Untersuchungen zur Regulation der jejunalen Calcium ... · Tierärztliche Hochschule Hannover...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Regulation

der jejunalen Calcium-Resorption beim Schaf

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Nina Mrochen

Mainz

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder

Physiologisches Institut

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder

2. Gutachter: Prof. Dr. H. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2010

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHR 342/8-1)

unterstützt.

Für Lea

Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht bzw. auf Tagungen

vorgestellt:

Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):

Gastrointestinal calcium (Ca) transport in sheep as affected by dietary Ca and treatment with

1.25-dihydroxyvitamin D3.

Poster: XIth International Symposium on Ruminant Physiology

06. - 09.09.2009 in Clermont - Ferrand

Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):

Effect of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 on macromineral homeostasis of sheep fed different

levels of calcium.

Poster: 14th Workshop on Vitamin D

04. - 08.10.2009 in Brügge

Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):

Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on calcium and phosphorus homeostasis in sheep fed

diets either adequate or restricted in calcium content.

Domestic Animal Endocrinology 38 (2010) 190 - 199

Mrochen, N., Wilkens, M., Breves, G., Schröder, B. (2010):

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum intestinalen Calcium-Transport beim

Schaf.

Vortrag: 19. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen

Veterinärmedizinischen Gesellschaft

14. - 16.02.2010 in Hannover

Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):

Gastrointestinal calcium transport in sheep as affected by calcitriol and dietary calcium

supply.

Vortrag: 14th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition

06. - 08.09.2010 in Zürich

Inhaltsverzeichnis

I

Abkürzungsverzeichnis...................................................................................... IV

Abbildungsverzeichnis....................................................................................... VI

Tabellenverzeichnis ............................................................................................ IX

1 Einleitung ............................................................................................ 1

1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase ............... 1

1.2 Mechanismen des intestinalen Ca2+-Transports ...................................... 3

1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport ............................................................... 4

1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport .............................................................. 4

1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle ..................... 4

1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin ...................................... 6

1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran .................................... 7

1.3 Regulation des intestinalen Ca2+-Transports ........................................... 8

1.4 Gastrointestinaler Ca2+-Transport beim Wiederkäuer ............................. 9

1.5 Zielsetzung ............................................................................................... 12

2 Material und Methoden ................................................................... 13

2.1 Material ..................................................................................................... 13

2.1.1 Tiere ................................................................................................... 13

2.1.2 Fütterung ............................................................................................ 13

2.1.3 Behandlung ......................................................................................... 14

2.1.4 Entnahme der Blutproben ................................................................... 15

2.1.5 Entnahme der Gewebeproben ............................................................ 16

2.2 Analytische Methoden ............................................................................. 16

2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben ................................. 16

2.2.1.1 Gesamtcalcium ................................................................................... 16

2.2.1.2 Phosphat ............................................................................................. 17

2.2.1.3 Calcitriol .............................................................................................. 18

2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen.................................... 18

2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen ......................................... 19

2.2.3.1 Alkalische Phosphatase ...................................................................... 19

2.2.3.2 Na+/K+-ATPase ................................................................................... 19

2.3 Präparative Methoden .............................................................................. 20

2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese ................................................... 20

2.3.2 Präparation von Rohmembranen ........................................................ 22

2.3.3. Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV) .......... 22

2.4 Expressionsstudien ................................................................................. 26

2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................................... 26

2.4.1.1 ß-Aktin PCR ........................................................................................ 27

2.4.2 Die quantitative RT-PCR ..................................................................... 27

2.4.2.1 Standardreihe für die Quantifizierung PMCA-spezifischer Transkripte 27

2.4.2.2 TaqMan-PCR ...................................................................................... 31

Inhaltsverzeichnis

II

2.4.2.3 Auswertung ......................................................................................... 32

2.4.3. Western Blot Analysen ........................................................................ 33

2.4.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese ...................................................... 33

2.4.3.2 Tank-Blot-Verfahren ............................................................................ 33

2.4.3.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen .......................................... 34

2.4.3.4 Überprüfung der Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA ............. 35

2.4.3.5 Enzymatische Deglykosilierung des TRPV6-Proteins.......................... 36

2.5 Funktionelle Studien ................................................................................ 36

2.5.1 Durchführung der Aufnahmestudien in BSMV ..................................... 36

2.5.2 Berechnung von [Ca2+]frei .................................................................... 37

2.5.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme ................... 38

2.5.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme ................... 38

2.5.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme . 39

2.5.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen . 39

2.5.8 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die Calciumaufnahme in jejunale BSMV .................................................... 41

2.6 Statistik ..................................................................................................... 41

3 Ergebnisse ........................................................................................ 42

3.1 Charakterisierung des Tiermodells......................................................... 42

3.1.1 Einfluss der Fütterung auf wichtige Blutparameter .............................. 42

3.1.2 Unterschiede der Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma 12 h nach der Behandlung .......................................................................... 43

3.2 RNA-Expression ....................................................................................... 43

3.3 Nachweis und Quantifizierung der spezifischen Transport-proteine im Jejunum ............................................................................................... 45

3.3.1 Semiquantitative Detektion des TRPV6-Proteins ................................ 45

3.3.2 Spezifität des PMCA-Protein-Nachweises ........................................... 48

3.3.3 Semiquantitative Detektion des PMCA-Proteins .................................. 49

3.4 Charakterisierung der BSMV ................................................................... 51

3.4.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktionen ............................ 51

3.4.2 Überprüfung der Funktionsfähigkeit der BSMV ................................... 52

3.4.2 Ca2+-Aufnahmeraten in jejunale BSMV ............................................... 54

3.4.3 Der Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV ................................................................ 58

4 Diskussion ........................................................................................ 59

4.1 Beurteilung des Tiermodells ................................................................... 59

4.2 Beurteilung der angewandten Methoden ............................................... 60

4.2.1 Quantitative RT-PCR .......................................................................... 60

4.2.2 Western Analyse ................................................................................. 61

4.2.3 Qualität der BSMV .............................................................................. 64

4.2.4 Bestimmung der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV............................. 66

Inhaltsverzeichnis

III

4.3 Effekt der Calcium-Depletion bzw. der Calcitriolbehandlung auf die Ca2+-Transportkomponenten im Jejunum .............................................. 70

4.3.1 Expressionsstudien ............................................................................. 70

4.3.2 Funktionelle Untersuchungen .............................................................. 75

4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick.......................................................... 81

5 Zusammenfassung .......................................................................... 83

6 Summary ........................................................................................... 85

7 Literaturverzeichnis ......................................................................... 87

Anhang .................................................................................................. 102

A. Puffer und Lösungen für die Präparation von Gesamtmembranen und BSMV ............................................................................................... 102

B. Puffer und Lösungen für die Western Analyse .................................... 103

C. Puffer für die funktionellen Untersuchungen ....................................... 104

Danksagung .......................................................................................... 105

Abkürzungsverzeichnis

IV


Abb. Abbildung

ANOVA analysis of variance (Varianzanalyse)

A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

A. bidest. Aqua bidestillata

ATP(ase) Adenosintriphosphat(ase)

bp base pairs (Basenpaare)

BSMV Bürstensaummembranvesikel

Ca2+ ionisiertes Calcium

[Ca2+]frei Konzentration freier Ca2+-Ionen

CaCo-2 colorectal adenocarcinoma cells (coloraktale Adenokarzinom Zellen)

cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)

cpm counts per minute (Impulse pro Minute)

Ct threshold cycle (PCR-Zyklus, in dem die Reporterfluoreszenz die

Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP 2′-Desoxyribonukleosid-5′-triphosphat

DTT Dithiothreitol

EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat

g Vielfaches der Erd- oder Normalbeschleunigung (gn = 9,80665 m · s-2)

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

h hour (Stunde)

HEK human embyonic kidney (Nierenzellkultur)

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N′-2-ethansulfonsäure

i. m. intramuskulär

i. v. intravenös


V

Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante,

Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport

MDBK Madin-Darby bovine kidney (Nierenzellkultur)

min Minute(n)

NCX Na+/Ca2+- exchanger (Na+/Ca2+-Austauscher)

p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit)

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PMCA Plasmamembran-Ca2+-ATPase

PMSF Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride

PTH Parathormon

RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes)

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

TRP(V) transient receptor potential (vannilloid) channel

U unit

uS ursprüngliche Substanz

VDR Vitamin D-Rezeptor

VDRE vitamin D responsive element

Vmax maximale Aufnahmerate

WT Wildtyp

x arithmetisches Mittel

Abbildungsverzeichnis

VI


Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in

intestinalen (Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien

(Calbindin-D28K-vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im

Text (1.2.2.1 bis 1.2.2.3); Wilkens 2006. ........................................... 7

Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV (g

bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte

Zentrifugationsdauer). ..................................................................... 25

Abb. 3.1: Darstellung der mRNA-Gehalte an GAPDH im Jejunum adäquat bzw.

restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol-

bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in

Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA. .................................... 44

Abb. 3.2: Darstellung der mRNA-Gehalte an TRPV6 im Verhältnis zu GAPDH

im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12

Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM,

Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: ***:

p < 0,001. ........................................................................................ 44

Abb. 3.3: Darstellung der mRNA-Gehalte an PMCA im Verhältnis zu GAPDH


Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM,

Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: *: p

< 0,05, ***: p < 0,001. ...................................................................... 45

Abb. 3.4: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des TRPV6-

Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische

Membran: unbehandelte und behandelte Tiere der Calcium-

Depletions-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit einem

unbehandelten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ......................... 46

Abb. 3.5: Der zur Abbildung 3.4 dazugehörige semiquantitative Nachweis von

Villin ................................................................................................ 46

Abb. 3.6: Densitometrische Werte der TRPV6-Expression bezogen auf die

Villin-Expression, auf der betreffenden Membran sind jeweils fünf

unbehandelte und fünf behandelte Tiere der Kontrollfütterungsgruppe

aufgetragen. .................................................................................... 47

Abb. 3.7: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler

Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12

Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung

(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der

unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der

behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl


VII

der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05,

**: p < 0,01. ..................................................................................... 47




(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat

gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Ca-

restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM,

Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *:

p < 0,05, **: p < 0,01. ...................................................................... 48

Abb. 3.9: Überprüfung der PMCA-Antikörper-Spezifität an Gesamtmembranen

verschiedener Darmabschnitte von Ratte (1), Huhn (2), Jejunum (3),

Colon (4) und Pansen (5) vom Schaf. ............................................. 49

Abb. 3.10: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des PMCA-


Membran: behandelte Tiere der Calcium-Depletions- bzw. der

Kontroll-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit den restriktiv

gefütterten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ................................ 49

Abb. 3.11: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler


Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-

Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der



der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p <

0,05. ................................................................................................ 50





adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression

der Calcium-restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese

aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse

des Students t-Tests: *: p < 0,05.................................................... 50

Abb. 3.13: Zeitabhängige Glukoseaufnahme in jejunale BSMV bei RT und

0,05 mmol∙l-1 Glukose in An- und Abwesenheit von Na+ im

Inkubationsmedium. ........................................................................ 53

Abb. 3.14: A23187-Quotient (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz

des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-


VIII

Konzentration von 0,09 mmol∙l-1) der vier Versuchsgruppen ( x ±

SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way

ANOVA: ***: p < 0,001. .................................................................. 53

Abb. 3.15: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV mit und ohne

Zusatz des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-

Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ..................................................... 54

Abb. 3.16: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV in den ersten 50 s

bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ........ 55

Abb. 3.17: Ca2+-Gesamtaufnahmerate in jejunale BSMV bei RT mit den

dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den daraus

resultierenden spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten und den

berechneten Vmax und Km-Werten von 2 Schafen. ........................... 56

Abb. 3.18: Spezifische Ca2+-Aufnahmerate in jejunale BSMV unbehandelter

(gestrichelte Linien) bzw. mit Calcitriol behandelter (durchgezogene

Linien), adäquat (schwarze Linien) bzw. restriktiv mit Calcium (graue

Linien) versorgter Schafe in Abhängigkeit von der freien Ca2+-

Konzentration (Kurven stellen Mittelwerte von je 5 Tieren da). ........ 57

Abb.3.19: Maximale Transportkapazität (Vmax) der Ca2+-Aufnahme in jejunale

BSMV der vier Gruppen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);

Ergebnisse der 2-way ANOVA. ....................................................... 57

Abb. 3.20: Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV der vier Gruppen ( x

± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way

ANOVA. .......................................................................................... 58

Abb. 4.1: Korrelation von PMCA mRNA mit TRPV6 mRNA. ........................... 71

Abb. 4.2: Ca2+-Gesamtaufnahme nach 30 s bei freier Ca2+-Konzentration von

0,09 mmol∙l-1 in jejunale BSMV von adäquat bzw. restriktiv mit

Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-

Behandlung ..................................................................................... 79

Tabellenverzeichnis

IX

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz

(uS)) ................................................................................................ 14

Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro

Tier und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4

Wochen) in g bzw. % der TS ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere) ....... 15

Tabelle 2.3: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von β-Aktin .............. 27

Tabelle 2.4: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von PMCA1b ........... 28

Tabelle 2.5: Pipettierschema der PMCA-PCR..................................................... 28

Tabelle 2.7: Pipettierschema der TaqMan-PCR .................................................. 32

Tabelle 2.8: Sondensequenz .............................................................................. 32

Tabelle 2.7: Antikörper und Inkubationsbedingungen für den spezifischen

Proteinnachweis .............................................................................. 35

Tabelle 3.1: Ca-, Ca2+-, Pi- und Calcitriol-Konzentration im Plasma (Ca, Pi,

Calcitriol) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen nach einer mindestens

vierwöchigen diätetischen Calcium-Depletion ( x ± SEM, n = Anzahl

der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p <

0,01, ***: p < 0,001 .......................................................................... 42

Tabelle 3.2: Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma (Ca, Pi) bzw. Vollblut

(Ca2+) von Schafen 12 h nach Calcitriolbehandlung, Vergleich

zwischen den behandelten und den unbehandelten Tieren einer

Fütterungsgruppe ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des

Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 ................ 43

Tabelle 3.3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der

Na+/K+-ATPase im Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension.

Darstellung der Anreicherungsfaktoren als Quotient aus den Werten

von Suspension und Homogenat. Relative Anreicherung wurde als

Quotient aus BSM:BLM dargestellt. ( x ± SEM, n = Anzahl der

Tiere) ............................................................................................ 51

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase

Calcium besitzt nicht nur in seiner ionisierten Form die Funktion eines Second

messengers, sondern ist auch darüber hinaus in vielfältiger Weise an verschiedenen

Abläufen innerhalb des Körpers, wie zum Beispiel der Muskelkontraktion, der

präsynaptischen Ausschüttung von Neurotransmittern, der Blutgerinnung sowie der

Sekretionstätigkeit verschiedener Drüsen, beteiligt (RAMASAMY 2006). Es ist daher

essentiell, dass die Calcium-Konzentration im Plasma konstant gehalten wird, bei

den meisten Säugetieren je nach Alter und Spezies zwischen 2,2 und 2,5 mmol∙l-1

(SCHRÖDER & BREVES 2006).

Für die enge Regulation des Plasmacalciumspiegels sind die drei Hormone Calcitriol,

Parathormon (PTH) und Calcitonin, die in unterschiedlicher Weise auf den

Gastrointestinaltrakt, die Niere und das Skelettsystem wirken, von entscheidender

Bedeutung (RAMASAMY 2006).

Das Steroidhormon Calcitriol, die biologisch aktivste Form des Vitamin D, entsteht im

Körper durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere aus dem mit der

pflanzlichen Nahrung als Ergocalciferol (Vitamin D2) aufgenommenen oder mit der

tierischen Nahrung aufgenommenen bzw. UV-Licht-abhängig körpereigen

gebildetem Prohormon Vitamin D3 (Cholcalciferol). Der in der Niere ablaufende

zweite Hydroxylierungsschritt am C1 wird durch die 1α-Hydroxylase katalysiert,

deren Aktivität streng reguliert ist (FRASER & KODICEK 1970). Ein erniedrigter

Calciumspiegel (BUSHINSKY et al. 1985), ein niedriger Phosphatspiegel (TANAKA

&DELUCA 1973), sowie erhöhtes PTH (GARABEDIAN et al. 1972) führen zu einer

Aktivierung des Enzyms. Calcitriol selbst wirkt über negative Feedback-

Mechanismen hemmend auf die 1α-Hydroxylase (TRECHSEL et al. 1979, SHINKI et

al. 1997).

Calcitriol wirkt über eine gesteigerte Expression von Strukturen, die an der

gastrointestinalen Resorption (siehe auch 1.2.2) und der renalen Rückresorption von

Calcium beteiligt sind, stimulierend auf die Aufnahme aus der Nahrung und hemmt

gleichzeitig dessen renale Ausscheidung (HOENDEROP et al. 2005). Vermittelt wird

die genomische Wirkung durch Bindung an einen spezialisierten Vitamin D-Rezeptor

(VDR), der als ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor fungiert und sich nach Bildung

eines Heterodimers mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR) an Vitamin D-abhängige

Einleitung

2

Elemente (VDREs) in den Promotorregionen der entsprechenden Zielgene anlagert

und so die Transkription reguliert (HOENDEROP et al. 2005). Am Knochen kann

Calcitriol auf unterschiedliche Weise wirken. Zum einen unterstützt ein erhöhter

Calcitriolspiegel die Mineralisierung des Skelettsystems, dabei handelt es sich aber

vermutlich um einen indirekten Effekt durch die vermehrte Bereitstellung von Calcium

im Blut. Zum anderen fördert Calcitriol im Zusammenspiel mit PTH die Mobilisation

von Calcium aus dem Knochen (BROWN et al. 1999).

Neben den relativ langsamen genomischen Effekten konnten auch Calcitriol-

Wirkungen beobachtet werden, die innerhalb von Sekunden bzw. Minuten eintreten.

Bei Hühnern kam es durch Zugabe von Calcitriol ins Lumen innerhalb von wenigen

Minuten zu einer Steigerung des Calcium-Transportes im Duodenum (NEMERE et

al. 1984). Bei dem als „Transcaltachia“ bezeichneten Vorgang wird Calcium apikal in

endozytotische Vesikel aufgenommen und nach Verschmelzung mit Lysosomen zur

basolateralen Seite transportiert, wo es durch Exozytose freigesetzt wird. Als

membranständiger Rezeptor, der diese nichtgenomische Wirkung vermitteln soll,

wurde der 1,25D3-MARRS identifiziert (NEMERE et al. 2004).

Das in der Nebenschilddrüse gebildete Parathormon (PTH), ein Peptidhormon mit 84

Aminosäuren, spielt unter physiologischen Bedingungen eine entscheidende Rolle

bei der Regulation kurzzeitiger Schwankungen des Plasmacalciumlevels

(HOENDEROP et al. 2005). Bei einem vom Calcium-sensing-Rezeptor (CaR)

registrierten Abfall der Ca2+-Konzentration wird PTH, aufgrund der Speicherung in

Form von Sekretgranula in der Nebenschilddrüse, innerhalb weniger Sekunden

freigesetzt (BROWN & MACLEOD 2001) und wirkt hauptsächlich an Niere und

Knochen über Bindung an den membranständigen Parathormon-Rezeptor. PTH

steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium in der Niere (GREGER et al. 1978)

und fördert die Mobilisation aus dem Knochen. Außerdem erhöht PTH durch

Aktivierung der 1α-Hydroxylase die Synthese von Calcitriol und wirkt somit indirekt

auch auf die intestinale Calciumresorption (HOENDEROP et al. 2005). Eine

längerfristige pathologische Erniedrigung des Calciumspiegels bzw. eine Calcium-

Phosphor-Imbalanz kann zu einem sekundären Hyperparathyreoidismus mit

dauerhaft erhöhten PTH-Spiegeln führen.

Calcitonin, ein Peptidhormon mit 32 Aminosäuren, wird bei einem erhöhten

Plasmacalciumspiegel aus den C-Zellen der Schilddrüse freigesetzt. Durch

Einleitung

3

Unterdrückung der resorptiven Effekte von PTH am Knochen fördert Calcitonin eine

vermehrte Einlagerung von Calcium in das Skelettsystem (PECHET et al. 1967).

Physiologischerweise auftretende, vorübergehende Belastungen der Calcium-

Homöostase, wie z.B. ein erhöhter Bedarf während des Wachstums oder eine

verminderte Verfügbarkeit von Calcium in der Nahrung, erfordern ein komplexes

Zusammenspiel der genannten Regulationsmechanismen. Besondere

Herausforderungen treten dabei beim weiblichen Tier auf. Bedingt durch die massive

Bedarfserhöhung während der Trächtigkeit und die sehr plötzlich eintretende

zusätzliche Belastung des Calcium-Haushaltes durch Einsetzen der Laktation muss

die Adaptation besonders effizient bzw. schnell erfolgen.

Da beim Wiederkäuer negative Calcium-Bilanzen nicht durch Verminderung der

basal schon sehr niedrigen renalen Calcium-Ausscheidung ausgeglichen werden

können (BRAITHWAITE & RIAZUDDIN 1971), geschieht dies vermutlich

hauptsächlich durch eine vermehrte Mobilisation aus dem Skelett und eine

Steigerung der Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt.

Beim monogastrischen Tier findet eine regulierte und bei erhöhtem Bedarf

entsprechend angepasste intestinale Resorption hauptsächlich im Duodenum statt

(PANSU et al. 1983). Aus zahlreichen Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass sich

die Lokalisation und die genauen Mechanismen der gastrointestinalen Calcium-

Resorption des Wiederkäuers von denen des monogastrischen Tieres zumindest

teilweise unterscheiden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass das Duodenum

weder beim Rind noch beim Schaf eine bedeutende Rolle für die intestinale

Absorption von Calcium hat (siehe 1.4). Stattdessen scheint beim Wiederkäuer,

neben der präintestinalen Calcium-Aufnahme, die Resorption schwerpunktmäßig im

Jejunum lokalisiert zu sein. (PHILLIPSON & STORRY 1965, BEN-GHEDALIA et al.

1975, SCHRÖDER & BREVES 2006).

1.2 Mechanismen des intestinalen Ca2+

-Transports

Der intestinale Transport von Calcium in seiner ionisierten Form (Ca2+) kann

prinzipiell auf zwei unterschiedlichen Wegen ablaufen: parazellulär über einen nicht-

sättigbaren, passiv verlaufenden Transport und transzellulär über einen aktiven

Transport.

Einleitung

4

1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport

Der parazelluläre Ca2+-Transport über die Tight junctions stellt einen von der

luminalen Konzentration und dem elektrischen Gradienten abhängigen

Diffusionsprozess dar, der prinzipiell entlang der gesamten Darmachse stattfinden

kann (BRONNER et al. 1986). Da die Menge an parazellulär transportiertem Ca2+

positiv mit der Verweildauer des Chymus in den einzelnen Darmabschnitten

korreliert, tritt bei normaler Calcium-Versorgung diese Transportform beim

monogastrischen Tier vor allem im distalen Dünndarm, d. h. im Ileum auf (BRONNER

2003), wo die mittlere Verweildauer mit 100-120 min um ein Vielfaches größer ist als

im Duodenum mit nur 2-6 min (MARCUS & LENGEMANN 1962). Die quantitative

Bedeutung des parazellulären Transports am Gesamt-Ca2+-Transport ist von der

alimentären Calcium-Versorgung abhängig (BRONNER & PANSU 1999).

Eine weitere mögliche Triebkraft des parazellulären Transports stellt der Solvent

drag-Mechanismus dar. Hierbei wird durch aktive Resorption anderer Stoffe, wie zum

Beispiel Na+-Ionen oder Glukose ein osmotischer Gradient erzeugt, der zu einem

parazellulären Nachströmen von Wasser mit den darin gelösten Ionen, unter

anderem Calcium, führt (KARBACH 1992).

1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport

Der transzelluläre Ca2+-Transport ist ein sättigbarer, aktiv ablaufender Prozess, der

Ca2+ prinzipiell auch gegen einen Gradienten aus dem Darmlumen ins Blut

transportiert. Mengenmäßig tritt diese Transportform besonders in

Belastungssituationen, wie einer niedrigen Calciumverfügbarkeit in der Nahrung, in

den Vordergrund (BRONNER & PANSU 1999). Er gliedert sich in drei Teilschritte

(apikaler Calcium-Einstrom, cytosolischer Calcium-Transfer, basolaterale Calcium-

Ausschleusung) (BRONNER et al. 1986, BRONNER 1992). Beim monogastrischen

Tier ist er hauptsächlich im proximalen Dünndarm, vor allem im Duodenum lokalisiert

und unterliegt einer Regulation durch Calcitriol (PANSU et al. 1983, BRONNER

1992).

