Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in ...

Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg

(Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie und Onkologie, Medizinische Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg)

Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in humanen Granulozyten

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Gwendolyn Ulrike Maria Doschko

aus Heidelberg

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

Dr. med. Markus Munder

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. I. Nolte

Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2004

Meinen lieben Eltern

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ............................................................................. 8

1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................. 11

2 Literaturübersicht............................................................................................................ 13

2.1 Das Enzym Arginase .............................................................................................. 13

2.1.1 Induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und Arginase .................................... 13

2.1.2 Das Enzym Arginase im murinen Immunsystem............................................. 16

2.1.3 Funktion der Arginase in Krankheitsmodellen ................................................ 17

2.1.4 Arginase im humanen System.......................................................................... 18

2.2 Myeloische Zellen ................................................................................................... 19

2.2.1 Makrophagen.................................................................................................... 20

2.2.2 Dendritische Zellen .......................................................................................... 20

2.2.3 Granulozyten .................................................................................................... 21

2.3 Abstoßungsreaktion (Graft-versus-host reaction) .............................................. 23

2.4 Glukokortikoide ..................................................................................................... 26

2.4.1 Das Enzym Arginase und Glukokortikoide ..................................................... 27

3 Geräte, Material und Methoden ..................................................................................... 29

3.1 Geräte ...................................................................................................................... 29

3.2 Material ................................................................................................................... 30

3.2.1 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................... 30

3.2.2 Reagenzien ....................................................................................................... 31

3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ............................................................... 34

3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen................................................................ 35

3.2.5 Humane Probanden .......................................................................................... 39

3.3 Methoden................................................................................................................. 44

3.3.1 Gewinnung der Leukozyten ............................................................................. 44

3.3.2 Separation mittels Ficoll................................................................................... 44

3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen ..................................................................... 45

3.3.4 Durchflusszytometrie ....................................................................................... 46

3.3.5 Zellsortierung ................................................................................................... 49

3.3.6 Auftrennung der PBMC ................................................................................... 49

3.3.7 Kultivierung der Granulozyten in vitro............................................................ 49

3.3.8 Proteinmessung ................................................................................................ 50

3.3.9 Enzymaktivitätsmessung: Bestimmung der Arginase...................................... 51

3.3.10 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) und

Immunoblot ...................................................................................................... 51

3.3.11 RNA-Extraktion ............................................................................................... 53

3.3.12 Quantifizierung der RNA................................................................................. 53

3.3.13 Statistisches Verfahren..................................................................................... 53

4 Ergebnisse........................................................................................................................ 55

4.1 Methodische Vorarbeiten ...................................................................................... 55

4.1.1 Bestimmung des pH-Optimums der humanen Granulozyten-Arginase........... 55

4.1.2 Bestimmung der Enzymaktivität nach Präaktivierung mit zweiwertigen Ionen

.......................................................................................................................... 56

4.2 Arginase in humanen myeloischen Zellen............................................................ 57

4.2.1 Arginase in humanen mononukleären Zellen und Granulozyten..................... 57

4.2.2 Arginase in hochreinen Granulozyten- und PBMC-Fraktionen....................... 59

4.2.3 Arginase in humanen Erythrozyten.................................................................. 62

4.2.4 Arginase in Granuloyzyten von Patienten mit Arginase-Defizienz ................. 63

4.3 Regulation der Arginase in vitro........................................................................... 65

4.3.1 Stimulation der Granulozyten mit den TH2-Zytokinen IL-4 und IL-10.......... 67

4.3.2 Stimulation der Granulozyten mit den TH1-Zytokinen TNF-α und IFN-γ...... 69

4.3.3 Stimulation der Granulozyten mit dem Chemokin IL-8 .................................. 69

4.3.4 Stimulation der Granulozyten mit Forskolin.................................................... 70

4.3.5 Stimulation der Granulozyten mit Dexamethason ........................................... 70

4.3.6 Zusammenfassung der in vitro Experimente.................................................... 71

4.3.7 Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten............................................. 72

4.4 Regulation der Arginase in vivo............................................................................ 74

4.4.1 Enzymaktivität bei Kontrollpersonen............................................................... 75

4.4.2 Enzymaktivität bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation ......... 75

4.5 Quantifizierung der Arginase-mRNA in Granulozyten von Patienten nach

allogener Stammzelltransplantation..................................................................... 97

5 Diskussion...................................................................................................................... 100

5.1 Arginase in humanen myeloischen Zellen.......................................................... 100

5.2 Arginase im murinen und humanen Immunsystem: fundamentale Differenzen

in Lokalisation, Regulation und Funktion ......................................................... 102

5.3 In vivo veritas: Regulation der humanen Granulozyten-Arginase durch

Glukokortikoide ................................................................................................... 105

5.4 Glukokortikoide und humane Granulozyten: Steigerung der

Arginaseexpression während der Reifung im Knochenmark oder nach

Abschluss der Differenzierung?.......................................................................... 108

5.5 Steigerung der Arginase-Aktivität in PMN durch Steroide: Beeinflussung der

Infektionsabwehr?................................................................................................ 110

5.6 Genetische Determination der Arginase-Aktivität in den Granulozyten? ..... 110

5.7 Arginase I und IL8 in humanen Granulozyten: Charakterisierung eines

(anti)inflammatorischen Phänotyps? ................................................................. 111

6 Zusammenfassung......................................................................................................... 113

7 Summary........................................................................................................................ 115

8 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 117

9 Anhang........................................................................................................................... 132

9.1 Transplantationsvorbereitung (Konditionierung) des Patienten .................... 132

9.1.1 GvHD-Prophylaxe und -Diagnostik............................................................... 132

9.2 Übersicht über die Patienten............................................................................... 133

9.3 Verlauf der Patienten........................................................................................... 135

9.3.1 Patienten mit mehr als 6 Messzeitpunkten..................................................... 135

9.3.2 Patienten mit 6 oder weniger Zeitpunkten ..................................................... 174

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen A Ampere

Abb. Abbildung

Aqua bidest. Aqua bidestillata (zweifach destiliertes Wasser)

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

ca. zirka

CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigen)

CD14+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD14 an der Oberfläche exprimieren

CD14- Zellen, die das Differenzierungsantigen CD14 nicht an der Oberfläche exprimieren

CMV Cytomegalie-Virus

CO2 Kohlenstoffdioxid

d.h. das heißt

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ERK Extracellular-regulated kinase

FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FL-1/2/3 FL-1=Grünfluoreszenz,530+-15nm FL-2=Orangefluoreszenz,585+-21nm FL-3=Rotfluoreszenz, > 650nm

FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®

g Gramm

GvHD Graft-versus-host-disease (Erkrankung)

h Stunde (lateinisch, hora)

Hb Hämoglobin

I.E. internationale Einheiten

IFN Interferon

IL Interleukin

iNOS induzierbare Stickstoffoxid-Synthase

l Liter

m milli (x 10-3)

mAK monoklonale(r) Antikörper

MIF Membranimmunfluoreszenz

min Minute(n)

MnCl2 Manganchlorid

MSH Mundschleimhaut

MW arithmetischer Mittelwert

n Anzahl der Einzelbeobachtungen bei Berechnung des Mittelwerts

NaCl Natriumchlorid

Nr Nummer

p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeiten zweier Datengruppe

PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (engl. pheripheral blood mononuclear cells)

PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Pellet Bodensatz durch Zentrifugation sedimentierter Zellen

PI Propidiumiodid

PMN polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten)

r / ρ Korrelationskoeffizient

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

s. siehe

SD Standardabweichung

SDS-PAGE Natrium(Sodium) Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®

Tab. Tabelle

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TH T-Helfer-Zelle

TNF Tumornekrosefaktor

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Unit, Einheit

u.a. unter anderem

V Volt

vgl. vergleiche

x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

z.B. zum Beispiel

µ mikro (x 10-6)

11

1 Einleitung und Zielsetzung Der Arginin-Stoffwechsel muriner Immunzellen spielt im Rahmen von entzündlichen

Prozessen eine herausragende Rolle (BOGDAN 2001). Arginin kann zum einen über die

Stickstoffmonoxid-Synthase (NO-Synthase) zu dem zytotoxischen Produkt NO

verstoffwechselt werden. Beim alternativen Stoffwechselweg wird die Aminosäure Arginin

durch das Enzym Arginase zu den Folgeprodukten Ornithin und Harnstoff umgesetzt.

Ornithin wiederum ist Ausgangsprodukt für die Synthese der Polyamine, welche

grundlegende Funktionen bei Prozessen der Zellreplikation ausüben (TABOR & TABOR

1984) und von Prolin, welches in die Synthese von Kollagen mündet. Neben der

antiinflammatorischen Potenz durch Kompetition mit iNOS um das gemeinsame Substrat

Arginin scheint Arginase somit aktiv an Prozessen der Geweberegeneration und

(patho)physiologischen Synthese von Extrazellularmatrix beteiligt zu sein (JENKINSON et

al. 1996). Es sind zwei Isoenzymvarianten der Arginase bekannt, welche die gleiche Reaktion

katalysieren, sich allerdings in zellulärer Lokalisation und Regulation voneinander

unterscheiden. Neben der zytosolischen Arginase I des hepatischen Harnstoffzyklus wird in

diversen extrahepatischen Geweben (v.a. Niere, Prostata, Dünndarm) des

Säugetierorganismus mitochondriell die Arginase II exprimiert.

Die Regulation des Arginin-Stoffwechsels in murinen myeloischen Zellen verläuft streng

dichotom durch Zytokine und CD4+T-Zellen. Während die NO-Synthase im Rahmen TH1-

gesteuerter inflammatorischer Bedingungen exprimiert wird, induzieren TH2-

Immunantworten die Expression der Arginase I in murinen Makrophagen und dendritischen

Zellen (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999) sowie in Granulozyten (MUNDER et

al. Manuskript eingereicht).

Im Vergleich zu den mittlerweile detaillierten Kenntnissen im murinen System liegen kaum

Daten zur Expression von Arginase in Zellen des humanen Immunsystems vor.

Es konnte bisher gezeigt werden, dass verschiedene humane Monozyten-Reifungsstadien

beide Isoenzyme der Arginase exprimieren (ROUZAUT et al. 1999), und dass

posttraumatisch Arginaseaktivität in humanen mononukleären Zellen induziert wird (OCHOA

et al. 2000). Eine mögliche Beteiligung der Arginase im Rahmen inflammatorischer Prozesse

zeigt sich durch die Überexpression der Arginase I in situ im Rahmen entzündlicher Infiltrate

bei der humanen Psoriasis (BRUCH-GERHARZ et al. 2003). Des weiteren konnte auch in

12

inflammatorischen Zellen der Synovialflüssigkeit bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

Arginase-Expression nachgewiesen werden (CORRALIZA et al. 2002).

In Vorversuchen des Labors konnte gezeigt werden, dass innerhalb der humanen myeloischen

Reihe das Enzym Arginase selektiv durch Granulozyten im Ruhezustand exprimiert wird. Im

Rahmen dieser Promotionsarbeit soll nun die Regulation der Arginase in humanen

Granulozyten in vivo und in vitro untersucht werden.

Die Analyse in vitro erfolgt in Zellkulturexperimenten mit Granulozyten klinisch gesunder

Probanden. Dabei soll zunächst die selektive Expression der Arginase in humanen

Granulozyten an einem größeren Spenderkollektiv validiert werden. Anschließend soll in

vitro untersucht werden, ob sich die konstitutive Arginase-Aktivität humaner Granulozyten

durch Zytokine, Chemokine und immunmodulierende Substanzen beeinflussen lässt.

In einem zweiten Teil soll zur Klärung der Funktion und Regulation des Enzyms Arginase in

vivo im humanen Immunsystem ein Patientenkollektiv im Verlauf nach allogener

Stammzelltransplantation untersucht werden. Dieses Kollektiv scheint besonders geeignet, da

diese Patienten zum einen nach Transplantation in relativ hoher Frequenz inflammatorische

Probleme entwickeln, bei denen sowohl infektiöse (v.a. Sepsis, Pneumonie, Weichteilinfekte)

wie nicht-infektiöse (GvHD) pathogenetische Effektormechanismen zugrunde liegen. Zum

anderen erhalten diese Patienten verschiedene immunmodulierende Substanzen mit

konsekutiver Beeinflussung der Granulozyten-Aktivierung (z.B. Steroide). So kann der

mögliche Einfluss verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zustände auf die humane

Granulozyten-Arginase in vivo im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden.

13

2 Literaturübersicht Das Immunsystem stellt ein komplexes Netzwerk miteinander interagierender Zellen und

ihrer Botenstoffe und Effektormoleküle dar. Eine der zentralen Aufgaben dieses Systems

besteht in der Steuerung von Inflammation und Antiinflammation: So sollen Pathogene über

inflammatorische Mechanismen eliminiert werden, wobei im Idealfall ein Maximum an

Effizienz (Inflammation) mit einem Minimum an Gewebedestruktion (Antiinflammation)

kombiniert wird. Einer der zentralen Stoffwechselwege im murinen Immunsystem im

Rahmen von Inflammation und Zytotoxizität ist der Arginin-Metabolismus myeloischer

Zellen.

2.1 Das Enzym Arginase

2.1.1 Induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und Arginase Die Aminosäure Arginin kann auf zwei Wegen abgebaut werden.

Durch das Enzym NO-Synthase, von dem drei Isoformen existieren, kann Arginin über das

Zwischenprodukt NG-Hydroxy-L-Arginin zu Citrullin und Stickstoffmonoxid (NO)

verstoffwechselt werden. Zwei der Isoformen, die neuronale und die endotheliale Form,

synthetisieren Calcium-abhängig kleine Mengen an NO, die als Botenstoffe bei vielen

physiologischen Prozessen (wie z.B. Vasoregulation oder Darmperistaltik) beteiligt sind. Die

induzierbare NO-Synthase, welche die dritte Isoform darstellt, wird Calcium-unabhängig

durch transkriptionelle Induktion reguliert (MACMICKING et al. 1997), wobei vor allem von

Makrophagen große Mengen an NO über lange Zeiträume synthetisiert werden können. NO

und weitere reaktive Folgeprodukte (z.B. Peroxynitrit) wiederum interagieren dann mit

Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren und sind so an zytotoxischen, antibakteriellen und

antiviralen Abwehrmechanismen beteiligt.

In einem alternativen Stoffwechselweg kann Arginin mittels Hydrolyse durch das Enzym

Arginase zu den Produkten Ornithin und Harnstoff abgebaut werden. Aus der Aminosäure

Ornithin kann durch die mitochondriell gelegene Ornithin-Aminotransferase Prolin

synthetisiert werden, welches eine zentrale Komponente des Kollagen darstellt. Durch das

Enzym Ornithin-Decarboxylase wird Ornithin zu den Polyaminen Putrescin, Spermidin und

Spermin abgebaut, welche u.a. bei der Zellreplikation von Bedeutung sind (TABOR &

TABOR 1984).

14

Das Enzym Arginase wurde bei vielen Prokaryonten und Eukaryonten charakterisiert und

liegt als multimerer, zumeist trimerer bis hexamerer Komplex vor, welcher aus identischen

Untereinheiten besteht (Molekulargewicht 30-40 kDa). Im aktiven Zentrum befinden sich

zwei Mn2+-Ionen, die für die Stabilität und Aktivität des Enzyms notwendig sind (KANYO et

al. 1996). Das pH-Optimum liegt im basischen Bereich bei pH 9-10.

Beim Menschen existieren zwei Isoenzymvarianten: Im hepatischen Harnstoffzyklus nimmt

die zytosolisch gelegene Arginase (Arginase I) eine wichtige Stellung ein, da diese

Ammoniak aus dem Proteinkatabolismus letztlich zu Harnstoff abbaut, welcher dann über die

Nieren ausgeschieden werden kann. Die grossen Organismenklassen lassen sich dabei

hinsichtlich ihrer metabolischen Entsorgung von Ammoniak einteilen. Fische und

amphibische Larven sezernieren Ammoniak direkt in das umgebende Wasser, während Vögel

und landlebende Reptilien es in Form von praktisch unlöslicher Harnsäure ausscheiden

(JENKINSON et al. 1996). Von allen im Harnstoffzyklus gelegenen Enzymen weist die

Arginase die höchste Aktivität auf. Eine Übersicht des Harnstoffzyklus findet sich in Abb. 1.

15

Abb. 1 Funktion der Arginase im Harnstoffzyklus (LÖFFLER & PETRIDES 2003)

Die zweite Isoenzymvariante, die mitochondriell gelegene Arginase II, die sich aufgrund ihrer

Regulation, chromosomalen Lokalisation (Arginase I: Chromosom 6; Arginase II:

Chromosom: 14) und diverser physikochemischer Eigenschaften von der anderen

Isoenzymvariante unterscheidet, ist in vielen extrahepatischen Geweben (v.a. Gehirn, Niere,

Prostata und Dünndarm) zu finden. Sie katalysiert die gleiche enzymatische Reaktion

(JENKINSON et al. 1996). Hierbei kontrolliert die Arginase an wichtigen Stellen des

Metabolismus die Höhe des Argininspiegels und liefert Ornithin für die Synthese z.B. von

Harnstoff, Proteinen, Kreatin, NO, Polyaminen, Prolin, Glutamat, Glutamin, GABA (γ-

Aminobuttersäure) und Agmatin.

Je nach Expression der alternativen Enzyme iNOS oder Arginase verschiebt sich folglich die

Homöostase des Immunsystems entweder in Richtung Inflammation (Generierung reaktiver

16

Stickstoffverbindungen durch iNOS) oder Anti-Inflammation (Reparaturprozesse,

Kollagensynthese durch Arginase) (BOGDAN 2001).

2.1.2 Das Enzym Arginase im murinen Immunsystem Murine Makrophagen und dendritische Zellen können sowohl hohe Arginaseaktivität als auch

iNOS exprimieren (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al.

1999). Dabei können diese Stoffwechselwege durch bestimmte Zytokine, bakterielle Produkte

oder antigenabhängig durch aktivierte T-Zellen in den myeloischen Zellen induziert werden.

Während Lipopolysaccharid gramnegativer Bakterien gleichzeitig beide Enzyme des

Argininstoffwechsels induziert (WANG et al. 1995), findet eine selektive Induktion eines der

beiden Enzyme im Rahmen CD4+ T-Zell-gesteuerter und zytokinvermittelter

Immunreaktionen statt. Hierbei lassen sich CD4+ T-Zellen anhand ihrer sezernierten Zytokine

in zwei große Klassen einteilen (ABBAS et al. 1996). T-Helfer 1 (TH1) Zellen sezernieren

die Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-β, während TH2-Zellen die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-

10 und IL-13 bei Stimulation produzieren. Diesem dichotomen Zytokin-Sekretionsmuster

entsprechen ebenso unterschiedliche Funktionen. TH1-Zellen sind v.a. an zellvermittelten

Immunreaktionen und TH2-Zytokine eher an humoralen Immunantworten beteiligt. Die

zentrale Bedeutung dieser Dichotomie zeigt sich im Verlauf zahlreicher muriner Infektionen,

der wesentlich vom Typ der T-Zell-Polarisierung bestimmt wird (MOSMANN & SAD 1996).

Typische TH1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) induzieren die Expression von iNOS und Hemmung

der Arginase, während typische TH2-Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13) umgekehrt die Expression

der Arginase und Hemmung der iNOS bewirken (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et

al. 1995).

Die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege sind ebenfalls an der

dichotomen Regulation beteiligt. So hemmt Nitrit, ein stabiles Produkt von NO, bzw. NG-

Hydroxy-L-Arginin die Arginase (BOUCHER et al. 1994, HRABAK et al. 1996), während

das Polyamin Spermin (SOUTHAN et al. 1994) und Harnstoff (PRABHAKAR et al. 1997)

die iNOS hemmen (s. Abb. 2).

17

Arginin

NO + Citrullin

Ornithin + Harnstoff

Polyamine ( Putrescin , Spermidin, Spermin )

Prolin

Kollagen

TH1 Zytokine (IFN - γ , TNF - α , TNF-β)LPS

TH2 Zytokine (IL - 4, IL - 10, IL - 13) LPS +

OAT ODC

+

Arginase iNOS

Arginin

NO + Citrullin

Ornithin + Harnstoff

Polyamine ( Putrescin , Spermidin, Spermin )

Prolin

Kollagen

TH1 Zytokine (IFN - γ , TNF - α , TNF-β)LPS

TH2 Zytokine (IL - 4, IL - 10, IL - 13) LPS +

OAT ODC

+

Arginase Arginase iNOSiNOS

Abb. 2 Argininstoffwechsel in murinen Makrophagen: Regulation und Folgeprodukte

Murine Makrophagen können durch bestimmte Zytokine bzw. bakterielle Produkte zur Expression von iNOS bzw. Arginase stimuliert werden. Durch LPS können beide Enzyme des Argininstoffwechsels induziert werden. Typische TH1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) führen zur Expression der induzierbaren NOS und Hemmung der Arginase, während typische TH2-Zytokine (IL-4, IL-13, IL-10) die Expression der Arginase und Hemmung der iNOS bewirken. Auch die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege greifen in die Regulation ein. Nitrit hemmt die Arginase, während das Polyamin Spermin und Harnstoff die induzierbare NOS hemmen. OAT: Ornithin-Aminotranferase ODC: Ornithin-Decarboxylase

Auch auf zellulärer Ebene mit polarisierten TH1- und TH2-Zell-Klonen zeigte sich diese

dichotome Regulation, wobei durch synergistische Kooperation der sezernierten TH2-

Zytokine IL-4 und IL-10 bzw. IL-13 und IL-10 sehr hohe Arginase-Aktivitäten in den

murinen myeloischen Zellen induziert werden (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999).

2.1.3 Funktion der Arginase in Krankheitsmodellen In murinen Krankheitsmodellen zeigt sich, dass die Polarisierung des Argininstoffwechsels

für den Phänotyp der Immunantwort von Bedeutung ist.

Die dichotome Regulation des Argininstoffwechsels korreliert mit dem inflammatorischen

Phänotyp und dem Verlauf bei verschiedenen murinen Krankheitsmodellen wie

beispielsweise bei der Wundheilung (SHEARER et al. 1997), der granulomatösen

Entzündung (RUTSCHMAN et al. 2001), der Herpes-simplex-Infektion (MISTRY et al.

2001), der Sepsis (CARRAWAY et al. 1998) sowie der autoimmunen Glomerulonephritis

(WADDINGTON et al. 1998). So ist die frühe Phase einer Inflammation bzw. die

Tumorabstoßung mit der Expression des Enzyms iNOS vergesellschaftet, wobei die

entstehenden reaktiven Stickstoffverbindungen ein zytotoxisches Umfeld schaffen.

Demgegenüber wird im weiteren Verlauf der Inflammation zunehmend Arginase in den

18

myeloischen Zellen exprimiert. Im Rahmen dieser späteren Phase setzen reparative Prozesse

ein, welche die Arginase durch Bereitstellung von Prolin für die Kollagensynthese bzw.

Polyaminen zur Fibroblastenreplikation begünstigt. Auch in einem murinen Tumormodell

wurde die Assoziation von Zytotoxizität (Tumorabstoßung) mit der iNOS bzw. von

Tumorprogress mit der Arginase demonstriert. So konnte gezeigt werden, dass Mäuse nach

Präimmunisierung mit avitalen P815 Tumorzellen nachfolgend intraperitoneal injizierte vitale

P815 Tumoren abstoßen, während es in naiven Mäusen zu einem progredienten

Tumorwachstum kommt. Im Rahmen der Tumorabstoßung exprimieren die im Tumor

enthaltenen Makrophagen vermehrt NO-Synthase, was zu einem Anstieg der Produktion von

NO und Citrullin im Tumorgewebe führt. Im Gegensatz hierzu ist der Tumorprogress mit

einem Abfall der Citrullin- und NO-Produktion und einer vermehrten Arginaseexpression der

infiltrierenden Makrophagen assoziiert (MILLS et al. 1992).

Die pathogenetische Relevanz der Arginase wurde auch im murinen Krankheitsmodell einer

Infektion mit Schistosoma mansoni gezeigt. In dieser Infektion kommt es im Rahmen einer

TH2-Zytokin-induzierten Immunantwort zur pathologisch-fibrosierenden Granulombildung

durch lokale Makrophagen mit starker Arginase-Expression. Diese TH2-induzierten Zellen

unterhalten durch Prolin-Bereitstellung und konsekutive Kollagensynthese die

Granulombildung (HESSE et al. 2001). Bei einer Infektion muriner Makrophagen durch

Trypanosoma cruzi wird das Parasitenwachstum durch Arginaseexpression der Makrophagen

gefördert (STEMPIN et al. 2004).

Auch bei der murinen Leishmaniasis spielt die Aktivierung der Arginase über TH2-Zytokine

eine Rolle für den Krankheitsverlauf. Leishmanien sind auxotroph für Polyamine, welche

durch TH2-induzierte Makrophagen bereitgestellt werden. Diesen Mechanismus nutzen die

Parasiten über eine TH2-Polarisierung der Immunantwort gezielt, um sich innerhalb des

Wirtes zu vermehren (INIESTA et al. 2001).

2.1.4 Arginase im humanen System Im humanen System kommt es unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen zu einer

vermehrten Expression der Arginase. So wurde in entzündlichen Infiltraten bei Patienten mit

Psoriasis eine vermehrte Expression der Arginase I beschrieben (BRUCH-GERHARZ et al.

2003). In der Synovia von Patienten mit rheumatoider Arthritis wurde eine Hochregulation

19

der Arginase II beobachtet (CORRALIZA et al. 2002). Ebenso konnte im Tumorgewebe der

Milchdrüse vermehrt Arginase gemessen werden (POREMBSKA et al. 2003).

Im menschlichen hämatopoetischen System wurde Arginaseaktivität in Granulozyten bei

einem an chronisch myeloischer Leukämie erkrankten Patienten nachgewiesen. Auch bei zwei

an akuter myeloischer Leukämie erkrankten Patienten war Arginaseaktivität im Überstand

maligner Zellen nach Differenzierungsinduktion zu finden (REYERO et al. 1975, PALU et al.

1979).

In humanen Erythrozyten konnte eine Expression der Arginase gemessen werden, wobei es

sich um das Isoenzym I handelt (SPECTOR et al. 1985, KIM et al. 2002).

Erhöhte Arginase-Aktivität wurde in peripheren humanen mononukleären Zellen nach

Verletzungen entdeckt, wobei die Zunahme der zellulären Arginase-Aktivität korreliert war

mit einer abnehmenden Plasma-Arginin-Konzentration sowie dem Schweregrad der

Verletzung (OCHOA et al. 2001).

Auch im Serum klinisch gesunder Probanden kann Arginase-Aktivität gemessen werden.

Außerdem zeigte sich bei Untersuchungen von Patienten mit Mammatumoren eine erhöhte

Enzymaktivität im Serum, die positiv mit dem Stadium der Erkrankung korrelierte

(POREMBSKA et al. 2002, POLAT et al. 2003). Ebenso konnte bei Patienten mit

kolorektalem Karzinom eine erhöhte Aktivität im Serum nachgewiesen werden, die nach

Tumorresektion wieder abfiel (POREMBSKA et al. 2002). Weiter zeigten sich bei Patienten

mit rheumatoider Arthritis erhöhte Enzymwerte im Serum (HUANG et al. 2001).

2.2 Myeloische Zellen

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wird der Arginase-Stoffwechselweg in humanen

Granulozyten näher charakterisiert. Im folgenden soll daher kurz auf das myeloische

Zellsystem sowie die Stellung der Granulozyten innerhalb dieses Zellsystems eingegangen

werden.

Im Knochenmark kommt es zur Bildung der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle, von

der sich alle zellulären Bestandteile des Blutes ableiten. Während die lymphatischen

Vorläuferzellen zur Reifung der T-Lymphozyten in den Thymus abwandern, verbleiben die

lymphatischen Vorläuferzellen der B-Lymphozyten wie auch die myeloischen

Vorläuferzellen im Knochenmark, wo sie v.a. zu Monozyten und Granulozyten

ausdifferenzieren.

20

2.2.1 Makrophagen Aus myeloischen Vorläuferzellen entwickeln sich Monozyten, die nach Auswanderung aus

dem Blutstrom in verschiedene Gewebe zu Makrophagen differenzieren. Je nach

Aufenthaltsort und Aktivierungszustand variieren Makrophagen funktionell und

morphologisch stark. Wesentliche Aufgabe der Makrophagen ist die Erkennung und

Bekämpfung von Infektionen. Sie gehören zu den ersten Zellen am Infektionsort und

erkennen Bakterien an allgemein vorkommenden Oberflächenstrukturen mittels Rezeptoren

(z.B. Toll-like-Rezeptoren, Mannose- und Scavenger-Rezeptor), welche die Phagozytose der

Infektionserreger bzw. die Aktivierung des Makrophagen einleiten.

So führt eine Stimulation des Makrophagen über Toll-like-Rezeptoren zu einer Aktivierung

des Transkriptionsfaktor NFκB und konsekutiv zur Produktion verschiedener Zytokine und

Expression der B7-Kostimulationsproteine. Diese wiederum spielen eine wichtige Rolle bei

der Antigenpräsentation und somit der Induktion der adaptiven Immunantwort.

Neben einer Vielzahl von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen (z.B. TNF-α, G-CSF,

IL-10, IL-15) sezernieren Makrophagen Chemokine (z.B. IL-8, MCP-1), die über

spezialisierte Rezeptoren weitere Entzündungszellen an den Infektionsort bringen.

Makrophagen sind somit gleichsam Bindeglieder zwischen dem angeborenen und erworbenen

Immunsystem (JANEWAY & TRAVERS 2002).

2.2.2 Dendritische Zellen Aus der myeloischen Vorläuferzelle können sich dendritische Zellen differenzieren.

Dendritische Zellen sind wesentlich für die Antigenpräsentation und Primärstimulation von

naiven T-Zellen verantwortlich (BANCHERAU & STEINMAN 1998).

Sie wandern im unreifen Zustand aus dem Blutstrom ins Gewebe, wo sie verbleiben und als

interdigitierende Zellen in einem Netzwerk verteilt sind. Dendritische Zellen nehmen

Antigene über Phagozytose (z.B. via Mannoserezeptor) und über Makropinozytose

(SALLUSTO et al. 1995) auf. Nach Antigenaufnahme in einem inflammatorischen Milieu

migrieren dendritische Zellen zum drainierenden Lymphknoten. Während der Migration

erfolgt eine weitere Ausreifung und Aktivierung der dendritischen Zellen. Im Zuge dieser

Differenzierung verlieren sie weitgehend die Fähigkeit zur Antigenaufnahme. Sie exprimieren

stattdessen in hoher Dichte MHC-Klasse I und II-Proteine, Kostimulations- und

Adhäsionsmoleküle und sind somit ausgerichtet auf eine möglichst effektive

21

Antigenpräsentation und ggf. Aktivierung interagierender T-Zellen (JANEWAY &

TRAVERS 2002).

2.2.3 Granulozyten Die Entwicklung des Granulozyten führt über verschiedene Differenzierungsstufen im

Knochenmark (Promyelozyt- Metamyelozyt- Myelozyt- Stabkerniger- Segmentkerniger)

schließlich zur Ausschwemmung in die Blutzirkulation, wobei z.B. bakterielle Produkte

(LPS) oder Glukokortikoide den Prozess der Ausschwemmung befördern. Die komplette

Entwicklung dauert ca. 10 Tage, nach dem Stadium des Myelozyten verliert der reifende

Granulozyt die Fähigkeit zur Replikation. Die Halbwertszeit des im Blut zirkulierenden

Granulozyten beträgt lediglich 4-10 Stunden. Im Blut unterscheidet man eine zirkulierende

und eine am Endothel verlangsamt entlangrollende Fraktion.

Granulozyten verdanken ihren Namen der ausgeprägten zytoplasmatischen Granulierung. Sie

enthalten vier verschiedene Granula-Typen, die sich in ihrer Proteinzusammensetzung und

Funktion voneinander unterscheiden. Insgesamt sind bislang mehr als 50 verschiedene

Proteine als Bestandteile der diversen Granula bekannt. Die Primärgranula (azurophile

Granula), deren Markerprotein die Myeloperoxidase darstellt, verschmelzen mit dem

Phagolysosom nach Phagozytose und entleeren ihren Inhalt (v.a. hydrolytische und

bakterizide Proteine) in das neue Kompartiment. Demgegenüber sind die Sekundärgranula

(Markerprotein: Lactoferrin) wesentlich für die Exozytose ihrer Inhaltsstoffe vorgesehen.

Neben diesen Granulatypen sind noch Tertiärgranula (Markerprotein: Gelatinase) und

sekretorische Vesikel beschrieben (BORREGAARD & COWLAND 1997, GEMSA et al.

1997, JANEWAY & TRAVERS 2002). Es existieren drei Arten von Granulozyten:

neutrophile Granulozyten, welche als Phagozyten wesentlich für die Infektionsabwehr des

Organismus sind, eosinophile Granulozyten, die bei der Abwehr von Infektionen durch

Parasiten und Würmer beteiligt sind und basophile Granulozyten, deren primäre

physiologische Funktion weitgehend unklar ist.

Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Immunzellen, die angelockt durch

Chemokine, welche von Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen als Reaktion auf

bakterielle Bestandteile sezerniert werden, am Ort eines Infektionsgeschehens erscheinen. Es

kommt zur Wanderung der Neutrophilen aus dem Blutgefäß ins Gewebe, der sogenannten

Extravasation.

