Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Regulation
der jejunalen Calcium-Resorption beim Schaf
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Nina Mrochen
Mainz
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder
Physiologisches Institut
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2010
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHR 342/8-1)
unterstützt.
Für Lea
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht bzw. auf Tagungen
vorgestellt:
Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):
Gastrointestinal calcium (Ca) transport in sheep as affected by dietary Ca and treatment with
1.25-dihydroxyvitamin D3.
Poster: XIth International Symposium on Ruminant Physiology
06. - 09.09.2009 in Clermont - Ferrand
Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):
Effect of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 on macromineral homeostasis of sheep fed different
levels of calcium.
Poster: 14th Workshop on Vitamin D
04. - 08.10.2009 in Brügge
Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on calcium and phosphorus homeostasis in sheep fed
diets either adequate or restricted in calcium content.
Domestic Animal Endocrinology 38 (2010) 190 - 199
Mrochen, N., Wilkens, M., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum intestinalen Calcium-Transport beim
Schaf.
Vortrag: 19. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen
Veterinärmedizinischen Gesellschaft
14. - 16.02.2010 in Hannover
Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Gastrointestinal calcium transport in sheep as affected by calcitriol and dietary calcium
supply.
Vortrag: 14th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition
06. - 08.09.2010 in Zürich
Inhaltsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................... IV
Abbildungsverzeichnis....................................................................................... VI
Tabellenverzeichnis ............................................................................................ IX
1 Einleitung ............................................................................................ 1
1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase ............... 1
1.2 Mechanismen des intestinalen Ca2+-Transports ...................................... 3
1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport ............................................................... 4
1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport .............................................................. 4
1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle ..................... 4
1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin ...................................... 6
1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran .................................... 7
1.3 Regulation des intestinalen Ca2+-Transports ........................................... 8
1.4 Gastrointestinaler Ca2+-Transport beim Wiederkäuer ............................. 9
1.5 Zielsetzung ............................................................................................... 12
2 Material und Methoden ................................................................... 13
2.1 Material ..................................................................................................... 13
2.1.1 Tiere ................................................................................................... 13
2.1.2 Fütterung ............................................................................................ 13
2.1.3 Behandlung ......................................................................................... 14
2.1.4 Entnahme der Blutproben ................................................................... 15
2.1.5 Entnahme der Gewebeproben ............................................................ 16
2.2 Analytische Methoden ............................................................................. 16
2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben ................................. 16
2.2.1.1 Gesamtcalcium ................................................................................... 16
2.2.1.2 Phosphat ............................................................................................. 17
2.2.1.3 Calcitriol .............................................................................................. 18
2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen.................................... 18
2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen ......................................... 19
2.2.3.1 Alkalische Phosphatase ...................................................................... 19
2.2.3.2 Na+/K+-ATPase ................................................................................... 19
2.3 Präparative Methoden .............................................................................. 20
2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese ................................................... 20
2.3.2 Präparation von Rohmembranen ........................................................ 22
2.3.3. Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV) .......... 22
2.4 Expressionsstudien ................................................................................. 26
2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................................... 26
2.4.1.1 ß-Aktin PCR ........................................................................................ 27
2.4.2 Die quantitative RT-PCR ..................................................................... 27
2.4.2.1 Standardreihe für die Quantifizierung PMCA-spezifischer Transkripte 27
2.4.2.2 TaqMan-PCR ...................................................................................... 31
Inhaltsverzeichnis
II
2.4.2.3 Auswertung ......................................................................................... 32
2.4.3. Western Blot Analysen ........................................................................ 33
2.4.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese ...................................................... 33
2.4.3.2 Tank-Blot-Verfahren ............................................................................ 33
2.4.3.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen .......................................... 34
2.4.3.4 Überprüfung der Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA ............. 35
2.4.3.5 Enzymatische Deglykosilierung des TRPV6-Proteins.......................... 36
2.5 Funktionelle Studien ................................................................................ 36
2.5.1 Durchführung der Aufnahmestudien in BSMV ..................................... 36
2.5.2 Berechnung von [Ca2+]frei .................................................................... 37
2.5.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme ................... 38
2.5.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme ................... 38
2.5.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme . 39
2.5.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen . 39
2.5.8 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die Calciumaufnahme in jejunale BSMV .................................................... 41
2.6 Statistik ..................................................................................................... 41
3 Ergebnisse ........................................................................................ 42
3.1 Charakterisierung des Tiermodells......................................................... 42
3.1.1 Einfluss der Fütterung auf wichtige Blutparameter .............................. 42
3.1.2 Unterschiede der Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma 12 h nach der Behandlung .......................................................................... 43
3.2 RNA-Expression ....................................................................................... 43
3.3 Nachweis und Quantifizierung der spezifischen Transport-proteine im Jejunum ............................................................................................... 45
3.3.1 Semiquantitative Detektion des TRPV6-Proteins ................................ 45
3.3.2 Spezifität des PMCA-Protein-Nachweises ........................................... 48
3.3.3 Semiquantitative Detektion des PMCA-Proteins .................................. 49
3.4 Charakterisierung der BSMV ................................................................... 51
3.4.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktionen ............................ 51
3.4.2 Überprüfung der Funktionsfähigkeit der BSMV ................................... 52
3.4.2 Ca2+-Aufnahmeraten in jejunale BSMV ............................................... 54
3.4.3 Der Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV ................................................................ 58
4 Diskussion ........................................................................................ 59
4.1 Beurteilung des Tiermodells ................................................................... 59
4.2 Beurteilung der angewandten Methoden ............................................... 60
4.2.1 Quantitative RT-PCR .......................................................................... 60
4.2.2 Western Analyse ................................................................................. 61
4.2.3 Qualität der BSMV .............................................................................. 64
4.2.4 Bestimmung der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV............................. 66
Inhaltsverzeichnis
III
4.3 Effekt der Calcium-Depletion bzw. der Calcitriolbehandlung auf die Ca2+-Transportkomponenten im Jejunum .............................................. 70
4.3.1 Expressionsstudien ............................................................................. 70
4.3.2 Funktionelle Untersuchungen .............................................................. 75
4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick.......................................................... 81
5 Zusammenfassung .......................................................................... 83
6 Summary ........................................................................................... 85
7 Literaturverzeichnis ......................................................................... 87
Anhang .................................................................................................. 102
A. Puffer und Lösungen für die Präparation von Gesamtmembranen und BSMV ............................................................................................... 102
B. Puffer und Lösungen für die Western Analyse .................................... 103
C. Puffer für die funktionellen Untersuchungen ....................................... 104
Danksagung .......................................................................................... 105
Abkürzungsverzeichnis
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ANOVA analysis of variance (Varianzanalyse)
A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
A. bidest. Aqua bidestillata
ATP(ase) Adenosintriphosphat(ase)
bp base pairs (Basenpaare)
BSMV Bürstensaummembranvesikel
Ca2+ ionisiertes Calcium
[Ca2+]frei Konzentration freier Ca2+-Ionen
CaCo-2 colorectal adenocarcinoma cells (coloraktale Adenokarzinom Zellen)
cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)
cpm counts per minute (Impulse pro Minute)
Ct threshold cycle (PCR-Zyklus, in dem die Reporterfluoreszenz die
Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP 2′-Desoxyribonukleosid-5′-triphosphat
DTT Dithiothreitol
EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat
g Vielfaches der Erd- oder Normalbeschleunigung (gn = 9,80665 m · s-2)
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
h hour (Stunde)
HEK human embyonic kidney (Nierenzellkultur)
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N′-2-ethansulfonsäure
i. m. intramuskulär
i. v. intravenös
Abkürzungsverzeichnis
V
Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante,
Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport
MDBK Madin-Darby bovine kidney (Nierenzellkultur)
min Minute(n)
NCX Na+/Ca2+- exchanger (Na+/Ca2+-Austauscher)
p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit)
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PMCA Plasmamembran-Ca2+-ATPase
PMSF Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride
PTH Parathormon
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
s Sekunde(n)
SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes)
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TRP(V) transient receptor potential (vannilloid) channel
U unit
uS ursprüngliche Substanz
VDR Vitamin D-Rezeptor
VDRE vitamin D responsive element
Vmax maximale Aufnahmerate
WT Wildtyp
x arithmetisches Mittel
Abbildungsverzeichnis
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in
intestinalen (Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien
(Calbindin-D28K-vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im
Text (1.2.2.1 bis 1.2.2.3); Wilkens 2006. ........................................... 7
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV (g
bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte
Zentrifugationsdauer). ..................................................................... 25
Abb. 3.1: Darstellung der mRNA-Gehalte an GAPDH im Jejunum adäquat bzw.
restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol-
bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in
Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA. .................................... 44
Abb. 3.2: Darstellung der mRNA-Gehalte an TRPV6 im Verhältnis zu GAPDH
im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: ***:
p < 0,001. ........................................................................................ 44
Abb. 3.3: Darstellung der mRNA-Gehalte an PMCA im Verhältnis zu GAPDH
im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: *: p
< 0,05, ***: p < 0,001. ...................................................................... 45
Abb. 3.4: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des TRPV6-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische
Membran: unbehandelte und behandelte Tiere der Calcium-
Depletions-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit einem
unbehandelten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ......................... 46
Abb. 3.5: Der zur Abbildung 3.4 dazugehörige semiquantitative Nachweis von
Villin ................................................................................................ 46
Abb. 3.6: Densitometrische Werte der TRPV6-Expression bezogen auf die
Villin-Expression, auf der betreffenden Membran sind jeweils fünf
unbehandelte und fünf behandelte Tiere der Kontrollfütterungsgruppe
aufgetragen. .................................................................................... 47
Abb. 3.7: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung
(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der
behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl
Abbildungsverzeichnis
VII
der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05,
**: p < 0,01. ..................................................................................... 47
Abb. 3.8: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung
(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat
gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Ca-
restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *:
p < 0,05, **: p < 0,01. ...................................................................... 48
Abb. 3.9: Überprüfung der PMCA-Antikörper-Spezifität an Gesamtmembranen
verschiedener Darmabschnitte von Ratte (1), Huhn (2), Jejunum (3),
Colon (4) und Pansen (5) vom Schaf. ............................................. 49
Abb. 3.10: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des PMCA-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische
Membran: behandelte Tiere der Calcium-Depletions- bzw. der
Kontroll-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit den restriktiv
gefütterten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ................................ 49
Abb. 3.11: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der
behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl
der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p <
0,05. ................................................................................................ 50
Abb. 3.12: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression
der Calcium-restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese
aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse
des Students t-Tests: *: p < 0,05.................................................... 50
Abb. 3.13: Zeitabhängige Glukoseaufnahme in jejunale BSMV bei RT und
0,05 mmol∙l-1 Glukose in An- und Abwesenheit von Na+ im
Inkubationsmedium. ........................................................................ 53
Abb. 3.14: A23187-Quotient (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz
des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-
Abbildungsverzeichnis
VIII
Konzentration von 0,09 mmol∙l-1) der vier Versuchsgruppen ( x ±
SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA: ***: p < 0,001. .................................................................. 53
Abb. 3.15: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV mit und ohne
Zusatz des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-
Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ..................................................... 54
Abb. 3.16: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV in den ersten 50 s
bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ........ 55
Abb. 3.17: Ca2+-Gesamtaufnahmerate in jejunale BSMV bei RT mit den
dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den daraus
resultierenden spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten und den
berechneten Vmax und Km-Werten von 2 Schafen. ........................... 56
Abb. 3.18: Spezifische Ca2+-Aufnahmerate in jejunale BSMV unbehandelter
(gestrichelte Linien) bzw. mit Calcitriol behandelter (durchgezogene
Linien), adäquat (schwarze Linien) bzw. restriktiv mit Calcium (graue
Linien) versorgter Schafe in Abhängigkeit von der freien Ca2+-
Konzentration (Kurven stellen Mittelwerte von je 5 Tieren da). ........ 57
Abb.3.19: Maximale Transportkapazität (Vmax) der Ca2+-Aufnahme in jejunale
BSMV der vier Gruppen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);
Ergebnisse der 2-way ANOVA. ....................................................... 57
Abb. 3.20: Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV der vier Gruppen ( x
± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA. .......................................................................................... 58
Abb. 4.1: Korrelation von PMCA mRNA mit TRPV6 mRNA. ........................... 71
Abb. 4.2: Ca2+-Gesamtaufnahme nach 30 s bei freier Ca2+-Konzentration von
0,09 mmol∙l-1 in jejunale BSMV von adäquat bzw. restriktiv mit
Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-
Behandlung ..................................................................................... 79
Tabellenverzeichnis
IX
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz
(uS)) ................................................................................................ 14
Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro
Tier und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4
Wochen) in g bzw. % der TS ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere) ....... 15
Tabelle 2.3: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von β-Aktin .............. 27
Tabelle 2.4: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von PMCA1b ........... 28
Tabelle 2.5: Pipettierschema der PMCA-PCR..................................................... 28
Tabelle 2.7: Pipettierschema der TaqMan-PCR .................................................. 32
Tabelle 2.8: Sondensequenz .............................................................................. 32
Tabelle 2.7: Antikörper und Inkubationsbedingungen für den spezifischen
Proteinnachweis .............................................................................. 35
Tabelle 3.1: Ca-, Ca2+-, Pi- und Calcitriol-Konzentration im Plasma (Ca, Pi,
Calcitriol) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen nach einer mindestens
vierwöchigen diätetischen Calcium-Depletion ( x ± SEM, n = Anzahl
der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p <
0,01, ***: p < 0,001 .......................................................................... 42
Tabelle 3.2: Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma (Ca, Pi) bzw. Vollblut
(Ca2+) von Schafen 12 h nach Calcitriolbehandlung, Vergleich
zwischen den behandelten und den unbehandelten Tieren einer
Fütterungsgruppe ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des
Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 ................ 43
Tabelle 3.3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der
Na+/K+-ATPase im Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension.
Darstellung der Anreicherungsfaktoren als Quotient aus den Werten
von Suspension und Homogenat. Relative Anreicherung wurde als
Quotient aus BSM:BLM dargestellt. ( x ± SEM, n = Anzahl der
Tiere) ............................................................................................ 51
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase
Calcium besitzt nicht nur in seiner ionisierten Form die Funktion eines Second
messengers, sondern ist auch darüber hinaus in vielfältiger Weise an verschiedenen
Abläufen innerhalb des Körpers, wie zum Beispiel der Muskelkontraktion, der
präsynaptischen Ausschüttung von Neurotransmittern, der Blutgerinnung sowie der
Sekretionstätigkeit verschiedener Drüsen, beteiligt (RAMASAMY 2006). Es ist daher
essentiell, dass die Calcium-Konzentration im Plasma konstant gehalten wird, bei
den meisten Säugetieren je nach Alter und Spezies zwischen 2,2 und 2,5 mmol∙l-1
(SCHRÖDER & BREVES 2006).
Für die enge Regulation des Plasmacalciumspiegels sind die drei Hormone Calcitriol,
Parathormon (PTH) und Calcitonin, die in unterschiedlicher Weise auf den
Gastrointestinaltrakt, die Niere und das Skelettsystem wirken, von entscheidender
Bedeutung (RAMASAMY 2006).
Das Steroidhormon Calcitriol, die biologisch aktivste Form des Vitamin D, entsteht im
Körper durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere aus dem mit der
pflanzlichen Nahrung als Ergocalciferol (Vitamin D2) aufgenommenen oder mit der
tierischen Nahrung aufgenommenen bzw. UV-Licht-abhängig körpereigen
gebildetem Prohormon Vitamin D3 (Cholcalciferol). Der in der Niere ablaufende
zweite Hydroxylierungsschritt am C1 wird durch die 1α-Hydroxylase katalysiert,
deren Aktivität streng reguliert ist (FRASER & KODICEK 1970). Ein erniedrigter
Calciumspiegel (BUSHINSKY et al. 1985), ein niedriger Phosphatspiegel (TANAKA
&DELUCA 1973), sowie erhöhtes PTH (GARABEDIAN et al. 1972) führen zu einer
Aktivierung des Enzyms. Calcitriol selbst wirkt über negative Feedback-
Mechanismen hemmend auf die 1α-Hydroxylase (TRECHSEL et al. 1979, SHINKI et
al. 1997).
