfung des Eizellenvorrats fort. Während eines Brunstzyklus beim Rind

findet das Wachstum von Follikeln mit einer Größe von 3 - 5 mm oder größer in zwei bis drei

aufeinander folgende Follikelwellen statt (GINTHER et al. 1989; SAVIO et al. 1988; SIROIS

und FORTUNE 1988). Der funktionelle Wachstumsverlauf einer Follikelwelle kann in

Rekrutierung, Selektion, Dominanz und Ovulation oder Atresie eingeteilt werden (IRELAND

1987). Mit Beginn der ersten Follikelwelle eines Zyklus, d.h. am Tag vor der Ovulation, tritt

eine Gruppe von drei bis sechs Follikeln, auch Kohorte genannt, aus dem

Gesamtfollikelvorrat des Ovars in Erscheinung, die weiterwachsen, bis ihr Durchmesser mehr

als 4-5 mm beträgt (GINTHER et al. 1996). Die zweite Follikelwelle beginnt etwa zehn Tage

nach der Ovulation, während die dritte Welle am Tag 16 des Zyklus startet (GINTHER et al.

1996). Der Mechanismus dieser Rekrutierung ist noch unbekannt, aber es ist nachgewiesen,

dass ein Anstieg in der FSH-Konzentration diesen Prozess stimuliert (LUCY et al. 1992).

Einige Tage nach der Rekrutierung beginnt die Selektionsphase, bei der ein Follikel schneller

wächst, während der Rest der Kohorte in der Größe abnimmt (GINTHER et al. 1996; LUCY

et al. 1992; GINTHER et al. 1989; SAVIO et al. 1988). Der größte Follikel wird als

dominanter Follikel (DF) bezeichnet. Beim Rind ist der DF in der Lage, das Wachstum der

anderen Follikel auf dem Ovar zu unterdrücken, indem er durch Östradiol-Produktion ein

negatives Feedback auf die Ausschüttung von FSH hervorruft sowie durch eine verstärkte

Exprimierung der LH-Rezeptoren. Dadurch besitzt der DF nach GINTHER et al. (1997) in

der frühen Entwicklungsphase einen Vorteil gegenüber anderen Follikeln derselben Kohorte.

Da er schneller wächst, erreicht er die Deviationsphase früher als der Rest der Kohorte

(GINTHER et al. 1997). Der DF der ersten Welle kann ovulieren, wenn eine Luteolyse durch

PGF2α an Tag 5 bis 8 des Zyklus eingeleitet wird (KASTELIC et al. 1990). In

unbeeinflussten Zyklen bildet sich der erste DF jedoch zurück und wird durch die neue

Kohorte der zweiten bzw. dritten Welle ersetzt (SAVIO et al. 1988; SIROIS und FORTUNE

1988). Die Lebensspanne der großen Follikel ist unter anderem von der pulsatilen Sekretion

des LHs abhängig (LUCY et al. 1992). Es wird angenommen, dass der DF aufgrund der

Literatur

17

geringen Frequenz der LH-Pulse während der mittleren lutealen Phase der Atresie unterliegt

(SAVIO et al. 1993a; SIROIS und FORTUNE 1990). P4 nimmt somit eine wichtige Stellung

bei der Entwicklung der Follikel ein, da es eine negative Rückkopplung auf die GnRH-Frei-

setzung des Hypothalamus und damit einen hemmenden Effekt auf die Ausschüttung von LH

aus der Hypophyse ausübt. Auf diese Weise beeinflusst P4 über eine Inhibition der GnRH-

Sekretion die Follikelentwicklung in der Lutealphase und verhindert eine Ovulation (AUSTIN

et al. 2002; STOCK und FORTUNE 1993).

In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass exogenes P4 die Ovulation des DF

unterdrückt. So verzögerten SALVIO et al. (1993a) mittels P4-Implantaten die Ovulation bis

zum Zyklustag 18, obwohl sie bereits am Tag 8 post ovulationem mit PGF2α die Luteolyse

induziert hatten. Auch ANDERSON und DAY (1994) konnten durch eine orale P4-

Verabreichung in Abwesenheit eines CL die Ovulation unterdrücken. Erst nach Abbruch der

P4-Zufuhr kam es zu einer Ovulation. In einer früheren Studie von ULBERG et al. (1951)

wurde ebenfalls beobachtet, dass exogenes P4 das Potenzial besitzt, bei Milchrindern Brunst

und Ovulation während der Behandlungsdauer zu unterdrücken. Abhängig von der

Injektionsdosis und dem Zeitpunkt der Behandlung konnte exogenes P4 Einfluss auf das

Follikelwachstum nehmen. Am stärksten trat dies bei einer Injektion von 50 mg P4 pro Tag

zutage. Dennoch konnte bei einigen Tieren während der 13- bis 17-tägigen Supplementation

beginnend an Tag 14 oder Tag 15 des Zyklus eine reduzierte follikuläre Entwicklung

nachgewiesen werden. Die folgende Ovulation fand durchschnittlich fünf Tage nach

Behandlungsende statt. Zudem ovulierte in keinem Fall in dieser Studie der Follikel mit dem

größten Durchmesser. Bereits bei einer Reduzierung der Dosis auf 25 mg pro Tag waren diese

Resultate nicht mehr so deutlich ausgeprägt. Die Injektion von 12,5 mg pro Tag führte zur

Bildung größerer Follikel. Eine tägliche P4-Dosis von weniger als 12,5 mg hatte dagegen

keine Auswirkungen auf die follikuläre Entwicklung. Darüber hinaus musste das Intervall der

P4-Administration vor dem Tag 15 des Zyklus beginnen, damit das exogene P4 einen Einfluss

ausüben kann. Im Gegensatz hierzu zeigte sich in einer weiteren Studie, dass der DF der

ersten Welle unter frühem exogenem P4-Einfluss ein vermindertes Wachstum aufwies

(ADAMS et al. 1992). Im Vergleich zum DF der Kontrollgruppe hatte dieser einen geringeren

Durchmesser (12,7 ± 0.9 mm versus 15,3 ± 0,7 mm). Gemäß den Autoren unterdrückte das in

Literatur

18

der Wachstumsphase von Tag 6 bis Tag 20 verabreichte P4 dosisabhängig (30 mg, 150 mg

oder 300 mg pro Tag) den DF in seiner Entwicklung. In einer weiteren Studie wird von einer

signifikanten Reduktion des follikulären Wachstums berichtet, wenn der größte Follikel zum

Zeitpunkt der P4-Behandlung einen Durchmesser von mehr als 9 mm aufwies (GINTHER et

al. 2001). Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 7 mm zum Zeitpunkt des

Behandlungsbeginns zeigten dagegen keine Beeinträchtigung in ihrem Wachstum. Im

Widerspruch zu diesen Ergebnissen konnten AUSTIN et al. (2002) unter dem Einfluss

exogenen P4s keine Veränderung des Follikelwachstums aus der ersten Welle beobachten.

Neben der Hemmung des Follikelwachstums verhindert exogenes P4 im Östrus den

vorübergehenden Anstieg der LH-Konzentration, die gemäß GINTHER et al. (2001) die

Deviation der Follikel bei Färsen begleitet, und reduziert zudem die Frequenz der LH-Pulse

(AUSTIN et al. 2002). Die verminderten LH-Konzentrationen sind mit einem reduzierten

Wachstum des größten Follikels assoziiert, beeinflussen jedoch nicht die Entwicklung und

Rückbildung des nächstgrößeren Follikels. Bei anöstrischen Kühen war die exogene P4-

Supplementation mit einem vorübergehend initialen Rückgang sowohl der Frequenz der LH-

Pulse als auch der mittleren LH-Konzentrationen am Tag nach der Insertion der CIDR®-

Spange assoziiert. Die beiden Parameter stiegen jedoch nach Tag 4 der Behandlung wieder zu

den vor der Substitution gemessenen Ausgangswerten an (NATION et al. 2000). Bei Kühen

mit zystischen Ovarfollikeln reduzierte exogenes P4 die abnorm hohen LH-Pulse (CALDER

et al. 1999). Dies führte zu Rückbildung der zystischen Ovarfollikel, so dass sich daraufhin

ein neuer dominanter Follikel heranbilden und somit nach dem Ende der Supplementation

eine Ovulation stattfinden konnte (LUCY et al. 2004; CALDER et al. 1999).

2.1.2.5 Einfluss von exogenem P4 auf die Zykluslänge

Ergebnisse diverser Studien zeigten, dass exogenes P4 die Lebensspanne des CL und damit

die Zykluslänge beeinflusst (GARRETT et al. 1988a; SREENAN und MULVEHILL 1977;

HARMS und MALVEN 1969; WOODY et al. 1967; LOY et al. 1960). So konnten LOY et al.

(1960) einen zeitabhängigen Einfluss exogenen P4s auf die luteale Entwicklung und auf die

Zykluslänge feststellen. Eine am Tag 1 (Tag 1 = Ovulation) durchgeführte Einzelinjektion

Literatur

19

von 2 mg P4 pro kg Körpergewicht hatte einen negativen Effekt auf das luteale Gewicht und

auf die Funktion der am Tag 14 des Zyklus extrahierten Luteinzellen, während das am Tag 5

supplementierte P4 keine derartigen Veränderungen hervorrief. Auch WODDY et al. (1967)

beobachteten nach zehntägiger s.c. Applikation von 100 mg P4, beginnend am Tag des

Östrus, eine Verkürzung der Zyklusdauer von 20,7 Tagen auf 16,7 Tage. Allerdings kam es in

einer weiteren Studie (WOODY and GINTHER 1968) zu der Einschränkung, dass diese

Fähigkeit des exogenen P4 nur bei intaktem Uterushorn der ipsilateralen Seite zum CL

auftrat. Das Fehlen (z.B. einseitige Hysterektomie) des ipsilateralen Hornes unterdrückte

weitestgehend diese Wirkung. Fehlte dagegen das Uterushorn auf der kontralateralen Seite, so

blieb dieser verkürzende Einfluss bestehen. Die Autoren vermuteten, dass die Fähigkeit des

exogenen P4, die CL-Regression zu beeinflussen, von einer direkten Verbindung des

ovulierenden Ovars zum uterinen Horn abhängig und somit vom Uterus vermittelt ist. Zudem

übte das exogene P4 scheinbar eine größere reduzierende Wirkung auf die Zykluslänge aus,

wenn die Injektionen beginnend mit dem Östrus verabreicht wurden als eine Applikation z.B.

zwei Tage später. Die Fähigkeit des exogenen P4, die Zykluslänge zu verkürzen, konnten

HARMS und MALVEN (1969) ebenfalls in ihrer Studie nachweisen. So berichteten sie von

einer maximalen Effektivität der P4-Substitution von 100 mg/Tag, wenn die i.m. Injektion

bereits am Tag 1 (Tag 1 = Ovulation) des Zyklus verabreicht und bis zum Tag 3 fortgeführt

wurde. Wurde die Behandlung erst nach Tag 2 angewandt, musste sie über Tag 3 des Zyklus

hinaus fortgesetzt werden, um einen Einfluss auf die Zykluslänge auszuüben. Die Autoren

machten jedoch keine Angabe darüber, wie lang die P4-Behandlung fortzusetzen ist.

Übereinstimmend mit den Ergebnissen von LOY et al. (1960) stellten sie eine Verminderung

des lutealen Gewichtes durch die P4-Zufuhr von Tag 2 bis 6 fest. Jedoch konnten sie die von

LOY et al. (1960) beobachtete Verminderung der P4-Konzentration in CLs von Tag 14 nicht

bestätigen. Sie vermuteten, dass der Grund für diese Diskrepanz im Alter des CL zum

Zeitpunkt der Gewebeentnahme liegen könnte, da die Lutektomie in ihrer Studie bereits am

Tag 8 stattfand. Da andere supplementierte Färsen am Tag 15 nach der P4-Behandlung in

Brunst kamen, ist zu vermuten, dass sich eine Abnahme des P4-Spiegels in den CLs hätte

gezeigt haben, wenn sie am Tag 14 entnommen worden wären (HARMS und MALVEN

1969).

Literatur

20

Wie WOODY et al. (1967) konnten GARRETT et al. (1988a) eine Zyklusverkürzung um

mehr als vier Tage (21,6 Tage bei Kontrolltieren versus 16,7 Tage bei P4-Tieren) durch

exogenes P4 beobachten. Sie verabreichten zyklischen Rindern 100 mg P4 i.m. pro Tier und

Tag an den Tagen 1, 2, 3 und 4 des Zyklus. Neben einer Senkung der peripheren Plasma-P4-

Konzentration stellten die Autoren einen Anstieg des Prostaglandins fest. Sie folgerten

daraus, dass exogenes P4 einen vorzeitigen Abschluss der endometrialen Entwicklung

bewirke. Dies führe zu einer frühzeitigen Freisetzung des PGF2α, das eine Luteolyse einleite

und den Diöstrus bei den Kühen verkürze.

2.2 Uteriner Blutfluss

Die uterine Perfusion ändert sich nicht nur während der Gravidität, sondern auch während des

Zyklus. Endotheliale vaskuläre Veränderungen während des Zyklus sind teilweise auf die

Einflüsse der Steroidhormone zurückzuführen. Der uterine Blutfluss wurde in verschiedenen

Studien über chirurgisch implantierte Blutflusssonden oder über nicht invasive Methoden

bestimmt (BOLLWEIN et al. 2002a; BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998;

BOLLWEIN et al. 1998; WAITE et al. 1990; FORD et al. 1979). BOLLWEIN et al. (2002c)

etablierten mittels der transrektalen Farbdopplersonographie erstmalig die nicht invasive

Methode zur Untersuchung der uterinen Blutgefäße. Damit kann die uterine Perfusion ohne

chirurgische Eingriffe über einen längeren Zeitraum an denselben Tieren verfolgt werden. Mit

Hilfe dieser Methode konnte unter anderem gezeigt werden, dass neben dem Zyklusstand

auch der Reproduktionsstatus (z.B. Gravidität) die uterine Perfusion beeinflusst (BOLLWEIN

et al. 2002a; BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998; BOLLWEIN et al. 1998;

WAITE et al. 1990; FORD et al. 1979).

BOLLWEIN et al. (2000) untersuchten die Veränderungen des Resistance Index (RI) und der

mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV = Time Average Maximum Velocity) während des

Zyklus. Dabei galten ein niedriger RI und eine hohe TAMV als Indikatoren für eine erhöhte

uterine Perfusion. Der höchste RI und die niedrigste TAMV waren am Tag 1 (Tag 0 =

Ovulation) des Zyklus festzustellen, während der niedrigste RI und die höchste TAMV

zwischen den Tagen -2 und 0 gemessen wurden (BOLLWEIN et al. 2000). Des Weiteren

Literatur

21

konnten die Autoren eine positive Korrelation zwischen TAMV und der Östrogen (E2)-

Konzentration, sowie eine negative Korrelation zwischen RI und der E2-Konzentration

beobachten. Zudem war TAMV negativ mit der peripheren P4-Konzentration korreliert.

Bereits in früheren Studien, in denen elektromagnetische Blutflusssonden (FORD und

CHENAULT 1981) oder dopplersonographische Transducer (WAITE et al. 1990) chirurgisch

in bzw. um die uterinen Arterien angebracht wurden, wurde wie bei BOLLWEIN et al. (2000)

von einer positiven Korrelation zwischen uteriner Perfusion und der systemischer E2-

Konzentration, sowie von einer negativen Korrelation zwischen uteriner Perfusion und der

systemischen P4-Konzentration berichtet (FORD und CHENAULT 1981).

2.3 Follikuläre Durchblutung

Die erhöhte Blutversorgung der einzelnen Follikel scheint mit dem follikulären Wachstum

und der Follikeldeviation assoziiert zu sein, während eine reduzierte Vaskularisation eng mit

der follikulären Atresie in Verbindung steht. Vor der Follikelselektion der ersten follikulären

Welle konnten sowohl ACOSTA et al. (2005) als auch MATSUI und MIYAMOTO (2009)

mit Hilfe der Dopplersonographie keinen Unterschied in der Vaskularisation zwischen den

größten und den nächstgrößten Follikeln feststellen. Erst nach der follikulären Selektion kam

es zur Abnahme der Blutversorgung der nächstgrößeren Follikel. Die genannten Autoren

gaben an, dass die Erhaltung der follikulären Vaskularisation und der Blutversorgung der

größten Follikel essentiell für die Follikeldominanz war und dass die Veränderung der

Blutversorgung bei einem individuellen Follikel in enger Beziehung mit dem follikulären

Wachstum der ersten Follikelwelle stand. In einer weiteren Studie konnten ACOSTA et al.

(2003) beobachten, dass die Perfusion des präovulatorischen Follikels initial auf einen kleinen

Bereich der Follikelwand beschränkt war und dass das durchblutete Areal im Laufe der

follikulären Entwicklung kontinuierlich anstieg. Bei Tieren mit einer spontanen Ovulation

stieg die vaskularisierte Fläche parallel mit der E2-Konzentration im Plasma graduell an und

blieb bis zur Ovulation hoch, wohingegen der durchblutete Bereich in der Follikelwand bei

der induzierten Ovulation 30 Minuten nach einer GnRH-Injektion plötzlich expandierte und

bis zur Ovulation größer blieb als das Areal bei der spontanen Ovulation (ACOSTA et al.