1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle

Der Einstrom von Ca2+ in die Zelle erfolgt passiv entlang eines steilen

elektrochemischen Gradienten durch zwei einander sehr ähnliche, spezifische Ca2+-

Einleitung

5

Kanäle (TRPV5 und TRPV6) der Bürstensaummembran. Die initiale Calcium-

Aufnahme über die TRPV-Kanäle wird als geschwindigkeitslimitierender Schritt des

Gesamtprozesses angesehen. (HOENDEROP et al. 2002a, NIJENHUIS et al. 2005).

Der TRPV5-Kanal wurde erstmals in Niere, Dünndarm und Plazenta des Kaninchens

beschrieben (HOENDEROP et al. 1999), zeitnah dazu konnte der TRPV6-Kanal im

Darm der Ratte gezeigt werden (PENG et al. 1999). In der Folge konnten diese

Kanäle bei weiteren Spezies, u. a. bei der Maus (SUZUKI et al. 2000), dem

Menschen (PENG et al. 2000), beim Schwein (HINTERDING 2002; CHOI et al.

2009) und beim Schaf (WILKENS et al. 2009), nachgewiesen werden. Beide Kanäle

gehören zur TRP-Familie (transient receptor potential) und werden auf Grund ihrer

Sequenzhomologie, zusammen mit TRPV1-4 der Subfamilie der TRPV-Kanäle

(Vanilloid) zugeordnet.

Wie alle Kanäle der TRP-Familie sind sie aus vier Untereinheiten mit sechs

Transmembrandomänen aufgebaut und weisen mehrere N-terminale Ankyrin-Motive

auf (HOENDEROP et al. 1999). TRPV5 und TRPV6 zeigen eine 75%-Homologie auf

AS-Ebene, wobei Unterschiede hauptsächlich in den N- und C-terminalen

Segmenten lokalisiert sind (PENG et al. 1999, PENG et al. 2003).

In der TRP-Familie bilden sie eine Gruppe hochselektiver Ca2+-Kanäle, die bei

physiologischem Membranpotenzial konstitutiv geöffnet sind (VENNEKENS et al.

2000). Beide werden durch ein Ansteigen der intrazellulären Ca2+-Konzentration

inaktiviert, wobei dieser Prozess bei TRPV6 durch eine initiale, gefolgt von einer

langsameren Inaktivierungsphase charakterisiert ist während TRPV5 nur die

langsame Inaktivierungsphase zeigt (HOENDEROP et al. 2002a). Eine verglichen

mit TRPV6 100-fach höhere Affinität des TRPV5-Kanals zu dem Inhibitor Ruthenium

Rot zeigt einen weiteren Unterschied der funktionellen Eigenschaften (HOENDEROP

et al. 2001).

TRPV5 und TRPV6 werden in Niere, Darm und anderen Geweben wie Pankreas,

Prostata, Hoden und Speicheldrüse (HOENDEROP et al. 1999; HOENDEROP et al.

2001) coexprimiert, wobei TRPV5 jedoch die wichtigste Isoform in der Niere ist. Im

Darm ist TRPV6 quantitativ am bedeutendsten und entscheidend an der regulierten

Calcium-Resorption beteiligt. Deutlich wird dies am Beispiel eines TRPV6-Knockout

Modells. Die Mäuse waren zwar lebensfähig, zeigten jedoch eine deutlich reduzierte

intestinale Ca2+-Absortion (40%), mangelnde Gewichtszunahmen, eine geringere

Knochendichte und eine verminderte Fruchtbarkeit, wobei die Serum-Calciumspiegel

Einleitung

6

bei adäquater Versorgung unbeeinflusst waren. Bei einer zusätzlichen alimentären

Calcium-Depletion entwickelten die Tiere eine Hypocalcämie (BIANCO et al. 2007).

1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin

Beim zweiten Teilschritt des transzellulären Transports müssen die eingeströmten

Ca2+-Ionen durch das Cytosol auf die basolaterale Seite transportiert werden.

Gleichzeitig muss aber sichergestellt sein, dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration

niedrig gehalten wird, damit die Second messenger-Funktion des freien Ca2+ erhalten

bleibt. Erreicht wird dies durch Calcium-bindende Proteine, deren Funktion

hauptsächlich darin besteht, die Ca2+-Ionen im Cytosol abzupuffern (SCHRÖDER et

al. 1996). Außerdem vermitteln sie einen 70-mal schnelleren Transport von Ca2+

durch die Zelle, verglichen mit freier Diffusion der Ionen (BRONNER et al. 1986). Von

einigen Autoren wird angegeben, dass dieser Schritt des cytosolischen Transfers

geschwindigkeitslimitierend für den transzellulären Transport zu sein scheint, da im

Duodenum der Ratte ein linearer Zusammenhang zwischen Calbindin-Menge und

Transportrate besteht (SLEPCHENKO & BRONNER 2001). In einer Studie an

CaCo-2 Zellen gingen hohe Calbindin-Konzentrationen jedoch nicht mit einer

erhöhten Calcium-Transportrate einher (FLEET et al. 2002). SPENCER et al. (1976)

konnten zeigen, dass es bei rachitischen Hühnern nach einer Calcitriolbehandlung zu

einem Anstieg der Calbindin-D28K-Konzentration mit einem Maximum nach 48 h

kommt. Die ebenfalls erhöhte Calcium-Absorption konnte nicht über den gleichen

Zeitraum beobachtet werden, sie erreichte ihr Maximum bereits 8 h nach Behandlung

und fiel dann wieder ab auf 25% der maximalen Rate nach 48 h.

Anhand des Molekulargewichts unterscheidet man zwei Typen des Calcium-

Bindungsproteins, Calbindin-D9K und Calbindin-D28K. Beide Proteine sind strukturell

nicht verwandt. Calbindin-D9K besitzt zwei Calcium-Bindungsstellen, Calbindin-D28K

kann vier Calcium-Ionen binden (BREDDERMAN & WASSERMAN 1974,

FULLMER & WASSERMAN 1981). Calbindin-D9K wird bei Säugetieren hauptsächlich

in der Darmschleimhaut exprimiert, ist aber in geringerem Maße auch in der Niere

nachweisbar (THOMASSET et al. 1982, HOENDEROP et al. 2005, WILKENS 2006).

Calbindin-D28K ist in Niere, Pankreas, Plazenta, Knochen und Gehirn präsent

(HOENDEROP et al. 2005). Bei Vögeln ist in Darm und Niere ausschließlich

Calbindin-D28K vorhanden (FULLMER & WASSERMAN 1987, HOENDEROP et al.

2005).

Einleitung

7

Durch die langsame Kinetik der Calbindine ist gewährleistet, dass zwar die

intrazelluläre Konzentration an freien Calcium-Ionen niedrig gehalten wird, das für

funktionelle Second messenger-Signale typische kurzfristige Ansteigen der Calcium-

Konzentration aber nicht behindert wird (KOSTER et al. 1995).

1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran

Im dritten Schritt werden die Calcium-Ionen gegen einen elektrochemischen

Gradienten mit zwei unterschiedliche Ca2+-Transportmechanismen über die

basolaterale Membran aus der Zelle ins Plasma geschleust. Von der primär aktiven,

membranständigen Calcium-ATPase (PMCA) sind vier verschiedene Isoformen mit

mehreren Splicevarianten bekannt, wobei im Dünndarm die Isoform PMCA1b den

quantitativ bedeutendsten Mechanismus zur aktiven Ca2+-Ausschleusung darstellt

(HOENDEROP et al. 2005). Von untergeordneter Bedeutung ist der sekundär aktive

3Na+/Ca2+-Austauscher (NCX1) der hauptsächlich an der renalen Ca2+-Resorption

beteiligt ist und intestinal nur sehr niedrig exprimiert wird (HILDMANN et al. 1982,

HOENDEROP et al. 2005).

Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen

(Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien (Calbindin-D28K-

vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im Text (1.2.2.1 bis

1.2.2.3); Wilkens 2006.

TRPV5

TRPV6

PMCA

NCX

ATP

ADP + Pi

Calbindin-D9K

Calbindin-D28K

Ca2+

apikal basolateral

Einleitung

8

1.3 Regulation des intestinalen Ca2+

-Transports

Die intestinale Ca2+-Aufnahme ist ein wichtiges Stellglied bei der Regulation der

Calcium-Homöostase, da es die einzige exogene Zufuhrmöglichkeit von Calcium in

das extrazelluläre Kompartiment des Körpers darstellt (RAMASAMY 2006).

Der aktive transzelluläre Ca2+-Transport wird im Wesentlichen durch das

Steroidhormon Calcitriol (1α,25(OH)2-VitaminD3), der biologisch aktivsten Form des

Vitamins D, reguliert. Calcitriol stimuliert am Darm die Expression von TRPV6,

Calbindin-D9K und PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Vitamin D responsive elements

(VDREs), über die die Calcitriolwirkung vermittelt wird, konnten in den

Promotorregionen von TRPV6 (MEYER et al. 2006), Calbindin-D9K (DARWISH &

DELUCA 1992) und PMCA1b (GLENDENNING et al. 2000) nachgewiesen werden.

Auf funktioneller Ebene konnte schon wesentlich früher die stimulierende Wirkung

von Calcitriol auf den aktiven Ca2+-Transport gezeigt werden. Eine Behandlung mit

Calcitriol führte bei Ratten zu einer Verdopplung der Calcium-Nettofluxraten im

Duodenum (JUNGBLUTH & BISWANGER 1989).

Von der Regulation des parazellulären Ca2+-Transportes hat man bislang weniger

konkrete Vorstellungen. Es konnte jedoch an CaCo-2 Zelllinien gezeigt werden, dass

Calcitriol die Leitfähigkeit der Tight junctions erhöht und somit zu einem verstärkten

parazellulären Ca2+-Transport führt (CHIRAYATH et al. 1998).

Eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation des intestinalen Calcium-

Transports kommt auch der alimentären Calcium-Versorgung zu. Ein niedriges

Calcium-Angebot in der Nahrung erhöht die Effizienz der intestinalen Calcium-

Absorption über Adaptationsmechanismen des Vitamin D-Systems (WASSERMAN

et al. 1992). Das durch die alimentäre Calcium-Depletion hervorgerufene

vorübergehende Absinken des Plasma-Calcium-Spiegels bewirkt, über eine

Stimulation der 1α-Hydroxylase, eine Erhöhung der Calcitriol-Konzentration im

Plasma. Infolge dessen kommt es zu einer Erhöhung der mRNA-Expression von

TRPV5 und TRPV6 (BROWN et al. 2005), Calbindin-D28K sowie der Protein-

Expression von PMCA und NCX (WASSERMAN et al. 1992, CENTENO et al. 2004).

Demgegenüber scheint eine alimentäre Calcium-Supplementation den intestinalen

Calcium-Transport calcitriolunabhängig zu regulieren. Demonstriert wurde dies

anhand von 1α-OH-Knockout Mäusen, die das klinische Bild einer Pseudovitamin-D-

Mangel-Rachitis mit Hypocalcämie, undetektierbaren Calcitriol-Spiegeln und

sekundärem Hyperparathyreoidismus zeigten. Durch Fütterung einer calciumreichen

Einleitung

9

„Rescue diet“ (2% Calcium und 20% Laktose) kam es zu einer Normalisierung des

Calcium-Spiegels (HOENDEROP et al. 2004). Außerdem erhöht sich die Expression

der am intestinalen Ca2+-Transport beteiligten Proteine, TRPV6, Calbindin-D9K und

PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Jedoch sind die molekularen Mechanismen dieser

calcitriolunabhängigen Genregulation bislang nicht bekannt. Denkbar wäre, dass

neben den bekannten VDREs in den Promotorregionen der Ca2+-Transportergene so

genannte Ca2+-abhängige Elemente (CaREs) vorhanden sind (HOENDEROP et al.

2005). GALLIN & GREENBERG (1995) konnten die Existenz solcher CaREs, die

auffällige Ähnlichkeiten mit cAMP-abhängigen Elementen aufwiesen, in Nervenzellen

zeigen.

Neben Calcitriol sind weitere Hormone an der Regulation des intestinalen Calcium-

Transports beteiligt. Das bei erniedrigtem Plasmacalciumspiegel ausgeschüttete

PTH greift hauptsächlich am Knochen und an der Niere an und erhöht die Calcium-

Mobilisation bzw. steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium. Durch

Aktivierung der 1α-Hydroxylase steigert es die Synthese von Calcitriol, und wirkt

somit indirekt auch auf die intestinale Ca2+-Resorption (HOENDEROP et al. 2005).

Es konnte aber auch ein direkter Effekt von PTH auf Enterozyten gezeigt werden.

Dabei erhöhte PTH die Ca2+-Aufnahme in isolierte Duodenumzellen der Ratte

(PICOTTO 2001). Außerdem konnten PTH-Rezeptoren an Enterozyten des Villus

immunhistochemisch nachgewiesen werden (GENTILI et al. 2003).

1.4 Gastrointestinaler Ca2+

-Transport beim Wiederkäuer

Zur Ca2+-Resorption beim Wiederkäuer liegen zahlreiche, zum Teil widersprüchliche

Ergebnisse vor.

In Bilanzstudien an fistulierten Schafen konnte gezeigt werden, dass prinzipiell nicht

nur Dünn- und Dickdarm, sondern auch die präintestinalen Abschnitte des

Gastrointestinaltraktes sowohl zur Nettosekretion als auch zur Nettoresorption von

Calcium befähigt sind. In einigen Untersuchungen stellte sich heraus, dass in

Vormägen und Labmagen zum Teil eine Sekretion von Calcium auftrat, die durch

Nettoresorption im Dünndarm bzw. Dickdarm mehr als kompensiert wurde

(PFEFFER et al. 1970, GREENE et al. 1983, WYLIE et al. 1985). In anderen

Untersuchungen wurde festgestellt, dass ein beträchtlicher Anteil der täglichen Ca2+-

Aufnahme präintestinal erfolgt (RAYSSIGUIER & PONCET 1980). Ähnliche

Einleitung

10

widersprüchliche Beobachtungen wurden auch in Bilanzstudien an Rindern gemacht.

So beobachteten GREENE et al. (1983) in einer Studie an jungen Bullen eine

Nettoresorption von Calcium aus den Vormägen und dem Dickdarm, im Dünndarm

hingegen wurde Calcium sezerniert. In einer weiteren Studie ergaben sich Hinweise

darauf, dass das Vormagen/Labmagen-Kompartiment sogar der ausschließliche

Abschnitt des Gastrointestinaltraktes für die Ca2+-Nettoresorption ist (GREENE et al.

1988).

Diese unterschiedlichen Ergebnisse lassen sich in Einklang bringen, wenn man die

präintestinalen und intestinalen Anteile an der gesamten Calcium-Resorption in

Abhängigkeit der alimentären Calcium-Versorgung betrachtet. Bei diesem Vorgehen

ergeben sich Hinweise darauf, dass es bei hohem Calcium-Angebot in der Nahrung

zu einer Verschiebung der Hauptlokalisation der Calcium-Nettoresorption in die

präintestinalen Abschnitte kommt (SCHRÖDER & BREVES 2006). Die intestinale

Resorption von Calcium scheint also erst mit abnehmendem alimentärem Angebot

an Bedeutung zu gewinnen.

Auch In-vitro-Untersuchungen zeigten einen aktiven Ca2+-Transport im Pansen. An

Epithelien von wachsenden Ziegen und adulten Schafen konnten mit der Ussing-

Kammer-Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten signifikante

Nettofluxraten bestimmt werden (HÖLLER et al. 1988, SCHRÖDER et al. 1997). Der

Transport scheint aber nur in Anwesenheit kurzkettiger Fettsäuren in der mucosalen

Pufferlösung stattzufinden (SCHRÖDER et al. 1999).

Bei In-vitro-Versuchen an verschiedenen Darmabschnitten von Schafen und Ziegen

verschiedenen Alters zeigten sich deutliche Speziesunterschiede. So ließen sich bei

adulten, bedarfsgerecht mit Calcium versorgten Schafen mit der Ussing-Kammer-

Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten nur im Jejunum

signifikant von Null verschiedene Calcium-Nettofluxraten bestimmen (SCHRÖDER et

al. 1997). Überraschenderweise konnten im Duodenum, welches die

Hauptlokalisation für den aktiven Ca2+-Transport beim monogastrischen Tier darstellt,

keine signifikanten Nettofluxraten gefunden werden. An Epithelien wachsender

Ziegen jedoch konnten unter gleichen Bedingungen im Duodenum und im Jejunum

signifikante Nettofluxraten gezeigt werden. Allerdings waren die für die Calcium-

Nettofluxraten beider Spezies ermittelten Werte nur sehr gering und lagen weit unter

den Werten von monogastrischen Tieren (SCHRÖDER et al. 1997). In einer neueren

Studie an Epithelien adulter, laktierender Schlachtkühe wurde sogar eine

Einleitung

11

Nettosekretion im Duodenum und im Colon beobachtet (LIESEGANG et al. 2006).

SIDLER-LAUFF et al. (2010) beobachteten eine Nettosekretion im Duodenum

wachsender Ziegen.

Auch Untersuchungen zur Regulation des gastrointestinalen Ca2+-Transportes beim

Wiederkäuer zeigten deutliche Speziesunterschiede auf. Bezüglich der Resorption

von Calcium aus dem Vormagensystem ergeben sich aus verschiedenen

Untersuchungen Hinweise darauf, dass diese keiner Regulation durch Calcitriol

unterliegt (SCHRÖDER et al. 2001; SIDLER-LAUFF et al. 2010). Für die intestinale

Resorption konnte zwar anhand molekularbiologischer Studien nachgewiesen

werden, dass beim Wiederkäuer die strukturellen Voraussetzungen für einen aktiven,

calcitriolregulierten Ca2+-Transport vorhanden sind, die Regulation konnte funktionell

aber noch nicht eindeutig gezeigt werden.

So konnte beim Rind die Expression von VDR, Calbindin-D9K und PMCA im

Duodenum demonstriert werden (YAMAGISHI et al. 2002, YAMAGISHI et al. 2006).

Im Dünndarm der Ziege konnten der VDR, Calbindin-D9K und TRPV6 nachgewiesen

werden (SCHRÖDER et al. 1995; RITTMANN 1996, MUSCHER unveröffentlichte

Ergebnisse). Eine alimentäre Calcium-Depletion über neun Wochen, verbunden mit

einem deutlichen Anstieg der Calcitriolspiegel von 130 auf 230 pmol∙l-1, hatte jedoch

keinen signifikanten Effekt auf die Calcium-Nettofluxraten im Duodenum und

Jejunum von wachsenden Ziegen (SCHRÖDER et al. 1997). Ebenfalls konnten im

Dünndarm von Schafen VDR, Calbindin-D9K, TRPV6 und PMCA nachgewiesen

werden (SCHRÖDER et al. 2001, WILKENS 2006). Laktierende Schafe, die mit

0,1 µg/kg 1α-Hydroxyvitamin D3 i. m. über zehn Tage behandelt wurden, zeigten

einen deutlichen Anstieg der Calcium-Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt,

wobei aufgrund des Versuchsdesigns aber nicht auf beteiligte Darmsegmente

geschlossen werden konnte (BRAITHWAITE 1978). Bei Lämmern konnte nach

zweiwöchiger Calcium-Restriktion unter Anwendung der „Thiry-Vella loop“-Technik

eine erhöhte Effizienz der Calcium-Absorption im Jejunum beobachtet werden

(ABDEL-HAFEEZ et al. 1982). Jedoch konnte bei Schafen eine Steigerung der

Nettofluxraten im Jejunum durch eine Calcium-Depletion bzw. eine Vitamin D3-

Behandlung bislang nicht gezeigt werden.

Warum trotz des Vorhandenseins dieser Strukturen an jejunalen Epithelien vom

Schaf bislang keine entsprechende Regulierbarkeit der Calcium-Nettofluxraten wie

bei monogastrischen Tieren gezeigt werden konnte, bleibt unklar.

Einleitung

12

1.5 Zielsetzung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulierbarkeit des Ca2+-Transportes im

Jejunum des Schafes zu überprüfen.

Dazu sollte die Wirkung einer alimentären Calcium-Depletion, einer Behandlung mit

Calcitriol in pharmakologischer Dosierung und der Kombination aus Depletion und

Behandlung auf Expression und Aktivität der am transzellulären Ca2+-Transport

beteiligten Strukturen untersucht werden.

Dass das verwendete Behandlungsprotokoll zu einer Stimulation der

gastrointestinalen Aufnahme von Calcium führt, konnte bereits in vorangegangenen

funktionellen Studien demonstriert werden (Wilkens et al. 2010). In der vorliegenden

Arbeit wurde nun die Expression des apikalen Calcium-Kanals TRPV6 und der

basolateralen Calcium-Pumpe PMCA1b mithilfe von quantitativer RT-PCR und

Western Blot Analysen auf Transkriptions- und Translationsebene bestimmt,

während die Aktivität des Kanals mittels Uptake-Studien an isolierten

Bürstensaummembranvesikeln erfasst werden sollten.

Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Tiere

Es standen 20 weibliche, ca. sechs Monate alte und zwischen 30 und 40 kg schwere

Schafe der Rasse „Suffolk“ zur Verfügung, die ca. sechs Wochen vor dem ersten

Schlachttermin von einem kommerziellen Zuchtbetrieb gekauft und eingestallt

wurden. Nach einer zweiwöchigen Adaptationsphase wurden die Tiere in vier

Versuchsgruppen mit jeweils fünf Tieren eingeteilt.

2.1.2 Fütterung

Zwei Gruppen (Calcium-Depletions-Fütterungsgruppen, Ca-) erhielten ein Versuchs-

futter mit reduziertem Calciumgehalt (0,14% im Kraftfutter), die beiden anderen

Gruppen (Kontroll-Fütterungsgruppen, Kon) wurden bedarfsgerecht mit Calcium

(1,44% im Kraftfutter) versorgt. Die Schafe wurden zu fünft in mit Sägespänen

eingestreuten Laufboxen gehalten und auch gruppenweise gefüttert. Die tägliche

Ration pro Tier und Tag setzte sich aus 90 g Heu und 660 g Kraftfutter zusammen.

Stroh, dessen Mineralstoffgehalt vor Versuchsbeginn analytisch bestimmt worden

war, und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die

Zusammensetzung der Pellets ist der Tabelle 2.1 zu entnehmen. Die Ration wurde

auf drei Mahlzeiten am Tag verteilt und das nicht aufgenommene Futter

rückgewogen. Anhand der Differenz zwischen der vorgelegten Futtermenge und der

Rückwaage konnte die tägliche Aufnahme pro Tier und Tag geschätzt werden

(Tab. 2.2). Zwischen den beiden Fütterungsgruppen bestand nur in der

aufgenommenen Calcium-Menge ein signifikanter Unterschied, diese betrug bei den

Tieren der Kontrollfütterungsgruppen 10,37 ± 0,1 g und in den Calcium-Depletions-

Fütterungsgruppen 2,6 ± 0,04 g pro Tier und Tag.

Während der mindestens vier Wochen dauernden Fütterungsphase wurden in

wöchentlichem Abstand die Gewichtszunahmen kontrolliert, sowie am Ende der

Fütterungsperiode Blutproben aus der V. jugularis entnommen, um die Konzentration

von Gesamtcalcium (Ca), ionisiertem Calcium (Ca²+ ), Phosphat (Pi) und Calcitriol zu

bestimmen.


14

2.1.3 Behandlung

Je fünf Tiere der Calcium-Depletions- bzw. Kontrollfütterunggruppen wurden zwölf

Stunden vor der Schlachtung mit Calcitriol in einer Dosierung von 0,5 µg pro kg

Körpergewicht behandelt. Mittels Infusion über einen Venenkatheter wurde den

Tieren eine entsprechende Menge Calcitriol gelöst in 180 ml physiologischer

Kochsalzlösung verabreicht. Polysorbat 20 diente als Lösungsvermittler. Die

restlichen Tiere erhielten ein Placebopräparat, bestehend aus physiologischer

Kochsalzlösung und Polysorbat 20.

Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz (uS))

Inhaltsstoffe (in % der ursprünglichen Substanz)

Diät

Ca-Depletion Kontrolle

Gerste 26,7 25,8

Hafer 29,7 28,7

Weizenkleie 14,8 14,3

Sojaextraktionsschrot 14,8 14,3

Sojabohnen 11,9 11,5

Sojaöl 1,5 1,4

NaH2PO4 ∙ 2 H2O 0,6 0,6

CaCO3 --- 3,4


15

Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro Tier

und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4 Wochen)

in g bzw. % der TS ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)

Tägliche Aufnahme

Ca-Depletion n = 10

Kontrolle n = 10

TS (kg) 1,01 ± 0,02 1,12 ± 0,01

ME (MJ) 9,4 ± 0,11 10,0 ± 0,10

Calcium (g) 2,60 ± 0,04 10,37 ± 0,10

Phosphor (g) 4,17 ± 0,04 4,24 ± 0,04

Magnesium (g) 1,80 ± 0,02 1,80 ± 0,02

Natrium (g) 0,95 ± 0,01 1,03 ± 0,01

Rohfett 4,4% 4,8%

Rohfaser 24,2% 25,8%

Rohprotein 13,1% 11,6%

Stärke + Zucker

20,8% 18,8%

2.1.4 Entnahme der Blutproben

Vor Beginn und im Anschluss an die Behandlung wurden in zweistündigem Abstand

Blutproben aus der V. jugularis über einen Venenkatheter in Lithium-Heparin-

Monovetten (Monovette® 9ml LH; Fa. Sarstedt, 51588 Nümbrecht) entnommen.