Calcitriol wirkt über eine gesteigerte Expression von Strukturen, die an der
gastrointestinalen Resorption (siehe auch 1.2.2) und der renalen Rückresorption von
Calcium beteiligt sind, stimulierend auf die Aufnahme aus der Nahrung und hemmt
gleichzeitig dessen renale Ausscheidung (HOENDEROP et al. 2005). Vermittelt wird
die genomische Wirkung durch Bindung an einen spezialisierten Vitamin D-Rezeptor
(VDR), der als ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor fungiert und sich nach Bildung
eines Heterodimers mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR) an Vitamin D-abhängige
Einleitung
2
Elemente (VDREs) in den Promotorregionen der entsprechenden Zielgene anlagert
und so die Transkription reguliert (HOENDEROP et al. 2005). Am Knochen kann
Calcitriol auf unterschiedliche Weise wirken. Zum einen unterstützt ein erhöhter
Calcitriolspiegel die Mineralisierung des Skelettsystems, dabei handelt es sich aber
vermutlich um einen indirekten Effekt durch die vermehrte Bereitstellung von Calcium
im Blut. Zum anderen fördert Calcitriol im Zusammenspiel mit PTH die Mobilisation
von Calcium aus dem Knochen (BROWN et al. 1999).
Neben den relativ langsamen genomischen Effekten konnten auch Calcitriol-
Wirkungen beobachtet werden, die innerhalb von Sekunden bzw. Minuten eintreten.
Bei Hühnern kam es durch Zugabe von Calcitriol ins Lumen innerhalb von wenigen
Minuten zu einer Steigerung des Calcium-Transportes im Duodenum (NEMERE et
al. 1984). Bei dem als „Transcaltachia“ bezeichneten Vorgang wird Calcium apikal in
endozytotische Vesikel aufgenommen und nach Verschmelzung mit Lysosomen zur
basolateralen Seite transportiert, wo es durch Exozytose freigesetzt wird. Als
membranständiger Rezeptor, der diese nichtgenomische Wirkung vermitteln soll,
wurde der 1,25D3-MARRS identifiziert (NEMERE et al. 2004).
Das in der Nebenschilddrüse gebildete Parathormon (PTH), ein Peptidhormon mit 84
Aminosäuren, spielt unter physiologischen Bedingungen eine entscheidende Rolle
bei der Regulation kurzzeitiger Schwankungen des Plasmacalciumlevels
(HOENDEROP et al. 2005). Bei einem vom Calcium-sensing-Rezeptor (CaR)
registrierten Abfall der Ca2+-Konzentration wird PTH, aufgrund der Speicherung in
Form von Sekretgranula in der Nebenschilddrüse, innerhalb weniger Sekunden
freigesetzt (BROWN & MACLEOD 2001) und wirkt hauptsächlich an Niere und
Knochen über Bindung an den membranständigen Parathormon-Rezeptor. PTH
steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium in der Niere (GREGER et al. 1978)
und fördert die Mobilisation aus dem Knochen. Außerdem erhöht PTH durch
Aktivierung der 1α-Hydroxylase die Synthese von Calcitriol und wirkt somit indirekt
auch auf die intestinale Calciumresorption (HOENDEROP et al. 2005). Eine
längerfristige pathologische Erniedrigung des Calciumspiegels bzw. eine Calcium-
Phosphor-Imbalanz kann zu einem sekundären Hyperparathyreoidismus mit
dauerhaft erhöhten PTH-Spiegeln führen.
Calcitonin, ein Peptidhormon mit 32 Aminosäuren, wird bei einem erhöhten
Plasmacalciumspiegel aus den C-Zellen der Schilddrüse freigesetzt. Durch
Einleitung
3
Unterdrückung der resorptiven Effekte von PTH am Knochen fördert Calcitonin eine
vermehrte Einlagerung von Calcium in das Skelettsystem (PECHET et al. 1967).
Physiologischerweise auftretende, vorübergehende Belastungen der Calcium-
Homöostase, wie z.B. ein erhöhter Bedarf während des Wachstums oder eine
verminderte Verfügbarkeit von Calcium in der Nahrung, erfordern ein komplexes
Zusammenspiel der genannten Regulationsmechanismen. Besondere
Herausforderungen treten dabei beim weiblichen Tier auf. Bedingt durch die massive
Bedarfserhöhung während der Trächtigkeit und die sehr plötzlich eintretende
zusätzliche Belastung des Calcium-Haushaltes durch Einsetzen der Laktation muss
die Adaptation besonders effizient bzw. schnell erfolgen.
Da beim Wiederkäuer negative Calcium-Bilanzen nicht durch Verminderung der
basal schon sehr niedrigen renalen Calcium-Ausscheidung ausgeglichen werden
können (BRAITHWAITE & RIAZUDDIN 1971), geschieht dies vermutlich
hauptsächlich durch eine vermehrte Mobilisation aus dem Skelett und eine
Steigerung der Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt.
Beim monogastrischen Tier findet eine regulierte und bei erhöhtem Bedarf
entsprechend angepasste intestinale Resorption hauptsächlich im Duodenum statt
(PANSU et al. 1983). Aus zahlreichen Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass sich
die Lokalisation und die genauen Mechanismen der gastrointestinalen Calcium-
Resorption des Wiederkäuers von denen des monogastrischen Tieres zumindest
teilweise unterscheiden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass das Duodenum
weder beim Rind noch beim Schaf eine bedeutende Rolle für die intestinale
Absorption von Calcium hat (siehe 1.4). Stattdessen scheint beim Wiederkäuer,
neben der präintestinalen Calcium-Aufnahme, die Resorption schwerpunktmäßig im
Jejunum lokalisiert zu sein. (PHILLIPSON & STORRY 1965, BEN-GHEDALIA et al.
1975, SCHRÖDER & BREVES 2006).
1.2 Mechanismen des intestinalen Ca2+
-Transports
Der intestinale Transport von Calcium in seiner ionisierten Form (Ca2+) kann
prinzipiell auf zwei unterschiedlichen Wegen ablaufen: parazellulär über einen nicht-
sättigbaren, passiv verlaufenden Transport und transzellulär über einen aktiven
Transport.
Einleitung
4
1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport
Der parazelluläre Ca2+-Transport über die Tight junctions stellt einen von der
luminalen Konzentration und dem elektrischen Gradienten abhängigen
Diffusionsprozess dar, der prinzipiell entlang der gesamten Darmachse stattfinden
kann (BRONNER et al. 1986). Da die Menge an parazellulär transportiertem Ca2+
positiv mit der Verweildauer des Chymus in den einzelnen Darmabschnitten
korreliert, tritt bei normaler Calcium-Versorgung diese Transportform beim
monogastrischen Tier vor allem im distalen Dünndarm, d. h. im Ileum auf (BRONNER
2003), wo die mittlere Verweildauer mit 100-120 min um ein Vielfaches größer ist als
im Duodenum mit nur 2-6 min (MARCUS & LENGEMANN 1962). Die quantitative
Bedeutung des parazellulären Transports am Gesamt-Ca2+-Transport ist von der
alimentären Calcium-Versorgung abhängig (BRONNER & PANSU 1999).
Eine weitere mögliche Triebkraft des parazellulären Transports stellt der Solvent
drag-Mechanismus dar. Hierbei wird durch aktive Resorption anderer Stoffe, wie zum
Beispiel Na+-Ionen oder Glukose ein osmotischer Gradient erzeugt, der zu einem
parazellulären Nachströmen von Wasser mit den darin gelösten Ionen, unter
anderem Calcium, führt (KARBACH 1992).
1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport
Der transzelluläre Ca2+-Transport ist ein sättigbarer, aktiv ablaufender Prozess, der
Ca2+ prinzipiell auch gegen einen Gradienten aus dem Darmlumen ins Blut
transportiert. Mengenmäßig tritt diese Transportform besonders in
Belastungssituationen, wie einer niedrigen Calciumverfügbarkeit in der Nahrung, in
den Vordergrund (BRONNER & PANSU 1999). Er gliedert sich in drei Teilschritte
(apikaler Calcium-Einstrom, cytosolischer Calcium-Transfer, basolaterale Calcium-
Ausschleusung) (BRONNER et al. 1986, BRONNER 1992). Beim monogastrischen
Tier ist er hauptsächlich im proximalen Dünndarm, vor allem im Duodenum lokalisiert
und unterliegt einer Regulation durch Calcitriol (PANSU et al. 1983, BRONNER
1992).
1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle
Der Einstrom von Ca2+ in die Zelle erfolgt passiv entlang eines steilen
elektrochemischen Gradienten durch zwei einander sehr ähnliche, spezifische Ca2+-
Einleitung
5
Kanäle (TRPV5 und TRPV6) der Bürstensaummembran. Die initiale Calcium-
Aufnahme über die TRPV-Kanäle wird als geschwindigkeitslimitierender Schritt des
Gesamtprozesses angesehen. (HOENDEROP et al. 2002a, NIJENHUIS et al. 2005).
Der TRPV5-Kanal wurde erstmals in Niere, Dünndarm und Plazenta des Kaninchens
beschrieben (HOENDEROP et al. 1999), zeitnah dazu konnte der TRPV6-Kanal im
Darm der Ratte gezeigt werden (PENG et al. 1999). In der Folge konnten diese
Kanäle bei weiteren Spezies, u. a. bei der Maus (SUZUKI et al. 2000), dem
Menschen (PENG et al. 2000), beim Schwein (HINTERDING 2002; CHOI et al.
2009) und beim Schaf (WILKENS et al. 2009), nachgewiesen werden. Beide Kanäle
gehören zur TRP-Familie (transient receptor potential) und werden auf Grund ihrer
Sequenzhomologie, zusammen mit TRPV1-4 der Subfamilie der TRPV-Kanäle
(Vanilloid) zugeordnet.
Wie alle Kanäle der TRP-Familie sind sie aus vier Untereinheiten mit sechs
Transmembrandomänen aufgebaut und weisen mehrere N-terminale Ankyrin-Motive
auf (HOENDEROP et al. 1999). TRPV5 und TRPV6 zeigen eine 75%-Homologie auf
AS-Ebene, wobei Unterschiede hauptsächlich in den N- und C-terminalen
Segmenten lokalisiert sind (PENG et al. 1999, PENG et al. 2003).
In der TRP-Familie bilden sie eine Gruppe hochselektiver Ca2+-Kanäle, die bei
physiologischem Membranpotenzial konstitutiv geöffnet sind (VENNEKENS et al.
2000). Beide werden durch ein Ansteigen der intrazellulären Ca2+-Konzentration
inaktiviert, wobei dieser Prozess bei TRPV6 durch eine initiale, gefolgt von einer
langsameren Inaktivierungsphase charakterisiert ist während TRPV5 nur die
langsame Inaktivierungsphase zeigt (HOENDEROP et al. 2002a). Eine verglichen
mit TRPV6 100-fach höhere Affinität des TRPV5-Kanals zu dem Inhibitor Ruthenium
Rot zeigt einen weiteren Unterschied der funktionellen Eigenschaften (HOENDEROP
et al. 2001).
TRPV5 und TRPV6 werden in Niere, Darm und anderen Geweben wie Pankreas,
Prostata, Hoden und Speicheldrüse (HOENDEROP et al. 1999; HOENDEROP et al.
2001) coexprimiert, wobei TRPV5 jedoch die wichtigste Isoform in der Niere ist. Im
Darm ist TRPV6 quantitativ am bedeutendsten und entscheidend an der regulierten
Calcium-Resorption beteiligt. Deutlich wird dies am Beispiel eines TRPV6-Knockout
Modells. Die Mäuse waren zwar lebensfähig, zeigten jedoch eine deutlich reduzierte
intestinale Ca2+-Absortion (40%), mangelnde Gewichtszunahmen, eine geringere
Knochendichte und eine verminderte Fruchtbarkeit, wobei die Serum-Calciumspiegel
Einleitung
6
bei adäquater Versorgung unbeeinflusst waren. Bei einer zusätzlichen alimentären
Calcium-Depletion entwickelten die Tiere eine Hypocalcämie (BIANCO et al. 2007).
1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin
Beim zweiten Teilschritt des transzellulären Transports müssen die eingeströmten
Ca2+-Ionen durch das Cytosol auf die basolaterale Seite transportiert werden.
Gleichzeitig muss aber sichergestellt sein, dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration
niedrig gehalten wird, damit die Second messenger-Funktion des freien Ca2+ erhalten
bleibt. Erreicht wird dies durch Calcium-bindende Proteine, deren Funktion
hauptsächlich darin besteht, die Ca2+-Ionen im Cytosol abzupuffern (SCHRÖDER et
al. 1996). Außerdem vermitteln sie einen 70-mal schnelleren Transport von Ca2+
durch die Zelle, verglichen mit freier Diffusion der Ionen (BRONNER et al. 1986). Von
einigen Autoren wird angegeben, dass dieser Schritt des cytosolischen Transfers
geschwindigkeitslimitierend für den transzellulären Transport zu sein scheint, da im
Duodenum der Ratte ein linearer Zusammenhang zwischen Calbindin-Menge und
Transportrate besteht (SLEPCHENKO & BRONNER 2001). In einer Studie an
CaCo-2 Zellen gingen hohe Calbindin-Konzentrationen jedoch nicht mit einer
erhöhten Calcium-Transportrate einher (FLEET et al. 2002). SPENCER et al. (1976)
konnten zeigen, dass es bei rachitischen Hühnern nach einer Calcitriolbehandlung zu
einem Anstieg der Calbindin-D28K-Konzentration mit einem Maximum nach 48 h
kommt. Die ebenfalls erhöhte Calcium-Absorption konnte nicht über den gleichen
Zeitraum beobachtet werden, sie erreichte ihr Maximum bereits 8 h nach Behandlung
und fiel dann wieder ab auf 25% der maximalen Rate nach 48 h.
Anhand des Molekulargewichts unterscheidet man zwei Typen des Calcium-
Bindungsproteins, Calbindin-D9K und Calbindin-D28K. Beide Proteine sind strukturell
nicht verwandt. Calbindin-D9K besitzt zwei Calcium-Bindungsstellen, Calbindin-D28K
kann vier Calcium-Ionen binden (BREDDERMAN & WASSERMAN 1974,
FULLMER & WASSERMAN 1981). Calbindin-D9K wird bei Säugetieren hauptsächlich
in der Darmschleimhaut exprimiert, ist aber in geringerem Maße auch in der Niere
nachweisbar (THOMASSET et al. 1982, HOENDEROP et al. 2005, WILKENS 2006).
Calbindin-D28K ist in Niere, Pankreas, Plazenta, Knochen und Gehirn präsent
(HOENDEROP et al. 2005). Bei Vögeln ist in Darm und Niere ausschließlich
Calbindin-D28K vorhanden (FULLMER & WASSERMAN 1987, HOENDEROP et al.
2005).
Einleitung
7
Durch die langsame Kinetik der Calbindine ist gewährleistet, dass zwar die
intrazelluläre Konzentration an freien Calcium-Ionen niedrig gehalten wird, das für
funktionelle Second messenger-Signale typische kurzfristige Ansteigen der Calcium-
Konzentration aber nicht behindert wird (KOSTER et al. 1995).
1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran
Im dritten Schritt werden die Calcium-Ionen gegen einen elektrochemischen
Gradienten mit zwei unterschiedliche Ca2+-Transportmechanismen über die
basolaterale Membran aus der Zelle ins Plasma geschleust. Von der primär aktiven,
membranständigen Calcium-ATPase (PMCA) sind vier verschiedene Isoformen mit
mehreren Splicevarianten bekannt, wobei im Dünndarm die Isoform PMCA1b den
quantitativ bedeutendsten Mechanismus zur aktiven Ca2+-Ausschleusung darstellt
(HOENDEROP et al. 2005). Von untergeordneter Bedeutung ist der sekundär aktive
3Na+/Ca2+-Austauscher (NCX1) der hauptsächlich an der renalen Ca2+-Resorption
beteiligt ist und intestinal nur sehr niedrig exprimiert wird (HILDMANN et al. 1982,
HOENDEROP et al. 2005).
Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen
(Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien (Calbindin-D28K-
vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im Text (1.2.2.1 bis
1.2.2.3); Wilkens 2006.
TRPV5
TRPV6
PMCA
NCX
ATP
ADP + Pi
Calbindin-D9K
Calbindin-D28K
Ca2+
apikal basolateral
Einleitung
8
1.3 Regulation des intestinalen Ca2+
-Transports
Die intestinale Ca2+-Aufnahme ist ein wichtiges Stellglied bei der Regulation der
Calcium-Homöostase, da es die einzige exogene Zufuhrmöglichkeit von Calcium in
das extrazelluläre Kompartiment des Körpers darstellt (RAMASAMY 2006).
Der aktive transzelluläre Ca2+-Transport wird im Wesentlichen durch das
Steroidhormon Calcitriol (1α,25(OH)2-VitaminD3), der biologisch aktivsten Form des
Vitamins D, reguliert. Calcitriol stimuliert am Darm die Expression von TRPV6,
Calbindin-D9K und PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Vitamin D responsive elements
(VDREs), über die die Calcitriolwirkung vermittelt wird, konnten in den
Promotorregionen von TRPV6 (MEYER et al. 2006), Calbindin-D9K (DARWISH &
DELUCA 1992) und PMCA1b (GLENDENNING et al. 2000) nachgewiesen werden.