2003). Ferner stellten die Autoren eine temporäre Beziehung des durchbluteten Areals,

Literatur

22

welches als semiquantitativer Parameter für die follikuläre Durchblutung herangezogen

wurde, und der TAMV sowohl mit dem Plasma-Konzentrationsanstieg von E2 als auch mit

dem Anstieg von LH fest. Die höchste TAMV in der Wand des präovulatorischen Follikels

wurde während des LH-Konzentrationsanstiegs sowohl in der spontan ovulierenden als auch

hormonell behandelten Gruppe beobachtet. Des Weiteren stieg bei Kühen mit GnRH-

induzierter Ovulation der follikuläre Blutfluss simultan mit der Plasma-Konzentration von LH

sowie von E2 an und blieb bis zur Ovulation relativ unverändert hoch. Dagegen begann bei

Tieren mit einer spontanen Ovulation der follikuläre Blutfluss bereits zu steigen, obwohl die

LH-Konzentration im Plasma noch niedrig war (ACOSTA et al. 2003). Aus den beobachteten

Ergebnissen schlussfolgerten ACOSTA et al. (2003), dass es eine funktionale Assoziation

zwischen dem Blutfluss in der Follikelwand und der Plasma-Konzentration von E2 und LH

während der präovulatorischen Phase bei der Kuh existiert. Darüber hinaus wurde in einer

Studie die follikuläre Perfusion bei zyklischen Kühen in Verbindung mit der Höhe der P4-

Konzentration gebracht. So berichteten LÜTTGENAU et al. (2011a), dass eine niedrige P4-

Konzentration im peripheren Blut einen größeren dominanten Follikel (DF) der ersten

Follikelwelle zur Folge hatte als eine höhere P4-Konzentration. Dagegen war der

Durchmesser des präovulatorischen DF unabhängig von der P4-Konzentration

(LUTTGENAU et al. 2011a). Am Tag 7 (Tag 1 = Ovulation) ihres Experiments konnten die

Autoren einen signifikant geringeren follikulären Blutfluss bei der niedrigen als bei einer

höheren P4-Konzentration beobachten. Das war der einzige Tag, an dem zwischen Tieren mit

niedrigen und hohen P4-Werten ein Unterschied bezüglich der follikulären Perfusion

festzustellen war (LUTTGENAU et al. 2011a).

2.4 Luteale Durchblutung

Das bovine CL ist relativ zu seiner Größe das bestdurchblutete Organ des Körpers und weist

die höchste Durchblutungsrate pro Gewebeeinheit des Gesamtorganismus auf (WILTBANK

et al. 1988). Seine Durchblutung kann mittels Dopplersonographie bestimmt werden. Die

luteale Durchblutung zeigt charakteristische Veränderungen nach spontaner (MATSUI und

MIYAMOTO 2009; MIYAMOTO et al. 2005) sowie induzierter (GINTHER et al. 2007;

SHIRASUNA et al. 2004; ACOSTA et al. 2002) Luteolyse. Gleiches konnte auch während

Literatur

23

des Zyklus festgestellt werden (TAKASAKI et al. 2009). In verschiedenen Studien (SINGH

et al. 1998; TOM et al. 1998; KASTELIC et al. 1990b) wurde beobachtet, dass auch die

luteale Größe einem typischen Verlauf unterliegt. Das CL nimmt bis Tag 10 des Zyklus an

Größe zu, erreicht dann eine Plateauphase, um dann zwei Tage nach Beginn der Luteolyse,

welche über den Abfall der peripheren P4-Konzentration bestimmt wird, kleiner zu werden.

In einigen Studien wurde von einer geringen lutealen Durchblutung (LDB) während der

ersten drei Tage des Zyklus (BOLLWEIN et al. 2002b; NISWENDER et al. 1976) berichtet.

ACOSTA et al. (2003) wiesen einen graduellen Anstieg der LDB parallel mit dem Anstieg

des lutealen Volumens von Tag 2 bis 5 des Zyklus nach. Zwischen den Tagen 3 und 4 nahm

sowohl das durchblutete Areal als auch das Volumen des jungen CLs um das Zwei- bis

Dreifache zu (ACOSTA et al. 2003). Eine annähernde Verdopplung der LDB von Tag 4 bis

Tag 7 konnten HERZOG et al. (2010) in ihrer Untersuchung beobachten. Während der

statischen Phase (Tag 8-16) nahm die LDB noch einmal um fast das Zweifache zu und

erreichte maximale Werte an den Tagen 14 und Tag 16. In der Regressionsphase war dagegen

ein rapider Abfall der LDB nachweisbar, der im Gegensatz zur Größe des CL parallel mit

dem Abfall des P4-Spiegels einherging (HERZOG et al. 2010).

Während der spontanen (MATSUI und MIYAMOTO 2009; MIYAMOTO et al. 2005) und

der induzierten (MATSUI und MIYAMOTO 2009; GINTHER et al. 2007; ACOSTA et al.

2002) Luteolyse wurde vor dessen Abfall ein kurzzeitiger initialer Anstieg der LDB

beobachtet. Einen solchen Anstieg konnten GINTHER et al. (2007) in ihrem Experiment

durch sowohl systemische als auch intrauterine PGF2α-Administration induzieren und

bestätigten somit die Schlussfolgerung von MIYAMOTO et al. (2005), die das Phänomen auf

die Stimulierung des vasodilatativ wirkenden NO durch PGF2α zurückführten.

In anderen Studien konnte in den ersten Tagen des Zyklus eine sehr gute (BOLLWEIN et al.

2002c) und während der mittleren lutealen Phase eine gute (TAKASAKI et al. 2009; FORD

und CHENAULT 1981; NISWENDER et al. 1976) Korrelation zwischen der Größe des

durchbluteten Areals im CL und der P4-Konzentration im Serum festgestellt werden. Jedoch

konnten WILTBANK et al. (1988) keine Veränderung des Gefäßwiderstandes innerhalb des

CL durch eine Hemmung der P4-Produktion mittels Aminoglutethimid-Applikation

Literatur

24

induzieren. In der Studie von LÜTTGENAU et al. (2011a) wurde eine Korrelation zwischen

systemischen P4-Konzentrationen und der lutealen Perfusion beschrieben. So wiesen

zyklische Kühe mit einer niedrigen P4-Konzentration ein kleineres CL mit einer geringeren

luteale Durchblutung auf als Kühe mit einer physiologischen P4-Konzentration. In einer

jüngst veröffentlichten Studie (PUNSMANN 2013) wurde frühtragenden, laktierenden Kühen

exogenes P4 über CIDR®-Spange supplementiert. Hierbei konnte kein Einfluss exogenen P4s

auf die Größe oder auf die Durchblutung des CLs beobachtet werden. Zudem konnte im

Gegensatz zu den Ergebnissen von LÜTTGENAU et al. (2011a) keine Korrelation zwischen

peripherer P4-Konzentration und den genannten lutealen Parametern festgestellt werden.

2.5 Genexpression im Corpus luteum

Das Corpus luteum (CL) ist der Hauptort der P4-Produktion während der lutealen Phase im

Brunstzyklus des Rindes.

Als Ausgangssubstanz für die Steroidhormone gelangt das an Lipoprotein gebundene

Cholesterol über das Blut zu den Luteinzellen. Im Anschluss wird Cholesterol durch das

Steroidogenic Acute Regulatory (StAR)-Protein von der äußeren zur inneren Membran der

Mitochondrien transportiert. Dieser Vorgang ist der entscheidende Schritt in der gesamten

Synthese des Steroidhormons. Er allein bestimmt die Geschwindigkeit der P4-Biosynthese

(MILLER 2007; CHRISTENSON und STRAUSS 2000; STOCCO und CLARK 1996). An

der mitochodrialen Innenmembran wandelt das Cytocrome-P450-side-chain-cleavage-Enzym

(P450scc, CYP11A) durch die Hydoxylierung am C20 und C22 mit anschließender

Seitenkettenabspaltung das Cholesterol in Pregnenolon um. Am glatten endoplasmatischen

Retikulum setzt es das 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Enzym (HSD-3β) über eine

Dehydierung zum Keton und eine Umlagerung der Doppelbindung schließlich Pregnenolon

zu Progesteron um.

Literatur

25

Abb. 1: Schematische Darstellung der Progesteron-Synthese in der Lutealzelle (modifiziert nach SENGER 2003).

Es liegen nach PESCADOR et al. (1996) zwei Isoformen von StAR mRNA mit einer Größe

von 2,9 bzw. 1,8 kb im bovinen CL vor. Die Transkription dieses für den Transport erforderli-

chen Gens erfolgt nach HARTUNG et al. (1995) in Abhängigkeit von der 3’ Polyadenylie-

rung. Bereits 24 Stunden nach der Ovulation konnte eine StAR mRNA Expression im CL

nachgewiesen werden, jedoch nur in geringem Ausmaß (PESCADOR et al. 1996;

HARTUNG et al. 1995). Dagegen waren die beiden Transkripte des StAR in den CL der

mittleren und späten Zyklusphase hoch exprimiert (HARTUNG et al. 1995). Nach

PESCADOR et al. (1996) steigen sie bis Tag 10 des Zyklus um das Neun- bis 15-fache an.

Die Konzentrationen von StAR mRNA blieben bis Tag 17 konstant und verschwanden

während der Regression des CL (TANIGUCHI et al. 2009; PESCADOR et al. 1996). Es

wurde eine hohe Korrelation zwischen StAR mRNA und StAR Protein während des gesamten

Brunstzyklus beobachtet (TANIGUCHI et al. 2009; PESCADOR et al. 1996). Die Expression

von P450scc und HSD-3β zeigte einen ähnlichen Verlauf mit einem charakteristischen

Rückgang während der lutealen Regressionsphase (TANIGUCHI et al. 2009). Entsprechend

der mRNA Expression waren alle drei korrespondierenden Proteine während der mittleren

Literatur

26

(Tag 8-12) und späten (Tag 15-17) lutealen Phase in höherer Zahl im CL vorhanden als zum

Zeitpunkt der Regression (Tag 19-21) (TANIGUCHI et al. 2009).

Unter dem Einfluss einer exogenen P4-Supplementation wurde in einer jüngeren Studie ein

Anstieg der relativen Expression von StAR mRNA zwischen Tag 6 und Tag 12 beobachtet

(PUNSMANN 2013). Es wurde kein signifikanter Einfluss des exogenen P4 auf die Bildung

des für den P4-Metabolismus verantwortlichen StAR-Proteins festgestellt. In einem früheren

in vitro-Versuch inkubierten KOTWICA et al. (2004) Luteinzellen von CLs, die an den Tagen

5 bis 10 des Zyklus von Kühen entnommen wurden, mit exogenem P4 für zwei, vier oder acht

Stunden. Chronologisch zu der Inkubationslänge zeigte HSD-3β einen entsprechenden

Anstieg an Aktivitäten. REKAWIECKI et al. (2005) konnten ebenfalls in einem in vitro-

Versuch eine Steigerung der Genexpression von StAR und HSD-3β in Luteinzellen von CLs

der Tage 6 bis 10 sowie der Tage 11 bis 16 des bovinen Brunstzyklus nachweisen. In ihrem

Experiment inkubierten die Autoren Luteinzellen mit exogenem P4 für die Dauer von drei,

sechs, 18 und 24 Stunden. Bereits nach sechs Stunden Inkubation konnten sie einen Anstieg

der mRNA-Konzentrationen für StAR und HSD-3β feststellen.

In engem Zusammenhang mit der Luteinisierung und Formation des CLs stehen

Veränderungen in der lutealen Vaskularisation (REYNOLDS et al. 1992). Für die

Angiogenese ist unter anderem der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

verantwortlich (BERISHA et al. 2000). Er gilt nach BERISHA et al. (2000) als der wichtigste

Faktor in der Regulation der normalen und abnormalen Angiogenese. Seine biologischen

Aktivitäten sind an der Kaskade von Vorgängen, welche zur Angiogenese führen und damit

essentiell für die Entwicklung des CLs sind, beteiligt. In ihrer Studie konnten die oben

angeführten Autoren alle Komponenten des VEGF-Systems im bovinen CL während des

Brunstzyklus und während der Trächtigkeit nachweisen. Das luteale Gewebe exprimiert

jedoch überwiegend die zwei kleinsten Isoformen (VEGF120 und VEGF164) und in sehr

geringer Menge VEGF188. Die höchste mRNA Expression für VEGF und VEGF-

Rezeptoren 2 (VEGFR-2) wurde während der frühen Lutealphase (Tag 3-4) nachgewiesen.

Die Expressionsintensität von VEGF sank nach Tag 7 des Zyklus signifikant auf den

niedrigsten Level während der Regression des CLs ab. Nach BERISHA et al. (2000) stellen

die lutealen Zellen den Hauptort der VEGF mRNA-Synthese dar. Während die VEGFR-1

Literatur

27

mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Untersuchungsphasen nicht differierte, war

die VEGFR-2 mRNA an Tag 3 bis 4 des Zyklus am höchsten exprimiert. Darauf folgte dann

ein signifikanter Rückgang. Ein ähnliches Expressionsmuster wurde bei Wasserbüffeln

beschrieben (CHOUHAN et al. 2013). Die Häufigkeit der Transkripte von VEGF-Isoformen

und ihren Rezeptoren (VEGFR-1 und VEGFR-2) variierte während der Lutealphasen. Jedoch

wies das VEGF-System die höchste mRNA-Expression in dieser Studie nicht nur während der

frühen, sondern auch während der mittleren Lutealphase auf. Danach nahm sie stetig ab und

erreichte während der lutealen Regression den niedrigsten Wert (CHOUHAN et al. 2013).

Bezüglich der lutealen Durchblutung konnten LÜTTGENAU et al. (2011b) eine negative

Korrelation zwischen relativem lutealen Blutfluss und VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 sowie

HSD-3β beobachten.

Wie VEGF reguliert Stickstoffmonoxid (NO) verschiedene biologische Funktionen. Das

gasförmige Molekül ist ein potenter Vasodilatator. Es nimmt eine wichtige Rolle in der

Angiogenese unter anderem im CL ein. Die NO-Bildung wird von der NO-Synthase-

Konzentration (NOS) reguliert (ALDERTON et al. 2001). Zwei Isoformen von NOS, die

iNOS (induzierte, Ca2+-unabhängige NOS) und eNOS (endotheliale, Ca2+- abhängige NOS),

wurden von ROSIANSKY-SULTAN et al. (2006) im bovinen CL nachgewiesen. Die

genannten Autoren untersuchten die Konzentrationen für iNOS und eNOS mRNA im CL von

Schlachthofovarien. Nach optischer Beurteilung wurden die vorliegenden CLs in eine frühe

(Tag 1 bis 5), eine mittlere (Tag 8 bis 15) und eine späte (Tag 16 bis 18) Lutealphase

eingeteilt. Die Autoren konnten zunächst eine hohe Konzentration sowohl von eNOS (mRNA

und Proteine) als auch von iNOS feststellen, wobei eNOS zu jedem untersuchten Zeitpunkt in

zehnmal höheren Konzentrationen als iNOS vorlag. Die Expression von mRNA beider

Enzyme nahm mit dem Alter des CLs ab, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung. Zudem

konnten die genannten Autoren einen Rückgang der Expression von eNOS in der mittleren

Lutealphase um 70 % im Vergleich zu der frühen Lutealphase beobachten, während die

Konzentration von iNOS mRNA in der mittleren Lutealphase nur leicht zurückging. Darüber

hinaus zeigte sich iNOS in der späten Lutealphase um das Sechsfache reduziert, im Vergleich

zu der frühen Lutealphase (ROSIANSKY-SULTAN et al. 2006).

Material und Methode

28

3 Material und Methode 3.1 Tiere

Für die vorliegende Studie standen von Januar 2011 bis Januar 2012 sieben nichtlaktierende,

unipare Kühe der Rasse Deutsch Holstein der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover zur Verfügung. Die Entwicklung ihrer Kälber geschah via Sectio

Caesarea. Die Tiere waren klinisch gesund und ohne pathologische Veränderungen des

Genitaltraktes. Sie wogen bei einem Body Condition Score (BCS) von 3,25 ± 0,25 (Mean ±

SD) im Mittel 664 ± 75 kg (Mean ± SD). Ihr Alter betrug 5,0 ± 1,7 Jahre (Mean ± SD).

Die Tiere wurden in Einzelboxen gehalten mit freiem Zugang zu Wasser und einer ad libitum

Fütterung mit Heu. Die Anzeige des Tierversuches wurde bei der zuständigen Behörde

eingereicht und genehmigt (Aktenzeichen: 11/0416, Niedersächsisches Landesamt für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Oldenburg).