Mit Hilfe einer ionen-sensitiven Elektrode (Rapidlab™ 348; Siemens Healthcare

Dagnostics GmbH, 65760 Eschborn) wurde unmittelbar danach die Konzentrationen

an ionisiertem Calcium (Ca2+) im Vollblut gemessen.

In einem anschließenden Zentrifugationsschritt für 10 min bei 3500 rpm (Minifuge 2;

Heraeus Instruments, 63450 Hanau) wurde das Blutplasma isoliert und bis zur

weiteren Analyse bei -20°C eingefroren.


16

2.1.5 Entnahme der Gewebeproben

Zwölf Stunden nach der Behandlung wurden die Tiere mittels Bolzenschuss betäubt

und durch einen Kehlschnitt entblutet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden

Proben aus dem proximalen Jejunum entnommen. Die Entnahme der

Gewebeproben erfolgte innerhalb von 10 min nach dem Töten der Tiere.

Für die Isolierung von RNA und Zellmembranen für Western Analysen wurden 20 bis

30 cm des proximalen Jejunums entnommen, am Mesenterialansatz aufgeschnitten

und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mehrfach gespült. Von dem

Darmabschnitt, mit der serosalen Seite auf einer eisgekühlten Glasplatte liegend,

wurde nun unter Zuhilfenahme eines Objektträgers der lumenseitige Anteil der

Darmwand, d.h. die Lamina epithelialis und die Lamina propria der Tunica mucosa,

von der Lamina muscularis mucosae separiert und das auf diese Weise gewonnene

Material in flüssigem Stickstoff eingefroren. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die

Mukosaproben bei -80°C gelagert.

Für die Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel wurde ein

Jejunumstück von 2 m Länge kaudal der Entnahmestelle der Proben für die RNA-

Isolierung mehrfach mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gespült.

Anschließend wurden die Darmstücke auf mesenterialer Seite der Länge nach

aufgeschnitten, erneut bis zur vollständigen Entfernung vorhandener Ingestareste

gespült und in Alufolie gewickelt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung bis

zur Präparation der Bürstensaummembranvesikel (BSMV) erfolgte ebenfalls bei

-80°C.

2.2 Analytische Methoden

2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben

2.2.1.1 Gesamtcalcium

Der Gehalt an Gesamtcalcium im Blutplasma wurde mit Hilfe der o-Kresolphtalein-

Komplexon-Methode bestimmt (SARKAR & CHAUHAN 1967). Das Testprinzip

beruht auf der Bildung eines violetten Komplexes aus Calcium und o-Kresolphtalein-

Komplexon in alkalischer Lösung, dessen Farbintensität zur Calciumkonzentration

direkt proportional ist. Jeweils 25 µl Probe bzw. Standardlösung (2 mmol∙l-1 CaCl2)

wurden mit 500 µl einer 2-Amino-2-Methylpropanol-Lösung (3,5 mmol∙l-1, pH 10,8)


17

und 500 µl Farbstofflösung (0,16 mmol∙l-1 o-Kresolphtalein-Komplexon, 6,89 mmol∙l-1

8-Hydroxychinolin in 0,06 mmol∙l-1 HCl) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion

im Photometer (DU® 640 Spectrophotometer; Beckman Coulter GmbH, 47807

Krefeld) bei einer Wellenlänge von 570 nm gegen einen Leerwert gemessen. Die

Messung erfolgte für alle Proben jeweils im Doppelansatz.

Die Berechnung der Calciumwerte erfolgte mit nachstehender Formel:

ExtinktionProbe

Ca-KonzentrationProbe = --- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1]

ExtinktionStandard

2.2.1.2 Phosphat

Die Messung beruht auf der Bildung eines gelben Farbkomplexes aus Pi mit

Molybdat und Vanadat in salpetersaurer Lösung, dessen Farbintensität proportional

zur Pi-Konzentration ist (PETER 1982). Vorab wurden die Proben einer Enteiweißung

unterzogen. Dazu wurden die Plasmaproben 1:10 mit Trichloressigsäure

(1,2 mmol∙l-1) versetzt und 10 min bei 805 g und 4°C zentrifugiert (GS-15R

Centrifuge; Beckman Coulter GmbH, 47807 Krefeld). Anschließend wurden jeweils

400 µl des Überstandes bzw. 400 µl Standardlösung (0,161 mmol∙l-1 KH2PO4) mit

dem gleichen Volumen Ammoniumvanadat- (21 mmol∙l-1) und Ammoniummolybdat-

Lösung (40 mmol∙l-1) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion bei einer

Wellenlänge von 405 nm gegen den Leerwert gemessen. Alle Messungen wurden im

Doppelansatz durchgeführt.

Die Pi-Konzentration der Probe ergibt sich aus folgender Formel:

ExtinktionProbe

Pi-KonzentrationProbe = ---- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1]

ExtinktionStandard


18

2.2.1.3 Calcitriol

Die Bestimmung der Konzentration von Calcitriol im Blutplasma erfolgte durch die

Firma Immundiagnostik AG (64625 Bensheim) mittels eines kommerziell erhältlichen

Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assays (ELISA).

2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen

Zur Quantifizierung der in den Western Blot Analysen und den Uptake-Studien

eingesetzten Membranpräparationen, sowie zur Überprüfung der Anreicherung

apikaler Membranen nach der Bürstensaummembranvesikel-Präparation, wurden die

entsprechenden Proteinkonzentrationen mithilfe des BIO-RAD Proteinassays

(Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) bestimmt. Das Absorptionsmaximum

des enthaltenen Farbstoffes, Coomassie-Brillant-Blau G-250, verschiebt sich in

saurer Lösung durch Bindung an Proteinstrukturen von 465 nm nach 595 nm

(BRADFORD 1976). Hierbei wird der zuvor als rotes Kation vorliegende Farbstoff in

seine anionische Form überführt und färbt sich blau. Durch zeitgleiche Messung

einer Standardreihe bekannter Konzentrationen an gamma-Globulin (BIO-RAD

Protein Standard; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) ist die Ermittlung

unbekannter Probenwerte möglich. Die Inkubation mit oberflächenaktivem Saponin

vor der Zugabe des Farbreagenz verbessert die Darstellung der

Proteinbindungsstellen.

Nach dem Auftauen der Proben wurden diese durch mehrmaliges Aufziehen mit

einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisiert und

anschließend 1:20 mit A. dest. verdünnt. 50 µl der verdünnten Probe bzw. 50 µl A.

dest. als Leerwert wurden mit gleicher Menge an Saponinlösung (1%ig) vermischt.

Nach einer 20 minütigen Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 2,5 ml des zuvor

1:5 mit A. dest. verdünnten Bio-Rad-Farbreagenz zu allen Proben. Nach weiteren

10 min konnte die Extinktion im Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gegen

den Leerwert gemessen werden. Parallel dazu wurde die Extinktion von vier

verschiedenen Konzentrationen (0,139, 0,278, 0,417 und 0,556 mg∙ml-1) eines

gamma-Globulin-Standards ermittelt. Alle Messungen wurden jeweils im

Doppelansatz durchgeführt. Aus den Extinktions- und Konzentrationswerten des

Standardproteins wurde eine lineare Regression erstellt, aus welcher die

Proteinwerte der Proben berechnet werden konnten.


19

2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen

Um die Anreicherung apikaler Membranen durch die Differentialzentrifugation (2.3.3)

zu bestimmen, wurden Aktivitäten von Leitenzymen der apikalen bzw. der

basolateralen Membranen in Vollhomogenat und Vesikel-Präparation bestimmt und

zueinander ins Verhältnis gesetzt.

2.2.3.1 Alkalische Phosphatase

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP), Leitenzym der apikalen Membran,

wurde nach der von KAWADE (1964) beschriebenen Methode bestimmt. Hierbei wird

farbloses p-Nitrophenylphosphat durch die AP hydrolytisch in Phosphat und p-

Nitrophenyl gespalten. Die entstandene Menge an gelbem p-Nitrophenyl pro

Zeiteinheit ist proportional zur Aktivität der AP und kann photometrisch bei einer

Wellenlänge von 405 nm bestimmt werden.

Je 50 µl der auf Eis aufgetauten und durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-

Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisierten Probe wurde mit 3 ml

auf 25°C temperiertem AP-Puffer (1,02 mol∙l-1 Diethanolamin, 0,51 mmol∙l-1 MgCl2, 10

mmol∙l-1 Na-Nitrophenylphosphat, pH 9,8) vermischt. Im Anschluss wurde die

Extinktion in 1 minütigen Intervallen über einen Zeitraum von 4 min bei 405 nm

gegen Luft gemessen. Die Aktivität konnte durch Multiplikation der

Extinktionsänderung pro Minute (E3min- E2min) mit dem versuchsinternen Faktor 3300

in der Einheit U∙l-1

berechnet werden.

Für die Auswertung wurden diese Ergebnisse auf den zuvor ermittelten Proteingehalt

bezogen.

2.2.3.2 Na+/K+-ATPase

Die Aktivität der Na+/K+-ATPase, Leitenzym für die basolaterale Membran, wurde

nach der Methode von MIRCHEFF u. WRIGHT (1976) photometrisch bestimmt.

Durch die ATPase-Aktivität wird aus ATP anorganisches Phosphat frei, welches in

saurer Lösung mit Molybdat Phosphomolybdänsäure bildet. Diese wird zu

Molybdänsäure, einem blauen Farbkomplex, reduziert und kann bei einer

Wellenlänge von 690 nm photometrisch bestimmt werden. Durch Zusatz von

Ouabain kann spezifisch die Aktivität der Na+/K

+-ATPase gehemmt werden, so dass

sich dann aus der Differenz der Umsetzung von ATP in einem Ansatz mit und einem

ohne Ouabain die Aktivität des Enzyms in der Präparation errechnen lässt.


20

Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und mit A. dest. eine Verdünnung hergestellt,

von der 20 µl mit jeweils 0,5 ml Assaymix-Puffer (5 mmol∙l-1 MgCl2, 100 mmol∙l-1

NaCl, 10 mmol∙l-1 KCl, 100 mmol∙l-1 Tris (basisch), 2 mmol∙l-1 ATP, 3 mmol∙l-1 EDTA,

pH 7, 4 bei 37°C) bzw. Assaymix-Puffer mit Ouabainzusatz (6,86 mmol∙l-1 Ouabain)

30 min bei 37°C inkubiert wurden. Durch die Zugabe von 0,5 ml 5%iger

Trichloressigsäure wurde die ATPase-Reaktion gestoppt, die weiteren Zugaben

erfolgten alle bei Raumtemperatur. Die Zugabe von 1 ml Farbreagenz (1,15 mol∙l-1

H2SO4, 8,9 mmol∙l-1 Ammoniumheptamolybdat, 143,8 mmol∙l-1 FeSO4) führte zur

Bildung eines blauen Farbkomplexes mit dem freigesetzten anorganischen

Phosphat. Nach einer 30 minütigen Inkubation wurde die Extinktion bei einer

Wellenlänge von 690 nm gegen einen Leerwert bestimmt. Die Aktivität der Na+/K+-

ATPase wurde anhand der Differenz der Extinktionswerte mit Ouabainhemmung und

ohne Hemmung sowie nachfolgender Multiplikation mit dem versuchsinternen Faktor

862 in der Einheit U∙l-1 berechnet und auf die zuvor ermittelte Proteinkonzentration

bezogen.

2.3 Präparative Methoden

Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Puffer und Lösungen, die sich auf

Vorrat herstellen ließen, in alphabetischer Reihenfolge im Anhang A aufgeführt.

2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den jejunalen Mukosaproben wurde das

RNeasy® Mini-Kit (QIAGEN GmbH, 40724 Hilden) mit den darin enthaltenen Puffern

RLT, RW1 und RPE gemäß den Herstellerangaben verwendet. Vor

Präparationsbeginn wurde der RLT-Puffer zunächst mit 1% ß-Mercaptoethanol, zur

Spaltung der Disulfidbrücken, versetzt.

Das Probenmaterial wurde in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühltem Mörser

zerkleinert. Anschließend wurden ca. 30 mg der pulverisierten Probe in einem

vorgekühlten Eppendorf-Tube (Eppendorf AG, 22331 Hamburg) mit 600 µl des

vorbereiteten RLT-Puffers vermischt. Durch zehnmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-


21

Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle wurde die Probe homogenisiert. Alle

weiteren Präparationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur.

Zunächst wurde das Homogenat zur Beseitigung von Zelltrümmern 3 min bei

13 000 rpm (Biofuge pico; Heraeus Instruments, 63450 Hanau) zentrifugiert, der

Überstand vorsichtig abpipettiert und auf eine gDNA-Eliminationssäule gegeben.

Diese wurde für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde zur Fällung

der RNA mit dem gleichen Volumen 70%igem Ethanol vermischt und anschließend

in zwei Schritten auf eine RNeasy®-Säule überführt. Durch eine 1 minütige

Zentrifugation bei 13 000 rpm wurden die gelösten Nukleinsäuren ins Innere der

Säule getrieben, wo eine Anlagerung an eine Kieselgelmembran erfolgte.

Anschließend wurden drei Waschschritte durchgeführt, zunächst mit 700 µl RW1-

Puffer, dann zweimal mit je 500 µl ethanolhaltigem RPE-Puffer. Bei den ersten

beiden Waschschritten wurde mit 13 000 rpm für 1 min zentrifugiert, beim letzten zur

vollständigen Trocknung der Säule für 2 min. Der Durchfluss wurde jeweils

verworfen. Nach dem Trocknen wurde die RNeasy®-Säule in ein neues

Sammelgefäß verbracht und die gebundene Gesamt-RNA mit 50 µl RNAse-freiem

Wasser durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für eine Minute eluiert.

Nach Abschluss der Isolierung wurde die Gesamt-RNA photometrisch quantifiziert

(Eppendorf Biophotometer; Eppendorf AG, 22331 Hamburg) und bis zur weiteren

Verwendung bei -80°C aufbewahrt.

Zum Umschreiben der isolierten Gesamt-RNA wurden TaqMan-Reverse

Transcription Reagents (Applied Biosystems, Roche Diagnostics GmbH, 68298

Mannheim) verwendet. Zunächst wurde ein so genannter Master-Mix angesetzt, der

je Probe 2,5 µl 10-fach Puffer, 5,5 µl MgCl2 (25 mmol∙l-1), 5,0 µl dNTPs (10 mmol∙l-1),

0,625 µl Random-Hexamere, 0,625 µl Oligo(dT)-Primer, 0,5 µl RNase-Inhibitor sowie

0,68 µl Reverse Transkriptase (50 U∙µl-1) enthielt. Von der entsprechenden RNA-

Präparation wurde ein zu 200 ng äquivalentes Volumen mit RNase-freiem Wasser

auf ein Volumen von 9,6 µl erweitert und mit 15,4 µl Master-Mix versetzt. Die

Inkubation im Thermocycler (MyCycler; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939

München) lief unter folgenden Bedingungen ab: 10 min 25°C, 45 min 48°C und 5

min 95°C. Nach Abschluss des Programms wurden die Reaktionsgefäße auf 4°C

herunter gekühlt und die synthetisierte cDNA bei -20°C gelagert. Zur Kontrolle der

Umschreibung wurde eine PCR mit den Primern „ACTB for“ und „ACTB rev“ zum


22

Nachweis des konstitutiv exprimierten Gens ß-Aktin mit anschließender Gel-

Elektrophorese durchgeführt (2.4.1.1).

2.3.2 Präparation von Rohmembranen

Die Isolierung der Rohmembranen erfolgte nach einer modifizierten Methode nach

OSSWALD et al. (2005). Je 1 g jejunale Mukosa wurde in 10 ml eisgekühltem

Homogenisierungspuffer versetzt mit 50 µl PMSF überführt und anschließend in

einem Elvehjem-Potter (Potter S30; B. Braun Melsungen AG, 34212 Melsungen)

durch zehn Schübe bei höchster Stufe homogenisiert. Eine Zentrifugation für 20 min

bei 2 000 g und 4°C (Sorvall® RC-5C, Rotor SM24; Sorvall Instruments, Du Pont

Company, Wilmington, USA) schloss sich an. Das entstandene Pellet, dass vor allem

Zelltrümmer, Zellkerne und Mitochondrien enthielt, wurde verworfen, der Überstand

für weitere 60 min bei 40 000 g und 4°C zentrifugiert. Durch die zweite Zentrifugation

erreicht man eine Trennung cytosolischer Proteine, die sich im Überstand

anreichern, von der Plasmamembranfraktion, die ein anderes Sedimentations-

verhalten besitzt und sich deshalb im entstandenen Pellet wieder findet. Je nach

Größe wurde das Pellet in 500-1000 µl eisgekühltem Resuspensionspuffer mit einem

Zusatz von 15 µl Proteaseinhibitor (Protease Inhibitor Cocktail; Sigma-Aldrich, St.

Louis, USA) aufgeschwemmt und anschließend durch zehnmaliges Aufziehen mit

einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle resuspendiert. Nach

Bestimmung der Proteinkonzentration (2.2.2) wurden die Präparationen in 50 µg

Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.

2.3.3. Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV)

Die Isolierung der Bürstensaummembranvesikel erfolgte nach einer modifizierten

Mg2+-EGTA-Präzipitationsmethode (KAUNE et al. 1992; SCHRÖDER et al. 1998).

Neben der Abtrennung der Zellorganellen lässt sich hierbei aufgrund der

unterschiedlichen Affinität verschiedener Zellmembrananteile zu Mg2+ (SHEIKH et al.

1982) durch definierte Zentrifugationsschritte die Bürstensaummembranfraktion

spezifisch anreichern.


23

Die bei -80°C gelagerten Proben wurden ca. 12 h vor Präparationsbeginn bereits in

einen Gefrierschrank mit nur -20°C verbracht. Für die Präparation wurden dann ca.

20-30 g Gewebe in der 2-fachen Menge Präparationspuffer 1 langsam auf Eis

aufgetaut. Auch alle weiteren Schritte wurden auf Eis bzw. in einer auf 4°C gekühlten

Zentrifuge durchgeführt. Die aufgetaute Probe wurde mithilfe eines Vibromischers

(Vibro-Mixer; Chemap AG, 8604 Volketswil, Schweiz) 10 min bei höchster

Vibrationsstufe in Schwingung versetzt um die Enterozyten von der Darmwand

abzulösen. Anschließend wurde die Suspension aus Zellen und Puffer durch ein

Haushaltssieb vom restlichen Darmgewebe separiert und mit der 4-fachen Menge an

eiskaltem A. dest. aufgefüllt, wodurch die Zellen osmotisch aufgebrochen wurden.

Nach 10 minütiger Inkubation wurde die Zellsuspension mit einem Haushaltsmixer

(Turboblender, Modell D70; Moulinex) dreimal für jeweils 1 min bei Stufe 4

homogenisiert und damit die restlichen intakten Enterozyten mechanisch

aufgebrochen. Um eine übermäßige Erwärmung der Suspension durch den

Mixvorgang zu verhindern, wurde diese zwischen den Schritten jeweils 2 min auf Eis

gestellt. Nach dem letzten Mixvorgang wurde der entstandene Schaum, der

hauptsächlich aus durch Erwärmung denaturierten Proteinen besteht, mit einer

Wasserstrahlpumpe entfernt.

Nachdem eine Probe (1 ml) zur späteren Bestimmung von Proteinkonzentration und

Enzymaktivität (siehe 2.2.2 und 2.2.3) entnommen worden war, wurde das

Homogenat unter langsamem Rühren tropfenweise mit MgCl2 (1 mol∙l-1) bis zu einer

Endkonzentration von 10 mmol∙l-1 versetzt und 15 min inkubiert. Während dieser Zeit

aggregieren Mg2+-Ionen in unterschiedlichem Maße mit den Membranfragmenten.

Aufgrund der geringer vorhandenen Oberflächenladung binden die Mg2+-Ionen

weniger stark an die apikalen Membranfragmente, wodurch deren Separation durch

die sich anschließende Differentialzentrifugation ermöglicht wird. Eine Zentrifugation

für 18 min bei 3 300 g und 4°C (Sorvall® RC-5C, Rotor GSA; Sorvall Instruments, Du

Pont Company, Wilmington USA) schloss sich an. Das entstandene Pellet wurde

verworfen, der Überstand für weitere 40 min bei 26 900 g und 4°C zentrifugiert. Das

entstandene Pellet wurde in 35 ml Präparationspuffer 2 aufgeschwemmt und

anschließend in einem Elvehjem-Potter (Potter S30; B. Braun Melsungen AG, 34212

Melsungen) durch zehn Schübe bei höchster Stufe homogenisiert. Darauf folgte eine

weitere tropfenweise MgCl2–Zugabe unter langsamem Rühren bis zu einer

Endkonzentration von 10 mmol∙l-1 und anschließender 15 minütigen Inkubation. Die


24

zuvor beschriebenen Zentrifugationsschritte (18 min, 3 300 g, 4°C und 40 min, 26

900 g, 4°C) wurden ebenfalls wiederholt, wobei aufgrund des geringeren

Probenvolumens ein anderer Rotor (Rotor SS34; Sorvall Instruments) verwendet

wurde. Das nach der zweiten Zentrifugation entstandene Pellet wurde in 35 ml

Präparationspuffer 3 mittels des o. g. Potters in gleicher Weise homogenisiert und

anschließend bei 34 500 g und 4°C für 45 min zentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen, das entstandene Pellet je nach Größe mit 1-2 ml Präparationspuffer 3

versetzt und mit einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle durch

mehrmaliges Aufziehen resuspendiert. Zur Bestimmung der Endproteinkonzentration

sowie der Enzymaktivität wurden 500 µl Vesikelsuspension entnommen und bei

-20°C gelagert.

Die verbleibende Suspension wurde in 500 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.

Die einzelnen Präparationsschritte sind zur besseren Übersicht in Abbildung 2.1

schematisch dargestellt.


25

Isolation der Enterozyten

(ca. 30g Darmmaterial)

Osmotisches und mechanisches

Aufbrechen der Enterozyten

Ausgangshomogenat

1.MgCl2-Fällung

(15 min Inkubation)

Überstand

Proben für Protein- und Enzymbestimmung

Zentrifugation

18 min, 3 300g Pellet verwerfen

Pellet verwerfen

Überstand verwerfen

Zentrifugation

40 min, 26 900g

Pellet resuspendieren

Überstand

2.MgCl2-Fällung

(15 min Inkubation)





Zentrifugation

40 min, 26 900g

Zentrifugation

18 min, 3 300g

Zentrifugation

45 min, 34 500g

Vesikelsuspension

für Aufnahmeversuche


Isolation der Enterozyten

(ca. 30g Darmmaterial)

Osmotisches und mechanisches

Aufbrechen der Enterozyten

Ausgangshomogenat

1.MgCl2-Fällung

(15 min Inkubation)

Überstand


Zentrifugation

18 min, 3 300g Pellet verwerfen

Pellet verwerfen


Zentrifugation

40 min, 26 900g


Überstand

2.MgCl2-Fällung

(15 min Inkubation)





Zentrifugation

40 min, 26 900g

Zentrifugation

18 min, 3 300g

Zentrifugation

45 min, 34 500g

Vesikelsuspension

für Aufnahmeversuche


Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV (g

bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte

Zentrifugationsdauer).


26

2.4 Expressionsstudien

Es wurden zwei Arten von Expressionstudien durchgeführt. Die Expression an

TRPV6 und PMCA wurde mithilfe von quantitativer RT-PCR auf Transkriptionsebene

untersucht. Als Ausgangsmaterial für diese Expressionsstudie wurde die

synthetisierte cDNA (2.3.1) verwendet. Auf Translationsebene wurde die Expression

an TRPV6 und PMCA in Rohmembranpräparationen (2.3.2) mittels Western Analyse

untersucht.