Auf funktioneller Ebene konnte schon wesentlich früher die stimulierende Wirkung
von Calcitriol auf den aktiven Ca2+-Transport gezeigt werden. Eine Behandlung mit
Calcitriol führte bei Ratten zu einer Verdopplung der Calcium-Nettofluxraten im
Duodenum (JUNGBLUTH & BISWANGER 1989).
Von der Regulation des parazellulären Ca2+-Transportes hat man bislang weniger
konkrete Vorstellungen. Es konnte jedoch an CaCo-2 Zelllinien gezeigt werden, dass
Calcitriol die Leitfähigkeit der Tight junctions erhöht und somit zu einem verstärkten
parazellulären Ca2+-Transport führt (CHIRAYATH et al. 1998).
Eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation des intestinalen Calcium-
Transports kommt auch der alimentären Calcium-Versorgung zu. Ein niedriges
Calcium-Angebot in der Nahrung erhöht die Effizienz der intestinalen Calcium-
Absorption über Adaptationsmechanismen des Vitamin D-Systems (WASSERMAN
et al. 1992). Das durch die alimentäre Calcium-Depletion hervorgerufene
vorübergehende Absinken des Plasma-Calcium-Spiegels bewirkt, über eine
Stimulation der 1α-Hydroxylase, eine Erhöhung der Calcitriol-Konzentration im
Plasma. Infolge dessen kommt es zu einer Erhöhung der mRNA-Expression von
TRPV5 und TRPV6 (BROWN et al. 2005), Calbindin-D28K sowie der Protein-
Expression von PMCA und NCX (WASSERMAN et al. 1992, CENTENO et al. 2004).
Demgegenüber scheint eine alimentäre Calcium-Supplementation den intestinalen
Calcium-Transport calcitriolunabhängig zu regulieren. Demonstriert wurde dies
anhand von 1α-OH-Knockout Mäusen, die das klinische Bild einer Pseudovitamin-D-
Mangel-Rachitis mit Hypocalcämie, undetektierbaren Calcitriol-Spiegeln und
sekundärem Hyperparathyreoidismus zeigten. Durch Fütterung einer calciumreichen
Einleitung
9
„Rescue diet“ (2% Calcium und 20% Laktose) kam es zu einer Normalisierung des
Calcium-Spiegels (HOENDEROP et al. 2004). Außerdem erhöht sich die Expression
der am intestinalen Ca2+-Transport beteiligten Proteine, TRPV6, Calbindin-D9K und
PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Jedoch sind die molekularen Mechanismen dieser
calcitriolunabhängigen Genregulation bislang nicht bekannt. Denkbar wäre, dass
neben den bekannten VDREs in den Promotorregionen der Ca2+-Transportergene so
genannte Ca2+-abhängige Elemente (CaREs) vorhanden sind (HOENDEROP et al.
2005). GALLIN & GREENBERG (1995) konnten die Existenz solcher CaREs, die
auffällige Ähnlichkeiten mit cAMP-abhängigen Elementen aufwiesen, in Nervenzellen
zeigen.
Neben Calcitriol sind weitere Hormone an der Regulation des intestinalen Calcium-
Transports beteiligt. Das bei erniedrigtem Plasmacalciumspiegel ausgeschüttete
PTH greift hauptsächlich am Knochen und an der Niere an und erhöht die Calcium-
Mobilisation bzw. steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium. Durch
Aktivierung der 1α-Hydroxylase steigert es die Synthese von Calcitriol, und wirkt
somit indirekt auch auf die intestinale Ca2+-Resorption (HOENDEROP et al. 2005).
Es konnte aber auch ein direkter Effekt von PTH auf Enterozyten gezeigt werden.
Dabei erhöhte PTH die Ca2+-Aufnahme in isolierte Duodenumzellen der Ratte
(PICOTTO 2001). Außerdem konnten PTH-Rezeptoren an Enterozyten des Villus
immunhistochemisch nachgewiesen werden (GENTILI et al. 2003).
1.4 Gastrointestinaler Ca2+
-Transport beim Wiederkäuer
Zur Ca2+-Resorption beim Wiederkäuer liegen zahlreiche, zum Teil widersprüchliche
Ergebnisse vor.
In Bilanzstudien an fistulierten Schafen konnte gezeigt werden, dass prinzipiell nicht
nur Dünn- und Dickdarm, sondern auch die präintestinalen Abschnitte des
Gastrointestinaltraktes sowohl zur Nettosekretion als auch zur Nettoresorption von
Calcium befähigt sind. In einigen Untersuchungen stellte sich heraus, dass in
Vormägen und Labmagen zum Teil eine Sekretion von Calcium auftrat, die durch
Nettoresorption im Dünndarm bzw. Dickdarm mehr als kompensiert wurde
(PFEFFER et al. 1970, GREENE et al. 1983, WYLIE et al. 1985). In anderen
Untersuchungen wurde festgestellt, dass ein beträchtlicher Anteil der täglichen Ca2+-
Aufnahme präintestinal erfolgt (RAYSSIGUIER & PONCET 1980). Ähnliche
Einleitung
10
widersprüchliche Beobachtungen wurden auch in Bilanzstudien an Rindern gemacht.
So beobachteten GREENE et al. (1983) in einer Studie an jungen Bullen eine
Nettoresorption von Calcium aus den Vormägen und dem Dickdarm, im Dünndarm
hingegen wurde Calcium sezerniert. In einer weiteren Studie ergaben sich Hinweise
darauf, dass das Vormagen/Labmagen-Kompartiment sogar der ausschließliche
Abschnitt des Gastrointestinaltraktes für die Ca2+-Nettoresorption ist (GREENE et al.
1988).
Diese unterschiedlichen Ergebnisse lassen sich in Einklang bringen, wenn man die
präintestinalen und intestinalen Anteile an der gesamten Calcium-Resorption in
Abhängigkeit der alimentären Calcium-Versorgung betrachtet. Bei diesem Vorgehen
ergeben sich Hinweise darauf, dass es bei hohem Calcium-Angebot in der Nahrung
zu einer Verschiebung der Hauptlokalisation der Calcium-Nettoresorption in die
präintestinalen Abschnitte kommt (SCHRÖDER & BREVES 2006). Die intestinale
Resorption von Calcium scheint also erst mit abnehmendem alimentärem Angebot
an Bedeutung zu gewinnen.
Auch In-vitro-Untersuchungen zeigten einen aktiven Ca2+-Transport im Pansen. An
Epithelien von wachsenden Ziegen und adulten Schafen konnten mit der Ussing-
Kammer-Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten signifikante
Nettofluxraten bestimmt werden (HÖLLER et al. 1988, SCHRÖDER et al. 1997). Der
Transport scheint aber nur in Anwesenheit kurzkettiger Fettsäuren in der mucosalen
Pufferlösung stattzufinden (SCHRÖDER et al. 1999).
Bei In-vitro-Versuchen an verschiedenen Darmabschnitten von Schafen und Ziegen
verschiedenen Alters zeigten sich deutliche Speziesunterschiede. So ließen sich bei
adulten, bedarfsgerecht mit Calcium versorgten Schafen mit der Ussing-Kammer-
Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten nur im Jejunum
signifikant von Null verschiedene Calcium-Nettofluxraten bestimmen (SCHRÖDER et
al. 1997). Überraschenderweise konnten im Duodenum, welches die
Hauptlokalisation für den aktiven Ca2+-Transport beim monogastrischen Tier darstellt,
keine signifikanten Nettofluxraten gefunden werden. An Epithelien wachsender
Ziegen jedoch konnten unter gleichen Bedingungen im Duodenum und im Jejunum
signifikante Nettofluxraten gezeigt werden. Allerdings waren die für die Calcium-
Nettofluxraten beider Spezies ermittelten Werte nur sehr gering und lagen weit unter
den Werten von monogastrischen Tieren (SCHRÖDER et al. 1997). In einer neueren
Studie an Epithelien adulter, laktierender Schlachtkühe wurde sogar eine
Einleitung
11
Nettosekretion im Duodenum und im Colon beobachtet (LIESEGANG et al. 2006).
SIDLER-LAUFF et al. (2010) beobachteten eine Nettosekretion im Duodenum
wachsender Ziegen.
Auch Untersuchungen zur Regulation des gastrointestinalen Ca2+-Transportes beim
Wiederkäuer zeigten deutliche Speziesunterschiede auf. Bezüglich der Resorption
von Calcium aus dem Vormagensystem ergeben sich aus verschiedenen
Untersuchungen Hinweise darauf, dass diese keiner Regulation durch Calcitriol
unterliegt (SCHRÖDER et al. 2001; SIDLER-LAUFF et al. 2010). Für die intestinale
Resorption konnte zwar anhand molekularbiologischer Studien nachgewiesen
werden, dass beim Wiederkäuer die strukturellen Voraussetzungen für einen aktiven,
calcitriolregulierten Ca2+-Transport vorhanden sind, die Regulation konnte funktionell
aber noch nicht eindeutig gezeigt werden.
So konnte beim Rind die Expression von VDR, Calbindin-D9K und PMCA im
Duodenum demonstriert werden (YAMAGISHI et al. 2002, YAMAGISHI et al. 2006).
Im Dünndarm der Ziege konnten der VDR, Calbindin-D9K und TRPV6 nachgewiesen
werden (SCHRÖDER et al. 1995; RITTMANN 1996, MUSCHER unveröffentlichte
Ergebnisse). Eine alimentäre Calcium-Depletion über neun Wochen, verbunden mit
einem deutlichen Anstieg der Calcitriolspiegel von 130 auf 230 pmol∙l-1, hatte jedoch
keinen signifikanten Effekt auf die Calcium-Nettofluxraten im Duodenum und
Jejunum von wachsenden Ziegen (SCHRÖDER et al. 1997). Ebenfalls konnten im
Dünndarm von Schafen VDR, Calbindin-D9K, TRPV6 und PMCA nachgewiesen
werden (SCHRÖDER et al. 2001, WILKENS 2006). Laktierende Schafe, die mit
0,1 µg/kg 1α-Hydroxyvitamin D3 i. m. über zehn Tage behandelt wurden, zeigten
einen deutlichen Anstieg der Calcium-Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt,
wobei aufgrund des Versuchsdesigns aber nicht auf beteiligte Darmsegmente
geschlossen werden konnte (BRAITHWAITE 1978). Bei Lämmern konnte nach
zweiwöchiger Calcium-Restriktion unter Anwendung der „Thiry-Vella loop“-Technik
eine erhöhte Effizienz der Calcium-Absorption im Jejunum beobachtet werden
(ABDEL-HAFEEZ et al. 1982). Jedoch konnte bei Schafen eine Steigerung der
Nettofluxraten im Jejunum durch eine Calcium-Depletion bzw. eine Vitamin D3-
Behandlung bislang nicht gezeigt werden.
Warum trotz des Vorhandenseins dieser Strukturen an jejunalen Epithelien vom
Schaf bislang keine entsprechende Regulierbarkeit der Calcium-Nettofluxraten wie
bei monogastrischen Tieren gezeigt werden konnte, bleibt unklar.
Einleitung
12
1.5 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulierbarkeit des Ca2+-Transportes im
Jejunum des Schafes zu überprüfen.
Dazu sollte die Wirkung einer alimentären Calcium-Depletion, einer Behandlung mit
Calcitriol in pharmakologischer Dosierung und der Kombination aus Depletion und
Behandlung auf Expression und Aktivität der am transzellulären Ca2+-Transport
beteiligten Strukturen untersucht werden.
Dass das verwendete Behandlungsprotokoll zu einer Stimulation der
gastrointestinalen Aufnahme von Calcium führt, konnte bereits in vorangegangenen
funktionellen Studien demonstriert werden (Wilkens et al. 2010). In der vorliegenden
Arbeit wurde nun die Expression des apikalen Calcium-Kanals TRPV6 und der
basolateralen Calcium-Pumpe PMCA1b mithilfe von quantitativer RT-PCR und
Western Blot Analysen auf Transkriptions- und Translationsebene bestimmt,
während die Aktivität des Kanals mittels Uptake-Studien an isolierten
Bürstensaummembranvesikeln erfasst werden sollten.
Material und Methoden
13
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Tiere
Es standen 20 weibliche, ca. sechs Monate alte und zwischen 30 und 40 kg schwere
Schafe der Rasse „Suffolk“ zur Verfügung, die ca. sechs Wochen vor dem ersten
Schlachttermin von einem kommerziellen Zuchtbetrieb gekauft und eingestallt
wurden. Nach einer zweiwöchigen Adaptationsphase wurden die Tiere in vier
Versuchsgruppen mit jeweils fünf Tieren eingeteilt.
2.1.2 Fütterung
Zwei Gruppen (Calcium-Depletions-Fütterungsgruppen, Ca-) erhielten ein Versuchs-
futter mit reduziertem Calciumgehalt (0,14% im Kraftfutter), die beiden anderen
Gruppen (Kontroll-Fütterungsgruppen, Kon) wurden bedarfsgerecht mit Calcium
(1,44% im Kraftfutter) versorgt. Die Schafe wurden zu fünft in mit Sägespänen
eingestreuten Laufboxen gehalten und auch gruppenweise gefüttert. Die tägliche
Ration pro Tier und Tag setzte sich aus 90 g Heu und 660 g Kraftfutter zusammen.
Stroh, dessen Mineralstoffgehalt vor Versuchsbeginn analytisch bestimmt worden
war, und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die
Zusammensetzung der Pellets ist der Tabelle 2.1 zu entnehmen. Die Ration wurde
auf drei Mahlzeiten am Tag verteilt und das nicht aufgenommene Futter
rückgewogen. Anhand der Differenz zwischen der vorgelegten Futtermenge und der
Rückwaage konnte die tägliche Aufnahme pro Tier und Tag geschätzt werden
(Tab. 2.2). Zwischen den beiden Fütterungsgruppen bestand nur in der
aufgenommenen Calcium-Menge ein signifikanter Unterschied, diese betrug bei den
Tieren der Kontrollfütterungsgruppen 10,37 ± 0,1 g und in den Calcium-Depletions-
Fütterungsgruppen 2,6 ± 0,04 g pro Tier und Tag.
Während der mindestens vier Wochen dauernden Fütterungsphase wurden in
wöchentlichem Abstand die Gewichtszunahmen kontrolliert, sowie am Ende der
Fütterungsperiode Blutproben aus der V. jugularis entnommen, um die Konzentration
von Gesamtcalcium (Ca), ionisiertem Calcium (Ca²+ ), Phosphat (Pi) und Calcitriol zu
bestimmen.
Material und Methoden
14
2.1.3 Behandlung
Je fünf Tiere der Calcium-Depletions- bzw. Kontrollfütterunggruppen wurden zwölf
Stunden vor der Schlachtung mit Calcitriol in einer Dosierung von 0,5 µg pro kg
Körpergewicht behandelt. Mittels Infusion über einen Venenkatheter wurde den
Tieren eine entsprechende Menge Calcitriol gelöst in 180 ml physiologischer
Kochsalzlösung verabreicht. Polysorbat 20 diente als Lösungsvermittler. Die
restlichen Tiere erhielten ein Placebopräparat, bestehend aus physiologischer
Kochsalzlösung und Polysorbat 20.
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz (uS))
Inhaltsstoffe (in % der ursprünglichen Substanz)
Diät
Ca-Depletion Kontrolle
Gerste 26,7 25,8
Hafer 29,7 28,7
Weizenkleie 14,8 14,3
Sojaextraktionsschrot 14,8 14,3
Sojabohnen 11,9 11,5
Sojaöl 1,5 1,4
NaH2PO4 ∙ 2 H2O 0,6 0,6
CaCO3 --- 3,4
Material und Methoden
15
Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro Tier
und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4 Wochen)
in g bzw. % der TS ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)
Tägliche Aufnahme
Ca-Depletion n = 10
Kontrolle n = 10
TS (kg) 1,01 ± 0,02 1,12 ± 0,01
ME (MJ) 9,4 ± 0,11 10,0 ± 0,10
Calcium (g) 2,60 ± 0,04 10,37 ± 0,10
Phosphor (g) 4,17 ± 0,04 4,24 ± 0,04
Magnesium (g) 1,80 ± 0,02 1,80 ± 0,02
Natrium (g) 0,95 ± 0,01 1,03 ± 0,01
Rohfett 4,4% 4,8%
Rohfaser 24,2% 25,8%
Rohprotein 13,1% 11,6%
Stärke + Zucker
20,8% 18,8%
2.1.4 Entnahme der Blutproben
Vor Beginn und im Anschluss an die Behandlung wurden in zweistündigem Abstand
Blutproben aus der V. jugularis über einen Venenkatheter in Lithium-Heparin-
Monovetten (Monovette® 9ml LH; Fa. Sarstedt, 51588 Nümbrecht) entnommen.