3.2 Versuchsanordnung

3.2.1 Ovulationsinduktion

Zu Beginn der Studie wurde der Zyklus der Tiere mit Hilfe eines Ovulation-Synchronisation-

Protokolls (OvSynch-Protokoll) synchronisiert (Abb. 2).

1. GnRH PGF-2α 2. GnRH Abb. 2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs des OvSynch-Protokolls

Unabhängig vom Zyklusstand wurde jedem Versuchstier ein GnRH-Analogon (10 µg

Buserelin; Receptal®, Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) i.m. verabreicht. Ferner

wurde nach sieben Tagen ein Prostaglandin-Analogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz,

Tag -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2


29

Estrumate®, Essex, München, Deutschland) i.m. injiziert. Zwei Tage später wurde das oben

genannte GnRH-Analogon in derselben Dosierung i.m. verabreicht. Die Ovarien wurden 24

und 48 h später transrektal sonographisch untersucht, um die Ovulation zu registrieren. Damit

die Kühe in die Studie aufgenommen werden konnten, mussten sie innerhalb von 48 h nach

der zweiten GnRH-Analogon-Injektion ovulieren. Fand die Ovulation im beschriebenen

Zeitraum nicht statt, durchliefen die Versuchstiere erneut das OvSynch-Protokoll. Der Tag, an

dem der dominante Follikel sonographisch nicht mehr sichtbar war, wurde als Tag 1 des

eingeleiteten Zyklus definiert.

3.2.2 Versuchsdesign

In einem Cross-Over Design wurden die Tiere jeweils mit einem P4-Präparat oder einem

Placebo behandelt. Am Tag der Ovulation (Tag 1 des eingeleiteten Zyklus) wurde jedem Tier

eine PRID®-Spirale (Progesteron Releasing Intravaginal Device, PRID® alpha 1,55 g,

Deutschland) oder ein Placebo intravaginal eingesetzt. Bei dem Placebo handelte es sich um

ein 5 x 10 x 3 cm großes Schwämmchen, welches in Plastik eingefasst war. Es besaß keinerlei

hormonsekretorische Eigenschaften. Die Spirale, respektive das Placebo, verblieben sieben

Tage intravaginal. Die Spirale bzw. das Placebo wurde nicht von der untersuchenden Person

selbst eingesetzt. Somit handelte es sich um ein geblindetes Vorgehen. Bekam das Tier im

ersten Zyklus das Placebo, so erhielt es in dem zweiten zu untersuchenden Zyklus die Spirale

und umgekehrt. Zwischen den beiden zu untersuchenden Zyklen lag eine Ruhephase von

mindestens 21 Tagen, in der keine Manipulationen am Tier vorgenommen wurden.

3.2.3 Zeitlicher Ablauf der Untersuchungen

Arteria uterina

Zur Dokumentation der uterinen Perfusion wurde der Blutfluss in der linken und rechten

A. uterina zum ersten Mal am Tag der induzierten Ovulation (= Tag 1) mittels

Farbdopplersonographie untersucht. Die weiteren Untersuchungen fanden an den Tagen 2, 5,

8, 11, 15, -5, -4, -3 bis zur folgenden Ovulation statt. Im Anschluss an jede Untersuchung


30

wurde mit Hilfe der B-Mode Sonographie der Durchmesser der A. uterina zur späteren

Ermittlung des Blutflussvolumens gemessen (Abb. 3).

Corpus luteum

Der Blutfluss des CL wurde an den Tagen 5, 8, 11, 15, -5, -4, -3 bis zur folgenden Ovulation

mittels Farbdopplersonographie untersucht. Nach der Untersuchung wurde mittels B-Mode

Sonographie die Größe des Gelbkörpers via Messung des größten Durchmessers bestimmt

(Abb. 3).

Dominanter Follikel

Der Blutfluss des DF wurde an den Tagen -5, -4, -3 bis zur folgenden Ovulation mittels

Farbdopplersonographie untersucht. Danach wurde mit Hilfe der B-Mode Sonographie die

Follikelgröße via Messung des größten Durchmessers ermittelt (Abb. 3).

Abb. 3: Zeitlicher Ablauf der Untersuchungen und Behandlungen.


31

3.3 Durchführung der Farbdoppler- und B-Mode-Sonographie

Alle transrektalen sonographischen Untersuchungen wurden von derselben Person (PDD)

vorgenommen und erfolgten in einem Untersuchungsstand, in dem das Tier fixiert worden

war. Die Geräteeinstellungen blieben für alle Untersuchungen im jeweiligen Modus identisch.

Für die sonographischen Untersuchungen der Aa. uterinae wurde ein Dopplergerät (Power-

vision 6000 SSA-370 A, Toshiba Co., Tokyo, Japan) verwendet. Es war mit einer 7,5 MHz

Mikrokonvexsonde (PVF-738 F) ausgestattet. Die Aufzeichnung aller Dopplerwellen und B-

Mode-Aufnahmen, die später am PC ausgewertet wurden, erfolgte im Audio Video Interleave

(avi) Format auf einen tragbaren digitalen Video Recorder (AV 605, Archos Inc., Irvine,

USA). Die dopplersonographische Untersuchungen der rechten und linken A. uterina dauerte

bei jeder Kuh insgesamt ca. 40 min. Die Messung des Blutflusses in der A. uterina wurde

nach der von BOLLWEIN et al. (2000) beschriebenen Methode durchgeführt. Die

Dopplerwellen wurden über das Farbdopplerfenster abgeleitet und aufgezeichnet. Unmittelbar

nach jeder Blutflussmessung in der A. uterina wurde der Gefäßdurchmesser im B-Mode

bestimmt. Es wurden drei Messungen in derselben Position im Abstand von je 20 Sekunden

vorgenommen. Die Bestimmung der Gefäßquerschnitte erfolgte anhand des Messprogramms,

welches im Ultraschallgerät integriert war.

Für die Bestimmung der Gelbkörper- und Follikelgröße, sowie der follikulären und lutealen

Durchblutung wurde das LOGIQTMBook XP Ultraschallgerät (General Electrics Medical

Systems, Jiangsu, China), das mit einem 7,0 MHz Linearschallkopf (General Electrics

Yokogawa Medical Systems, Tokyo, Japan) ausgestattet war, verwendet. Dazu wurde das

jeweilige Ovar mit dem Schallkopf von kranial nach kaudal, von medial nach lateral und von

dorsal nach ventral abgefahren, um das gesamte Ovar in verschiedenen Ebenen darzustellen.

Die maximalen lutealen und follikulären Größen wurden an den größten darstellbaren

Durchmessern der CLs bzw. Follikel mittels B-Mode Sonographie erfasst. Es wurden jeweils

drei Bilder erstellt. Die Ergebnisse wurden digital gespeichert und später ausgewertet. Mit

Hilfe der Farbdopplersonographie wurden sowohl am CL als auch am DF Bilder zur

Ermittlung der Durchblutung gespeichert. Es wurden jeweils mindestens 15 Bilder

angefertigt. Von diesen wurden die drei mit der höchsten Farbpixelzahl innerhalb des CL


32

bzw. der Follikelwand ausgewertet. Die Werte dienten als semi-quantitativer Parameter für

die luteale (LDB) und follikuläre Durchblutung (FDB). Für die Ergebnisermittlung wurden

jeweils die Mittelwerte aus den drei einzelnen Bildern errechnet.

3.4 Auswertung der Farbdoppler- und B-Mode Bilder

3.4.1 Auswertung der uterinen Perfusion

Die Auswertung der Dopplerwellen erfolgte mit Hilfe der Software Pixel Flux (1.0,

Chameleon-Software®, Leipzig, DE). Für die Analyse des Blutflusses wurden zwei

konsekutive, möglichst ähnliche Dopplerwellen mit einem maximalen Verhältnis der Diastole

zur Systole herangezogen. Es wurden drei Dopplerwellenpaare sowohl von der rechten als

auch von der linken A. uterina ausgewertet und die Ergebnisse gemittelt.

Als Parameter für die semiquantitative Beurteilung der Dopplerwellen wurden die

Dopplerindizes herangezogen. Mit ihrer Hilfe wurden die Widerstandsverhältnisse im

Gefäßbett distal zur Untersuchungsstelle quantifiziert (SOHN 1993). Es wurden sowohl der

Pulsatility Index (PI) als auch der Resistance Index (RI) bestimmt. Die beiden Indizes werden

aus der maximalen systolischen (S), der minimalen (M), der enddiastolischen (D) und der

mittleren maximalen Frequenzverschiebung während eines Herzzyklus (TAMF = Time

Average Maximum Frequency Shift) errechnet (Abb. 4).

Pulsatility Index (PI) = �–�

��

Resistance Index (RI) = �–�

�


33

Abb. 4: Schematische Darstellung einer Dopplerwelle mit der maximalen systolischen (S), der minimalen (M), der enddiastolischen (D) und der mittleren, maximalen Frequenzverschiebung (TAMF= Time Average Maximum Frequency Shift) während eines Herzzyklus (modifiziert nach BOLLWEIN et al. (2000)). Als quantitativer Parameter für die Blutversorgung fungierte das uterine Blutflussvolumen

(BFV). Unter Einbeziehung des Winkels α zwischen Dopplerstrahl und Blutflussrichtung

diente die TAMF zur Berechnung der mittleren maximalen Blutgeschwindigkeit (Time

Average Maximum Velocity = TAMV) über den Herzzyklus. Aus den Werten für TAMV und

dem Gefäßdurchmesser (d) wurde das uterine Blutflussvolumen (BFV) errechnet.

TAMV = ��∗

�∗�∗� �

c = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Weichteilgewebe (ca. 1540 m/s)

F = Sendefrequenz des Schallkopfes (Hz)

α = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und der Blutflussrichtung


34

BFV = �∗��∗��

��

A = (½ d)2 * π

BFV = Blutflussvolumen (ml/min)

A = Fläche des Gefäßquerschnittes (cm2)

d = Durchmesser (cm)

TAMF = Time Average Maximum Freqence Shift (Hz)

TAMV = Time Average Maximum Velocity (m/s)

100 = Faktor für die Umrechnung der TAMV von m/s auf cm/s

60 = Faktor für die Umrechnung des BFV von ml/s auf ml/min

3.4.2 Auswertung der lutealen Perfusion und Größe

Die Auswertung der Farbdopplerbilder erfolgte mit Hilfe der Software Pixel Flux (1.0,

Chameleon-Software®, Leipzig, DE). Für die Bestimmung der LDB wurden drei Standbilder

analysiert. Hierbei wurde der gesamte Bereich des CLs als „ region of interest“ (ROI)

markiert (Abb. 5). Über die Farbpixel innerhalb der Markierung wurde die Durchblutung

errechnet. Zur Bestimmung der LS wurden drei Standbilder im B-Mode ausgewertet und der

Mittelwert für spätere statistische Berechnungen ermittelt. Hierbei wurde der Umfang des

CLs exakt umfahren und markiert. Die gesamte Fläche wurde errechnet. Bei einem CL mit

Hohlraum entspricht die LS der errechneten Fläche abzüglich der Fläche des Hohlraumes,

dessen Größe zuvor ebenfalls durch Umfahren bestimmt wurde.


35

Abb. 5: Sonographische Aufnahmen eines Corpus luteum mit Hohlraum im B-Mode (links) und im Color-Angio-Mode (rechts).

3.4.3 Auswertung der follikulären Größe und Perfusion

Die Auswertung der Farbdopplerbilder des DF erfolgte ebenfalls mit Hilfe der Software Pixel

Flux (1.0, Chameleon-Software®, Leipzig, DE). Analog zur Bestimmung der Durchblutung

und der Größe des CLs wurden die follikuläre Durchblutung und Größe ermittelt (Abb. 6).


36

Abb. 6: Sonographische Aufnahmen eines Follikels im B-Mode (links) und im Color-Angio-Mode (rechts) einer Kuh am Tag 18 des Zyklus.

3.5 Plasmagewinnung und hormonanalytische Methoden

Zur Bestimmung des Gehaltes an P4 im Blutplasma wurde den Kühen nach jeder

Ultraschalluntersuchung eine Blutprobe aus der V. coccygica entnommen und in 2 EDTA-

Röhrchen (EDTA-Reagenz- und Zentrifugenröhrchen 4,0 ml, Sarstedt, Deutschland)

verbracht. Die Blutproben wurden unmittelbar danach bei einer Beschleunigung von 2600 g

für 10 Minuten zentrifugiert und das Plasma in 2 Reagenzgefäße (Reagenzgefäß 1,5 ml,

Sarstedt, Deutschland Eppendorff-Röhrchen) pipettiert und bei -20°C eingefroren. Die

Bestimmung der P4-Konzentration wurde im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mittels Radioimmunoassay (RIA)

durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird ein automatisierter, kompetitiver Chemilumineszenz

Immunoassay verwendet (LKPG1, Immulite® 1000 System, Siemens Diagnostics, USA), der

nach dem Prinzip eines Sandwich ELISAs funktioniert. In einem Teströhrchen befanden sich

dabei mit monoklonalen Antikörpern gegen P4 beschichtete Kugeln. Durch den verwendeten


37

Immulite®-Automat wurden jeweils 25 µl des zu analysierenden Plasmas in eines der

Teströhrchen pipettiert, wo das darin enthaltene P4 an die Antikörper gebunden wurde. Im

nächsten Schritt wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper mit alkalischer Phosphatase

hinzugegeben, damit dieser ebenfalls an das P4 binden konnte. Das im Anschluss automatisch

hinzu pipettierte Adamantyl 1,2-Dioxetane-Arylphosphat reagierte spezifisch mit der

alkalischen Phosphatase, wobei das instabile Produkt Adamantyldioxtan entstand. Bei dem

ablaufenden Zerfall kam es zu einer Lichtemission, die sich proportional zu der Konzentration

des P4 in der Probe verhielt und die vom verwendeten Immulite®-Automat detektiert wurde.

Das Gerät errechnete anschließend anhand einer Standardkurve die in der Probe vorhandene

P4 Konzentration. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient betrug 5,8 bis 16,0 % und der Intra-

Assay-Variationskoeffizient lag zwischen 6,3 und 16,0 %. Die analytische Sensitivität betrug

0,2 ng/ml und der untere Messbereich lag bei <0,09 ng/ml.

3.6 Transvaginale Corpus luteum Biopsie unter Ultraschallkontrolle

Die Entnahme der lutealen Biopsien wurde an den Tagen 8 und 15 des Zyklus im Anschluss

an die farbdopplersonographischen Untersuchungen durchgeführt. Die Biopsieentnahme

erfolgte transvaginal unter sonographischer Sichtkontrolle (Verfahren nach KOT et al. (1999),

modifiziert nach ONNEN-LÜBBEN (2009)). Es wurde ein RNAse-freies (RNAse-

ExiddusPlusTM, ApplChem, Darmstadt, Deutschland) halbautomatisches Biopsienadelsystem

(Abb. 7, Nr.4; TEMNO EvolutionTM, Firma Walter Veterinär-Instrumente e.K., Baruth/ Mark,

Deutschland) verwendet. Dieses wurde in ein Nadelführungsrohr (Abb. 7, Nr.3) eingeführt,

welches in einen Biopsienadelträger (Abb. 7, Nr. 1) eingebettet war. Der Träger war zudem

mit einer 7,5 MHz Konvex-Sonde (Abb. 7, Nr. 2) ausgerüstet, welche mit dem

LOGIQTMBook XP verbunden war. Vor dem Eingriff erhielten die Tiere eine Epiduralan-

ästhesie (4 ml = 80 mg Procain Hydrochlorid, Procasel 2%®, der Firma Selectavet Dr. Otto

Fischer GmbH, Weyarn-Holzolling, Deutschland) zur Schmerzausschaltung sowie zur

Unterdrückung der Darmperistaltik. Zuerst wurde das äußere Genitale mit Papiertüchern

trocken gereinigt. Der Biopsienadelträger wurde transvaginal unter das Scheidendach

vorgeschoben. Das Ovar, auf dem sich das CL befand, wurde transrektal mit der Hand fixiert

und vor dem Schallkopf positioniert. Der maximale luteale Durchmesser wurde im


38

Ultraschallbild eingestellt. Das Scheidendach wurde mit der Trokarkanüle (14 gauge) (Abb. 7,

Nr.5, Abb. 8) perforiert, die auf dem Nadelführungsrohr aufgesteckt war. Diese Einrichtung

wurde ebenfalls im Biopsienadelträger untergebracht. Nach der Perforation der Scheidenwand

wurde eine luteale Gewebeprobe mit Hilfe der Biopsienadel (Größe ca.15 x 1 x 1 mm)

gewonnen. Das Bioptat wurde mit einer sterilen Kanüle aus der Biopsienadelkammer

entnommen, in ein DNAse- und RNAse-freies Kryoröhrchen (CryoPure 2,0 ml, Fa. Sarstedt

AG &Co, Nümbrecht, Deutschland) verbracht, in Stickstoffbehälter gelegt und dann zur

Lagerung bei -80°C für die spätere Analyse überführt.

Abb. 7: Darstellung der zur Biopsieentnahme verwendeten Gerätschaften.