2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bei der Polymerase-Kettenreaktion wird ein Stück der vorliegenden DNA bzw. cDNA

mit Hilfe von sequenzspezifischen Primern vervielfältigt. Jede PCR stellt eine

mehrfache Abfolge von Zyklen dar, wobei jeder Zyklus in der Regel aus drei

Teilschritten besteht. Zunächst werden die DNA-Doppelstränge durch Erhitzung auf

95°C voneinander getrennt, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den

komplementären Basen zerstört werden (Denaturierung). Anschließend wird das

Reaktionsgemisch wieder herunter gekühlt, dies ermöglicht die Anlagerung der

Primer an die Matrizenstränge (Annealing). Die genaue Annnealing-Temperatur

hängt von der Basenzusammensetzung der Primer ab. Die DNA-Polymerase kann

nun von diesem kurzen doppelsträngigen Stück ausgehend einen zur Matrize

komplementären Strang aus den zugegebenen dNTPs synthetisieren (Elongation).

Die optimale Arbeitstemperatur des Enzyms liegt in der Regel bei 72°C. Diese drei

Teilschritte werden mehrfach wiederholt, wobei die Zeitdauer der einzelnen Schritte

von der Länge des PCR-Produktes abhängt. Das Protokoll der TaqMan PCR sieht

nur eine Zwei-Schritt-PCR mit kombiniertem Annealing-Extinktions-Schritt bei 60°C

vor. Da die Hybridisierung der Sonde im Gegensatz zu den PCR-Primern während

der Elongationsphase nicht zusätzlich durch die DNA-Polymerase stabilisiert wird,

wird so ein temperaturbedingtes Lösen vom Matrizenstrang verhindert. Eine erhöhte

MgCl2-Konzentration ermöglicht eine Anlagerung der Primer und Sonden auch bei

einer höheren Annealingtemperatur. Nach jedem Zyklus verdoppelt sich theoretisch

die Anzahl der neu synthetisierten DNA-Fragmente (Amplifikate).


27

2.4.1.1 ß-Aktin PCR

Um den Erfolg der cDNA-Synthese zu überprüfen wurde eine PCR mit ß-Aktin-

spezifischen Primern durchgeführt. Dabei wurde die FastStart Taq DNA Polymerase

(Roche Applied Science, 68298 Mannheim) unter Standardbedingungen verwendet

(2 mmol∙l-1 MgCl2, 0,2 mmol∙l-1 dNTPs, 0,5 µmol∙l-1 sense Primer, 0,5 µmol∙l-1

antisense Primer, 1 U Taq Polymerase). Die Inkubation im Thermocycler (MyCycler;

Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) lief unter folgenden Bedingungen ab:

5 min 95°C, 30 Zyklen von 30 s 95°C, 30 s 55°C, 45 s 72°C und einmalig 10 min

72°C. Anschließend wurden die mit Roti®-Load DNA-Puffer (Roth GmbH & Co. KG,

76185 Karlsruhe) versetzten Proben mithilfe eines 3%igen Agarose-TAE-Gels bei

einer Spannung von 100 V (Power Pac 3000; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939

München) größenfraktioniert, wobei der pUC19-Marker (Roth GmbH & Co. KG,

76185 Karlsruhe) als Größenstandard verwendet wurde. Nach der

Agarosegelelektrophorese wurde das Gel 10 min in einer Ethidiumbromid-Lösung

gefärbt, 15 min in A. dest gewaschen und auf einem UV-Licht-Tisch beurteilt.

Tabelle 2.3: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von β-Aktin

Gen Primer Sequenz Produkt

ß-aktiv ACTB for 5`-ccctg agcgc aagta ctc-3` 125 bp

ACTB rev 5`-gcatt tgcgg tggac gat-3`

2.4.2 Die quantitative RT-PCR

2.4.2.1 Standardreihe für die Quantifizierung PMCA-spezifischer Transkripte

Die Standardreihe mit bekannter Anzahl an DNA-Fragmenten wird benötigt, um

unbekannte Ausgangsmengen an cDNA einer Probe zu berechnen. Die

Standardreihen sowie die Primer und Sonden für die Quantifizierung TRPV6- und

GAPDH-spezifischer Transkripte lagen in der Arbeitsgruppe bereits vor (WILKENS et

al. 2009).

PCR zur Herstellung der PMCA-spezifischen Transkripte

Als Matrize für die PCR diente jejunale cDNA, ein Reaktionsansatz enthielt als

Negativkontrolle keine cDNA, sondern eine entsprechende Menge A. dest.


28

Die Sequenzen der verwendeten Primer, die resultierende Amplifikatgröße sowie die

genauen Reaktionsbedingungen sind den Tabellen (Tab. 2.4 bis 2.6) zu entnehmen.

Tabelle 2.4: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von PMCA1b

Gen Primer Sequenz Produkt

PMCA PMCA sense 5`-ggtat tgctg gaact gatgt agcta a-3` 94 bp

PMCA antisense 5`-cgtcc ccaca taact gcttt-3`

Tabelle 2.5: Pipettierschema der PMCA-PCR

Volumen im Ansatz in µl

Konzentration der Gebrauchslösung

Konzentration im Ansatz

Wasser 17,65

PCR-Puffer 2,5 10-fach 1-fach

MgCl2 0,75 50 mmol∙l-1 1,5 mmol∙l-1

dNTPs 0,5 10 mmol∙l-1 0,2 mmol∙l-1

Primer sense 0,75 5 µmol∙l-1 0,15 µmol∙l-1

Primer antisene 0,75 5 µmol∙l-1 0,15 µmol∙l-1

Taq-Polymerase 0,1 5 U∙µl-1 0,02 U∙µl-1

cDNA 2,0

Gesamtvolumen 25,0

Tabelle 2.6: Inkubationsbedingungen der PMCA-PCR

I II, 40 Wiederholungen III

3 min 94°C 15 s 94°C 1 min 61°C

∞ 4°C

Aufreinigung und Sequenzierung des PCR-Produkts

Für die Ligation des PCR-Produktes in den Vektor war es notwendig, überschüssige

Primer, Enzyme und Salze aus dem Ansatz zu entfernen. Zur Aufreinigung des PCR-

Produktes wurde das MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, 40724 Hilden)

nach Herstellerangaben verwendet. Dazu wurde der PCR-Reaktionsansatz mit der

5-fachen Menge an PB-Puffer vermischt, das Gemisch anschließend zum Binden der

DNA auf eine MinElute-Säule gegeben und für 1 min bei 13 000 rpm (Biofuge pico;


29

Heraeus Instruments, 63450 Hanau) zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen

und die Säule mit 750 µl PE-Puffer und anschließender Zentrifugation bei 13 000 rpm

und 1 min gewaschen. Zur vollständigen Trocknung der Säule wurde ein weiteres

Mal zentrifugiert, bevor die Säule in ein neues Sammelgefäß überführt und die

gebundene DNA mit 10 µl sterilem Wasser durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für

1 min eluiert wurde.

Die Sequenzierung im Kettenabbruchverfahren erfolgte durch die Firma GATC

Biotech AG (78467 Konstanz). Die Spezifität der Sequenz wurde anschließend durch

Abgleich mit veröffentlichten Sequenzen anderer Spezies mithilfe des Algorhythmus

BLAST überprüft.

Ligation

Das aufgereinigte Amplifikat wurde in den linearisiert vorliegenden Vektor pGEM®-T

Easy (Promega GmbH, 8819 Mannheim) ligiert. Der Vektor enthält eine Ampicillin-

Resistenz und eine in einem lac-Operon liegende Multiple cloning region, die man

sich bei der anschließenden Selektion der Bakterien zunutze macht.

Die Ligation des Amplifikates erfolgte nach Anweisung des Herstellers, dazu wurden

3 µl des in A. dest. gelösten PCR-Produktes zusammen mit 50 ng pGEM-T Easy,

5 µl Rapid Ligation Buffer Konzentrat und 3 Units T4 DNA Ligase über Nacht bei 4°C

inkubiert.

Transformation

Für die Transformation wurden am nächsten Morgen 2 µl des Ligationsansatzes mit

25 µl Solopack Gold Competent Cells (Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande)

vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Für die Hitzeschocktransformation erfolgte

eine Erwärmung der Zellsuspension auf 42°C in einem Heizblock (Eppendorf

Thermomixer 5436; Eppendorf AG, 22331 Hamburg) bei 42°C für exakt 60 s mit

anschließender Kühlung auf Eis über eine Dauer von 2 min. Nachdem die Zellen für

1 h bei 37°C unter mäßigem Schütteln bei 150 rpm (Schüttelinkubator Typ 3031;

Gesellschaft für Labortechnik mbH, 30938 Burgwedel) in 500 µl LB-Flüssigmedium

ohne Antibiotikazusatz inkubiert worden waren, wurden anschließend 100 µl der

regenerierten Kulturen auf mit 40 µl XGal (50 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-

Galaktopyranosid) und 60 µl PTG-Lösung (100mM Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid)

bestrichenen Selektivnährböden (LB-Agar-Platten mit 25 µg/ml Ampicillin)


30

gleichmäßig ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Aufgrund der mit dem

Vektor übertragenen Ampicillin-Resistenz wachsen nur erfolgreich mit dem pGEM-T

Easy transformierte Zellen unter Bildung von blauen und weißen Kolonien auf dem

Selektivnährboden. Zellen, die ein Plasmid ohne das Ligationsprodukt in der Multiple

cloning region aufgenommen haben, verfügen über ein intaktes lacZ-Gen und sind

deshalb in der Lage, die Galaktose aus dem Nährboden abzubauen. Der bei diesem

Vorgang entstehende Farbstoff führt zur Bildung von blauen Kolonien. Wurde das

Insert jedoch in das Plasmid aufgenommen, wird das lacZ-Gen zerstört und die

Zellen bilden weiße Kolonien aus. Von diesen weißen Kolonien wurden 4

ausgewählt, jeweils einzeln von der Platte entnommen und in 3 ml LB-

Flüssigmedium mit Ampicillin-Zusatz bei 37°C und 150 rpm über Nacht inkubiert.

Plasmid-Präparation

Die Plasmide wurden mit dem kommerziell erhältlichen PureYieldTM Plasmid

Miniprep System (Promega GmbH, 8819 Mannheim) nach Angaben des Herstellers

aufgereinigt. Dazu wurden die Bakterien aus den Übernachtkulturen bei

Raumtemperatur 30 s bei 13 000 rpm (Biofuge pico; Heraeus Instruments, 63450

Hanau) abzentrifugiert und das Pellet anschließend mit 600 µl TE-Puffer

resuspendiert. Nach einer Zugabe von 100 µl „Cell-Lysis“-Puffer und Mischen durch

mehrmaliges Schwenken wurde die Lysisreaktion nach 2 min durch Zugabe von

350 µl kalter Neutralisationslösung gestoppt. Nach einer 3 minütigen Zentrifugation

bei 13 000 rpm wurde der Überstand auf eine Säule gegeben, worauf sich ein

weiterer Zentrifugationsschritt für 15 s bei 13 000 rpm anschloss. Die Säule wurde

mit 200 µl „Endotoxin-Removal“-Waschlösung und im Anschluss mit 400 µl

„Column“-Waschlösung gespült, wobei sich jeweils eine Zentrifugation bei

13 000 rpm für 30 s anschloss. Zuletzt wurde die Plasmid-DNA in 30 µl A. dest.

eluiert. Nachdem Reinheit und Konzentration der DNA photometrisch bestimmt

worden waren (Eppendorf Biophotometer; Eppendorf AG, 22331 Hamburg), wurde

sie bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.

Verdünnungsreihe

Anhand der photometrisch bestimmten Konzentration wurde als nächstes eine

Verdünnungsreihe hergestellt. Unter Berücksichtigung der Vektorgröße, der Größe

des Inserts und der Konzentration an Plasmid konnte computergestützt die Menge


31

an DNA errechnet werden, die notwendig ist, um eine Anfangskonzentration von 1010

Plasmiden pro 2 µl herzustellen. Diese wurde dann in weiteren Schritten jeweils 1:10

bis zu einer Konzentration von 102 pro 2 µl verdünnt. Diese Verdünnungsreihe mit

bekannter Konzentration wurde dann in der TaqMan PCR als Standard eingesetzt.

2.4.2.2 TaqMan-PCR

Bei der quantitativen PCR mit Hilfe von TaqMan-Sonden ist es möglich, bei

gleichzeitigem mitführen einer Standardreihe mit bekannter Anzahl an DNA-

Fragmenten, rechnerisch auf die amplifizierte Ausgangsmenge an cDNA zu

schließen. Bei der TaqMan PCR wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt, ein

Oligonuklotid, das zu dem zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt komplementär ist und

dessen 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (FAM, 6-Carboxy-

Fluorescein) markiert ist, während das 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (TAMRA,

6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin) trägt. Wird die intakte Sonde bei einer

spezifischen Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des

Reporter-Farbstoffes aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher unterdrückt.

Während der PCR bindet die Sonde zunächst mit den Primern an den

Matrizenstrang, während der Elongationsphase wird die Sonde dann aber durch die

5´-3´-Exonukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase hydrolysiert und durch einen

neuen Strang ersetzt. Durch die Sondenhydrolyse wird die räumliche Nähe zwischen

Reporter und Quencher unterbrochen. Der Anstieg der Fluoreszenz ist dabei direkt

proportional zur Anreicherung des Amplifikats.

Für die TaqMan-PCR wurde der TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied

Biosystems Deutschland GmbH, 64293 Darmstadt) verwendet. Die genaue

Zusammensetzung des Inkubationsansatzes ist der Tabelle 2.7 zu entnehmen. Die

Proben wurden jeweils im Doppelansatz untersucht. Als Leerwert diente ein Ansatz,

der A. dest. anstelle der cDNA enthielt.

Die bei der TaqMan PCR zur Quantifizierung von PMCA1b-spezifischen Transkripten

verwendeten Primer und Sonden (Tib Molbiol Syntheselabor GmbH, 12103 Berlin)

sowie die genauen Reaktionsbedingungen (Cycler Stratagene Mx3005P™; Agilent

Technologies Stratagene Products Division, Amsterdam, Niederlande) sind den

Tabellen 2.4, 2.8 und 2.9 zu entnehmen.


32

Tabelle 2.7: Pipettierschema der TaqMan-PCR

Volumen im Ansatz in µl

Konzentration der Gebrauchslösung

Konzentration im Ansatz

Wasser 6

10-fach Mix: 2 10-fach 1-fach

Primer sense 3 µmol∙l-1 0,3 µmol∙l-1

Primer antisense 3 µmol∙l-1 0,3 µmol∙l-1

Sonde 1 µmol∙l-1 0,1 µmol∙l-1

Universal Mastermix 10

cDNA 2

Gesamtvolumen 20

Tabelle 2.8: Sondensequenz

Gen Sonde Sequenz

PMCA PMCA TM 5`-FAM-caatg cttgt aaaat tgtca tccgt gaga--TMR-3`

Tabelle 2.9: Inkubationsbedingungen der TaqMan-PCR

I II III, 40 Wiederholungen

2 min 50°C 10 min 95°C

15 s 95°C

1 min 60°C

2.4.2.3 Auswertung

Die Auswertung erfolgte mit der MxProQPCR-Software (Agilent Technologies,

Stratagene Products Division, Amsterdam, Niederlande). Aus den Ct-Werten, der

den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die

Hintergrundfluoreszenz ansteigt und der bekannten Anzahl an Kopien der

Standardreihe wurde eine lineare Regression erstellt. Anhand dieser konnte für die

Ct-Werte der Proben die jeweilige Kopienanzahl zugeordnet werden. Die Anzahl der

für TRPV6 und PMCA1b codierenden Transkripte wurden dann auf die Kopien von

GAPDH bezogen.


33

2.4.3. Western Blot Analysen


Vorrat herstellen ließen, in alphabetischer Reihenfolge im Anhang B aufgeführt.

2.4.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese

Zur Vorbereitung auf die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

(SDS-PAGE) wurden die präparierten Rohmembranen (2.3.2) (50 µg) 5 min bei

16 000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Mit dem verbleibenden Pellet

wurde auf zwei unterschiedliche Weisen weiter verfahren. Für den TRPV6-Nachweis

wurde das Pellet in 8 µl Denaturierungspuffer mit 5% ß-Mercaptoethanol gelöst und

dann 5 min bei 95°C denaturiert. Im Falle des PMCA-Nachweises wurde das Pellet

ebenfalls in 8 µl Denaturierungspuffer gelöst, dieser enthielt aber DTT in einer

Konzentration von 100 mmol∙l-1. Anschließend wurde fünf Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf ein SDS-Gel

(4,75% Sammelgel, 8,5% Trenngel) aufgetragen, eine Spur pro Gel wurde jeweils mit

einem Größenmarker (Fermentas Prestained Protein SM 0671; Fermentas GmbH,

68789 St. Leon-Rot (Bereich 10-170 kDa)) beladen. Die Proteine wurden

elektrophoretisch in einem diskontinuierlichen Puffersystem nach LAEMMLI (1970)

aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte mit SDS-Laufpuffer zuerst bei 60 V für

30 min, anschließend wurde auf 120 V für die Dauer von 90 min erhöht.

2.4.3.2 Tank-Blot-Verfahren

Die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch aus dem Gel auf eine

Nitrocellulosemembran (NC-Membran; AmershamTM-HybondTM-ECL, GE Healthcare,

80807 München) transferiert. Die mit Transferpuffer ohne SDS gefüllte Blotapparatur

wurde während des elektrophoretischen Transfers bei einer Spannung von 100 V für

120 min mit Eis gekühlt.

Anschließend wurden die Proteine auf der Membran mit Ponceau Rot angefärbt.

Anhand der Proteinfärbung sollte die gleichmäßige Proteinverteilung und somit der

Erfolg des Transfers überprüft werden. Dazu wurden die Membranen 5 min in

Ponceau Rot-Lösung unter Schwenken inkubiert. Wenn sich auf der Membran ein

gleichmäßiges Bandenmuster zeigte, wurden diese einige Minuten in PBS entfärbt

und für die Antikörper-Inkubation verwendet.


34

2.4.3.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen

Vor der Inkubation mit dem primären Antikörper wurde die Membran zur Blockierung

unspezifischer Protein-Bindungsstellen über Nacht bei 4°C in PBS mit 5%

Magermilchpulver inkubiert. Nach kurzem Schwenken in PBS wurde anschließend

der jeweilige primäre Antikörper auf die Nitrocellulosemembran gegeben. Die

entsprechenden Konzentrationen und Inkubationszeiten sind der Tabelle 2.7 zu

entnehmen. Nach der Inkubation wurde die Membran in einem sich vier Mal

wiederholenden Waschschritt jeweils 10 min in PBST geschwenkt und anschließend

mit dem passenden Sekundärantikörper inkubiert (siehe Tabelle 2.7). Nach der

Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde die Membran erneut gewaschen

(s. o.), im Falle der Villin-Antikörper-Inkubation wurde der Waschvorgang auf

einmalige 10 min verkürzt. Alle Antikörper-Inkubationen erfolgten stets bei

Raumtemperatur.

Zur Visualisierung des Signals wurde Pierce (SuperSignal® West Dura Extended

Duration Substrate; Thermo Scientific, 3747 N. Meridian Rd., USA) als Substrat für

die mit dem Sekundärantikörper verknüpfte Peroxidase verwendet. Nach

fünfminütiger Einwirkzeit erfolgte die Aufnahme der entstandenen Chemilumineszenz

mittels ChemiDoc-System. Die Auswertung der detektierten Proteinbanden erfolgte

mit der Quantifizierungs-Software „Quantity One“ (Bio-Rad Laboratories GmbH,

80939 München). Jede Bande wurde einzeln vermessen, wobei die erhaltene

dimensionslose Zahl das Produkt aus der Fläche unter der Kurve (mm²) multipliziert

mit der Pixeldichte (Intensität) darstellt. Da die Quantifizierung der Proteinexpression

abhängig von der aufgetragenen Menge und der Integrität der Proteine ist, wurde

Villin als interner Standard verwendet, um die Werte zu relativieren und vergleichbar

zu machen. Für die Quantifizierung wurde der Quotient aus der Menge an

gesuchtem Protein und der Menge an Villin gebildet und mit den Quotienten anderer

Tiere verglichen. Dabei wurden nur die Quotienten der Tiere verglichen, die auf

derselben Membran aufgetragen waren, um sicherzustellen, dass die Proteine den

exakt gleichen Inkubationsbedingungen ausgesetzt waren.


35

Tabelle 2.7: Antikörper und Inkubationsbedingungen für den spezifischen Proteinnachweis

Antikörper Verdünnung Inkubationszeit

Rabbit anti-TRPV6, polyklonal H90; Santa Cruz

1:400 2 h

Sekundärantikörper (anti-rabbit IgG-HRP) A9169; Sigma

1:10 000 1 h

Mouse anti-PMCA1/4, monoklonal 5F10; Santa Cruz

1:400 2 h

Sekundärantikörper (anti-mouse IgG-HRP) A2304; Sigma

1:10 000 1 h

Mouse anti-Villin, monoklonal CTS2192; Labgen

1:4 000 30 min

Sekundärantikörper (anti-mouse IgG-HRP) s. o.

1:25 000 20 min

2.4.3.4 Überprüfung der Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA

Der Nachweis der Antikörper-Spezifität erfolgte durch Präinkubation des anti PMCA-

Antikörpers mit dem antigenen Peptid, welches anhand der spezifischen

Erkennungs-Aminosäurensequenz (FLCLEGKEFNRLIRNEKGEV) synthetisiert

worden war (JPT Peptide Technologies GmbH, 12489 Berlin). In 1 ml PBST wurden

2 µg primärer Antikörper und 100 µg antigenes Peptid bei 37°C mit 200 rpm für 2 h

im Schüttler inkubiert (Schüttelinkubator Typ 3031; Gesellschaft für Labortechnik

mbH, 30938 Burgwedel). Im Anschluss wurde das Gemisch über Nacht bei 4°C

gelagert. Parallel wurde zur Kontrolle eine entsprechende Menge Antikörper den

gleichen Inkubationsbedingungen ausgesetzt. Am nächsten Morgen wurden die

Ansätze noch mal für 1 h bei Raumtemperatur geschwenkt bevor die präinkubierten

Antikörper auf zwei identische Membranen mit transferierten Proteinen gegeben

wurden. Da vom Hersteller angegeben wird, dass der Antikörper reaktiv gegenüber

der PMCA aus Huhn und Ratte ist, wurden Membranen verwendet, die jejunale

Rohmembranen von Ratte und Huhn sowie von verschiedenen intestinalen

Abschnitten vom Schaf trugen. Der immunologische Nachweis erfolgte wie in Kap.

2.4.3.3 beschrieben.


36

2.4.3.5 Enzymatische Deglykosilierung des TRPV6-Proteins

Um eventuell vorhandene Glykosilierungen vom TRPV6-Protein zu entfernen,

wurden die Proben vor der Gel-Elektrophorese enzymatisch behandelt. Als

Endoglykosidase wurde das Enzym PNGase F (New England Biolabs GmbH, 65926

Frankfurt), welches die N-Glycan-Bindungen von Glykoproteinen zwischen Asparagin

und der Kohlenhydratkette spaltet, verwendet. Die Proben (50 µg) wurden wie oben

beschrieben 5 min bei 16 000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die im

verbleibenden Pellet enthaltenen Proteine in 2 µl 10-fach Glykoprotein

Denaturierungspuffer und 18 µl A. dest. 10 min bei 100°C denaturiert. Nach Zugabe

von 4 µl 10-fach G7-Reaktions-Puffer, 4 µl NP40 (10%), 10 µl A. dest. und 2 µl

PNGase F erfolgte eine Inkubation bei 37 °C für 1 h. Durch Zugabe des 3-fachen

Volumens eiskalten Acetons wurden die Proteine bei -20 °C über Nacht gefällt. Am

nächsten Tag wurden die ausgefällten Proben 15 min bei 16 000 g zentrifugiert, der

Überstand verworfen und das Pellet bei 37°C 5 min im Heizblock getrocknet. Das

Pellet wurde in 15 µl Denaturierungspuffer mit 5% ß-Mercaptoethanol gelöst und

nach 5 minütiger Hitzedenaturierung bei 95°C zusammen mit Proben ohne

Enzymbehandlung auf ein Gel aufgetragen. Elektrophorese und immunologischer

Proteinnachweis erfolgten wie in Kap. 2.4.3.1- 2.4.3.3 beschrieben.

2.5 Funktionelle Studien


Vorrat herstellen ließen in alphabetischer Reihenfolge im Anhang C aufgeführt.

2.5.1 Durchführung der Aufnahmestudien in BSMV

Die bei -80°C gelagerte Vesikelsuspension wurde zunächst auf Eis aufgetaut und

anschließend durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-Einmalspritze und einer

0,45 x 25 mm Kanüle erneut homogenisiert. Die im Folgenden beschriebenen

Schritte wurden alle bei Raumtemperatur durchgeführt.