Mit Hilfe einer ionen-sensitiven Elektrode (Rapidlab™ 348; Siemens Healthcare
Dagnostics GmbH, 65760 Eschborn) wurde unmittelbar danach die Konzentrationen
an ionisiertem Calcium (Ca2+) im Vollblut gemessen.
In einem anschließenden Zentrifugationsschritt für 10 min bei 3500 rpm (Minifuge 2;
Heraeus Instruments, 63450 Hanau) wurde das Blutplasma isoliert und bis zur
weiteren Analyse bei -20°C eingefroren.
Material und Methoden
16
2.1.5 Entnahme der Gewebeproben
Zwölf Stunden nach der Behandlung wurden die Tiere mittels Bolzenschuss betäubt
und durch einen Kehlschnitt entblutet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden
Proben aus dem proximalen Jejunum entnommen. Die Entnahme der
Gewebeproben erfolgte innerhalb von 10 min nach dem Töten der Tiere.
Für die Isolierung von RNA und Zellmembranen für Western Analysen wurden 20 bis
30 cm des proximalen Jejunums entnommen, am Mesenterialansatz aufgeschnitten
und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mehrfach gespült. Von dem
Darmabschnitt, mit der serosalen Seite auf einer eisgekühlten Glasplatte liegend,
wurde nun unter Zuhilfenahme eines Objektträgers der lumenseitige Anteil der
Darmwand, d.h. die Lamina epithelialis und die Lamina propria der Tunica mucosa,
von der Lamina muscularis mucosae separiert und das auf diese Weise gewonnene
Material in flüssigem Stickstoff eingefroren. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die
Mukosaproben bei -80°C gelagert.
Für die Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel wurde ein
Jejunumstück von 2 m Länge kaudal der Entnahmestelle der Proben für die RNA-
Isolierung mehrfach mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gespült.
Anschließend wurden die Darmstücke auf mesenterialer Seite der Länge nach
aufgeschnitten, erneut bis zur vollständigen Entfernung vorhandener Ingestareste
gespült und in Alufolie gewickelt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung bis
zur Präparation der Bürstensaummembranvesikel (BSMV) erfolgte ebenfalls bei
-80°C.
2.2 Analytische Methoden
2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben
2.2.1.1 Gesamtcalcium
Der Gehalt an Gesamtcalcium im Blutplasma wurde mit Hilfe der o-Kresolphtalein-
Komplexon-Methode bestimmt (SARKAR & CHAUHAN 1967). Das Testprinzip
beruht auf der Bildung eines violetten Komplexes aus Calcium und o-Kresolphtalein-
Komplexon in alkalischer Lösung, dessen Farbintensität zur Calciumkonzentration
direkt proportional ist. Jeweils 25 µl Probe bzw. Standardlösung (2 mmol∙l-1 CaCl2)
wurden mit 500 µl einer 2-Amino-2-Methylpropanol-Lösung (3,5 mmol∙l-1, pH 10,8)
Material und Methoden
17
und 500 µl Farbstofflösung (0,16 mmol∙l-1 o-Kresolphtalein-Komplexon, 6,89 mmol∙l-1
8-Hydroxychinolin in 0,06 mmol∙l-1 HCl) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion
im Photometer (DU® 640 Spectrophotometer; Beckman Coulter GmbH, 47807
Krefeld) bei einer Wellenlänge von 570 nm gegen einen Leerwert gemessen. Die
Messung erfolgte für alle Proben jeweils im Doppelansatz.
Die Berechnung der Calciumwerte erfolgte mit nachstehender Formel:
ExtinktionProbe
Ca-KonzentrationProbe = --- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1]
ExtinktionStandard
2.2.1.2 Phosphat
Die Messung beruht auf der Bildung eines gelben Farbkomplexes aus Pi mit
Molybdat und Vanadat in salpetersaurer Lösung, dessen Farbintensität proportional
zur Pi-Konzentration ist (PETER 1982). Vorab wurden die Proben einer Enteiweißung
unterzogen. Dazu wurden die Plasmaproben 1:10 mit Trichloressigsäure
(1,2 mmol∙l-1) versetzt und 10 min bei 805 g und 4°C zentrifugiert (GS-15R
Centrifuge; Beckman Coulter GmbH, 47807 Krefeld). Anschließend wurden jeweils
400 µl des Überstandes bzw. 400 µl Standardlösung (0,161 mmol∙l-1 KH2PO4) mit
dem gleichen Volumen Ammoniumvanadat- (21 mmol∙l-1) und Ammoniummolybdat-
Lösung (40 mmol∙l-1) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion bei einer
Wellenlänge von 405 nm gegen den Leerwert gemessen. Alle Messungen wurden im
Doppelansatz durchgeführt.
Die Pi-Konzentration der Probe ergibt sich aus folgender Formel:
ExtinktionProbe
Pi-KonzentrationProbe = ---- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1]
ExtinktionStandard
Material und Methoden
18
2.2.1.3 Calcitriol
Die Bestimmung der Konzentration von Calcitriol im Blutplasma erfolgte durch die
Firma Immundiagnostik AG (64625 Bensheim) mittels eines kommerziell erhältlichen
Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assays (ELISA).
2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen
Zur Quantifizierung der in den Western Blot Analysen und den Uptake-Studien
eingesetzten Membranpräparationen, sowie zur Überprüfung der Anreicherung
apikaler Membranen nach der Bürstensaummembranvesikel-Präparation, wurden die
entsprechenden Proteinkonzentrationen mithilfe des BIO-RAD Proteinassays
(Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) bestimmt. Das Absorptionsmaximum
des enthaltenen Farbstoffes, Coomassie-Brillant-Blau G-250, verschiebt sich in
saurer Lösung durch Bindung an Proteinstrukturen von 465 nm nach 595 nm
(BRADFORD 1976). Hierbei wird der zuvor als rotes Kation vorliegende Farbstoff in
seine anionische Form überführt und färbt sich blau. Durch zeitgleiche Messung
einer Standardreihe bekannter Konzentrationen an gamma-Globulin (BIO-RAD
Protein Standard; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) ist die Ermittlung
unbekannter Probenwerte möglich. Die Inkubation mit oberflächenaktivem Saponin
vor der Zugabe des Farbreagenz verbessert die Darstellung der
Proteinbindungsstellen.
Nach dem Auftauen der Proben wurden diese durch mehrmaliges Aufziehen mit
einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisiert und
anschließend 1:20 mit A. dest. verdünnt. 50 µl der verdünnten Probe bzw. 50 µl A.
dest. als Leerwert wurden mit gleicher Menge an Saponinlösung (1%ig) vermischt.
Nach einer 20 minütigen Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 2,5 ml des zuvor
1:5 mit A. dest. verdünnten Bio-Rad-Farbreagenz zu allen Proben. Nach weiteren
10 min konnte die Extinktion im Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gegen
den Leerwert gemessen werden. Parallel dazu wurde die Extinktion von vier
verschiedenen Konzentrationen (0,139, 0,278, 0,417 und 0,556 mg∙ml-1) eines
gamma-Globulin-Standards ermittelt. Alle Messungen wurden jeweils im
Doppelansatz durchgeführt. Aus den Extinktions- und Konzentrationswerten des
Standardproteins wurde eine lineare Regression erstellt, aus welcher die
Proteinwerte der Proben berechnet werden konnten.
Material und Methoden
19
2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen
Um die Anreicherung apikaler Membranen durch die Differentialzentrifugation (2.3.3)
zu bestimmen, wurden Aktivitäten von Leitenzymen der apikalen bzw. der
basolateralen Membranen in Vollhomogenat und Vesikel-Präparation bestimmt und
zueinander ins Verhältnis gesetzt.
2.2.3.1 Alkalische Phosphatase
Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP), Leitenzym der apikalen Membran,
wurde nach der von KAWADE (1964) beschriebenen Methode bestimmt. Hierbei wird
farbloses p-Nitrophenylphosphat durch die AP hydrolytisch in Phosphat und p-
Nitrophenyl gespalten. Die entstandene Menge an gelbem p-Nitrophenyl pro
Zeiteinheit ist proportional zur Aktivität der AP und kann photometrisch bei einer
Wellenlänge von 405 nm bestimmt werden.
Je 50 µl der auf Eis aufgetauten und durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-
Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisierten Probe wurde mit 3 ml
auf 25°C temperiertem AP-Puffer (1,02 mol∙l-1 Diethanolamin, 0,51 mmol∙l-1 MgCl2, 10
mmol∙l-1 Na-Nitrophenylphosphat, pH 9,8) vermischt. Im Anschluss wurde die
Extinktion in 1 minütigen Intervallen über einen Zeitraum von 4 min bei 405 nm
gegen Luft gemessen. Die Aktivität konnte durch Multiplikation der
Extinktionsänderung pro Minute (E3min- E2min) mit dem versuchsinternen Faktor 3300
in der Einheit U∙l-1
berechnet werden.
Für die Auswertung wurden diese Ergebnisse auf den zuvor ermittelten Proteingehalt
bezogen.
2.2.3.2 Na+/K+-ATPase
Die Aktivität der Na+/K+-ATPase, Leitenzym für die basolaterale Membran, wurde
nach der Methode von MIRCHEFF u. WRIGHT (1976) photometrisch bestimmt.
Durch die ATPase-Aktivität wird aus ATP anorganisches Phosphat frei, welches in
saurer Lösung mit Molybdat Phosphomolybdänsäure bildet. Diese wird zu
Molybdänsäure, einem blauen Farbkomplex, reduziert und kann bei einer
Wellenlänge von 690 nm photometrisch bestimmt werden. Durch Zusatz von
Ouabain kann spezifisch die Aktivität der Na+/K
+-ATPase gehemmt werden, so dass
sich dann aus der Differenz der Umsetzung von ATP in einem Ansatz mit und einem
ohne Ouabain die Aktivität des Enzyms in der Präparation errechnen lässt.
Material und Methoden
20
Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und mit A. dest. eine Verdünnung hergestellt,
von der 20 µl mit jeweils 0,5 ml Assaymix-Puffer (5 mmol∙l-1 MgCl2, 100 mmol∙l-1
NaCl, 10 mmol∙l-1 KCl, 100 mmol∙l-1 Tris (basisch), 2 mmol∙l-1 ATP, 3 mmol∙l-1 EDTA,
pH 7, 4 bei 37°C) bzw. Assaymix-Puffer mit Ouabainzusatz (6,86 mmol∙l-1 Ouabain)
30 min bei 37°C inkubiert wurden. Durch die Zugabe von 0,5 ml 5%iger
Trichloressigsäure wurde die ATPase-Reaktion gestoppt, die weiteren Zugaben
erfolgten alle bei Raumtemperatur. Die Zugabe von 1 ml Farbreagenz (1,15 mol∙l-1
H2SO4, 8,9 mmol∙l-1 Ammoniumheptamolybdat, 143,8 mmol∙l-1 FeSO4) führte zur
Bildung eines blauen Farbkomplexes mit dem freigesetzten anorganischen
Phosphat. Nach einer 30 minütigen Inkubation wurde die Extinktion bei einer
Wellenlänge von 690 nm gegen einen Leerwert bestimmt. Die Aktivität der Na+/K+-
ATPase wurde anhand der Differenz der Extinktionswerte mit Ouabainhemmung und
ohne Hemmung sowie nachfolgender Multiplikation mit dem versuchsinternen Faktor
862 in der Einheit U∙l-1 berechnet und auf die zuvor ermittelte Proteinkonzentration
bezogen.
2.3 Präparative Methoden
Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Puffer und Lösungen, die sich auf
Vorrat herstellen ließen, in alphabetischer Reihenfolge im Anhang A aufgeführt.
2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den jejunalen Mukosaproben wurde das
RNeasy® Mini-Kit (QIAGEN GmbH, 40724 Hilden) mit den darin enthaltenen Puffern
RLT, RW1 und RPE gemäß den Herstellerangaben verwendet. Vor
Präparationsbeginn wurde der RLT-Puffer zunächst mit 1% ß-Mercaptoethanol, zur
Spaltung der Disulfidbrücken, versetzt.
Das Probenmaterial wurde in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühltem Mörser
zerkleinert. Anschließend wurden ca. 30 mg der pulverisierten Probe in einem
vorgekühlten Eppendorf-Tube (Eppendorf AG, 22331 Hamburg) mit 600 µl des
vorbereiteten RLT-Puffers vermischt. Durch zehnmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-
Material und Methoden
21
Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle wurde die Probe homogenisiert. Alle
weiteren Präparationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur.
Zunächst wurde das Homogenat zur Beseitigung von Zelltrümmern 3 min bei
13 000 rpm (Biofuge pico; Heraeus Instruments, 63450 Hanau) zentrifugiert, der
Überstand vorsichtig abpipettiert und auf eine gDNA-Eliminationssäule gegeben.
Diese wurde für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde zur Fällung
der RNA mit dem gleichen Volumen 70%igem Ethanol vermischt und anschließend
in zwei Schritten auf eine RNeasy®-Säule überführt. Durch eine 1 minütige
Zentrifugation bei 13 000 rpm wurden die gelösten Nukleinsäuren ins Innere der
Säule getrieben, wo eine Anlagerung an eine Kieselgelmembran erfolgte.
Anschließend wurden drei Waschschritte durchgeführt, zunächst mit 700 µl RW1-
Puffer, dann zweimal mit je 500 µl ethanolhaltigem RPE-Puffer. Bei den ersten
beiden Waschschritten wurde mit 13 000 rpm für 1 min zentrifugiert, beim letzten zur
vollständigen Trocknung der Säule für 2 min. Der Durchfluss wurde jeweils
verworfen. Nach dem Trocknen wurde die RNeasy®-Säule in ein neues
Sammelgefäß verbracht und die gebundene Gesamt-RNA mit 50 µl RNAse-freiem
Wasser durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für eine Minute eluiert.
Nach Abschluss der Isolierung wurde die Gesamt-RNA photometrisch quantifiziert
(Eppendorf Biophotometer; Eppendorf AG, 22331 Hamburg) und bis zur weiteren
Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
Zum Umschreiben der isolierten Gesamt-RNA wurden TaqMan-Reverse
Transcription Reagents (Applied Biosystems, Roche Diagnostics GmbH, 68298
Mannheim) verwendet. Zunächst wurde ein so genannter Master-Mix angesetzt, der
je Probe 2,5 µl 10-fach Puffer, 5,5 µl MgCl2 (25 mmol∙l-1), 5,0 µl dNTPs (10 mmol∙l-1),
0,625 µl Random-Hexamere, 0,625 µl Oligo(dT)-Primer, 0,5 µl RNase-Inhibitor sowie
0,68 µl Reverse Transkriptase (50 U∙µl-1) enthielt. Von der entsprechenden RNA-
Präparation wurde ein zu 200 ng äquivalentes Volumen mit RNase-freiem Wasser
auf ein Volumen von 9,6 µl erweitert und mit 15,4 µl Master-Mix versetzt. Die
Inkubation im Thermocycler (MyCycler; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939
München) lief unter folgenden Bedingungen ab: 10 min 25°C, 45 min 48°C und 5
min 95°C. Nach Abschluss des Programms wurden die Reaktionsgefäße auf 4°C
herunter gekühlt und die synthetisierte cDNA bei -20°C gelagert. Zur Kontrolle der
Umschreibung wurde eine PCR mit den Primern „ACTB for“ und „ACTB rev“ zum
Material und Methoden
22
Nachweis des konstitutiv exprimierten Gens ß-Aktin mit anschließender Gel-
Elektrophorese durchgeführt (2.4.1.1).
2.3.2 Präparation von Rohmembranen
Die Isolierung der Rohmembranen erfolgte nach einer modifizierten Methode nach
OSSWALD et al. (2005). Je 1 g jejunale Mukosa wurde in 10 ml eisgekühltem
Homogenisierungspuffer versetzt mit 50 µl PMSF überführt und anschließend in
einem Elvehjem-Potter (Potter S30; B. Braun Melsungen AG, 34212 Melsungen)
durch zehn Schübe bei höchster Stufe homogenisiert. Eine Zentrifugation für 20 min
bei 2 000 g und 4°C (Sorvall® RC-5C, Rotor SM24; Sorvall Instruments, Du Pont
Company, Wilmington, USA) schloss sich an. Das entstandene Pellet, dass vor allem
Zelltrümmer, Zellkerne und Mitochondrien enthielt, wurde verworfen, der Überstand
für weitere 60 min bei 40 000 g und 4°C zentrifugiert. Durch die zweite Zentrifugation
erreicht man eine Trennung cytosolischer Proteine, die sich im Überstand
anreichern, von der Plasmamembranfraktion, die ein anderes Sedimentations-
verhalten besitzt und sich deshalb im entstandenen Pellet wieder findet. Je nach
Größe wurde das Pellet in 500-1000 µl eisgekühltem Resuspensionspuffer mit einem
Zusatz von 15 µl Proteaseinhibitor (Protease Inhibitor Cocktail; Sigma-Aldrich, St.