22

Eingeleitet wird diese durch die in den Weibel-Palade-Körperchen der Endothelzellen

vorliegenden P-Selektinen und E-Selektinen, die wenige Minuten bzw. einige Stunden nach

Freisetzung chemotaktischer Faktoren an der Oberfläche der Endothelzellen erscheinen.

Diese Selektine erkennen die sulfatisierte Sialyl-Lewisx-Einheit, die an der Oberfläche der

Neutrophilen zu finden sind. Durch die Wechselwirkung zwischen Selektin und der Sialyl-

Lewisx-Einheit kommt es zum reversiblen Anheften der Neutrophilen an die Endothelzellen

und somit zu ihrer Abbremsung („rollen“), was eine stärkere Interaktion ermöglicht. Kommt

es nun durch TNF-α induziert auf den Endothelzellen zur Expression des Adhäsionsmoleküls

ICAM-1 und auf der Oberfläche der Granulozyten durch Chemokine (z.B. IL-8) zu einer

Konformationsänderung der Integrine LFA-1 und Mac-1, die normalerweise nur eine

schwache Adhäsion zeigen, heften sich die Granulozyten nun fest an das Endothel und

beenden das Entlangrollen. Mit Hilfe des immunglobulinähnlichen Molekül CD31, das

sowohl auf den Granulozyten als auch an den Verbindungsstellen der Endothelzellen

vorkommt, wird es den Neutrophilen ermöglicht, sich zwischen die Endothelzellen zu

drängen und das Blutgefäß zu verlassen („Diapedese“), wobei die Basalmembran mittels

proteolytischer Enzyme der Granulozyten für diese passierbar wird. Im Gewebe reagieren die

Leukozyten auf Chemokine und erreichen entlang eines Konzentrationsgradienten den

Infektionsherd (JANEWAY & TRAVERS 2002). Schon der Kontakt der Granulozyten mit

dem Fremdmaterial bzw. mit IL-8 und TNF-α setzt verschiedene Kaskaden in Gang. In der

Arachidonsäurekaskade werden z.B. biologisch hoch-wirksame Eicosanoide freigesetzt

(Prostaglandine, Leukotriene). Die Granulozyten besitzen weiterhin die Fähigkeit zur

Phagozytose, indem sie durch Ausstülpung der Membran als Pseudopodium das Pathogen

umhüllen. Für eine effiziente Phagozytose wesentlich ist die Interaktion von Komplement-

und FC-Rezeptoren des Granulozyten mit opsonisierenden Strukturen (Immunglobuline,

Komplement) auf der Oberfläche des Pathogens. Es bildet sich so ein Phagosom, welches

dann als Phagolysosom v.a. mit azurophilen Granula verschmilzt.

Granulozyten verfügen über ein breites Spektrum oxidativer und nicht-oxidativer Abwehr-

mechanismen gegenüber Pathogenen. Durch das Enzymsystem der NADPH Oxidase werden

im sogenannten „respiratory burst“ aus molekularem Sauerstoff Superoxidanionen und durch

weitere Umsetzung Hydroxylradikale und Hypochlorsäure gebildet. Diese hochreaktiven

Verbindungen wirken antimikrobiell, aktivieren Metalloproteinasen und inaktivieren

Antiproteinasen, was u.a. für die Gewebeschädigung im Rahmen einer Granulozyten-

23

vermittelten Entzündung verantwortlich ist. Neben den oxidativen Abwehrsystemen besitzen

Granulozyten in ihren Granula verschiedene nicht-oxidativ operierende antimikrobielle

Proteine (Defensine, Cathepsin G, Azurocidin, bacterial-permeability increasing protein,

Lactoferrin). Nach Verrichtung ihrer Aufgabe im Rahmen von Inflammation sterben

Granulozyten rasch durch Apoptose oder Nekrose ab und werden durch Makrophagen

phagozytiert (GEMSA et al. 1997, JANEWAY & TRAVERS 2002).

2.3 Abstoßungsreaktion (Graft-versus-host reaction)

Bei einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD) kommt es zur Abstoßung von Empfänger-

Zellen, Geweben und Organen (host) durch alloreaktive Spender-T-Lymphozyten (graft), die

sich aus dem Transplantat des Spenders entwickeln und die Zellen des Empfängers aufgrund

antigener Differenzen als „fremd“ erkennen.

Es gibt drei Voraussetzungen, die für das Entstehen einer GvHD erfüllt sein müssen

(BILLINGHAM 1966). Dies sind die Übertragung immunkompetenter Zellen, eine

Histoinkompatibilität zwischen Spender und Empfänger, und die Unfähigkeit des

Empfängers, die transfundierten oder transplantierten Zellen zu inaktivieren oder zu zerstören.

Alle diese Voraussetzungen sind bei einer allogenen Blutstammzell-Transplantation mit

nicht-monozygotem Spender erfüllt, wobei die klinisch relevante Inzidenz der GvHD in

Abhängigkeit von der Spendersituation trotz immunsuppressiver medikamentöser Prophylaxe

und der Auswahl eines in möglichst vielen HLA-Loci kompatiblen Spenders zwischen 30%

und 80% (BEATTY et al. 1985) beträgt. Die Rate höhergradiger akuter GvHD-Reaktionen

steigt aufgrund der Tatsache, dass zunehmend ältere Patienten transplantiert werden, und sich

der Anteil an Fremdspendern und Mismatch-Transplantationen (Nicht-Übersteinstimmung

zwischen Spender und Empfänger auf einem HLA-Allel) erhöht. In welchem Ausmaß eine

Abstoßung auftritt, hängt zum einem von der allelischen Variabilität im Bereich der

verschiedenen Genloci des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA A, B, C, DR, DP, DQ)

sowie weiterer, heute noch unvollständig charakterisierter sog. „minor histocompatibility

antigens“ ab. Auch das Alter des Patienten, Geschlechtsunterschiede zwischen Spender und

Empfänger, die Art der vorbereitenden Konditionierung, der CMV (Cytomegalievirus)-Status,

der klinische Zustand des Patienten vor der Transplantation und Art und Umfang der

Immunsuppression bestimmen die Inzidenz einer GvHD (GALE et al. 1987, NASH et al.

1992).

24

Pathophysiologisch betrachtet ist die GvHD eine entzündliche Reaktion, welche durch

immunkompetente Zellen aus dem Transplantat des Spenders ausgelöst wird, die sich gegen

Empfängerzellen richten. Diese immunkompetenten Zellen erkennen Fremdstrukturen des

Empfängers durch direkte oder indirekte Alloreaktivität und werden dadurch aktiviert. Die

Antigene werden den Spender-T-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen wie dendritische

Zellen oder Makrophagen präsentiert, wobei Interleukin 1, das hauptsächlich von Monozyten

produziert wird, die T-Helfer-Zellen zusammen mit anderen Faktoren stimuliert. Die T-

Helfer-Zellen wiederum exprimieren Interleukin 2, was zytotoxische CD8-positive T-Zellen

aktiviert. Diese reagieren mit den Empfänger-Zielzellen, die den MHC-Klasse-I-Komplex auf

ihrer Oberfläche besitzen. Die aktivierten T-Zellen sezernieren ein ganzes Spektrum

proinflammatorischer Zytokine (z.B. IFN-γ, TNF-α), aktivieren andere Effektorzellen des

Immunsystems (z.B. Makrophagen und NK-Zellen) und vermitteln direkte Zytotoxizität (z.B.

CD8+ T-Zell-vermittelt über Perforine und Granzym). Im murinen System konnte eine

Dominanz von TH1-vermittelten Immunreaktionen, die wesentlich durch CD4+-Zell-

Aktivierung initiiert und unterhalten wird, gezeigt werden (FERRARA et al. 1996).

Zeichen einer GvHD treten bevorzugt an den Organsystemen Haut, Gastrointestinaltrakt und

Leber auf. Am häufigsten betroffen ist die Haut. Bei einem Vergleich (MARTIN et al. 1990)

von 740 an akuter GvHD erkrankter Menschen zeigten 81% einen Befall der Haut, 54%

Zeichen am Gastrointestinaltrakt und 50% an der Leber.

Die Hautmanifestationen zeigen ein breites Spektrum, welches vom typischen

makulopapulösen Exanthem bis zur generalisierten bullösen Erythrodermie reichen kann.

Typische Prädilektionsstellen sind Handflächen, Fußsohlen, Schultern und Nacken. Eine

Ausbreitung der häufig juckenden entzündlichen Hautreaktion über den gesamten Körper ist

möglich. Nicht selten sind besonders bei chronischer GvHD neben der Haut auch die

Schleimhäute betroffen. Das Ausmaß der GvHD wird anhand der befallenen Körper-

oberfläche ermittelt und ist nicht zuletzt abhängig von der Schwere der Hautreaktion

(Erythem, Blasenbildung, Nekrosen und weiteres).

Histopathologisch lässt sich neben der Zerstörung des Epithelgewebes und Zellnekrosen bei

schweren Formen eine komplette Ablösung des oberen Teils der Epidermis von darunter

liegenden Hautschichten nachweisen. Die GvHD des Gastrointestinaltraktes ist eine der

häufigsten Todesursachen nach allogener Blutstammzell-Transplantation. Sie äußert sich

meist in sehr starken, teils blutigen, hochfrequenten wässrigen Diarrhöen und krampfartigen

25

Bauchschmerzen. Die pro Tag ausgeschiedene Stuhlmenge ist für die Beurteilung des

Schweregrades entscheidend. Bei schweren Verläufen kann sie mehrere Liter betragen und

führt somit zu einem massiven Verlust an Elektrolyten und Körperflüssigkeit.

Differentialdiagnostisch müssen dabei vor allem virale (z.B. CMV, Rotavirus, HSV,

Adenovirus) oder bakterielle Enteritiden sowie die Clostridium difficile-assoziierte

Enterokolitis abgegrenzt werden. Zur Beurteilung des histologischen Schweregrades wird in

der Regel eine endoskopische Untersuchung des Gastrointestinaltraktes mit Gewinnung von

Stufenbiopsien vorgenommen. Typischerweise ist das Kolon des Patienten betroffen, GvHD-

Zeichen können aber auch in allen anderen Bereichen des Gastrointestinaltraktes, wie

beispielsweise Magen, Ösophagus oder Duodenum auftreten.

Die Leber-GvHD ist eine entzündliche Erkrankung des Epithels der kleinen Gallengänge,

wobei es zu einem cholestatischen Ikterus mit direkter Hyperbilirubinämie, Anstieg der

Cholestaseparameter (AP, γGT) und weniger ausgeprägt auch der Transaminasen kommt.

Differentialdiagnostisch kommen z.B. virale Hepatitis, medikamententoxische Leberschäden

oder Venenverschlusskrankheit in Frage.

Je nach Ausmaß der Organbeteiligung und histologischer Analyse des betroffenen Areals

wird die GvHD in vier histologische Schweregrade unterteilt (GLUCKSBERG et al. 1974).

Aus dem Zusammenspiel aller beteiligten Organsysteme ergibt sich ein klinisches

Gesamtstadium, das von einer milden GvHD im Grad I bis zu einer lebensbedrohlichen

Symptomatik im Grad IV reichen kann.

Man unterscheidet zwischen einer akuten und einer chronischen GvHD, wobei die akute

GvHD innerhalb der ersten 100 Tage und die chronische GvHD typischerweise nach mehr als

100 Tagen nach allogener Transplantation auftritt. Zur Unterscheidung zwischen diesen

beiden Formen ist jedoch nicht primär der Zeitpunkt des Auftretens relevant, sondern das

klinische Erscheinungsbild.

So zeigt die akute GvHD meist ein sich rasch entwickelndes und - falls medikamentös nicht

beherrschbar – schnell progredientes Krankheitsbild, während die chronische GvHD, die

schätzungsweise 40%-60% der Langzeitüberlebenden entwickeln (VOGELSANG et al.

2003), eher schleichend verläuft. Während in den letzten drei Jahrzehnten bei transplantierten

Patienten die Mortalität nach akuter GvHD durch Entdeckung neuer Immunsuppressiva

deutlich gesenkt werden konnte, so ist es bis heute kaum möglich, die Häufigkeit des

26

Auftretens der chronischen GvHD sowie deren Mortalitätsrate zu senken (GÖRNER et al.

2002).

Die akute GvHD, die mit zunehmendem Alter der Patienten eine höhere Inzidenz zu haben

scheint, ist häufig mit Fieber, Verschlechterung des Allgemeinzustandes und Gewichtsverlust

verbunden. Neben den genannten Organen können auch lymphatische Organe, die

Konjunktiven oder die Bronchien betroffen sein. Bei der chronischen Form der GvHD, die

Ähnlichkeiten zu bestimmten schweren Autoimmunerkrankungen aufweist, sind oft auch

Schleimhäute, Augen, Ösophagus, Lunge oder Muskeln betroffen.

Therapiebedürftigkeit bezüglich einer GvHD besteht in der Regel ab einem klinischen

Gesamtschweregrad II, insbesondere bei viszeraler Beteiligung. Die Primärtherapie besteht in

der Gabe von Steroiden wie beispielsweise Prednison, welches die zellvermittelte Immunität

durch eine Reduktion der Zahl an Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten supprimiert.

Das rasche Ansprechen der GvHD auf diese Therapie ist von großer Bedeutung für die

weitere Prognose des Patienten. Bei Therapierefraktärität können sich, ähnlich zu

Darmerkrankungen anderer Genese, Komplikationen wie Ileusbildung, Perforation,

Megakolon, schwere Blutungen oder exsudative Enteropathiesyndrome entwickeln. Die

Mortalität der schweren, steroidrefraktären GvHD liegt bei etwa 70% (MARTIN et al. 1990).

2.4 Glukokortikoide

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wird der Einfluss von Glukokortikoiden auf die

Arginase-Aktivität humaner Granulozyten in vitro und in vivo untersucht. Glukokortikoide

werden zum einen bei einer Vielzahl von inflammatorischen Erkrankungen als

Immunsuppressivum therapeutisch eingesetzt. Sie beeinflussen die Reaktionslage des

Immunsystems durch Interaktion mit verschiedenen Zelltypen wie beispielsweise

neutrophilen Granulozyten (COX 1995), Eosinophilen und Lymphozyten (OHTA &

YAMASHITA 1999, FRANCHIMONT 2004) sowie durch Induktion einer Vielzahl

zellulärer Mechanismen (COX 1995, NAKAGAWA et al. 1998, OHTA & YAMASHITA

1999). Bei schwereren Verlaufsformen der GvHD stellen sie das Mittel der ersten Wahl dar

(s. 2.3). Ihre Wirkungsweise summiert sich hierbei zu einer im wesentlichen

antiinflammatorischen Effektorfunktion. Da in verschiedenen Studien eine Beeinflussung der

Arginaseexpression durch Steroide gezeigt worden war, schien es interessant, eine mögliche

Regulation der humanen Granulozyten-Arginase durch Glukokortikoide zu analysieren.

27

Glukokortikoide werden hauptsächlich in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde gebildet

(TAN et al. 1975). Über die Freisetzung des Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) aus dem

Hypothalamus erfolgt die Ausschüttung von ACTH aus dem Hypophysenvorderlappen,

welches wiederum die Synthese von Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde bewirkt. Die

Ausschüttung des ACTH und somit die vermehrte Synthese und Ausschüttung der

Glukokortikoide erfolgt zirkadian, mit einem morgendlichen Gipfel. Das ausgeschüttete

Glukokortikoid wiederum koppelt negativ zur Hypophyse und zum Hypothalamus zurück

(HODGES 1984, LABRIE et al. 1984, CSERNUS & MESS 2003).

Glukokortikoide regulieren den Metabolismus von Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen. Sie

stimulieren die Glukoneogenese der Leber, und im Fettmetabolismus bewirken Gluko-

kortikoide eine Spaltung von Triglyzeriden (Lipolyse) zur Erhöhung des Fettsäurespiegels im

Blut (EXTON 1979, FAIN 1979, DE MARTINO et al. 2004).

Unter Stressreaktionen kommt es zur vermehrten Ausschüttung von Glukokortikoiden und bei

lange andauernden Stressphasen zur Habituation (HERMAN et al. 2003, HELM et al. 2004).

Des weiteren wirken Glukokortikoide antiinflammatorisch und immunsuppressiv. So hemmen

sie das Enzym Phospholipase A2, welches aus Phospholipiden Arachidonsäure synthetisiert

(BAILEY 1991). Sie senken die Anzahl der zirkulierenden eosinophilen und basophilen

Granulozyten und Lymphozyten (OHTA & YAMASHITA 1999, MARONE et al. 2002,

DRUILHE et al. 2003).

Außerdem wurde eine Interaktion von inflammatorischen Zytokinen mit dem Hypothalamus-

Hypophysen-Nebennierenrinden-System gezeigt. So führen die Zytokine IL-1 und IL-2 zur

vermehrten Freisetzung des CRH aus dem Hypothalamus, während im Gegenzug die

Zytokinproduktion durch Glukokortikoide gehemmt wird (CAMBRONERO et al. 1992,

GILL et al. 1998).

2.4.1 Das Enzym Arginase und Glukokortikoide Verschiedentlich ist eine Beeinflussung der Arginase durch Glukokortikoide beschrieben

worden. Sowohl in vivo in der Rattenleber (PATNAIK & PATNAIK 1989) als auch in vitro

in Hepatozyten und hepatischen Zell-Linien der Ratte (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et

al. 1997) lässt sich die Arginase-Expression durch die Stimulation mit Glukokortikoiden

steigern.

28

In Alveolarmakrophagen wird durch die Gabe von Glukokortikoiden die basale Arginase-

Enzymaktvität erniedrigt und die LPS-induzierte Zunahme der Arginaseaktivität unterdrückt

(KLASEN et al. 2001). Bei Fibroblasten der Atemwege der Ratte bleibt zwar durch

Glukokortikoidgabe die basale Enzymaktivität unverändert, allerdings zeigt sich auch hier

eine Blockade des durch IL-13 und IL-4 induzierten Enzymanstiegs (LINDEMANN &

RACKÉ 2003). Bei der steroidvermittelten Regulation der Arginase handelt es sich offenbar

um ein weit verbreitetes Phänomen. So induzieren Steroide das Enzym u.a. in humanen

Magenkarzinom-Zell-Linien (WU et al. 1992), im Intestinaltrakt neonataler Ratten

(KONARSKA et al. 1986) und in murinen Speicheldrüsen (AKIBA et al. 2002).

Verschiedene Arbeiten zeigten eine Beteiligung von Transkriptionsfaktoren der

CCAAT/Enhancer Binding Protein Familie im Rahmen der Glukokortikoid-induzierten

Arginase I-Expression in verschiedenen Gewebetypen (TAKIGUCHI & MORI 1991,

GOTOH et al. 1997).

29

3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte

Absaugvorrichtung für Zellkulturen und Mikrobiologie

neoLab (29336), Heidelberg

Accu-jet® Pipettierhilfe neoLab (32650), Heidelberg

Aqua tridest Aufbereitungsanlage Quantum EX(QTUM 000 EX), Millipore, Schwalbach

Autoklav Typ A5-70598 Webeco, Bad Schwartau

Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau

Blotkammer - Trans Blot-49BR 1374 Bio-RAD, Hercules, USA

Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

Cytospinzentrifuge „Cytospin® 2“ Shandon, Franfurt

Dampfsterilisator „Varioklav®“ Typ 300EC H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim

Eismaschine Typ AF 20AS/B Scotsman, Milano

Eisschrank –80°C Heraeus, Hanau

Electrophorese Einheit –SE 600 Hoefer, US Patent 4,224,134

Electrophoresis Power Supply EPS 3500 Amersham Pharmacia Bio Tech, Freiburg

ELISA Lesegerät Tecan Sunrise Tecan, Crailsheim

FACSScan Becton Dickinson, Heidelberg

FACSVantage SE Becton Dickinson, Heidelberg

Gene Quant II RNA/DNA-Calculator Pharmacia Biotech, Cambridge, England

Heizblöcke Eppendorf, Hamburg

HeraCell Begasungsfeuchtraumbrutschrank Heraeus Instruments, Hanau

Laborwaage L2200P Sartorius, Mannheim

Mikroskope DMIL Leica, Solms

Mikroskop DMLS Typ 020 518 500 Leica, Wetzlar

Neubauer Zählkammer Eppendorf, Hamburg

pH-Meter- Typ 766 Knick, Darmstadt

Photoentwicklungsmaschine-Typ: 9462/205 Agfa (CP 1000), Mortsel, Belgien

Pipetten, einstellbar von 100-1000ul, 20-200ul, 1-20ul

Abimed, Langenfelden

Reinluftsterilbank HeraSafe Heraeus Instruments, Hanau

30

Sepatech Megafuge 3.0R Heraeus Instruments, Hanau

Vortex-Genie 2 neoLab, Heidelberg (Wellesley, USA)

3.2 Material

3.2.1 Verbrauchsmaterialien 96 Well Polystyrol Microplatten, F-Boden, transparent

Greiner (655 101), Frickenhausen

Abdeckfolie für Mikrotiterplatten Greiner (676 001), Frickenhausen

MACS® CD 14 Micro Beads Miltenyi Biotec (191-01), Bergisch Gladbach

Filterkarten, weiss zur Cytospinzentrifuge Shandon(599 100 22), Frankfurt

Filterpipettenspitzen 101-1000ul Starlab (51126 7810), Ahrensberg

HybondTM P Amersham Bioscience (Rpn 2020), Little Chalfont, UK

HyperfilmTM Amersham Bioscience (RPN 3103k), Little Chalfont, UK

MiniMACS® Starting Kit Miltenyi Biotec (130 090 312), Bergisch Gladbach

Multifly® Set Sarstedt (85.1638), Nümbrecht

Objektträger Langenbrinck, Emmendingen

Objektträger „Superfrost“ Shandon (6776207), Frankfurt

Pasteur Kapillarpipetten, Grösse 150mm neoLab (E 1096), Heidelberg

Pipetten, serologisch 25ml Greiner (760 180), Frickenhausen

Pipettenspitzen 0,5-20ul Greiner (771 290), Frickenhausen

Pipettenspitzen 100-1000ul Greiner (740 290), Frickenhausen

Pipettenspitzen 10-200ul Greiner (739 290), Frickenhausen

Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,15ml, konische Bodenform


Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,50ml, konische Bodenform


Reaktionsgefäß „Cryo-Tubes“ 1,5ml neoLab (74708), Heidelberg

Reaktionsgefäße 1,5ml Eppendorf (0030 120 086), Hamburg

Röhrchen, 5ml für die Durchflusszytometrie Becton Dickinson (2008), Heidelberg

S-Monovette®-EDTA Sarstedt (02.1066.001), Nümbrecht

31

Sterilfilter, 0,22um Porenweite Renner (06001), Darmstadt

Whatman-Papier Sartorius (2519460570), Göttingen

Zellkultur Multiwell Platten, 12 Vertiefungen, steril


3.2.2 Reagenzien

α-Isonitrosopropiophenon Sigma (I3502), Steinheim

Acrylamide-Bis Serva (10688), Darmstadt

Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck (1142), Farnstadt

Ammoniumpersulfat Fluka - Sigma (09914), Steinheim

Aprotinin Sigma (A1153), Taufkirchen

Bovines Serum Albumin Serva (11930), Heidelberg

Bromphenolblau Merck (46191), Farnstadt

Chloroform Baker (7386), Deventer, Holland

ColorBurstTM Elektrophoresemarker Sigma (C 4105), Saint Louis, USA

Dexamethason Sigma (D1756), Saint Louis, USA

Dextransulfat Amersham Pharmacia Biotech (17-0340-01), Uppsala, Schweden

Dimethyl-Sulfoxid Sigma (02140EB), St.Louis, USA

Dithiothreitol Roche (70004021), Mannheim

ECLTM Reagent 1 Amersham Bioscience (RPN 2106V1), Little Chalfont, UK

ECLTM Reagent 2 Amersham Bioscience (RPN 2106V2), Little Chalfont, UK

EDTA Sigma (E5134), Taufkirchen

Entwickler, Reagens A Agfa (G153-A), Mortsel, Belgien

Entwickler, Reagens B Agfa (G153-B), Mortsel, Belgien

Ethanol absolut Riedel-de Häen (32205), Seelze

Fetales Kälberserum Sigma (F7524), St. Louis, USA

FicoLite H® Linaris (1511YK),Wertheim-Bettingen

Fixierer Agfa (G354), Mortsel, Belgien

Forskolin Calbiochem (344 270), La Jolla, USA

Giemsa-Lösung Fluka - Sigma (48900), Steinhein

32

Glycerol ICN Biomedicals (800688), Aurora, USA

Glycin für die Molekularbiologie AppliChem (1067.1000), Darmstadt

Harnstoff Fluka - Sigma (51459), Steinheim

Immersionsöl für Mikroskopie Merck (1046990100), Farmstadt

Kaliumhydrogenkarbonat (KHCO3) Riedel-de Häen (12602), Seelze

L-Arginin Hydrochlorid Sigma (A5131), Steinheim

Leupeptin Sigma (L2884), Taufkirchen

L-Glutamin Bio Whittaker (BE 17-605E), Verviers, Belgien

Manganchlorid Fluka - Sigma (M3634), Steinheim

May-Grünwald Merck (1014240500), Darmstadt

Methanol Fluka - Sigma (65543), Seelze

Milchpulver Roth (T 145.2), Karlsruhe

N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Fluka - Sigma (87689), Steinheim

Natriumazid J.T.Baker (9099), Gross-Gerau

Natriumchlorid Roth (9265), Karlsruhe

ortho-Phosphorsäure 85%, p.a. neoLab (4990), Heidelberg

PBS-Dubecco (1x) w/o Ca2+, Mg2+ Biochrom A(L1825), Berlin

Penicillin-Streptomycin-Lösung Sigma (P0781), St.Louis, USA

PepstatinA Sigma (P5318), Taufkirchen

Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma (P7626), Steinheim

Phenolrot Sigma (P5530), St.Louis, USA

Propidiumiodid Calbiochem (537059), Bad Soden

Protein Assay, Reagent A Bio-RAD (500-0113), Hercules, USA

Protein Assay, Reagent B Bio-RAD (500-0114), Hercules, USA

Protein Assay, Reagent S Bio-RAD (500-0115), Hercules, USA

rHu IFN-γ PromoCell (C-60724), Heidelberg

rHu IL-4 PromoCell (C-61410), Heidelberg



rHu TNF-α PromoCell (C-63720), Heidelberg

RPMI 1640-Medium Sigma (R0883), Steinheim

33

Schwefelsäure 96%, p.a. Roth (9316.2), Karlsruhe

Sodium dodecyl sulfate Sigma (L3771), Steinheim

Trifast® Peqlab (302020), Erlangen

Tris-HCl Fluka - Sigma (61952), Steinheim

Tris, Pufferan® Roth (48551), Karlsruhe

Triton x-100 Sigma (T8532), Steinheim

Trypanblau Merck (143903), Darmstadt

Tween®20 Roth (91271), Karlsruhe

34

3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien

Kaninchen-anti-Ratte-Arginase I Hierbei handelt es sich um ein gegen Leber-Arginase der Ratte gewonnenes polyklonales

Kaninchen-Antiserum, welches kreuzreaktiv gegen humane Leber-Arginase ist.

Der Antikörper wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. G. Soler, Universität

der Extremadura, Cáceres, Spanien (DIEZ et al. 1994). Der Antikörper wurde in einer

Verdünnung von 1:5000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1% BSA eingesetzt.

MAP-Kinase: ERK 1/2 (Extracellular-regulated kinase) Zur Kontrolle der Proteinbeladung beim Immunoblot wurde dieser Antikörper (Kaninchen,

polyklonal) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1%BSA

eingesetzt.

Sekundärantikörper Als Sekundärantikörper beim Immunoblot wurde Ziege-anti-Kaninchen IgG HRP (Sc 2004,

Santa Cruz 40174 251) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) hergestellt.

Monoklonale Antikörper Die Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Bo1 (IgG 1κ) produzieren, wurden in

der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der

Immunisierung von Mäusen mit bovinen lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach

Transformation mit Theileria annulata) hergestellt (VON DER OSTEN 1990, REBESKI

1990). Der mAK Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse I-Moleküle (SCHUBERTH et al. 1992).

Sekundärantikörper zur Herstellung von Referenzzellen Als Sekundärantikörper dienten Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten),

affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörper, absorbiert gegen Human-,

Rinder- und Pferdeserumproteine, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Dianova,

Hamburg, Nr.115-015-068, 1,5mg/ml). Die eingesetzte Verdünnung zur Herstellung von

Referenzzellen war 1:40.

35

3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Alle Medien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua bidest.

angesetzt.

Lösungen zur Aufreinigung des Blutes Dextransulfat-Lösung

3g Dextransulfat wurden in 100ml PBS gelöst.

Erythrozyten-Lyse-Puffer

NH4Cl 155 mmol/l

KHCO3 10 mmol/l

EDTA 0,1 mmol/l

Der pH-Wert wurde auf 7,4 einstellt.

Zellkulturmedien und Zusätze Zellkultur-Vollmedium

RPMI-1640-Medium wurden 10%FCS zugefügt, das zuvor 30min bei 56°C inaktiviert wurde,

sowie 100E/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 2mmol/l L-Glutamin.

Stammlösung von Interferon- γ (IFN-γ), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 10 (IL-10)

Zur Herstellung einer Stammlösung wurde das jeweilige Zytokin in sterilem Wasser gelöst

und auf eine Konzentration von 10µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde

es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale Konzentration von 20ng/ml verdünnt.

Stammlösung von Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF−α) Humanes rekombinantes TNF-α wurde zur Herstellung einer Stammlösung in sterilem

Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10µg/ml verdünnt.

Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) zur

Erstellung der finalen Konzentration 1:100 verdünnt.

Stammlösung von Interleukin-8 (IL-8)

Humanes rekombinantes IL-8 wurde mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von

100µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium

(s.S. 35) auf eine Konzentration von 50ng/ml eingestellt.

36

Stammlösung von Forskolin Forskolin wurde in DMSO gelöst und eine Stammlösung von 10mmol/l hergestellt. Vor

Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine

Konzentration von 50µmol/l eingestellt.

Stammlösung von Dexamethason

Dexamethason wurde in Ethanol gelöst und eine Stammlösung von 2,5mmol/l hergestellt. Vor

dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale

Konzentration von 50 µmol/l eingestellt.

Lösungen zur Messung der Enzymaktivität der Arginase Triton-Lösung

1ml Triton X-100 wurde zur Herstellung einer 1%igen Triton-Lösung in 99 ml H2O gelöst.

Tris-HCl-Lösung

Zur Herstellung einer Tris-HCl-Lösung mit einer Konzentration von 50mmol/l wurden 3,03g

Tris-Base/500ml in H2O gelöst und anschließend mit 5 mol/l HCL auf einen pH-Wert von 7,5

eingestellt.

Proteaseinhibitoren

PMSF: zur Herstellung einer Stocklösung von 100mmol/l wurde 17,4mg in 1 ml

100% Ethanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 mmol/l

Aprotinin: zur Herstellung einer 5000fachen (10mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in

5 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 2 µg/ml

Leupeptin: zur Herstellung einer 1000fachen (1mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in

50 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 µg/ml

Pepstatin A: zur Herstellung einer 1000fachen (1,5mg/ml) Stocklösung wurde 5mg in

3300 µl Methanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1,5 µg/ml

Die aliquoten Teile der Proteinaseinhibitoren (1 ml) wurden bei –20°C aufbewahrt.

Zell-Lyse-Puffer

Zur Herstellung des Zell-Lyse-Puffers wurde 1%ige Triton-Lösung (s.S. 36) mit Tris-HCl-

Lösung (s.S. 36) in einem Verhältnis 1:1 gemischt. Danach erfolgte die Zugabe der

Proteinaseinhibitoren in oben aufgeführter finaler Konzentration.

37

Manganchlorid-Lösung (MnCl2) Zur Herstellung einer MnCl2-Lösung von 10mmol/l wurden 0,19 g MnCl2 in 100 ml

H2O.gelöst.

L-Arginin-Lösung

Zur Herstellung einer L-Arginin-Lösung mit einer Konzentration von 0,5mol/l wurden 10,53g

L-Arginin in 100ml H2O gelöst und dann mit 5 mol/l NaOH auf einen pH-Wert von 9,7

eingestellt.

Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.

Säuregemisch

Es wurden 320 ml H2O mit 135 ml Phosphorsäure (H3PO4, 85%) und 45 ml Schwefelsäure

(H2SO4, 97%) gemischt und bei 4°C gelagert.

α-Isonitrosopropiophenon-Lösung Zur Herstellung einer 6% ISPF-Lösung wurden 3g ISPF in 50ml 100% Ethanol gelöst.

Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C in Dunkelheit.

Harnstoff-Stock-Lösung

Zur Herstellung der Harnstoff-Stocklösung wurden 60 mg Harnstoff in 100 ml H2O gelöst.

Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.

Lösungen für die Elektrophorese und den Immunoblot SDS-Page Puffer (3fach)

Dithiothreitol 7mg/ml

EDTA 1mmol/l

Tris-HCl 10mmol/l

SDS 3%

Glycerol 13%

Bromphenolblau 0,007%

EDTA, Tris-HCl, SDS, Glycerol und Bromphenolblau wurden auf 37°C erwärmt, um die

Produkte zu lösen. Danach erfolgte die Zugabe von Dithiothreitol.

Tris-Lösung I

Tris-Base 1,5mol/l

Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1 mol/l) auf pH 8,8 eingestellt.

Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.

Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.

38

Tris-Lösung II Tris-Base 0,5mol/l

Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1mol/l) auf 6,8 eingestellt.

Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.

Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.