Zur Durchführung der Aufnahmestudien in die Bürstensaummembranvesikel wurde

die Vesikelsuspension mit dem jeweiligen radioaktiv-markierten Inkubationsansatz

(3H-Glukose oder 45Calcium) auf einem Schüttler (Heidolph REAX 2000; Heidolph


37

Instruments, 91126 Schwabach) vermischt und je nach Versuchsansatz für einen

definierten Zeitraum inkubiert. Durch Zugabe von 1 ml eiskalter Stopplösung wurden

die ablaufenden Transportvorgänge abgebrochen und die BSMV mittels

Schnellfiltrationstechnik (Nitrocellulose-Membranfilter, Porengröße 0,65 µm;

Sartorius AG, 37075 Göttingen) von der restlichen Inkubationslösung getrennt. Um

die Probe vollständig zu entfernen wurde das Reaktionsröhrchen erneut mit 1 ml

eisgekühlter Stopplösung nachgespült.

Der Filter wurde anschließend zweimal mit 5 ml Lösung gespült, bevor dieser in

einem Minivial (Polyethylen Vial, 6 ml; PerkinElmer, Life Sciences, 63110 Rodgau)

mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit (LumasafeTM Plus, Luma * LSC B.V.; PerkinElmer,

Life Sciences, 63266 Dreieich) versetzt wurde. Nach gründlichem Mischen wurde die

Aktivität in einem Flüssigkeits-Szintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500TR Liquid

Scintillation Analyzer; Canberra-Packard GmbH, 63266 Dreieich) bestimmt. Alle

Proben wurden in Dreifachbestimmung gemessen.

Um den Leerwert zu bestimmen, wurde der Inkubationsansatz ohne Zugabe von

Vesikelsuspension in gleicher Weise wie die Proben filtriert und analysiert. Zur

Ermittlung der Gesamtaktivität wurde der jeweilige Inkubationsansatz direkt mit der

Szintillationsflüssigkeit vermischt und gemessen. Auch hier erfolgten jeweils

Dreifachbestimmungen.

2.5.2 Berechnung von [Ca2+]frei

Konzentration an freiem Ca2+ ([Ca2+]frei) und Gesamt-Ca2+-Konzentration ([Ca2+]ges)

der Inkubationsansätze mit 0,5 mmol∙l-1 EGTA.

[Ca2+]frei [mmol∙l-1] 0,045 0,09 0,4 0,75 1,0 2,0 4,0

[Ca2+]ges [mmol∙l-1] 0,544 0,590 0,900 1,250 1,500 2,500 4,500

Die Konzentration an freiem Ca2+ ([Ca2+]frei) in Bezug auf die Gesamt-Ca2+-

Konzentration in den Inkubationsansätzen wurde mittels der Software WINMAX32

Version 2.50 bestimmt. EGTA fungiert als Komplexbildner, mit dem sich bei

bekannter Affinität von Calcium zu EGTA sowie unter einem definierten pH-Wert und


38

einer definierten Temperatur die Konzentration an freien Calcium-Ionen

entsprechend dem Massenwirkungsgesetz einstellt.

2.5.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme

Zur Überprüfung der funktionellen Integrität der BSMV wurden in einem ersten

Versuchsansatz, zeitabhängige Glukoseaufahmestudien durchgeführt. Hierzu

wurden Vesikel aus jejunalem Gewebe, das von Schafen aus einem Vorversuch mit

einem Versuchsprotokoll, welches ebenfalls eine Ca-restriktive Fütterung bzw. eine

Calcitriolbehandlung beinhaltete, stammte, verwendet und deren relative

Anreicherung überprüft.

Die Aufnahmerate wurde in zwei unterschiedlichen Reaktionsansätzen, mit einem

Na+-haltigen Inkubationsmedium bzw. einem Inkubationsmedium ohne Na+-Ionen,

bestimmt. Zu diesem Zweck wurden aus zweifach konzentriertem NaCl- bzw. KCl-

Transportpuffer, Glukose-Lösung (0,5 mmol∙l-1) und 3H-Glukose Inkubationsansätze

hergestellt. Hieraus wurden je 80 µl entnommen und diese mit 20 µl

Vesikelsuspension vermischt. Nach 10 s, 15 s, 25 s, 30 s, 1 min, 2 min, 5 min,

10 min, sowie 1 h, 3 h und 4 h Inkubationszeit wurde die Aufnahme mittels

Stopplösung unterbrochen und wie oben beschrieben weiterbehandelt. Die

Endkonzentration von Glukose betrug jeweils 0,05 mmol∙l-1.

Die Glukose-Aufnahme in die BSMV als Funktion der Zeit wird in nmol Glukose je mg

Protein angegeben. Die Berechnung der Glukoseaufnahme erfolgte analog zu der

Berechnung der Calcium-Aufnahme (siehe Kap. 2.5.6).

2.5.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme

Mit der Untersuchung der zeitabhängigen Calciumaufnahme in die BSMV wurde der

Zeitraum der linearen Aufnahme bestimmt, damit ein definierter Zeitpunkt für die

konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien festgelegt werden konnte. Für die

Untersuchung standen ebenfalls Vesikelpräparationen aus dem Vorversuch zur

Verfügung, an denen der Zeitverlauf der Ca2+-Aufnahme in BSMV vom Schaf

exemplarisch bestimmt wurde.


39

Die Analyse der Aufnahme von Calcium in die BSMV als Funktion der Zeit wurde

sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 im

Inkubationsansatz durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach

konzentriertem KCl-Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO bzw.

A23187-Stammlösung in DMSO (1 mg∙ml-1), CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca

Inkubationsansätze hergestellt. Hieraus wurden je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension

vermischt. Nach 10 s, 20 s, 30 s, 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, sowie 1 h, 2 h und 3 h

Inkubationszeit wurde die Aufnahme mittels Stopplösung unterbrochen und wie oben

beschrieben weiterbehandelt. Die Endkonzentrationen in den Aufnahmestudien

betrugen für EGTA 0,5 mmol∙l-1, für A23187 10 µg∙ml-1 und für [Ca2+]frei 0,09 mmol∙l-1.

2.5.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme

Die Analyse zur Aufnahme von Calcium in die BSMV in Abhängigkeit von [Ca2+]frei

wurde bei freien Ca2+-Konzentrationen von 0,045, 0,09, 0,4, 0,75, 1,0, 2,0 und

4,0 mmol∙l-1, in einem Ansatz zusätzlich in Gegenwart des Calcium-Ionophors

A23187, durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach konzentriertem KCl-

Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO bzw. A23187-Stammlösung in

DMSO (1 mg∙ml-1), CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca Inkubationsansätze

hergestellt. Hieraus wurden je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension vermischt, 30 s bei

RT inkubiert und anschließend wie oben beschrieben bearbeitet. Die

Endkonzentrationen in den Aufnahmestudien betrugen für EGTA 0,5 mmol∙l-1, für

A23187 10 µg∙ml-1 und für [Ca2+]frei zwischen 0,045 und 4,0 mmol∙l-1. Die

Untersuchung in Gegenwart von A23187 wurde bei einer freien Ca2+-Konzentration

von 0,09 mmol∙l-1 durchgeführt.

2.5.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen

Aus den ermittelten Daten der Szintillationsmessungen sowie der

Proteinkonzentration im Inkubationsansatz wurde die Ca2+-Aufnahme (ACa) in die

BSMV als Funktion der Zeit bzw. der Konzentration an freiem Calcium mit

nachstehender Formel berechnet.


40

(cpmProbe,t – cpmLeer) x [Ca2+]frei

ACa (t, [Ca2+]frei) = .

cpmTotal x [Protein]

mit:

ACa (t, [Ca2+]frei) Ca2+-Aufnahme nach der Inkubationsdauer t bei einer freien

Ca2+-Konzentration von [Ca2+]frei [nmol∙ (mg Protein)-1]

cpmProbe,t gemessene Aktivität in der Probe nach der Inkubationsdauer t

[cpm]

cpmLeer gemessene Aktivität des Leerwerts [cpm]

[Ca2+]frei Konzentration an freiem Ca2+ im Inkubationsansatz [mmol∙l-1]

cpmTotal Gesamtaktivität im Inkubationsansatz [cpm]

[Protein] Proteinkonzentration im Inkubationsansatz [mg∙l-1]

Anhand der berechneten Werte wurden für gleiche Inkubationszeiten die kinetischen

Kenngrößen einer konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme im Sinne einer

Michaelis-Menten-Kinetik ermittelt. Zur Kalkulation der Variablen wurde die Software

GraphPad Prism® verwendet. Dabei wurde folgende Formel zu Grunde gelegt:

Vmax ∙ [Ca2+]frei

Ca2+-Aufnahme = –––––––––––––– + U ∙ [Ca2+]frei

Km + [Ca2+]frei

mit:

Vmax Maximum der sättigbaren Aufnahme [nmol∙ (mg Protein)-1]

Km Michaelis-Menten-Konstante [mmol∙l-1]

[Ca2+]frei Konzentration des freien Calciums [mmol∙l-1]

U Steigung des nicht sättigbaren Anteils der Ca2+-Aufnahme


41

2.5.8 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die

Calciumaufnahme in jejunale BSMV

Die Analyse zum Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die

Aufnahme von Calcium in die BSMV wurde bei einer freien Ca2+-Konzentration von

1,0 mmol∙l-1 und einer Ruthenium Rot-Endkonzentration von 100 µmol∙l-1

durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach konzentriertem KCl-

Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO, Ruthenium Rot (1 mmol∙l-1)

CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca Inkubationsansätze hergestellt. Hieraus wurden

je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension vermischt, 30 s bei RT inkubiert und

anschließend wie oben beschrieben bearbeitet.

2.6 Statistik

In den Tabellen und Abbildungen werden die Ergebnisse als arithmetische

Mittelwerte ( x ) mit entsprechenden Standardfehlern (SEM) angegeben. Die

statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm GraphPad

Prism® Version 5.00 (GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com).

Die Einzelwerte einer Gruppe wurden zunächst auf das Vorliegen einer Gauß´schen

Normalverteilung überprüft. Zum Vergleich zweier Gruppenmittelwerte wurde der

nicht gepaarte t-Test nach Student gewählt. Mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse

(Two-way ANOVA) wurden die Expressionsdaten sowie die kinetischen Kenngrößen

aller vier Gruppen miteinander verglichen um den Einfluss der Fütterung, der

Behandlung und einer möglichen Interaktion zu untersuchen.

Für die Signifikanzangaben gilt:

n. s. nicht signifikant

p<0,05 *, schwach signifikant

p<0,01 **, signifikant

p<0,001 ***, hoch signifikant

Ergebnisse

42

3 Ergebnisse

3.1 Charakterisierung des Tiermodells

Durch die Bestimmung der Konzentrationen von Gesamtcalcium (Ca), ionisiertem

Calcium (Ca²+), Phosphat (Pi) und Calcitriol im Plasma sollte der Effekt der Calcium-

Depletions-Fütterung und der Calcitriolbehandlung auf die Calcium-Homöostase

überprüft werden.

3.1.1 Einfluss der Fütterung auf wichtige Blutparameter

In der Tabelle 3.1 ist der Einfluss der mindestens vierwöchigen Ca-Restriktion auf die

wichtigsten Blutparameter dargestellt. Die Plasma-Ca-Konzentrationen und ebenso

die Ca2+-Konzentrationen waren bei den Ca-restriktiv gefütterten Schafen signifikant

erniedrigt, während die Pi- und Calcitriol-Spiegel im Plasma gegenüber den Tieren

der Kontrollfütterungsgruppe signifikant erhöht waren.

Für die Messung der Parameter wurden Blutproben, die unmittelbar vor der

Calcitriolbehandlung aus dem Venenkatheter entnommen wurden, verwendet. Bei

einem Tier der Kontrollgruppe gelang es nicht den Venenkatheter zu platzieren,

weshalb in der Kontrollgruppe die Auswertung nur mit n = 9 Tieren durchgeführt

wurde.

Tabelle 3.1: Ca-, Ca2+-, Pi- und Calcitriol-Konzentration im Plasma (Ca, Pi,

Calcitriol) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen nach einer mindestens

vierwöchigen diätetischen Calcium-Depletion ( x ± SEM, n = Anzahl

der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01,

***: p < 0,001

Gruppe Ca

[mmol ∙ l-1] Ca2+

[mmol ∙ l-1] Pi

[mmol ∙ l-1] Calcitriol [pg ∙ ml-1]

Kontrolle (Kon) n=9

2,57 ± 0,04 1,27 ± 0,01 1,82 ± 0,08 21,9 ± 2,1

Ca-Depletion (Ca-) n=10

2,37 ± 0,04** 1,19 ± 0,02*** 2,28 ± 0,12** 31,4 ± 3,4*

Ergebnisse

43

3.1.2 Unterschiede der Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma 12 h nach

der Behandlung

Die Auswirkung der Behandlung mit Calcitriol auf die Ca2+-Konzentration im Vollblut

sowie die Ca- und Pi-Konzentrationen im Plasma sind in Tabelle 3.2. dargestellt. Wie

erwartet, kam es infolge der Calcitriolinfusion in beiden Fütterungsgruppen innerhalb

der 12 h zu einem deutlichen Anstieg der Ca- und damit verbunden auch der Ca2+-

Konzentration. Ein signifikanter Anstieg der Pi-Konzentration infolge der

Calcitriolbehandlung konnte nur in der Kontrollfütterungsgruppe beobachtet werden.

Tabelle 3.2: Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma (Ca, Pi) bzw. Vollblut

(Ca2+) von Schafen 12 h nach Calcitriolbehandlung, Vergleich

zwischen den behandelten und den unbehandelten Tieren einer

Fütterungsgruppe ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des

Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001

Kon unbehandelt

n=4

Kon behandelt

n=5

Ca- unbehandelt

n=5

Ca- behandelt

n=5

Ca [mmol ∙ l-1] 2,69 ± 0,08 3,14 ± 0,05** 2,35 ± 0,3 2,66 ± 0,06**

Ca2+ [mmol ∙ l-1] 1,33 ± 0,02 1,54 ± 0,02*** 1,22 ± 0,03 1,33 ± 0,02*

Pi [mmol ∙ l-1] 1,62 ± 0,14 2,53 ± 0,15** 2,30 ± 0,19 2,18 ± 0,14

3.2 RNA-Expression

Mit Hilfe der TaqMan-PCR wurden die für TRPV6 und PMCA codierenden

Transcripte relativ zur Expression von GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-

Dehydrogenase) (Abb. 3.1) ermittelt. Der quantitative Nachweis konnte bei allen 20

Tieren erbracht und die Werte gruppenweise miteinander verglichen werden. Die

Werte der Leerwertproben lagen stets unterhalb der Nachweisgrenze. Die

statistische Auswertung ergab eine signifikant höhere Expression der TRPV6-mRNA

sowie der PMCA-mRNA bei den behandelten Tieren (Abb. 3.2, 3.3). Außerdem

zeigte sich ein signifikanter Effekt der Kombination aus Fütterung und Behandlung

auf die PMCA-mRNA-Expression. Für beide Gene zeigt sich eine höhere Expression

in der Calcium-Depletions-Gruppe gegenüber der Kontroll-fütterungsgruppe,

statistisch ließ sich dieser Fütterungseffekt aber nicht bestätigen.

Ergebnisse

44

Abb. 3.1: Darstellung der mRNA-Gehalte an GAPDH im Jejunum adäquat bzw.

restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol-

bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);

Ergebnisse der 2-way ANOVA.

Abb. 3.2: Darstellung der mRNA-Gehalte an TRPV6 im Verhältnis zu GAPDH


Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl

der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: ***: p <

0,001.

Ergebnisse

45

Abb. 3.3: Darstellung der mRNA-Gehalte an PMCA im Verhältnis zu GAPDH im

Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12

Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl

der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: *: p < 0,05,

***: p < 0,001.

3.3 Nachweis und Quantifizierung der spezifischen Transport-

proteine im Jejunum

Auf einer Membran wurden immer Proben von jeweils fünf Tieren aus zwei Gruppen

untersucht und miteinander verglichen. Um den Vergleich aller Gruppen miteinander

zu ermöglichen, mussten insgesamt vier Membranen angefertigt werden. Die

Auswertung erfolgte durch die Vermessung der spezifischen Banden bezogen auf

Villin als internen Standard. Jeweils eine repräsentative Membran ist hier

exemplarisch dargestellt. Die Ergebnisse der Auswertung sind als Balkendiagramm

dargestellt, wobei der Mittelwert der Expression der unbehandelten Gruppen bzw.

der Kontrollfütterungsgruppen gleich 1 gesetzt wurde und die Expressionen der

behandelten Gruppe bzw. der Calcium-Depletions-Gruppen normiert auf diese

aufgetragen wurde.

3.3.1 Semiquantitative Detektion des TRPV6-Proteins

Das TRPV6-Protein wurde in Gesamtmembranen jejunaler Enterozyten als

Doppelbande mit einer Größe von ca. 70 und 72 kDa bei allen Tieren nachgewiesen.

In Abbildung 3.4 ist eine Membran exemplarisch dargestellt.

Ergebnisse

46

Die Vermutung, dass es sich bei der Bande mit dem höheren Molekulargewicht um

eine glykosilierte Form des Proteins handelt konnte nicht bestätigt werden. Trotz

Vorinkubation der Probe mit der Endoglykase (PNGase F), zwecks Abspaltung der

Glykosilierung, traten ebenfalls zwei Banden auf. Ausgewertet wurde nur die untere

Bande, da sich für den Gruppenvergleich kein Unterschied ergab, ob nur die untere

oder beide Banden berücksichtigt wurden.

Als interner Standard konnte das Villin-Protein in einer Größe von 95 kDa in allen

Proben detektiert werden (Abb. 3.5).

Abb. 3.4: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des TRPV6-


Membran: unbehandelte und behandelte Tiere der Calcium-

Depletions-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit einem

unbehandelten, jeweils abwechselnd aufgetragen.

Abb. 3.5: Der zur Abbildung 3.4 dazugehörige semiquantitative Nachweis von

Villin

Bei der Auswertung fiel auf, dass sich für ein Tier (Kontrollfütterung – unbehandelt)

Werte ergaben, die das 3-fache des Mittelwertes der restlichen vier Tiere dieser

Gruppe betrugen (Abb. 3.6). Aus diesem Grund wurde dieses Tier als Ausreißer

betrachtet und nicht für den Gruppenvergleich mit den Tieren (Kontrollfütterung –

behandelt) herangezogen. So ergab sich ein deutlicher Einfluss der

Calcitriolbehandlung auf die Expression des TRPV6-Proteins in jejunalen

Gesamtmembranen. In der Kontrollfütterungsgruppe war bei den behandelten Tieren

die Expression gegenüber den unbehandelten Tieren dieser Gruppe signifikant

erhöht, ebenso in der Calcium-Depletions-Fütterungsgruppe (Abb. 3.7). Die

75 kDa75 kDa

95 kDa95 kDa

Ergebnisse

47

diätetische Ca-Restriktion hatte keinen signifikanten Einfluss auf die jejunale TRPV6-

Protein-Expression (Abb. 3.8).

Abb. 3.6: Densitometrische Werte der TRPV6-Expression bezogen auf die Villin-

Expression, auf der betreffenden Membran sind jeweils fünf

unbehandelte und fünf behandelte Tiere der Kontrollfütterungsgruppe

aufgetragen.




(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der unbehandelten

Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der behandelten Tiere

normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in

Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01.

Ergebnisse

48




(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat

gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Ca-

restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM,

Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p

< 0,05, **: p < 0,01.

3.3.2 Spezifität des PMCA-Protein-Nachweises

Die Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA wurde in der Western Analyse mittels

Präinkubation mit dem antigenen Peptid überprüft. In den jejunalen

Gesamtmembranen vom Schaf wurde das PMCA-Protein in einer Größe von 140

und 80 kDa detektiert. Laut Hersteller ist aber nur eine Bande mit einer Größe von

129-140 kDa zu erwarten, dies ließ sich auch an Gesamtmembranpräparationen vom

Hühnerdarm bestätigen. Nach Inkubation mit dem präinkubierten Antikörper

verschwanden beide Banden (Abb. 3.9), somit ist davon auszugehen, dass sowohl

die 140 kDa als auch die 80 kDa Bande beim Schaf spezifisch sind. Bei dem kleinen

Fragment (80 kDa) ist nicht klar, ob es in vivo existiert oder durch die Präparation

induziert wurde. Für die Auswertung wurden beide Banden vermessen.

Ergebnisse

49

Abb. 3.9: Überprüfung der PMCA-Antikörper-Spezifität an Gesamtmembranen

verschiedener Darmabschnitte von Ratte (1), Huhn (2), Jejunum (3),

Colon (4) und Pansen (5) vom Schaf.

3.3.3 Semiquantitative Detektion des PMCA-Proteins

Das PMCA-Protein wurde in jejunalen Gesamtmembranen mit zwei spezifischen

Banden (80 und 140 kDa) bei allen Tieren nachgewiesen (Abb. 3.10). Die

Calcitriolbehandlung hatte bei den Tieren der Kontrollfütterungsgruppe einen

signifikanten Einfluss auf die Expression des PMCA-Proteins. Bei den Calcium-

restriktiv gefütterten Tieren konnte kein statistisch abgesicherter Unterschied in der

jejunalen PMCA-Expressionshöhe durch die Behandlung festgestellt werden,

tendenziell ist aber die Menge an PMCA-Protein bei den behandelten Tieren erhöht

(Abb. 3.11). Die Auswertung ergab signifikant höhere PMCA-Expressionen bei den

behandelten Tieren der Kontrollfütterungsgruppe gegenüber denen der Calcium-

Depletionsgruppe. Die Expressionshöhe des Proteins wurde bei den unbehandelten

nicht durch die diätetische Calcium-Depletion beeinflusst (Abb. 3.12).

Abb. 3.10: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des PMCA-


Membran: behandelte Tiere der Calcium-Depletions- bzw. der

Kontroll-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit den restriktiv

gefütterten, jeweils abwechselnd aufgetragen.

140 kDa

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Antikörper Antikörper +

Antigenes Peptid

140 kDa

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5


Antigenes Peptid

140 kDa

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5


Antigenes Peptid

130 kDa

75 kDa

130 kDa

75 kDa

Ergebnisse

50







der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05.





adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression

der Calcium-restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen

( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students

t-Tests: *: p < 0,05.

Ergebnisse

51

3.4 Charakterisierung der BSMV

3.4.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktionen

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Leitenzym für die

Bürstensaummembran (BSM), sowie die Aktivität der Na+/K+-ATPase als

Markerenzym für die basolaterale Membran (BLM) wurden sowohl im ersten

Gewebehomogenat als auch in der Vesikelsuspension bestimmt (Tabelle 3.3).

Hierdurch war es möglich, die relative Anreicherung der Bürstensaummembranen

gegenüber den basolateralen Membranen abzuschätzen: sie betrug das 10,9 bis

14,2-fache der Ausgangsmenge. Die Aktivität der Leitenzyme wiesen weder im

Ausgangshomogenat, noch in der Vesikelsuspension signifikante Gruppen-

unterschiede auf, auch die relative Anreicherung unterschied sich nicht signifikant

zwischen den Gruppen.

Tabelle 3.3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der

Na+/K+-ATPase im Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension.