Abb. 8: Vergrößerte Darstellung einer Biopsienadel in einer Trokarnadel.


39

3.7 Genexpressionsanalyse

Aus dem lutealen Bioptat wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits von Qiagen (QIAGEN

GmbH, Hilden, Deutschland) die Gesamt-RNA isoliert. Anschließend erfolgte eine Reverse

Transkription mittels des MMLUV Point Mutant H-RT-Enzyms von Promega (Promega

GmbH, Mannheim, Deutschland). Die RT-qPCR wurde auf dem CFX384™ Real-Time PCR

Detection System von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland) unter

Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes SsoFast™ EvaGreen® (Bio-Rad) durchgeführt.

Mittels der in Tab. 2 dargestellten Primer wurde die luteale mRNA Expression der Gene

StAR und HSD-3ß untersucht, welche als Schlüsselenzyme der zellulären P4-Produktion

gelten (SLOUGH et al. 2011; TSAI et al. 2001; JUENGEL et al. 1998), sowie der Gene

Vascular Endothelial Growth Factor Isoform 120 (VEGF120), Isoform 164 (VEGF164) und

Isoform 188 (VEGF188), endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), die entscheidende

Faktoren der Angiogenese darstellen. Die Anzahl der Zyklen (Cq), die benötigt wurden, um

ein definitives Fluoreszenz-Signal detektieren zu können, wurde bestimmt. Der Cq-Wert

verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der initialen Template-Konzentration.

Die erhaltenen Cq-Werte für die unterschiedlichen Gene wurden gegen das geometrische

Mittel der Cq-Werte der drei Haushaltsgene Histon, Ubiquitin und YWHAZ normiert (∆Cq).

Ein hoher ∆Cq-Wert steht hierbei für ein häufiges Vorkommen des Transkripts. Um die

Expressionshöhe der beiden Gruppen (P4-Gruppe vs. Placebo-Gruppe) zu vergleichen,

wurden die ∆Cq-Werte voneinander abgezogen und die n-fache Expression errechnet (2-∆∆Cq).

Ein positiver Wert steht dabei für eine um das n-fache erhöhte Expression innerhalb der P4-

Gruppe, ein negativer Wert repräsentiert eine um das n-fache erniedrigte Expression.

Drei der gewonnenen Proben wiesen nach der Isolation eine sehr geringe RNA-Konzentration

auf. Die Zuverlässigkeit der ermittelten Expressionswerte war damit fraglich, so dass sie in

der statistischen Auswertung nicht berücksichtigt wurden. Alle drei Proben stammten aus der

P4-Gruppe. Eine dieser drei Proben entstammte von einem der Tiere mit vorzeitiger

Luteolyse.


40

Tab. 2: Primer-Sequenzen und Parameter für die quantitative Bestimmung der Genexpression mittels real-time PCR. Es sind der Name des Gens, die Ausrichtung der Primer sowie deren Sequenz, die Größe der zu amplifizierenden Fragmente in Basenpaaren (bp) und die zur Hybridisierung ideale Temperatur in °C angegeben.

Gen Ausrich-

tung

Primer Sequenz (5´-... -3´) Fragment-

größe (bp)

Hybridisie-

rungstem-

peratur (°C)

Histon* F AGATCCAGGATAAGGAAGGCAT

233 60 R GCTCCACCTCCAGGGTGAT

Ubiquitin* F AGATCCAGGATAAGGAAGGCAT

19 60 R GCTCCACCTCCAGGGTGAT

YWHAZ* F CAGGCTGAGCGATATGATGAC

141 60 R GACCCTCCAAGATGACCTAC

StAR F GGATTAACCAGGTTCGGCG

157 60 R CTCTCCTTCTTCCAGCCCTC

HSD-3ß F TACCCAGCTGCTGTTGGA

322 60 R ATGCCGTTGTTATTCAAGGC

eNOS F AGGAGTGGAAGTGGTTCCG

126 66 R GCCCCGGTACTACTCTGTCA

VEGF188 F CCGTCCCATTGAGACCCTG

296 60 R TGCCCCTTTCCCTTTCCTC

VEGF120 F CCGTCCCATTGAGACCCTG

280 60 R CGGCTTGTCACAATTTTTCTTGTC

VEGF164 F CCG TCC CAT TGA GAC CCT G

278 60 R GCC CAC AGG GAT TTT CTT GC

* Haushaltsgen


41

3.8 Statistische Auswertung

Mit dem Programm SAS 9.3 (Statistical Analysis System Institute Inc., Cary, North Carolina,

USA) wurden die erhobenen Daten statistisch ausgewertet. Die Daten wurden mit

UNIVARIATE, MEANS und FREQ des Shapiro-Wilk-Testes auf Normalverteilung

überprüft. Die erfassten normalverteilten Daten wurden als Mittelwerte (MW) und

Standardabweichungen (SD) beschrieben und mit dem Student´s t-Test hinsichtlich der

Signifikanzen ausgewertet. Die nicht normal verteilten Daten wurden mit Hilfe des

Wilcoxon´s rank-sum-Test (NPAR1WAY) auf signifikante Unterschiede zwischen den

Gruppen untersucht. Zudem wurden die Parameter zwischen den einzelnen Tagen innerhalb

der Gruppe mit Hilfe des Wilcoxon´s signed-rank-Test (MEANS, UNIVARIATE, CHART)

verglichen und auf Signifikanz geprüft. Die Korrelation zwischen nicht normal verteilten

Parametern wurde anhand des Spearman Rang-Korrelationskoeffizienten (r) ermittelt. Nur die

statistisch signifikanten Korrelationskoeffizienten waren von Interesse. Als statistisch

signifikant wurden Ergebnisse mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p ≤ 0,05

angesehen. Ergebnisse mit p-Werten im Bereich 0,05 < p ≤ 0,10 galten als tendenziell

signifikant.

Ergebnisse

42

4 Ergebnisse

Um Parameter der Brunstzyklen mit unterschiedlicher Zykluslänge zu vergleichen, wurden

die Untersuchungen von Tag 1 bis 15 und von Tag −2 bis zur Ovulation des nachfolgenden

Zyklus für die Analyse verwendet.

4.1 Zykluslänge

Bei allen sieben Kühen fanden sowohl im P4- als auch im Placebo-Zyklus Einzelovulationen

statt. Tiere der P4-Gruppe wiesen eine Zykluslänge von 19,2 ± 1,89 Tagen (Mittelwert ±

Standardabweichung; MW ± SD) auf, während die Tiere der Placebo-Gruppe durchschnittlich

nach 21,1 ± 2,97 Tagen ovulierten. Im Vergleich zu den Tieren der Placebo-Gruppe zeigten

die Tiere der P4-Gruppe eine tendenziell kürzere Zykluslänge (p = 0,08).

Tab. 3:

Zykluslänge in Tagen der einzelnen Tiere, getrennt nach Progesteron- und Placebo-Gruppe.

Tier Zykluslänge in Tagen

P4-Zyklus Placebo-Zyklus

1 17* 19

2 19* 20

3 23 26

4 19 24

5 18 19

6 19 18

7 20 22

* Tiere mit einer vorzeitigen Luteolyse im supplementierten Zyklus

(P4-Konzentration ≤ 1 ng/ml am Tag 15)

Ergebnisse

43

4.2 Progesteronkonzentration im Plasma

Die P4-Konzentration im Plasma der P4-Gruppe war an den Tagen 2, 5 und 8 des Zyklus

gegenüber der Placebo-Gruppe erhöht (p ≤ 0,05; Abb. 9). An den anderen Tagen bestanden

keine (p > 0,05) Unterschiede in den P4-Spiegeln zwischen beiden Tiergruppen.

In der Placebo-Gruppe waren die Plasma-P4-Konzentrationen, außer am Tag 2, an den Tagen

5, 8, 11 und 15 höher als an Tag 1 (p ≤ 0,05). Sie erreichten mit 7,56 ng/ml am Tag 15 ihr

Maximum (p ≤ 0,05).

Die Progesteronkonzentrationen der P4-Gruppe waren an den Tagen 2, 5, 8 und 11 höher als

an Tag 1 (p ≤ 0,05). Nach der Entfernung der PRID®-Spirale an Tag 8 fielen die P4-Werte bis

zum Tag 11 um 0,9 ng/ml (p ≤ 0,05) ab. Die P4-Konzentrationen an den Tagen 11 und 15

unterschieden sich nicht voneinander (p > 0,05). Am Tag 15 lag die Plasma-P4-Konzentration

bei zwei von sieben Tieren bereits unter 1,0 ng/ml (Tab. S2).

Abb. 9: Progesteron (P4)-Konzentration (P4, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. * Signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen an einem Untersuchungszeitpunkt (p ≤ 0,05). Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

44

4.3 Größe des Corpus luteum

Es konnten im gesamten Untersuchungszeitraum keine Unterschiede hinsichtlich der lutealen

Größe zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe festgestellt werden (p > 0,05; Abb. 10).

Bei den Tieren der P4-Gruppe war das Corpus luteum an den Tagen 8 und 11 größer als an

Tag 5 (p ≤ 0,05). Das Corpus luteum eines der beiden Tiere mit einer vorzeitigen Luteolyse

war an den untersuchten Tagen größer als die der anderen Tiere (Tab. S5). Bei den Tieren der

Placebo-Gruppe war das Corpus luteum an den Tagen 8, 11, und 15 größer als das am Tag 5

(p ≤ 0,05).

Abb. 10: Luteale Größe (LS, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

45

4.4 Durchblutung des Corpus luteum

Die luteale Durchblutung unterschied sich an keinem der Untersuchungstage zwischen den

beiden Gruppen (p > 0,05; Abb. 11).

In der P4-Gruppe stieg LDB kontinuierlich bis Tag 11 an (p ≤ 0,05), während eine Zunahme

in der Placebo-Gruppe nur bis Tag 8 feststellbar war (p ≤ 0,05). Die LDB der beiden Tiere mit

einer vorzeitigen Luteolyse waren am Tag 15 niedriger als diejenige der anderen Tiere (Tab.

S8).

Abb. 11: Luteale Durchblutung (LDB, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

46

4.5 Größe des präovulatorischen Follikels

Die Größe der dominanten Follikel unterschied sich sowohl zwischen der P4- und Placebo-

Gruppe als auch innerhalb der einzelnen Gruppe an den letzten drei Tagen vor der Ovulation

nicht (p > 0,05; Abb. 12). Die Größen der dominanten Follikel der beiden Tiere mit einer

vorzeitigen Luteolyse unterschieden sich nicht von denen der anderen Tiere (Tab. S11).

Abb. 12: Follikelgröße des Ovulationsfollikels (FS, Mittelwert ± Standardabweichung; MW ± SD, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

47

4.6 Durchblutung des präovulatorischen Follikels

Die follikuläre Durchblutung der dominanten Follikel unterschied sich weder zwischen der

P4- und Placebo-Gruppe noch zwischen den drei Tagen vor der Ovulation innerhalb der

einzelnen Gruppen (p > 0,05; Abb. 13). Die follikuläre Durchblutung der beiden Tiere mit

einer vorzeitigen Luteolyse unterschied sich nicht von denen der anderen Tiere (Tab. S11).

Abb. 13: Follikuläre Durchblutung des Ovulationsfollikels (FDB, Mittelwert ± Standardabweichung; MW ± SD, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe über einen Zyklus (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

48

4.7 Uteriner Blutfluss

4.7.1 Mittlere Blutflussgeschwindigkeit

Zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe war an keinem der Untersuchungstage ein

Unterschied in den TAMV-Werten festzustellen (p > 0,05; Abb. 15).

TAMV fiel zwischen den Tagen 1 und Tag 2 sowohl in der P4-, als auch in der Placebo-

Gruppe ab (p < 0,05). In der Placebo-Gruppe stieg TAMV zwischen den Tagen 2 und Tag 5,

8 und 11 sowie -1 und 0 an, um von Tag 0 auf Tag 1 erneut abzufallen (p < 0,05). In der P4-

Gruppe gab es dagegen keine weiteren signifikanten Schwankungen in den TAMV-Werten

im weiteren Verlauf der Untersuchungen. Die TAMV der beiden Tiere mit einer vorzeitigen

Luteolyse unterschied sich an den untersuchten Tagen nicht von der der anderen Tiere (Tab.

S17).

Abb. 15: Mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

49

4.7.2 Uterines Blutflussvolumen

Es gab zu keinem Zeitpunkt der Untersuchungszyklen Unterschiede in den BFV-Werten

zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe (p > 0,05; Abb. 14).

Innerhalb der P4-Gruppe unterschieden sich die BFV-Werte während des Zyklus nicht

(p > 0,05). Der BFV-Wert während des Östrus unterschied sich von denen an den Tagen 1, 2

und 5 sowie von dem Tag 1 des folgenden Zyklus (p < 0,05). In der Placebo-Gruppe war das

BFV zwischen Tagen 8 und 11, 8 und 15, 8 und -2, 8 und 0 unterschiedlich (p < 0,05). Des

Weiteren unterschied sich der BFV-Wert von Tag -2 von denen an Tagen 1, 2, 5 und 1 des

neuen Zyklus (p < 0,05). Der BFV-Wert von Tag -1 unterschied sich von denen der Tage 1,

2, 5 und 1 des neuen Zyklus (p < 0,05). Ebenso unterschied sich der BFV-Wert von Östrustag

von den Tagen 1, 2, 5 und Tag1 des neuen Zyklus (p < 0,05). Bei den beiden Tieren mit einer

vorzeitigen Luteolyse unterschieden sich die BFV-Werte nicht von denen der anderen Tiere

(Tab. S14).

Abb. 14: Uterines Blutflussvolumen (BFV, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in randomisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

50

4.7.3 Pulsatility Index

Zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe konnte im gesamten Untersuchungszeitraum kein

Unterschied bezüglich des PI festgestellt werden (p > 0,05, Abb. 16).

In der P4-Gruppe lag ein Unterschied der PI-Werte zwischen Tagen 1 und 5, 1 und 15, 1 und

-1, 1 und 0, 2 und 5, 2 und 15, 2 und -2, 2 und -1, 2 und 0 sowie zwischen Tagen 5 und -1, 5

und 0 und zwischen Tagen 8 und -1, 8 und 0, auch zwischen Tagen 11 und 0 vor.

In der Placebo-Gruppe lag ein Unterschied der PI-Werte zwischen den Tagen 2 und 5, 2 und

8, 2 und 15, 2 und -2, 2 und -1, 2 und 0, 2 und 1 sowie zwischen Tagen 5 und -1, 5 und 0 und

zwischen Tagen 8 und -1, 8 und 0, auch zwischen Tagen 11 und -1, 11 und 0, 15 und 0 vor.

Die PI-Werte der beiden Tiere mit einer vorzeitigen Luteolyse unterschieden sich nicht von

denen der anderen Tiere (Tab. S20).

Abb. 16: Pulsatility Index (PI, Median, unteres und oberes Quartil, Minimum, Maximum) einer mit exogenem Progesteron (PRID®-Spirale) und einer mit Placebo behandelten Gruppe (Tag 1 = Ovulation) während des Zyklus. Dunkelgrau unterlegte Boxplots stellen die Werte der P4-Gruppe dar und weiß unterlegte jene der Placebo-Gruppe. Es wurden 7 Kühe in ran-domisierter Reihenfolge behandelt und nicht behandelt. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Gruppen unterscheiden sich (p ≤ 0,05).

Ergebnisse

51

4.8 Genexpression des Corpus luteum

Die untersuchten Parametern differierten weder zwischen den Tagen 8 und 15 innerhalb der

beiden Gruppen (p ≥ 0,05) noch zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe an den

verschiedenen Zyklustagen (p ≥ 0,05; Tab. 12).

Betrachtet man die Werte der beiden Tiere der P4-Gruppe, die an Tag 15 bereits eine P4-

Konzentration ≤ 1,0 ng/ml aufwiesen, so fiel auf, dass bei einem der beiden Tiere die

Expression der RNA für StAR, HSD-3β und die drei Isoformen von VEGF (gemessen an

∆Cq) geringer war als bei den anderen Tieren dieser Gruppe (Tab. S26). Die Probe des

anderen Tieres mit einer P4-Konzentration ≤ 1,0 ng/ml konnte aufgrund der zu geringen

RNA-Konzentrationen nicht analysiert werden (siehe 3.7.).

Tab. 4:

Luteale mRNA Expressionen (∆Cq; Median ± MAD) von Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR), 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (HSD-3β), endothelialer Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, drei Isoformen) an den Tagen 8 und 15 des Zyklus (Tag 1 = Ovulation) bei Kühen (n = 7), die zwischen den Tagen 1 bis 8 in einem Zyklus exogenes Progesteron und in einem Zyklus Placebo erhielten.