Trenngel

12% finale Acrylamidkonzentration

6ml 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide

3,75ml Tris-Lösung I (s.S. 37)

5,25ml H2O

0,05ml 10% Ammoniumpersulfat

0,01ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

Sammelgel

0,65ml 30% Acrylamide/0,8 % Bisacrylamide

1,25ml Tris-Lösung II (s.S. 38)

3,05ml H2O

0,025ml 10% Ammoniumpersulfat

0,005ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

Puffer zur Elektrophorese (5fach)

Tris-Base 15,1g/l

Glycin 72,0g/l

SDS 5,0g/l

TBS (5fach)

Tris-Base 50 mmol/l

NaCl 250 mmol/l

Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (12mol/l) auf 8,0 eingestellt.

TBST

1 l TBS (5fach) ad 5 l Wasser

Es wurden 0,5% Tween-20 zugegeben.

SDS-PAGE Blotting Puffer (5fach)

Tris-Base 242,4 g/l

Glycin 1152 g/l

39

SDS-PAGE Blotting Puffer (1fach) 800 ml 5x SDS-PAGE Blotting Puffer

10 ml 20% SDS

800 ml Methanol

2390 ml H2O

Blocking-Puffer

Zur Herstellung einer 5%igen Magermilch-Blocking-Puffer-Lösung wurden 5g

Magermilchpulver in 100 ml TBST (s.S. 38) gelöst.

Lösungen für die Durchflusszytometrie Stammlösung von Propidiumiodid-Lösung

25 µg/ml Propidiumiodid in PBS

Membranimmunfluoreszenzpuffer (MIF-Puffer)

Wasch- und Verdünnungspuffer für die Immunfluoreszenz

BSA 5g/l

NaN3 0,1g/l

Gelöst in PBS

Lagerung bei 4°C

3.2.5 Humane Probanden

Patienten Bei den Patienten handelte es sich um Personen im Alter zwischen 21 und 65 (im

Durchschnitt: 48) mit hämatologischen Krankheitsbildern, die im Zeitraum von Mai 2002 bis

November 2003 in der Medizinischen Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg

allogen blutstammzelltransplantiert wurden.

Diese Patienten wurden vor Beginn der Studie schriftlich und mündlich über den Hintergrund

der geplanten Analysen und die damit verbundenen Belastungen aufgeklärt. Ihre Zustimmung

wurde durch Unterschrift auf der Einwilligungserklärung dokumentiert.

In ca. 14-tägigen Abständen wurde den Patienten im Rahmen von routinemäßigen

Untersuchungen zusätzlich ca. 8ml EDTA-Blut abgenommen. Dies wurde bis maximal ein

Jahr nach der allogenen Stammzelltransplantation durchgeführt.

Bei einer therapierefraktären Anämie mit einem Hb unter 7,5 g/dl wurde den Patienten kein

zusätzliches Blut entnommen.

40

Die Blutabnahmen wurden im Rahmen einer von der Ethikkommission der Medizinischen

Fakultät der Universität Heidelberg befürworteten Studie gewonnen (#120/2002; Titel:

Verwendung von Restmaterial aus gewonnenen diagnostischen Darm-, Haut- und

Knochenmarkbiopsien sowie Gewinnung zusätzlicher Blutproben bei Patienten nach

allogener Stammzelltransplantation zur Evaluation der Zusammenhänge von Graft-versus-

Host-Erkrankung (GvHD) und Immunrekonstitution).

Eine Übersicht der Patienten hinsichtlich Alter, Grunderkrankung, Konditionierung und

Krankheitsverlauf befindet sich im Anhang.

Vorbereitung und Transplantation Indikationen zur allogenen Transplantation

Die Grunderkrankungen stellten bei den an dieser Studie teilnehmenden Patienten eine

Indikation zur allogenen Blutstammzell-Transplantation mit einem familiären oder

unverwandten Spender dar. Die Indikation zur Transplantation wurde nach ausführlicher

Untersuchung, Restaging der Erkrankung und Einverständnis des Patienten gestellt.

Die genaue Vorgehensweise bei der Transplantationsvorbereitung ist dem Anhang zu

entnehmen.

Medikamente zur Prophylaxe einer GvHD Cyclosporin A (CsA)

Das Oligopeptid Cyclosporin A hemmt die Calcineurin-Phosphatase und somit die

Translokation des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of activated T cells) aus dem

Zytosol in den Zellkern. Dieser Wirkmechanismus erklärt die selektive Suppression der

Zytokinsekretion und Proliferation von T-Zellen.

Mycophenolatmofetil (MMF)

Mycophenolatmotefil hemmt die de-novo-Synthese von Guanosin-Nukleotiden durch

Blockade des Enzyms Inosin Monophosphat Dehydrogenase. Da diese de-novo-Synthese für

die Proliferation von T- und B-Lymphozyten unerlässlich ist, wirkt MMF stärker zytostatisch

auf Lymphozyten als auf andere Zellen.

Prednison

Das Glukokortikoid Prednison (1,2-Dehydrocortison) hat eine antiinflammatorische und

antiproliferative Wirkung auf verschiedene Zelltypen. Es supprimiert die zellvermittelte

Immunität durch eine Reduktion der Zahl an Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten.

Im Gegensatz hierzu wird die Zahl der Thrombozyten und neutrophilen Granulozyten erhöht.

41

Wie alle Glukokortikoide gelangt auch Prednison nach Bindung an einen zytoplasmatischen

Steroidrezeptor in den Zellkern. Dort moduliert der Glukokortikoid-Rezeptorkomplex durch

Bindung an regulatorische Gensequenzen die Transkription verschiedener Zytokine und

Adhäsionsproteine, welche im Rahmen inflammatorischer Immunantworten exprimiert

werden.

FK506

Wie Cyclosporin A ist auch FK506 ein Calcineurin-Inhibitor, der über eine Hemmung der

NFAT-Translokation in den Zellkern eine Suppression der T-Zell-vermittelten

Immunreaktionen bewirkt.

Methotrexat

Methotrexat wirkt immunsuppressiv durch seinen Antagonismus gegenüber Folsäure.

GvHD-Diagnostik Zur Beurteilung der GvHD werden sowohl klinische Zeichen (Stuhlmenge und Stuhlfrequenz,

Übelkeit, Veränderungen der Haut und Schleimhäute) als auch Laborwerte (Bilirubin)

herangezogen. Man unterscheidet die akute von der chronischen GvHD. Die akute GvHD

zeigt sich definitionsgemäß vor dem Tag+100, die chronische GvHD beginnt nach Tag+100.

Für die Unterscheidung ist jedoch der klinische Zustand aussagekräftiger als der genaue

Zeitpunkt des Auftretens typischer Symptome.

42

Einteilung der akuten GvHD

Folgende Tabellen zeigen eine Übersicht über die Einteilung der akuten GvHD.

Tab. 1 Ausmaß der Organbeteiligung bei akuter GvHD

GRAD HAUT LEBER GIT

I makulopapulöses Erythem

< 25% der Körperoberfläche Bilirubin 2-3 mg/dl

Diarrhoe 0,5 - 1 l/d,

persistierende Nausea

II makulopapulöses Exanthem

25-50% der Körperoberfläche Bilirubin 3-6 mg/dl Diarrhoe 1 - 1,5 l/d

III makulopapulöses Exanthem

> 50% der Körperoberfläche Bilirubin 6-15 mg/dl Diarrhoe 1,5 - 2 l/d

IV

generalisierte Erythrodermie

mit Blasenbildung und

Desquamation

Bilirubin > 15 mg/dlDiarrhoe > 2 l/d,

Ileus

Bestimmung des Schweregrades einer akuten GvHD nach Glucksberg et al. 1974. Entscheidend sind Lokalisation, Ausmaß und Beteiligung der einzelnen Organsysteme. Abkürzungen: GIT = Gastrointestinaltrakt, Grad = klinischer Grad der Organbeteiligung

Tab. 2 Klinisches Gesamtstadium der akuten GvHD

GESAMTSTADIUM HAUT LEBER GIT

I (mild) I - II 0 0

II (moderat) I - III I I

III (schwer) II - III II - III II - III

IV (lebensbedrohlich) II - IV II - IV II - IV

Bestimmung des klinischen Gesamtstadiums einer akuten GvHD unter Berücksichtigung der Schwere des Befalls der einzelnen betroffenen Organe. GIT = Gastrointestinaltrakt

43

Einteilung der chronischen GvHD

Folgende Tabelle zeigt eine Übersicht über die Einteilung der chronischen GvHD.

Tab. 3 Einteilung der chronischen GvHD

GVHD-STADIUM BESCHREIBUNG DES STADIUMS

"subclinical" histologisch positiver Befund ohne klinische Symptome

"limited disease" lokale Hautbeteiligung und/oder Leberbeteiligung

"extensive disease" generalisierte Hautbeteiligung

oder

lokale Hautbeteiligung und/oder Leberbeteiligung

plus

histol. Nachweis mit Zeichen einer chronisch aggressiven Hepatitis, Bindegewebsbrücken, Nekrosen oder Zirrhosezeichen in der Leber

oder

Augenbeteiligung (Schirmertest < 5mm)

oder

histologisch gesicherte Beteiligung der kleinen Speicheldrüsen oder der Mundschleimhaut

oder

andere viszerale Beteiligungen (z.B. Lunge oder Niere)

Einteilung der chronischen GvHD nach RATANATHARATHORN et al. 2001 und SHULMAN et al. 1980. Hierbei wird die cGvHD nach dem Ausmaß der Organbeteiligung in drei Stadien eingeteilt.

Kontrollprobanden a) Zur Kontrolle der Enzymaktivität der Arginase im Verlauf standen 7 klinisch gesunde

Personen zwischen 25 und 50 Jahren zur Verfügung, denen im Abstand von ca. 4 Wochen 2

bis 6 mal Vollblut entnommen wurde.

b) Für die Gewinnung von humanem Blut für die Zellkultivierung in vitro (s. 3.3.7) standen

freiwillige klinisch gesunde männliche und weibliche Personen (Alter zwischen 20-50) zur

Verfügung.

44

3.3 Methoden

Das durch Punktion der in der Armbeuge gelegenen Venen gewonnene Blut wurde in sterile

EDTA-enthaltende Blutentnahmeröhrchen überführt.

3.3.1 Gewinnung der Leukozyten Es wurde 1ml des Vollblutes entnommen. Die Erythrozyten wurden mittels hypotoner Lyse

entfernt, indem zu dem EDTA-Blut 10ml kalter Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35)

zugegeben wurde.

Nach gutem Mischen erfolgte eine 15minütige Inkubation auf Eis. Im Anschluss wurden die

Zellen bei 260xg, 4°C für 8min zentrifugiert. Zur vollständigen Entfernung der Erythrozyten

wurde der kalte Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35) erneut für 15min zugesetzt.

3.3.2 Separation mittels Ficoll Die bis zu 8 ml Vollblut wurden mit dem Nährmedium RPMI-1640 auf ein Gesamtvolumen

von 25 ml verdünnt, über eine Schicht aus 15ml Ficoll pipettiert und 20min bei

Raumtemperatur und 700xg zentrifugiert. Auf Grund der spezifischen Dichte der

mononukleären Zellen sammeln sich diese zusammen mit den Thrombozyten, als sogenannte

Interphase, zwischen Plasma und Ficoll, während Erythrozyten und Granulozyten sich als

Pellet (Bodensatz) am Röhrchenboden absetzen.

Gewinnung der mononukleären Zellen aus der Ficoll-Separation Der Interphasering des Ficollgradienten wurde vorsichtig abgenommen, erneut mit RPMI-

1640 auf ein Gesamtvolumen von 40 ml aufgefüllt und 10 Minuten bei 4°C und 400xg

zentrifugiert. Um die kontaminierenden Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde das

Zellpellet nach Zentrifugation zur hypotonen Lyse in 20ml kalten Erythrozyten-Lyse-Puffer

(s.S. 35) resuspendiert und für 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren erfolgte

erneut ein Waschschritt in PBS (ohne Ca2+, und Mg2+). Ein Aliquot der Zellsuspension wurde

nun mit Trypanblau gemischt, auf Vitalität geprüft und gezählt. Die durchschnittliche Vitalität

lag bei 90%. Jeweils 5x106 vitale Zellen wurden in ein Röhrchen überführt, zur RNA-

Extraktion in 500µl TriFast gelöst bzw. als Zellpellet bei -80°C eingefroren.

45

Gewinnung der Granulozyten nach der Separation über Ficoll Das im Rahmen der Ficoll-Separation sich bildende Zellpellet setzt sich aus Granuloyten und

Erythrozyten zusammen. Das Zellpellet wurde mit PBS (ohne Ca2+und Mg2+) resusupendiert

und 1:1 mit 3% Dextransulfat-Lösung (s.S. 35) gemischt. Nach 20minütiger Sedimentation

der Erythrozyten bei Raumtemperatur wurde die obere Phase abgenommen, bei 4°C 8min mit

260xg zentrifugiert und anschließend der Überstand entfernt. Um die noch verbleibenden

Erythrozyten aus dem Pellet zu entfernen wurde es in 20ml kaltem Erythrozyten-Lyse-Puffer

(s.S. 35) resuspendiert und für 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Zentrifugieren (260xg,

4°C, 8min) erfolgte ein Waschschritt in PBS und dann bei Bedarf eine erneute 15minütige

Erythrozytenlyse auf Eis. Nach Vitalitätsprüfung (durchschnittliche Vitalität: 85%) und

Quantizifierung mit Trypanblau wurden jeweils 5x106 vitale Zellen in ein Röhrchen

überführt, zur RNA-Extraktion in 500µl TriFast gelöst bzw. als Zellpellet bei -80°C

eingefroren.

Gewinnung der Erythrozyten Nach der 20minütigen Sedimentationsphase mit 3% Dextran in PBS (s.S. 35) blieb am

Röhrchenboden ein Erythrozytenpellet zurück, das bei 4°C 8min mit 260xg abzentrifugiert

wurde. Nach Entfernung des Überstands wurde das Zellpellet aliquotiert und bei –80°C

weggefroren.

3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen

Mikroskopie nach Trypanblaufärbung Ein Aliquot der jeweiligen Zellsuspension wurde 1:1 mit Trypanblau-Lösung gemischt und in

einer Neubauer-Zählkammer gezählt.

Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, dessen Anion an Zellproteine bindet. Das Trypanblau

dringt durch defekte Zellmembranen toter Zellen in das Zytosol und färbt diese Zellen

tiefblau, während intakte Zellen gut an einer Doppelbrechung im Phasenkontrast zu erkennen

sind.

Mikroskopie nach May-Grünwald-Färbung Der Zellpopulation in PBS wurden 100 000 Zellen entnommen und in der Cytospin-

Zentrifuge bei 100xg 5 min auf den Objektträger zentrifugiert.

Nach Trocknung der Objektträger wurden sie mit 0,8ml einer 1% May-Grünwald-Lösung

überschichtet.

46

Nach drei Minuten wurde vorsichtig 1,6ml H2O hinzugefügt und weitere 90 sec inkubiert.

Danach wurde der Objektträger kurz mit Wasser abgewaschen und für weitere 15min mit

einer 1:10 verdünnten Giemsa-Lösung überschichtet.

Der Objektträger wurde schließlich gründlich mit Wasser gereinigt und an der Luft

getrocknet.

Am Ölimmersionsmikroskop konnten nun die Zellen hinsichtlich Reinheit, Vitalität und

Morphologie beurteilt werden.

Durchflusszytometrische Beurteilung von Zellen Die Vitalität und Reinheit der separierten Zellen wurden am Durchflusszytometer (FSC, SSC

und Propidiumiodid) kontrolliert. Der Anteil propidiumiodidnegativer und damit lebender

Zellen lag immer bei über 80%. Der Anteil von PMN an der separierten Zellpopulation betrug

immer mehr als 95%.

3.3.4 Durchflusszytometrie Mit dem Durchflusszytometer erfolgt die zuverlässige und schnelle Charakterisierung von

Zellen aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Die Zellen aus einer

Suspension werden hierbei über ein Probenführsystem vereinzelt und kreuzen dann

hintereinander einen Laserstrahl.

Die Größe der Zelle sowie die Struktur der Zellmembran und des Zellinnern beeinflusst die

Interaktion des Laserstrahles (hier Argonlaser) mit der Zelle. Als Vorwärtsstreulicht, Forward

Scatter (FSC), bezeichnet man die Beugung des Lichts bei einer in Richtung des einfallenden

Strahls, als Seitwärtsstreulicht, Side Scatter (SSC), das im rechten Winkel zum Strahlengang

gestreute Licht, wobei das Ausmaß der Streuung beim Vorwärtsstreulicht abhängig von der

Größe des Partikels, beim Seitwärtsstreulicht von seiner Komplexität

(Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) ist.

Außerdem registriert das Gerät Fluoreszenzlichtemissionen jedes Partikels in drei

unterschiedlichen Wellenlängenbereichen: die Grünlichtfluoreszenz FL-1 in einer

Wellenlänge von 515-545 nm, die Orangefluoreszenz FL-2 in einer Wellenlänge von 564-

606nm und die Rotlichtfluoreszenz FL-3 in einer Wellenlänge von > 650nm.

Jeder Partikel, der den Laserstrahl passiert, liefert somit bei einer bestimmten

Geräteeinstellung entsprechend seiner optischen Eigenschaften ein Datenmuster, das ihn als

Messereignis definiert. Über die Software (CellQuest Pro®) der zum Gerät gehörende

47

Computereinheit wird nun eine gezielte Auswertung der Messung mit Hilfe einer

Zweiparameterdarstellung ermöglicht.

Quantifizierung der Zahl an vitalen Zellen mittels Durchflusszytometrie (Referenzzellmethode) Bei der Zellkultivierung in vitro (s. 3.3.7) sterben im Laufe der Inkubation aufgrund der

Kulturbedingungen oder der stimulierenden Zytokine ein Teil der Zellen ab und somit sind in

der Zellkultur eine unbekannte Anzahl vitaler Zellen vorhanden. Um diesen Teil zu

bestimmen, werden der Zellprobe eine bestimmte Anzahl anderer Partikel (Referenzzellen)

zugesetzt, die mit den gleichen Geräteinstellungen erfasst werden können, aber sich in einem

zu messenden Parameter von den Kulturzellen unterscheiden.

Der absolute Gehalt vitaler Zellen kann nun berechnet werden, in dem man die Zahl der

gemessenen, als Referenzzellen identifizierten, mit denen als vitale Zellen identifizierten

Zellen ins Verhältnis setzt.

Als Referenzzellen zur Bestimmung der Zahl vitaler Zellen dienten bovine mononukleäre

Zellen des Blutes. Sie wurden mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-

Klasse-I-Moleküle markiert und indirekt mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-

Maus-Antikörper gefärbt, weswegen sie von den unmarkierten Zellen der Probe im

Durchflusszytometer zu unterscheiden waren.

Herstellung der Referenzzellen Zur Herstellung der Referenzzellen erfolgte zuerst die Isolierung von bovinen mononukleären

Zellen aus Vollblut. Hierzu wurde das Vollblut 1:2 mit PBS verdünnt, über eine Schicht aus

15 ml Ficoll pipettiert und 30 min bei 1380xg, 10°C zentrifugiert. Aufgrund der spezifischen

Dichte sammeln sich die mononukleären Zellen und einige Thrombozyten in einer Interphase

zwischen Plasma und Ficoll, die nun vorsichtig abgesaugt wurde. In ein mit 10ml PBS

gefülltes Röhrchen wurde nun die Interphase überführt und durch dreimaliges Zentrifugieren

(jeweils 15 min bei 430xg, 220xg, 80xg, RT) und Resuspendieren in PBS die mononukleären

Zellen von den spezifisch leichteren Thrombozyten gereinigt. Nun wurden 2x107 der frisch

separierten bovinen mononukleären Zellen des Blutes in einem 15ml Röhrchen 5min bei 80xg

und 4°C abzentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstands wurde das Zellpellet in 100µl PBS

resuspendiert und nach Zugabe von 100µl des unverdünnten mAk BoI für 15min bei 4°C

inkubiert.

48

Danach erfolgte ein Waschschritt in 5ml MIF-Puffer (s.S. 39) (80xg, 4°C, 7min). Das

Zellpellet wurde nun für 20 Minuten bei 4°C lichtgeschützt mit 100ul FITC-konjugiertem

Ziege-anti-Maus Antikörper, der 1:40 in MIF-Puffer (s.S. 39) verdünnt wurde, inkubiert.

In 5ml PBS wurden die Zellen anschließend erneut gewaschen, dann in ein 50ml-Rörchen

überführt, das auf 50ml mit PBS aufgefüllt wurde und 15min bei 80xg und 4°C

abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde nun in 30ml einer 4%-igen Paraformaldehydlösung

resuspendiert und 24h bei 4°C lichtgeschützt inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei

Raumtemperatur und einem erneuten Waschschritt in PBS, erfolgt die Aufnahme des

Zellpellets in einer PI-haltigen Trägerflüssigkeit in einer Konzentration von 4x105 /ml. Vor

dem Einsatz der Referenzzellen wurde die Konzentration kontrolliert und gegebenenfalls

korrigiert.

Vorbereitung der Proben für die Messung Die Mikrotiterplatte wurde nach Beendigung der Inkubation mikroskopisch auf Vitalität und

bakterielle Kontamination kontrolliert.

Danach wurde die Platte 15 Minuten auf Eis gestellt, um adhärente Zellen abzulösen,

nachfolgend der Inhalt jeder Vertiefung gut durchmischt und 100µl zur Messung in ein

Röhrchen zur Durchflusszytometrie überführt. Nach Zugabe von 100µl der

Referenzzellsuspension und 16µl Propidiumiodidstammlösung (s.S. 39) (Endkonzentration

2µg/ml) erfolgte die Messung am Durchflusszytometer.

Ermittlung der Zahl vitaler Zellen Es wurden je Probe 2000 Messereignisse erfasst. Da die Referenzzellen nach ihrer Fixierung

weitgehend ihre Morphologie behielten, wiesen sie im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht die

gleichen Charakteristika auf wie frisch separierte vitale humane mononukleäre Zellen. Durch

verschiedene Darstellung derselben Messung einer Mischung aus Referenzzellen und

Kulturzellen gelang es, die einzelnen Zellpopulationen durch Setzen von Fenstern (gates) zu

identifizieren und die jeweilige Zahl der Messereignisse (events, E) zu registrieren.

49

Aus folgender Formel ergibt sich die Zahl vitaler Kulturzellen, da die eingesetzte Anzahl an

Referenzzellen bekannt war:

ref

refvitvit

EAEA ×=

A vit : Anzahl vitaler Kulturzellen

Evit: Messereignis vitaler Messereignisse

Aref: Anzahl eingesetzter Referenzzellen

E ref: Messereignisse für Referenzzellen

3.3.5 Zellsortierung Die Zellsortierung der aufgereinigten Granulozyten und PBMC erfolgte mit dem Gerät

FACSVantageSE® der Firma Becton Dickinson und wurde von Herrn Manuel Scheuermann,

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, anhand der charakteristischen

Streulichteigenschaften im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht unter Zugabe von

Propidiumiodid-Stammlösung in einer Endkonzentration von 2µg/ml durchgeführt.

3.3.6 Auftrennung der PBMC Die Auftrennung der PBMC in eine CD14+ (Monozyten) und eine CD14- (v.a. Lymphozyten)

Fraktion mittels magnetischer Zellauftrennung erfolgte nach Herstellerangaben mit dem

MACS®-System.

3.3.7 Kultivierung der Granulozyten in vitro Es wurde die Enzymaktivität der Arginase frisch separierter humaner Granulozyten nach

Zugabe von verschiedenen Stimulatoren bzw. Zugabe einer Kombination von Thrombozyten

und Stimulatoren getestet. Als Stimulatoren wurden die Zytokine IL-4, IL-10, sowie eine

Kombination aus IL-4 und IL-10 eingesetzt. Weiter wurden die Granulozyten mit TNF-α und

IFN-γ sowie einer Kombination aus TNF-α und IFN-γ stimuliert. Als weitere Stimulatoren

dienten Dexamethason und Forskolin. Der Einsatz der Stimulatoren erfolgte in der unter S. 35

und S. 36 aufgeführten Konzentration.

Aktivierung mittels Zytokinen Alle Inkubationen erfolgten in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 12 Vertiefungen. Als

Nährmedium wurde Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) verwendet. Pro Vertiefung wurden

5x106 Zellen in einem Volumen von 500µl eingesetzt, zu denen 500µl Zellkultur-Vollmedium

50

(s.S. 35) mit Zytokinen zugesetzt wurden. Bei Kontrollansätzen wurden fehlende Zytokine

durch das gleiche Volumen Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) ersetzt.

Aktivierung mittels Thrombozyten und Zytokinen Die Blutbank des Universitätsklinikums Heidelberg stellte Thrombozytenhochkonzentrate

nach Ablauf des für die klinische Transfusion entscheidenden Haltbarkeitsdatums zur

Verfügung. Für die Zellkulturarbeiten wurde Präparate verwendet, die am Vortag dieses

Haltbarkeitsdatum überschritten hatten. Diese wurden 2x für 15min bei 1500xg in PBS

gewaschen. Danach wurden sie in einer Flachboden-Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen in

einem Verhältnis von 50:1 bzw. 10:1 mit frisch separierten Granulozyten gemischt

(ANDONEGUI et al. 1997), wobei pro Vertiefung 5x106 Granulozyten in 250µl Zellkultur-

Vollmedium (s.S. 35) und 50 bzw. 250 x 106 Thrombozyten in 250µl Zellkultur-Vollmedium

(s.S. 35) aufgenommen wurden. Nach Zugabe von Zytokinen in 500ul Zellkultur-Vollmedium

(s.S. 35) erfolgte die Inkubation. Bei Kontrollansätzen wurden fehlende Zytokine durch das

gleiche Volumen Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) ersetzt.

Inkubation Die Inkubation der Ansätze erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 in Luft für einen

Zeitraum zwischen 2 und 18 Stunden.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Zahl der vitalen Zellen anhand der

Referenzzellmethode bestimmt. Die Zellen eines Parallelansatzes wurden nach einem

Waschschritt als Zellpellet bei -80°C eingefroren.

3.3.8 Proteinmessung Die Lyse der Zellpellets (5x106), die bei Proben von Patienten und Kontrollpersonen sowie

bei Zellkultivierung in vitro gewonnen wurden, erfolgte in 100µl Zell-Lyse-Puffer (s.S. 36)

während eines 20minütigen Schüttelvorgangs bei 4°C. Bei 17900 g, und 4°C wurden die

Röhrchen 10min zentrifugiert und danach der Überstand (Zell-Lysat) in ein neues

Reaktionsgefäß überführt.

Die Messung der Proteinkonzentration wurde mit dem BioRad DC Assay durchgeführt. Bei

dieser Messung erfolgt zuerst eine Reaktion zwischen Protein und Kupfer in einem

alkalischen Medium und nachfolgend die Reduktion des Folinreagenz durch das

kupferbehandelte Protein. Die Messung erfolgte laut Herstellerangaben.

51

Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte für die nachfolgende

Enzymaktivitätsmessung der Arginase die Einstellung der Proteinkonzentration (3,3

µg/100µl) in Zell-Lyse-Puffer (s.S. 36).

3.3.9 Enzymaktivitätsmessung: Bestimmung der Arginase

Nach der Proteinmessung (s. 3.3.8) wurden 100µl des Ansatzes (3,3µg Protein in Zell-Lyse-

Puffer (s.S. 36)) in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt, in das 20µl MnCl2 –Lösung (s.S. 37)

zupipettiert wurde. Durch Erhitzen auf 56°C für 8 min wurde das Enzym Arginase aktiviert.

Zu diesem Lysat wurde 100µl L-Arginin-Lösung (s.S. 37) zugegeben. Bei 37°C erfolgte nun

die Arginin-Hydrolyse, die nach 30-120min durch Zugabe von 800µl Säuregemisch (s.S. 37)

abgestoppt wurde. Ebenso angesetzt wurden Harnstoff-Standards (0-10mmol/l) (s.S. 37), von

denen je 100µl mit 900µl Säuregemisch (s.S. 37) versetzt wurden.

Zu Proben und Standards wurden je 40µl α-Isonitrosopropiophenon-Lösung (s.S. 37)

zugegeben; danach erst 30 min bei 95°C und danach weitere 30 min bei 4°C abgedunkelt

inkubiert. Je nach Harnstoffkonzentration bildet sich hierbei eine rot-violette Farbreaktion

unterschiedlicher Intensität. Aus dem Reaktionsgefäß wurden 200µl in eine Flachboden-

Mikrotiterplatte überführt. Die Absorption bei 540nm (Referenzwellenlänge 750nm) wurde in

einem ELISA Reader gemessen. Eine Einheit an Arginase-Enzymaktivität ist definiert durch

die Bildung von 1µmol Harnstoff/min.

3.3.10 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) und Immunoblot

Probenaufarbeitung Die aufgearbeiteten Zell-Lysate der Patienten bzw. Kontrollprobanden sowie der

Zellkultivierung in vitro (s. 3.3.7) wurden nach Bestimmung der Proteinkonzentration im

Verhältnis 2:1 mit 3fach SDS-PAGE-Puffer (s.S. 37) versetzt, gerüttelt und 5 min bei 95°C

erhitzt.

SDS-PAGE In Polyacrylamidgelen können Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Unter dem

Einfluss von Ammoniumpersulfat und TEMED polymerisieren Acrylamid und Bisacrylamid

zu einem Netzwerk, in dem kleinere Proteine beweglicher sind als große. Abhängig von der

Größe der aufzutrennenden Proteine wählt man verschiedene Konzentrationen der

52

einzusetzenden Reagenzien und damit der resultierenden Retentionseigenschaften der

polymerisierten Gele. Durch Zugabe von Natrium-Dodecylsulfat (SDS), einem anionischen

Detergens, wird der größte Anteil der nicht kovalenten Bindungen aufgebrochen und so die

Proteine denaturiert. SDS bindet an Proteine und bewirkt eine negative Ladung der Proteine,

die proportional zu ihrer Masse ist.

Das Gel wurde zwischen zwei vertikalen Glasplatten gegossen. Zuerst wurde das 12% SDS-

PAGE-Trenngel (s.S. 38) gegossen und vorsichtig mit Isobutanol überschichtet, um eine

glatte Gelgrenze zu erhalten. Nach Polymerisation wurde das Isobutanol abgekippt, der

Plattenzwischenraum oberhalb des Trenngels mit Aqua dest. gespült und das Trenngel mit

einem Sammelgel (s.S. 38) überschichtet, das mit Hilfe eines Kammes nach Polymerisation

Aussparungen für die Proteinproben enthält.

Nach Auftragen der Proben (20µg Protein pro Tasche) erfolgte die Elektrophorese des Gels

bei einer konstanten Stromstärke von 60mA für 4-6h, bis die Bromphenolbande das Ende des

Trenngels erreicht hatte.

Immunoblot Nach Auftrennung der Proben durch SDS-PAGE (s.S. 51) wurden die Proteine mittels

Elektrotransfer in einem Tank-Elektroblotgerät auf eine Hybond P Membran übertragen.

Dazu wurde das Gel in SDS-PAGE-Blotting Puffer (s.S. 39) äquilibriert und auf zwei mit

Puffer getränkte Whatman-Filter gelegt. Die Hybond-P-Membran wurde in Methanol getränkt

und nach Äquilibrierung im Transfer-Puffer auf das Gel gelegt, auf das wiederum zwei mit

Puffer getränkte Whatman-Filter gelegt wurden. Der Elektrotransfer wurde bei 10 Volt über

Nacht durchgeführt.

Nach mehreren Waschschritten mit TBST (+0,05% Tween-20) (s.S. 38) wurden die freien

unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran 2h bei Raumtemperatur in Blocking-Puffer

(s.S. 39) blockiert. Nach den nächsten Waschschritten wurde der Primärantikörper (anti-

Arginase-Antiserum 1:5000 verdünnt, anti-ERK1/2 (MAP-Kinase) 1:3000 verdünnt, s.S. 34)

zugegeben und 1h inkubiert. Nach erneuten Waschschritten wurde zu der Membran ein

Peroxidase-markierter Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-IgG 1:3000, s.S. 34)

zugegeben. Nach 1 h Inkubation wurde wiederum mehrmals gewaschen und die Membran zur

Detektion der gebundenen Antikörper mit 1ml ECL (ReagentA:ReagentB 1:1) überschichtet.

Die sich entwickelnde Lumineszenz-Reaktion wurde auf Filmen dargestellt.

53

3.3.11 RNA-Extraktion Die eingefrorenen Zell-Lysate in Trifast wurden vorsichtig aufgetaut und 200µl Chloroform

pro 1 ml Trifast zugegeben. Unter kräftigem Schütteln vermischten sich die beiden Lösungen,

worauf sich eine Ruhephase für 5-10min bei Raumtemperatur anschloss. Nach einer

Zentrifugation mit 12900xg für 5min bei Raumtemperatur wurde die RNA-haltige obere

Phase in ein neues 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 500µl Isopropanol

zur RNA-Präzipitation zugegeben und alles gut vermischt. Nach einer 15 minütigen

Inkubation bei Raumtemperatur und einer erneuten Zentrifugation (12900xg, 10min) wurde

der Überstand vorsichtig entfernt und verworfen. Das Pellet wurde mit 1ml 75% Ethanol

gewaschen und dann erneut für 10min bei 12900xg und 4°C zentrifugiert. Der Überstand

wurde wieder entfernt und das RNA-Pellet an der Luft getrocknet. Nach Lösung des Pellets in

20µl Aqua dest. wurde mit Hilfe des RNA-Meßgerätes Gene Quant II die gewonnene RNA-

Menge gemessen. Hierzu wurden 1µl der Lösung entnommen und mit Aqua dest. im

Verhältnis 1:50 verdünnt. Nach Kalkulation der RNA-Menge wurde die wässrige RNA-

Suspension bis zum späteren Gebrauch erneut bei -80°C eingefroren. Alle Reagenzien zur

RNA-Extraktion waren frei von RNAse.