Darstellung der Anreicherungsfaktoren als Quotient aus den Werten

von Suspension und Homogenat. Relative Anreicherung wurde als

Quotient aus BSM:BLM dargestellt. ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)

Kon (unbehandelt)

n=4

Kon (behandelt)

n=5

Ca- (unbehandelt)

n=5

Ca- (behandelt)

n=5

Aktivität der alkalischen Phosphatase

Homogenat (U ∙ g Protein

-1)

1354 ± 364 1435 ± 160 1447 ± 281 955 ± 107

Vesikelsuspension (U ∙ g Protein

-1)

21029 ± 3723 23125 ± 3065 23234 ± 3132 17513 ± 1465

Anreicherung 16,80 ± 1,61 16,03 ± 0,71 17,36 ± 1,78 18,64 ± 1,14

Aktivität der Na+/K

+-ATPase

Homogenat (U ∙ g Protein

-1)

81,41 ± 9,79 78,64 ± 7,32 68,71 ± 5,63 72,15 ± 6,84

Vesikelsuspension (U ∙ g Protein

-1)

109,10 ± 16,32 118,30± 13,79 111,80 ± 7,04 96,52 ± 6,33

Anreicherung 1,38 ± 0,25 1,53 ± 0,14 1,65 ± 0,12 1,39 ± 0,17

Relative Anreicherung 12,87 ± 1,73 10,86 ± 0,99 10,95 ± 1,74 14,17 ± 2,01

Ergebnisse

52

3.4.2 Überprüfung der Funktionsfähigkeit der BSMV

Zur Überprüfung der Intaktheit und der Funktionstüchtigkeit der

Bürstensaummembranvesikel vom Schaf wurde die Glukoseaufnahme in An- und

Abwesenheit eines einwärtsgerichteten Na+-Gradienten ermittelt. Es zeigte sich in

Anwesenheit des Na+-Gradienten ein deutliches Overshoot-Phänomen, welches nur

mit intakten Vesikeln darzustellen ist. Die Glukoseaufnahme erreichte ihr Maximum

mit ca. 1 nmol ∙ mg-1 Protein nach 1-2 min und fiel dann wieder ab. Nach 180 min war

der Ausgleichswert zwischen der Aufnahme mit Gradienten und ohne Na+-

Gradienten erreicht (Abb. 3.13). Da damit exemplarisch die Funktionstüchtigkeit

jejunaler BSMV vom Schaf demonstriert werden konnte, wurde im Weiteren für alle

Vesikel die Intaktheit durch Ca2+-Aufnahme in An- und Abwesenheit des Calcium-

Ionophors A23187 überprüft. Das Einlagern des Ionophors in die Vesikelmembran

führt zu einem vielfach schnelleren Ca2+-Einstrom in die Vesikel, als dieser in die

Vesikel ohne das Ionophor erfolgt. Verglichen wurde die Aufnahme in An- und

Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 nach 30 s und einer Ca2+-

Konzentration von 0,09 mmol ∙ l-1, indem der Quotient aus der Ca2+-Aufnahme mit

Ionophor und der Ca2+-Aufnahme ohne Ionophor betrachtet wurde. Die Vesikel

galten als intakt, wenn der Quotient mindestens größer als 2 war. Alle Tiere wiesen

eine mindestens 3-fach höhere Ca2+-Aufnahme nach 30 s in Anwesenheit des

Ionophores auf. Es gab einen signifikanten Unterschied des A23187-Quotienten

zwischen den Gruppen. Die Calcium-depletiert gefütterten Tiere zeigten im Mittel

eine deutlich geringere Steigerung der Aufnahmerate durch das Ionophor (Abb.

3.14).

Ergebnisse

53

Abb. 3.13: Zeitabhängige Glukoseaufnahme in jejunale BSMV bei RT und

0,05 mmol∙l-1 Glukose in An- und Abwesenheit von Na+ im

Inkubationsmedium.

Abb. 3.14: A23187-Quotient (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz

des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-

Konzentration von 0,09 mmol∙l-1) der vier Versuchsgruppen ( x ± SEM,

Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way

ANOVA: ***: p < 0,001.

Ergebnisse

54

3.4.2 Ca2+-Aufnahmeraten in jejunale BSMV

Die zeitabhängige Ca2+-Aufnahme wurde mit einer freien Ca2+-Konzentration von

0,09 mmol∙l-1 im Medium in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187

über einen Zeitraum von 3 Stunden bestimmt. Ohne Ionophor wird Ca2+ relativ

langsam in die BSMV transportiert, der Kurvenverlauf ist anfänglich, in den ersten 5

bis 10 min, steiler und flacht dann immer mehr ab. Die Vesikel, die mit dem Ionophor

inkubiert wurden, füllten sich innerhalb der ersten Minute bis zu einem Maximum mit

Ca2+ (Abb. 3.15). Aufgrund der Tatsache, dass die Aufnahme in die BSMV ohne

Ionophor nur in den ersten 50 s linear verläuft (Abb. 3.16), wurden die

konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien bei 30 s durchgeführt, da für die

Berechnung der kinetischen Parameter die „schnelle“ Ca2+-Aufnahmerate

entscheidend ist.

Abb. 3.15: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV mit und ohne Zusatz

des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+

-

Konzentration von 0,09 mmol∙l-1.

Ergebnisse

55

Abb. 3.16: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV in den ersten 50 s

bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1.

Die konzentrationsabhängige Ca2+-Aufnahme in die jejunalen BSMV in den ersten

30 s wurde bei Raumtemperatur als Gesamt-Aufnahmerate bestimmt. Diese

Gesamt-Aufnahmerate setzt sich zusammen aus einem unspezifischen, nicht

sättigbaren und einem sättigbaren Anteil, dessen Kurvenverlauf einer Michaelis-

Menten-Kinetik entspricht und aus dem sich rechnerisch die Parameter Km und Vmax

bestimmen lassen. Die Michaelis-Menten-Konstante (Km), die die Menge an Substrat

angibt, die für die halbmaximale Transportrate notwendig ist, ist ein Maß für die Ca2+-

Affinität des Transportsystems und die maximale Aufnahmerate (Vmax) ein Maß für

die Transportkapazität bzw. Anzahl der Transporter. Die Berechnung der kinetischen

Parameter erfolgte mit dem Computerprogramm GraphPad Prism® Version 5.00.

Zur Bestimmung der spezifischen Ca2+-Aufnahmerate wurde von der Gesamt-

Aufnahmerate die linear verlaufende, transporterunabhängige Aufnahmerate

subtrahiert. Abbildung 3.17 zeigt dies exemplarisch für ein Tier mit einem hohen

unspezifischen Anteil der Gesamt-Aufnahmerate und für ein Tier mit einem geringen

unspezifischen Anteil.

Ergebnisse

56

Abb. 3.17: Ca

2+-Gesamtaufnahmerate in jejunale BSMV bei RT mit den

dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den daraus

resultierenden spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten und den berechneten

Vmax und Km-Werten von 2 Schafen.

Ergebnisse

57

Abb. 3.18: Spezifische Ca2+-Aufnahmerate in jejunale BSMV unbehandelter

(gestrichelte Linien) bzw. mit Calcitriol behandelter (durchgezogene

Linien), adäquat (schwarze Linien) bzw. restriktiv mit Calcium (graue

Linien) versorgter Schafe in Abhängigkeit von der freien Ca2+-

Konzentration (Kurven stellen Mittelwerte von je 5 Tieren da).

In der nachfolgenden Abbildung sind die Vmax- und Km-Werte als Gruppenmittelwerte

dargestellt. Statistisch ergab sich kein signifikanter Effekt der Fütterung oder der

Behandlung auf die maximale Transportkapazität. Bei den Km-Werten ergab die

Auswertung die Tendenz eines Fütterungseffekts mit p = 0,06.

Abb.3.19: Maximale Transportkapazität (Vmax) der Ca2+-Aufnahme in jejunale

BSMV der vier Gruppen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);

Ergebnisse der 2-way ANOVA.

Ergebnisse

58

Abb. 3.20: Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV der vier Gruppen

( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way

ANOVA.

3.4.3 Der Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die Ca2+-

Aufnahme in jejunale BSMV

Durch die Anwesenheit von 100 µmol∙l-1 Ruthenium Rot im Inkubationsansatz konnte

die Ca2+-Aufnahme in die BSMV in keiner der vier Gruppen signifikant gesenkt

werden.

Diskussion

59

4 Diskussion

4.1 Beurteilung des Tiermodells

Die mindestens vierwöchige alimentäre Calcium-Depletion führte zu einer Adaptation

der Tiere. Dies wird sichtbar an den Veränderungen der Ca, Ca2+, Pi und Calcitriol-

Konzentrationen im Plasma. Die Tiere zeigten mit 2,37 mmol∙l-1 signifikant niedrigere

Calcium-Konzentration im Plasma gegenüber den Tieren der Kontroll-

fütterungsgruppe, deren Werte bei 2,57 mmol∙l-1 lagen. In gleicher Weise verhielten

sich auch die Ca2+-Konzentrationen, die entsprechend 1,19 mmol∙l-1 und

1,27 mmol∙l-1 ergaben. Die Pi-Konzentrationen im Plasma waren durch die

Regulationsmechanismen von 1,82 mmol∙l-1 in der Kontrollgruppe auf 2,28 mmol∙l-1 in

der Calcium-Depletionsgruppe signifikant erhöht. Die Calcitriol-Konzentrationen

waren von 21,9 pg∙ml-1 auf 31,4 pg∙ml-1 um 44% erhöht. Auch hieran wird deutlich,

dass eine hormonelle Anpassung an das verminderte Calcium-Angebot erfolgte,

ohne dass sich eine klinisch pathologische Situation entwickelte.

Wie in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt werden konnte, erreichten die mit

dem Behandlungsprotokoll erzielten Calcitriol-Spiegel mit 2 000 pg∙ml-1 Werte, die

deutlich oberhalb des physiologischen Bereichs lagen (WILKENS et al. 2010). Die

Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer Dosierung hatte in der adäquat mit

Calcium versorgten Gruppe einen hypercalcämischen Effekt mit einem Anstieg der

Ca-Konzentration im Plasma von 2,69 mmol∙l-1 auf 3,14 mmol∙l-1 innerhalb von 12

Stunden zur Folge. Bei den Calcium-depletierten Tieren stieg die Ca-Konzentration

aufgrund der basal niedrigeren Werte von 2,35 mmol∙l-1 nur auf 2,66 mmol∙l-1. Relativ

gesehen liegen die Anstiege aber in vergleichbaren Größenordnungen.

Der hypercalcämische Effekt der Behandlung ließ sich nicht allein durch erhöhte

Mobilisation aus dem Knochen erklären. Da es darüber hinaus auch keine Hinweise

auf eine vermehrte renale Resorption gab, ergibt sich als sinnvolle Erklärung, dass

die gastrointestinale Resorption von Calcium erhöht sein muss (WILKENS et al.

2010). Unterstützt wird diese Hypothese von Ergebnissen aus In-vitro-

Untersuchungen mit der Ussing-Kammer-Technik. Im Jejunum wiesen die

Diskussion

60

behandelten Tiere signifikant erhöhte Calcium-Nettofluxraten auf (MROCHEN et al.

2010).

Die Adaptationsprozesse zeigen eindeutig, dass das Tiermodell wie geplant geeignet

ist, die calcitriolstimulierte Calcium-Resorption im Darm zu untersuchen.

4.2 Beurteilung der angewandten Methoden

4.2.1 Quantitative RT-PCR

In der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Expression von TRPV6 und PMCA mit

Hilfe der Real-Time PCR quantitativ untersucht, um so die Auswirkung eines

erhöhten Calcitriolspiegels auf die Transkription dieser Gene zu ermitteln. Zur

Expression von TRPV6 und PMCA beim Schaf werden in der Literatur bisher nur

qualitative Aussagen getroffen. So konnte eine deutliche mRNA-Expression beider

Gene im Jejunum und Duodenum adulter Schafe nachgewiesen werden (WILKENS

2006, WILKENS et al. 2010).

In der vorliegenden Studie wurde nun erstmals die Expression im Jejunum quantitativ

bestimmt. Für alle 20 Tiere konnte der quantitative Nachweis beider Gene erbracht

werden. Diese wurden in Bezug auf die mRNA-Expression des Housekeeping genes

GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) bestimmt. Auch in einer

Studie an calcitriolbehandelten Ratten wurde die Expression von GAPDH als interner

Standard zur Quantifizierung der intestinalen TRPV6-Expression eingesetzt

(BROWN et al. 2005). Es wird vorausgesetzt, dass dieses Enzym der Glykolyse in

etwa gleicher Menge in den Geweben der verschiedenen Tiere vorkommt und eine

ausreichende Stabilität aufweist (REIST et al. 2003, WANG & XU 2010). Dadurch

konnten Proben verglichen werden, deren Menge an intakter cDNA nicht exakt gleich

war.

Zwar gibt es in der Literatur Hinweise auf eine Hochregulation von GAPDH durch

geringe Dosen Calcitriol (DESPREZ et al. 1992), jedoch sind dies Ergebnisse aus

Untersuchungen an Brustkrebszellen, die nicht unmittelbar auf die Regulation des

Gens in Enterozyten übertragbar ist. In der vorliegenden Arbeit konnte kein Effekt der

Calcitriolbehandlung auf die GAPDH-Expression beobachtet werden (Kap. 3.2).

Diskussion

61

Vergleicht man die Ergebnisse der auf GAPDH standardisierten mRNA-Gehalte

miteinander, so fällt auf, dass in der Kontrollgruppe für PMCA eine 10-fach höhere

Kopienanzahl als für TRPV6 nachgewiesen wurde. Ähnliche Relationen der

Kopienzahl wurden auch bei 1-α-Hydroxylase Knockout Mäusen beobachtet (VAN

ABEL et al. 2003). Wobei jene Ergebnisse sich auf Analysen stützen, die unter

Vitamin D-defizienten Versuchsbedingungen durchgeführt wurden und daher nicht

unmittelbar mit den Ergebnissen aus Studien an hormonell intakten Schafen

verglichen werden können.

4.2.2 Western Analyse

Mit der Hilfe der Western Analyse wurde der Einfluss der Calcitriolbehandlung bzw.

der Calcium-Depletion auf Ebene der Translation untersucht. Die Daten wurden

semiquantitativ erfasst. Dazu wurden immer nur Werte einer Membran miteinander

verglichen, da diese unter exakt gleichen Bedingungen erzeugt wurden. Als interner

Standard wurde nicht wie meist üblich ß-Aktin verwendet, da gezeigt werden konnte,

dass schon bei eingesetzten Proteinkonzentrationen von 15 µg der ß-Aktin-Nachweis

nicht linear verläuft und daher bei einer aufgetragenen Proteinmenge von 50 µg nicht

sensitiv genug ist, um Unterschiede in der Proteinbeladung zu detektieren (DITTMER

& DITTMER 2006). Stattdessen wurde die gleichmäßige Beladung der Gele mit

Villin, einem Strukturprotein der Mikrovilli, das hauptsächlich in epithelialen Zellen

des Darms und des proximalen Tubulus der Niere zu finden ist (FRIEDERICH et al.

1990), als internem Standard überprüft.

Bei der TRPV6-Western Analyse wurden überraschenderweise zwei Banden von 70

und 72 kDa detektiert. Belegt wurde die Existenz des Kanals auf Protein-Ebene

schon in apikalen Membranen des Jejunums bei adulten Schafen, wobei nur eine

Bande mit einer Größe von ca. 70 kDa detektiert wurde (WILKENS et al. 2009). In

apikalen und basolateralen Membranen humaner Plazenta wurde TRPV6 mit einer

dominanten Bande von 80 kDa nachgewiesen (BERNUCCI et al. 2006). Mit einer

75 kDa-Bande wurde der Kanal im Endometrium tragender Sauen detektiert (CHOI

et al. 2009). Auffällig ist, dass die mittels Western Analyse gemachten Angaben zum

Diskussion

62

relativen Molekulargewicht von TRPV6 in der Literatur stark differieren. Die

detektierten Banden waren, wie auch in unserer Untersuchung, meist deutlich kleiner

als die anhand der Sequenz erwarteten 83 kDa (PENG et al. 1999). Die Ursache für

diese Größenunterschied sowie das Auftreten der Doppelbanden ist unklar.

HOENDEROP et al. (2003) konnte zeigen, dass es sich bei den in TRPV6-

exprimierenden Xenopus laevis Oozyten detektierten spezifischen Banden mit

75 kDa und 85-100 kDa um die reine Kernstruktur sowie eine glykosylierte Form des

Proteins handelt. Nach enzymatischer Abspaltung des Zuckerrestes mit N-

Glykosidase F war nur eine einzelne Bande mit 75 kDa sichtbar. Eine N-

Glykosilierungsstelle wird in der ersten extrazellulären Schleife zwischen dem ersten

und zweiten Transmembransegement des Kanals vermutet (PENG et al. 1999). Die

posttranslationale Glykosilierung kann unterschiedliche Funktionen haben, zum

einen erhöht sie die Stabilität mancher Proteine, schützt sie vor proteolytischem

Abbau oder dient dem intrazellulären Transport zur Zellmembran. Möglicherweise

handelt es sich bei der in dieser Arbeit detektierten Doppelbande ebenfalls um eine

glykosilierte Form des Proteins. Zu diesem Zweck wurden die Proben vor der

Elektrophorese mit N-Glykosidase F (EndoF), einer Endoglykosidase, die alle Typen

von Asparagingebundenen N-Glykanen spaltet (TARENTINO et al. 1985), behandelt.

Trotz der Behandlung traten weiterhin zwei Banden auf. Wenn man davon ausgeht,

dass die Reaktionsbedingungen für das Enzym richtig gewählt wurden und somit die

Methodik nicht als Ursache für die fehlende Deglykosilierung angesehen werden

kann, muss eine glykosilierte Form des Proteins ausgeschlossen werden. Eine

andere Möglichkeit wäre, dass die heterogene Molekularmasse des Antigens durch

Unterschiede in der Phosphorylierung zustande kommt. Mehrere potenzielle

Phosphorylierungsstellen sind in den cytoplasmatischen Domänen des Kanals

lokalisiert (PENG et al. 1999).

Als weitere posttranslationale Modifikation wird die Abspaltung bestimmter

Signalsequenzen aus 15 bis 30 Aminosäuren, die am Amino-Ende mancher Proteine

lokalisiert sind und dazu beitragen, dass das Molekül in der Zelle an seinen

endgültigen Bestimmungsort gelangt, angegeben. Solche Signalsequenzen werden

letztlich von spezifischen Peptidasen entfernt und sind daher im reifen Protein nicht

Diskussion

63

mehr zu finden (NELSON & COX 2001). Die Differenz der Molekulargewichte der

Doppelbanden von 2 kDa würde in etwa einer Anzahl von 15 Aminosäuren

entsprechen. Dies würde bedeuten, dass die kleinere untere Bande ohne

Signalsequenz das in die Membran eingebaute funktionsfähige Protein repräsentiert.

Deren Größe deckt sich auch mit der in rein apikalen Membranen vom Jejunum des

Schafes detektierten Bande (WILKENS et al. 2009). Eventuell könnten bei der

Präparation der Gesamtmembranen nicht alle intrazellulären Bestandteile entfernt

worden sein, sodass dort lokalisierte Vorläuferproteine des TRPV6 bei der Detektion

mit auftauchen könnten. Jedoch gibt es in der Literatur keine Hinweise auf die

Existenz solcher Signalsequenzen im TRPV6-Protein. Daher kann die Ursache für

das Auftreten der Doppelbanden nicht abschließend geklärt werden.

Für die Auswertung wurden beide Banden densitometrisch vermessen. Statistisch

gab es für den Gruppenvergleich keinen Unterschied, ob nur die untere Bande oder

beide Banden berücksichtigt wurden. Aus diesem Grund wurde für die weitere

Auswertung nur die untere Bande, deren Größe sich außerdem mit der Bande in

apikalen Membranen des Jejunums der Ratte (Daten nicht gezeigt) deckt,

berücksichtigt.

Für den PMCA-Nachweis zeigte sich in der Western Analyse eine dominante Bande

mit einem Molekulargewicht von 140 kDa. Dies stimmt mit den für PMCA

angegebenen Molekularmassen, die bei allen Splicevarianten um die 140 kDa liegen,

überein (STAUFFER et al. 1995, GLENDENNING et al. 2000). Zusätzlich trat eine

Bande in Höhe von ca. 80 kDa auf, sowie mehrere diffuse Banden zwischen 140 und

80 kDa.

Um zu klären, welche der Banden für die Auswertung als spezifisch angesehen

werden kann, wurde durch eine Antikörperblockierung dessen Spezifität überprüft.

Nach Inkubation der Membran mit dem blockierten Antikörper konnte weder bei

140 kDa noch bei 80 kDa ein Signal detektiert werden. Für die Auswertung wurden

daher alle Signale als spezifisch für PMCA angesehen und densitometrisch

vermessen. An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass der Antikörper

nach Herstellerangaben sowohl mit PMCA1 als auch mit der Isoform PMCA4

reagiert. Da beide Isoformen in zahlreichen Geweben, wie auch im Dünndarm

Diskussion

64

coexprimiert werden (STREHLER & ZACHARIAS 2001), kann nicht von einem

spezifischen PMCA1b-Proteinnachweis gesprochen werden.

Bei der kleineren Bande (80 kDa) sowie den von den beiden dominanten

eingerahmten diffusen Banden könnte es sich möglicherweise um Produkte einer

proteolytischen Degradation des Proteins handeln. Gleiches vermuten auch BORKE

et al. (1990), der ein ähnliches Muster von mehreren Banden (135 kDa, 125 kDa und

72 kDa) bei Untersuchungen am Darm der Ratte beobachten konnte. Dafür spricht

auch, dass im Pansen, wo sich keine proteolytisch wirksamen Enzyme befinden, nur

die größere Bande detektiert wurde (Abb. 3.8).

Es bleibt jedoch unklar, ob die Fragmentierung des PMCA-Proteins durch die im

Anschluss an die Schlachtung rasch einsetzenden proteolytischen Prozesse in der

Darmschleimhaut zurückzuführen ist, oder ob dies infolge der Membranpräparation

eintritt. Auch die Möglichkeit von bereits in vivo stattfindenden Abbauprozessen kann

nicht ausgeschlossen werden.

4.2.3 Qualität der BSMV

Die Anreicherung der BSM, als Qualitätsmerkmal der BSMV-Präparation, wurde

anhand der Aktivität verschiedener membranständiger Leitenzyme im

Ausgangshomogenat und in der Vesikelsuspension, die spezifische Indikatoren für

bestimmte Membranfraktionen sind (MIRCHEFF & WRIGHT 1976), bestimmt. Als

Leitenzym der Bürstensaummembran wurde die Aktivität der alkalischen

Phosphatase gemessen, die im Mittel um das 17-fache angereichert werden konnte.

Ähnliche Anreicherungen wurden auch in anderen Untersuchungen am Schafdarm

(SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991; SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung)

und bei anderen Spezies (KAUNE et al. 1992; ZURICH 2009) ermittelt. Als

Leitenzym für die basolaterale Membran wurde die Aktivität der Na+/K+-ATPase

bestimmt. Diese waren im Mittel nur um das 1,5-fache angereichert, was sich

ebenfalls mit Werten aus anderen Untersuchungen deckt (KAUNE et al. 1992;

ZURICH 2009; SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung). Sowohl für die

spezifische, als auch für die relative Anreicherung, die im Mittel bei 12 lag, ergaben

Diskussion

65

sich keine Gruppenunterschiede und somit konnten die Gruppen hinsichtlich ihrer

Membrantransporteigenschaften verglichen werden.

Mit Hilfe der zeitabhängigen Glukose-Aufnahme in Anwesenheit eines einwärts

gerichteten Na+-Gradienten wurde die funktionelle Integrität der BSMV überprüft. Das

typische Overshoot-Phänomen bei dem, durch den Na+-Gradienten getrieben, initial

mehr Glucose in die Vesikel aufgenommen wird als bei einem

Konzentrationsausgleich zwischen extra- und intravesikulärem Medium zu erwarten

wäre, kann nur bei der Glukose-Aufnahme in ein geschlossenes Kompartiment

beobachtet werden.

Als eine weitere Möglichkeit die Vesikelintegrität zu überprüfen, wurde die Ca2+-

Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca2+-Ionophors A23187 untersucht. Durch

den Einbau des Ionophors in die BSMV werden diese permeabel für Ca2+ und füllen

sich sehr schnell bis zu einem Konzentrationsausgleich. Dieses schnelle „Volllaufen“

mit Ca2+ tritt nur beim Einbau des Ionophors in Vesikel, die zuvor ein geschlossenes

Kompartiment begrenzten, auf. Um die Integrität der Vesikel zu beurteilen, wurden

für alle Tiere die Ca2+-Aufnahmewerte nach 30 s in An- und Abwesenheit des Ca2+-

Ionophors verglichen. Bei einer mindestens 2-fach höheren Ca2+-Aufnahme in

Anwesenheit des Ionophors wurden die Vesikel als funktionell intakt angesehen

(HINTERDING 2002, BRANDENBURGR 2004). Im vorliegenden Versuch ergaben

sich Quotienten zwischen 3,7 und 4,8, weshalb davon ausgegangen wurde, dass für

alle Tiere intakte Vesikel zur Bestimmung der kinetischen Parameter des Ca2+-

Transportes durch jejunale Bürstensaummembran vorlagen.

Es zeigte sich jedoch ein signifikanter Gruppenunterschied. Der Quotient der Ca2+-

Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca2+-Ionophors der Calcium-depletiert

gefütterten Tiere war deutlich niedriger als bei der Kontrollfütterungsgruppe. Dies

könnte ein Hinweis für eine verminderte Stabilität der Vesikel bzw. einen geringeren

Anteil an geschlossenen Vesikeln sein. Bekannt ist, dass Ca2+-Ionen eine wichtige

Rolle bei der Regulation der strukturellen und funktionellen Eigenschaften

biologischer Membranen spielen (OHYASHIKI & MOHRI 1982, BRASITUS &

DUDEJA 1986). OHYASHIKI & MOHRI (1982) konnten zeigen, dass es, induziert

durch die Bindung von Ca2+ an BSMV vom Schwein, zu einer Stabilisierung des

Diskussion

66

Lipid-Verbandes kommt. Außerdem vermindert Ca2+ die Fluidität sowohl der

Bürstensaum- als auch der basolateralen Membran (BRASITUS & DUDEJA 1986).