Gene Tag 8 Tag 15

Progesteron Placebo Progesteron Placebo

StAR 1,00 ± 0,65 1,69 ± 0,36 1,09 ± 0,74 1,54 ± 0,45

HSD-3β 2,89 ± 0,39 3,38 ± 0,45 3,59 ± 0,15 3,72 ± 0,14

eNOS -8,02 ± 0,32 -7,97 ± 0,16 -7,76 ± 0,37 -8,00 ± 0,17

VEGF188 -5,60 ± 0,32 -5,81 ± 0,21 -5,96 ± 0,37 -6,02 ± 0,04

VEGF120 24,43 ± 0,38 24,49 ± 0,40 25,93 ± 0,66 24,89 ± 0,30

VEGF164 -3,17 ± 0,37 -3,10 ± 0,25 -4,00 ± 0,73 -3,78 ± 0,31

Diskussion

52

5 Diskussion Progesteron nimmt eine entscheidende Rolle in der bovinen Reproduktion ein. Die

Supplementierung dieses Hormons wird seit Jahren in der Praxis durchgeführt. Die Wirkung

einer solchen Substitution war Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (FORRO et al. 2012;

LONERGAN 2011; LOPEZ-GATIUS et al. 2004; VILLARROEL et al. 2004; MANN und

LAMMING 1999; MACMILLAN 1991; ROBINSON et al. 1989; WILTBANK et al. 1988;

LOY et al. 1975; LOY et al. 1959; JOHNSON 1958). Dabei unterschieden sich die Anzahl,

die Art der Versuchstiere sowie die Methodik und die Zeiträume der P4-Behandlungen. Als

Parameter zur Untersuchung und Beurteilung dienten in vivo die Trächtigkeitsrate, P4-

Konzentration, die Größe und Durchblutung des Corpus luteum, des dominanten Follikels

und die Durchblutung der Arteria uterina, sowie die Genexpression im lutealen Gewebe in

vitro. Die Ergebnisse divergieren.

Als wichtige Parameter für die luteale Funktion wurden in einigen Studien (HERZOG et al.

2011; LUTTGENAU et al. 2011a; LUTTGENAU et al. 2011b; HERZOG et al. 2010;

MIYAMOTO et al. 2005) die Größe und Durchblutung des CLs herangezogen.

Die Autoren konnten dabei einen Zusammenhang feststellen. Eine Untersuchung dieser

Parameter unter dem Einfluss einer in der frühen Phase des Zyklus stattgefundenen P4-

Supplementation erscheint daher wichtig.

Auch eine Untersuchung der Veränderung bezüglich uteriner Durchblutung unter exogenem

P4 in der frühen Phase des Zyklus könnte Erkenntnisse über dessen Einfluss liefern, da ein

solcher Effekt bei Stuten beschrieben ist (BOLLWEIN et al. 2004).

In der vorliegenden Studie sollte daher der Einfluss einer exogenen P4-Substitution in der

frühen Phase des Zyklus auf die uterine Durchblutung, auf das CL sowie auf den

präovulatorischen Follikel untersucht werden. Zur Beurteilung des Einflusses wurden die

mittlere Blutflussgeschwindigkeit, das Blutflussvolumen, der Pulsatility Index, die P4-

Konzentration, die Größe und die Durchblutung des CL, die Größe und Durchblutung des

präovulatorischen dominanten Follikels sowie die Expression einiger wichtiger Gene

überprüft.

Diskussion

53

5.1 Progesteron

Vorangegangene Untersuchungen berichteten von einem signifikanten Anstieg der Plasma-

P4-Konzentration unter dem Einfluss einer exogenen P4-Supplementation mittels

unterschiedlicher Applikationsmethoden wie CIDR®-Spange, PRID®-Spirale oder subkutaner

Injektion unterschiedlicher Dosierungen (LARSON et al. 2007; SHAHAM-ALBALANCY et

al. 2001; CAVALIERI et al. 1998; MANN und LAMMING 1995; ADAMS et al. 1992;

GARRETT et al. 1988a; BATTISTA et al. 1984; SREENAN und GOSLING 1977;

SREENAN und MULVEHILL 1977). Das gleiche Ergebnis wurde in dieser Studie

festgestellt. Wie in einigen der oben angeführten Studien konnten bereits einen Tag nach der

Insertion der PRID®-Spirale am Tag 1 des Zyklus erhöhte P4-Werte gemessen werden. Dieser

P4-Spiegel blieb bis zum Ende der exogenen Supplementation erhalten. Im Vergleich zu

Kontrolltieren konnten höhere P4-Konzentrationen bei P4-Tieren am Tag nach der

Applikation erfasst werden. Des Weiteren wurde in der eigenen Untersuchung ein P4-Spiegel

beobachtet, der über mehrere Tage während der Substitution erhöht war. Auch dieses

Ergebnis steht in Kongruenz zur Literatur (MANN et al. 2006; ROBINSON et al. 1989;

GARRETT et al. 1988a; GARRETT et al. 1988b; BATTISTA et al. 1984; SREENAN und

MULVEHILL 1977). Der Anstieg der P4-Konzentration beruht auf der Eigenschaft der

PRID®-Spirale, kontinuierlich P4 freizusetzen. Der signifikante P4-Unterschied zwischen P4-

und Placebo-Tieren lässt vermuten, dass die hier gemessene periphere P4-Konzentration eine

Addition aus exogenem P4 und endogener P4-Sekretion sein kann, da laut SREENAN et a.

(1977) und GARRETT et al. (1988a) sowie ROBINSON et al. (1989) die endogene P4-

Sekretion nicht von einer exogenen P4-Supplementation in der frühen Lutealphase beeinflusst

wird. Im Einklang mit der Hypothese angeführter Autoren steht auch die in der vorliegenden

Untersuchung gemachte Beobachtung, dass die periphere P4-Konzentration sofort nach

Entfernung der PRID®-Spirale am Tag 8 signifikant abfiel. Es gab keinen Hinweis auf eine

Unterdrückung der endogenen P4-Produktion, da bereits drei Tage nach Ende der P4-

Substitution kein Unterschied mehr in der peripheren P4-Konzentration zwischen beiden

Untersuchungsgruppen vorlag. Somit schien die P4-Substitution weder auf die Entwicklung

des CLs noch auf seine Fähigkeit zur P4-Sekretion Einfluss zu haben. Jedoch wiesen zwei der

sieben supplementierten Tiere bereits an Tag 15 eine P4-Konzentration ≤ 1 ng/ml auf, so dass

Diskussion

54

hier eine luteolytische Wirkung der P4-Zufuhr in Betracht gezogen werden kann. Dieses

Ergebnis stimmt zum Teil mit den Ergebnissen von WOODY et al. (1967), WOODY und

GINTHER (1968), MUNRO und MOORE (1985), GARRETT et al. (1988a) überein.

Während GARRETT et al. (1988a) einen signifikanten P4-Anstieg während der gesamten

Behandlungsdauer von vier Tagen feststellten, beobachten MUNRO und MOORE (1985)

nach der Insertion der PRID®-Spirale bei Rindern am Tag 3 des Zyklus einen schnellen

Anstieg der peripheren P4-Konzentration. Dieser initiale Anstieg fiel während der

Supplementation wieder ab. Gemäß den Verfassern schien die exogene P4-Substitution

endogene P4-Sekretion zu inhibieren, sofern die Supplementation in den ersten Tagen nach

Östrus stattfand. Es wurde vermutet, dass exogenes P4 sowohl luteolytische als auch

luteotrophe Aktivitäten besitzt. Diese Eigenschaften sind jedoch vom Zeitpunkt der exogenen

P4-Supplementierung im Zyklus abhängig (MUNRO und MOORE 1985). Zudem wurde vor

Kurzem nachgewiesen, dass die intraluteale P4-Konzentration eine wichtige Stellung in der

Erhaltung der Steroidgenese des CL einnimmt.

5.2 Genexpression der an der lutealen P4 Synthese beteiligten Enzyme

In der vorliegenden Arbeit wurde neben der Bestimmung der peripheren P4-Konzentration im

Plasma eine Genexpressionsanalyse der Progesteron-Schlüsselenzyme StAR und HSD-3β aus

dem lutealen Gewebe durchgeführt. In der Vergangenheit wurde in verschiedenen Studien

über die Genexpression der genannten Enzyme in verschiedenen Zyklusphasen berichtet.

Während sich keine mRNA-Konzentration für StAR und HSD-3β bei der Luteolyse, in den

Corpora albicantia detektieren und sich sehr schwach in der frühesten lutealen Phase

nachweisen lässt, steigt sie langsam an den Tagen 4 bis 6 an (HARTUNG et al. 1995). Im

mittleren und späteren Diöstrus ändert sich die Expression der Gene nicht, welche StAR und

HSD-3β codieren (TANIGUCHI et al. 2009; PESCADOR et al. 1996; HARTUNG et al.

1995). Laut PESCADOR et al. (1996) und HARTUNG et al. (1995) steht die Regression des

CL in Assoziation mit dem Verlust der Expression von StAR und HSD-3β, so dass in dieser

Phase des Zyklus keine oder kaum mRNA für StAR und HSD-3β nachzuweisen sind. Die

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten keinen Anstieg der mRNA für StAR und HSD-3β

zwischen beiden Untersuchungstagen. Da die Gewebeentnahme zur Mitte und zum Ende des

Diskussion

55

Diöstrus an Tag 8 und Tag 15 erfolgte, schien der Diöstrus eine nicht empfängliche

Zyklusphase für eine Beeinflussung der P4-Syntheseleistung durch eine in der frühen Phase

des Zyklus stattgefundene P4-Supplementation zu sein. Dieses Ergebnis wird dadurch betont,

dass auch kein Unterschied in der Expression der Gene für StAR und HSD-3β zwischen der

P4- und der Placebo-Gruppe an beiden untersuchten Tagen festgestellt wurde. Die niedrige

mRNA-Konzentration für StAR und HSD-3β an Tag 15 von einem der beiden Tiere mit

vorzeitiger Luteolyse steht im Einklang mit der Beobachtung von HARTUNG et al. (1995)

und deutet auf eine luteolytische Aktivität des exogenen P4 bei diesem Tier hin.

In vitro konnte unter Einfluss exogenen P4s allerdings ein Anstieg der mRNA für HSD-3β in

Luteinzellen von an den Zyklustagen 5 bis 10 gewonnenen CLs beobachtet werden, obwohl

die verwendete Dosis im Vergleich zur physiologischen endogenen Konzentration im

gleichen Stadium zehn Mal geringer war (KOTWICA et al. 2004). Auch REKAWIECKI et

al. (2005) beobachteten einen Anstieg der mRNA-Konzentrationen für StAR und HSD-3β in

einem in vitro-Versuch, in dem Luteinzellen von CLs der Zyklustage 6 bis 10 mit exogenem

P4 behandelt wurden. Dieses Phänomen führten die Autoren darauf zurück, dass P4 seine

eigene Produktion stimulierte. Damit unterstützten sie die Hypothese von KOTWICA et al.

(2004), dass P4 insbesondere in der frühen Phase der lutealen Entwicklung seine eigene

Synthese moduliert. Die Autoren wiesen in ihrer Studie eine Stimulation der mRNA-

Expression bei Rindern nach. Sie vermuteten, dass P4 eine Regulation der Expression von

HSD-3β bewirkte. REKAWIECKI et al. (2005) postulierten, dass P4 über die de novo

Synthese von StAR- und HSD-3β in seine eigene Produktion involviert zu sein scheint. Die

Resultate der vorliegenden in vivo-Studie lieferten jedoch keine Anhaltspunkte für das

Vorliegen solcher Phänomene. Möglicherweise war die Erhöhung der peripheren P4-

Konzentration nicht ausreichend, um im Lutealgewebe einen entsprechenden Effekt auf

Ebene der Genexpression auszulösen.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die P4-Substitution zu einem Anstieg der

peripheren P4 Konzentration während der Behandlung geführt hat. Nach Beendigung der P4-

Supplementation unterschieden sich die P4- und Placebo-Gruppe sowohl in der peripheren

P4-Konzentration als auch hinsichtlich der Genexpression der untersuchten Enzyme nicht.

Die niedrige Konzentration der Genexpression bei einem der zwei Tiere, bei denen es durch

Diskussion

56

die P4-Supplementierung zu einer vorzeitigen Luteolyse kam, impliziert jedoch, dass eine P4-

Substitution in der frühen Phase des Zyklus möglicherweise negative Auswirkungen auf die

Genexpression hervorruft. Es lässt sich daher nicht eindeutig sagen, ob eine Behandlung mit

exogenem P4 zu keiner Verschlechterung der lutealen Syntheseleistung führt und auch das

Entfernen der PRID®-Spirale keinen Einfluss auf die P4-Produktion des lutealen Gewebes

ausübt. Um diese Fragestellung abzuklären, sind weitere Untersuchungen nötig.

5.3 Größe des Corpus luteum

Der Einfluss einer exogenen P4-Supplementierung auf das Wachstum des Gelbkörpers wird

in der Literatur kontrovers diskutiert. LOY et al. (1960) beobachteten eine frühzeitige

Rückbildung des CL unter dem Einfluss von exogenem P4 bei Rindern. Durch eine einmalige

Injektion am Tag 1 des Zyklus reduzierte exogenes P4 sowohl die P4-Konzentration im

Plasma und den prozentualen Anteil der funktionalen Luteinzellen als auch das luteale

Gewicht. WOODY et al. (1967) beschrieben ebenfalls eine Reduktion der lutealen Größe bei

Kühen durch eine tägliche P4-Applikation von Tag 1 bis 10. Weiterhin demonstrieren

Untersuchungen an Jungsauen (FOOTE et al. 1958), Schafen (ZIMBELMAN et al. 1959) und

Meerschweinchen (ALDRED et al. 1961), dass eine P4-Substitution mit kleinen Gelbkörpern

assoziiert war. Ohne die Hormone genau zu spezifizieren begründeten ALDRED et al. (1961)

diesen Effekt damit, dass exogenes P4 die Fähigkeit besaß, die hypophysäre Sekretion der

luteotrophen Hormone herabzusetzen. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Studien

konnte in der eigenen Arbeit unter dem Einfluss der P4-Substitution ein stetiges Wachstum

des CLs bis etwa Tag 11 des Zyklus beobachtet werden. Es bestand in diesem Zeitraum kein

Unterschied bezüglich des CL zwischen der P4- und der Placebo-Gruppe. Auch in der

späteren Phase des Zyklus unterschied sich die luteale Größe der beiden Versuchsgruppen

nicht voneinander, obwohl die luteale Größe der P4-Gruppe zwischen den Tagen 11 und 15

bereits kleiner geworden ist. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen

vorangegangener Untersuchungen (PUNSMANN 2013; ARNDT et al. 2009) überein. Die

Verfasser konnten ebenfalls keine negative Rückkopplung der P4-Behandlung auf die luteale

Größenentwicklung beobachten. Dennoch konnte die Theorie von WOODY et al. (1967) und

LOY et al. (1960) in der eigenen Studie zum Teil bestätigt werden, da zum einen die LS der

Diskussion

57

P4-Tiere zwischen den Tagen 11 und 15 kleiner wurde, während die der Placebo-Tiere

zwischen diesen Tagen noch größer zu sein schienen. Zum anderen zeigten zwei der sieben

supplementierten Tiere am Tag 15 eine P4-Konzentration von unter 1 ng/ml. Ferner konnte

die Tendenz einer Verkürzung der Zykluslänge bei den P4-Tieren festgestellt werden. Das

alles deutet auf einen luteolytischen Effekt hin.

Überraschenderweise zeigte eines der beiden Tiere mit vorzeitiger Luteolyse am Tag 15 das

CL mit dem größten Durchmesser innerhalb der P4-Gruppe und dem drittgrößten

Durchmesser aller untersuchten Zyklen. Auch diese Beobachtung steht in Kongruenz zur

Literatur. Gemäß MANN (2009) nimmt die Größe des CL keine entscheidende Stellung in der

P4-Synthese mehr ein, wenn es zwischen Tag 5 und Tag 8 eine bestimmte Größe erreicht hat.

Ferner postulierten auch HERZOG et al. (2010), dass die luteale Funktion besonders während

der Regression nicht mehr von der Größe des CL abhängig ist.

5.4 Durchblutung des Corpus luteum

Die LDB spiegelt während des Zyklus, insbesondere in der Regressionsphase, die

Synthesekapazität des CL wider und ist ein direktes Maß für die luteale Funktion (HERZOG

et al. 2011; HERZOG et al. 2010; TAKASAKI et al. 2009; BOLLWEIN et al. 2002b). In der

vorliegenden Studie wurde die luteale Perfusion sowohl dopplersonographisch als auch

anhand der Bestimmung der Genexpression verschiedener angiogenetisch wirkender Enzyme

(VEGF188, VEGF120, VEGF164, eNOS) ermittelt.

Während der Anbildungsphase des Gelbkörpers geht der Anstieg der Durchblutung mit dem

Anstieg der lutealen Größe und der P4-Konzentration im Plasma einher (ACOSTA et al.

2003). In dieser Phase etablieren die Luteinzellen den Kontakt zu zahlreichen Blutkapillaren.