3.3.12 Quantifizierung der RNA Die folgenden Arbeitsschritte wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Dr. Giese /

Institut für Immunologie der Universität Heidelberg im Rahmen einer Kooperation

durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurde aus der zellulären RNA (s. 3.3.11) die mRNA

mittels MagNAPure LC Technik (Roche, Mannheim) extrahiert und ein DNAse-Verdau

durchgeführt. Nach cDNA-Synthese wurden die mRNA für Arginase I und verschiedene

weitere Genprodukte mittels Light Cycler Technologie quantifiziert.

3.3.13 Statistisches Verfahren Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung des Statistikprogramms Instat 3.05

(Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

Um bei der Zellkultivierung in vitro den Unterschied zwischen unstimulierter und stimulierter

Probe abschätzen zu können, wurde der gepaarte Student’s t-test mit einem Signifikanzniveau

von 0,05 angewandt.

Um festzustellen, in wie weit ein Merkmal vom anderen abhängig ist, erfolgte die

Berechnung des Korrelationskoeffizienten mittels linearer Regression.

54

Bei p>0,05 handelt es sich um eine nicht signifikante Veränderung bzw. bei p<0,05 um eine

signifikante Veränderung, wobei bei p<0,01 von einer sehr signifikanten und bei p<0,001 von

einer hochsignifikanten Veränderung gesprochen werden kann.

Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der

Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die

Messwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen

voneinander abweichen. Für die Arginase-Aktivitätsmessung ergab sich für die Einzelansätze

von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein Variationskoeffizient zwischen 4% bis 10%.

Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters desselben

Probanden in verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der

Ergebnisse von Test zu Test. Zur Ermittlung dieser Varianz wurde bei 3 klinisch gesunden

Probanden die Enzymaktivität der Arginase in drei bis fünf unterschiedlichen Messungen

bestimmt, wobei der Variationskoeffizient zwischen 6% und 30% lag. Um die

Vergleichbarkeit aller Probenentnahmen im Verlauf eines Patienten zu gewährleisten, erfolgte

daher die Arginasebestimmung immer während eines Versuchsdurchlaufs.

55

4 Ergebnisse 4.1 Methodische Vorarbeiten

Während die physikochemischen Eigenschaften der humanen Leber-Arginase (Arginase I)

bzw. Nieren-Arginase (Arginase II) bekannt sind (JENKINSON et al. 1996), lagen bislang

zur neu beschriebenen Arginase der humanen Granulozyten (MUNDER et al. Manuskript

eingereicht) noch keine Untersuchungen zu wesentlichen biochemischen Eigenschaften vor.

Die Arginase-Formen des Tierreichs zeichnen sich charakteristischerweise durch ein

Katalyse-Optimum im alkalischen Milieu und die Notwendigkeit für zweiwertige Kationen

im aktiven Zentrum des Enzyms aus (JENKINSON et al. 1996). Im folgenden wurde die

humane Granulozyten-Arginase diesbezüglich weiter charakterisiert.

4.1.1 Bestimmung des pH-Optimums der humanen Granulozyten-Arginase Zur Bestimmung des pH-Optimums der Arginase in humanen Granulozyten erfolgte die

Herstellung von Zell-Lyse-Puffern (s.S. 36) und Arginin-Lösungen (s.S. 37), die auf

verschiedene pH-Werte eingestellt wurden (pH 6 bis pH 10, Differenz jeweils 0,5). Jeweils

5x106 frisch isolierte humane Granulozyten eines Spenders wurden in Zell-Lyse-Puffer eines

bestimmten pH-Werts lysiert. Nach Proteinmessung (s. 3.3.8) erfolgte die Einstellung der

Proteinkonzentration (s. 3.3.8) in Zell-Lyse-Puffer mit dem jeweiligen pH-Wert. Nach

Aktivierung der Arginase (Erhitzen auf 56°C für 8 Minuten nach Zugabe von MnCl2) erfolgte

die Zugabe von Arginin-Lösung, die jeweils auf den pH-Wert des Zell-Lyse-Puffers

eingestellt war. Der weitere Ablauf der Arginase-Bestimmung erfolgte wie in 3.3.8

beschrieben.

In zwei unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass das pH-Optimum der

Arginase in humanen Granulozyten im basischen Bereich zwischen pH 9-10 liegt (Abb. 3).

56

0

200

400

600

800

1000

1200

6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

pH-Wert

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 3 Bestimmung des pH-Optimums der Enzymaktivität humaner Granulozyten- Arginase

Die enzymatische Aktivität humaner Granulozyten-Arginase wurde in Granulozyten-Lysaten in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmt. Hierzu wurden Granulozyten-Lysate auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt und die Arginin-Hydrolyse im enzymatischen Assay gemessen. Dargestellt sind die Titrationskurven von 2 unabhängigen Experimenten. Es wurde gezeigt, dass humane Granulozyten-Arginase ein pH-Optimum im basischen Bereich besitzt.

4.1.2 Bestimmung der Enzymaktivität nach Präaktivierung mit zweiwertigen Ionen

Im aktiven Zentrum der Leber-Arginase der Ratte befinden sich zwei Mn2+-Ionen, die für die

Stabilität und Aktivität des Enzyms notwendig sind (KANYO et al. 1996). Es wurde gezeigt,

dass diese Metallionen durch andere zweiwertige Kationen austauschbar sind, was jeweils zu

unterschiedlich starker Reduktion der enzymatischen Aktivität führte (TORMANEN 2001).

Es wurde daher in einer weiteren Versuchsreihe an Granulozyten-Lysaten eines Spenders die

enzymatische Aktivität der Arginase in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen

diverser zweiwertiger Kationen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass nach Präaktivierung

mit MnCl2 die Enzymaktivität am höchsten ist. Bei Anwesenheit von FeCl2 und CaCl2 konnte

keine Enzymaktivität gemessen werden (Abb. 4).

57

0

300

600

900

1200

100 20 4 0,8 0,16 0,032

mmol / l

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

MnClMgClNi(NO ) FeClCoClCaCl

Abb. 4 Einfluss verschiedener Kationen auf die enzymatische Aktivität der humanen Granulozyten-Arginase

Gemessen wurde die Arginase-Aktivität in Granulozyten-Lysaten in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen diverser Kationen. Es wurde gezeigt, dass nach Präaktivierung des Enzyms mit MnCl2 die Enzymaktivität am höchsten ist. Bei Anwesenheit von FeCl2 und CaCl2 konnte keine Enzymaktivität gemessen werden.

Die optimale Konzentration von MnCl2 lag bei 10mmol/l. Es konnte zwar bei einer höheren

Konzentration eine weitere leichte Zunahme der Enzymaktivität verzeichnet werden, doch fiel

dabei das MnCl2 als dunkler Niederschlag aus der Lösung aus.

4.2 Arginase in humanen myeloischen Zellen

4.2.1 Arginase in humanen mononukleären Zellen und Granulozyten Im murinen System wurde gezeigt, dass Makrophagen und dendritische Zellen nach

Stimulation durch bakterielle Produkte (CORRALIZA et al. 1995) bzw. Zytokine

(MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al. 1998) hohe Arginaseaktivitäten aufweisen. In

Vorversuchen des Labors zeigte es sich, dass humane Monozyten bzw. in vitro generierte

humane Makrophagen und dendritische Zellen weder in Ruhe noch nach Inkubation mit

diversen pro- und antiinflammatorischen Stimuli Arginase-Aktivität exprimieren. Im

Gegensatz dazu zeigten Analysen der Leukozytenfraktion des peripheren Blutes eine relativ

hohe Arginase-Aktivität. Ferner war an einzelnen Blutspendern demonstriert worden, dass die

3

2

2

2

2

2

2

58

Arginase-Aktivität in der granulozytären Fraktion lokalisiert ist (MUNDER et al. Manuskript

eingereicht). Diese Vorbefunde sollten zunächst an einem größeren Spenderkollektiv

überprüft werden. Hierzu wurden Leukozyten mittels hypotoner Erythrozytenlyse aus

Vollblut klinisch gesunder Spender isoliert. In allen Leukozytenfraktionen zeigte sich eine

relativ hohe Arginase-Enzymaktivität (Mittelwert: 824 ± 196 mU/mg Protein, Bereich: 651-

1200 mU/mg Protein; n=5 Normalspender, s. Abb. 5).

Es sollte ferner überprüft werden, welche leukozytäre Fraktion das Enzym Arginase

exprimiert. Hierzu erfolgte die Auftrennung der Leukozyten im selben Experiment in

Granulozyten und periphere mononukleäre Zellen mittels Ficoll-Gradienten und Dextran-

Sedimentation (PBMC, vorwiegend Lymphozyten und Monozyten).

In den PBMC zeigte sich jeweils keine Arginaseaktivität, während in der granulozytären

Fraktion jeweils eine hohe Arginase-Enzymaktivität messbar war (Mittelwert: 1837 ± 334

mU/mg Protein, Bereich: 1428 bis 2444 mU/mg Protein, s. Abb. 5). Aufgrund der auf mg

Protein bezogenen Enzymaktivität zeigt sich deutlich die Anreicherung der Enzymaktivität in

der Granulozyten-Fraktion im Vergleich zu unseparierten Leukozyten.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Leukozyten PBMC PMN

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 5 Die Arginase-Aktivität humaner Leukozyten findet sich ausschließlich in der granulozytären Fraktion.

Fünf individuelle Leukozytenisolate humaner Spender wurden weiter in PBMC und Granulozyten aufgetrennt. In den einzelnen Fraktionen wurde jeweils die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Nur die granulozytäre Fraktion zeigte jeweils Arginaseaktivität.

59

In einem größeren Kollektiv von 31 klinisch gesunden Normalspendern im Alter zwischen 18

und 65 Jahren waren Arginase-Enzymaktivitäten in allen Granulozyten-Fraktionen messbar

(Abb. 6, Mittelwert: 1644 ± 423 mU/mg Protein, Bereich: 667-2189 mU/mg Protein). Parallel

hierzu wurden von 25 dieser Spender auch PBMC-Fraktionen aufgereinigt. Hierbei zeigten

19/25 PBMC-Fraktionen keine Arginase-Enzymaktivität, während bei 6 Proben eine sehr

geringe Aktivität gemessen wurde (Abb. 6, Mittelwert: 26±52mU/mg Protein, Bereich: 0-156

mU/mg Protein).

Abb. 6 Vergleich der Enzymaktivität humaner Granulozyten (PMN) und PBMC

Bei der Untersuchung eines Kollektivs 31 klinisch gesunder Normalspender war in allen Granulozytenfraktionen Arginase-Aktivität messbar. Parallel hierzu wurde von 25 Probanden die Arginase-Aktivität der PBMC-Fraktion bestimmt. 19/25 PBMC-Fraktionen zeigten keine Enzymaktivität, während bei 6 Proben eine sehr geringe Aktivität zu messen war.

4.2.2 Arginase in hochreinen Granulozyten- und PBMC-Fraktionen In den bisher dargestellten Experimenten erreichte die konventionelle Auftrennung von

Leukozyten in Granulozyten und PBMC jeweils eine Reinheit der einzelnen Fraktionen von >

95%. Es war also nicht definitiv auszuschließen, dass innerhalb der Granulozyten-Fraktion

eine andere kontaminierende Zellpopulation Träger der Arginaseaktivität war. Als

Goldstandard der Zellfraktionierung gilt die durchflusszytometrische Zelltrennung. Es

erfolgten daher noch Untersuchungen an hochreinen Granulozyten und PBMC-Fraktionen,

welche mittels FACS anhand der charakteristischen Streulichteigenschaften im Vorwärts- und

Seitwärtsstreulicht gewonnen wurden. Außerdem wurde die PBMC-Fraktion durch diese

Zellfraktionierung von kontaminierenden Granulozyten befreit. In einem weiteren Schritt

erfolgte die Auftrennung der PBMC in eine CD14+ (Monozyten) und eine CD14- (v.a.

Lymphozyten) Fraktion mittels magnetischer Zellauftrennung (MACS). Die Reinheit der

60

einzelnen Fraktionen lag jeweils bei > 99,5% für die Granulozyten (Abb. 7) und PBMC und

> 90% für die weitere Auftrennung in CD14+ und CD14- PBMC.

Abb. 7 Durchflusszytometrische Analyse humaner Granulozyten-Fraktionen vor und nach weiterer Aufreinigung mittels FACS

Die linke Abbildung zeigt dotplots (FSC/SSC) isolierter propidiumiodidnegativer, vitaler Granulozyten vor dem FACS-Sortieren. Die rechte Abbildung zeigt hochreine Granulozyten nach FACS-Sortierung. Der Pfeil in der linken Abbildung zeigt die vor der FACS-Sortierung noch vorhandenen kontaminierenden PBMC in der Granulozytenfraktion.

In drei unabhängigen Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass nur die hochreine

Granulozyten-Fraktion Arginase exprimiert. Weder in der CD14+ noch in der CD14- -

Fraktion der PBMC konnte Arginase-Aktivität nachgewiesen werden (Abb. 8).

Die Expression der Arginase wurde in den mittels FACS-Sortierung gewonnenen hochreinen

Populationen auf Proteinebene im Immunoblot und funktionell im enzymatischen Assay

analysiert.

61

A

B

0

500

1000

1500

2000

PBMC PMN PBMCCD14-

PBMCCD14+

PMN

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 8 Arginase I Protein (A) und enzymatische Aktivität (B) finden sich ausschließlich in der granulozytären Fraktion: Analyse hochreiner, FACS-sortierter Zellpopulationen

A: Arginase I Immunoblot mit Lysaten konventionell aufgereinigter mononukleärer Zellen (PBMC) und Granulozyten (PMN) sowie hochreiner PBMC- und Granulozyten-Fraktionen nach FACS-Sortierung. Die PBMC-Fraktion wurde zudem in eine CD14+ (Monozyten) und eine CD14- (v.a. Lymphozyten) Fraktion mittels magnetischer Zellauftrennung (MACS) subfraktioniert. Ausschließlich in der granulozytären Fraktion (konventionell aufgereinigt bzw. zusätzlich FACS-sortiert) wurde Arginase-I-Protein nachgewiesen. Weder in unsortierten PBMC noch in einer der sortierten und damit angereicherten PBMC-Subpopulationen zeigte sich Expression des Arginase-I-Proteins. Die gleiche Proteinbeladung wurde mittels Immunoblot für MAP-Kinase (Extracellular-regulated kinase (ERK1/2)) überprüft.

B: Bestimmung der Enzymaktivität der Arginase in den im Immunoblot (A) untersuchten Zell-Lysaten Es zeigte sich nur in der granulozytären Fraktion Enzymaktivität. Weder in der unsortierten noch in der sortierten PBMC-Fraktion konnte Arginase-Aktivität nachgewiesen werden.

FACS sortiertunsortiert

62

Wie in Abb. 8 dargestellt, bestätigen sich die an konventionell aufgereinigten

Zellpopulationen gewonnenen Ergebnisse in den hochreinen Populationen nach

durchflusszytometrischer Zellsortierung. Wiederum findet sich Arginase I-Protein

ausschließlich in der granulozytären Fraktion. Weder in unsortierten PBMC noch in einer der

sortierten und damit angereicherten PBMC-Subpopulationen konnte Arginase-Aktivität

nachgewiesen werden. Wie ebenfalls Abb. 8 zu entnehmen ist, zeigte sich parallel zur

Proteinexpression auch Arginase-Aktivität lediglich in den Granulozyten-Fraktionen.

4.2.3 Arginase in humanen Erythrozyten In verschiedenen Veröffentlichungen wurde über eine Arginase-Expression humaner

Erythrozyten berichtet (SPECTOR et al. 1985, KIM et al. 2002). Die Bestimmung der

Arginase-Aktivität in diesen Zellen dient z.B. als diagnostisch wegweisend bei der seltenen

vererbten Harnstoffzyklus-Stoffwechselkrankheit der Hyperargininämie (Arginase I –

Defizienz). Es wurde daher die Arginase-Aktivität der neu beschriebenen humanen

Granulozyten-Arginase mit jener der Erythrozyten verglichen. Hierzu wurden

Erythrozytenpellets (s.S. 45) mit Zell-Lyse-Puffer (s.S. 36) lysiert und nach Bestimmung der

Proteinkonzentration die Enzymaktivität gemessen.

Die Arginaseaktivität der Erythrozyten, bezogen auf mg Protein des Zell-Lysats, war um den

Faktor 50 bis 100 mal geringer als die Aktivität in humanen Granulozytenlysaten (Mittelwert:

26 ± 2mU/mg Protein, Bereich: 24-30mU/mg Protein, s. Abb. 9).

63

1

10

100

1000

10000

Erythrozyten Granulozyten

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 9 Vergleich der Arginase Enzymaktivität in Erythrozyten und Granulozyten (in logarithmischer Skala)

Es wurde die Arginase-Enzymaktivität der Erythrozyten und Granulozyten bei 5 klinisch gesunden Probanden gemessen. Diese Abbildung zeigt Mittelwert und Standardabweichung der Arginase-Enzymaktivität von Erythrozyten und Granulozyten. Die Arginase-Enzymaktivität der Erythrozyten (pro mg Protein des Lysats) war um den Faktor 50 bis 100 geringer als die der Granulozyten.

4.2.4 Arginase in Granuloyzyten von Patienten mit Arginase-Defizienz Nachdem an Normalspendern gezeigt werden konnte, dass in humanen Leukozyten das

hepatische Isoenzym der Arginase (Arginase I) selektiv in Granulozyten exprimiert wird,

sollten diese Untersuchungen abschließend noch an Granulozyten von Patienten mit Arginase

I-Mangel überprüft werden. Bei dieser Krankheit handelt es sich um eine sehr seltene,

autosomal-rezessiv erbliche Störung des Harnstoffzyklus mit einer Inzidenz von 1:350.000.

Die Erkrankung wird dominiert durch Hyperargininämie und Hyperammonämie bei defektem

Harnstoffzyklus und konsekutiver neurologischer Beeinträchtigung (v.a. Spastizität) sowie

progressiver Demenz. Der Schweregrad der Symptome ist abhängig von dem Ausmaß der

Enzymdefizienz und von dem Zeitpunkt der Diagnosestellung mit Beginn einer diätetischen

Behandlung.

Es wurden aus dem Vollblut von 2 Patienten (Patient 1: männlich, 18 Jahre; Patient 2:

weiblich, 5 Jahre) mit Arginase-I-Defizienz Granulozyten isoliert und die Arginase-

Expression sowie Enzymaktivität analysiert.

Die Granulozyten beider Patienten zeigten keine Enzymaktivität im Granulozyten-Zell-Lysat

und keine Proteinexpression der Arginase I im Immunoblot des Lysats (Abb. 10).

64

A

B

0

500

1000

1500

2000

Kontrolle Patient 1Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

500

1000

1500

2000

Kontrolle Patient 2Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 10 Expression der Arginase I in humanen Granulozyten: Vergleich Normalperson und Arginase I-defizienter Patient

Es wurden Granulozyten zweier Patienten mit Arginase-I-Defizienz und je einer Kontrollperson untersucht. Es zeigte sich keine Arginase I-Proteinexpression (A) und keine Arginaseaktivität (B) in den Granulozyten der Patienten. Als Vergleich dargestellt sind die Arginaseaktivität und Proteinexpression je einer Kontrollperson. Die gleiche Proteinbeladung wurde mittels Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) überprüft.

65

4.3 Regulation der Arginase in vitro

Im Gegensatz zu murinen Makrophagen und dendritischen Zellen, die in Ruhe keine Arginase

exprimieren, zeigen die humanen Granulozyten bereits in Ruhe eine hohe Arginase-Aktivität.

Murine myeloische Zellen wiederum zeigen eine Arginase-Induktion nach TH2 Zytokin-

Stimulation (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et. al. 1995, MUNDER et al. 1998,

MUNDER et al. 1999, LOUIS et al. 1999, CHANG et al. 2000, HESSE et al. 2001). Es sollte

daher nun untersucht werden, ob sich die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch

Zytokine, Chemokine, immunmodulierende Substanzen oder Zell-Zell-Interaktionen mit

Thrombozyten beeinflussen lässt. Dazu wurden 5x106 Granulozyten mit und ohne die

angegebenen Stimuli bzw. Thrombozyten für 2 bzw. 14-18 Stunden inkubiert.

Initial erfolgte die Austitrierung der Stimuli IL-8 (500-50-5ng/ml), Dexamethason (50-5-

0,5µmol/l und Forskolin (500-50-5µmol/l) (Daten nicht gezeigt) in 2-4 unabhängigen

Experimenten, wobei keine konzentrationsabhängige Zu- oder Abnahme der Arginaseaktivität

feststellbar war. In allen weiteren Experimenten wurde dann eine auch in der Literatur

(HAGGERTY et al. 1982, MUNDER et al. 1999, HAMMERMANN et al. 2000, KLASEN et

al. 2001) angegebene optimale Konzentration der einzelnen Stmuli für andere in myeloischen

Zellen induzierte Funktionen eingesetzt.

Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgt die Messung der Vitalität der Granulozyten mit Hilfe

der Referenzzell-Methode (s.S. 48). Hierdurch wurde vorab sicher gestellt, dass die

Ergebnisse nicht durch ein unterschiedliches Ausmaß an Apoptose der analysierten

Granulozytenpopulationen verfälscht wurden. Danach wurde die Enzymaktivität der Arginase

in den Granulozyten-Lysaten gemessen (s. 4.3.1-4.3.5). Die statistische Auswertung des

Vergleichs zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten erfolgte mittels gepaartem

Student’s t-test mit einem Signifikanzniveau von 0,05.

66

Tab. 4 Vergleich der Vitalität der Granulozyten in Abhängigkeit von Zeit und

Stimulationsbedingung.

STIMULATIONSBEDINGUNG ZAHL VITALER ZELLEN NACH2 STUNDEN (%)

ZAHL VITALER ZELLEN NACH14-18 STUNDEN (%)

O 100 100

IL-4 108 (p=0,42) 102 (p=0,40)

IL-10 107 (p=0,025) 103 (p=0,34)

IL-4 + IL-10 101 (p=0,76) 106 (p=0,11)

TNF-α 95 (p=0,30) 66 (p=0,13)

IFN-γ 100 (p=0,61) 95 (p=0,28)

TNF-α + IFN-γ 89 (p=0,36) 64 (p= 0,15)

IL-8 105 (p=0,79) 102 (p=0,54)

Forskolin 101 (p=0,57) 88 (p=0,06)

Dexamethason 96 (p=0,40) 91 (p=0,21)

Es wurden jeweils 5x106 Granulozyten mit den angegebenen Substanzen stimuliert und für 2 bzw. 14-18 Stunden inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Zahl vitaler Zellen mit Hilfe der Referenzzellmethode (s.S. 48) bestimmt. Die Zahl vitaler Zellen in den unstimulierten Ansätzen wurde als 100% gesetzt und die Zahl vitaler Zellen in den Stimulationsansätzen darauf bezogen.

Es zeigte sich, dass die Vitalität der unstimulierten Zellen nicht verschieden war von der

Vitalität der Zellen nach Stimulation. Eine Ausnahme bildete hierbei die Stimulation mit

TNF-α bzw. mit der Kombination aus TNF-α und IFN-γ, wo sich besonders nach 14-18-

stündiger Inkubation eine deutliche Abnahme der Vitalität zeigte.

Im folgenden sind die Ergebnisse der Arginase-Enzymaktivitätsmessungen bei unterschied-

licher Stimulation der Granulozyten dargestellt. Angegeben ist jeweils die Zahl n der

unabhängig voneinander durchgeführten Experimente an Granulozyten jeweils verschiedener

Blutspender sowie das Signifikanzniveau p beim Vergleich der Granulozyten ohne und mit

Stimulation. Des weiteren wurde der Mittelwert und die Standardabweichung der

Enzymaktivität innerhalb einer Stimulationsbedingung bei Experimenten verschiedener

Spender aufgeführt. Eine zusammenfassende graphische Darstellung ist in Abb. 12

dargestellt.

67

4.3.1 Stimulation der Granulozyten mit den TH2-Zytokinen IL-4 und IL-10 Die typischen TH2-Zytokine IL-4 und IL-10 bewirken im murinen System eine Expression

der Arginase in Makrophagen, dendritischen Zellen (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL

et al. 1995, MUNDER et al. 1999) und Granulozyten (MUNDER et al. Manuskript

eingereicht). Durch synergistische Kooperation zwischen den einzelnen TH2-Zytokinen kann

die Expression noch erhöht werden (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999).

IL-4

Bei Stimulation der Granulozyten mit IL-4 konnte weder bei 2h (n=7; p=0,7901; MW: 2288 ±

954), noch bei 14-18h (n=7; p=0,3921; MW: 1766 ± 534) eine signifikante Veränderung der

Enzymexpression verzeichnet werden.

IL-10

Auch bei Inkubation der Granulozyten mit IL-10 konnte keine signifikante Veränderung der

Enzymexpression verzeichnet werden (2h: n=6; p=0,3274; MW: 2196 ± 994 / 14-18h: n=6;

p=0,0757; MW: 1948 ± 799).

IL-4 und IL-10

Durch Kombination beider Interleukine konnte keine Stimulation oder Suppression der

Arginase-Aktivität induziert werden (2h: n=6; p= 0,8991; MW: 2297 ± 1067 / 14-18h: n=6;

p=0,2784; MW: 1788 ±661).

Neben der Enzymaktivität wurde bei einzelnen Experimenten auch die Proteinexpression der

Arginase I nach TH2-Zytokinstimulation der Granulozyten mittels Immunoblot analysiert

(Abb. 11). Im Gegensatz zum murinen System konnten humane Granulozyten durch typische

TH2-Zytokine nicht zur Expression der Arginase stimuliert werden.

68

A

B

0

500

1000

1500

2000

unstimuliert IL-4 IL-4+IL-10

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 11 Keine Induktion von Arginase I Protein (A) bzw. Arginase-Aktivität (B) in humanen Granulozyten durch TH2-Zytokin-Stimulation.

Es wurden 5x106 PMN für 14 Stunden mit IL-4 bzw. IL-4 und IL-10 (jeweils 10 ng/ml) stimuliert. Es zeigte sich weder eine vermehrte Arginase I-Proteinexpression im Immunoblot (A) noch eine erhöhte enzymatische Aktivität im Granulozytenlysat (B). Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung.

69

4.3.2 Stimulation der Granulozyten mit den TH1-Zytokinen TNF-α und IFN-γ

Die typischen TH1-Zytokine TNF-α und IFN-γ führen im murinen System zu einer

Suppression der Arginase I Expression sowie zu einer vermehrten Expression der

induzierbaren NO-Synthase. Beide Zytokine sind potente Stimulatoren humaner

Granulozytenfunktionen wie z.B. Adhärenz (SEOW et al. 1987), Phagozytose (ELLIS et al.

2004) und Degranulation (KLEBANOFF et al. 1986). Sie führen zur Stimulation der

Expression von MHCII, Chemokin-Rezeptoren und der Sekretion verschiedener

proinflammatorischer Zytokine (ELLIS et al. 2004) sowie der Produktion reaktiver

Sauerstoffverbindungen (BERTON 1992).

TNF-α

TNF-α führte zu keiner signifikanten Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner

Granulozyten (2h: n=8; p=0,7328; MW: 2632± 1115 / 14-18h: n=9; p=0,2546; MW: 2000 ±

908).

IFN-γ

Auch IFN-γ führte zu keiner signifikante Veränderung der Arginase-Aktivität (2h: n=6,

p=0,5366; MW: 2719±1048 / 14-18h: n=6; p=0,3438; MW: 2178 ± 534).

TNF-α und IFN-γ

Auch die Kombination beider Zytokine führte zu keiner signifikanten Veränderung der

Enzymaktivität der Arginase (2h: n=7; p=0,9988; MW: 2566 ± 881 / 14-18h: n=7; p=0,1598;

MW: 2144 ± 437).

4.3.3 Stimulation der Granulozyten mit dem Chemokin IL-8 Bei Interleukin-8 handelt es sich um eines der wesentlichen Chemokine zur Attraktion von

Granulozyten (BAGGIOLINI et al. 1989).

Die Stimulation der Granulozyten mit Interleukin 8 (2h: n=5; p=0,7069; MW: 2095 ± 333 /

14-18h: n=7; p=0,1630 MW: 1627 ± 706) führte zu keiner signifikanten Veränderung der

Arginase-Expression.

70

4.3.4 Stimulation der Granulozyten mit Forskolin Im murinen System wurde in verschiedenen Zelltypen eine Induktion der Arginase durch das

cAMP / Proteinkinase A-System gezeigt (CORRALIZA et al. 1997, HAMMERMANN et al.

2000). Unter der Annahme vergleichbarer grundlegender Signaltransduktionsmechanismen in

verschiedenen Spezies erfolgte daher die Stimulation mit Forskolin. Forskolin steigert über

die direkte Stimulation der Adenylylcyclase die intrazelluläre Konzentration von cAMP.

Die Stimulation der Granulozyten mit Forskolin zeigte keine signifikante Veränderung der

Enzymaktivität der Arginase verglichen mit den unstimulierten Granulozyten (2h: n=7,

p=0,4648; MW: 2651 ± 1073 / 14-18h: n=7; p=0,7529; MW: 1992 ± 748).

4.3.5 Stimulation der Granulozyten mit Dexamethason In verschiedenen Spezies und Zelltypen wurde eine Beeinflussung der Arginase-Expression

durch Steroide gezeigt. In Hepatozyten der Ratte lässt sich durch die Stimulation mit

Dexamethason die Expression der Arginase über eine Bindung des Transkriptionsfaktors

C/EBPbeta an einen Enhancer erhöhen (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997),

während sie in Alveolarmakrophagen erniedrigt wird (KLASEN et al. 2001).

Bei Stimulation der humanen Granulozyten mit Dexamethason zeigte sich keine signifikante

Veränderung der Enzymaktivität der Arginase. (2h: n=5; p=0,7069; MW: 2102 ± 330 / 14-

18h: n=7; p=0,2734; MW: 1612 ± 644).

71

4.3.6 Zusammenfassung der in vitro Experimente A

0

1000

2000

3000

4000un

stim

ulie

rt

IL4

IL10

IL4+

IL10

TNF-α

IFN

-γ

TNF-α

+IFN

-γ

IL 8

Dex

amet

haso

n

Fors

kolin

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

B

0

1000

2000

3000

4000

unst

imul

iert

IL4

IL10

IL4+

IL10

TNF-α

IFN

-γ

TNF-α

+ IF

N-γ

IL 8

Dex

amet

haso

n

Fors

kolin

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 12 Arginase-Aktivität humaner Granulozyten nach Inkubation mit verschiedenen Zytokinen, Dexamethason und Forskolin. Inkubationszeit: 2 (A) bzw. 14-18 Stunden (B)

Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason (mit einer finalen Konzentration wie in S. 35 angegeben) für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Keine der Stimulationsbedingungen führte zu einer signifikanten Veränderung (p<0,05) der Arginase-Aktivität der Granulozyten. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von n=5 (2h: IL-8, Dexamethason), n=6 (2h: IL-10, IL-4+IL-10, IFN-γ / 14-18h: IL-10, IL-4+IL-10, IFN-γ), n=7 (2h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, Forskolin / 14-18h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, IL-8, Forskolin, Dexamethason), n=8 (2h: TNF-α), n=9 (14-18h: TNF-α).

72

4.3.7 Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten In vitro wurde gezeigt, dass Thrombozyten fähig sind, verschiedene Fähigkeiten der

neutrophilen Granulozyten zu modulieren wie beispielsweise Chemotaxis (DEUEL et al.

1982), Aggregation (RHEE et al. 1986), Phagozytose (WILSON et al. 1987), die Produktion

von Superoxidanionen (MOON et. al 1990), die Freisetzung lysosomaler Enzyme mittels

Degranulation (DEL MASCHIO et al. 1989) sowie die Synthese von Arachidonsäure-

Metaboliten (z.B. Leukotriene) (MACLOUF et al. 1990). Die Interaktion findet zwischen

Adhäsionsmolekülen der Thrombozyten wie P-Selectin und GPIIb/IIIa und den

korrespondierenden Rezeptoren der Granulozyten statt (PALABRICA et al. 1992,

SPANGENBERG et al. 1993).

In Vorversuchen erfolgte eine Messung der Enzymaktivität der Arginase in Thrombozyten,

wobei in drei Experimenten mit Thrombozyten gesunder Normalspender jeweils keine

Arginase-Aktivität messbar war. Es wurde die mögliche Beeinflussung der Arginase-Aktivität

in Granulozyten durch Thrombozyten allein oder in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen

und immunmodulierenden Substanzen in Kokultivierungsassays (Verhältnis 50:1 bzw. 10:1 /

Thrombozyten:Granulozyten) überprüft. Wiederum zeigte sich keine signifikante

Beeinflussung der Arginase-Aktivität der humanen Granulozyten. Abb. 13 zeigt einen

Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten

(in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten). Die Arginaseaktivität

der unstimulierten Granulozyten wurde jeweils als 100% gesetzt.