Louis, USA) aufgeschwemmt und anschließend durch zehnmaliges Aufziehen mit
einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle resuspendiert. Nach
Bestimmung der Proteinkonzentration (2.2.2) wurden die Präparationen in 50 µg
Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
2.3.3. Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV)
Die Isolierung der Bürstensaummembranvesikel erfolgte nach einer modifizierten
Mg2+-EGTA-Präzipitationsmethode (KAUNE et al. 1992; SCHRÖDER et al. 1998).
Neben der Abtrennung der Zellorganellen lässt sich hierbei aufgrund der
unterschiedlichen Affinität verschiedener Zellmembrananteile zu Mg2+ (SHEIKH et al.
1982) durch definierte Zentrifugationsschritte die Bürstensaummembranfraktion
spezifisch anreichern.
Material und Methoden
23
Die bei -80°C gelagerten Proben wurden ca. 12 h vor Präparationsbeginn bereits in
einen Gefrierschrank mit nur -20°C verbracht. Für die Präparation wurden dann ca.
20-30 g Gewebe in der 2-fachen Menge Präparationspuffer 1 langsam auf Eis
aufgetaut. Auch alle weiteren Schritte wurden auf Eis bzw. in einer auf 4°C gekühlten
Zentrifuge durchgeführt. Die aufgetaute Probe wurde mithilfe eines Vibromischers
(Vibro-Mixer; Chemap AG, 8604 Volketswil, Schweiz) 10 min bei höchster
Vibrationsstufe in Schwingung versetzt um die Enterozyten von der Darmwand
abzulösen. Anschließend wurde die Suspension aus Zellen und Puffer durch ein
Haushaltssieb vom restlichen Darmgewebe separiert und mit der 4-fachen Menge an
eiskaltem A. dest. aufgefüllt, wodurch die Zellen osmotisch aufgebrochen wurden.
Nach 10 minütiger Inkubation wurde die Zellsuspension mit einem Haushaltsmixer
(Turboblender, Modell D70; Moulinex) dreimal für jeweils 1 min bei Stufe 4
homogenisiert und damit die restlichen intakten Enterozyten mechanisch
aufgebrochen. Um eine übermäßige Erwärmung der Suspension durch den
Mixvorgang zu verhindern, wurde diese zwischen den Schritten jeweils 2 min auf Eis
gestellt. Nach dem letzten Mixvorgang wurde der entstandene Schaum, der
hauptsächlich aus durch Erwärmung denaturierten Proteinen besteht, mit einer
Wasserstrahlpumpe entfernt.
Nachdem eine Probe (1 ml) zur späteren Bestimmung von Proteinkonzentration und
Enzymaktivität (siehe 2.2.2 und 2.2.3) entnommen worden war, wurde das
Homogenat unter langsamem Rühren tropfenweise mit MgCl2 (1 mol∙l-1) bis zu einer
Endkonzentration von 10 mmol∙l-1 versetzt und 15 min inkubiert. Während dieser Zeit
aggregieren Mg2+-Ionen in unterschiedlichem Maße mit den Membranfragmenten.
Aufgrund der geringer vorhandenen Oberflächenladung binden die Mg2+-Ionen
weniger stark an die apikalen Membranfragmente, wodurch deren Separation durch
die sich anschließende Differentialzentrifugation ermöglicht wird. Eine Zentrifugation
für 18 min bei 3 300 g und 4°C (Sorvall® RC-5C, Rotor GSA; Sorvall Instruments, Du
Pont Company, Wilmington USA) schloss sich an. Das entstandene Pellet wurde
verworfen, der Überstand für weitere 40 min bei 26 900 g und 4°C zentrifugiert. Das
entstandene Pellet wurde in 35 ml Präparationspuffer 2 aufgeschwemmt und
anschließend in einem Elvehjem-Potter (Potter S30; B. Braun Melsungen AG, 34212
Melsungen) durch zehn Schübe bei höchster Stufe homogenisiert. Darauf folgte eine
weitere tropfenweise MgCl2–Zugabe unter langsamem Rühren bis zu einer
Endkonzentration von 10 mmol∙l-1 und anschließender 15 minütigen Inkubation. Die
Material und Methoden
24
zuvor beschriebenen Zentrifugationsschritte (18 min, 3 300 g, 4°C und 40 min, 26
900 g, 4°C) wurden ebenfalls wiederholt, wobei aufgrund des geringeren
Probenvolumens ein anderer Rotor (Rotor SS34; Sorvall Instruments) verwendet
wurde. Das nach der zweiten Zentrifugation entstandene Pellet wurde in 35 ml
Präparationspuffer 3 mittels des o. g. Potters in gleicher Weise homogenisiert und
anschließend bei 34 500 g und 4°C für 45 min zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen, das entstandene Pellet je nach Größe mit 1-2 ml Präparationspuffer 3
versetzt und mit einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle durch
mehrmaliges Aufziehen resuspendiert. Zur Bestimmung der Endproteinkonzentration
sowie der Enzymaktivität wurden 500 µl Vesikelsuspension entnommen und bei
-20°C gelagert.
Die verbleibende Suspension wurde in 500 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
Die einzelnen Präparationsschritte sind zur besseren Übersicht in Abbildung 2.1
schematisch dargestellt.
Material und Methoden
25
Isolation der Enterozyten
(ca. 30g Darmmaterial)
Osmotisches und mechanisches
Aufbrechen der Enterozyten
Ausgangshomogenat
1.MgCl2-Fällung
(15 min Inkubation)
Überstand
Proben für Protein- und Enzymbestimmung
Zentrifugation
18 min, 3 300g Pellet verwerfen
Pellet verwerfen
Überstand verwerfen
Zentrifugation
40 min, 26 900g
Pellet resuspendieren
Überstand
2.MgCl2-Fällung
(15 min Inkubation)
Überstand verwerfen
Pellet resuspendieren
Überstand verwerfen
Pellet resuspendieren
Zentrifugation
40 min, 26 900g
Zentrifugation
18 min, 3 300g
Zentrifugation
45 min, 34 500g
Vesikelsuspension
für Aufnahmeversuche
Proben für Protein- und Enzymbestimmung
Isolation der Enterozyten
(ca. 30g Darmmaterial)
Osmotisches und mechanisches
Aufbrechen der Enterozyten
Ausgangshomogenat
1.MgCl2-Fällung
(15 min Inkubation)
Überstand
Proben für Protein- und Enzymbestimmung
Zentrifugation
18 min, 3 300g Pellet verwerfen
Pellet verwerfen
Überstand verwerfen
Zentrifugation
40 min, 26 900g
Pellet resuspendieren
Überstand
2.MgCl2-Fällung
(15 min Inkubation)
Überstand verwerfen
Pellet resuspendieren
Überstand verwerfen
Pellet resuspendieren
Zentrifugation
40 min, 26 900g
Zentrifugation
18 min, 3 300g
Zentrifugation
45 min, 34 500g
Vesikelsuspension
für Aufnahmeversuche
Proben für Protein- und Enzymbestimmung
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV (g
bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte
Zentrifugationsdauer).
Material und Methoden
26
2.4 Expressionsstudien
Es wurden zwei Arten von Expressionstudien durchgeführt. Die Expression an
TRPV6 und PMCA wurde mithilfe von quantitativer RT-PCR auf Transkriptionsebene
untersucht. Als Ausgangsmaterial für diese Expressionsstudie wurde die
synthetisierte cDNA (2.3.1) verwendet. Auf Translationsebene wurde die Expression
an TRPV6 und PMCA in Rohmembranpräparationen (2.3.2) mittels Western Analyse
untersucht.
2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Bei der Polymerase-Kettenreaktion wird ein Stück der vorliegenden DNA bzw. cDNA
mit Hilfe von sequenzspezifischen Primern vervielfältigt. Jede PCR stellt eine
mehrfache Abfolge von Zyklen dar, wobei jeder Zyklus in der Regel aus drei
Teilschritten besteht. Zunächst werden die DNA-Doppelstränge durch Erhitzung auf
95°C voneinander getrennt, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den
komplementären Basen zerstört werden (Denaturierung). Anschließend wird das
Reaktionsgemisch wieder herunter gekühlt, dies ermöglicht die Anlagerung der
Primer an die Matrizenstränge (Annealing). Die genaue Annnealing-Temperatur
hängt von der Basenzusammensetzung der Primer ab. Die DNA-Polymerase kann
nun von diesem kurzen doppelsträngigen Stück ausgehend einen zur Matrize
komplementären Strang aus den zugegebenen dNTPs synthetisieren (Elongation).
Die optimale Arbeitstemperatur des Enzyms liegt in der Regel bei 72°C. Diese drei
Teilschritte werden mehrfach wiederholt, wobei die Zeitdauer der einzelnen Schritte
von der Länge des PCR-Produktes abhängt. Das Protokoll der TaqMan PCR sieht
nur eine Zwei-Schritt-PCR mit kombiniertem Annealing-Extinktions-Schritt bei 60°C
vor. Da die Hybridisierung der Sonde im Gegensatz zu den PCR-Primern während
der Elongationsphase nicht zusätzlich durch die DNA-Polymerase stabilisiert wird,
wird so ein temperaturbedingtes Lösen vom Matrizenstrang verhindert. Eine erhöhte
MgCl2-Konzentration ermöglicht eine Anlagerung der Primer und Sonden auch bei
einer höheren Annealingtemperatur. Nach jedem Zyklus verdoppelt sich theoretisch
die Anzahl der neu synthetisierten DNA-Fragmente (Amplifikate).
Material und Methoden
27
2.4.1.1 ß-Aktin PCR
Um den Erfolg der cDNA-Synthese zu überprüfen wurde eine PCR mit ß-Aktin-
spezifischen Primern durchgeführt. Dabei wurde die FastStart Taq DNA Polymerase
(Roche Applied Science, 68298 Mannheim) unter Standardbedingungen verwendet
(2 mmol∙l-1 MgCl2, 0,2 mmol∙l-1 dNTPs, 0,5 µmol∙l-1 sense Primer, 0,5 µmol∙l-1
antisense Primer, 1 U Taq Polymerase). Die Inkubation im Thermocycler (MyCycler;
Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) lief unter folgenden Bedingungen ab:
5 min 95°C, 30 Zyklen von 30 s 95°C, 30 s 55°C, 45 s 72°C und einmalig 10 min
72°C. Anschließend wurden die mit Roti®-Load DNA-Puffer (Roth GmbH & Co. KG,
76185 Karlsruhe) versetzten Proben mithilfe eines 3%igen Agarose-TAE-Gels bei
einer Spannung von 100 V (Power Pac 3000; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939
München) größenfraktioniert, wobei der pUC19-Marker (Roth GmbH & Co. KG,
76185 Karlsruhe) als Größenstandard verwendet wurde. Nach der
Agarosegelelektrophorese wurde das Gel 10 min in einer Ethidiumbromid-Lösung
gefärbt, 15 min in A. dest gewaschen und auf einem UV-Licht-Tisch beurteilt.
Tabelle 2.3: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von β-Aktin
Gen Primer Sequenz Produkt
ß-aktiv ACTB for 5`-ccctg agcgc aagta ctc-3` 125 bp
ACTB rev 5`-gcatt tgcgg tggac gat-3`
2.4.2 Die quantitative RT-PCR
2.4.2.1 Standardreihe für die Quantifizierung PMCA-spezifischer Transkripte
Die Standardreihe mit bekannter Anzahl an DNA-Fragmenten wird benötigt, um
unbekannte Ausgangsmengen an cDNA einer Probe zu berechnen. Die
Standardreihen sowie die Primer und Sonden für die Quantifizierung TRPV6- und
GAPDH-spezifischer Transkripte lagen in der Arbeitsgruppe bereits vor (WILKENS et
al. 2009).
PCR zur Herstellung der PMCA-spezifischen Transkripte
Als Matrize für die PCR diente jejunale cDNA, ein Reaktionsansatz enthielt als
Negativkontrolle keine cDNA, sondern eine entsprechende Menge A. dest.
Material und Methoden
28
Die Sequenzen der verwendeten Primer, die resultierende Amplifikatgröße sowie die
genauen Reaktionsbedingungen sind den Tabellen (Tab. 2.4 bis 2.6) zu entnehmen.
Tabelle 2.4: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von PMCA1b
Gen Primer Sequenz Produkt
PMCA PMCA sense 5`-ggtat tgctg gaact gatgt agcta a-3` 94 bp
PMCA antisense 5`-cgtcc ccaca taact gcttt-3`
Tabelle 2.5: Pipettierschema der PMCA-PCR
Volumen im Ansatz in µl
Konzentration der Gebrauchslösung
Konzentration im Ansatz
Wasser 17,65
PCR-Puffer 2,5 10-fach 1-fach
MgCl2 0,75 50 mmol∙l-1 1,5 mmol∙l-1
dNTPs 0,5 10 mmol∙l-1 0,2 mmol∙l-1
Primer sense 0,75 5 µmol∙l-1 0,15 µmol∙l-1
Primer antisene 0,75 5 µmol∙l-1 0,15 µmol∙l-1
Taq-Polymerase 0,1 5 U∙µl-1 0,02 U∙µl-1
cDNA 2,0
Gesamtvolumen 25,0
Tabelle 2.6: Inkubationsbedingungen der PMCA-PCR
I II, 40 Wiederholungen III
3 min 94°C 15 s 94°C 1 min 61°C
∞ 4°C
Aufreinigung und Sequenzierung des PCR-Produkts
Für die Ligation des PCR-Produktes in den Vektor war es notwendig, überschüssige
Primer, Enzyme und Salze aus dem Ansatz zu entfernen. Zur Aufreinigung des PCR-
Produktes wurde das MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, 40724 Hilden)
nach Herstellerangaben verwendet. Dazu wurde der PCR-Reaktionsansatz mit der
5-fachen Menge an PB-Puffer vermischt, das Gemisch anschließend zum Binden der
DNA auf eine MinElute-Säule gegeben und für 1 min bei 13 000 rpm (Biofuge pico;
Material und Methoden
29
Heraeus Instruments, 63450 Hanau) zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen
und die Säule mit 750 µl PE-Puffer und anschließender Zentrifugation bei 13 000 rpm
und 1 min gewaschen. Zur vollständigen Trocknung der Säule wurde ein weiteres
Mal zentrifugiert, bevor die Säule in ein neues Sammelgefäß überführt und die
gebundene DNA mit 10 µl sterilem Wasser durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für
1 min eluiert wurde.
Die Sequenzierung im Kettenabbruchverfahren erfolgte durch die Firma GATC
Biotech AG (78467 Konstanz). Die Spezifität der Sequenz wurde anschließend durch
Abgleich mit veröffentlichten Sequenzen anderer Spezies mithilfe des Algorhythmus
BLAST überprüft.
Ligation
Das aufgereinigte Amplifikat wurde in den linearisiert vorliegenden Vektor pGEM®-T
Easy (Promega GmbH, 8819 Mannheim) ligiert. Der Vektor enthält eine Ampicillin-
Resistenz und eine in einem lac-Operon liegende Multiple cloning region, die man
sich bei der anschließenden Selektion der Bakterien zunutze macht.
Die Ligation des Amplifikates erfolgte nach Anweisung des Herstellers, dazu wurden
3 µl des in A. dest. gelösten PCR-Produktes zusammen mit 50 ng pGEM-T Easy,
5 µl Rapid Ligation Buffer Konzentrat und 3 Units T4 DNA Ligase über Nacht bei 4°C
inkubiert.
Transformation
Für die Transformation wurden am nächsten Morgen 2 µl des Ligationsansatzes mit
25 µl Solopack Gold Competent Cells (Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande)
vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Für die Hitzeschocktransformation erfolgte
eine Erwärmung der Zellsuspension auf 42°C in einem Heizblock (Eppendorf
Thermomixer 5436; Eppendorf AG, 22331 Hamburg) bei 42°C für exakt 60 s mit
anschließender Kühlung auf Eis über eine Dauer von 2 min. Nachdem die Zellen für
1 h bei 37°C unter mäßigem Schütteln bei 150 rpm (Schüttelinkubator Typ 3031;
Gesellschaft für Labortechnik mbH, 30938 Burgwedel) in 500 µl LB-Flüssigmedium
ohne Antibiotikazusatz inkubiert worden waren, wurden anschließend 100 µl der
regenerierten Kulturen auf mit 40 µl XGal (50 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-
Galaktopyranosid) und 60 µl PTG-Lösung (100mM Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid)
bestrichenen Selektivnährböden (LB-Agar-Platten mit 25 µg/ml Ampicillin)
Material und Methoden
30
gleichmäßig ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Aufgrund der mit dem
Vektor übertragenen Ampicillin-Resistenz wachsen nur erfolgreich mit dem pGEM-T
Easy transformierte Zellen unter Bildung von blauen und weißen Kolonien auf dem
Selektivnährboden. Zellen, die ein Plasmid ohne das Ligationsprodukt in der Multiple
cloning region aufgenommen haben, verfügen über ein intaktes lacZ-Gen und sind
deshalb in der Lage, die Galaktose aus dem Nährboden abzubauen. Der bei diesem
Vorgang entstehende Farbstoff führt zur Bildung von blauen Kolonien. Wurde das
Insert jedoch in das Plasmid aufgenommen, wird das lacZ-Gen zerstört und die
Zellen bilden weiße Kolonien aus. Von diesen weißen Kolonien wurden 4
ausgewählt, jeweils einzeln von der Platte entnommen und in 3 ml LB-
Flüssigmedium mit Ampicillin-Zusatz bei 37°C und 150 rpm über Nacht inkubiert.