In der Blütenphase besteht das CL bis zu 50 % aus vaskulär endothelialen Zellen

(MIYAMOTO et al. 2009). Sowohl die großen als auch die kleinen Luteinzellen haben

Kontakt zu mehreren Blutgefäßen (REYNOLDS et al. 1992), so dass der Transport von

Gonadotropinen sowie von Cholesterol und auch von P4 gewährleistet ist (ACOSTA und

MIYAMOTO 2004). Hierdurch wird wiederum deutlich, dass das Potential des CL, P4 zu

produzieren und zu sezernieren, eng mit der lutealen Durchblutung in Zusammenhang steht

Diskussion

58

(MATSUI und MIYAMOTO 2009). In verschiedenen Studien wurde von einer signifikanten

Korrelation zwischen peripherer P4-Konzentration und lutealer Perfusion berichtet

(LUTTGENAU et al. 2011a; FORD und CHENAULT 1981; NISWENDER et al. 1976;

NISWENDER et al. 1975). In seiner Arbeit zeigte PUNSMANN (2013) jedoch, dass eine

exogene P4-Supplementation die Perfusion des CL nicht beeinflusste. In der eigenen Studie

wurde ebenfalls kein Einfluss des exogenen P4 auf LDB in Bezug auf die beiden Gruppen

beobachtet, da kein LDB-Unterschied zwischen beiden Gruppen festgestellt wurde. Die LDB

stieg jedoch bei den P4 substituierten Tieren bis Tag 11 an, während sich die LDB der

Placebo-Tiere zwischen den Tagen 8, 11 und 15 nicht mehr unterschied. In der P4-Gruppe

zeigten zwei Tiere eine vorzeitige Luteolyse. Einzeln betrachtet lag bei diesen Tieren eine

geringere luteale Durchblutung an Tag 15 vor. Da es sich um Einzelfälle handelte, ließ sich

daher nicht eindeutig abklären, ob eine exogene P4-Substitution einen Einfluss auf die LDB

ausübt.

BERISHA et al. (2000) beschrieben VEGF als den wichtigsten Faktor in der Regulation der

normalen und abnormalen lutealen Angiogenese. Sie stellten die höchste Konzentration der

mRNA von VEGF und seinen Rezeptoren in der frühen Lutealphase fest. Diese war zudem

positiv korreliert mit der lutealen Vaskularisation. Die mRNA Expression von VEGF und

seinen Rezeptoren blieb in der Studie bis zur Regression des CLs auf einem hohen Level.

Dies deutet auf eine weitere wichtige Funktion von VEGF über die Vaskularisation in der

frühen Lutealphase hinaus hin (BERISHA et al. 2000). Bei einem in vitro-Versuch konnten

KOBAYASHI et al. (2001) nachweisen, dass VEGF die P4-Sekretion der Luteinzellen vom

jungen CL stimulierte. Die Autoren waren deshalb der Ansicht, dass eine aktive luteale

Angiogenese die P4-Produktion im sich anbildenden CL in vivo sicherstellt. In der

vorliegenden Untersuchung konnte eine relativ hohe Ausprägung der mRNA für VEGF in

Vergleich zu Haushaltsgenen sowohl in der mittleren (Tag 8) als auch in der späten (Tag 15)

Lutealphase beobachtet werden. Es lag kein signifikanter Unterschied bezüglich der

Expression von mRNA für dieses Gen zwischen diesen beiden Tagen vor. Ferner wurde kein

signifikanter Unterschied in der Genexpression für VEGF sowohl bei den P4-

supplementierten als auch bei den Placebo-Tieren festgestellt. Die beiden Beobachtungen

Diskussion

59

lassen vermuten, dass die exogene P4-Supplementation keinen Einfluss auf die Konzentration

der mRNA für VEGF am Tag 8 und am Tag 15 zur Folge hatte.

Wie VEGF reguliert NO neben verschiedenen biologischen Funktionen auch die Angiogenese

im CL. Die eigene Untersuchung ergab eine im Vergleich zu Haushaltsgenen relativ geringe

Konzentration von eNOS mRNA im CL an den Tagen 8 und 15. Dieses Ergebnis steht im

Einklang mit ROSIANSKY-SULTAN et al. (2006), die im Gegensatz zur frühen (Tag 1 bis 5

des Zyklus) während der mittleren Lutealphase eine geringere Genexpression von eNOS

beobachteten. In der eigenen Untersuchung wurde trotz exogener P4-Substitution kein

signifikanter Unterschied in der Expressionshöhe zwischen beiden Untersuchungstagen in der

mittleren Lutealphase nachgewiesen. Darüber hinaus unterschied sich die relative Expression

der eNOS mRNA von P4-Tieren nicht von der Expression der Placebo-Tiere. Jedoch wies

eines der beiden Tiere mit vorzeitiger Luteolyse eine sehr geringe Konzentration von eNOS

mRNA an Tag 15 auf. Aus diesen Beobachtungen lässt sich nicht eindeutig schlussfolgern,

ob exogenes P4 keinen Einfluss auf die Bildung der eNOS mRNA besaß.

Zusammenfassend konnte für die untersuchten Parameter der lutealen Perfusion ähnliche

Ergebnisse wie bereits in der Literatur beschrieben festgestellt werden. Dabei war weder

hinsichtlich der dopplersonographischen Untersuchungen noch der Genexpressionsanalysen

ein eindeutiger Effekt der P4-Substitution auf die Durchblutung des CLs oder auf die

Ausprägung der mRNA Expression für VEGF und eNOS erkennbar.

5.5 Größe und Perfusion des Follikels

Bezüglich des präovulatorischen DFs konnte in der vorliegenden Studie kein Unterschied in

der FS und der FDB zwischen beiden Versuchsgruppen festgestellt werden. In den eigenen

Untersuchungen stieg sowohl die Größe als auch die Durchblutung des DF beider Gruppen

bis zur Ovulation nahezu linear an, was laut ACOSTA et al. (2003) als Indiz für ein normales

Wachstum des präovulatorischen DF gilt.

ADAMS et al. (1992) beobachteten, dass eine geringe P4-Substitution während der

follikulären Wachstumsphase ein stärkeres Wachstum des DF sowohl von der ersten als auch

Diskussion

60

von der zweiten Follikelwelle zur Folge hatte, wohingegen eine größere P4-Substitution in

Zusammenhang mit einem unterdrückten Wachstum des DF stand. Die beiden Ergebnisse

ließen vermuten, dass exogenes P4 den DF in seiner Wachstumsphase unterdrückte und dass

diese Hemmung sowohl von der Dosis als auch vom Zeitpunkt des Substitutionsbeginns

abhängig war. Die suppressiven Effekte auf den DF waren gemäß den Autoren nicht durch

eine Reduktion von FSH initiiert, da die P4-Behandlung die FSH-Freisetzung nicht inhibierte.

Weiterhin konnten sie feststellen, dass eine höhere P4-Menge während des follikulären

Wachstums in einem kleineren DF mit einer kürzeren Lebensspanne sowie in einem früheren

Anstieg des FSH resultierte, was wiederum die folgende Follikelwelle beschleunigte. Im

Gegensatz hierzu führte eine geringe P4-Dosis zu übergroßen, persistierenden DFs, einem

verspäteten Anstieg des FSH sowie einem verspäteten Auftreten der nächsten Follikelwelle.

Einen positiven Effekt auf die follikuläre Dynamik unter Einfluss einer exogenen P4-

Substitution konnten PFEIFER et al. (2009) feststellen. Die Autoren beobachteten ein

verbessertes follikuläres Wachstum durch exogenes P4. Als Grund vermuteten sie, dass der

suppressive Effekt des exogenen P4s auf Östrogen eine negative Rückkopplung auf den

Hypothalamus ausübte. Ein solches Phänomen auf den präovulatorischen Follikel konnte in

der vorliegenden Untersuchung nicht beobachtet werden. Der Grund dafür liegt

wahrscheinlich darin, dass exogenes P4 nur bis zum Tag 8 des Zyklus supplementiert wurde

und damit, anders als bei ADAMS et al. (1992) und PFEIFER et al. (2009), kein direkter

Einfluss des exogenen P4s auf den präovulatorischen Follikel vorlag.

In der Literatur liegen bis jetzt wenig Informationen über die FDB unter dem Einfluss

exogenen P4s vor. Es wurde in einer jüngst veröffentlichten Studie die follikuläre Perfusion

bei zyklischen Kühen in Verbindung mit der Höhe der P4-Konzentration gebracht. So

berichteten LÜTTGENAU et al. (2011a), dass eine systemische, niedrige P4-Konzentration

an Tag 7 einen geringen follikulären Blutfluss zur Folge hatte und die follikuläre Perfusion

des präovulatorischen DF nicht von der Höhe der P4-Konzentration beeinträchtigt wurde.

Gleiches konnte in der vorliegenden Studie beobachtet werden. Hierbei wurde der Einfluss

exogenen P4s auf die Durchblutung des präovulatorischen DFs untersucht. Die Ergebnisse

deuten darauf hin, dass die FDB des dominanten Follikels nicht von einer exogenen P4-

Supplementation beeinflusst wird. Es wurde kein Unterschied bezüglich der follikulären

Diskussion

61

Perfusion zwischen den beiden untersuchten Gruppen beobachtet. ACOSTA et al. (2003)

beobachteten bei Rindern, die dem Einfluss des exogenen P4s nicht ausgesetzt waren, einen

fast linearen Anstieg der Perfusion des DF bis zur Ovulation. In der eigenen Studie konnte

ebenfalls ein ähnlicher Verlauf ermittelt werden. In der Literatur wurde diese Veränderung

der FDB als Indiz für ein normales Wachstum des ovulatorischen DFs ausgelegt (ACOSTA et

al. 2003).

5.6 Uterine Perfusion

In einer Studie zur Untersuchung der uterinen Perfusion zeigten zyklische Stuten durch eine

exogene P4-Supplementation von Tag 0 bis 14 eine Erhöhung des PI von Tag 4 bis Tag 10

und während des folgenden Östrus (Tag -6 bis -1) (BOLLWEIN et al. 2004). Die Autoren

vermuteten, dass eine exogene P4-Substitution eine verminderte Ausbildung der

Östrogenrezeptoren bewirkte, wodurch sich die Abnahme der uterinen Perfusion auch nach

der Beendigung der P4-Behandlung erklären ließe. Ein derartiger PI-Anstieg wie in der oben

erwähnten Studie konnte in der vorliegenden Studie bei Kühen in der P4-Gruppe jedoch nicht

festgestellt werden. Dieses Ergebnis deutet an, dass beim Rind exogenes P4 nicht zu einer

Beeinflussung der uterinen Perfusion führt. Dies steht im Einklang mit den Beobachtungen

vorangegangener Untersuchungen, bei denen exogenes P4 kastrierten Sauen (DICKSON et al.

1969) und Schafen (RESNIK et al. 1977) supplementiert wurde. Unter exogener P4-Ein-

wirkung konnten DICKSON et al. (1969) bei kastrierten Sauen einen uterinen Blutfluss

feststellen, der während des gesamten Zyklus fast identisch mit dem der Kontrolltiere war.

Den Autoren zufolge schien P4 nur einen geringen systemischen Einfluss auf die uterine

Durchblutung auszuüben. Ebenso konnten RESNIK et al. (1977) nachweisen, dass eine

intramuskuläre P4-Administration den uterinen Blutfluss bei nichttragenden, kastrierten

Schafen, der durch Östrogen-Substitution gesteigert worden war, negativ beeinträchtigte. Die

P4-Substitution beeinflusste den physiologischen Blutfluss jedoch nicht. Nach Meinung der

Verfasser beruhte die fehlende Wirkung auf der Verstoffwechselung des P4s in der

Peripherie, bevor dieses Hormon den Wirkungsort erreichte. Da die periphere P4-

Konzentration unter Substitution von exogenem P4 in der vorliegenden Studie anstieg, konnte

diese Theorie nicht bestätigt werden. Obwohl ein signifikanter Unterschied in der peripheren

Diskussion

62

P4-Konzentration während der Supplementation vorlag, konnte in der eigenen Untersuchung

in keiner Phase der untersuchten Zyklen ein uteriner Perfusionsunterschied zwischen beiden

Versuchsgruppen ermittelt werden. Ein Vergleich innerhalb der P4-Gruppe ließ jedoch die

Feststellung zu, dass die zyklischen Blutflussschwankungen weniger stark ausgeprägt waren

als in der Placebo-Gruppe. Es ließ sich aus den vorliegenden Beobachtungen daher nicht

eindeutig schließen, ob sich eine exogene P4-Administration nicht auf den uterinen Blutfluss

auswirkte.

5.7 Zykluslänge

Während BOLLWEIN et al. (2004) von einer Verlängerung der Zykluslänge bei Stuten durch

eine exogene P4-Substitution berichteten, und somit die Ergebnisse von LOY et al. (1975)

bestätigten, wurde in anderen Studien über eine Verkürzung der Zykluslänge bei Rindern

(GARRETT et al. 1988a; BATTISTA et al. 1984; WOODY et al. 1967), bei Schafen

(OTTOBRE et al. 1980; WOODY et al. 1967) und Meerschweinchen (WOODY et al. 1967)

berichtet. In der vorliegenden Untersuchung zeigten zwei der P4-supplementierten Tiere eine

vorzeitige Luteolyse. Weiterhin konnte bei der Beobachtung aller Kühe die Tendenz einer

Zyklusverkürzung durch den Einfluss der P4-Supplementation festgestellt werden (p = 0,08).

Nach WOODY et al. (1967) und WOODY und GINTHER (1968) kommt es durch die P4-

Behandlung zu einer Reduzierung der LS. Dieses Phänomen scheint nach den eigenen

Ergebnissen aber nicht Ursache zu sein, da sich die luteale Größe der P4- und Placebo-

Gruppe nicht voneinander unterschied. Lediglich die Größenreduktion zwischen Tag 11 und

15 in der P4-Gruppe könnte hier als Indiz für die von WOODY und GINTHER (1968)

aufgestellte Theorie gelten. Als eine weitere mögliche Pathogenese einer verkürzten

Zykluslänge gilt eine Interferenz zwischen der hohen peripheren P4-Konzentration in Folge

des supplementierten P4s und der Neuformation des jungen CL (BATTISTA et al. 1984).

Diese Theorie konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden, denn exogenes P4

wurde bereits am Tag 1 des induzierten Zyklus supplementiert, ohne dass eine signifikante

Verkürzung des Zyklus beobachtet wurde. Auch eine vorgezogene Freisetzung des uterinen

PGF2α könnte durch die P4-Substitution initiiert worden sein und eine mögliche

Zyklusverkürzung bedingen (GARRETT et al. 1988a; GINTHER 1970b). Da GARRETT et

Diskussion

63

al. (1988a) eine vorzeitige Erhöhung der PGF2α-Metabolit-Pulse (PGFM-Pulse) bei den P4-

behandelten Tieren feststellten, kamen sie zu der Vermutung, dass die exogene P4-

Administration eine vorzeitige Reife der endometrialen Entwicklung stimulierte, was zu einer

frühzeitigen Freisetzung von PGF2α führte und den Diöstrus verkürzte.

Diskussion

64

Zusammenfassend konnten folgende Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen der

vorliegenden Arbeit gezogen werden:

1. Eine exogene P4-Substitution von Tag 1 bis 8 des Zyklus mittels PRID®-Spirale führt zu

einem Anstieg der P4-Konzentration im peripheren Plasma.

2. Die in der Literatur beschriebene negative Rückkopplung auf die luteale Entwicklung

konnte nicht nachgewiesen werden. Sowohl in der Größe als auch in der Perfusion des

Corpus luteum waren Tiere der P4-Gruppe nicht von denen der Placebo-Gruppe zu

unterscheiden. Dennoch kam es bei zwei P4-Tieren zu eine frühzeitigen Regression des CL

im Vergleich zu Kontrolltieren.

3. Die P4-Administration hat keine negativen Auswirkungen auf die uterine Perfusion und

die Follikelentwicklung.

4. Die fehlenden Auswirkungen der P4-Supplementation auf die Genexpression der

Schlüsselenzyme für die P4-Synthese sowie auf die Genexpression von VEGF und eNOS

im lutealen Gewebe am Tag 8 des Zyklus geben einen weiteren Hinweis darauf, dass

exogene P4-Supplementation die endogenen P4-Produktion nicht verändert.

5. Folglich liefern die Ergebnisse dieser Studie Anhaltspunkte dafür, dass eine frühzeitige

Substitution von P4 nicht das CL direkt, sondern über eine Stimulierung einer vorzeitigen

Prostaglandinsynthese die Fertilität vermindern kann. Diese Hypothese ist jedoch durch

weitere Untersuchungen zu überprüfen.

Zusammenfassung

65

6 Zusammenfassung

Phuong Do Duc (2015)

Einfluss von exogenem Progesteron auf die uterine, luteale und follikuläre Durchblutung sowie die Genexpression im lutealen Gewebe bei zyklischen Kühen

Ziel dieser vorliegenden Arbeit war, den Einfluss exogen über eine PRID®-Spirale von Tag 1

bis 8 des Zyklus verabreichten Progesterons (P4) auf die uterine, luteale und follikuläre

Durchblutung sowie die Expression wichtiger Gene im lutealen Gewebe bei zyklischen

Kühen zu untersuchen.