73

A

2 Stunden

0%

25%

50%

75%

100%

125%

0 IL4 IL10

IL4+IL1

0 IL8

Forsko

lin

Dexam

ethas

onEnzy

mak

tivitä

t: Ve

rgle

ich

mit

unst

imul

iert

er K

okul

tivie

rung

1:50 Gran:Thromb1:10 Gran:Thromb

B

14 -18 Stunden

0%

25%

50%

75%

100%

125%

0 IL4 IL10

IL4+IL

10 IL8

Forsko

lin

Dexam

ethas

onEnzy

mak

tivitä

t: Ve

rgle

ich

mit

unst

imul

iert

er K

okul

tivie

rung

1:50 Gran:Thromb1:10 Gran:Thromb

Abb. 13 Beeinflussung der Arginase-Aktivität in Granulozyten durch Thrombozyten in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen und immunmodulierende Substanzen in Kokultivierungsassays; Inkubationszeit: 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B)

Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden in Gegenwart von Thrombozyten (Verhältnis 50:1 bzw. 10:1 / Thrombozyten:Granulozyten) mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Dargestellt ist der Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten. Die Arginaseaktivität der unstimulierten Granulozyten (in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten) wurde jeweils als 100% gesetzt. Dargestellt ist die Zusammenfassung von zwei unabhängigen Experimenten mit Mittelwert und Schwankung.

74

Zusammenfassend zeigte sich in den Zellkulturuntersuchungen keine signifikante Modulation

der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch verschiedene pro- und

antiinflammatorische Mediatoren des Immunsystems. Auch die zusätzliche Interaktion der

Granulozyten mit Thrombozyten führte unter den unterschiedlichen Stimulationsbedingungen

nicht zu einer Beeinflussung der Arginase in den humanen PMN.

4.4 Regulation der Arginase in vivo

Nachdem sich in den in Abschnitten 4.1-4.3 dargestellten Zellkulturuntersuchungen keine

signifikante Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten in vitro gezeigt hatte,

sollte die Frage der Regulation in vivo untersucht werden. Hierzu schien das

Patientenkollektiv der allogen blutstammzelltransplantierten Patienten aus verschiedenen

Gründen besonders geeignet. Zum einen entwickeln die Patienten nach Transplantation in

relativ hoher Frequenz inflammatorische Probleme, bei denen sowohl infektiöse (v.a. Sepsis,

Pneumonie, Weichteilinfekte) wie nicht-infektiöse (GvHD) pathogenetische

Effektormechanismen zugrunde liegen. Zum zweiten erhalten diese Patienten verschiedene

immunmodulierende Substanzen mit konsekutiver Beeinflussung auch der Granulozyten-

Aktivierung (z.B. Steroide). Zum dritten handelt es sich bei den Patienten nach allogener

Stammzelltransplantation um ein Kollektiv, welches einer engmaschigen klinischen und

laborchemischen Kontrolle unterliegt, eine Grundvoraussetzung für intraindividuelle

Untersuchungen im Langzeitverlauf. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden 51

Patienten untersucht, die aufgrund einer hämatologischen Erkrankung in der Medizinischen

Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg allogen blutstammzelltransplantiert

wurden. Im Abstand von ca. 14 Tagen wurden Blutproben asserviert und die Granulozyten

zur späteren Bestimmung von Arginase-Aktivität, mRNA und Proteinexpression isoliert. Bei

55% der Patienten konnten auch Granulozyten vor Transplantation gewonnen werden. Bei

den anderen Patienten begann der Beobachtungszeitraum 14 bis 261 Tage nach

Transplantation. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich bis ca. ein Jahr nach

Transplantation, wobei 22% der Patienten während dieser Zeitspanne verstarben.

75

4.4.1 Enzymaktivität bei Kontrollpersonen Zur Einschätzung der Schwankungsbreite der Arginase-Enzymaktivität bei gesunden

Kontrollpersonen wurde 7 klinisch gesunden Blutspendern im Alter zwischen 25 und 50

Jahren im Abstand von ca. 4 Wochen 2 bis 6 mal Vollblut entnommen und daraus die

Granulozyten isoliert.

Die Enzymaktivität innerhalb dieses Kontrollkollektivs schwankte zwischen 1037 und 1886

mU Enzymaktivität pro mg Protein (Mittelwert: 1578 mU/mg Protein, SD: 251). Der Verlauf

der Granulozyten-Arginase-Aktivität der Einzelspender ist in Abb. 14 A dargestellt, die

Mittelwerte samt Standardabweichungen der einzelnen Spender ist Abb. 14 B zu entnehmen.

Die Standardabweichung der Arginase-Aktivität der Einzelspender schwankte zwischen 9 und

215, entsprechend einer prozentualen Schwankung zwischen 0,5 und 13,2, im Mittel 8.

A

0500

10001500200025003000

0 50 100 150 200 250

Zeitachse in Tage

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

B

0

500

1000

1500

2000

1 2 3 4 5 6 7

Spender

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 14 Arginase-Enzymaktivität von Kontrollpersonen im Verlauf

Bei 7 klinisch gesunden Personen wurde im Abstand von ca. 4 Wochen zwei bis sechs Mal Blut genommen und die Arginaseaktivität der Granulozyten untersucht. A: Verlauf der KontrollpersonenB: Mittelwerte und Standardabweichungen der Arginase-Aktivität der Granulozyten von Kontrollpersonen, von welchen über einen individuell unterschiedlichen Gesamtzeitraum von 28 bis 273 Tagen Blutproben gewonnen wurden

4.4.2 Enzymaktivität bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation Bei den 51 Patienten handelte es sich um 35% weibliche und 65% männliche Personen im

Alter zwischen 21 und 65 Jahren (Durchschnittsalter 48 Jahre). Da diese Patienten nach ihrer

Stammzelltransplantation immer wieder Phasen generalisierter Inflammation wie Sepsis oder

Graft-versus-host-Reaktion durchlaufen, sollte die mögliche Funktion des Arginase-

Stoffwechselweges im Rahmen von inflammatorischen bzw. antiinflammatorischen

Zuständen des Immunsystems untersucht werden.

76

Einfluss von Graft-versus-host-Erkrankungen auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten Während sich im murinen System die pathogenetische Relevanz von TH1 und TH2 Zytokinen

in der Induktion bzw. Suppression von GvHD zweifelsfrei gezeigt hat (ALLEN et al. 1993,

RUS et al. 1995, FERRARA et al. 1996), scheint die Situation im Rahmen der humanen

GVHD komplexer zu sein. Gleichwohl spielen auch hier Zytokin-vermittelte

Entzündungsvorgänge eine wesentliche Rolle.

Die humane GvHD in ihrer unterschiedlichen Ausprägung (lokalisiert / generalisiert),

Lokalisation (v.a. Leber, Haut, Darm) und sicher auch Pathogenese (akut / chronisch) ist für

ein Studium der Regulation myeloischer Zellfunktionen im Kontext von Inflammation und

Antiinflammation daher sehr gut geeignet.

Im Rahmen des untersuchten Studienkollektivs entwickelten 76% (n=39/51) der Patienten

eine oder mehrere Episoden einer Graft-versus-host-Erkrankung, wobei 19% der Patienten

nur an einer akuten GvHD und 39% nur an einer chronischen GvHD erkrankten. 18% der

Patienten entwickelten im Verlauf sowohl eine akute als auch eine chronische GvHD-

Erkrankung. Es handelte sich hierbei um Abstoßungsreaktionen (n=73) der Haut (41%), der

Mundschleimhaut (23%), des Darms (19%), der Leber (14%) und sonstige GvHD (3%). 24%

(n=12/51) der Patienten erkrankten an keiner Graft-versus-host-Erkrankung. Innerhalb der

GvHD-Episoden ist zwischen solchen mit und ohne spezifische Therapie (Kortison) zu

unterscheiden. Diese Unterscheidung ist in diesem Kontext von großer Bedeutung, da einer

potentiellen Beeinflussung der Arginase-Aktivität der Granulozyten sowohl die Inflammation

der GvHD wie auch die spezifische Therapie zugrunde liegen könnte. Betrachtet man

zunächst alle GvHD-Phasen ohne spezifische immunsuppressive Therapie (n=12/73; 16%), so

zeigt es sich, dass weder im Rahmen von akuten GvHD Episoden (n=2/12; 17%) noch im

Rahmen von chronischen GvHD-Episoden (n=10/12; 83%) eine deutliche Modulation der

Arginase-Aktivität zu verzeichnen war. Bei den unbehandelten GvHD-Episoden handelt es

sich ausschließlich um Abstoßungsreaktionen der Haut (n=6) und Mundschleimhaut (n=6) mit

histologischem Grad I. Zwei repräsentative Verläufe sind in Abb. 15 dargestellt.

77

A

0

1000

2000

3000

-40 10 60 110 160

Tage nach Transplantation

Enzy

mak

tivitä

t m

U/m

g Pr

otei

n

Enzymaktivität Argniase

B

0

1000

2000

3000

+100 +200 +300 +400


Enzy

mak

tivitä

t m

U/m

g Pr

otei

n

Enzymaktivität Arginase

Abb. 15 Patient WD 58 mit akuter GvHD

Keine Modulation der Arginase-Aktivität durch GvHD

Patient WD 58 erkrankte an einer akuten GvHD ( ) der Haut (histologischer Grad: I). Es war kein Anstieg der Enzymaktivität bedingt durch GvHD zu beobachten. Die GvHD-Episode wurden nicht systemisch behandelt.

Patient GH 58 mit chronischer GvHD

Keine Modulation der Arginase-Aktivität durch GvHD

Patient GH 56 erkrankte zweimal an chronischer, histologisch gesicherter GvHD ( ) der Haut bzw. der Haut und Mundschleimhaut. Es war kein Anstieg der Enzymaktivität bedingt durch GvHD zu beobachten. Die GvHD-Episoden wurden nicht systemisch behandelt.

Betrachtet man nun bei diesen Patienten den Mittelwert der Enzymaktivität der Proben vor

bzw. nach der GvHD (Ausgangswert: 100%; Werte unter Steroidmedikation nicht

berücksichtigt) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, so kam es im Mittel zu keinem

Anstieg (Arginaseaktivität in den Proben vor bzw. nach GvHD = 100%, unter GvHD = 106%

des Ausgangswerts, Minimum: 81% Maximum: 123%, p = 0,2098).

78

50%

100%

150%

A B

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein:

Verg

leic

h m

it Pr

oben

ohn

e G

vHD

Abb. 16 Keine Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch GvHD-Inflammation

Vergleich Mittelwert der Enzymaktivität der Proben vor bzw. nach GvHD (Ausgangswert: 100%; Werte unter Steroidmedikation nicht berücksichtigt) (A) mit dem Mittelwert der Proben unter unbehandelter GvHD (B)

Zusammenfassend wurde also keine Modulation der Arginase-Aktivität humaner

Granulozyten im Rahmen einer unbehandelten GvHD beobachtet. Die Analyse der mit

Steroiden systemisch behandelten GvHD-Episoden erfolgt auf Seite 81.

Einfluss von infektiös-inflammatorischen Episoden auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten 57% (n=29/51) der Patienten entwickelten während des Beobachtungszeitraums eine oder

mehrere infektiöse inflammatorische Episoden. Neben klinischen Kriterien (z.B. Fieber) und

mikrobiologischen Untersuchungsergebnissen (Blutkulturen, Abstrichergebnisse) wurde

laborchemisch als Entzündungsmarker das C-reaktive Protein (CRP) gemessen (Normbereich

0-5 mg/l).

Tab. 5 zeigt die Verteilung und den dabei durchschnittlich aufgetretenen CRP-Wert bei

Patienten mit infektiösen-inflammatorischen Episoden. 26% der infektiös-inflammatorischen

Geschehnisse traten während einer bereits bestehenden GvHD auf.

79

Tab. 5 Verteilung der infektiös-inflammatorischen Geschehnisse bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation

ART DER INFEKTIÖS-INFLAMMATORISCHEN EPISODEN DURCHSCHNITTLICHER CRP-WERT1

Pneumonie (23%) 114,8

fieberhafter Infekt (42%) 70,9

respiratorischer Infekt (12%) 33,1

Sonstige infektiös-inflammatorische Episoden (23%) 42,2

Bei 57% (n=29/51) der Patienten traten während des Beobachtungszeitraums eine oder mehrere infektiös-inflammatorische Episoden (n=43) auf. 1) Der Normbereich des CRP liegt <5mg/l

Korreliert man nun bei allen Patienten (n=29/51), die eine oder mehrere infektiöse

inflammatorische Episoden entwickelten, den CRP-Wert mit der Enzymaktivität, so konnte

nur bei 5% (n=1) eine Korrelation festgestellt werden. Eine repräsentative Analyse ist in Abb.

17 dargestellt.

0

1000

2000

3000

0 20 40 60 80 100

CRP in mg/l

Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

Abb. 17 Einfluss des CRP-Wert auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten bei Patient SH47

Patient SH47 entwickelte während des Beobachtungszeitraums mehrere infektiöse inflammatorische Episoden mit Anstieg des CRP-Wert bis 33,8 mg/l. Es konnte keine Korrelation festgestellt werden.

Auch im Rahmen der 43 infektiös-inflammatorischen Episoden konnte jeweils keine

signifikante Veränderung der Enzymaktivität der Granulozyten-Arginase zu Beginn oder im

Verlauf der Episoden verzeichnet werden. Im folgenden sind drei repräsentative Verläufe

dargestellt.

80

0

1000

2000

3000

60 80 100 120


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

100

200C

RP-W

ert mg/l

Enzymaktivität Arginase CRP-Wert

Abb. 18 Humane Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch infektiöse Inflammation: Patient BJ50 mit respiratorischem Infekt

Patient BJ 50 erkrankte an einem respiratorischen Infekt ( ), der CRP-Wert stieg auf 54,1 mg/l (Pfeil). Die Enzymaktivität der Granulozyten-Arginase blieb nahezu unverändert.

0

1000

2000

-30 20 70 120


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

100

200

CR

P-Wert m

g/l

Enzymaktivität Arginase CRP-Wert

Abb. 19 Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch Sepsis: Patient PA 83

Bei Patient PA 83 kam es im Verlauf zu Fieberschüben bedingt durch Sepsis mit Nachweis von Staphylococcus haemolyticus ( ). Der CRP-Wert stieg auf max. 85,5 mg/l an (Pfeil). Die Enzymaktivität blieb unverändert.

81

0

1000

2000

+25 +65 +105 +145 +185


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

50

100

150C

RP-W

ert mg/l

Enzymaktivität CRP-Wert

Abb. 20 Humane Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch infektiöse Inflammation: Patient KC 41mit Pneumonie

Bei Patient KC 41 kam es im Verlauf zu einer schweren Pneumonie. Der CRP-Wert stieg auf max. 58,1 mg/l. an (Pfeil). Die Enzymaktivität blieb unverändert.

Einfluss von in vivo Glukokortikoiden auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten Wie auf Seite 76 dargelegt, wurden 12 von 73 GvHD Episoden nicht spezifisch therapiert. Für

alle übrigen GvHD Episoden bestand die Primärtherapie aus der unterschiedlich hoch

dosierten Gabe von Steroiden, zumeist Prednison. Zwar hatte sich in den

Zellkulturuntersuchungen in vitro kein Einfluss von Glukokortikoiden auf die Arginase-

Aktivität isolierter humaner Granulozyten gezeigt, doch schien eine erneute Analyse der

Steroid-Wirkung in vivo interessant. So war zum einen in verschiedenen Spezies und

Gewebetypen ein Einfluss von Steroiden auf die Expression von Arginase dokumentiert

(HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997, KLASEN et al. 2001), zum anderen kann

natürlich eine Zellkulturuntersuchung niemals die Komplexität der in vivo Situation abbilden.

67% (n=34/51) der Patienten erhielten aufgrund einer klinisch vermuteten oder histologisch

nachgewiesenen Abstoßungsreaktion das Glukokortikoid Prednison. Die Therapiedauer der

Behandlungszyklen schwankte im Patientenkollektiv zwischen drei Wochen und mehreren

82

Monaten. Die Anfangsdosierung lag bei 20 bis 1000 mg pro Tag, das Absetzen des Präparats

erfolgte durch langsame Dosisreduktion.

84% (n=61/73) aller Abstoßungsreaktionen wurden mit Prednison behandelt. 15% (n=11/73)

der GvHD-Episoden lagen bereits zu Beginn des Beobachtungszeitraums vor und wurden

dementsprechend schon bei Studieneinschluss des Patienten mit Steroiden behandelt. Weitere

12% (n=9/73) der GvHD-Episoden entwickelten sich während der Steroidbehandlung einer

sich an einem anderen Organ manifestierenden GvHD. Die Mehrzahl der GvHD-Episoden

innerhalb des Patientenkollektivs (56%, n= 41/73) entwickelte sich de novo während des

Beobachtungszeitraums und wurde neu mit Steroiden behandelt. Die Latenzzeit zwischen

Diagnosestellung der GvHD und dem Beginn einer Steroidtherapie war wesentlich abhängig

vom klinischen Schweregrad der GvHD und von der Art (akut / chronisch) und schwankte

erheblich zwischen 0 und 270 Tagen. Im Mittel wurde 33 Tage nach Diagnosestellung mit der

Behandlung begonnen. Bei 54% (n=22/41) dieser Episoden konnte mindestens eine

Granulozyten-Probe zwischen histologischer oder klinischer Diagnosestellung und Beginn der

Prednisontherapie gewonnen werden. Bei diesen Patienten konnte folglich definitiv zwischen

dem Einfluss der GvHD und dem der Steroidmedikation auf die Arginase-Aktivität der

humanen Granulozyten unterschieden werden.

Betrachtet man nun bei diesen Patienten die Enzymaktivität der Probe vor Diagnosestellung

der GvHD (Ausgangswert: 100%) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, aber vor

Prednisongabe, so kam es im Mittel zu keinem Anstieg (Arginaseaktivität in der Probe vor

Diagnosestellung = 100%, nach Diagnosestellung und vor Steroidbehandlung = 97% des

Ausgangswerts; Minimum: 56%, Maximum: 128%; p = 0,3450). Vergleicht man hingegen die

Enzymaktivität vor Diagnosestellung der GvHD mit der Probe unter Prednisontherapie, so

kam es im Mittel zu einem signifikanten Anstieg (139% des Ausgangswert; Minimum: 93%,

Maximum: 216%; p = 0,0058) (s. Abb. 21).

83

0%

50%

100%

150%

200%

A B C

Enzy

mak

tivitä

t mU/

mg

Pro

tein

: Ve

rgle

ich

mit

Prob

e vo

r GvH

D

Abb. 21 Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Steroide, nicht aber durch GvHD-Inflammation.

Vergleich der Arginaseaktivität der Probe vor Diagnosestellung der GvHD (A, Ausgangswert: 100%) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, aber vor Prednisongabe (B, 97%) und der Probe unter Prednisontherapie (C, 139%) bei Patienten, bei denen zwischen Beginn der GvHD-Inflammation und Beginn der Steroidtherapie unterschieden werden konnte (n=22).

In Abb. 22, Abb. 23 und Abb. 24 sind beispielhafte Verläufe dreier Patienten nach allogener

Stammzelltransplantation dargestellt.

0

500

1000

1500

2000

2500

75 125 175 225 275 325 375


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

70

140

Prednison in mg

Enzymaktivität Arginase Prednison

Abb. 22 Humane Granulozyten-Arginase: Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten: Patient LS 64

Patient LS 64 erkrankte an einer akuten GvHD des Darms ( ), histologisch Grad II und klinisch Grad III bzw. an einer chronischen GvHD der Mundschleimhaut und der Haut ( ), histologisch Grad II.

84

Bei der ersten Granulozytenprobe (Tag+120) während der akuten GvHD des Darmes zeigte sich ein Anstieg der Enzymaktivität, wobei aber bereits ab Tag+109 mit einer Steroidtherapie begonnen worden war (hier konnte nicht zwischen Beginn der GvHD und Beginn der Kortisontherapie unterschieden werden). Bei der GvHD der Mundschleimhaut und Haut konnte zwischen dem Beginn der GvHD und dem Beginn der Cortisontherapie unterschieden werden. Hier zeigte es sich, dass erst nach der Gabe von Prednison (ab Tag+293) die Enzymaktivität in den Granulozyten anstieg.

0

1000

2000

3000

20 70 120 170 220 270 320


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

100

200

Prednison in mg


Abb. 23 Arginase-Induktion durch Steroidmedikation: Patient GM 74

Der Patient GM 74 erkrankte an einer GvHD der Haut, klinisch Grad II ( ). Die Enzymaktivität blieb dabei nahezu unverändert (vor GvHD: 1807, unter GvHD 1590 –1890). Durch Einnahme von Prednison (Pfeile, ) (beginnend mit Tagesdosen von 80 mg an Tag +66 bzw. 40mg an Tag +105, das bei V.a. immunologisch vermittelte Fieberschübe unklarer Genese verordnet wurde, zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Enzymaktivität (Messwerte an Tag +71: Enzymaktivität: 2365 mU/mg Protein bzw. Tag +113 Enzymaktivität: 1965 mU/mg Protein).

85

0

1000

2000

3000

100 150 200 250 300 350 400


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

100

200Prednison in m

g


Abb. 24 Arginase-Induktion durch Steroidmedikation: Patient HC 51

Patient HC 51 entwickelte 2 GvHD-Phasen, eine chronische GvHD der Haut ( ) bzw. eine chronische GvHD des Darms ( ), beide histologisch Grad I, die schon zu Beginn des Beobachtungszeitraums bestanden. Im Rahmen der histologisch gesicherten Haut- und Darm-GvHD-Episoden kam es zu keiner signifikanten Veränderung der Enzymaktivität. Nach klinischer Remission der Darm-GvHD um den Tag +120 entwickelte sich erneut eine Darm-GvHD ( ) ab Tag +165, wobei auf eine histologische Bestätigung verzichtet wurde. Prednison wurde in einer Dosierung von zunächst 80mg täglich appliziert, was zu einer signifikanten Erhöhung der Arginase-Aktivität in den Granulozyten führte.

Korreliert man nun die applizierte Steroidtagesdosis mit der an dem jeweiligen Tag

gemessenen Arginaseaktivität der Granulozyten, so zeigte sich statistisch bei 68% der

analysierbaren Verläufe eine positive Korrelation zwischen Steroiddosis und Enzymaktivität.

Eine repräsentative Analyse ist in Abb. 25 dargestellt. Diese Dosis-Wirkungs-Beziehung war

in 41% der Fälle signifikant (p<0,05), in 24% sehr signifikant (p<0,01) und in 35%

hochsignifikant (p<0,001).

Bei einem Drittel der Verläufe konnte keine signifikante Korrelation zwischen Steroiddosis

und Enzymaktivität festgestellt werden. Ein beispielhafter Verlauf ist in Abb. 26 dargestellt.

86

Eine vollständige Dokumentation der jeweiligen Korrelationen zeigt Tab. 6. Da es sich bei

einer ersten Analyse der Verläufe gezeigt hatte, dass relativ niedrige Steroid-Tagesdosen

offensichtlich keinen Einfluss auf die Arginase-Aktivität der Granulozyten haben,

konzentriert sich die nachfolgende Auswertung auf Patienten mit einer Mindest-Tagesdosis

von 30 mg (n=29/34). Aus statistischen Gründen wurden auch Patienten ausgeschlossen, bei

denen weniger als 2 Granulozyten-Proben ohne Kortisonmedikation vorlagen (n=4/34).

0

1500

3000

4500

25 125 225 325


Enzy

mak

tivitä

t m

U/m

g Pr

otei

n

0

100

200 Prednison in mg


0

1000

2000

3000

4000

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0 25 50

Prednison in mgEn

zym

aktiv

ität

mU

/mg

Prot

ein

Abb. 25 Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten Positive Korrelation: Patient BH 53

Bei Patient BH 53 zeigten sich kaum Schwankungen der Aktivität der Granulozyten-Arginase. Aufgrund einer histologisch gesicherten GvHD der Mundschleimhaut ( ) wurde Prednison (zu Beginn 40mg täglich) verabreicht, konsekutiv kam es zu einem Anstieg der Enzymaktivität. Rechts: Korrelation der Prednison-Tagesdosis mit der jeweiligen Arginase-Aktivität mittels linerarer Regression; Korrelationskoeffizient: ρ =0,8961 (p < 0,0001)

0500

1000150020002500

130 180 230 280


Enzy

mak

tivitä

t m

U/m

g Pr

otei

n

0

50

100 Prednison in mg


0500

1000150020002500

0 20 40 60

Prednison in mg

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 26 Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten Keine Korrelation nachweisbar: Patient WU 62

Bei Patient WU 62 bestand ein Verdacht auf GvHD der Leber und Haut. Prednison wurde in einer Dosierung von zunächst 40mg täglich appliziert. Es zeigte sich keine Modulation der Enzymaktivität: ρ=-0,06041 (p>0,05)

87

Tab. 6 Korrelation von Steroiddosis und Granulozyten-Arginase-Aktivität Zusammenstellung aller Patienten, die das Glukokortikoid Prednison aufgrund einer GvHD erhielten

PATIENT PROBENANZAHL (n) KORRELATIONSKOEFFIZIENT (r) SIGNIFIKANZNIVEAU (p)BH53 17 0,8961 <0,0001 PA83 15 0,8589 <0,0001 GM74 17 0,8086 <0,0001 ST66 18 0,7397 0,0004 LS64 22 0,6929 0,0004 SH39 11 0,8612 0,0007 GB60 12 0,8163 0,0012 WH44 14 0,7264 0,0033 HC51 13 0,7188 0,0056 HS66 17 0,6197 0,0080 BJ50 8 0,8218 0,0123 BB43 14 0,6386 0,0140 MH40 8 0,7709 0,025 BH47 13 0,5917 0,0331 MM63 14 0,5678 0,0342 MW44 13 0,7709 0,0389 HH47 7 0,7703 0,0427 SH47 19 0,4442 0,0568 FK46 9 0,5474 0,1271 BK80 21 0,3180 0,1600 JU58 15 -0,5155 0,2120 GH56 23 0,2451 0,2596 WG46 19 0,3826 0,2752 WU62 18 -0,06041 0,8118 SM40 3 -0,2780 0,8207

Gezeigt ist die Korrelation (mittels linearer Regression) der applizierten Prednisontagesdosis je Patient mit der an dem jeweiligen Tag gemessenen Arginaseaktivität der Granulozyten. Patienten, denen initial weniger als 30 mg pro Tag appliziert wurde bzw. Patienten, bei denen weniger als 2 Granulozyten-Proben ohne Kortison bzw. weniger als 3 Messwerte vorlagen, wurden von der Analyse ausgeschlossen (n=9/34). Im oberen Bereich jeder Graphik ist jeweils der Korrelationskoeffizient ρ und das Signifikanzniveau p angegeben.

88

Die Induktion der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Steroidmedikation in vivo

ist prinzipiell durch vermehrte Proteinexpression und/oder durch erhöhte enzymatische

Aktivität durch posttranslationelle Modifikationen erklärbar. Um dieser Fragestellung

nachzugehen, wurde bei ausgewählten Patienten die Expression der hepatischen Isoform

Arginase I im Kontext der Steroid-Medikation mittels Immunoblot analysiert. Wie in Abb.

27, Abb. 28 und Abb. 29 demonstriert, ist jeweils parallel zur Steroid-induzierten Arginase-

Aktivität eine vermehrte Expression der Arginase I als Protein feststellbar. Nachdem bereits

in 4.2.4 gezeigt wurde, dass humane Granulozyten in Ruhe einzig die hepatische Isoform der

Arginase exprimieren, handelt es sich bei der im Kontext der Steroidmedikation induzierten

Form ebenfalls um die Arginase I.

A B

0500

10001500200025003000

0 250

Prednison in mg

Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

Abb. 27 Induktion von Arginase I Protein und Enzymaktivität in humanen Granulozyten durch Steroide in vivo: Immunoblot (A) und Enzymaktivität (B) des Patient HH 47 jeweils ohne und mit Prednison-Medikation

Patient HH 47 erhielt zur Therapie eines GvHD-Progress 250 mg Prednison täglich.

A: Der Immunoblot zeigt die Proteinexpression der Arginase I unmittelbar vor Beginn und unter Therapie mit Prednison. Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung

B: Die Arginaseaktivität im Zell-Lysat unmittelbar vor Beginn und unter Therapie mit Prednison

89

A

B

0500

1000150020002500

0 80 20

Prednison in mg

Enzy

mak

tivitä

t m

U/m

g Pr

otei

n

Abb. 28 Induktion von Arginase I Protein und Enzymaktivität in humanen Granulozyten durch Steroide in vivo: Immunoblot (A) und Enzymaktivität (B) des Patient ST 66 jeweils ohne und mit Prednison-Medikation

Patient ST 66 erhielt aufgrund eines Verdacht auf chronische GvHD der Leber und Mundschleimhaut zur Therapie initial 80mg Prednison täglich.

A: Der Immunoblot zeigt die Proteinexpression der Arginase I unmittelbar vor Beginn und unter Therapie mit Prednison. Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung.

B: Die Arginaseaktivität im Zell-Lysat unmittelbar vor Beginn und unter Therapie mit Prednison.

A

B

0

500

1000

1500

2000

60 0

Prednison in mg

Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

Abb. 29 Induktion von Arginase I Protein und Enzymaktivität durch Steroide in vivo: Immunoblot (A) und Enzymaktivität (B) in humanen Granulozyten des Patient SH 39 jeweils mit und ohne Prednison-Medikation

Patient SH39. erhielt aufgrund einer akuten GvHD der Haut, histologisch Grad I zur Therapie 60 mg Prednison täglich.

A: Der Immunoblot zeigt die Proteinexpression der Arginase I unter und nach Therapie mit Prednison. Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung.

B: Die Arginaseaktivität im Zell-Lysat unter und nach Therapie mit Prednison.

90

Bei den Patienten, denen Prednison verabreicht wurde (n=34), konnten 42 Prednisonepisoden

unterschieden werden, da 8 Patienten während zwei Phasen Prednison erhielten. Der Beginn

von 7 Prednisonepisoden lag vor dem Beobachtungszeitraum, so dass nicht zwischen der

Enzymaktivität vor und während Prednisongabe differenziert werden konnte.

35 Prednisonphasen begannen während des Beobachtungszeitraums. Nach Prednisongabe

erfolgte die anschließende Blutentnahme mit Gewinnung von Granulozyten in einem

zeitlichen Abstand von 0-27 Tagen (im Mittel 10,5 Tage).

Es zeigte sich, dass ein signifikanter Anstieg der Granulozyten-Arginaseaktivität frühestens

48h nach Steroidgabe zu verzeichnen ist.

Tab. 7 stellt den prozentualen Anstieg der Arginase-Aktivität der Granulozyten in

Abhängigkeit von der zeitlichen Latenz nach Beginn der Steroidmedikation dar. Ein

repräsentativer Patientenverlauf, der den fehlenden Anstieg der Granulozyten-Arginase-

Aktivität 48h nach Beginn einer hochdosierten Steroidtherapie in vivo zeigt, ist in Abb. 30

dargestellt.

Tab. 7 Zeitliche Latenz zwischen dem Beginn der Prednisontherapie und dem Anstieg der Granulozyten-Arginaseaktivität bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation

ANZAHL DER TAGE BIS

ZUR ERSTEN BLUTENTNAHME

NACH PREDNISONGABE

ANZAHL DER

ANALYSIERTEN

PROBEN

MITTELWERT DES ANSTIEGS DER ARGINASE-

AKTIVITÄT IN % (IM VERGLEICH MIT

DER PROBE VOR PREDNISONGABE)

0-2 5 3,4

3-5 6 87,2

6-10 8 91,6

10-15 8 73,1

>15 8 53,6

Dargestellt ist eine Aufstellung der zeitlichen Abstände zwischen Beginn der Steroidmedikation und der ersten Granulozytenprobe unter Steroide sowie der dabei verzeichnete prozentuale Anstieg der Arginaseaktivität (Vergleich: letzter Messwert vor und erste Probe unter Steroidmedikation)

91

0

1000

2000

3000

20 70 120 170


Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

0

100

200Prednison in m

g


Abb. 30 Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung der Aktivität in der Frühphase (<48h) nach Beginn einer Steroidmedikation

Patient PA 83 erhielt aufgrund einer histologisch gesicherten GvHD der Leber ( ) eine Prednison-Therapie mit einer initialen täglichen Dosis von 50mg ab Tag+131. Die erste Blutprobe wurde bereits 2 Tage (Tag +133) nach der ersten Prednisoneinnahme analysiert. Es zeigt sich, dass noch kein Anstieg der Arginaseaktivität der Granulozyten zu verzeichnen war (Pfeil). Erst bei der nächsten Blutprobe ist ein Anstieg zu sehen.

33% der Patienten erhielten während des Beobachtungszeitraums kein Cortison. Diese

Patienten zeigten zumeist keine starken Schwankungen in der Arginase-Enzymaktivität der

Granulozyten. Vergleicht man hierzu die Mittelwerte mit Standardabweichungen und

Variationskoeffizient aller Arginase-Enzymaktivitäten der Patienten mit und ohne

Kortisonmedikation, so zeigt es sich, dass die Schwankungsbreite der Patienten ohne

Steroidmedikation (MW: 1135±261 mU/mg; VK: 23%) derjenigen der Normalspender (s.

Abb. 14) vergleichbar ist (MW: 1578± 251 mU/mg; VK: 16%). Demgegenüber kommt die

starke Schwankung der Arginase-Aktivität bei Patienten mit Steroidmedikation in einer sehr

viel höheren Standardabweichung bzw. einem höheren Variationskoeffizient zum Ausdruck

(MW: 1601±681 mU/mg; VK: 43%) (Abb. 31).