Zwar waren die Veränderungen der Plasmamembranfluidität relativ gering, doch

waren Enzymaktivitäten und Transportprozesse, wie beispielsweise der Ca2+-

ATPase, in diesen Membranen bei ähnlichen quantitative Veränderungen deutlich

beeinflusst (BRASITUS et al. 1979). Während sich die meisten Arbeiten mit dem

Einfluss einer Ca2+-Zugabe befassen, untersuchte TOLOSA DE TALAMONI (1996)

den Effekt einer alimentären Calcium-Depletion auf die Fluidität und die

Lipidzusammensetzung intestinaler basolateler Membranen. Infolge des Calcium-

Mangels kam es zu einer deutlichen Erhöhung der Membranfluidität, wobei die

verantwortlichen Mechanismen nicht klar sind. Als mögliche Erklärung führt er die bei

den Tieren erhöhten Calcitriol-Konzentrationen im Plasma an, die ursächlich für die

Veränderung der Membraneigenschaften sein sollen. Während diese Ca2+-

induzierten Effekte nicht eindeutig auf eine verminderte Stabilität intestinaler BSMV

hinweisen, kommt es durch Calcitriol zu einer Destabilisierung der Vesikel (PUTKEY

et al. 1986). So zeigten 80% der BSMV von mit Calcitriol behandelten Hühnern nach

24-stündiger Lagerung bei 4°C charakteristische Zeichen einer Destabilisierung. Mit

diesen Vesikeln konnte kein Glukose-Overshoot gezeigt werden. Ein solches

Phänomen der Destabilisierung konnte aber in der vorliegenden Arbeit nicht

beobachtet werden.

Der niedrigere A23187-Quotient könnte auch ein Hinweis auf einen Fütterungseffekt

auf die Ca2+-Aufnahmerate sein, deshalb wird in Kap. 4.3.3 vertiefend auf diese

Beobachtung eingegangen.

4.2.4 Bestimmung der Ca2+

-Aufnahme in jejunale BSMV

Aufnahmestudien an isolierten BSMV ermöglichen eine selektive Betrachtung der

Ca2+-Aufnahme über die apikale Membran unter kontrollierten Bedingungen.

Aufgrund der Annahme, dass die Aufnahme von Ca2+ über die apikale Membran der

geschwindigkeitslimitierende Schritt für den transzellulären Transport im Darm ist

Diskussion

67

(NIJENHUIS et al. 2005), erscheinen BSMV geeignet, um den regulierbaren Ca2+-

Transport im Detail zu untersuchen.

Die Herangehensweise sollte jedoch vorsichtig beurteilt werden. Auf der einen Seite

können so die Transportprozesse an der apikalen Membran, unabhängig von

zellulären Stoffwechselprozessen und anderen intrazellulären Einflüssen, sowie von

basolateralen Transportprozessen isoliert beurteilt werden. Durch die Trennung

zwischen intra- und extravesikulärem Kompartiment können durch unterschiedliche

intra- und extravesikuläre Pufferzusammensetzungen die Transportbedingungen

variiert und die Wirkung verschiedener Substanzen auf den betrachteten

Transportvorgang untersucht werden. Auf der anderen Seite stellen die Ergebnisse

Daten dar, die unter vollkommen artifiziellen Bedingungen gewonnen wurden. Da

jeglicher Einfluss von intrazellulären Strukturen oder cytosolischen Proteinen

unterbunden wird, kann eine mögliche komplexe Interaktion mit anderen

Komponenten, die für die einwandfreie Funktion des Transporters nötig sind, nicht

ausreichend berücksichtigt werden (MURER & KINNE 1980).

Die durch die Schnellfiltrationsmethode ermittelten Ca2+-Aufnahmeraten stellen

zunächst einmal den Gesamttransport dar, der sich aus einer sättigbaren und einer

nicht sättigbaren Komponente zusammensetzt (SCHEDL & WILSON 1985,

GHISHAN et al. 1989, KAUNE et al. 1992). Die sättigbare Komponente kann im

Gegensatz zu der nicht sättigbaren Komponente mit dem aktiven Ca2+-Transport

korreliert werden (SCHEDL & WILSON 1985). Nicht genau definiert werden kann der

Anteil der Bindung von Ca2+ an Proteine sowohl der Außen- als auch der Innenseite

der isolierten Bürstensaummembran am Gesamttransport. Durch den Vergleich der

aus Glukose- und Ca2+-Aufnahmestudien berechneten Vesikelvolumina wurden

unterschiedliche Werte für die unspezifische Proteinbindung geschätzt. MILLER &

BRONNER (1981) konnten 50% der Aufnahme auf Bindung zurückführen,

KASSIANOFF (1989) gibt 75-90% an und MERRIL et al. (1986) gehen von 100%

Bindung aus, wobei sie präzisieren, dass es sich hauptsächlich um Bindung an die

Innenseite der Membran handelt. Eine andere Herangehensweise zwischen Bindung

und Ca2+-Aufnahme zu unterscheiden, wurde von GHISHAN et al. (1989)

angewendet. Untersuchungen zur Ca2+-Aufnahme in BSMV bei steigender

Diskussion

68

Osmolarität des Inkubationsmediums zeigten eine lineare Beziehung, weshalb sie

darauf schlossen, dass es sich bei der Ca2+-Aufnahme in die Vesikel hauptsächlich

um die Aufnahme in ein intravesikuläres Lumen handelte und der gebundene Anteil

nur unwesentlich war.

Um eine Verfälschung der Ca2+-Aufnahmeraten durch unspezifische Proteinbindung

möglichst gering zu halten, wurde der Stopplösung zusätzlich EGTA (1 mmol∙l-1)

zugesetzt. Durch Waschen der Vesikel mit einer Stopplösung, die als Chelator EGTA

(5 mmol∙l-1) bzw. EDTA (5 mmol∙l-1) enthielt, konnten, verglichen mit der Stopplösung

ohne Zusatz, 30-35% des gebundenen Ca2+ entfernt werden (MERRILL et al. 1986).

Durch Untersuchung der zeitabhängigen Ca2+-Aufnahme in die BSMV wurde der

Zeitraum der linearen Aufnahme bestimmt, damit konnte ein definierter Zeitpunkt für

die konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien festgelegt werden. Anfänglich zeigt

sich ein sehr steiler Kurvenverlauf der Aufnahme bis ca. 5 min, zu späteren

Zeitpunkten flacht die Kurve deutlich ab, wobei sich der lineare Verlauf der Aufnahme

auf den Zeitraum zwischen 10 und 50 s beschränkt. Die Ca2+-Aufnahmeraten als

Funktion der freien Ca2+-Konzentration wurde deshalb bei 30 s durchgeführt. Anhand

dieser Werte lassen sich nach der Theorie von Michaelis-Menten die kinetischen

Parameter Vmax und Km, also die maximale Transportkapazität und die Affinität des

Transporters, kalkulieren.

Für die Km-Werte, welche die Ca2+-Konzentration im Inkubationsmedium angibt, bei

der die halbmaximale Transportrate erreicht ist, ergaben sich sehr unterschiedliche

Werte. Diese lagen zwischen 1,0 und 5,9 mmol∙l-1, ohne dass sigifikante

Gruppenunterschiede nachgewiesen werden konnten.

Beim Wiederkäuer wurden bislang nur wenige vergleichbare Untersuchungen zur

Ca2+-Aufnahme in BSMV durchgeführt. Bei Aufnahmestudien am Jejunum des

Schafes konnte ein mittlerer Km-Wert von 4,0 mmol∙l-1 errechnet werden

(SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung). Vorliegende Vergleichswerte

stammen meist aus Studien an monogastrischen Tieren. Dort ermittelte Km-Werte

liegen durchweg im unteren Bereich der in dieser Studie berechneten Werte. Die

Affinität des Kanals zum Calcium scheint also bei Vesikeln monogastrischer Tiere

höher zu sein. So konnte für die Ca2+-Aufnahme in BSMV von Saugferkeln eine Km

Diskussion

69

von 2,3 mmol∙l-1, bei Absetzferkeln von 1,0 mmol∙l-1 festgestellt werden

(BRANDENBURGER 2004). Bei den Untersuchungen von HINTERDING (2002)

ergaben sich Km-Werte bei Schweinen unterschiedlicher Altersgruppen, die ebenfalls

zwischen 1,1 und 1,4 mmol∙l-1 lagen. Ganz ähnliche Km-Werte wurden auch für

BSMV aus Hühnerenterozyten beschrieben (RASMUSSEN et al. 1979). Im

Gegensatz dazu ermittelte KAUNE et al. (1992) eine Km von nur 0,03 mmol∙l-1. Es

muss aber darauf hingewiesen werden, dass die kalkulierten Km-Werte je nach

Vorhandensein von TRPV5 und TRPV6 in der Bürstensaummembran die Ca2+-

Affinität als Mittelwert beider Ca2+_Kanäle darstellen können. Jedoch sind die an

Oozyten von Xenopus laevis ermittelten Km-Werte für TRPV5 und TRPV6 sehr

ähnlich. Sie variieren bei TRPV5 exprimierenden Oozyten von 0,2 mmol∙l-1

(HOENDEROP et al. 1999) bis 0,66 mmol∙l-1 (PENG et al. 2000) und bei TRPV6 von

0,25 mmol∙l-1 (PENG et al. 2000) bis 0,44 mmol∙l-1 (PENG et al. 1999). Für die

großen Unterschiede der Km-Werte beim Schaf verglichen mit anderen Spezies gibt

es bislang keine Erklärung. Die niedrige Calcium-Affinität weist auf eine geringe

Spezifität des Transportsystems in der apikalen Membran bzw. einen niedrigen Anteil

spezifischen Transports an der Gesamtaufnahme hin.

Die ermittelten Vmax-Werte lagen zwischen 1,4 und 8,8 nmol∙mg-1 Protein∙30 s-1, ohne

dass sigifikante Gruppenunterschiede nachgewiesen werden konnten. Die

ungerichteten Unterschiede der Vmax-Werte könnten durch die technische Umsetzung

zu erklären sein, da Vmax von mehreren Faktoren wie der Reinheit der

Membranpräparation oder dem Grad der Inaktivierung des Transporters während der

Präparation abhängt.

Diskussion

70

4.3 Effekt der Calcium-Depletion bzw. der Calcitriolbehandlung

auf die Ca2+

-Transportkomponenten im Jejunum

4.3.1 Expressionsstudien

Um mögliche fütterungs- und behandlungsabhängige Veränderungen über die

Teilschritte des transzellulären Ca2+-Transports im Jejunum auf genomischer Ebene

nachweisen zu können, wurden Untersuchungen zur mRNA-Expression des apikalen

TRPV6-Kanals und der basolateralen Ca2+-Pumpe PMCA1b mit Hilfe der

quantitativen RT-PCR durchgeführt.

Durch die Calcitriolbehandlung kam es wie erwartet zu einer signifikant höheren

Expression der mRNA für TRPV6 (~20-fach) sowie für PMCA (~3-fach). VDREs,

über die diese Calcitriolwirkung vermittels wird, wurden in den Promotorregionen

beider Gene nachgewiesen (GLENDENNING et al. 2000, MEYER et al. 2006).

Während für Schafe noch keine Ergebnisse zum Einfluss einer Behandlung mit

Calcitriol auf Transkriptionsebene vorliegen, weisen mehrere Studien an

Zellmodellen und Ratten ebenfalls auf eine Erhöhung der TRPV6-Expression durch

Calcitriol hin. WOOD et al. (2001) konnte zeigen, dass sich die mRNA-Expression an

TRPV6 in CaCo-2 Zellen nach Zugabe von 1,25(OH)2D3 innerhalb von 24 h um das

10-fache erhöht. Ein erhöhter mRNA-Level für TRPV6 und PMCA konnte auch schon

8 h nach einer 1,25(OH)2D3-Behandlung in CaCo-2-Zelllinien registriert werden.

Gleichzeitig war diese Beobachtung mit einem 40 h verzögert auftretenden erhöhten

Calcium-Nettotransport in die Zellen verbunden (FLEET et al. 2002).

Bei 1-α-Hydroxylase-Knockout-Mäusen führt eine Behandlung mit 1,25(OH)2D3 über

mehrere Wochen zu einer erhöhten mRNA-Expression für TRPV6 (~ 20-fach), für

Calbindin D9K (~100-fach) und für PMCA (~3-fache) (VAN ABEL et al. 2003). Das

Verhältnis der durch die Behandlung erzielten Steigerungen der Expression deckt

sich sehr gut mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Jedoch stützen sich die

beschriebenen Daten auf Analysen, die unter Vitamin D-defizienten

Versuchsbedingungen durchgeführt wurden. Betrachtungen an Versuchsgruppen mit

physiologischem Calcitriol-Haushalt bieten weniger eindeutige Ergebnisse. Während

beispielsweise VAN CROMPHAUT et al. (2001) von einer vermehrten mRNA-

Diskussion

71

Expression von TRPV6 (~ 6,5-fach), Calbindin D9K (~ 2,2-fach) und PMCA (~ 1,8-

fach) bei WT-Mäusen nach einmaliger Behandlung mit Calcitriol berichten, konnten

weder bei Ratten noch bei Menschen mit unterschiedlichem Calcitriol-Status ein

Zusammenhang zum mRNA-Gehalt von TRPV6 im vorderen Dünndarm hergestellt

werden (PENG et al. 1999, BARLEY et al. 2001). Auch konnten in Studien von

ARMBRECHT et al. (2002) bei Mäusen mit basal physiologischen Calcitriolspiegeln

keine erhöhten mRNA-Gehalte für Calbindin D9K und PMCA nach Calcitriol-Injektion

festgestellt werden. Die Autoren vermuten, dass die Tiere bereits eine ausreichend

hohe mRNA-Ausstattung für die betreffenden Gene aufweisen, wodurch keine

darüber hinausgehende signifikante Erhöhung durch die Behandlung zu induzieren

ist.

Betrachtet man die untersuchten mRNA-Gehalte in Relation zueinander, so wird

deutlich, dass die Expression beider Gene positiv miteinander korreliert (Abb. 4.1).

Dies zeigt deutlich, dass die Calcitriolwirkung auf identischem Wege über VDREs

vermittelt wird. Auffällig bleibt jedoch, dass die mRNA-Gehalte von PMCA durch

Calcitriol weitaus weniger stark hochreguliert wurden.

Abb. 4.1: Korrelation von PMCA mRNA mit TRPV6 mRNA.

Diskussion

72

Auch KUTUZOVA & DELUCA (2004) beschreiben, dass die Expression von

PMCA1b nicht so streng durch Calcitriol reguliert wird, wie für TRPV5, TRPV6 und

Calbindin-D9K beschrieben. Möglicherweise handelt es sich bei der Regulation der

PMCA-Expression nicht um einen rein transkriptionellen Effekt. Die Erhöhung der

mRNA-Gehalte an PMCA könnte auch durch posttranskriptionelle Prozesse, wie eine

erhöhte mRNA-Stabilisierung bedingt sein. PANNABECKER et al. (1995) konnten

zwar an Hühnern anhand von isolierten nukleären RNA-Gehalten zeigen, dass

Calcitriol eindeutig die Transkriptionsrate erhöhte. Die Zugabe von 10-8 mol∙l-1

Calcitriol führte bei einer distalen Nierentubuluszelllinie aber neben einer Erhöhung

der Expression auch zu einer erhöhten PMCA1b-mRNA Stabilität (GLENDENNING

et al. 2000).

SONG et al. (2003) beschreiben zeitliche Unterschiede der durch Calcitriol-Injektion

induzierten Steigerung der Expression von TRPV6 und Calbindin-D9K. So ging die

Erhöhung der TRPV6-Expression, die ihr Maximum nach 6 Stunden erreichte und 24

Stunden nach der Behandlung wieder auf Basalniveau zurückkehrte, der Steigerung

der Calbindin-D9K-Expression, deren Maximum erst nach 24 Stunden erreicht war,

voraus. Eventuell wird das Maximum der PMCA-Expression ebenfalls erst nach mehr

als 12 Stunden nach der Calcitriol-Applikation erreicht. Die in der vorliegenden Studie

ermittelten Expressionszunahmen könnten möglicherweise noch in der

Anstiegsphase liegen und daher die maximale Zunahme nicht abgeschätzt werden.

Da der Einstrom von Calcium durch die TRPV-Kanäle in der apikalen Membran als

geschwindigkeitslimitierender Schritt des transzellulären Calciumtransports

angesehen wird (NIJENHUIS et al. 2005), erscheint das unterschiedliche Ausmaß

der Expressionssteigerung jedoch physiologisch begründet zu sein.

Durch die alimentäre Calcium-Depletion kam es zu einer scheinbaren Verdopplung

der mRNA-Expression beider Gene, statistisch ließ sich aber kein direkter

Zusammenhang nachweisen. Daten zum Einfluss einer Calcium-restriktiven Diät auf

genomischer Ebene beim Wiederkäuer liegen bislang nicht vor. Untersuchungen an

Ratten ergaben allerdings eine Erhöhung der TRPV6-mRNA um das 2,5-fache nach

vierwöchiger Fütterung einer calciumarmen Ration (0,02% gegenüber 1,2%

Diskussion

73

Calcium), in Abhängigkeit des Alters der Tiere. Die durch die restriktive Fütterung

erreichten mRNA-Level fielen bei den adulten (12 Monate) wesentlich geringer aus

als bei den jungen Tieren (2 Monate) (BROWN et al. 2005). Gleichzeitig konnte

gezeigt werden, dass die mRNA-Level positiv mit dem Calcium-Transport korrelieren.

Gleiche Beobachtungen machten auch SONG et al. (2003) an Mäusen, bei denen es

durch die calciumarme Fütterung im Duodenum zu einer sehr viel stärkeren,

30-fachen Erhöhung der mRNA-Gehalte an TRPV6 und einer 8-fachen Erhöhung an

Calbindin-D9K kam. Dies war von einer 4-fach erhöhten Serum-Calcitriol-

Konzentration begleitet.

Eine gesteigerte mRNA-Expression an PMCA konnte bei Hühnern nach 10-tägiger

alimentärer Calcium-Depletion beobachtet werden (CAI et al. 1993).

Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der genomischen Effekte der Calcium-

Depletion bei Studien an monogastrischen Tieren und den Ergebnissen der

Untersuchung am Schaf kann in der unterschiedlichen Calcitriolantwort begründet

sein. Im Gegensatz zu der 4-fach erhöhten Calcitriolkonzentration bei Mäusen

(SONG et al. 2003) waren die Calcitriolspiegel durch eine Calcium-Depletion bei den

Schafen nur um 50% gesteigert. Ähnlich geringe Steigerungen (2-fache) wurden

auch schon in früheren Studien an Schaf und Ziege beobachtet (ABDEL-HAFEEZ et

al. 1982, SCHRÖDER et al. 1997, SCHRÖDER et al. 1999). Infolge der verringerten

alimentären Calciumverfügbarkeit, nur 25% des normalen Bedarfs, kommt es zwar

zu einem signifikanten Absinken der Plasma-Calcium-Konzentration, jedoch liegen

die Werte noch im physiologischen Bereich, der für das Schaf mit 2,1 bis 2,7 mmol∙l-1

angegeben wird (KRAFT und DÜRR 2005). Möglicherweise kommt es erst beim

Absinken in pathophysiologische Konzentrationsbereiche zum Erreichen von

Calcitriolspiegeln, die für eine Beeinflussung der Genexpression nötig sind. Um dies

zu erreichen, wäre eine weitere Verringerung der Calciumaufnahme notwendig.

Allerdings ist eine calciumarme Fütterung mit nur ca. 2% des Calciumgehaltes der

Kontrollfütterung (BROWN et al. 2005), wie sie in den Studien an monogastrischen

Tieren eingesetzt wird, beim Wiederkäuer nicht realisierbar. Aufgrund des benötigten

mindestens 18%igen Rohfaseranteils in der Ration (MEYER 2004) ist die Calcium-

Depletion mit nur 25% des normalen Bedarfs weitgehend ausgeschöpft.

Diskussion

74

Möglicherweise können die Tiere die Calcium-Depletion aber auch besser

kompensieren und deshalb ihre Plasma-Calcium-Konzentration im physiologischen

Bereich halten. Bei den Tieren der Calcium-Depletionsgruppe waren die Werte des

Knochenresorptionsmarkers Cross Laps signifikant erhöht (WILKENS et al. 2010).

Dies legt die Vermutung nahe, dass die Tiere das fehlende Calcium bei

vermindertem Angebot in der Nahrung auch durch Mobilisation aus dem Knochen

bereitstellen.

Da sich aus den Ergebnissen der Real-Time PCR auf Grundlage der mRNA-Gehalte

keine verbindlichen Aussagen über die tatsächlich exprimierte Proteinmengen treffen

lassen, wurden ergänzend dazu Western Analysen durchgeführt.

In den Ergebnissen der Proteinexpression spiegelt sich deutlich der Effekt von

Behandlung und Fütterung auf RNA-Ebene wieder.

Für den apikalen Calcium-Kanal TRPV6 zeigte sich eine signifikant Proteinzunahme

durch die Calcitriolbehandlung. Die alimentäre Calcium-Depletion beeinflusste die

Proteinkonzentration nicht. Für die auf RNA-Ebene sichtbare, jedoch statistisch nicht

signifikante Expressionserhöhung konnte aufgrund der geringeren Sensitivität der

Methode auf Proteinebene kein Hinweis gefunden werden.

Für die PMCA-Protein-Expression konnte ebenfalls eine Proteinzunahme nach

Calcitriolbehandlung detektiert werden, die jedoch deutlich geringer als bei TRPV6

ausfiel. Vergleichbare Ergebnisse auf Proteinebene liegen von Wiederkäuern bislang

nicht vor. MDBK-Zelllinien (distale Nierentubuluszellen), die mit steigenden

Konzentrationen an Calcitriol behandelt wurden, wiesen bei einer Konzentration von

10-8 mol∙l-1 Calcitriol im Medium eine Steigerung des PMCA-Proteins um 80% auf.

Übereinstimmend mit dem Effekt auf die Proteinexpression konnte auf funktioneller

Ebene eine 100%ige Steigerung des ATP-abhängigen Transports beobachtet

werden (GLENDENNING et al. 2000). Studien an Vitamin D-defizienten Hühnern

weisen ebenfalls auf eine Erhöhung der PMCA-Potein-Expression durch Calcitriol hin

(WASSERMAN et al. 1992). Die Autoren fanden auch Hinweise auf eine erhöhte

Proteinexpression nach Fütterung einer calciumarmen Diät. Bei den Schafen war die

Proteinexpression durch die Fütterung allein in keiner Weise beeinflusst, obwohl die

Diskussion

75

PMCA-Expression auf RNA-Ebene im Mittel immer über der Kontrolle lag. Ein Grund,

weshalb dies auf Proteinebene nicht sichtbar wird, ist vermutlich technisch

begründet. Da es sich bei der RNA um einen spezifischen Nachweis der PMCA1b-

Isoform handelt, wogegen mit dem Antikörper in der Western Analyse neben PMCA1

auch PMCA4 nachgewiesen wird, kommt es möglicherweise zu einer Überlagerung

existierender Effekte. Während PMCA1b nachweislich über Calcitriol reguliert wird

(GLENDENNING et al. 2000), ist über die Regulation von PMCA4 nicht viel bekannt.

Die Tiere, die der Kombination aus Fütterung und Behandlung unterzogen wurden,

lagen mit der PMCA-Proteinmenge signifikant unterhalb der behandelten Tiere der

Kontrollfütterung. Diese Beobachtung wiederholt sich auch in den Ergebnissen der

RNA-Expression. Eine Erklärung für dieses Phänomen kann zum jetzigen Zeitpunkt

leider nicht gegeben werden.

4.3.2 Funktionelle Untersuchungen

Für die Resorption von Calcium im Organismus ist selbstverständlich nicht nur die

Menge an exprimierten Transportern, sondern vor allem auch deren

Funktionsfähigkeit von entscheidender Bedeutung. Durch Untersuchung der Ca2+-

Aufnahme in Bürstensaummembranvesikel wurde überprüft, ob die erhöhte TRPV6-

Proteinmenge auch mit einem gesteigerten Einstrom über die apikale Membran

verbunden ist.