Sieben nicht laktierende Kühe der Rasse Deutsch Holstein der Klinik für Rinder der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover standen für das Experiment zur Verfügung. Die Tiere

wurden entsprechend einem cross over-Design in zwei Gruppen eingeteilt: P4-Gruppe:

Einsatz einer PRID®-Spirale von Tag 1 bis 8 des Zyklus im ersten zu untersuchenden Zyklus;

Placebo-Gruppe: Einsatz eines Placebos von Tag 1 bis 8 des Zyklus im zweiten zu

untersuchenden Zyklus. Zwischen diesen beiden Zyklen herrschte eine Ruhephase von

mindestens 21 Tagen, an denen keine Manipulation an den Tieren erfolgte. Nach Feststellung

der klinischen Allgemeingesundheit wurden die Zyklen aller Tiere in Kleingruppen von zwei

bis drei Tieren zeitversetzt mit Hilfe des OvSynch-Verfahrens synchronisiert. Am Tag der

Ovulation (Tag 1) wurden sie mit PRID®-Spirale oder Placebo behandelt. Zur Bestimmung

der Plasma-P4-Konzentrationen erfolgten an den Tagen 1, 2, 5, 8, 11, 15, -2, -1 bis zur

folgenden Ovulation nach jeder Untersuchung Blutprobenentnahmen. Anhand der

transvaginalen Doppler-Sonographie wurden an denselben Tagen bis zur folgenden Ovulation

sonographische Aufnahmen der beiden Aa. uterinae angefertigt, um die uterine Durchblutung

zu bestimmen. Darüber hinaus wurden an den Tagen 5, 8, 11, 15, -2, -1, 0 bis zur folgenden

Ovulation sonographische Aufnahmen des CL zur Bestimmung der lutealen Größe und

Durchblutung erstellt. Zudem wurden an den Tagen -2, -1, 0 bis zur folgenden Ovulation

sonographische Bilder der DF zur Bestimmung der follikulären Größe und Durchblutung

aufgenommen. Des Weiteren erfolgte an den Tagen 8 und 15 eine Gewebeentnahme vom CL

Zusammenfassung

66

unter Ultraschallkontrolle. Die Proben dienten zur Erfassung der Genexpression von

Schlüsselenzymen der P4-Synthese sowie der lutealen Angiogenese.

Die Zykluslänge war bei den P4-Tieren tendenziell kürzer als bei den Placebo-Tieren (p =

0,08). Ferner wiesen die P4-Tiere eine höhere Plasma-P4-Konzentration während der P4-Sub-

stitution an den Tagen 2 bis 8 auf (p ≤ 0,05). Nach der Entfernung der PRID®-Spirale fiel die

P4-Konzentration von Tag 8 auf Tag 11 ab (p = 0,001), während die P4-Konzentration der

Placebo-Tiere erst an Tag 15 sein Maximum erreichte (p ≤ 0,05). Bei zwei der sieben mit P4

supplementierten Kühe, aber bei keinem der Placebo-Tiere war der P4-Wert am Tag 15 des

Zyklus ≤ 1,0 ng/ml. Im Gegensatz zur P4-Konzentration differierten weder LS noch LDB

zwischen den beiden Versuchsgruppen zu keinem Untersuchungszeitpunkt (p > 0,05). Größe

und Durchblutung des präovulatorischen DFs unterschieden sich ebenfalls nicht (p > 0,05)

zwischen den beiden untersuchten Gruppen.

Sowohl TAMV als auch BFV sowie PI differierten an keinem der Untersuchungstage

zwischen der P4- und Placebo-Gruppe (p > 0,05). Auch die mRNA Expression der wichtigen

Enzyme der P4-Synthese (StAR, HSD-3β) und der Angiogenese (eNOS, VEGF188, VEGF120,

VEGF164) des CLs unterschieden sich nicht (p > 0,05) an den Tagen 8 und Tag 15 zwischen

der P4- und Placebo-Gruppe. Auch innerhalb der einzelnen Gruppen blieb die Genexpression

an Tag 8 oder an Tag 15 konstant (p > 0,05).

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die P4- Konzentration durch eine frühzeitige

Supplementation mittels einer intravaginalen Progesteronspirale gesteigert werden kann. Die

bei zwei der sieben mit Progesteron supplementierten Kühe beobachtete vorzeitige Luteolyse

scheint nicht auf einer Beeinträchtigung der Entwicklung des Corpus luteum, sondern auf

anderen, noch nicht genau identifizierten Mechanismen zu beruhen.

Summary

67

7 Summary

Phuong Do Duc (2015)

Effects of exogenous progesterone on uterine, luteal and follicular perfusion and gene-

expression in the luteal tissue of cyclic cows

The aim of this study was to examine the effects of intravaginal application of exogenous

progesterone (P4) from day 1 to 8 of the estrous cycle on uterine, luteal and follicular

perfusion and expression of important genes in the luteal tissues of cyclic cows.

Seven non-lactating Deutsch Holstein cows from the Clinic for Cattle of the University of

Veterinary Medicine Hannover were used for this experiment. According to a cross-over

design, the animals were divided into two groups: Intravaginal application of PRID® (P4-

group) or a placebo (placebo-group) from day 1 to 8 of the estrous cycle. Between both

investigated cycles, there was a resting period of at least 21 days in which the animals were

not manipulated. Estrous cycles of all animals were synchronized using Ovsynch. For

determination of P4-concentration, blood samples were taken after each sonographic

examination on Days 1, 2, 5, 8, 11, 15, -2, -1, 0 until ovulation. Using transvaginal Doppler

sonography blood flow in the uterine arteries was investigated on the same Days. Luteal size

and perfusion were determined on Days 5, 8, 11, 15, -2, -1, 0 until ovulation and follicular

size and perfusion on Days -2, -1, 0 until ovulation. On Days 8 and 15, a biopsy of the CL

was performed transvaginally under sonographic control to investigate gene-expression of

key-enzymes of P4-synthesis and luteal angiogenesis by using qRT-PCR.

By tendency (p = 0.08) the cycle-length of the P4-group was shorter compared to the placebo-

group. From Days 2 to 8 animals of the P4-group showed a higher P4-concentration than

those of the placebo-group (p ≤ 0.05). After removal of the device, P4-concentrations of

P4-animals declined from Days 8 to 11 (p = 0.001), while P4-concentrations of placebo-

animals continued to rise and reached the maximum on day 15 (p = 0.05). Two of the cows of

the P4-group, but none of the animals of the placebo-group showed P4 ≤ 1.0 ng/mL on Day

15. In contrast to P4-concentration neither size nor perfusion of the CL differed between

animals of both groups (p > 0.05). There was also no difference in size and perfusion of the

pre-ovulatory follicles between both groups (p > 0.05).

Summary

68

TAMV and BFV as well the PI did not differ (p > 0.05) between animals of both groups.

Animals of both groups showed the same (p > 0.05) mRNA concentrations of key enzymes

for P4-synthesis (StAR, HSD-3β) and angiogenesis (eNOS, VEGF188, VEGF120, VEGF164) on

Days 8 and 15. Furthermore, there were no differences (p > 0.05) in gene expressions between

Days 8 and 15 within animal groups.

The results of this study show that an intravaginal supplementation with a progesterone-

device is able to increase P4. The premature luteolysis observed in two of the seven cows of

the P4-group seems not to be caused by disturbances in luteal development, but by other not

yet clarified mechanisms.

Literaturverzeichnis

69

8 Literaturverzeichnis

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Anhang

84

9 Anhang

Tab. S1: P4-Werte in ng/ml. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag bis Tag 15 getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandlung Tag 1 Tag 2* Tag 5* Tag 8* Tag 11 Tag 15

P4

(n=7)

Med 0,40 3,76 5,88 6,27 5,33 4,93 Min 0,27 0,67 3,46 5,49 4,87 0,57 Max 1,77 12,10 12,40 11,30 7,08 11,20

Placebo

(n=7)

Med 0,40 0,89 2,51 4,87 5,48 7,56 Min 0,27 0,65 2,21 4,09 4,89 4,45 Max 1,77 3,28 3,55 7,83 11,30 12,50

* p ≤ 0,05 Tab. S2: P4-Werte in ng/ml von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 0,72 3,58 4,80 11,35 6,11 0,57 Tier2 1,77 2,63 4,42 5,49 5,04 1,00 Tier3 0,38 0,67 6,48 7,73 4,87 11,21 Tier4 0,43 12,16 12,4 6,27 7,08 10,30 Tier5 0,40 3,76 5,88 5,66 5,19 3,90 Tier6 0,39 5,10 3,46 5,56 5,34 4,93 Tier7 0,27 9,51 7,97 8,10 5,33 5,62 Tab. S3: P4-Werte in ng/ml von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 0,72 3,28 2,51 7,36 7,53 7,56 Tier2 1,77 0,65 2,56 5,00 5,41 10,13 Tier3 0,38 0,89 3,55 4,87 4,89 5,36 Tier4 0,43 0,68 2,47 4,19 5,41 12,51 Tier5 0,40 0,96 2,21 4,09 5,70 4,99 Tier6 0,39 0,76 2,44 4,13 5,48 4,45 Tier7 0,27 1,30 3,13 7,83 11,34 10,87

Anhang

85

Tab. S4: Luteale Größe in cm2. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag bis Tag 15 getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandlung Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

P4

(n=7)

Med 3,37 4,52 4,96 3,77 Min 2,19 3,44 4,67 3,47 Max 4,24 5,34 5,90 4,90

Placebo

(n=7)

Med 3,68 4,29 4,60 4,73 Min 2,63 3,66 3,94 3,42 Max 4,03 6,30 6,01 5,62

Tab. S5: Luteale Größe in cm2 von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 5,17 7,26 6,37 5,05 Tier2 2,99 4,78 4,88 3,46 Tier3 4,21 5,63 5,25 4,28 Tier4 3,50 4,30 4,36 2,91 Tier5 3,38 3,99 4,28 3,64 Tier6 5,10 5,50 4,97 3,85 Tier7 2,33 2,90 2,97 2,88 Tab. S6: Luteale Größe in cm2 von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 2,99 3,15 4,51 4,03 Tier2 4,40 5,60 5,46 5,90 Tier3 4,37 7,29 5,70 5,36 Tier4 2,64 4,21 3,74 3,57 Tier5 2,85 4,31 4,46 4,57 Tier6 3,04 3,60 4,19 4,17 Tier7 3,45 5,41 4,66 4,18

Anhang

86

Tab. S7: Luteale Durchblutung in cm2. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag bis Tag 15 getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandlung Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

P4 (n=7)

Med 0,64 1,13 1,70 1,53 Min 0,51 0,60 1,17 0,61 Max 0,94 1,93 1,87 2,61

Placebo (n=7)

Med 0,81 1,23 1,40 1,62 Min 0,48 0,51 0,68 1,07 Max 1,33 2,02 2,25 2,44

Tab. S8: Luteale Durchblutung in cm2 von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 0,51 0,60 1,29 0,61 Tier2 0,97 1,36 1,87 0,91 Tier3 0,94 1,93 1,87 2,61 Tier4 0,55 1,18 1,42 1,92 Tier5 0,67 1,13 1,17 1,27 Tier6 0,59 0,81 1,70 1,87 Tier7 0,64 0,73 1,87 1,53 Tab. S9: Luteale Durchblutung in cm2 von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag bis Tag 15. Tier Tag5 Tag8 Tag11 Tag15

Tier1 0,59 1,23 1,28 1,77 Tier2 1,33 2,02 2,09 2,44 Tier3 1,05 1,85 2,25 2,24 Tier4 0,81 1,17 0,94 0,98 Tier5 0,51 0,61 0,68 1,07 Tier6 1,21 1,47 1,40 1,44 Tier7 0,48 0,48 1,62 1,40

Anhang

87

Tab. S10: Follikuläre Größe (FS) und Follikuläre Durchblutung (FDB) in cm2. Dargestellt

sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behand-

lung FS FDB

Tag–2 Tag–1 Tag–0 Tag–2 Tag–1 Tag–0

P4 (n=7)

Med 1,37 1,86 2,02 0,39 0,69 0,88 Min 0,16 0,24 0,40 0,35 0,51 0,76 Max 1,93 2,19 2,69 0,91 1,14 1,21

Placebo (n=7)

Med 1,60 1,79 2,15 0,64 0,81 0,93 Min 1,47 1,50 1,58 0,58 0,47 0,76 Max 2,04 2,29 2,49 0,97 0,97 1,12

Tab. S11: Follikuläre Größe (FS) und Follikuläre Durchblutung (FDB) in cm2 von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier FS FDB

Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag-2 Tag-1 Tag-0

Tier1 # # 2,02 # # 0,82 Tier2 1,37 1,47 1,58 0,39 0,51 0,80 Tier3 1,93 2,19 2,69 0,91 1,14 1,18 Tier4 # 1,86 2,01 # 0,61 0,76 Tier5 # # 2,38 # # 0,77 Tier6 # 1,87 2,36 # 0,89 1,21 Tier7 1,18 2,07 2,09 0,35 0,69 0,96

Anhang

88

Tab. S12: Follikuläre Größe (FS) und Follikuläre Durchblutung (FDB) in cm2 von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Werte für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier FS FDB

Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag-2 Tag-1 Tag-0

Tier1 # 2,05 2,49 # 0,66 0,83 Tier2 1,70 2,09 2,15 0,58 0,87 0,93 Tier3 2,04 2,29 2,42 0,97 0,97 1,12 Tier4 1,47 1,50 2,18 0,61 0,47 0,76 Tier5 # 1,54 2,01 # 0,86 1,03 Tier6 # # 2,08 # # 1,02 Tier7 1,43 1,37 1,58 0,68 0,77 0,63 Tab. S13: Uterines Blutflussvolumen in ml/min. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandl

ung

Tag

1

Tag

2

Tag

5

Tag

8

Tag

11

Tag

15

Tag

–2

Tag

–1

Tag

–0

Tag

1

P4 (n=7)

Med 1,94 1,67 1,72 2,09 2,07 3,31 2,73 3,64 3,15 2,62 Min 1,54 1,09 1,16 1,55 1,20 0,80 1,69 1,86 2,21 1,84 Max 2,33 3,18 2,85 2,71 3,41 5,26 3,14 3,70 7,35 3,86

Placebo (n=7)

Med 1,94 1,28 1,85 1,72 2,70 3,28 2,84 3,08 3,66 1,64 Min 1,54 0,59 1,45 1,15 1,59 1,70 2,70 1,95 2,73 1,03 Max 2,33 2,01 2,24 2,47 3,50 4,25 4,34 3,76 4,51 3,10

Tab. S14: Uterines Blutflussvolumen in ml/min von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 2,26 1,67 2,85 1,76 3,41 4,60 # # 3,03 2,61 Tier2 1,56 1,55 2,27 1,87 2,66 3,31 2,73 1,90 2,21 1,84 Tier3 1,54 1,90 1,16 1,55 1,91 1,25 3,14 3,64 3,59 2,62 Tier4 1,99 1,09 1,72 2,55 2,07 0,80 # 3,64 4,56 3,86 Tier5 2,33 3,18 2,49 2,34 3,36 5,26 # # 7,35 3,83 Tier6 1,94 1,80 1,27 2,71 1,87 3,70 # 3,70 2,58 1,84 Tier7 1,61 1,50 1,62 2,09 1,20 1,00 1,69 1,86 3,15 2,86

Anhang

89

Tab. S15: Uterines Blutflussvolumen in ml/min von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 2,26 1,71 1,45 2,47 2,70 4,25 # 3,68 4,51 1,22 Tier2 1,56 0,91 2,18 2,15 3,03 4,22 2,94 3,76 3,74 2,51 Tier3 1,54 1,24 1,60 1,64 2,45 2,02 4,34 2,85 2,73 1,14 Tier4 1,99 1,28 1,90 1,15 1,83 2,41 2,70 2,45 3,66 1,64 Tier5 2,33 1,36 1,85 2,01 2,81 1,70 # 3,32 3,65 2,15 Tier6 1,94 2,01 2,24 1,72 3,50 4,03 # # 4,19 3,10 Tier7 1,61 0,59 1,60 1,52 1,59 3,28 2,74 1,95 3,12 1,03 Tab. S16: TAMV in cm/s. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandl

ung

Tag

1

Tag

2

Tag

5

Tag

8

Tag

11

Tag

15

Tag

–2

Tag

–1

Tag

–0

Tag

1

P4 (n=7)

Med 17,38

15,10

20,94

15,84

17,94

19,71

23,82

22,16

25,23

21,46

Min 15,16

13,66

9,75 12,15

15,42

12,97

20,59

7,36 15,71

10,11

Max 22,75

18,04

29,27

32,71

26,88

29,37

25,63

41,42

44,26

30,06

Placebo (n=7)