92

0

500

1000

1500

2000

2500

A B C

Mitt

elw

ert u

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arda

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chun

g

Abb. 31 Hohe Schwankungsbreite der Arginase-Aktivität in Granulozyten von Patienten mit Steroidmedikation

Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichungen der Granulozyten-Arginase-Aktivitäten von Kontrollpersonen (A) sowie Patienten ohne (B) bzw. mit (C) Steroidmedikation im Verlauf. Der Variationskoeffizient betrug bei A 16%, bei B 23% und bei C 43%.

Hieraus geht hervor, dass die Standardabweichung der Granulozyten-Arginase-Aktivitäten

(„Schwankungsbreite“) bei Patienten ohne Steroidgabe (ein exemplarischer Verlauf ist in

Abb. 33 gezeigt, sowie die gleichbleibende Expression der Arginase I im Immunoblot in Abb.

34) im Verlauf einem Kollektiv von Normalspendern vergleichbar ist. Patienten mit

Steroidmedikation im Verlauf zeigen dagegen eine signifikant größere Schwankungsbreite in

der Arginase-Aktivität ihrer Granulozyten (Abb. 32).

93

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%Pr

ozen

tual

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hwan

kung

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Mitt

elw

ert

Abb. 32 Prozentuale Schwankung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten in verschiedenen Spenderkollektiven.

Dargestellt ist die prozentuale Schwankung um den Mittelwert bei Kontrollpersonen ( ); bei Patienten ohne Prednisontherapie ( ) sowie bei Patienten, die Prednison bekamen ( ). Der jeweilige Mittelwert der Personengruppen ist durch einen Balken eingezeichnet.

0

500

1000

1500

2000

2500

+150 +200 +250 +300 +350 +400


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 33 Geringe Schwankungsbreite der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten bei Patienten ohne Steroidmedikation: Patient DD 63

Patient DD 63 zeigte einen komplikationslosen Verlauf nach Transplantation, ohne infektiös-inflammatorische oder GvHD-Episoden. Es erfolgte keine Therapie mit Prednison, die Arginase-Aktivität der Granulozyten zeigt im Verlauf eine geringe Schwankungsbreite.

94

A B

0

400

800

1200

Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

Abb. 34 Immunoblot und Arginaseaktivität im Zell-Lysat des Patient KC 41 ohne Prednison-Medikation

Dem Patient KC 41 wurden zu keinem Zeitpunkt nach Transplantation Steroide appliziert. Die Expression des Arginase I Proteins (A) sowie die Arginaseaktivität im Zell-Lysat (B) war annähernd gleichbleibend. Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung.

Anzumerken bleibt in diesem Zusammenhang noch, dass bei einem Patienten eine

Steroidmedikation vollständig im zeitlichen Intervall zwischen zwei Blutentnahmen begonnen

und abgeschlossen wurde. In diesem Fall war keine Modifikation der Arginase-Aktivität nach

Abschluss der Steroidgabe zu verzeichnen. Eine Aussage zur Arginase-Aktivität der

Granulozyten während der Steroidgabe war selbstverständlich nicht möglich, so dass diese

Steroidgaben aus der Analyse ausgeschlossen wurden. Wie in Abb. 35 zu sehen, war jeweils

die genaue Kenntnis des klinischen Verlaufs samt genauem Beginn und Ende der applizierten

therapeutischen Steroidgabe unerlässlich.

0

1000

2000

3000

50 100 150 200 250 300 350


Enzy

mak

tivitä

tm

U/m

g Pr

otei

n

0

100

200

Prednison in mg


Abb. 35 Steroidgabe zwischen zwei Messzeitpunkten: Keine Beeinflussung der nachfolgenden Arginase-Aktivität.

Patient OJ 58 erhielt Prednison (Pfeil) zwischen zwei Messpunkten aufgrund eines Verdachts auf GvHD der Lunge. 18 Tage nach der letzten Prednisoneinnahme erfolgte erneut eine Blutentnahme. Es sind keine Schwankungen zu sehen.

95

Einfluss der Transplantation auf die Enzymaktivität der Granulozyten-Arginase Bei 55% der Patienten (n=28/51) konnte eine Blutprobe vor Transplantation gewonnen

werden. Vergleicht man die Granulozyten-Arginaseaktivitäten in den Proben vor

Transplantation mit den Werten nach Transplantation (Werte unter Steroidmedikation nicht

berücksichtigt), so differieren die jeweiligen Aktivitäten teilweise erheblich. Ein Beispiel ist

in Abb. 36 gezeigt.

0

700

1400

2100

2800

3500

-10 10 30 50 70 90 110 130


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 36 Arginase-Aktivität in Granulozyten eines Patienten vor und nach allogener Stammzelltransplantation:

Bei Patient BJ 50 wurde eine Probe vor (Pfeil) und 8 Proben im Verlauf nach Stammzelltransplantation bezüglich der Arginaseaktivität in Granulozyten analysiert, wobei die Enzymaktivität der Arginase vor und nach Transplantation variierten. Aufgrund einer Darm- und Haut-GvHD wurde um den Tag 40 Prednison verabreicht, wobei die Enzymaktivität der Arginase anstieg. Zum Zeitpunkt des ersten Messwertes nach Transplantation bestand bereits vollständiger Spenderchimärismus. Nach Beendigung der Steroidmedikation ereichten die Werte der Enzymaktivität ein Niveau, welches deutlich vom ursprünglichen Messwert in den noch autologen Granulozyten (vor Transplantation) abweicht.

Die Unterschiede der Enzymaktivität im Granulozytenkompartiment (Werte vor und nach

Transplantation) lagen zwischen 3 und 58%, bzw. zwischen 34 und 1935mU/mg Protein.

Eine Zusammenstellung der Patienten zeigt Abb. 37.

96

500

1500

2500

3500

Enzymaktivität vor Transplantation Mittelwerte der Enzymaktivität nachTransplantation

Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 37 Vergleich der Granulozyten-Arginaseaktivitäten in den Proben vor Transplantation mit Werten nach Transplantation (Werte unter Steroidmedikation nicht berücksichtigt)

Bei 55% der Patienten (n=28/51) konnte eine Blutprobe vor Transplantation gewonnen werden. Vergleicht man die Granulozyten-Arginaseaktivitäten in den Proben vor Transplantation mit den Werten nach Transplantation (Werte unter Steroidmedikation nicht berücksichtigt), so differieren die jeweiligen Enzymaktivitäten teilweise erheblich. Die Unterschiede der Enzymaktivität im Granulozytenkompartiment lagen zwischen 3 und 58%, bzw. zwischen 34 und 1935mU/mg Protein.

Schwankungen der Enzymaktivität der Arginase mit unklarer Genese Bei einigen Patienten kam es während des Verlaufes zu Schwankungen, die nicht mit einem

klinisch oder laborchemisch definierbaren Ereignis assoziiert waren (Abb. 38). Da das hier

untersuchte Patientenkollektiv sehr heterogen war und die Probennahme im Vorfeld nicht mit

dem klinischen Verlauf korreliert war, sondern vielmehr dem 14-tägigen

Untersuchungsschema folgte, werden viele Fragen möglicherweise erst durch gezielte

Probennahme in einer Folgestudie geklärt werden können.

97

0

1000

2000

3000

4000

-10 40 90 140 190 240 290 340


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

Abb. 38 Schwankungen der Arginase-Enzymaktivität ohne erkennbare Genese

Es traten bei einigen Patienten Schwankungen der Enzymaktivität der Arginase auf, die nicht zu erklären waren. Bei Patient BK 80 handelt es sich um eine 23jährige Frau, bei der ab Tag +140 eine chronische GvHD der Leber ( ) diagnostiziert wurde.

4.5 Quantifizierung der Arginase-mRNA in Granulozyten von Patienten nach allogener Stammzelltransplantation

Bei 38 Patienten (Probenanzahl n=388) konnte neben der enzymatischen Aktivität und der

Proteinexpression auch die Expression der Arginase I-mRNA in den Granulozyten im Verlauf

nach Transplantation bestimmt werden. Nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurde

die mRNA neben Arginase I für verschiedene weitere Genprodukte mittels Light Cycler

Technologie quantifiziert. In einer Analyse der Korrelation der Expression der granulozytären

Arginase I mit anderen Genprodukten zeigte sich bei Inspektion der Verläufe eine sehr

häufige inverse Korrelation zwischen Arginase I und dem Chemokin IL-8. Wie in Abb. 39 an

zwei Patienten verdeutlicht, zeigte sich immer wieder, dass hohe Arginase I mRNA Spiegel

mit niedrigen IL-8 Messwerten (und reziprok) korreliert sind.

98

A

0

2500

5000

25 75 125 175 225 275 325


IL-8

RN

A

0

40

80A

rginase RN

A

IL8 RNA Arginase RNA

B

0

2500

5000

-10 40 90 140 190 240 290 340


IL8

RN

A

0

100

200 Arginase R

NA

IL8 RNA Arginase RNA

Abb. 39 Dichotome Expression von Arginase I und IL8-mRNA bei Patient BH53 (A) und Patient BK80 (B)

Bei Patient BH 53 (A) und Patient BK80 (B) wurde im Verlauf nach allogener Stammzelltransplantation wiederholt die Expression der mRNA von Arginase I und IL8 in den Granulozyten quantifiziert. Auffällig ist eine gegenläufige Expressionsstärke der beiden Genprodukte.

Die über alle Patienten homogenisierte Skalierung für die Arginase I-mRNA erstreckte sich

von 0 bis 821 (Transkripte / µl cDNA) und der Messbereich für die IL8-RNA von 1 bis 6602

(Transkripte / µl cDNA). Zur Definition von hohen und niedrigen Arginase-Werten wurden

zunächst der Median aller Proben bestimmt. Der Expressions-Median der Arginase I mRNA

aller Proben betrug 17, weshalb alle Werte <17 als niedrig und Werte >17 als hoch definiert

wurden. Der Expressions-Median der IL8-mRNA betrug 422, weshalb Werte <422 als niedrig

und Werte >422 als hoch definiert wurden.

99

Eine Zusammenstellung aller Messwerte ergibt folgende Vierfeldertafel:

Tab. 8 Zusammenstellung der Messwerte der mRNA von Arginase und IL-8

ARGINASE HOCH (>17) ARGINASE NIEDRIG (<17)

IL-8 hoch (<422) 15% 36%

IL-8 niedrig (>422) 35% 14%

Es wurden 388 Proben mRNA bezüglich Arginase und IL-8 (Transkripte/µl cDNA) analysiert. Anhand der Vierfeldertafel zeigt sich die Verteilung der Messwerte. Es zeigte sich folglich bei 71% aller Proben eine inverse Expression von IL8- und Arginase I-mRNA.

Abschließend wurde bei allen Patienten die Expressionsstärke der mRNA von Arginase I und

IL-8 jeweils im Verlauf miteinander verglichen und mittels Korrelationsanalyse ausgewertet.

In dieser Analyse lässt sich das Ausmaß der Korrelation mittels linearer Regression sowie ein

Signifikanzniveau für jeden einzelnen Patienten angeben. Zwei Beispiele sind in Abb. 40

dargestellt, im Anhang dieser Promotionsarbeit sind sämtliche Korrelationsdiagramme

aufgelistet.

Insgesamt zeigte sich mit diesem Verfahren bei 92% der Patienten (bei denen mindestens

50% der Proben eine dichotome Expression aufwiesen) eine Korrelation zwischen Arginase I

und IL-8.

A

1

10

100

1000

10000

0 150 300 450

Arginase RNA

IL-8

RN

A

B

1

1000

0 10 20

Arginase RNA

IL-8

RN

A

Abb. 40 Korrelation der mRNA-Expression von Arginase I und IL-8 in humanen GranulozytenA Patient LS64 / B Patient ST60

Bei den Patienten LS64 (A) und ST60 (B) wurde im Verlauf nach allogener Stammzelltransplantation wiederholt die Expression der mRNA von Arginase I und IL8 in den Granulozyten quantifiziert. Auffällig ist eine gegenläufige Expressionsstärke der beiden Genprodukte. Zu sehen ist die Korrelation der Expression von Arginase I mit der jeweiligen IL8 mRNA mittels linearer Regression; Korrelationskoeffizient ist ρ=-0,6158 (p<0,01) (A) bzw. ρ=-0,7980 (p<0,01) (B).

100

5 Diskussion In verschiedenen murinen Krankheitsmodellen wurde die entscheidende Bedeutung des

Arginin-Stoffwechels myeloischer Immunzellen für Phänotyp und Verlauf der sich

entwickelnden Immunantwort gezeigt (SHEARER et al. 1997, HESSE et al. 2001, INIESTA

et al. 2001, STEMPIN et al. 2004). In dieser Arbeit sollten daher neue Erkenntnisse zur

Regulation der Arginase in humanen myeloischen Zellen gewonnen werden. Insbesondere

sollte die Regulation der Arginase im Rahmen von Inflammation und Antiinflammation

studiert werden.

5.1 Arginase in humanen myeloischen Zellen

In Voruntersuchungen des Labors war gezeigt worden, dass humane Monozyten,

Makrophagen und dendritische Zellen – im Gegensatz zu den entsprechenden murinen Zellen

- weder im Ruhezustand noch bei Aktivierung durch diverse pro- und antiinflammatorische

Stimuli Arginase exprimieren. Interessanterweise zeigten Leukozyten gesunder Blutspender

hohe Arginase-Aktivitäten. Nach Auftrennung dieser heterogenen Zellpopulation stellte es

sich heraus, dass die Arginase-Aktivität selektiv in der granulozytären Fraktion exprimiert

wird (MUNDER et al. Manuskript eingereicht). Innerhalb dieser Promotionsarbeit wurden

diese an wenigen Einzelspendern gewonnenen Erkenntnisse zunächst an einem größeren

Kollektiv verifiziert (s. Abb. 6). Zwei interessante Schlussfolgerungen lassen sich aus den

Ergebnissen ziehen: Zum einen findet sich eine selektive Expression der Arginase in den

Granulozyten aller gesunder Normalspender. Die an konventionell aufgereinigten

Granulozyten (Reinheit >95%) gewonnenen Daten wurden an durchflusszytometrisch

sortierten, hochreinen (Reinheit >99%) Granulozyten-Fraktionen bestätigt (s. Abb. 7). Nur in

wenigen PBMC-Fraktionen ließen sich geringe Arginase-Aktivitäten messen. Da in der

PBMC-Fraktion oft noch kontaminierende Granulozyten zu finden sind, könnte die geringe

Arginase-Enzymaktivität vereinzelter PBMC-Fraktionen auf diese kontaminierenden Zellen

zurückzuführen sein. Alternativ kann eine Arginase-Expression in unstimulierten nicht-

granulozytären Zellen momentan nicht ausgeschlossen werden, wobei es aber bislang noch

keine Hinweise in der Literatur gibt. Weitere Klärung werden möglicherweise

immunzytologische Untersuchungen bringen können. Des weiteren zeigt sich eine breite

interindividuelle Streuung der Granulozyten-Arginaseaktivitäten im Spenderkollektiv, wobei

intraindividuell bei Blutabnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten relativ konstante Aktivitäten

101

feststellbar waren (s. Abb. 14). Um Schwankungen bezüglich der Arginasemessung

(Interassayvarianz) auszuschließen, erfolgte die Messung aller Normalspender in einem

Versuchsdurchlauf. Die Intraassayvarianz lag zwischen 4 und 10%. So konnte ausgeschlossen

werden, dass es aufgrund der Testdurchführung zu der interindividuellen Streuung der

Granulozyten-Arginase-Aktivität kam. Zukünftige Studien sollten klären, ob die

unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten der Arginase möglicherweise mit Unterschieden

in der Funktionalität der Granulozyten einzelner Spender vergesellschaftet sind.

In Voruntersuchungen des Labors hatte es sich gezeigt, dass in humanen Granulozyten die

hepatische Isoform der Arginase (Arginase I) exprimiert wird. Die Expression der Arginase II

konnte nicht überprüft werden, da kein spezifisches Antiserum zur Verfügung steht.

Durch Kontaktierung der großen pädiatrischen Stoffwechselzentren in Deutschland konnten

zwei Patienten mit der seltenen vererbten Harnstoffzyklus-Stoffwechselkrankheit der

Hyperargininämie (Arginase I-Defizienz) ermittelt werden. Die Granulozyten beider Patienten

zeigten keine Arginase-Enzymaktivität im Granulozyten-Lysat und keine Proteinexpression

der Arginase I im Immunoblot des Lysats. Daraus ist abzuleiten, dass es sich bei der von

Granulozyten exprimierten Arginase ausschließlich um die Isoform I handelt. Bei Patienten

mit Arginase I-Defizienz wurde eine kompensatorische Hochregulation des Isoenzyms

Arginase II im Nierengewebe beschrieben (GRODY et al. 1989, IYER et al. 1998). Ein

entsprechender Mechanismus steht den Granulozyten dieser Patienten offenbar nicht zur

Verfügung.

In verschiedenen Veröffentlichungen wurde über eine Arginase I Expression in humanen

Erythrozytenlysaten berichtet (SPECTOR et al. 1985, KIM et al. 2002). Die Bestimmung der

Arginaseaktivität in diesen Zellen dient zumeist als diagnostisch wegweisend bei der

humanen Arginase I–Defizienz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Aktivität der

Arginase I in humanen Granulozyten mit jener der Erythrozyten verglichen. Es konnte gezeigt

werden, dass die Arginase-Aktivität (in mU/mg Zellprotein) in humanen Erythrozyten um den

Faktor 50 bis 100 geringer als in Granulozyten ist (s. Abb. 9). Da in den durch Sedimentation

aufgereinigten Erythrozytenfraktionen nach Trypanblau-Färbung mikroskopisch immer auch

noch nicht-erythrozytäre Zellen (vermutlich kontaminierende Granulozyten) zu sehen waren,

ist es sehr wahrscheinlich, dass zumindest ein Teil der gemessenen „Erythrozyten-Arginase-

Aktivität“ tatsächlich von kontaminierenden Granulozyten stammt. Künftige Experimente

sollten die Expression von Arginase I in humanen Erythrozyten insgesamt reevaluieren, da es

102

im Licht der neuen Daten nicht auszuschließen ist, dass es sich bei der Erythrozyten-

Arginaseaktivität möglicherweise vollständig um enzymatische Aktivität beigemischter

Granulozyten handelt.

5.2 Arginase im murinen und humanen Immunsystem: fundamentale Differenzen in Lokalisation, Regulation und Funktion

Im Ruhezustand zeigen murine myeloische Zellen keine Arginaseaktivität, wobei sie durch

verschiedene Stimulatoren zur Arginase-Expression aktiviert werden können. Ihre Regulation

erfolgt streng dichotom mit der induzierbaren NO-Synthase. Die typischen TH2-Zytokine IL-

4 und IL-10 bewirken im murinen System eine Expression der Arginase I in Makrophagen

(CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al. 1998, RUTSCHMANN

et al. 2001), dendritischen Zellen (MUNDER et al. 1999), Granulozyten (MUNDER et al.

Manuskript eingereicht), Fibroblasten (WITTE et al. 2002), und glatter Muskulatur (WEI et

al. 2000). Durch synergistische Kooperation zwischen den einzelnen TH2-Zytokinen kann die

Expression der Arginase noch deutlich erhöht werden (MUNDER et al. 1998, MUNDER et

al. 1999).

Während es sich bei der TH2-vermittelten Arginase-Induktion im murinen System offenbar

um einen grundlegenden zellulären Mechanismus handelt, der sogar über die Grenzen des

eigentlichen Immunsystems hinausweist (z.B. Fibroblasten, glatte Muskulatur), findet sich

hierzu keine Entsprechung im humanen System. Weder de novo in humanen Monozyten,

Makrophagen und dendritischen Zellen (MUNDER et al. Manuskript eingereicht) noch

modulierend in Granulozyten (diese Arbeit) ist eine Induktion der Arginase durch TH2-

Zytokine feststellbar. Hierbei handelt es sich nicht um grundsätzliche Differenzen beider

Spezies in der Reaktion von Granulozyten auf TH2-Zytokine. So induziert IL-13 die

Expression des antiinflammatorischen IL-1 decoy receptor in humanen PMN (COLOTTA et

al. 1994). IL-4 induziert Veränderungen im Zytoskelett (GIRARD et al. 1997) und hemmt die

Granulozyten-induzierte Immunpathologie in einem murinen Glomerulonephritis-Modell

(SALEEM et al. 1998). IL-4 und IL-10 hemmen die LPS-induzierte COX-2 Expression in

humanen PMN (NIIRO et al. 1997). Zusammenfassend induzieren die TH2-Zytokine im

wesentlichen einen antiinflammatorischen Phänotyp in murinen und humanen Granulozyten.

Während sich die TH2-vermittelte Arginase-Induktion in murinen Granulozyten (MUNDER

103

et al. Manuskript eingereicht) in diesen Kontext einfügt, ist das Fehlen einer Arginase-

Induktion in humanen Granulozyten durch die entsprechenden Zytokine daher sehr

auffallend.

Eine spezifische antiinflammatorische Funktion im Rahmen von TH2-dominierten

Immunantworten scheint der humanen Granulozyten-Arginase daher nicht zuzukommen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss weiterer wichtiger Faktoren, die im murinen

System Arginase-Expression modulieren, auf die humanen Granulozyten untersucht. Die

typischen TH1-Zytokine TNF-α und IFN-γ führen im murinen System zu einer Suppression

der Arginase-I Expression sowie zu einer vermehrten Expression der induzierbaren NO-

Synthase (MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al. 1998). In murinen Knochenmark- und

Alveolarmakrophagen wurde eine Induktion der Arginase durch das cAMP / Proteinkinase A-

System gezeigt (CORRALIZA et al. 1997, HAMMERMANN et al. 2000). Durch Stimulation

mit dem Glukokortikoid Dexamethason kann die Expression der Arginase in Hepatozyten und

hepatischen Zell-Linien der Ratte über eine Bindung des Transkriptionsfaktors C/EBPbeta an

einen Enhancer erhöht werden (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997), während sie

in Alveolarmakrophagen erniedrigt wird (KLASEN et al. 2001). Ebenso wie im Falle der

TH2-Zytokine zeigte sich auch bei Stimulation humaner Granulozyten in vitro mit IFN-γ,

TNF-α, Dexamethason oder bei Anhebung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch

Forskolin keine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität (s. Abb. 11 & Abb. 12 ).

Auch eine Stimulation der humanen PMN mit dem Chemokin IL-8, welches in vivo

Granulozyten an den Ort eines entzündlichen Geschehens lockt (BAGGIOLINI et al. 1989),

bzw. zelluläre Interaktionen mit Thrombozyten parallel zu den genannten

Stimulationsbedingungen (s. Abb. 13) beeinflussten die Arginase-Aktivität der PMN nicht.

Bei den Versuchen handelte es sich um identische Versuchsansätze unter vergleichbaren

Bedingungen, wobei das Spenderkollektiv bezüglich Geschlecht und Alter (18 bis 50 Jahre)

stark differierte.

Viele Mechanismen und Effektorfunktionen im murinen und humanen Immunsystem

verlaufen ähnlich oder identisch. Dies trifft für den Arginin-Stoffwechsel der myeloischen

Zellen offenbar nicht zu.

Das Fehlen einer signifikanten Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten

durch verschiedene pro- und antiinflammatorische Mediatoren des Immunsystems steht

104

vielmehr in deutlichem Widerspruch zum murinen System. Diese Ergebnisse deuten auf eine

fundamental andere Funktion der Arginase im humanen Immunsystem hin.

Aufgrund dieser Differenzen erscheint es sinnvoll, die bisherigen Erkenntnisse im murinen

System über Regulation der Arginase auf Übertragbarkeit ins humane System zu überprüfen.

Die in dieser Arbeit gezeigten Unterschiede in der Regulation der Arginase zwischen murinen

und humanen myeloischen Zellen finden ihre Entsprechung in den noch nicht publizierten

Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation des Enzyms.

Während die Arginase I in murinen Makrophagen zytosolisch lokalisiert ist (JENKINSON et

al. 1996), befindet sich die Arginase I in den azurophilen Granula der humanen Granulozyten

(MUNDER et al. Manuskript eingereicht). Murine Makrophagen nehmen unter TH2-

Stimulation vermehrt L-Arginin aus der Umgebung auf und beginnen die Synthese von

Folgeprodukten der Arginase wie Ornithin, Polyamine und Prolin (JENKINSON et al. 1996,

HESSE et al. 1999), während humane Granulozyten trotz hoher zellulärer Arginaseaktivität

nicht wesentlich Arginin im Extrazellulärmilieu abbauen. Diese Diskrepanz könnte daran

liegen, dass der aggressive Inhalt der azurophilen Granula separat vom extrazellulären Milieu

gehalten werden muss. Auch hätte eine permanente Aufnahme und Verstoffwechselung von

Arginin durch humane Granulozyten eine extrazelluläre Argininverarmung zur Folge

(MUNDER et al. Manuskript eingereicht). Die azurophilen Granula enthalten eine große

Anzahl an proteolytischen und mikrobiziden Enzymen. Beim Prozess der Phagozytose

fusionieren sie mit dem Phagosom, entleeren ihren Inhalt in das Phagolysosom und beteiligen

sich somit an der Elimination phagozytierter Mikroorganismen (BORREGAARD &

COWLAND 1997). Es konnte gezeigt werden, dass sich die Arginase I bei der Phagozytose

im Phagolysosom befindet und innerhalb dieses Kompartiments vermutlich eine Arginin-

Depletion durch Hydrolyse des Arginins bewirkt. Diese Hypothese wird gestützt durch die

Beobachtung, dass in Saccharomyces cerevisiae und Candida albicans nach Aufnahme in

Phagosomen humaner Granulozyten Gene der Arginin-Biosynthese hochreguliert werden.

Offensichtlich reagieren diese Mikroorganismen damit auf eine Arginin-Depletion im

Mikromilieu des PMN-Phagosoms (RUBIN-BEJERANO et al. 2003). Während die Arginase

I im murinen System ein spezifisch im Kontext von Antiinflammation hochreguliertes Enzym

darstellt, fungiert das Enzym in humanen myeloischen Zellen vermutlich v.a. als neues

antimikrobielles Wirkprinzip in den azurophilen Granula der Granulozyten. Diese Arbeit

105

unterstützt durch Herausarbeitung der grundlegenden Unterschiede in der Regulation diese

Vorstellung.

Von großer Bedeutung wird es sein, die in murinen Krankheitsmodellen gezogenen

Schlussfolgerungen über die pathogenetische Funktion der Arginase im humanen Kontext zu

überprüfen. So spielt z.B. bei der murinen Leishmaniasis die Induktion der Arginase in

Makrophagen über TH2-Zytokine eine entscheidende Rolle für den Krankheitsverlauf, da

Leishmanien auf die Arginase-vermittelte Synthese von Polyaminen angewiesen sind

(INIESTA et al. 2001). Bei den Leishmanien handelt es sich jedoch um obligat intrazelluläre

Protozoen der Makrophagen, die in Granulozyten, den Zellen, die im humanen System

Arginase exprimieren, in der Regel nicht zu finden sind.

5.3 In vivo veritas: Regulation der humanen Granulozyten-Arginase durch Glukokortikoide

In Zellkulturuntersuchungen konnte keine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität

humaner Granulozyten in vitro gezeigt werden. Da aber eine Zellkulturuntersuchung niemals

die Komplexität der in vivo Situation abbilden kann, erfolgte die Untersuchung der

Regulation an einem Kollektiv allogen blutstammzelltransplantierter Patienten bzw. an

klinisch gesunden Probanden.

Zur Untersuchung einer möglichen Regulation der Arginase im Kontext von Inflammation

oder Anti-Inflammation in vivo wurden allogen transplantierte Patienten als besonders

geeignet ausgewählt, da diese Patienten nach Transplantation in relativ hoher Frequenz

inflammatorische Probleme entwickeln, verschiedene immunmodulierende Substanzen mit

konsekutiver Beeinflussung auch der Granulozyten-Aktivation (z.B. Steroide) erhalten und

außerdem einer engmaschigen klinischen und laborchemischen Kontrolle unterliegen.

Kritisch anzumerken ist, dass dieses Kollektiv sehr heterogen war bezüglich

Grunderkrankung, Alter (21-65 Jahre) und Krankheitsverlauf. Auch war es selbstverständlich

nicht möglich, exakt alle 14 Tage Blutproben zu gewinnen. Weiter erhielten diese Patienten je

nach individuellem Krankheitsverlauf unterschiedlich lange eine immunsuppressive

Prophylaxe mit Cyclosporin A, FK 506 oder Mycophenolatmofetil, wodurch

Zytokinsekretion und Proliferation von T-Zellen supprimiert werden. Möglicherweise wurde

also in dem untersuchten Kollektiv die Sekretion von physiologischen Arginase-

106

modulierenden T-Zell-Zytokinen systematisch unterdrückt und war somit der Beobachtung

nicht zugänglich.

Der Krankheitsverlauf der Patienten war sehr heterogen. Die GvHD-Episoden lagen in

unterschiedlicher Ausprägung (lokalisiert / generalisiert), Lokalisation (Leber, Haut, Darm,

Mundschleimhaut) und auch Pathogenese (akut / chronisch) vor. Ebenso verhielt es sich bei

den infektiös-inflammatorischen Episoden. Aufgrund dieser Heterogenität ist zwar zum einen

die Subgruppenanalyse wegen zu kleiner Fallzahlen erschwert bzw. unmöglich, zum anderen

erlaubt aber gerade die Vielfalt der qualitativ und quantitativ unterschiedlichen

inflammatorischen Episoden eine Analyse der Arginase-Expression im Rahmen verschiedener

Einflüsse. Im murinen System konnte die pathogenetische Relevanz von TH1 und TH2

Zytokinen in der Induktion bzw. Suppression von GvHD zweifelsfrei gezeigt werden

(ALLEN et al. 1993, RUS et al. 1995, FERRARA et al. 1996). Zwar ist die Situation im

humanen Kontext offenbar komplexer, doch spielen auch hier pro- und antiinflammatorische

Zytokine eine wesentliche pathogenetische Rolle (REDDY & FERRARA 2003). In Rahmen

einer Beobachtungsstudie wurde daher zunächst der potentielle Einfluss der Graft-versus-

host-Erkrankung samt assoziierter Inflammation auf das Enzym Arginase untersucht.

Die Mehrzahl der Patienten (76%) entwickelte erwartungsgemäß eine GvHD, wobei 19% der

Patienten nur an einer akuten GvHD und 39% nur an einer chronischen GvHD erkrankten.

18% der Patienten entwickelten im Verlauf sowohl eine akute als auch eine chronische

GvHD-Erkrankung. Von den GvHD-Episoden wurden 16% nicht systemisch mit

Glukokortikoiden behandelt, wobei es sich um Abstoßungsreaktionen der Haut und

Mundschleimhaut bis zum klinischen Grad I handelte. Im Rahmen dieser unbehandelten

GvHD-Episoden zeigte sich keine Modulation der Arginaseaktivität in den Granulozyten.

Auch bei den inflammatorisch-infektiösen Episoden, die bei 57% der Patienten auftraten und

welche durch den klinischen Verlauf bzw. einen erhöhten CRP-Wert definiert waren, zeigte

sich keine Modulation der Enzymaktivität.

Im Gegensatz zu den Zellkulturuntersuchungen zeigte sich bei den Patienten eine positive

Korrelation zwischen Steroidapplikation und der Arginase-Aktivität in den Granulozyten. Der

Einfluss von Glukokortikoiden auf Granulozyten ist gut bekannt. So führen Glukokortikoide

über verschiedene Mechanismen zu einer Granulozytose: es werden vermehrt v.a.

unsegmentierte Granulozyten aus dem Knochenmark ausgeschwemmt (KAJITA & HUGLI

1990), die Halbwertszeit der zirkulierenden Neutrophilen wird durch Beeinträchtigung der

107

Apoptose verlängert, während die der Eosinophilen und Lymphozyten induziert wird (COX

1995, OHTA & YAMASHITA 1999), die am Endothel verlangsamt entlangrollende

Granulozytenfraktion tritt vermehrt ins zirkulierende Blut (NAKAGAWA et al. 1998) und die

Extravasation von Granulozyten ins Gewebe wird beeinträchtigt (HIRASAWA et al. 1992).

Weitere Effekte von Glukokortikoiden auf ausdifferenzierte PMN bestehen in der Induktion

des Leukotrien B4-Rezeptors BLT 1 (STANKOVA et al. 2002), der vermehrten Abspaltung

zellmembrangebundenen L-Selectins (NAKAGAWA et al. 1999) sowie der Induktion des

Proteins Lipocortin-1 (PERRETTI et al. 1996).

Während des Beobachtungszeitraums erhielten 67% der Patienten meist aufgrund einer

klinisch vermuteten oder histologisch nachgewiesenen Abstoßungsreaktion das

Glukokortikoid Prednison. Die Therapiedauer der Behandlungszyklen schwankte im

Patientenkollektiv zwischen drei Wochen und mehreren Monaten. Bei 2/3 der Patienten, die

Prednison erhielten, konnte eine positive Korrelation zwischen applizierter Steroidmenge und

Expression der Arginase gezeigt werden (s. Abb. 25 & Tab. 6). Da die Prednisontherapie in

den meisten Fällen aufgrund einer Abstoßungsreaktion erfolgte, war es wichtig, dass definitiv

zwischen dem Einfluss der GvHD und dem der Prednisontherapie unterschieden werden

konnte. Bei 54% der Episoden (bis klinischer Grad III) konnte mindestens eine Granulozyten-

Probe zwischen histologischer oder klinischer Diagnosestellung und Beginn der

Prednisontherapie gewonnen werden.