Plasmid-Präparation
Die Plasmide wurden mit dem kommerziell erhältlichen PureYieldTM Plasmid
Miniprep System (Promega GmbH, 8819 Mannheim) nach Angaben des Herstellers
aufgereinigt. Dazu wurden die Bakterien aus den Übernachtkulturen bei
Raumtemperatur 30 s bei 13 000 rpm (Biofuge pico; Heraeus Instruments, 63450
Hanau) abzentrifugiert und das Pellet anschließend mit 600 µl TE-Puffer
resuspendiert. Nach einer Zugabe von 100 µl „Cell-Lysis“-Puffer und Mischen durch
mehrmaliges Schwenken wurde die Lysisreaktion nach 2 min durch Zugabe von
350 µl kalter Neutralisationslösung gestoppt. Nach einer 3 minütigen Zentrifugation
bei 13 000 rpm wurde der Überstand auf eine Säule gegeben, worauf sich ein
weiterer Zentrifugationsschritt für 15 s bei 13 000 rpm anschloss. Die Säule wurde
mit 200 µl „Endotoxin-Removal“-Waschlösung und im Anschluss mit 400 µl
„Column“-Waschlösung gespült, wobei sich jeweils eine Zentrifugation bei
13 000 rpm für 30 s anschloss. Zuletzt wurde die Plasmid-DNA in 30 µl A. dest.
eluiert. Nachdem Reinheit und Konzentration der DNA photometrisch bestimmt
worden waren (Eppendorf Biophotometer; Eppendorf AG, 22331 Hamburg), wurde
sie bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Verdünnungsreihe
Anhand der photometrisch bestimmten Konzentration wurde als nächstes eine
Verdünnungsreihe hergestellt. Unter Berücksichtigung der Vektorgröße, der Größe
des Inserts und der Konzentration an Plasmid konnte computergestützt die Menge
Material und Methoden
31
an DNA errechnet werden, die notwendig ist, um eine Anfangskonzentration von 1010
Plasmiden pro 2 µl herzustellen. Diese wurde dann in weiteren Schritten jeweils 1:10
bis zu einer Konzentration von 102 pro 2 µl verdünnt. Diese Verdünnungsreihe mit
bekannter Konzentration wurde dann in der TaqMan PCR als Standard eingesetzt.
2.4.2.2 TaqMan-PCR
Bei der quantitativen PCR mit Hilfe von TaqMan-Sonden ist es möglich, bei
gleichzeitigem mitführen einer Standardreihe mit bekannter Anzahl an DNA-
Fragmenten, rechnerisch auf die amplifizierte Ausgangsmenge an cDNA zu
schließen. Bei der TaqMan PCR wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt, ein
Oligonuklotid, das zu dem zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt komplementär ist und
dessen 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (FAM, 6-Carboxy-
Fluorescein) markiert ist, während das 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (TAMRA,
6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin) trägt. Wird die intakte Sonde bei einer
spezifischen Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des
Reporter-Farbstoffes aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher unterdrückt.
Während der PCR bindet die Sonde zunächst mit den Primern an den
Matrizenstrang, während der Elongationsphase wird die Sonde dann aber durch die
5´-3´-Exonukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase hydrolysiert und durch einen
neuen Strang ersetzt. Durch die Sondenhydrolyse wird die räumliche Nähe zwischen
Reporter und Quencher unterbrochen. Der Anstieg der Fluoreszenz ist dabei direkt
proportional zur Anreicherung des Amplifikats.
Für die TaqMan-PCR wurde der TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied
Biosystems Deutschland GmbH, 64293 Darmstadt) verwendet. Die genaue
Zusammensetzung des Inkubationsansatzes ist der Tabelle 2.7 zu entnehmen. Die
Proben wurden jeweils im Doppelansatz untersucht. Als Leerwert diente ein Ansatz,
der A. dest. anstelle der cDNA enthielt.
Die bei der TaqMan PCR zur Quantifizierung von PMCA1b-spezifischen Transkripten
verwendeten Primer und Sonden (Tib Molbiol Syntheselabor GmbH, 12103 Berlin)
sowie die genauen Reaktionsbedingungen (Cycler Stratagene Mx3005P™; Agilent
Technologies Stratagene Products Division, Amsterdam, Niederlande) sind den
Tabellen 2.4, 2.8 und 2.9 zu entnehmen.
Material und Methoden
32
Tabelle 2.7: Pipettierschema der TaqMan-PCR
Volumen im Ansatz in µl
Konzentration der Gebrauchslösung
Konzentration im Ansatz
Wasser 6
10-fach Mix: 2 10-fach 1-fach
Primer sense 3 µmol∙l-1 0,3 µmol∙l-1
Primer antisense 3 µmol∙l-1 0,3 µmol∙l-1
Sonde 1 µmol∙l-1 0,1 µmol∙l-1
Universal Mastermix 10
cDNA 2
Gesamtvolumen 20
Tabelle 2.8: Sondensequenz
Gen Sonde Sequenz
PMCA PMCA TM 5`-FAM-caatg cttgt aaaat tgtca tccgt gaga--TMR-3`
Tabelle 2.9: Inkubationsbedingungen der TaqMan-PCR
I II III, 40 Wiederholungen
2 min 50°C 10 min 95°C
15 s 95°C
1 min 60°C
2.4.2.3 Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit der MxProQPCR-Software (Agilent Technologies,
Stratagene Products Division, Amsterdam, Niederlande). Aus den Ct-Werten, der
den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die
Hintergrundfluoreszenz ansteigt und der bekannten Anzahl an Kopien der
Standardreihe wurde eine lineare Regression erstellt. Anhand dieser konnte für die
Ct-Werte der Proben die jeweilige Kopienanzahl zugeordnet werden. Die Anzahl der
für TRPV6 und PMCA1b codierenden Transkripte wurden dann auf die Kopien von
GAPDH bezogen.
Material und Methoden
33
2.4.3. Western Blot Analysen
Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Puffer und Lösungen, die sich auf
Vorrat herstellen ließen, in alphabetischer Reihenfolge im Anhang B aufgeführt.
2.4.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese
Zur Vorbereitung auf die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE) wurden die präparierten Rohmembranen (2.3.2) (50 µg) 5 min bei
16 000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Mit dem verbleibenden Pellet
wurde auf zwei unterschiedliche Weisen weiter verfahren. Für den TRPV6-Nachweis
wurde das Pellet in 8 µl Denaturierungspuffer mit 5% ß-Mercaptoethanol gelöst und
dann 5 min bei 95°C denaturiert. Im Falle des PMCA-Nachweises wurde das Pellet
ebenfalls in 8 µl Denaturierungspuffer gelöst, dieser enthielt aber DTT in einer
Konzentration von 100 mmol∙l-1. Anschließend wurde fünf Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf ein SDS-Gel
(4,75% Sammelgel, 8,5% Trenngel) aufgetragen, eine Spur pro Gel wurde jeweils mit
einem Größenmarker (Fermentas Prestained Protein SM 0671; Fermentas GmbH,
68789 St. Leon-Rot (Bereich 10-170 kDa)) beladen. Die Proteine wurden
elektrophoretisch in einem diskontinuierlichen Puffersystem nach LAEMMLI (1970)
aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte mit SDS-Laufpuffer zuerst bei 60 V für
30 min, anschließend wurde auf 120 V für die Dauer von 90 min erhöht.
2.4.3.2 Tank-Blot-Verfahren
Die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch aus dem Gel auf eine
Nitrocellulosemembran (NC-Membran; AmershamTM-HybondTM-ECL, GE Healthcare,
80807 München) transferiert. Die mit Transferpuffer ohne SDS gefüllte Blotapparatur
wurde während des elektrophoretischen Transfers bei einer Spannung von 100 V für
120 min mit Eis gekühlt.
Anschließend wurden die Proteine auf der Membran mit Ponceau Rot angefärbt.
Anhand der Proteinfärbung sollte die gleichmäßige Proteinverteilung und somit der
Erfolg des Transfers überprüft werden. Dazu wurden die Membranen 5 min in
Ponceau Rot-Lösung unter Schwenken inkubiert. Wenn sich auf der Membran ein
gleichmäßiges Bandenmuster zeigte, wurden diese einige Minuten in PBS entfärbt
und für die Antikörper-Inkubation verwendet.
Material und Methoden
34
2.4.3.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen
Vor der Inkubation mit dem primären Antikörper wurde die Membran zur Blockierung
unspezifischer Protein-Bindungsstellen über Nacht bei 4°C in PBS mit 5%
Magermilchpulver inkubiert. Nach kurzem Schwenken in PBS wurde anschließend
der jeweilige primäre Antikörper auf die Nitrocellulosemembran gegeben. Die
entsprechenden Konzentrationen und Inkubationszeiten sind der Tabelle 2.7 zu
entnehmen. Nach der Inkubation wurde die Membran in einem sich vier Mal
wiederholenden Waschschritt jeweils 10 min in PBST geschwenkt und anschließend
mit dem passenden Sekundärantikörper inkubiert (siehe Tabelle 2.7). Nach der
Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde die Membran erneut gewaschen
(s. o.), im Falle der Villin-Antikörper-Inkubation wurde der Waschvorgang auf
einmalige 10 min verkürzt. Alle Antikörper-Inkubationen erfolgten stets bei
Raumtemperatur.
Zur Visualisierung des Signals wurde Pierce (SuperSignal® West Dura Extended
Duration Substrate; Thermo Scientific, 3747 N. Meridian Rd., USA) als Substrat für
die mit dem Sekundärantikörper verknüpfte Peroxidase verwendet. Nach
fünfminütiger Einwirkzeit erfolgte die Aufnahme der entstandenen Chemilumineszenz
mittels ChemiDoc-System. Die Auswertung der detektierten Proteinbanden erfolgte
mit der Quantifizierungs-Software „Quantity One“ (Bio-Rad Laboratories GmbH,
80939 München). Jede Bande wurde einzeln vermessen, wobei die erhaltene
dimensionslose Zahl das Produkt aus der Fläche unter der Kurve (mm²) multipliziert
mit der Pixeldichte (Intensität) darstellt. Da die Quantifizierung der Proteinexpression
abhängig von der aufgetragenen Menge und der Integrität der Proteine ist, wurde
Villin als interner Standard verwendet, um die Werte zu relativieren und vergleichbar
zu machen. Für die Quantifizierung wurde der Quotient aus der Menge an
gesuchtem Protein und der Menge an Villin gebildet und mit den Quotienten anderer
Tiere verglichen. Dabei wurden nur die Quotienten der Tiere verglichen, die auf
derselben Membran aufgetragen waren, um sicherzustellen, dass die Proteine den
exakt gleichen Inkubationsbedingungen ausgesetzt waren.
Material und Methoden
35
Tabelle 2.7: Antikörper und Inkubationsbedingungen für den spezifischen Proteinnachweis
Antikörper Verdünnung Inkubationszeit
Rabbit anti-TRPV6, polyklonal H90; Santa Cruz
1:400 2 h
Sekundärantikörper (anti-rabbit IgG-HRP) A9169; Sigma
1:10 000 1 h
Mouse anti-PMCA1/4, monoklonal 5F10; Santa Cruz
1:400 2 h
Sekundärantikörper (anti-mouse IgG-HRP) A2304; Sigma
1:10 000 1 h
Mouse anti-Villin, monoklonal CTS2192; Labgen
1:4 000 30 min
Sekundärantikörper (anti-mouse IgG-HRP) s. o.
1:25 000 20 min
2.4.3.4 Überprüfung der Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA
Der Nachweis der Antikörper-Spezifität erfolgte durch Präinkubation des anti PMCA-
Antikörpers mit dem antigenen Peptid, welches anhand der spezifischen
Erkennungs-Aminosäurensequenz (FLCLEGKEFNRLIRNEKGEV) synthetisiert
worden war (JPT Peptide Technologies GmbH, 12489 Berlin). In 1 ml PBST wurden
2 µg primärer Antikörper und 100 µg antigenes Peptid bei 37°C mit 200 rpm für 2 h
im Schüttler inkubiert (Schüttelinkubator Typ 3031; Gesellschaft für Labortechnik
mbH, 30938 Burgwedel). Im Anschluss wurde das Gemisch über Nacht bei 4°C
gelagert. Parallel wurde zur Kontrolle eine entsprechende Menge Antikörper den
gleichen Inkubationsbedingungen ausgesetzt. Am nächsten Morgen wurden die
Ansätze noch mal für 1 h bei Raumtemperatur geschwenkt bevor die präinkubierten
Antikörper auf zwei identische Membranen mit transferierten Proteinen gegeben
wurden. Da vom Hersteller angegeben wird, dass der Antikörper reaktiv gegenüber
der PMCA aus Huhn und Ratte ist, wurden Membranen verwendet, die jejunale
Rohmembranen von Ratte und Huhn sowie von verschiedenen intestinalen
Abschnitten vom Schaf trugen. Der immunologische Nachweis erfolgte wie in Kap.
2.4.3.3 beschrieben.
Material und Methoden
36
2.4.3.5 Enzymatische Deglykosilierung des TRPV6-Proteins
Um eventuell vorhandene Glykosilierungen vom TRPV6-Protein zu entfernen,
wurden die Proben vor der Gel-Elektrophorese enzymatisch behandelt. Als
Endoglykosidase wurde das Enzym PNGase F (New England Biolabs GmbH, 65926
Frankfurt), welches die N-Glycan-Bindungen von Glykoproteinen zwischen Asparagin
und der Kohlenhydratkette spaltet, verwendet. Die Proben (50 µg) wurden wie oben
beschrieben 5 min bei 16 000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die im
verbleibenden Pellet enthaltenen Proteine in 2 µl 10-fach Glykoprotein
Denaturierungspuffer und 18 µl A. dest. 10 min bei 100°C denaturiert. Nach Zugabe
von 4 µl 10-fach G7-Reaktions-Puffer, 4 µl NP40 (10%), 10 µl A. dest. und 2 µl
PNGase F erfolgte eine Inkubation bei 37 °C für 1 h. Durch Zugabe des 3-fachen
Volumens eiskalten Acetons wurden die Proteine bei -20 °C über Nacht gefällt. Am
nächsten Tag wurden die ausgefällten Proben 15 min bei 16 000 g zentrifugiert, der
Überstand verworfen und das Pellet bei 37°C 5 min im Heizblock getrocknet. Das
Pellet wurde in 15 µl Denaturierungspuffer mit 5% ß-Mercaptoethanol gelöst und
nach 5 minütiger Hitzedenaturierung bei 95°C zusammen mit Proben ohne
Enzymbehandlung auf ein Gel aufgetragen. Elektrophorese und immunologischer
Proteinnachweis erfolgten wie in Kap. 2.4.3.1- 2.4.3.3 beschrieben.
2.5 Funktionelle Studien
Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Puffer und Lösungen, die sich auf
Vorrat herstellen ließen in alphabetischer Reihenfolge im Anhang C aufgeführt.
2.5.1 Durchführung der Aufnahmestudien in BSMV
Die bei -80°C gelagerte Vesikelsuspension wurde zunächst auf Eis aufgetaut und
anschließend durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-Einmalspritze und einer
0,45 x 25 mm Kanüle erneut homogenisiert. Die im Folgenden beschriebenen
Schritte wurden alle bei Raumtemperatur durchgeführt.
Zur Durchführung der Aufnahmestudien in die Bürstensaummembranvesikel wurde
die Vesikelsuspension mit dem jeweiligen radioaktiv-markierten Inkubationsansatz
(3H-Glukose oder 45Calcium) auf einem Schüttler (Heidolph REAX 2000; Heidolph
Material und Methoden
37
Instruments, 91126 Schwabach) vermischt und je nach Versuchsansatz für einen
definierten Zeitraum inkubiert. Durch Zugabe von 1 ml eiskalter Stopplösung wurden
die ablaufenden Transportvorgänge abgebrochen und die BSMV mittels
Schnellfiltrationstechnik (Nitrocellulose-Membranfilter, Porengröße 0,65 µm;
Sartorius AG, 37075 Göttingen) von der restlichen Inkubationslösung getrennt. Um
die Probe vollständig zu entfernen wurde das Reaktionsröhrchen erneut mit 1 ml
eisgekühlter Stopplösung nachgespült.