Im Gegensatz zur Proteinexpression war für die kinetischen Parameter der

Calciumaufnahme in BSMV eine Abhängigkeit von der Behandlung mit Calcitriol

nicht nachweisbar. Dieses Ergebnis ist konträr zu den Daten anderer Studien, in

denen eine Erhöhung der Vmax durch Calcitriol beobachtet wurde. Bei Vitamin D-

defizienten Ratten führte eine einmalige intraperitoneale Applikation von Calcitriol

16 Stunden vor der Schlachtung zu einer Steigerung der Ca2+-Aufnahmerate

(MILLER & BRONNER 1981). Bei BSMV vom Huhn war die Vmax durch

Calcitriolbehandlung nach 12 Stunden 2,5 bis 3-fach erhöht, ohne dass der Km-Wert

verändert war (FONTAINE et al. 1981). GHISHAN et al. (1988) konnten zeigen, dass

schon acht Stunden nach Calcitriolgabe die Vmax sowohl für die Ca2+

-Aufnahme in

Diskussion

76

BSMV als auch für die ATP-abhängige Aufnahme in basolaterale Membranvesikel

erhöht war. Allerdings stützen sich die Ergebnisse alle auf Untersuchungen an

Vitamin D-defizienten Tieren und sind somit nicht direkt mit den Daten dieser Studie

vergleichbar. Aber auch bei adäquat mit Vitamin D versorgten sechs Monate alten

Ratten konnte eine Steigerung der Ca2+-Aufnahmerate von 3,95 auf 5,10 nmol∙mg-1

Protein∙20s-1 nach Calcitriol-Applikation registriert werden (LIANG et al. 1991). Bei 24

Monate alten Tieren war die basal niedrigere Aufnahmerate von 2,61 auf 4,05

nmol∙mg-1 Protein∙20s-1 durch Calcitriol ebenfalls erhöht. Demgegenüber konnten

BRAUN et al. (1984) keinen Effekt einer zweimaligen Calcitriolbehandlung, 36 und

12 Stunden vor der Schlachtung, auf die maximale Ca2+-Aufnahmerate bei adulten

Ratten feststellen.

Warum in der vorliegenden Studie trotz der erhöhten Proteinmenge bei den

behandelten Tieren keine gesteigerte Aufnahme in die BSMV messbar war, bleibt

unklar. Für das TRPV6-Protein wird in diesem Zusammenhang ein intrazellulärer

Pool präformierter intakter Kanalproteine diskutiert. Ihr Einbau in die Zellmembran

kann eine weitere Regulationsmöglichkeit für den Organismus darstellen

(HOENDEROP et al. 2002b). Möglicherweise handelt es sich bei dem in der Western

Analyse detektierten Protein um eine noch nicht vollkommen funktionsfähige Form

des Kanals. Auch bei BRANDENBURGER (2004) konnte bei Ferkeln trotz einer

durch Vitamin D-Behandlung erhöhten TRPV6-mRNA-Menge kein funktioneller

Effekt in Ca2+-Uptake-Studien festgestellt werden. Die Proteinexpression wurde in

dieser Arbeit nicht quantifiziert, jedoch ergaben sich bei den Untersuchungen am

intakten Epithel in der Ussing-Kammer deutliche Effekte der Behandlung. Diese

Beobachtungen führen zu der Überlegung, dass die Diskrepanz möglicherweise

durch die isolierte Betrachtung der apikalen Membran bedingt wird. Wie schon

vorangehend beschrieben (4.1.4) wird durch die selektive Betrachtung der Vorgänge

an der apikalen Membran jeglicher Einfluss intrazellulärer Strukturen auf die

Transportrate unterbunden. Aus diesem Grund darf von dem Unvermögen, eine

bestimmte Eigenschaft in Vesikelstudien nachweisen zu können, nicht automatisch

auf ihre Abwesenheit im Gesamtsystem geschlossen werden (MURER & KINNE

1980). Das Fehlen einer Potenzialdifferenz über der Vesikelmembran könnte ein

Diskussion

77

möglicher Hinweis auf eine Schwachstelle der Methode sein, da bekannt ist, dass

der Öffnungszustand des TRPV6-Kanal wesentlich vom Membranpotenzial der Zelle

abhängt (HOENDEROP et al. 2005), wobei eine Hyperpolarisation einen erhöhten

Ca2+-Einstrom induziert (HOENDEROP et al. 1999). Der Nachweis möglicher

Veränderungen der Aufnahmerate könnte dadurch bei diesem Versuchsaufbau

behindert worden sein. Durch Anlegen eines intravesikulär negativen elektrischen

Potenzials durch ein K+-Diffusionspotenzial konnten KAUNE et al. (1992) die Ca2+-

Aufnahme in BSMV stimulieren.

Ein weiterer Unterschied zur intakten Zelle besteht in der fehlenden Pufferung der

einströmenden Ca2+-Ionen. Dies könnte ein Problem darstellen aufgrund der

Tatsache, dass sich der TRPV6-Kanal bei ansteigender intrazellulärer Ca2+-

Konzentration über einen negativen Feedback-Mechanismus selbst inaktiviert. Wobei

die IC50, die Konzentration bei der die Hälfte der Kanäle inaktiviert sind, in der

Zellkultur bei ~ 70 nmol∙l-1 lag (NILIUS et al. 2001). Durch den während der Ca2+-

Aufnahme starken Anstieg der intravesikulären Ca2+-Konzentration könnte es zu

einer vorzeitigen Schließung der Kanäle kommen, so dass die maximale

Transportkapazität nicht ausgeschöpft wurde und deshalb, wie bei einigen Tieren

deutlich auffiel, der sättigbare Anteil des Gesamttransportes stark von der nicht

sättigbaren Komponente überlagert wurde. Dies könnte eine mögliche Erklärung für

die fehlenden Gruppenunterschiede in den Vmax-Werten sein. Das Beladen der

Vesikel mit EGTA-haltigem Puffer sollte ein frühes Schließen der Kanäle verhindern.

In TRPV-exprimierenden HEK-Zellen, die mit 10 mmol∙l-1 BAPTA, einem Calcium-

spezifischen Chelator, beladen waren, trat die Ca2+-induzierte Inaktivierung ebenfalls

auf. Daher wird vermutet, dass eine lokale Erhöhung der Ca2+-Konzentration in

unmittelbarer Nähe der Kanalpore ursächlich für die Inaktivierung ist (NILIUS et al.

2001).

Die alimentäre Calcium-Depletion hatte ebenfalls keinen signifikanten Effekt auf die

Vmax-Werte, was die Beobachtungen auf Ebene der Proteinexpression bestätigt.

Jedoch scheint die Fütterung tendenziell einen Effekt auf die Affinität des

Transportsystems für Calcium zu haben. Die niedrigeren Km-Werte sind als Hinweis

auf eine Anpassung des Transportsystems an die langfristig erniedrigte luminale

Diskussion

78

Ca2+-Konzentration zu werten. Durch eine erhöhte Calcium-Affinität kann auch bei

niedrigerer Substratverfügbarkeit die gleiche Transportrate erreicht werden. Dies

deckt sich auch mit dem in Kap. 4.1.3 beschriebenen Phänomen des durch die

Fütterung erniedrigten A23187-Quotienten. Bei einzelner Betrachtung der Ca2+-

Aufnahme in BSMV ohne Ionophorzusatz fällt auf, dass die unbehandelten

Kontrolltiere bei einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1 in 30 s deutlich

weniger Aufnahme zeigten (Abb. 4.2). Bei dem einzelnen Ausreißer in der Gruppe

handelt es sich um dasselbe Tier, dass auch bei der Auswertung der TRPV6-

Proteinexpression aus zuvor genannten Gründen nicht berücksichtigt wurde. Ohne

dieses Tier war die Aufnahme bei einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1

in der Kontrollgruppe signifikant niedriger. Die größere bzw. schnellere Ca2+-

Aufnahme in Abwesenheit des Ionophors bedingt die statistisch nachweisliche

Erniedrigung des A23187-Quotienten. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass der

spezifische, wahrscheinlich kanalvermittelte Anteil der Ca2+-Aufnahme in die Vesikel

durch die Fütterung erhöht ist. Dieser Effekt lässt sich aber offenbar im klassischen

Ansatz nur schwer nachweisen, da er nur bei niedrigen freien Ca2+-Konzentrationen,

bei denen der sättigbare Transport nicht so stark durch den unspezifischen Anteil der

Aufnahme überlagert wird, auftritt.

Diskussion

79

Abb. 4.2: Ca2+-Gesamtaufnahme nach 30 s bei freier Ca2+-Konzentration von

0,09 mmol∙l-1 in jejunale BSMV von adäquat bzw. restriktiv mit Calcium

versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-

Behandlung

Durch die Zugabe von Ruthenium Rot sollte versucht werden, den apikalen Calcium-

Kanal in seiner Funktion zu hemmen. Von dieser Substanz, einem Calcium-

Kanalblocker ist eine IC50 von etwa 10 µmol∙l-1 bekannt (HOENDEROP et al. 2001).

In den Uptake-Studien konnte durch Ruthenium Rot, in einer Konzentration von

100 µmol∙l-1, in keiner der Versuchsgruppen ein Effekt auf die Ca2+-Aufnahme

beobachtet werden. Dies ist konträr zu Ergebnissen anderer Studien. Bei

Untersuchungen an BSMV vom Duodenum unbehandelter Ratten verringerte sich

durch Zugabe des Inhibitors in gleicher Konzentration die Aufnahme von Calcium um

44% (MILLER & BRONNER 1981). In einer Untersuchung zur Calcium-Resorption

aus dem Dünndarm von Ferkeln konnten mittels Ussing-Kammer-Technik durch

Ruthenium Rot in einer Konzentration von 10 µmol∙l-1 die Calcium-Nettofluxraten nur

um 15,8% gesenkt werden (BRANDENBURGER 2004). Allerdings trat dieser Effekt

auch nur bei Vitamin D-behandelten Tieren auf und wurde in der Kontrollgruppe nicht

beobachtet. In der vorliegenden Arbeit war es vermutlich aufgrund der starken

Diskussion

80

Überlagerung des sättigbaren Transportes durch den unspezifischen Anteil der

Aufnahme bei höheren freien Ca2+-Konzentrationen nicht möglich eine Inhibition des

Kanals nachzuweisen.

Diskussion

81

4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnte im Jejunum anhand von Expressionstudien eine

erhöhte Expression des apikalen Calcium-Kanals TRPV6 und der basolateralen

Calcium-Pumpe PMCA auf RNA und Proteinebene durch Behandlung mit Calcitriol in

pharmakologischer Dosierung gezeigt werden. Dies steht in Übereinstimmung mit

In-vitro-Untersuchungen in der Ussing-Kammer, bei denen im selben Tiermodell

durch Calcitriol stimulierte Calcium-Nettofluxraten nachgewiesen wurden

(MROCHEN et al. 2010). Aufgrund des deutlichen Behandlungseffektes kann darauf

geschlossen werden, dass der aktive, intestinale Calcium-Transport beim Schaf, wie

bei den meisten monogastrischen Säugetieren auch, prinzipiell durch Calcitriol

reguliert wird. Inwieweit dies unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt,

muss vorsichtig beurteilt werden.

Die durch die alimentäre Calcium-Depletion erniedrigte Calcium-Konzentration im

Plasma sowie die erhöhten Phosphat- und Calcitriol-Konzentrationen zeigen deutlich,

dass es zu einer Aktivierung adaptiver Mechanismen der Calcium-Homöostase

kommt. Obwohl eine Adaptation des aktiven Ca2+-Transports wahrscheinlich

stattfindet, gelang es nicht, eine erhöhte Expression entsprechender Strukturen

nachzuweisen. Die Veränderungen auf RNA-Ebene waren zu gering und aufgrund

der relativ geringen Tierzahl statistisch nicht abzusichern. Auch die augenscheinliche

Erhöhung der Calcium-Nettofluxraten war nicht signifikant (MROCHEN et al. 2010).

In zukünftigen Untersuchungen sollte versucht werden, durch eine länger

andauernde alimentäre Calcium-Depletion und außerdem größere Tierzahlen, die

Annahme zur Möglichkeit der Adaptation des aktiven Calcium-Transports im Jejunum

beim Schaf auch statistisch besser abzusichern. Darüber hinaus sollte der Einfluss

des Alters und des Reproduktionsstatus auf die Anpassung an einen Calciummangel

im Futter untersucht werden.

Der niedrige Anpassungslevel der intestinalen Resorption könnte darin begründet

sein, dass das Schaf unter physiologischen Bedingungen aufgrund seiner

Ernährungsweise immer ausreichend mit Calcium versorgt ist und außerdem bereits

im Pansen eine gewisse Calcium-Aufnahme erfolgt (MROCHEN et al. 2009). Somit

ist das Tier möglicherweise nicht auf eine engere Regulierung im Darm angewiesen.

Diskussion

82

Womöglich findet eine Anpassung auch dadurch statt, dass die sonst nur im

vordersten Abschnitt des Jejunums stattfindende Calcium-Aufnahme auf die distalen

Abschnitte ausgedehnt und so das mangelnde Calcium-Angebot ausgeglichen wird.

Die längere Verweildauer der Ingesta in diesen Darmsegmenten könnte hierfür

hilfreich sein.

Die Ca2+-Aufnahmestudien an Bürstensaummebranvesikeln erwiesen sich bei der

hier angewendeten Methodik nicht als geeignet, die maximale Transportkapazität als

Maß für die Anzahl der Calcium-Kanäle beim Schaf funktionell differenziert zu

untersuchen. Auf der Basis der in der Ussing-Kammer gezeigten Ca2+-Fluxraten

(MROCHEN et al. 2010), ist davon auszugehen, dass die Expression epithelialer

Calcium-Kanäle und somit auch die Höhe der spezifischen Ca2+-Aufnahme in BSMV

relativ niedrig sind. Dadurch wird aber der unspezifische Anteil an der Ca2+-

Gesamtaufnahme in die Vesikel relativ hoch, was eine sinnvolle Auswertung des

spezifischen Anteils erschwert. Darüber hinaus kann nicht ausgeschlossen werden,

dass es unter den gewählten Bedingungen zu einem vorzeitigen Schließen der

Kanäle kam, so dass sich Fütterungs- und Behandlungseffekte auf den spezifischen

Anteil an der Gesamtaufnahme nicht darstellen ließen. Es ist daher notwendig, die

Methode weiter zu modifizieren, entsprechende Ansätze zur Verbesserung wurden

weiter oben diskutiert. Dass Ca2+-Aufnahmestudien mit BSMV unter angepassten

Versuchsbedingungen eine adäquate Methode zur Demonstration stimulierter

Transportmechanismen sein können, deutet sich aber zumindest in den

Veränderungen der spezifischen Aufnahme bei sehr niedriger extravesikulärer Ca2+-

Konzentrationen und den tendenziell erniedrigten Km-Werten in den Calcium restriktiv

gefütterten Tieren an.

Zusammenfassung

83

5 Zusammenfassung

Nina Mrochen

Untersuchungen zur Regulation der jejunalen Calcium-Resorption beim Schaf

In funktionellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass im Unterschied zum

monogastrischen Tier die intestinale, aktive Calcium-Resorption beim Schaf nicht im

Duodenum sondern im Jejunum lokalisiert ist. Qualitativ konnten die strukturellen

Grundlagen für einen calcitriolregulierten, transzellulären Calcium-Transport in

diesem Darmabschnitt bereits in früheren Untersuchungen nachgewiesen werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die Regulation dieser strukturellen

Komponenten genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde die Wirkung einer

alimentären Calcium-Depletion, einer Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer

Dosierung und der Kombination aus Depletion und Behandlung auf die Expression

und die Aktivität der am transzellulären Calcium-Transport beteiligten Strukturen

untersucht.

Dazu wurde die Expression wichtiger Gene des transzellulären Calcium-Transportes,

des apikalen Calcium-Kanal TRPV6 und der basolateralen Calcium-Pumpe PMCA1b

mit Hilfe der quantitativen RT-PCR und der Western Analyse auf Transkriptions- und

Translationsebene quantifiziert. Darüber hinaus wurden Aufnahmestudien in isolierte

Bürstensaummembranvesikel (BSMV) durchgeführt und die kinetischen Kenngrößen

Vmax und Km der Ca2+-Aufnahme bestimmt.

Durch die Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer Dosierung kam es zu einer

eindeutigen Expressionssteigerung auf RNA- und Proteinebene, was die prinzipielle

Regulierbarkeit des transzellulären Calcium-Transportes im Jejunum beim Schaf

bestätigt. Es gelang nicht, diese Regulation durch Aufnahmestudien in BSMV auch

funktionell darzustellen. Letzteres könnte darin begründet sein, dass die Methode

weiter technisch optimiert werden müsste, um Bestimmungen der Calcium-Aufnahme

in jejunale BSMV vom Schaf in geeigneter Weise durchführen zu können.

Durch die alimentäre Calcium-Depletion allein waren die RNA- und Protein-

Expressionen nur in geringem Maße beeinflusst. Statistisch ließen sich die Effekte

Zusammenfassung

84

nicht absichern. Die funktionellen Untersuchungen brachten Hinweise auf eine

gesteigerte Ca2+-Affinität der apikalen Ca2+-Transportsysteme.

Damit konnte erstmals auf struktureller Ebene gezeigt werden, dass der jejunale

Calcium-Transport beim Schaf durch Calcitriol regulierbar ist. Eine alimentäre

Calcium-Depletion reichte als Stimulus aber nicht aus, um den Transport deutlich zu

steigern. Es kann daher diskutiert werden, dass das Schaf aufgrund seiner

Ernährungsweise und der Möglichkeit, ausreichend Calcium aus dem Pansen

aufzunehmen, unter physiologischen Bedingungen nicht auf aktive Ca2+-Resorption

im Dünndarm angewiesen ist.

Summary

85

6 Summary

Nina Mrochen

Studies on the regulation of the jejunal calcium resorption in sheep

In former functional studies it could be demonstrated that compared to most

monogastric animals, the ovine intestinal calcium resorption is mainly located in the

jejunum. Qualitative studies showed the existence of structural prerequisites for a

calcitriol-regulated transcellular calcium transport.

The aim of the present study was to evaluate the regulation of those structural

elements in the ovine jejunum. Therefore, we investigated the effect of alimentary

calcium restriction, treatment with calcitriol in pharmacological dosage or combination

of calcium depletion with treatment on expression and activity of structures involved

in transcellular calcium transport.

For this purpose, the expression of apical calcium-channel TRPV6 and basolateral

calcium-pump PMCA1b were determined by means of quantitative RT-PCR and

Western Analysis. These data were compared with kinetic parameters of calcium

uptake studies into isolated jejunal brush border membrane vesicles (BBMV).

Calcitriol treatment resulted in an increase of TRPV6 and PMCA RNA as well as

protein expression, indicating an up-regulation of calcium transport in ovine jejunum

by calcitriol in principle. However, we were not able to demonstrate this regulation in

functional studies with BBMV. This may be due to technical reasons. In further

investigations, this method has to be further improved and adapted.

A slight increase in RNA and protein expression of both genes seemed to be induced

by the calcium restricted feeding regime. However, this effect could not be verified

statistically. The calcium uptake study with BBMV suggests an increased calcium

affinity of the transport system.

It could be demonstrated for the first time on a structural level, that there is a

regulation of calcium transport in the ovine jejunum. Though, a nutritional calcium

deficiency was not sufficient to significantly increase the amount of intestinal calcium

transport. Hence, it may be discussed that the sheep are, due to their nutrition and

Summary

86

their ability to resorb calcium in the rumen, not necessarily dependent on active

intestinal calcium transport under physiological conditions.

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87

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Anhang

102

Anhang

A. Puffer und Lösungen für die Präparation von

Gesamtmembranen und BSMV

Name der Lösung Bestandteile

Homogenisierungspuffer

20 mmol∙l-1 Tris

250 mmol∙l-1 Saccharose

5 mmol∙l-1 EGTA

5 mmol∙l-1 MgSO4

pH 7,5

MgCl2 (1 mol ∙ l-1) 1 mol ∙ l-1 MgCl2

Präparationspuffer 1

300 mmol ∙ l-1 Mannit

12 mmol ∙ l-1 Tris, basisch

5 mmol ∙ l-1 EGTA

1 mmol ∙ l-1 HCl, pH 7,1



5 mmol ∙ l-1 EGTA

1 mmol ∙ l-1 Tris, basisch, pH 7,1



100 mmol ∙ l-1 KCl

10 mmol ∙ l-1 HEPES

1 mmol ∙ l-1 Tris, basisch, pH 7,4

Resuspensionspuffer

10 mmol∙l-1 Tris

150 mmol∙l-1 NaCl

pH 7,4

Anhang

103

B. Puffer und Lösungen für die Western Analyse


Blottingpuffer


192 mmol ∙ l-1 Glycin

20% v/v Methanol

Denaturierungspuffer

1 ml Glycerin

3 ml SDS [ 10% w/v]

1,25 ml Sammelgelpuffer

0,5 ml ges. Bromphenolblau-Lsg.

ad 10 ml A. bidest (steril)

PBS

137 mmol ∙ l-1 NaCl

3 mmol ∙ l-1 KCl

2 mmol ∙ l-1 KH2PO4

9 mmol ∙ l-1 Na2HPO4

PBST 1 ml Tween 20

Ad 1000 ml PBS

Ponceau Rot-Lösung 20 mg Ponceau 2R

10 ml Essigsäure (3%)

Sammelgel (4,75%)

1,25 ml Roti-Gel 40

1,25 ml Sammelgelpuffer

7,3 ml A. bidest (steril)

100 µl SDS (10%)

100 µl APS (10%)

5 µl TEMED

Sammelgelpuffer

pH 6,8

1 mol ∙ l-1 Trs/HCl

ad 100 ml A. bidest

Elektrodenpuffer


192 mmol ∙ l-1 Glycin

0,1% w/v SDS

Anhang

104

Trenngel (8,5%)

2,5 ml Roti-Gel 40

4,32 ml Trenngelpuffer

4,44 ml A. bidest (steril)

114 µl SDS (10%)

92 µl APS (10%)

9,2 µl TEMED

Trenngelpuffer

pH 8,8

1 mol ∙ l-1 Trs/HCl

ad 100 ml A. bidest

C. Puffer für die funktionellen Untersuchungen


KCl-Transportpuffer, 2-fach



20 mmol ∙ l-1 Hepes

NaCl-Transportpuffer, 2-fach


200 mmol ∙ l-1 NaCl


Stopplösung




1 mmol ∙ l-1 EGTA

Danksagung

105

Danksagung

Zu guter Letzt möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mir in diesem

entscheidenden Lebensabschnitt mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben.

Mein herzlicher Dank gilt:

….Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die freundliche Aufnahme in seine

Arbeitsgruppe.

….Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder für die Überlassung des interessanten

Themas, die engagierte Betreuung, die unglaublich raschen Korrekturen und seine

hilfsbereite Art nicht nur in Belangen der Arbeit.

….meinen Mitstreiterinnen Steffi, Nina, Nina, Katha, Maria, Lisa, Imke, Birgit, die mir

sehr ans Herz gewachsen sind. Danke für die vielen gemütlichen Stunden im

Doktorandenzimmer. Danke auch an Alexandra, Anja und Jens für die vielen

wertvollen Hinweise bei so manchem Laborproblemchen.

….Susi, der liebsten Zimmerkollegin der Welt.

….Inga, die sich für mich manche Nächte um die Ohren geschlagen hat. Danke für

die moralische Unterstützung, deine Diskussionsbereitschaft und die notwendige

Ablenkung auch beim Sport.

….Marion, Kerstin, Marion, Kathrin für die viele Hilfe im Labor und so manchen Keks,

Bärbel für das bekleben hunderter von Eppis und Karin für die aufmunternden Worte.

….Yvonne, Michael und Jelena für die Hilfe bei der Betreuung der Tiere.

Mein größter Dank gilt Mirja von der ich so viel gelernt habe, die alle meine

Gemütszustände mit Engelsgeduld ertragen hat, mich auf dem Weg durch meine

persönliche „Vortragshölle“ begleitet hat, die es nicht leid war auch noch ein zehntes

Danksagung

106

Mal über Vesikel zu diskutieren und die es mit „wohldosiertem“ Druck ermöglicht hat,

dass diese Arbeit zu einem termingerechten Abschluss gelangt ist. Dafür und noch

für so einiges mehr möchte ich dir von Herzen danken und wenn mal wieder eine

Nachtschicht ansteht, sag bescheid, dann bring ich dir was zu Essen.

Auf diesem Weg möchte ich mich auch bei meinen Eltern und meinen Schwestern

Nora und Laura bedanken, die mir ein Zuhause geben, in dem man sich geborgen

fühlt und alle Sorgen nur noch halb so groß sind. Danke für alles was ihr in den

letzten Jahren für uns getan habt. Es ist schön, dass es jemanden gibt auf den man

sich immer verlassen kann.

Den zwei wichtigsten Menschen in meinem Leben möchte ich dafür danken, dass sie

immer an mich geglaubt habe und für ihre Geduld, wenn ich es mal nicht tat.

Aber das Wichtigste: Danke, dass es euch gibt.

Untersuchungen zur Regulation der jejunalen Calcium ... · Tierärztliche Hochschule Hannover...

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