Bei diesen Patienten konnte folglich zwischen dem Einfluss der GvHD und dem der

Steroidmedikation auf die Arginase-Aktivität der humanen Granulozyten unterschieden

werden. Hier wurde deutlich, dass der Anstieg der Enzymaktivität mit der

Glukokortikoidgabe und nicht mit der Abstoßungsreaktion korrelierte (s. Abb. 22, Abb. 23,

Abb. 24).

Diese hier durchgeführten Untersuchungen zur Regulation der humanen Granulozyten-

Arginase in vivo dienten dazu, Hypothesen durch Korrelationsbeobachtungen zu generieren.

Die Probennahme erfolgte in einem 14-tägigen Rhythmus und war zum größten Teil nicht an

den klinischen Verlauf gekoppelt. Die Heterogenität der Patienten und der aufgetretenen

inflammatorischen Probleme komplizierte die Analyse zusätzlich. In Folgestudien sollte nun

gezielt der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Arginase-Expression in humanen

Granulozyten in vivo in gesunden Kontrollprobanden durch Quantifizierung vor und nach

Applikation einer definierten therapeutischen Glukokortikoiddosis untersucht werden.

108

Möglicherweise bietet sich hier auch ein Patientenkollektiv (z.B. Patienten mit idiopathischer

Thrombozytopenie) an, welches neben den über mehrere Tage applizierten Glukokortikoiden

keine weitere immunsuppressive Therapie (wie z.B. Cyclosporin A) erhält.

5.4 Glukokortikoide und humane Granulozyten: Steigerung der Arginaseexpression während der Reifung im Knochenmark oder nach Abschluss der Differenzierung?

Bei fünf Patienten, einem sicherlich sehr kleinem Kollektiv, wurde weniger als 48 Stunden

nach Steroidapplikation die erste Granulozytenprobe analysiert (s. Abb. 30).

Innerhalb dieses Zeitfensters war jeweils kein Anstieg der Granulozyten-Arginaseaktivität

messbar. Erst nach einer zeitlichen Latenz von mindestens 48h nach Steroidgabe war ein

Anstieg der Arginaseaktivität in den zirkulierenden Granulozyten zu verzeichnen (s. Tab. 7).

Unter der Voraussetzung einer kausalen Beziehung zwischen Steroidapplikation und

Arginaseinduktion lässt sich dieser protrahierte Effekt z.B. dadurch erklären, dass das

Glukokortikoid nicht auf die peripheren, zirkulierenden Granulozyten einwirkt (wie bei der

Expression der in Abschnitt 5.3 aufgeführten Genprodukte, z.B. Lipocortin-1), sondern auf

die sich differenzierenden Granulozyten im Knochenmark. Diese Hypothese wird gestützt

durch die Ergebnisse des ersten Teils dieser Arbeit, in dem in vitro keine Induktion des

Enzyms in ausdifferenzierten Granulozyten durch Steroidstimulation feststellbar war. Auch

die relativ kurze Halbwertszeit der Granulozyten in der peripheren Zirkulation (6-8 h) macht

eine Enzyminduktion, die erst nach einer Latenz von mindestens 48h in vivo auftritt, als

direkten Glukokortikoideffekt auf die zirkulierenden PMN eher unwahrscheinlich.

In verschiedenen Publikationen wird der Einfluss von Glukokortikoiden auf den

Differenzierungsprozess reifender Granulozyten beschrieben. Als Modell der

granulopoetischen Differenzierung diente hierbei die promyelozytäre Zellinie HL-60, welche

sich durch Zugabe von all-trans-Retinolsäure oder DMSO in eine granulozytäre Richtung

entwickelt. So führt die Gabe von Dexamethason während der neutrophilen Differenzierung

zur vermehrten Expression des Leukotrien B4-Rezeptors BLT1 (OBINATA et al. 2003), ein

Effekt, der auch bei ausdifferenzierten Granulozyten beobachtete werden kann (STANKOVA

et al. 2002). Die vermehrte Expression ist dabei dosisabhängig und ist nicht bei

Differenzierung der HL-60-Zell-Linie mittels Vitamin D3 in eine monozytäre Richtung zu

beobachten. Weiter wurde eine Potenzierung des Einflusses der Retinolsäure bei der

109

Differenzierung der HL-60-Zellen in Anwesenheit von Dexamethason beobachtet. So führt

das Steroid zu Verstärkung der sekretorischen Kapazität, des oxidativen Metabolismus und

der enzymatischen Ausstattung mit den Phosholipasen C, A2 und D (COLLADO-ESCOBAR

& MOLLINEDO 1994).

Bei den 5 Patienten, bei denen die Granulozytenprobe <48h nach Steroidgabe gewonnen

wurde, konnte bei 3 Patienten auch die mRNA quantifiziert werden. Während die

Proteinexpression der Arginase erst protrahiert erfolgte, zeigte sich bei fehlendem Anstieg der

enzymatischen Aktivität eine Zunahme der mRNA-Expression der Arginase (im Vergleich

der Mittelwerte aller übrigen Proben war ein Anstieg zwischen 25% bis 271% zu

verzeichnen). Folgestudien sollten klären, wie groß die zeitliche Latenz zwischen mRNA-

Expression und Proteinsynthese der Arginase nach Glukokortikoidgabe ist.

In diesem Zusammenhang relevant sind auch die noch ungeklärten Signaltransduktions-

mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Arginase I in humanen Granulozyten. Auf

molekularer Ebene wurde im murinen System die Bedeutung von Transkriptionsfaktoren der

CCAAT/Enhancer Binding Protein Familie für die Expression der Arginase nach

Glukokortikoid-Stimulation demonstriert (TAKIGUCHI & MORI 1991, GOTOH et al. 1997).

Während C/EBPalpha für die Expression des Arginase I Gens in der Leber während der

murinen Neonatalperiode (KIMURA et al. 1998) oder in der Glandula parotis (AKIBA et al.

2002) verantwortlich ist, vermittelt C/EBPbeta die Glukokortikoid- bzw. Glukagon-induzierte

Expression in primären kultivierten Ratten-Hepatozyten (NEBES et al. 1988, GOTOH et al.

1997, KIMURA et al. 2001).

Die durch Glukokortikoide induzierte Transkription von Zielgenen verläuft entweder direkt,

indem der Glukokortikoidrezeptor als Transkriptionsfaktor an Sequenzen im Promotor des

entsprechenden Gens bindet oder indirekt über de novo Synthese eines Proteins, welches dann

als Transkriptionsfaktor am Zielgen fungiert (TAKIGUCHI & MORI 1995, GOTOH et al.

1997). Letzterer Mechanismus wurde für die Glukokortikoid-vermittelte Induktion der

Arginase in primären Ratten-Leberzellen und einer Hepatom-Zell-Linie demonstriert (NEBES

et al. 1988). Glukokortikoide induzieren hierbei den Transkriptionsfaktor CEB/P beta, der

dann an eine DNA-Sequenz im Bereich der Enhancer-Region (11 kb in Richtung 3’ vom

Transkriptionsstart gelegen) bindet. Der Promotor der Ratten-Leberarginase vermittelt keine

Glukokortikoid-induzierte Steigerung der Transkription (GOTOH et al. 1997). Auch im

murinen System im Falle der TH2-Zytokin-induzierten Makrophagen-Arginase I zeigte sich

110

eine Induktion der Transkription über Bindung von Transkriptionsfaktoren (STAT-6, CEB/P

beta, PU-1) an einen Enhancer, 3 kb in Richtung 3’ vom Transkriptionsstart (PAULEAU et

al. 2004).

5.5 Steigerung der Arginase-Aktivität in PMN durch Steroide: Beeinflussung der Infektionsabwehr?

Offen ist auch die wichtige Frage, welchen Einfluss eine Glukokortikoid-induzierte erhöhte

Arginase-Aktivität auf die Funktionalität humaner Granulozyten hat. Hierzu muss zunächst

die physiologische Funktion des Enzyms als Bestandteil der azurophilen Granula geklärt

werden. Die in dieser Arbeit gezeigte Induktion durch die im wesentlichen

antiinflammatorisch wirksamen Glukokortikoide könnte hierbei helfen. Eine mögliche

antimikrobielle Funktion durch phagosomale Arginin-Depletion im Rahmen der Phagozytose

(MUNDER et al. Manuskript eingereicht) würde somit durch Steroide unterstützt.

Interessanterweise stimulieren Glukokortikoide die Expression des Mannose-Rezeptors und

des Scavenger Rezeptors CD163 auf humanen Monozyten (HOGGER et al. 1998,

PIEMONTI et al. 1999), was zu einer verstärkten phagozytären Aktivität dieser Zellen führt.

Der Hypothese einer verstärkten antimikrobiellen Aktivität durch steroidinduzierte Arginase

in humanen PMN entgegen steht die bekannte Beeinträchtigung der zellulären Immunität und

insbesondere der granulozytären Funktionen durch Glukokortikoide (FRANCHIMONT

2004).

5.6 Genetische Determination der Arginase-Aktivität in den Granulozyten?

Bei 55% der Patienten konnte eine Granulozytenprobe vor Transplantation analysiert werden.

Die Granulozyten-Arginaseaktivitäten in den Proben vor Transplantation differierten hierbei

zum Teil deutlich verglichen mit den Werten nach Transplantation (Werte unter

Steroidmedikation nicht berücksichtigt). Möglicherweise sind diese zum Teil deutlichen

Differenzen dadurch zu erklären, dass die Höhe der Arginaseaktivität der Granulozyten

zumindest partiell genetisch determiniert ist. So konnte bei der Analyse der Normalspender

gezeigt werden, dass jeder klinisch gesunde Spender im Verlauf zwar einen relativ konstanten

Wert der Enzymaktivität aufrecht erhält, dieser Wert aber zwischen den Spendern stark

variieren kann (s. Abb. 14). Im Rahmen der allogenen Transplantation wird nun die autologe

111

Hämatopoese (mit einer bestimmten, endogen festgelegten Größe der Arginase-Expression in

den Granulozyten) mehr oder weniger völlig zerstört, damit das Anwachsen der

transplantierten allogenen Stammzellen ermöglicht wird. Die transplantierten Stammzellen

stellen ein neues hämatopoetisches System mit unterschiedlichem Arginase-Niveau in den

allogenen Granulozyten dar. Diese Granulozyten-immanenten Unterschiede sind

möglicherweise auf Allel-Polymorphismen bzw. Sequenzunterschiede auf Promotor /

Enhancer – Ebene des Arginasegens in unterschiedlichen Individuen zurückzuführen (s. Abb.

36 & Abb. 37), wobei hierfür bislang keine publizierten Daten vorliegen.

5.7 Arginase I und IL8 in humanen Granulozyten: Charakterisierung eines (anti)inflammatorischen Phänotyps?

Des weiteren konnte bei 38 Patienten neben der enzymatischen Aktivität und der

Proteinexpression auch die Expression der Arginase I-mRNA in den Granulozyten im Verlauf

nach Transplantation bestimmt werden. Nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurde

die mRNA der Arginase I und weiterer Genprodukte mittels Light Cycler Technologie

quantifiziert. Bei Analyse der Korrelation der Expression der granulozytären Arginase I mit

anderen Genprodukten zeigte sich sehr häufig eine Korrelation zwischen Arginase I und dem

Chemokin IL-8: hohe Arginase I mRNA Expression korrelierte mit niedrigen IL-8

Messwerten und umgekehrt (s. Tab. 8).

Bei Interleukin 8 handelt es sich ein C-X-C Chemokin, welches chemotaktisch auf

Neutrophile, Basophile und Untergruppen der T-Lymphozyten wirkt. Neben der

chemotaktischen Wirkung auf Neutrophile führt es zu einer Freisetzung granulärer Enzyme,

einer gesteigerten Aktivität des „respiratory burst“ und einer Induktion von

Adhäsionsmolekülen auf der Zellmembran (SCAPINI et al. 2000). IL-8 wird im übrigen von

den Neutrophilen, den Hauptzielzellen, selbst synthetisiert. Dies geschieht vornehmlich in

einer proinflammatorischen Frühphase von Infektionen (SCAPINI et al. 2000). Es konnte

gezeigt werden, dass Serum Amyloid A, ein Akut-Phase-Protein, die Synthese von

Interleukin-8 mRNA und Protein sowie die Sekretion des Chemokins in Neutrophilen und

Monozyten stark induziert (WERTHEIM et al. 1993, FURLANETO & CAMPA 2000,

RIBEIRO et al. 2003).

112

Als weitere Stimulatoren der IL-8-Produktion in Granulozyten zeigten sich dosis- und

zeitabhängig LPS, TNF-α, IL-1β sowie die Phagozytose von Hefepartikeln (BAZZONI et al.

1991, WERTHEIM et al. 1993).

Eine Regulation der Sekretion von Interleukin-8 durch Granulozyten erfolgt unter anderem

durch Glukokortikoide. Diese hemmen eine durch LPS stimulierte Sekretion von Interleukin-

8 in humanen Granulozyten.

Die Suppression des Chemokins IL-8 findet wahrscheinlich auf der Stufe der

Gentranskription statt, wobei eine posttranskriptionelle Regulation nicht ausgeschlossen

werden kann (WERTHEIM et al. 1993). In Monozyten regulieren Glukokortikoide generell

proinflammatorische Zytokine (neben IL-8 auch IL-1 β, IL-6, IL-12) herunter

(FRANCHIMONT 2004), während antiinflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGF-β

hochreguliert werden (FRANCHIMONT et al. 1999).

In dieser Arbeit wurde die Suppression von IL-8 in humanen PMN durch Glukokortikoide als

Korrelation zwischen therapeutischer Applikation und Reduktion der IL-8 mRNA in vivo

verifiziert. Da sehr häufig (bei 71% der mRNA Proben) gleichzeitig ein Anstieg der Arginase

I-mRNA zu verzeichnen war, lässt sich ein Glukokortikoid-induzierter „antiinflam-

matorischer“ Phänotyp der Granulozyten auf mRNA Ebene beschreiben. So sind diese Zellen

durch eine hohe Expression von Arginase I mRNA und eine geringe Expression von IL-8

mRNA charakterisiert (ArgIhoch / IL-8niedrig). Korrespondierend hierzu ergeben sich prinzipiell

drei weitere Granulozyten-Phänotypen: neben dem „inflammatorischen“ Phänotyp ArgIniedrig /

IL-8hoch noch ArgIhoch / IL-8hoch und ArgIniedrig / IL-8niedrig. Zukünftige Studien sollten klären,

wie valide sich die Immunlage im Organismus durch Quantifizierung der beiden Genprodukte

in den Granulozyten beschreiben lässt.

113

6 Zusammenfassung Gwendolyn Doschko: Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in

humanen Granulozyten

Einer der zentralen Stoffwechselwege im murinen Immunsystem im Rahmen von

Inflammation und Zytotoxizität ist der Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen. In murinen

Makrophagen, Granulozyten und dendritischen Zellen erfolgt die Regulation der alternativen

Schlüsselenzyme induzierbare NO-Synthase und Arginase meist streng dichotom durch T-

Zell-Zytokine. Um zu prüfen, ob diese Regulation Spezies-übergreifend ähnlich erfolgt, war

die Regulation des Enzyms Arginase in humanen myeloischen Zellen Gegenstand dieser

Arbeit.

Zunächst wurde an einem größeren Normalspender-Kollektiv durch Fraktionierung der

Leukozyten verifiziert, dass das Enzym Arginase lediglich von Granulozyten exprimiert wird.

Im Gegensatz zu murinen myeloischen Zellen exprimieren humane Granulozyten bereits

konstitutiv eine hohe Arginaseaktivität (Mittelwert: 1644 ± 423 mU/mg Protein). Diese

Ergebnisse wurden mit hochreinen, durchflusszytometrisch sortierten

Granulozytenpopulationen durch Nachweis der Proteinexpression und der enzymatischen

Aktivität bestätigt. Durch wiederholte Probengewinnung an einem Kollektiv von 7

Normalspendern konnte gezeigt werden, dass jeder klinisch gesunde Spender im Verlauf

einen relativ konstanten Wert der Arginase-Aktivität zeigt, dieser Wert aber zwischen den

Spendern variieren kann (VK: 16%). Durch Analyse aufgereinigter Granulozyten von

Patienten mit Arginase I-Defizienz wurde schließlich bewiesen, dass humane Granulozyten

ausschließlich die hepatische Isoform der Arginase (Arginase I) und nicht die extrahepatische

Variante (Arginase II) exprimieren. In Zellkulturuntersuchungen zeigte es sich, dass die

wesentlichen Arginase-Induktoren (IL-4, IL-10, cAMP) bzw. Suppressoren (IFN-γ, TNF-α)

des murinen Systems in humanen Granulozyten keine Modulation der Arginaseaktivität

bewirken. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese einer grundsätzlich andersartigen

Funktion des Arginin-Metabolismus in den Immunsystemen beider Spezies. Auch eine

Stimulation humaner Granulozyten mit Dexamethason, Forskolin oder dem Chemokin IL-8

führte in vitro zu keiner signifikanten Modulation der konstitutiven Arginase-Aktivität.

114

In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Regulation der humanen Granulozyten-Arginase

in vivo untersucht. Hierzu wurden insgesamt 540 Granulozytenproben von 51 Patienten im

Langzeitverlauf nach allogener Stammzelltransplantation gewonnen und die vielfältigen

inflammatorischen und immunologischen Reaktionszustände dieses Kollektivs mit der jeweils

gemessenen Arginase-Aktivität der aufgereinigten Granulozyten korreliert.

Hierbei zeigte es sich, dass weder im Rahmen infektiöser Inflammation (v.a. Sepsis,

Pneumonie, Atemwegsinfekt) noch im Rahmen nicht-infektiöser Inflammation (Graft-versus

Host-Erkrankung) eine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität feststellbar war. Auch

diese Ergebnisse stehen im deutlichen Widerspruch zum murinen System, in dem die

Arginase in zahlreichen zytokinvermittelten inflammatorischen Prozessen in den beteiligten

myeloischen Zellen reguliert wird.

Eine signifikante positive Korrelation der Arginase-Aktivität der Granulozyten zeigte sich

dagegen im Rahmen einer therapeutischen Applikation von Glukokortikoiden. So war bei

68% der Patienten die Steroiddosis positiv korreliert mit der Arginase-Aktivität der

Granulozyten. Es wurde gezeigt, dass dieser Effekt erst mit einer zeitlichen Latenz von 48 h

nach dem Beginn der Steroidtherapie feststellbar ist.

Durch Quantifizierung der Arginase I und IL-8 mRNA in 388 Granulozytenproben von 38

Patienten im Langzeitverlauf wurde abschließend bei 92% der Patienten eine signifikante

reziproke Korrelation zwischen beiden Genprodukten nachgewiesen. Dies zeigt, dass die

Induktion pro-inflammatorischer Zytokine in vivo (IL-8) von einer Suppression der Arginase I

in humanen Granulozyten begleitet werden könnte oder im Gegenzug ein Anstieg der

Arginaseaktivität in den Granulozyten eine spezielle anti-inflammatorische Reaktionslage des

humanen Immunsystems charakterisieren könnte.

115

7 Summary Gwendolyn Doschko: Examination of the regulation of the enzyme arginase in

human granulocytes

One of the central metabolic pathways in the murine immune system in the context of

inflammation and cytotoxicity is the arginine metabolism of myeloid cells. Generally, in

murine macrophages, granulocytes and dendritic cells the alternative key enzymes (inducible

NO synthase and arginase) are regulated competitively by T cell cytokines. In order to

analyse if this type of regulation is similar between different species the regulation of the

enzyme arginase in human myeloid cells is the topic of this study.

By separating leukocyte fractions of normal blood donors it was verified that the enzyme

arginase is only expressed by granulocytes. In contrast to murine myeloid cells, human

granulocytes already express high arginase activity constitutively (mean: 1644 ± 423 mU/mg

protein). These results were confirmed with flow-cytometrically sorted granulocyte

populations of high-purity by demonstrating protein expression and enzymatic activity.

By repeatedly sampling 7 normal blood donors over time, it could be shown that each healthy

donor shows a relatively constant level of granulocyte arginase activity over time, while

individual values differ significantly between donors (variation index 16%). By analysis of

purified granulocytes from patients with arginase I-deficiency, it was proven that human

granulocytes express the hepatic isoform of arginase (arginase I) only and not the extrahepatic

arginase II.

It was then shown in cell culture experiments that the main arginase inducers (IL-4, IL-10,

cAMP) and suppressors (IFN-γ, TNF-α) of the murine system do not alter arginase activity in

human granulocytes. These results support the hypothesis of a fundamentally different

function of the metabolism of arginine in the immune systems of both species. Also, a

stimulation of human granulocytes with dexamethasone or the chemokine IL-8 does not lead

to any significant modulation of constitutive arginase activity in vitro.

116

The in vivo regulation of human granulocyte arginase was then examined. For this purpose, a

total of 540 granulocyte samples were collected during long term monitoring of 51 patients

after allogeneic stem cell transplantation and the various inflammatory and immunologic

problems of the patients were correlated with the measured arginase activity of the purified

granulocytes.

Here it turned out that a significant modulation of arginase activity was neither seen in the

context of infectious inflammation (sepsis, pneumonia, respiratory disease) nor in the context

of non-infectious inflammation (Graft-versus-Host-Disease). Again, these results contrast

sharply with the murine system in which arginase within involved myeloid cells is regulated

by many cytokine–mediated inflammatory processes. In contrast, a significant positive

correlation of arginase activity in granulocytes was seen in the context of therapeutical

application of glucocorticoids. In 68% of the patients the steroid dose correlated positively

with arginase activity of granulocytes. It was shown that an increase in granulocyte arginase

activity is seen only after at least 48 h of steroid therapy. By quantifying arginase I and IL-8

mRNA in 388 granulocyte probes of 38 patients after allogeneic stem cell transplantation, a

significant reciprocal correlation of both gene products could be demonstrated in 92% of

these patients.

This shows that the induction of pro-inflammatory cytokines in vivo (IL-8) is accompanied by

a downregulation of arginase I in human granulocytes or vice versa that an increase of

granulocyte arginase might characterise a defined antiinflammatory phenotype of the human

immune system.

117

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9 Anhang 9.1 Transplantationsvorbereitung (Konditionierung) des Patienten

Bei der Transplantationsvorbereitung des Patienten werden zwei Behandlungsformen

unterschieden: Zum einen die myeloablative und zum anderen die non-myeloablative

Konditionierung. Myeloablativ im engeren Sinne bedeutet die komplette und dauerhafte

Zerstörung der autologen Hämatopoese durch den direkten Effekt der Chemo- oder

Strahlentherapie während der Konditionierung. Ist aufgrund der dosisreduzierten Intensität

der Konditionierung prinzipiell eine Regeneration der autologen Hämatopoese möglich,

spricht man von non-myeloablativer Konditionierung. In diesem Fall wird durch die

transplantationsvorbereitende Therapie das Anwachsen der transplantierten allogenen

Stammzellen ermöglicht. Der Patient durchläuft eine Phase des hämatopoetischen

Chimärismus, d.h.autologe und allogene Blutbildung verlaufen nach Transplantation zunächst

noch gemeinsam ab bevor sich im weiteren Verlauf die Spenderhämatopoese durchsetzt.

9.1.1 GvHD-Prophylaxe und -Diagnostik

Prophylaxe der GvHD In Abhängigkeit der Konditionierung erfolgt die Prophylaxe der GvHD.

Myeloablative Konditionierung Zur Vorbeugung der Entstehung einer GvHD wird bei familiär-allogen transplantierten

Patienten ab Tag-1 Cyclosporin A (2 x 3 mg/kg KG) und Methotrexat (am Tag+1 15mg/m2

KO und an den Tagen +3 und +6 10mg/m2 KO) verabreicht. Ab Tag 0 wird Cyclosporin A

mit einem Zielspiegel von 250-300 mg/l i.v. dosiert, bei stabilen Spiegeln und fehlender

Kontraindikation ist eine Umstellung auf perorale Gabe möglich. Eine individuelle

Anpassung der Cyclosporin A-Zielspiegels an die jeweils individuelle Situation des Patienten

(z.B. Niereninsuffizienz, Krankheitsprogress) erlaubt Abweichungen von dieser Norm. Das

Cyclosporin A soll ab Tag +100 nach Tranplantation ausgeschlichen werden, ein

vollständiger Verzicht auf Immunsuppression wird bis zum Tag 180 angestrebt. Dies gilt

allerdings nur, sofern keine signifikante GvHD vorliegt. Bei Kontraindikationen gegenüber

Cyclosporin A oder Methotrexat kann auch Prednison zur Immunsuppression gegeben

werden.

133

Non-myeloablative Konditionierung Zur GvHD-Prophylaxe wird bei non-myeloablativer Konditionierung ab Tag-1 Cyclosporin A

(2 x 3 mg/kg KG) mit einem Zielspiegel von 300-400 mg/l appliziert. Zusätzlich erhalten die

Patienten ab Tag 0 Mycophenolat Mofetil (MMF) in einer Dosierung von 3x15 mg/kg. Sofern

keine GvHD auftritt, gelten folgende Vorgaben für die Immunsuppression: Im Fall eines

Familienspenders wird MMF am Tag 28 abgesetzt, Cyclosporin A ab Tag 35 ausgeschlichen.

Bei Fremdspendertransplantation wird MMF ab Tag 56 ausgeschlichen und bis Tag 100

abgesetzt, Cyclosporin A wird ab Tag 100 ausgeschlichen.

Ein vollständiger Verzicht auf Immunsuppression wird in beiden Fällen bis Tag 180

angestrebt.

9.2 Übersicht über die Patienten Patient Gschl. Alter Grunderkrankung Spender HLA Konditionierung Spende

AS74 w 30 AML M2 Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

BA51 m 53 AML M4 Bruder ident myelo-ablativ PBSC

BB43 m 61 M. Myelom IgG Kappa IIA Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

BH47 m 57 M. Myelom IgG Kappa IIIA fremd ident non-myelo-ablativ KM

BH53 m 51 AML M6 Bruder ident myelo-ablativ PBSC

BJ50 m 54 M.Myelom Lambda III A Tochter MM im A-Locus non-myelo-ablativ PBSC

BK80 w 24 AML M4 Bruder ident myelo-ablativ PBSC

BM65 e 39 Aplastische Anämie Bruder ident ATG+

Cyclophosphamid

PBSC

DD63 m 41 CLL (B-Zell-Typ) Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

DL40 w 64 M. Myelom IgG Lambda IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

EH51 m 53 B-NHL IIB fremd ident myelo-ablativ KM/PBSC

FK46 m 58 M. Myelom IgG Lambda IIIA Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

GB60 m 44 M. Myelom IgG Lambda IIIA fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

GH56 m 48 CML (Ph+) Schwester MM im C-Locus myelo-ablativ PBSC

GH58 m 46 M. Myelom IgG Lambda IIIA Bruder MM im A-Locus non-myelo-ablativ PBSC

GM74 m 30 MDS fremd ident myelo-ablatic PBSC

HC51 w 53 M. Myelom IgA Lambda IIIB fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

HH47 m 57 M. Myelom IgG Lambda IIIA Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

HM61 m 43 M Hodgkin IIIA fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

HM67 w 47 Osteomyelofibrose Schwester ident myelo-ablativ PBSC

HS66 m 38 c-ALL (Ph+) fremd ident myelo-ablativ PBSC

JT60 m 44 M Myelom IgA Kappa IA fremd MM im C- und

DRB1-Locus

non-myelo-ablativ PBSC

134

Patient Gschl. Alter Grunderkrankung Spender HLA Konditionierung Spende

JU58 w 46 AML M4 Bruder MM im DR-/

DQ-Locus

myelo-ablativ PBSC

KA81 m 23 Aplastische Anämie fremd ident ATG/Cyclosporin PBSC

KC41 w 62 sek. AML aus MDS (5q-del) Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

KE49 m 55 B-NHL IIIA Bruder MM im A-Lokus non-myelo-ablativ PBSC

KG39 w 64 M. Myelom IgG Kappa IIIA fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

LS64 w 40 M. Myelom IgG Kappa IIIA fremd MM im C-Locus non-myelo-ablativ PBSC

MG60 m 44 AML,M0/M1 Schwester MM im C-Locus myelo-ablativ PBSC

MH40 m 64 M. Myelom IgG Lambda IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

MK52 m 52 M. Myelom IgG Kappa IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

MM63 m 41 M.Myelom IgA Lambda IIIA Schwester ident non-melo-ablativ PBSC

MR43 w 61 M. Myelom

Typ BJ-Lambda IIIA

fremd MM im C-Locus non-myelo-ablativ PBSC

MT73 w 31 B-NHL IV fremd ident non-myelo-ablativ KM

MW44 w 59 M. Myelom IgG Kappa IIIA fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

OJ58 m 45 M. Myelom IgG Lambda IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

PA83 m 21 AML Schwester ident myelo-ablativ PBSC

PE73 m 30 lymphoblastisches T-NHL Schwester ident myelo-ablativ PBSC

SH39 m 65 M. Myelom IgA Kappa I Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

SH47 m 56 M. Myelom IgG Lambda IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

SM40 w 64 M. Myelom

Typ BJ-Lambda IIIA

Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

SS69 w 36 AML M4 fremd MM in C- und

DRB1

myelo-ablativ PBSC

ST60 m 44 M.Myelom IgG Kappa III A fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

ST66 m 38 AML M4 Bruder ident myelo-ablativ PBSC

TI49 w 54 C-ALL Schwester ident myelo-ablativ PBSC

WC57 w 47 M. Myelom BJ-Kappa IIIA fremd ident non-myelo-ablativ KM

WD58 m 46 Mantelzell-Lymphom IVA fremd ident non-myelo-ablativ PBSC

WG46 w 58 M. Myelom IgG Kappa IIIA Schwester ident non-myelo-ablativ PBSC

WH44 m 60 CD4+/CD5+Leukemia cutis Bruder ident non-myelo-ablativ PBSC

WU62 m 42 AML Schwester ident myelo-ablativ PBSC

ZK50 m 54 B-NHL Gross

cousine

MM im B- und

C-Locus

non-myelo-ablativ PBSC

Patienten alphabetisch geordnet

MM = Mismatch in einem HLA-Locus zwischen Empfänger und Spender PBSC = periphere Blutstammzelltransplantation KM = Knochenmarktransplantation ATG = Anti-Thymozyten-Globulin

135

9.3 Verlauf der Patienten

9.3.1 Patienten mit mehr als 6 Messzeitpunkten BA 51

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M4 Beobachtungszeitraum: Tag –34 bis Tag +43 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +14 Mukositis Tag +18 bis +20 Diarrhoe

akute GvHD der Haut, histologischer Grad: I Differentialdiagnose: allergische Reaktion

Tag +31 bis +43 Infekt des Hickman-Katheters Fieber mit Nachweis von Mycobacterium chelonae

Muskositis

GvHD Haut

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 -30 -10 10 30 50 70


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l

Enzymaktivität Arginase CRP

136

BB 43

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIA Beobachtungszeitraum: Tag –28 bis Tag +192 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF ab Tag +11: akute GvHD der Haut, klinisch: Grad II Tag +36 bis Tag+ 170 Prednisontherapie Tag +56 bis Tag +90 CMV-Reaktivierung Tag +110 bis Tag +140 CMV-Reaktivierung ab Tag +156 CMV-Reaktivierung Tag+192 fieberhafter Infekt

GvHD Haut

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-80 -30 20 70 120 170 220


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l

Enzymaktivität Arginase CRP Prednison

GvHD HautFieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-80 -30 20 70 120 170 220


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA

IL-8 RNA Arginase RNA

Korrelation IL-8- / Arginase-RNA

0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

137

BH 47

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +71 bis Tag + 328 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF bis Tag +237 Prednison-Therapie Tag +94 Ende der MMF-Therapie Tag +121 bis Tag +180 chronische GvHD der Leber Tag +130 Ende der CsA-Therapie

Beginn der FK 506-Therapie Tag+173 Diarrhoe ab Tag +180 kardiale Dekompensation

GvHD Leber

kardiale Dekompensation

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

100 150 200 250 300 350


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Leberkardiale

Dekompensation

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

100 150 200 250 300 350


IL-8

RN

A

0

50

100

150

200

250

300

350

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 50 100 150 200 250 300 350

Arginase RNA

IL-8

RN

A

138

BH 53

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M6 Beobachtungszeitraum: Tag + 28 bis Tag +349 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +75 Fieberspitzen nach Manipulation am Hickman-Katheter Tag + 87 Explantation des Hickman-Katheters mit

Nachweis von Corynebacterium jeikejum Tag +140 Beginn der CsA-Reduktion Tag +148 Ende der CsA-Therapie ab Tag 160 chronische GvHD der Mundschleimhaut ab Tag +217 Beginn der CsA-Therapie Tag +217 bis Tag +347 Prednisontherapie

FieberGvHD MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

-40 10 60 110 160 210 260 310 360


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


Fieber GvHD MSH

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-40 60 160 260 360


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

139

BJ 50

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ Lambda Stadium III A Beobachtungszeitraum: Tag –4 bis Tag + 128 Immunsuppressive Prophylaxe:: CsA und MMF Tag +10 Diarrhoe mit Nachweis von Norwalk-Virus Tag +30 bis Tag + 40 akute GvHD des Darms Tag +30 bis Tag + 80 akute GvHD der Haut Tag +32 bis Tag +108 Prednisontherapie Tag +44 bis Tag +56 CMV-Reaktivierung Tag +56 Beginn der Reduktion MMF-Therapie Tag +86 Ende der MMF-Therapie Tag +100 bis Tag +115 respiratorischer Infekt Tag +130 Beginn der CsA-Reduktion