Der Filter wurde anschließend zweimal mit 5 ml Lösung gespült, bevor dieser in
einem Minivial (Polyethylen Vial, 6 ml; PerkinElmer, Life Sciences, 63110 Rodgau)
mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit (LumasafeTM Plus, Luma * LSC B.V.; PerkinElmer,
Life Sciences, 63266 Dreieich) versetzt wurde. Nach gründlichem Mischen wurde die
Aktivität in einem Flüssigkeits-Szintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500TR Liquid
Scintillation Analyzer; Canberra-Packard GmbH, 63266 Dreieich) bestimmt. Alle
Proben wurden in Dreifachbestimmung gemessen.
Um den Leerwert zu bestimmen, wurde der Inkubationsansatz ohne Zugabe von
Vesikelsuspension in gleicher Weise wie die Proben filtriert und analysiert. Zur
Ermittlung der Gesamtaktivität wurde der jeweilige Inkubationsansatz direkt mit der
Szintillationsflüssigkeit vermischt und gemessen. Auch hier erfolgten jeweils
Dreifachbestimmungen.
2.5.2 Berechnung von [Ca2+]frei
Konzentration an freiem Ca2+ ([Ca2+]frei) und Gesamt-Ca2+-Konzentration ([Ca2+]ges)
der Inkubationsansätze mit 0,5 mmol∙l-1 EGTA.
[Ca2+]frei [mmol∙l-1] 0,045 0,09 0,4 0,75 1,0 2,0 4,0
[Ca2+]ges [mmol∙l-1] 0,544 0,590 0,900 1,250 1,500 2,500 4,500
Die Konzentration an freiem Ca2+ ([Ca2+]frei) in Bezug auf die Gesamt-Ca2+-
Konzentration in den Inkubationsansätzen wurde mittels der Software WINMAX32
Version 2.50 bestimmt. EGTA fungiert als Komplexbildner, mit dem sich bei
bekannter Affinität von Calcium zu EGTA sowie unter einem definierten pH-Wert und
Material und Methoden
38
einer definierten Temperatur die Konzentration an freien Calcium-Ionen
entsprechend dem Massenwirkungsgesetz einstellt.
2.5.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme
Zur Überprüfung der funktionellen Integrität der BSMV wurden in einem ersten
Versuchsansatz, zeitabhängige Glukoseaufahmestudien durchgeführt. Hierzu
wurden Vesikel aus jejunalem Gewebe, das von Schafen aus einem Vorversuch mit
einem Versuchsprotokoll, welches ebenfalls eine Ca-restriktive Fütterung bzw. eine
Calcitriolbehandlung beinhaltete, stammte, verwendet und deren relative
Anreicherung überprüft.
Die Aufnahmerate wurde in zwei unterschiedlichen Reaktionsansätzen, mit einem
Na+-haltigen Inkubationsmedium bzw. einem Inkubationsmedium ohne Na+-Ionen,
bestimmt. Zu diesem Zweck wurden aus zweifach konzentriertem NaCl- bzw. KCl-
Transportpuffer, Glukose-Lösung (0,5 mmol∙l-1) und 3H-Glukose Inkubationsansätze
hergestellt. Hieraus wurden je 80 µl entnommen und diese mit 20 µl
Vesikelsuspension vermischt. Nach 10 s, 15 s, 25 s, 30 s, 1 min, 2 min, 5 min,
10 min, sowie 1 h, 3 h und 4 h Inkubationszeit wurde die Aufnahme mittels
Stopplösung unterbrochen und wie oben beschrieben weiterbehandelt. Die
Endkonzentration von Glukose betrug jeweils 0,05 mmol∙l-1.
Die Glukose-Aufnahme in die BSMV als Funktion der Zeit wird in nmol Glukose je mg
Protein angegeben. Die Berechnung der Glukoseaufnahme erfolgte analog zu der
Berechnung der Calcium-Aufnahme (siehe Kap. 2.5.6).
2.5.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme
Mit der Untersuchung der zeitabhängigen Calciumaufnahme in die BSMV wurde der
Zeitraum der linearen Aufnahme bestimmt, damit ein definierter Zeitpunkt für die
konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien festgelegt werden konnte. Für die
Untersuchung standen ebenfalls Vesikelpräparationen aus dem Vorversuch zur
Verfügung, an denen der Zeitverlauf der Ca2+-Aufnahme in BSMV vom Schaf
exemplarisch bestimmt wurde.
Material und Methoden
39
Die Analyse der Aufnahme von Calcium in die BSMV als Funktion der Zeit wurde
sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 im
Inkubationsansatz durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach
konzentriertem KCl-Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO bzw.
A23187-Stammlösung in DMSO (1 mg∙ml-1), CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca
Inkubationsansätze hergestellt. Hieraus wurden je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension
vermischt. Nach 10 s, 20 s, 30 s, 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, sowie 1 h, 2 h und 3 h
Inkubationszeit wurde die Aufnahme mittels Stopplösung unterbrochen und wie oben
beschrieben weiterbehandelt. Die Endkonzentrationen in den Aufnahmestudien
betrugen für EGTA 0,5 mmol∙l-1, für A23187 10 µg∙ml-1 und für [Ca2+]frei 0,09 mmol∙l-1.
2.5.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme
Die Analyse zur Aufnahme von Calcium in die BSMV in Abhängigkeit von [Ca2+]frei
wurde bei freien Ca2+-Konzentrationen von 0,045, 0,09, 0,4, 0,75, 1,0, 2,0 und
4,0 mmol∙l-1, in einem Ansatz zusätzlich in Gegenwart des Calcium-Ionophors
A23187, durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach konzentriertem KCl-
Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO bzw. A23187-Stammlösung in
DMSO (1 mg∙ml-1), CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca Inkubationsansätze
hergestellt. Hieraus wurden je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension vermischt, 30 s bei
RT inkubiert und anschließend wie oben beschrieben bearbeitet. Die
Endkonzentrationen in den Aufnahmestudien betrugen für EGTA 0,5 mmol∙l-1, für
A23187 10 µg∙ml-1 und für [Ca2+]frei zwischen 0,045 und 4,0 mmol∙l-1. Die
Untersuchung in Gegenwart von A23187 wurde bei einer freien Ca2+-Konzentration
von 0,09 mmol∙l-1 durchgeführt.
2.5.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen
Aus den ermittelten Daten der Szintillationsmessungen sowie der
Proteinkonzentration im Inkubationsansatz wurde die Ca2+-Aufnahme (ACa) in die
BSMV als Funktion der Zeit bzw. der Konzentration an freiem Calcium mit
nachstehender Formel berechnet.
Material und Methoden
40
(cpmProbe,t – cpmLeer) x [Ca2+]frei
ACa (t, [Ca2+]frei) = .
cpmTotal x [Protein]
mit:
ACa (t, [Ca2+]frei) Ca2+-Aufnahme nach der Inkubationsdauer t bei einer freien
Ca2+-Konzentration von [Ca2+]frei [nmol∙ (mg Protein)-1]
cpmProbe,t gemessene Aktivität in der Probe nach der Inkubationsdauer t
[cpm]
cpmLeer gemessene Aktivität des Leerwerts [cpm]
[Ca2+]frei Konzentration an freiem Ca2+ im Inkubationsansatz [mmol∙l-1]
cpmTotal Gesamtaktivität im Inkubationsansatz [cpm]
[Protein] Proteinkonzentration im Inkubationsansatz [mg∙l-1]
Anhand der berechneten Werte wurden für gleiche Inkubationszeiten die kinetischen
Kenngrößen einer konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme im Sinne einer
Michaelis-Menten-Kinetik ermittelt. Zur Kalkulation der Variablen wurde die Software
GraphPad Prism® verwendet. Dabei wurde folgende Formel zu Grunde gelegt:
Vmax ∙ [Ca2+]frei
Ca2+-Aufnahme = –––––––––––––– + U ∙ [Ca2+]frei
Km + [Ca2+]frei
mit:
Vmax Maximum der sättigbaren Aufnahme [nmol∙ (mg Protein)-1]
Km Michaelis-Menten-Konstante [mmol∙l-1]
[Ca2+]frei Konzentration des freien Calciums [mmol∙l-1]
U Steigung des nicht sättigbaren Anteils der Ca2+-Aufnahme
Material und Methoden
41
2.5.8 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die
Calciumaufnahme in jejunale BSMV
Die Analyse zum Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die
Aufnahme von Calcium in die BSMV wurde bei einer freien Ca2+-Konzentration von
1,0 mmol∙l-1 und einer Ruthenium Rot-Endkonzentration von 100 µmol∙l-1
durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde aus zweifach konzentriertem KCl-
Transportpuffer, EGTA-Lösung (10 mmol∙l-1), DMSO, Ruthenium Rot (1 mmol∙l-1)
CaCl2-Lösung (10 mmol∙l-1) und 45Ca Inkubationsansätze hergestellt. Hieraus wurden
je 60 µl mit 20 µl Vesikelsuspension vermischt, 30 s bei RT inkubiert und
anschließend wie oben beschrieben bearbeitet.
2.6 Statistik
In den Tabellen und Abbildungen werden die Ergebnisse als arithmetische
Mittelwerte ( x ) mit entsprechenden Standardfehlern (SEM) angegeben. Die
statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm GraphPad
Prism® Version 5.00 (GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com).
Die Einzelwerte einer Gruppe wurden zunächst auf das Vorliegen einer Gauß´schen
Normalverteilung überprüft. Zum Vergleich zweier Gruppenmittelwerte wurde der
nicht gepaarte t-Test nach Student gewählt. Mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse
(Two-way ANOVA) wurden die Expressionsdaten sowie die kinetischen Kenngrößen
aller vier Gruppen miteinander verglichen um den Einfluss der Fütterung, der
Behandlung und einer möglichen Interaktion zu untersuchen.
Für die Signifikanzangaben gilt:
n. s. nicht signifikant
p<0,05 *, schwach signifikant
p<0,01 **, signifikant
p<0,001 ***, hoch signifikant
Ergebnisse
42
3 Ergebnisse
3.1 Charakterisierung des Tiermodells
Durch die Bestimmung der Konzentrationen von Gesamtcalcium (Ca), ionisiertem
Calcium (Ca²+), Phosphat (Pi) und Calcitriol im Plasma sollte der Effekt der Calcium-
Depletions-Fütterung und der Calcitriolbehandlung auf die Calcium-Homöostase
überprüft werden.
3.1.1 Einfluss der Fütterung auf wichtige Blutparameter
In der Tabelle 3.1 ist der Einfluss der mindestens vierwöchigen Ca-Restriktion auf die
wichtigsten Blutparameter dargestellt. Die Plasma-Ca-Konzentrationen und ebenso
die Ca2+-Konzentrationen waren bei den Ca-restriktiv gefütterten Schafen signifikant
erniedrigt, während die Pi- und Calcitriol-Spiegel im Plasma gegenüber den Tieren
der Kontrollfütterungsgruppe signifikant erhöht waren.
Für die Messung der Parameter wurden Blutproben, die unmittelbar vor der
Calcitriolbehandlung aus dem Venenkatheter entnommen wurden, verwendet. Bei
einem Tier der Kontrollgruppe gelang es nicht den Venenkatheter zu platzieren,
weshalb in der Kontrollgruppe die Auswertung nur mit n = 9 Tieren durchgeführt
wurde.
Tabelle 3.1: Ca-, Ca2+-, Pi- und Calcitriol-Konzentration im Plasma (Ca, Pi,
Calcitriol) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen nach einer mindestens
vierwöchigen diätetischen Calcium-Depletion ( x ± SEM, n = Anzahl
der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01,
***: p < 0,001
Gruppe Ca
[mmol ∙ l-1] Ca2+
[mmol ∙ l-1] Pi
[mmol ∙ l-1] Calcitriol [pg ∙ ml-1]
Kontrolle (Kon) n=9
2,57 ± 0,04 1,27 ± 0,01 1,82 ± 0,08 21,9 ± 2,1
Ca-Depletion (Ca-) n=10
2,37 ± 0,04** 1,19 ± 0,02*** 2,28 ± 0,12** 31,4 ± 3,4*
Ergebnisse
43
3.1.2 Unterschiede der Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma 12 h nach
der Behandlung
Die Auswirkung der Behandlung mit Calcitriol auf die Ca2+-Konzentration im Vollblut
sowie die Ca- und Pi-Konzentrationen im Plasma sind in Tabelle 3.2. dargestellt. Wie
erwartet, kam es infolge der Calcitriolinfusion in beiden Fütterungsgruppen innerhalb
der 12 h zu einem deutlichen Anstieg der Ca- und damit verbunden auch der Ca2+-
Konzentration. Ein signifikanter Anstieg der Pi-Konzentration infolge der
Calcitriolbehandlung konnte nur in der Kontrollfütterungsgruppe beobachtet werden.
Tabelle 3.2: Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma (Ca, Pi) bzw. Vollblut
(Ca2+) von Schafen 12 h nach Calcitriolbehandlung, Vergleich
zwischen den behandelten und den unbehandelten Tieren einer
Fütterungsgruppe ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des
Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001
Kon unbehandelt
n=4
Kon behandelt
n=5
Ca- unbehandelt
n=5
Ca- behandelt
n=5
Ca [mmol ∙ l-1] 2,69 ± 0,08 3,14 ± 0,05** 2,35 ± 0,3 2,66 ± 0,06**
Ca2+ [mmol ∙ l-1] 1,33 ± 0,02 1,54 ± 0,02*** 1,22 ± 0,03 1,33 ± 0,02*
Pi [mmol ∙ l-1] 1,62 ± 0,14 2,53 ± 0,15** 2,30 ± 0,19 2,18 ± 0,14
3.2 RNA-Expression
Mit Hilfe der TaqMan-PCR wurden die für TRPV6 und PMCA codierenden
Transcripte relativ zur Expression von GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-
Dehydrogenase) (Abb. 3.1) ermittelt. Der quantitative Nachweis konnte bei allen 20
Tieren erbracht und die Werte gruppenweise miteinander verglichen werden. Die
Werte der Leerwertproben lagen stets unterhalb der Nachweisgrenze. Die
statistische Auswertung ergab eine signifikant höhere Expression der TRPV6-mRNA
sowie der PMCA-mRNA bei den behandelten Tieren (Abb. 3.2, 3.3). Außerdem
zeigte sich ein signifikanter Effekt der Kombination aus Fütterung und Behandlung
auf die PMCA-mRNA-Expression. Für beide Gene zeigt sich eine höhere Expression
in der Calcium-Depletions-Gruppe gegenüber der Kontroll-fütterungsgruppe,
statistisch ließ sich dieser Fütterungseffekt aber nicht bestätigen.
Ergebnisse
44
Abb. 3.1: Darstellung der mRNA-Gehalte an GAPDH im Jejunum adäquat bzw.
restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol-
bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);
Ergebnisse der 2-way ANOVA.
Abb. 3.2: Darstellung der mRNA-Gehalte an TRPV6 im Verhältnis zu GAPDH
im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl
der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: ***: p <
0,001.
Ergebnisse
45
Abb. 3.3: Darstellung der mRNA-Gehalte an PMCA im Verhältnis zu GAPDH im
Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung ( x ± SEM, Anzahl
der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: *: p < 0,05,
***: p < 0,001.
3.3 Nachweis und Quantifizierung der spezifischen Transport-
proteine im Jejunum
Auf einer Membran wurden immer Proben von jeweils fünf Tieren aus zwei Gruppen
untersucht und miteinander verglichen. Um den Vergleich aller Gruppen miteinander
zu ermöglichen, mussten insgesamt vier Membranen angefertigt werden. Die
Auswertung erfolgte durch die Vermessung der spezifischen Banden bezogen auf
Villin als internen Standard. Jeweils eine repräsentative Membran ist hier
exemplarisch dargestellt. Die Ergebnisse der Auswertung sind als Balkendiagramm
dargestellt, wobei der Mittelwert der Expression der unbehandelten Gruppen bzw.
der Kontrollfütterungsgruppen gleich 1 gesetzt wurde und die Expressionen der
behandelten Gruppe bzw. der Calcium-Depletions-Gruppen normiert auf diese
aufgetragen wurde.
3.3.1 Semiquantitative Detektion des TRPV6-Proteins
Das TRPV6-Protein wurde in Gesamtmembranen jejunaler Enterozyten als
Doppelbande mit einer Größe von ca. 70 und 72 kDa bei allen Tieren nachgewiesen.
In Abbildung 3.4 ist eine Membran exemplarisch dargestellt.