Med 17,38

12,94

16,92

16,33

20,66

23,47

28,42

22,07

30,99

16,33

Min 15,16

9,63 10,44

14,72

18,36

14,89

22,54

18,16

22,09

9,10

Max 22,75

16,71

25,23

22,92

24,58

28,14

29,43

30,40

31,70

24,94

Anhang

90

Tab. S17: TAMV in cm/s von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 15,42 13,66 21,32 12,15 17,94 22,51 # # 15,71 14,90 Tier2 18,56 15,10 23,04 15,84 26,88 29,37 25,63 17,53 21,99 21,46 Tier3 15,16 14,51 13,67 18,76 17,71 14,94 23,82 26,29 25,23 23,76 Tier4 22,75 15,75 29,27 32,71 23,22 14,73 # 41,42 42,25 17,48 Tier5 19,06 18,04 18,87 15,53 26,79 26,27 # # 44,26 25,24 Tier6 15,24 15,05 9,75 14,35 16,32 19,71 # 7,36 15,74 10,11 Tier7 17,38 15,96 20,94 18,58 15,42 12,97 20,59 22,16 28,13 30,06 Tab. S18: TAMV in cm/s von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 15,42 15,45 10,44 18,50 19,08 22,00 # 22,96 29,28 12,24 Tier2 18,56 12,94 18,98 22,92 24,58 28,14 27,87 30,40 31,48 24,94 Tier3 15,16 10,20 16,34 16,33 19,58 21,08 28,98 21,18 23,89 14,70 Tier4 22,75 16,71 25,23 16,03 18,36 23,47 29,43 25,75 31,70 20,55 Tier5 19,06 12,94 16,70 14,72 24,00 14,89 # 20,48 22,09 16,33 Tier6 15,24 13,40 16,92 16,04 20,66 25,54 # # 30,99 21,06 Tier7 17,38 9,63 17,52 18,30 21,95 24,66 22,54 18,16 31,38 9,10 Tab. S19: Pulsatility Index. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behand

-lung

Tag

1

Tag

2

Tag

5

Tag

8

Tag

11

Tag

15

Tag

–2

Tag

–1

Tag

–0

Tag

1

P4 (n=7)

Med 2,78 2,77 1,96 2,62 2,74 1,93 1,80 1,56 1,54 2,26

Min 2,28 2,01 1,82 1,77 1,56 1,52 1,66 1,32 0,95 1,63 Max 3,68 3,21 3,20 3,29 3,01 3,38 2,04 3,00 2,73 3,54 Placebo (n=7)

Med 2,78 3,35 2,51 2,46 2,30 2,16 1,66 1,73 1,58 2,21

Min 2,28 2,01 1,53 2,01 1,67 1,55 1,42 1,50 1,53 1,94 Max 3,68 4,23 3,90 3,00 2,81 2,98 2,66 2,05 2,02 3,24

Anhang

91

Tab. S20: Pulsatility Index von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 3,68 3,16 2,73 3,29 2,93 1,52 # # 2,73 3,54 Tier2 2,78 2,96 1,96 2,59 1,56 1,55 1,66 3,00 2,36 2,87 Tier3 2,28 3,21 3,200 2,62 2,74 3,38 1,80 1,60 1,54 2,24 Tier4 2,32 2,01 1,82 1,77 2,11 1,93 # 1,33 1,46 2,26 Tier5 2,80 2,74 1,88 2,69 2,19 2,03 # # 0,95 1,74 Tier6 3,42 2,24 1,96 2,31 2,80 1,69 # 1,32 1,68 2,95 Tier7 2,59 2,77 1,90 2,73 3,01 2,78 2,04 1,56 1,18 1,63 Tab. S21: Pulsatility Index von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 3,68 4,05 3,90 3,00 2,81 2,65 1,69 1,8 3,02 Tier2 2,78 3,35 2,35 2,01 2,07 1,55 1,74 2,05 1,85 1,94 Tier3 2,28 4,23 2,71 2,44 2,30 2,13 1,58 1,50 1,58 3,13 Tier4 2,32 2,01 1,53 2,46 2,34 1,55 1,42 1,60 1,53 2,21 Tier5 2,80 3,52 2,38 2,15 1,67 2,98 1,78 2,02 3,24 Tier6 3,42 3,14 2,75 2,67 1,91 2,16 1,55 2,04 Tier7 2,59 2,55 2,51 2,56 2,62 2,33 2,66 1,95 1,58 2,20 Tab. S22: Resistance Index. Dargestellt sind jeweils Median (Med), Minimum (Min) und Maximum (Max) für jeden Untersuchungstag getrennt nach P4- und Placebo-Gruppe. Behandl

ung

Tag

1

Tag

2

Tag

5

Tag

8

Tag

11

Tag

15

Tag

–2

Tag

–1

Tag

–0

Tag

1

P4 (n=7)

Med 0,93 0,94 0,84 0,88 0,88 0,81 0,79 0,81 0,79 0,91

Min 0,83 0,81 0,76 0,83 0,70 0,70 0,73 0,69 0,51 0,73 Max 1,00 0,99 0,99 0,99 0,99 0,97 0,86 0,97 0,94 0,99 Placebo (n=7)

Med 0,93 0,98 0,90 0,89 0,86 0,84 0,81 0,79 0,80 0,92

Min 0,83 0,83 0,73 0,81 0,66 0,77 0,68 0,69 0,68 0,84 Max 1,00 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 0,94 0,95 0,90 0,99 Tab. S23: Resistance Index von allen Tieren der P4-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der

Anhang

92

konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 0,99 0,99 0,94 0,96 0,93 0,75 # # 0,93 0,99 Tier2 0,92 0,98 0,87 0,92 0,76 0,78 0,76 0,96 0,93 0,95 Tier3 0,86 0,95 0,99 0,93 0,94 0,96 0,81 0,76 0,75 0,84 Tier4 0,92 0,84 0,85 0,85 0,89 0,89 # 0,85 0,82 0,93 Tier5 0,94 0,90 0,78 0,89 0,81 0,79 # # 0,59 0,77 Tier6 0,99 0,90 0,85 0,88 0,94 0,78 # 4,55 0,79 0,94 Tier7 0,90 0,90 0,79 0,88 0,90 0,90 0,82 0,73 0,66 0,77 Tab. S24: Resistance Index von allen Tieren der Placebo-Gruppe. Dargestellt sind die Mittelwerte der beiden Aa. uterinae für jeden Untersuchungstag. Ein # markiert vom Tag der konsekutiven Ovulation (Tag1) ausgehend rückwärts gezählte Tage, die je nach individueller Zykluslänge nicht bei jedem Tier vorkamen. Tier Tag1 Tag2 Tag5 Tag8 Tag11 Tag15 Tag-2 Tag-1 Tag-0 Tag1

Tier1 0,99 0,99 0,99 0,99 1,00 0,92 # 0,79 0,82 0,97 Tier2 0,92 0,99 0,87 0,87 0,86 0,79 0,83 0,89 0,89 0,87 Tier3 0,86 0,99 0,92 0,89 0,87 0,83 0,75 0,73 0,75 0,93 Tier4 0,92 0,85 0,74 0,92 0,92 0,78 0,74 0,79 0,80 0,93 Tier5 0,94 0,99 0,86 0,82 0,74 0,92 # 0,79 0,81 0,94 Tier6 0,99 0,96 0,90 0,90 0,82 0,87 # # 0,77 0,88 Tier7 0,90 0,92 0,88 0,88 0,88 0,84 0,88 0,80 0,75 0,92

Anhang

93

Tab. S25: ∆Cq-Werte in der Placebo-Gruppe. Die ∆Cq-Werte für die Gene StAR, HSD-3β, eNOS, VEGF120, VEGF164 und VEGF188 sind für jedes Tier getrennt nach dem Tag der Corpus luteum-Biopsie (Tag 8 oder 15) dargestellt.

Tier Tag ∆Cq StAR ∆Cq HSD-3β

∆Cq eNOS

∆Cq VEGF120

∆Cq VEGF164

∆Cq VEGF188

Tier1 8 2,13 4,04 -8,86 -4,64 -3,10 -5,80 15 -0,43 2,88 -7,87 -5,58 -4,51 -6,05

Tier2 8 2,05 3,08 -8,10 -5,05 -3,69 -6,14 15 2,00 3,87 -7,94 -5,45 -3,65 -6,02

Tier3 8 1,42 3,38 -7,97 -5,40 -3,73 -6,34 15 1,61 3,09 -8,46 -5,06 -3,78 -5,37

Tier4 8 2,53 3,96 -8,41 -4,47 -2,87 -5,66 15 1,54 3,72 -8,00 -5,02 -3,20 -5,21

Tier5 8 1,60 3,30 -7,81 -4,48 -2,93 -5,59 15 -0,97 3,84 -8,81 -5,39 -3,96 -6,06

Tier6 8 1,69 3,83 -7,81 -4,12 -2,86 -5,81 15 0,62 1,68 -7,34 -6,24 -4,72 -7,15

Tier7 8 0,79 2,41 -6,68 -5,90 -4,51 -6,57 15 1,80 3,83 -8,17 -5,09 -3,46 -6,01

Anhang

94

Tab. S26: ∆Cq-Werte in der P4-Gruppe. Die ∆Cq-Werte für die Gene StAR, HSD-3β, eNOS,

VEGF120, VEGF164 und VEGF188 sind für jedes Tier getrennt nach dem Tag der Corpus

luteum-Biopsie (Tag 8 oder 15) dargestellt.

Fett markiert sind die Werte der zwei Tiere deren P4-Konzentration an Tag 15 ≤ 1,0 ng/ml

war. Kursiv dargestellt sind die drei Proben, deren RNA-Konzentration nach der Isolation nur

gering war und deren ∆Cq-Werte deshalb als nicht verlässlich eingestuft wurden. Sie fanden

in der statistischen Auswertung keine Berücksichtigung.

Tier Tag ∆Cq StAR ∆Cq HSD-3β

∆Cq eNOS

∆Cq VEGF120

∆Cq VEGF164

∆Cq VEGF188

Tier1 8 0,16 2,44 -8,48 -6,49 -5,48 -4,33 15 -2,69 -2,11 -5,71 -4,58 -2,61 -2,27

Tier2 8 1,76 3,21 -7,90 -5,43 -4,83 -3,02 15 -3,03 -1,76 -7,98 -8,13 -7,46 -6,42

Tier3 8 0,21 2,23 -8,49 -6,02 -5,19 -3,75 15 2,09 3,59 -8,83 -5,59 -4,54 -3,27

Tier4 8 0,99 3,02 -7,15 -5,17 -4,42 -3,01 15 0,36 3,60 -7,76 -5,89 -5,91 -4,47

Tier5 8 -0,05 1,52 -6,91 -4,56 -6,09 -5,45 15 -1,21 0,22 -6,61 -5,16 -7,74 -6,63

Tier6 8 1,00 2,75 -8,28 -5,76 -4,67 -3,31 15 1,09 3,44 -7,39 -5,96 -5,25 -4,00

Tier7 8 1,54 3,75 -7,84 -5,38 -4,22 -2,55 15 1,66 3,93 -7,39 -7,95 -4,70 -3,17

Anhang

95

Tab. S27: Zusammenhänge (Korrelationskoeffizienten (r) und Irrtumswahrscheinlichkeit (p)) zwischen den untersuchten Parametern. Dargestellt ist die Korrelation der P4-Konzentration zu den Parametern TAMV, BFV, PI, RI, LS, LDB, FS und FDB, sowie der LS zur LDB und TAMV zu PI für jeden Untersuchungstag. Para-

meter

Tag

1

Tag

2

Tag

5

Tag

8

Tag

11

Tag

15

Tag

–2

Tag

–1

Tag

–0

Tag

1

P4 : TAMV

r:0,43

p:0,34

r:0,54 p:0,22

r:0,40 p:0,38

r:0,00 p:1,00

r:-0,14 p:0,76

r:-0,75 p:0,05

r:-0,50 p:0,67

r:0,80 p:0,10

r:0,71 p:0,07

r:0,04 p:0,94

P4 :

BFV r:0,29 p:0,53

r:-0,57 p:0,18

r:-0,14 p:0,76

r:-0,46 p:0,29

r:0,11 p:0,82

r:-0,71 p:0,07

r:-1,00 p:<,01*

r:0,10 p:0,87

r:0,46 p:0,29

r:0,11 p:0,82

P4 :

PI r:0,39 p:0,38

r:-0,86 p:0,01*

r:-0,45 p:0,31

r:0,68 p:0,09

r:0,21 p:0,64

r:0,82 p:0,02*

r:0,50 p:0,67

r:-0,40 p:0,50

r:-0,68 p:0,09

r:0,14 p:0,76

P4 :

RI r:0,45 p:0,30

r:-0,82 p:0,03*

r:-0,18 p:0,70

r:0,29 p:0,53

r:0,07 p:0,88

r:0,90 p:0,01*

r:0,50 p:0,67

r:-0,60

p:0,28 r:-0,41 p:0,36

r:0,38 p:0,40

P4 :

LS - -

r:-0,36 p:0,43

r:0,18 p:0,70

r:0,00 p:1,00

r:-0,29 p:0,53

r:0,50 p:0,67

r:-0,30 p:0,62

r:-0,26 p:0,62

r:0,00 p:1,00

P4 :

LDB - -

r:-0,04 p:0,94

r:-0,50 p:0,25

r:-0,52 p:0,23

r:0,96 p:<,01*

r:0,50 p:0,67

r:0,30 p:0,62

r:0,14 p:0,76

r:0,18 p:0,70

P4 :

FS - - - - - -

r:-1,00 p:<,01*

r:-0,10 p:0,87

r:-0,54 p:0,22

-

P4 :

FDB - - - - - -

r:-1,00 p:<,01*

r:0,10 p:0,87

r:-0,60 p:0,21

-

LS :

LDB - -

r:-0,46 p:0,29

r:0,04 p:0,94

r:-0,04 p:0,94

r:-0,14 p:0,76

r:1,00 p:<,01*

r:0,50 p:0,39

r:0,83 p:0,04*

r:0,51 p:0,24

TAMV :

PI r:-0,07 p:0,88

r:-0,57 p:0,18

r:-0,41 p:0,36

r:-0,46 p:0,29

r:-0,86 p:0,01*

r:-0,57 p:0,18

r:-1,00 p:<,01*

r:0,10 p:0,87

r:-0,93 p:<,01*

r:-0,93 p:<,01*

* p ≤ 0,05

96

DANKSAGUNG

Es ist mir nicht nur ein Bedürfnis sondern auch eine große Freude, den Menschen zu danken, die mir so viel Hilfe zukommen ließen vor und während der Anfertigung dieser Dissertation.

Prof. Dr. Heinrich Bollwein kann ich nicht genug danken, für die Erlaubnis, in der Rinderklinik hospitieren zu dürfen, dadurch fand ich den Wiedereinstieg in diesen Beruf. Auch für die anschließende Überlassung dieses interessanten Themas, für seine unermüdliche Geduld und sein unentwegtes Engagement bei der Korrektur dieser Dissertation danke ich ihm.

Ganz herzlich möchte ich mich bei Dr. Kathrin Herzog für ihre aufmunternden Worte und die Betreuung bedanken. Ihre ruhige und motivierende Art bei den Gesprächen trieb mich immer wieder an, weiter zu machen.

Ein großes Dankeschön gilt Dr. Klaas Strüve für die Betreuung und die Entnahme der Gelbkörperbioptate. Die nette Zusammenarbeit bei den Biopsien und die Sitzungen bei der Korrektur werden in guter Erinnerung bleiben.

Herzlich bedanke ich mich bei Prof. Dr. Marion Schmicke für die Untersuchung der Blutproben im Labor der Endokrinologie an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover und für die kompetente Beratung.

Prof. Dr. Susanne Ulbrich danke ich für die Koordination der Genexpressionsanalyse am Institut der TU München und für die Beratung.

Danken möchte ich auch Prof. Dr. Martina Hoedemaker für die Chance Teil des Projektes zu sein und anschließend für Doktorandenstelle in der Klinik.

Ich möchte meinen drei Kollegen vom Projekt für ihre Zusicherung, dass ich es schaffen werde, danken. Frieder, ich danke dir, dass du mit mir ein Zimmer geteilt, mich über die Jahre ausgehalten und mich in jeglicher Hinsicht immer wieder aufgebaut hast. Anika , ich danke dir für deine beruhigende und warmherzige Freundlichkeit und deine Hilfe, die du mir entgegenbracht hast, besonders zu Anfang des Projektes. Resi, ich danke dir dafür, dass du eine Wucht voller Kompetenzen bist, du hast mich unerwartet aber sehr angenehm getroffen. Und auch dafür, dass du immer hinter mir stehst. Ich danke euch, dass ihr mich ins Projekt geholt habt. Ich danke auch Sabrina, auch wenn sie nicht zum Projekt gehörte, für alles. Ich danke euch vier dafür, dass ihr in mein Leben getreten seid und es bereichert habt.

Zum Schluss bedanke ich mich bei meinen Mitdoktoranden und den Tierpflegern der Klinik für Rinder.

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