GvHD DarmGvHD Haut

respiratorischer Infekt

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD DarmGvHD Haut

respiratorischer Infekt

0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

140

BK 80

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M4 Beobachtungszeitraum: Tag -8 bis Tag +332 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +28 bis + 56 Anämie aufgrund reduziert ausreifende linksverschobene

Erythropoese Tag +100 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie ab Tag + 140 chronische GvHD der Leber Tag +149 Ende der CsA-Therapie Tag +195 bis Tag +248 Prednison Therapie Tag +220 Beginn der CsA-Therapie

GvHD Leber

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-40 10 60 110 160 210 260 310 360


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Leber

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-40 60 160 260 360


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

141

DD 63

Grunderkrankung: chronisch-lymphatische Leukämie Beobachtungszeitraum: Tag +161 bis Tag + 391

0

500

1000

1500

2000

2500

150 200 250 300 350 400


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


0

500

1000

1500

2000

2500

150 200 250 300 350 400


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

142

FK 46

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: +239 bis +408 bis Tag +260 Prednison-Therapie ab Tag +345 chronische GvHD der Mundschleimhaut Tag +355 bis Tag +365 Infekt mit Fieber, atypische Pneumonie ab Tag +386 chronische allgemeine GvHD (Fieber, Husten

Ödeme an Händen und Füßen) ab Tag + 397 Prednison-Therapie

GvHD MSH

Pneumonie

GvHD

0

500

1000

1500

2000

2500

220 270 320 370 420


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD MSHPneumonie

GvHD

0

500

1000

1500

2000

2500

220 270 320 370 420


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

143

GB 60

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: +150 bis +295 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA durchgehend mehrmalige CMV-Reaktivierung durchgehend Prednison-Therapie ab Tag +150 chronische GvHD der Mundschleimhaut Tag +150 bis Tag +165 chronische GvHD der Haut ab Tag +164 chronische GvHD des Darms histologischer Grad: I Tag +166 Endokarditis mit Nachweis von Staphylococcus epidermidis ab Tag +218 Verschlechterung der Darm-GvHD

GvHD MSHGvHD Haut

GvHD DarmEndokarditis

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

130 150 170 190 210 230 250 270 290 310


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD MSHGvHD Haut

GvHD DarmEndokarditis

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

130 180 230 280


IL-8

RN

A

0

50

100

150

200

250

300

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200 250 300

Arginase RNA

IL-8

RN

A

144

GH 56

Grunderkrankung: chronisch-myeloische Leukämie Beobachtungszeitraum: Tag –27 bis Tag + 279 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag + 50 bis Tag +80 akute GvHD des Darmes, histologischer Grad: II und GvHD

der Haut, histologischer Grad: I, klinischer Gesamtgrad III ab Tag +65 progrediente akute GvHD der Leber Tag +62 bis Tag +124 Prednison-Therapie Tag + 73 Ende der CsA-Therapie

Beginn der FK 506-Therapie Tag +95 Progress Tag +126 Beginn der Reduktion des FK 506 Tag + 148 Ende der FK 506-Therapie Tag +163 bis Tag+173 chronische GvHD des Darms, histologischer Grad: III und

chronische GvHD der Haut Tag + 164 Beginn der FK 506-Therapie ab Tag +164 Prednison-Therapie ab Tag +188 chronische GvHD des Mundschleimhaut Tag +255 bis Tag +262 Pneumonie Tag +260 Beginn der MMF-Therapie

GvHD Haut/DarmGvHD Leber

GvHD Haut/DarmGvHD MSH

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

-50 0 50 100 150 200 250 300


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut/Darm

GvHD Leber

GvHD Haut/Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200 250 300


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

145

GH 58

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +108 bis Tag +387 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +100 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag + 117 bis Tag +128 chronische GvHD der Haut, klinischer Grad: I Tag + 204 Ende der CsA-Therapie ab Tag +250 chronische limitierte GvHD der Haut und Schleimhaut

GvHD Haut

GvHD Haut/MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

90 140 190 240 290 340 390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


GvHD Haut

GvHD Haut/MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

90 140 190 240 290 340 390


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

146

GM 74

Grunderkrankung: myelodysplastisches Syndrom Beobachtungszeitraum: Tag +24 bis Tag +310 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +31 bis Tag +50 akute GvHD der Haut, klinischer Grad: II Tag +50 bis Tag +70 intermittierend Fieber

Verdacht auf. Infekt des Hickman-Katheters; nach Explantation des Katheters bleiben Fieberschübe bestehen

Tag +56 Ende der MMF-Therapie Tag +66 bis Tag +92 Prednison-Therapie aufgrund Fieberschübe unklarer Genese Tag +93 bis Tag +110 erneut Fieberschübe unklarer Genese

Verdacht auf beginnende GvHD Tag +105 grampositive Kokken im Blut nachweisbar Tag +105 bis Tag +113 Prednison-Therapie Tag +125 Beginn der Reduktion des CsA Tag +190 Ende der CsA-Therapie ab Tag +280 chronische GvHD der Mundschleimhaut

GvHD Haut

FieberFieber

GvHD MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

-20 30 80 130 180 230 280 330


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD HautFieber Fieber

GvHD MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-20 30 80 130 180 230 280 330


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

147

HC 51

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgA Lambda Stadium IIIB Beobachtungszeitraum: Tag +110 bis +405 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA bis Tag +202 chronische GvHD der Haut Tag +70 bis Tag +121 Prednison-Therapie Tag +105 bis Tag +115 chronische GvHD des Darms, histologischer Grad: I Tag +142 bis Tag +165 chronische GvHD des Darms Tag +153 bis Tag +215 Prednison-Therapie Tag +186 bis Tag +210 CMV-Reaktivierung Tag +248 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +309 Ende der CsA-Therapie

GvHD Haut

GvHD Darm

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

90 140 190 240 290 340 390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD HautGvHD Darm

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

90 140 190 240 290 340 390


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

148

HH 47

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +100 bisTag +196 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +95 Progress der Grunderkrankung Tag +100 Beginn der CsA-Reduktion Tag + 136 Ende der CsA-Therapie Tag +151 Beginn der Thalidomid-Therapie Tag +157 bis Tag + 168 Dexamethason-Therapie Tag +158 Fieber, Diarrhoe Tag +168 bis Tag +171 Chemotherapie nach dem VAD-Schema Tag +178 Sepsis, Fieber Tag +193 bis Tag +198 Prednison-Therapie Tag +205 Exitus letalis durch fortschreitende Grunderkrankung in der

Kachexie

ProgressFieber

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

80 100 120 140 160 180 200 220


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

50

100

150

200

250

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


ProgressFieber Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

80 100 120 140 160 180 200 220


IL-8

RN

A

0100200300400500600700800900

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 200 400 600 800 1000

Arginase RNA

IL-8

RN

A

149

HM 61

Grunderkrankung: Morbus Hodgkin Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +191 bis Tag +358 Immunsuppressive Prophylaxe: FK 506 durchgehend chronische GvHD der Haut, histologischer Grad: I-III bis Tag + 280 Herpes-simplex-Infektion ab Tag +191 Prednison-Therapie Tag + 198 Ende der FK 506-Therapie Tag + 200 bis Tag + 275 hämolytisch-urämisches Syndrom (Plasmapheresen) Tag +255 bis Tag +265 interstitielle Pneumine, Fieber

GvHD Haut

hämolytisch-urämisches Syndrom

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut

hämolytisch-urämisches Syndrom

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

180 230 280 330 380


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

150

HM 67

Grunderkrankung: Osteomyelofibrose Beobachtungszeitraum: Tag –35 bis Tag +84 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +12 bis Tag +16 Mukositis Tag +21 bis Tag +37 CMV-Reaktivierung Tag +51 bis Tag +69 CMV-Reaktivierung

Mukositis

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


Mukositis

0

500

1000

1500

2000

2500

-90 -40 10 60 110


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

151

HS 66

Grunderkrankung: akute lymphatische Leukämie Beobachtungszeitraum: Tag –21 bis Tag + 246 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +31 bis Tag +70 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: III Tag +31 bis Tag +118 Prednison-Therapie Tag +42 bis Tag +91 CMV-Reaktivierung Tag +45 bis Tag +60 akute GvHD des Darms histologischer Grad IV Tag +49 Beginn der MMF-Therapie Tag 51 bis Tag + 53 Pentostatin-Therapie Tag +65 Beginn der Reduktion der MMF-Therapie Tag +77 bis Tag +82 CMV-Kolitis Tag +125 Übelkeit, Verdacht auf GvHD des Magens Tag + 125 bis Tag +197 Prednison-Therapie Tag +140 bis Tag +180 CMV-Reaktivierung Tag +168 Ende der MMF-Therapie

GvHD Haut

GvDH Darm

CMV-Kolitis

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 0 50 100 150 200 250


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD HautGvDH Darm

CMV-Kolitis

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 20 70 120 170 220 270


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

152

JT 60

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgA Kappa Stadium IA Beobachtungszeitraum: Tag -13 bis Tag+84 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +14 bis Tag +30 CMV-Reaktivierung Tag +36 bis Tag +70 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: II ab Tag +40 Prednison-Therapie ab Tag +75 CMV-Reaktivierung

GvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 -10 10 30 50 70 90 110


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 -10 10 30 50 70 90 110


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

153

JU 58

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M4 Beobachtungszeitraum: Tag –21 bis Tag + 246 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +16 bis Tag +22 akute respiratorische Verschlechterung

Pneumonie mit respiratorischer Dekompensation DD: immunologische Pneumopathie

Tag +16 bis Tag +81 Prednisontherapie Tag +30 bis Tag +70 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: I Tag +120 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag + 140 Ende der CsA-Therapie

PneumonieGvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-80 -30 20 70 120 170 220 270 320


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

50

100

150

200

250

300

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


PneumonieGvHD Haut

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-80 20 120 220 320


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

154

KC 41

Grunderkrankung: sekundäre akut lymphatische Leukämie aus myelodysplastischem Syndrom

Beobachtungszeitraum: Tag +31 bis Tag + 199 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA ab Tag +80 Rezidiv der akuten lymphatischen Leukämie Tag +102 Ende des CsA-Therapie Tag +155 bis Tag +212 Pneumonie

Rezidiv

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


155

KE 49

Grunderkrankung: Non-Hodgkin-Lymphom Stadium III A Beobachtungszeitraum: Tag +31 bis Tag +149 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +35 Beginn der Reduktion des CsA ab Tag +49 Progress des Lymphoms Tag +66 Ende der CsA-Therapie ab Tag +133 chronische GvHD der Haut , histologisch Grad I

Progress

GvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 0 50 100 150


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


ProgressGvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-80 -30 20 70 120 170


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

156

LS 64

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +78 bis Tag +394 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +104 bis Tag +140 chronische GvHD des Darms, histologischer Grad II Tag +109 bis Tag +202 Prednison-Therapie Tag +120 bis Tag +155 CMV-Reaktivierung Tag +167 bis Tag+202 CMV-Reaktinvierung Tag +244 fieberhafter Infekt Tag +253 Beginn der Reduktion des CsA Tag +261 bis Tag +300 CMV-Reaktivierung Tag +261 bis Tag +321 chronische GvHD der Leber Tag +265 Ende der CsA-Therapie ab Tag +275 chronische GvHD der Mundschleimhaut und Haut

histologischer Grad: II Tag +290 Progress des multiplen Myeloms ab Tag +293 Prednison-Therapie Tag +315 bis Tag +350 CMV-Reaktivierung Tag +380 Beginn einer FK 506-Therapie

GvHD DarmFieber

GvHD Leber

GvHD Haut/MSHProgress

0

500

1000

1500

2000

2500

60 110 160 210 260 310 360


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD DarmFieber

GvHD Leber

GvHD Haut/MSH

Progress

0

500

1000

1500

2000

2500

60 110 160 210 260 310 360


IL-8

RN

A

050100150200250300350400450500

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 100 200 300 400 500

Arginase RNA

IL-8

RN

A

157

MG 60

Grunderkrankung: akute lymphatische Leukämie M0/M1 Beobachtungszeitraum: Tag –35 bis +135 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +4 Infekt des Hickman-Katheters Tag +8 bis Tag +12 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: I

Differentialdiagnose: Arzneimittelreaktion Tag +50 bis Tag +57 Cholezystitis Tag +57 Cholezystektomie Tag +60 bis Tag +90 Fieber, Bauchwandphlegmone an Operationswunde Tag +85 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +110 Ende der CsA–Therapie

GvHD Haut

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

50

100

150

200

250

300

CR

P in mg/l


GvHD HautFieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 0 50 100 150


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

158

MH 40

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIA Beobachtungszeitraum: Tag +210 bis Tag +364 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA durchgehend chronische GvHD der Haut und Mundschleimhaut bis Tag +210 Prednison-Therapie Tag +239 bis Tag +259 Gastritis ab Tag +338 Beginn der Prednison-Therapie

GvHD Haut/MSHGastritis

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut/MSH

Gastritis

0

500

1000

1500

2000

2500

190 240 290 340 390


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

159

MK 52

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +212 bis Tag +364 Tag +238 bis Tag +252 fieberhafter Infekt des Sternoclaviculargelenks ab Tag +268 chronische GvHD der Mundschleimhaut Tag +320 bis Tag +330 atypische Pneumonie beidseits, Fieber

Fieber

GvHD MSH

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

+210 +230 +250 +270 +290 +310 +330 +350 +370 +390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


FieberGvHD MSH

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

+210 +260 +310 +360


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

160

MM 63

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgA Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag -35 bis Tag +208 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag + 28 Ende der MMF-Therapie Tag + 44 bis Tag +50 Übelkeit und Erbrechen, akute GvHD des Darms Tag +48 bis Tag +61 Prednison-Therapie Tag +52 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie ab Tag +110 chronische GvHD der Mundschleimhaut ab Tag +163 Prednison-Therapie

GvHD DarmGvHD MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

-70 -20 30 80 130 180 230


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Darm GvHD MSH

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-20 30 80 130 180 230


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

161

MR 43

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ Bence Jones Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag –6 bis Tag +302 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +11 bis Tag +15 Diarrhoe mit Nachweis von Rotaviren Tag +24 bis Tag +28 Fieber, Übelkeit, Erbrechen Tag +40 Beginn der Reduktion der MMF-Therapie Tag +59 bis Tag +73 CMV-Reaktivierung Tag +86 Ende der MMF-Therapie Tag +94 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +135 bis Tag +142 Bronchitis, Fieber Tag +150 bis Tag +177 chronische GvHD der Mundschleimhaut Tag +190 Ende der CsA-Therapie ab Tag +275 fieberhafter Infekt der oberen Atemwege

FieberFieber

GvHD MSH

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-70 -20 30 80 130 180 230 280 330


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


Fieber FieberGvHD MSH

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-20 30 80 130 180 230 280 330


IL-8

RN

A

0

100

200

300

400

500

600

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 100 200 300 400 500 600

Arginase RNA

IL-8

RN

A

162

MW 44

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +107 bis Tag +422 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +163 Ende der CsA-Therapie Tag + 197 bis Tag + 205 chronische GvHD des Darms, histologischer Grad III Tag +199 bis Tag +310 Prednison-Therapie Tag +202 Beginn der CsA-Therapie Tag +203 bis Tag +253 CMV-Reaktivierung Tag +250 bis Tag +260 Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Muskel und

Gelenksschmerzen

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

90 140 190 240 290 340 390 440


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

90 190 290 390


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

163

OJ 58

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +58 bis Tag + 366 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA ab Tag +81 akute GvHD der Haut und Mundschleimhaut Tag +196 bis Tag +199 Verdacht auf GvHD der Lunge

Prednison-Therapie (nicht erfasst) ab Tag +280 Progress des multiplen Myelom Tag +280 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +310 Ende der CsA-Therapie ab Tag +361 Prednison-Thearpie

GvHD Haut/MSH

Progress

0

500

1000

1500

2000

2500

40 90 140 190 240 290 340 390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut/MSH

Progress

0

500

1000

1500

2000

2500

40 90 140 190 240 290 340 390


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

164

PA 83

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie Beobachtungszeitraum: Tag –26 bis Tag + 188 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +18 bis Tag +27 Diarrhoe, Gastroenteritis mit Nachweis von Norwalk-Virus Tag +19 bis Tag +24 Fieberschübe durch Sepsis mit Staphylococcus haemolyticus Tag +93 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +100 Ende der CsA-Therapie ab Tag +121 chronische GvHD der Leber ab Tag +131 Prednison-Therapie ab Tag +141 Beginn der CsA-Therapie

FieberGvHD Leber

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-40 10 60 110 160 210


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


Fieber GvHD Leber

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

-40 10 60 110 160 210


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

165

SH 39

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgA Kappa Stadium I Beobachtungszeitraum: Tag –19 bis Tag +206 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +28 Ende der MMF-Therapie Tag +42 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: I Tag +43 bis Tag +100 Prednison-Therapie Tag +77 Diarrhoe, akute GvHD des Darms Tag +122 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie Tag +206 Ende der CsA-Therapie

GvHD Haut

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

-70 -20 30 80 130 180 230


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD HautGvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

-70 -20 30 80 130 180 230


IL-8

RN

A

0

50

100

150

200

250

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200 250

Arginase RNA

IL-8

RN

A

166

SH 47

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag –4 bis Tag +317 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +17 bis Tag +29 Weichteilinfekt, Fieber Tag +25 bis Tag +55 CMV-Reaktivierung Tag +31 bis Tag +55 akute GvHD der Haut, histologisch Grad II-III Tag +33 bis Tag +79 Prednison-Therapie Tag +80 bis Tag +100 CMV-Reaktivierung Tag +84 Ende der MMF-Therapie Tag +107 chronische GvHD der Haut Tag +107 bis Tag +164 Prednison-Therapie Tag +129 Infekt der Atemwege ab Tag +161 chronische GvHD der Mundschleimhaut Tag +227 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie ab Tag +315 Infekt der Atemwege

Fieber

GvHD Haut

GvHD HautAtemwegsinfekt

GvHD MSHAtemwegsinfekt

0

500

1000

1500

2000

2500

-60 -10 40 90 140 190 240 290 340


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


FieberGvHD Haut

GvHD HautAtemwegsinfektGvHD MSHAtemwegsinfekt

0

500

1000

1500

2000

2500

-60 40 140 240 340


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

167

ST 60

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIA Beobachtungszeitraum: Tag –33 bis Tag +218 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag + 55 bis Tag + 72 akute GvHD der Mundschleimhaut und Haut,

histologischer Grad: II Tag +66 Beginn der Reduktion der MMF-Therapie Tag +66 bis Tag +104 Prednison-Therapie Tag +111 Ende der MMF-Therapie Tag +140 Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +197 Ende der CsA-Therapie

GvHD Haut/MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

-60 -10 40 90 140 190 240


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut/MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

-60 -10 40 90 140 190 240


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

168

ST 66

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M4 Beobachtungszeitraum: Tag –33 bis Tag +259 Immunsuppressive Prophylaxe CsA Tag +6 Infekt des Hickman-Katheters mit Nachweis von Pseudomonas

aeroginosa Tag +45 bis Tag +50 Fieber, Verdacht auf Infekt des Hickman-Katheters Tag +106 Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +117 Ende der CsA-Therapie ab Tag +157 chronische GvHD der Haut, histologischer Grad: II ab Tag +190 chronische GvHD der Leber und Mundschleimhaut ab Tag +190 Beginn der CsA-Therapie ab Tag +198 Prednison-Therapie ab Tag +230 intestinaler Herpes-zoster-Infekt

chronische GvHD des Magens, histologischer Grad: III (Diagnose fraglich)

Fieber

GvHD Haut

GvHD Leber/MSH

GvHD Magen

0

500

1000

1500

2000

2500

-70 -20 30 80 130 180 230 280


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


FieberGvHD Haut

GvHD Leber/MSH

GvHD Magen

0

500

1000

1500

2000

2500

-70 -20 30 80 130 180 230 280


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

169

TI 49

Grunderkrankung: akute lymphatische Leukämie Beobachtungszeitraum: Tag –4 bis Tag +118 Immunsuppressive Prophylaxe CsA Tag +7 bis Tag +22 CMV-Reaktivierung Tag +60 Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +75 Fieber, Infekt des Hickman-Katheters Tag +100 Ende der CsA-Therapie ab Tag +111 chronische GvHD der Haut

Fieber

GvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-20 0 20 40 60 80 100 120 140


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


FieberGvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60 80 100 120 140


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

170

WD 58

Grunderkrankung: Mantelzell-Lymphom Stadium IVA Beobachtungszeitraum: Tag -35 bis Tag +188 Immunsuppressive Prophylaxe CsA und MMF Tag +48 bis Tag +56 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: I

Differentialdiagnose: Allergie Tag +57 Beginn der Reduktion der MMF-Therapie Tag +100 Ende der MMF-Therapie

Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +180 Ende der CsA–Therapie

GvHD Haut

0

500

1000

1500

2000

2500

-90 -40 10 60 110 160 210


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


GvHD Haut

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-40 10 60 110 160 210


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

171

WG 46

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum Tag –27 bis Tag +141 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +15 bis Tag +36 CMV-Reaktivierung Tag + 33 Ende der MMF-Therapie Tag +35 Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +57 Ende der CsA–Therapie ab Tag +57 bis Tag +94 hämolytisch-urämisches Syndrom

täglich Plasmapheresen Tag +57 bis Tag +127 Prednison-Therapie Tag +110 bis Tag +120 interstitielle Pneumonie

Hämolytisch-urämisches Syndrom

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 0 50 100 150


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


Hämolytisch-urämisches

Syndrom

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

-50 0 50 100 150


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

172

WH 44

Grunderkrankung: CD4+/CD5+Leukemia cutis Beobachtungszeitraum Tag -36 bis Tag +167 Immunsuppressive Prophylaxe CsA ab Tag +20 Prednison-Therapie Tag +20 bis Tag +35 akute GvHD der Haut, histologischer Grad: II Tag +95 bis Tag +100 Infektion des Hickman-Katheters mit Fieber Tag +97 Beginn der Reduktion der CsA–Therapie Tag +115 Ende der CsA–Therapie Tag +127 bis Tag +135 Enteritis mit Nachweis von Yersinia ab Tag +127 chronische GvHD des Darms, histologischer Grad: III Tag +133 Beginn der FK 506-Therapie Tag +139 bis Tag +141 Pentostatin-Therapie Tag +160 bis Tag +162 Pentostatin-Therapie Tag +162 Beginn der Reduktion der FK 506-Therapie

Beginn der MMF-Therapie ab Tag +163 CMV-Reaktivierung

GvHD Haut

Fieber

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 20 70 120 170


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD HautFieber

GvHD Darm

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-30 20 70 120 170


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

173

WU 62

Grunderkrankung: sekundäre akute myeloische Leukämie aus myelodysplastischen Syndrom

Beobachtungszeitraum: Tag –19 bis Tag +308 Immunsuppressive Prophylaxe CsA Tag +21 Fieber Tag +100 Beginn der Reduktion der CsA –Therapie Tag +154 Ende der CsA-Therapie ab Tag +210 Rezidiv des myelodysplastischen Syndrom ab Tag +235 chronische GvHD der Leber und der Haut ab Tag +239 Prednison-Therapie Tag +279 bis Tag +285 respiratorischer Infekt

Fieber Rezidiv

GvHD Leber/Haut

Respiratoricher Infekt

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-50 0 50 100 150 200 250 300


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


Fieber Rezidiv

GvHD Leber/Haut

Respiratoricher Infekt

0500

10001500200025003000350040004500

-30 20 70 120 170 220 270 320


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0500

10001500200025003000350040004500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

174

9.3.2 Patienten mit 6 oder weniger Zeitpunkten AS 74

Grunderkrankung: akute myeloische Leukämie M2 Beobachtungszeitraum: Tag +238 bis Tag +306

0

500

1000

1500

2000

2500

220 240 260 280 300 320


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


BM 65

Grunderkrankung: aplastische Anämie Beobachtungszeitraum: Tag –11 bis Tag +67 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 -10 10 30 50 70 90


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


175

DL 40

Grunderkrankung: multiples Myelom IgG Typ Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +127 bis Tag+177 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +120 Progress der Grunderkrankung Tag +133 Ende der CsA-Therapie ab Tag +140 limitierte chronische GvHD der Mundschleimhaut

Progress

GvHD MSH

0

500

1000

1500

2000

2500

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l

Enzymaktivität Arginase CRP KA 81

Grunderkrankung: aplastische Anämie Beobachtungszeitraum: Tag +18 bis Tag + 127 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +25 Fieber, Verdacht auf viralen Infekt Tag +36 bis Tag +55 CMV-Reaktivierung

Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

-10 10 30 50 70 90 110 130 150


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


176

EH 51

Grunderkrankung: diffus-grosszelliges B-Non-Hodgkin-Lymphom Stadium II BBeobachtungszeitraum: Tag -20 bis Tag+109 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA Tag +23 Verdacht auf Pilzpneumonie Tag +27 Knochenmarkspunktion:keine ortsständige Hämatopoese

nachgewiesen Tag +40 Nachweis von Staphylokokken in Blutkultur Tag +50 Ende der CsA-Therapie Tag +51 bis Tag + 82 Methylprednisolon-Therapie Tag +53 bis Tag + 76 Konditionierung mit OKT3 Tag + 57 Retransplantation ab Tag +75 CMV-Reaktivierung Tag +77 Beginn der CsA-Therapie ab Tag + 82 Prednison-Therapie Tag +110 Verdacht auf atypische Pneumonie

Differentialdiagnose: Pilzpneumonie, virale Pneumonie Tag +117 Exitus letalis in kardiorespiratorischer Insuffizienz

Pneumonie

0

500

1000

1500

2000

2500

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


177

KG 39

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ IgG Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag +25 bis Tag +111 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA durchgehend akute GvHD der Haut

akute GvHD des Darmes, histologischer Grad: II durchgehend Prednison-Therapie Tag +45 Beginn der Reduktion der CsA-Therapie ab Tag +99 akute GvHD der Leber, klinischer Grad: IV ab Tag +100 Progress der Grunderkrankung Tag +116 Exitus letalis durch steroidrefraktäre GvHD von Leber

und Darm in kardiorespiratorischer Insuffizienz

GvHD Haut/Darm

GvHD Leber

Progress

0

500

1000

1500

2000

2500

70 80 90 100 110 120 130 140


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

50

100

150

200

250

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


GvHD Haut/Darm

GvHD LeberProgress

0

500

1000

1500

2000

2500

20 40 60 80 100 120 140


IL-8

RN

A

020406080100120140160180200

Arginase R

NA



0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200

Arginase RNA

IL-8

RN

A

178

MT 73

Grunderkrankung: diffus grosszelliges B-Non-Hodgkin-Lymphom Stadium IV Beobachtungszeitraum: Tag –27 bis Tag +30 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF Tag +54 Exitus letalis in kardiorespiratorischer Insuffizienz

0

500

1000

1500

2000

2500

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l

Enzymaktivität Arginase CRP PE 73

Grunderkrankung: lymphoblastisches T-Non-Hodgkin-Lymphom Beobachtungszeitraum: Tag +14 bis Tag +56 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA durchgehend Progress Tag +14 Fieber ohne Erregernachweis ab Tag +18 akute GvHD der Leber, histologisch Grad III ab Tag +24 Prednison-Therapie Tag +35 Ende der CsA-Therapie Tag +35 Beginn der FK 506-Therapie Tag +86 Exitus letalis durch Progress bei nicht beherrschbarer GvHD der

Leber

Progress

GvHD Leber

0

500

1000

1500

2000

2500

0 10 20 30 40 50 60 70 80


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


179

SM 40

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ Bence-Jones-Lambda Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag –27 bis Tag +32 Immunsuppressive Prophylaxe: CsA und MMF durchgehend Progress des multiplen Myeloms Tag +22 Ende der MMF-Therapie ab Tag + 31 Prednison-Therapie Tag +40 Exitus letalis bei progredientem multiplem Myelom

Progress

0

500

1000

1500

2000

2500

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l

Enzymaktivität Arginase CRP Prednison SS 69

Grunderkrankung: akute lymphatische Leukämie M4 Beobachtungszeitraum: Tag +261 bis Tag +373 Immunsuppressive Prophylaxe: FK 506l durchgehend chronische GvHD der Haut und Mundschleimhaut Tag +237 bis Tag +311 Prednison-Therapie Tag +312 bis Tag + 325 Infekt des Hickman-Katheters mit Fieber

Pneumonie mit Nachweis von Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Enterkokken

Tag +335 Beginn der Reduktion der FK 506-Therapie Tag +345 Ende der FK 506-Therapie

GvHD Haut/MSH

Pneumonie/Fieber

0

500

1000

1500

2000

2500

250 270 290 310 330 350 370 390


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l


180

WC 57

Grunderkrankung: multiples Myelom Typ Bence-Jones-Kappa Stadium IIIA Beobachtungszeitraum: Tag –9 bis Tag +109 Immunsuppressive Prophylaxe CsA- und MMF Tag +2 bis Tag +18 Enteritis mit Nachweis von Rotaviren ab Tag +36 CMV-Reaktivierung

akute GvHD des Darms, histologischer Grad: II-III hämolytisch-urämisches Syndrom Prednison-Therapie

Tag +56 Ende der CsA-Therapie ab Tag +106 Pilzpneumonie mit Nachweis von Aspergillus-Galactomannan-

Antigen chronische GvHD der Leber, histologischer Grad: IV

Tag +118 Exitus letalis bei steroid-refraktärer GvHD des Darmes und der Leber sowie Pilzpneumonie

GvHD Darm

Hämolytisch-urämisches Syndrom

GvHD Leber

0

500

1000

1500

2000

2500

10 30 50 70 90 110 130


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Prednison in mg / C

RP in m

g/l

Enzymaktivität Arginase CRP Prednison ZK 50

Grunderkrankung: Non-Hodgkin-Lymphom Beobachtungszeitraum: Tag –41 bis Tag +53 Immunsuppressive Prophylaxe CsA ab Tag +14 CMV-Reaktivierung

0

500

1000

1500

2000

2500

-60 -40 -20 0 20 40 60 80


Enzy

mak

tivitä

t mU

/mg

Prot

ein

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CR

P in mg/l


181

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zur Regulation des Enzyms

Arginase in humanen Granulozyten“ selbständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden

folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

• Material und Geräte wurden von der Klinischen Kooperationseinheit Molekulare

Hämatologie und Onkologie am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg zur Verfügung gestellt.

• Sämtliche Blutentnahmen bei Patienten wurden durch Mitarbeiter der Medizinischen Klinik und Poliklinik 5 der Universität Heidelberg durchgeführt.

• Die Zellsortierung wurde von Manuel Scheuermann am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg durchgeführt.

• Die Quantifizierung der mRNA erfolgte von der Arbeitsgruppe Dr. Giese/ Institut für Immunologie, Universität Heidelberg.

• Die Referenzzellen wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

.......................................................................................................................................................

182

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. H.-J. Schuberth für seine Bereitschaft, dieses Thema von Hannover

aus zu betreuen sowie für seine Ratschläge und Anregungen.

Ein ganz besonders herzlicher Dank gilt Herrn Dr. Markus Munder für die hervorragende

Betreuung, die ständige Ansprechbarkeit, für seine Geduld und uneingeschränkte

Unterstützung, nicht zuletzt für seine positive motivierende Art, die mir das Verfassen dieser

Arbeit sehr erleichtert hat.

Weiter danke ich Herrn PD Martin Görner für die Bereitschaft, mir in der Kooperationseinheit

Molekulare Hämatologie und Onkologie (Medizinische Klinik und Poliklinik V der

Universität Heidelberg) am Deutschen Krebsforschungszentrum einen Arbeitsplatz zur

Verfügung zu stellen.

Auch bei Herrn Prof. A.D. Ho möchte ich mich für die Kooperation beim Aufbau der im

Rahmen dieser Arbeit ausgebauten Patienten-Materialdatenbank bedanken.

Herrn Dr. Thomas Giese danke ich für die mRNA-Quantifizierung der Patientenproben.

Bei Frau Claudia Luckner bedanke ich mich für die Anleitungen bei den ersten Schritten im

Labor sowie ihre Hilfsbereitschaft und Freundlichkeit.

Weiterhin möchte ich Herrn Markus Schneider, Herrn PD Dr. Johannes Schenkel, Frau Dr.

Svetlana Karakhanova, Herrn Michael Kirsch, Herrn Dr. Thomas Luft und Herrn Michael

Hess für die zahlreichen praktischen Ratschläge, entspannten Gespräche und aufmunternden

Worte danken.

Dank gilt auch Herrn Manuel Scheuermann für seine hervorragende Zellsortierung.

Vor allem möchte ich auch allen allogen transplantierten Patienten danken, die an dieser

Studie teilgenommen haben.

Dank gilt auch allen ärztlichen und nichtärztlichen Mitarbeitern der Poliklinik, die an der

Logistik der Probengewinnung beteiligt waren.

183

Weiter möchte ich mich auch bei Herrn Dr. M. Schwarz und Herrn Dr. U. Wendel

(Universitätsklinikum Düsseldorf) sowie Herrn Prof. Dr. F. Trefz (Kinderklinik Reutlingen)

bei der Mithilfe der Patientenrekrutierung von Arginase I-defizienten Patienten bedanken.

Philipp danke ich für seine Geduld und Liebe.

Meinen Eltern, Schwestern und Freunden danke ich für ihre Unterstützung und Anteilnahme.

Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in ...

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