Ergebnisse
46
Die Vermutung, dass es sich bei der Bande mit dem höheren Molekulargewicht um
eine glykosilierte Form des Proteins handelt konnte nicht bestätigt werden. Trotz
Vorinkubation der Probe mit der Endoglykase (PNGase F), zwecks Abspaltung der
Glykosilierung, traten ebenfalls zwei Banden auf. Ausgewertet wurde nur die untere
Bande, da sich für den Gruppenvergleich kein Unterschied ergab, ob nur die untere
oder beide Banden berücksichtigt wurden.
Als interner Standard konnte das Villin-Protein in einer Größe von 95 kDa in allen
Proben detektiert werden (Abb. 3.5).
Abb. 3.4: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des TRPV6-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische
Membran: unbehandelte und behandelte Tiere der Calcium-
Depletions-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit einem
unbehandelten, jeweils abwechselnd aufgetragen.
Abb. 3.5: Der zur Abbildung 3.4 dazugehörige semiquantitative Nachweis von
Villin
Bei der Auswertung fiel auf, dass sich für ein Tier (Kontrollfütterung – unbehandelt)
Werte ergaben, die das 3-fache des Mittelwertes der restlichen vier Tiere dieser
Gruppe betrugen (Abb. 3.6). Aus diesem Grund wurde dieses Tier als Ausreißer
betrachtet und nicht für den Gruppenvergleich mit den Tieren (Kontrollfütterung –
behandelt) herangezogen. So ergab sich ein deutlicher Einfluss der
Calcitriolbehandlung auf die Expression des TRPV6-Proteins in jejunalen
Gesamtmembranen. In der Kontrollfütterungsgruppe war bei den behandelten Tieren
die Expression gegenüber den unbehandelten Tieren dieser Gruppe signifikant
erhöht, ebenso in der Calcium-Depletions-Fütterungsgruppe (Abb. 3.7). Die
75 kDa75 kDa
95 kDa95 kDa
Ergebnisse
47
diätetische Ca-Restriktion hatte keinen signifikanten Einfluss auf die jejunale TRPV6-
Protein-Expression (Abb. 3.8).
Abb. 3.6: Densitometrische Werte der TRPV6-Expression bezogen auf die Villin-
Expression, auf der betreffenden Membran sind jeweils fünf
unbehandelte und fünf behandelte Tiere der Kontrollfütterungsgruppe
aufgetragen.
Abb. 3.7: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung
(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der unbehandelten
Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der behandelten Tiere
normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in
Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01.
Ergebnisse
48
Abb. 3.8: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung
(weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat
gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Ca-
restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p
< 0,05, **: p < 0,01.
3.3.2 Spezifität des PMCA-Protein-Nachweises
Die Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA wurde in der Western Analyse mittels
Präinkubation mit dem antigenen Peptid überprüft. In den jejunalen
Gesamtmembranen vom Schaf wurde das PMCA-Protein in einer Größe von 140
und 80 kDa detektiert. Laut Hersteller ist aber nur eine Bande mit einer Größe von
129-140 kDa zu erwarten, dies ließ sich auch an Gesamtmembranpräparationen vom
Hühnerdarm bestätigen. Nach Inkubation mit dem präinkubierten Antikörper
verschwanden beide Banden (Abb. 3.9), somit ist davon auszugehen, dass sowohl
die 140 kDa als auch die 80 kDa Bande beim Schaf spezifisch sind. Bei dem kleinen
Fragment (80 kDa) ist nicht klar, ob es in vivo existiert oder durch die Präparation
induziert wurde. Für die Auswertung wurden beide Banden vermessen.
Ergebnisse
49
Abb. 3.9: Überprüfung der PMCA-Antikörper-Spezifität an Gesamtmembranen
verschiedener Darmabschnitte von Ratte (1), Huhn (2), Jejunum (3),
Colon (4) und Pansen (5) vom Schaf.
3.3.3 Semiquantitative Detektion des PMCA-Proteins
Das PMCA-Protein wurde in jejunalen Gesamtmembranen mit zwei spezifischen
Banden (80 und 140 kDa) bei allen Tieren nachgewiesen (Abb. 3.10). Die
Calcitriolbehandlung hatte bei den Tieren der Kontrollfütterungsgruppe einen
signifikanten Einfluss auf die Expression des PMCA-Proteins. Bei den Calcium-
restriktiv gefütterten Tieren konnte kein statistisch abgesicherter Unterschied in der
jejunalen PMCA-Expressionshöhe durch die Behandlung festgestellt werden,
tendenziell ist aber die Menge an PMCA-Protein bei den behandelten Tieren erhöht
(Abb. 3.11). Die Auswertung ergab signifikant höhere PMCA-Expressionen bei den
behandelten Tieren der Kontrollfütterungsgruppe gegenüber denen der Calcium-
Depletionsgruppe. Die Expressionshöhe des Proteins wurde bei den unbehandelten
nicht durch die diätetische Calcium-Depletion beeinflusst (Abb. 3.12).
Abb. 3.10: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des PMCA-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische
Membran: behandelte Tiere der Calcium-Depletions- bzw. der
Kontroll-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit den restriktiv
gefütterten, jeweils abwechselnd aufgetragen.
140 kDa
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Antikörper Antikörper +
Antigenes Peptid
140 kDa
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Antikörper Antikörper +
Antigenes Peptid
140 kDa
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Antikörper Antikörper +
Antigenes Peptid
130 kDa
75 kDa
130 kDa
75 kDa
Ergebnisse
50
Abb. 3.11: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der
behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen ( x ± SEM, Anzahl
der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05.
Abb. 3.12: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12
Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression
der Calcium-restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen
( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students
t-Tests: *: p < 0,05.
Ergebnisse
51
3.4 Charakterisierung der BSMV
3.4.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktionen
Die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Leitenzym für die
Bürstensaummembran (BSM), sowie die Aktivität der Na+/K+-ATPase als
Markerenzym für die basolaterale Membran (BLM) wurden sowohl im ersten
Gewebehomogenat als auch in der Vesikelsuspension bestimmt (Tabelle 3.3).
Hierdurch war es möglich, die relative Anreicherung der Bürstensaummembranen
gegenüber den basolateralen Membranen abzuschätzen: sie betrug das 10,9 bis
14,2-fache der Ausgangsmenge. Die Aktivität der Leitenzyme wiesen weder im
Ausgangshomogenat, noch in der Vesikelsuspension signifikante Gruppen-
unterschiede auf, auch die relative Anreicherung unterschied sich nicht signifikant
zwischen den Gruppen.
Tabelle 3.3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der
Na+/K+-ATPase im Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension.
Darstellung der Anreicherungsfaktoren als Quotient aus den Werten
von Suspension und Homogenat. Relative Anreicherung wurde als
Quotient aus BSM:BLM dargestellt. ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)
Kon (unbehandelt)
n=4
Kon (behandelt)
n=5
Ca- (unbehandelt)
n=5
Ca- (behandelt)
n=5
Aktivität der alkalischen Phosphatase
Homogenat (U ∙ g Protein
-1)
1354 ± 364 1435 ± 160 1447 ± 281 955 ± 107
Vesikelsuspension (U ∙ g Protein
-1)
21029 ± 3723 23125 ± 3065 23234 ± 3132 17513 ± 1465
Anreicherung 16,80 ± 1,61 16,03 ± 0,71 17,36 ± 1,78 18,64 ± 1,14
Aktivität der Na+/K
+-ATPase
Homogenat (U ∙ g Protein
-1)
81,41 ± 9,79 78,64 ± 7,32 68,71 ± 5,63 72,15 ± 6,84
Vesikelsuspension (U ∙ g Protein
-1)
109,10 ± 16,32 118,30± 13,79 111,80 ± 7,04 96,52 ± 6,33
Anreicherung 1,38 ± 0,25 1,53 ± 0,14 1,65 ± 0,12 1,39 ± 0,17
Relative Anreicherung 12,87 ± 1,73 10,86 ± 0,99 10,95 ± 1,74 14,17 ± 2,01
Ergebnisse
52
3.4.2 Überprüfung der Funktionsfähigkeit der BSMV
Zur Überprüfung der Intaktheit und der Funktionstüchtigkeit der
Bürstensaummembranvesikel vom Schaf wurde die Glukoseaufnahme in An- und
Abwesenheit eines einwärtsgerichteten Na+-Gradienten ermittelt. Es zeigte sich in
Anwesenheit des Na+-Gradienten ein deutliches Overshoot-Phänomen, welches nur
mit intakten Vesikeln darzustellen ist. Die Glukoseaufnahme erreichte ihr Maximum
mit ca. 1 nmol ∙ mg-1 Protein nach 1-2 min und fiel dann wieder ab. Nach 180 min war
der Ausgleichswert zwischen der Aufnahme mit Gradienten und ohne Na+-
Gradienten erreicht (Abb. 3.13). Da damit exemplarisch die Funktionstüchtigkeit
jejunaler BSMV vom Schaf demonstriert werden konnte, wurde im Weiteren für alle
Vesikel die Intaktheit durch Ca2+-Aufnahme in An- und Abwesenheit des Calcium-
Ionophors A23187 überprüft. Das Einlagern des Ionophors in die Vesikelmembran
führt zu einem vielfach schnelleren Ca2+-Einstrom in die Vesikel, als dieser in die
Vesikel ohne das Ionophor erfolgt. Verglichen wurde die Aufnahme in An- und
Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 nach 30 s und einer Ca2+-
Konzentration von 0,09 mmol ∙ l-1, indem der Quotient aus der Ca2+-Aufnahme mit
Ionophor und der Ca2+-Aufnahme ohne Ionophor betrachtet wurde. Die Vesikel
galten als intakt, wenn der Quotient mindestens größer als 2 war. Alle Tiere wiesen
eine mindestens 3-fach höhere Ca2+-Aufnahme nach 30 s in Anwesenheit des
Ionophores auf. Es gab einen signifikanten Unterschied des A23187-Quotienten
zwischen den Gruppen. Die Calcium-depletiert gefütterten Tiere zeigten im Mittel
eine deutlich geringere Steigerung der Aufnahmerate durch das Ionophor (Abb.
3.14).
Ergebnisse
53
Abb. 3.13: Zeitabhängige Glukoseaufnahme in jejunale BSMV bei RT und
0,05 mmol∙l-1 Glukose in An- und Abwesenheit von Na+ im
Inkubationsmedium.
Abb. 3.14: A23187-Quotient (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz
des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-
Konzentration von 0,09 mmol∙l-1) der vier Versuchsgruppen ( x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA: ***: p < 0,001.
Ergebnisse
54
3.4.2 Ca2+-Aufnahmeraten in jejunale BSMV
Die zeitabhängige Ca2+-Aufnahme wurde mit einer freien Ca2+-Konzentration von
0,09 mmol∙l-1 im Medium in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187
über einen Zeitraum von 3 Stunden bestimmt. Ohne Ionophor wird Ca2+ relativ
langsam in die BSMV transportiert, der Kurvenverlauf ist anfänglich, in den ersten 5
bis 10 min, steiler und flacht dann immer mehr ab. Die Vesikel, die mit dem Ionophor
inkubiert wurden, füllten sich innerhalb der ersten Minute bis zu einem Maximum mit
Ca2+ (Abb. 3.15). Aufgrund der Tatsache, dass die Aufnahme in die BSMV ohne
Ionophor nur in den ersten 50 s linear verläuft (Abb. 3.16), wurden die
konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien bei 30 s durchgeführt, da für die
Berechnung der kinetischen Parameter die „schnelle“ Ca2+-Aufnahmerate
entscheidend ist.
Abb. 3.15: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV mit und ohne Zusatz
des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+
-
Konzentration von 0,09 mmol∙l-1.
Ergebnisse
55
Abb. 3.16: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV in den ersten 50 s
bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1.
Die konzentrationsabhängige Ca2+-Aufnahme in die jejunalen BSMV in den ersten
30 s wurde bei Raumtemperatur als Gesamt-Aufnahmerate bestimmt. Diese
Gesamt-Aufnahmerate setzt sich zusammen aus einem unspezifischen, nicht
sättigbaren und einem sättigbaren Anteil, dessen Kurvenverlauf einer Michaelis-
Menten-Kinetik entspricht und aus dem sich rechnerisch die Parameter Km und Vmax
bestimmen lassen. Die Michaelis-Menten-Konstante (Km), die die Menge an Substrat
angibt, die für die halbmaximale Transportrate notwendig ist, ist ein Maß für die Ca2+-
Affinität des Transportsystems und die maximale Aufnahmerate (Vmax) ein Maß für
die Transportkapazität bzw. Anzahl der Transporter. Die Berechnung der kinetischen
Parameter erfolgte mit dem Computerprogramm GraphPad Prism® Version 5.00.
Zur Bestimmung der spezifischen Ca2+-Aufnahmerate wurde von der Gesamt-
Aufnahmerate die linear verlaufende, transporterunabhängige Aufnahmerate
subtrahiert. Abbildung 3.17 zeigt dies exemplarisch für ein Tier mit einem hohen
unspezifischen Anteil der Gesamt-Aufnahmerate und für ein Tier mit einem geringen
unspezifischen Anteil.
Ergebnisse
56
Abb. 3.17: Ca
2+-Gesamtaufnahmerate in jejunale BSMV bei RT mit den
dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den daraus
resultierenden spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten und den berechneten
Vmax und Km-Werten von 2 Schafen.
Ergebnisse
57
Abb. 3.18: Spezifische Ca2+-Aufnahmerate in jejunale BSMV unbehandelter
(gestrichelte Linien) bzw. mit Calcitriol behandelter (durchgezogene
Linien), adäquat (schwarze Linien) bzw. restriktiv mit Calcium (graue
Linien) versorgter Schafe in Abhängigkeit von der freien Ca2+-
Konzentration (Kurven stellen Mittelwerte von je 5 Tieren da).
In der nachfolgenden Abbildung sind die Vmax- und Km-Werte als Gruppenmittelwerte
dargestellt. Statistisch ergab sich kein signifikanter Effekt der Fütterung oder der
Behandlung auf die maximale Transportkapazität. Bei den Km-Werten ergab die
Auswertung die Tendenz eines Fütterungseffekts mit p = 0,06.
Abb.3.19: Maximale Transportkapazität (Vmax) der Ca2+-Aufnahme in jejunale
BSMV der vier Gruppen ( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);
Ergebnisse der 2-way ANOVA.
Ergebnisse
58
Abb. 3.20: Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV der vier Gruppen
( x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA.
3.4.3 Der Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die Ca2+-
Aufnahme in jejunale BSMV
Durch die Anwesenheit von 100 µmol∙l-1 Ruthenium Rot im Inkubationsansatz konnte
die Ca2+-Aufnahme in die BSMV in keiner der vier Gruppen signifikant gesenkt
werden.
Diskussion
59
4 Diskussion
4.1 Beurteilung des Tiermodells
Die mindestens vierwöchige alimentäre Calcium-Depletion führte zu einer Adaptation
der Tiere. Dies wird sichtbar an den Veränderungen der Ca, Ca2+, Pi und Calcitriol-
Konzentrationen im Plasma. Die Tiere zeigten mit 2,37 mmol∙l-1 signifikant niedrigere
Calcium-Konzentration im Plasma gegenüber den Tieren der Kontroll-
fütterungsgruppe, deren Werte bei 2,57 mmol∙l-1 lagen. In gleicher Weise verhielten
sich auch die Ca2+-Konzentrationen, die entsprechend 1,19 mmol∙l-1 und
1,27 mmol∙l-1 ergaben. Die Pi-Konzentrationen im Plasma waren durch die
Regulationsmechanismen von 1,82 mmol∙l-1 in der Kontrollgruppe auf 2,28 mmol∙l-1 in
der Calcium-Depletionsgruppe signifikant erhöht. Die Calcitriol-Konzentrationen
waren von 21,9 pg∙ml-1 auf 31,4 pg∙ml-1 um 44% erhöht. Auch hieran wird deutlich,
dass eine hormonelle Anpassung an das verminderte Calcium-Angebot erfolgte,
ohne dass sich eine klinisch pathologische Situation entwickelte.
Wie in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt werden konnte, erreichten die mit
dem Behandlungsprotokoll erzielten Calcitriol-Spiegel mit 2 000 pg∙ml-1 Werte, die
deutlich oberhalb des physiologischen Bereichs lagen (WILKENS et al. 2010). Die
Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer Dosierung hatte in der adäquat mit
Calcium versorgten Gruppe einen hypercalcämischen Effekt mit einem Anstieg der
Ca-Konzentration im Plasma von 2,69 mmol∙l-1 auf 3,14 mmol∙l-1 innerhalb von 12
Stunden zur Folge. Bei den Calcium-depletierten Tieren stieg die Ca-Konzentration
aufgrund der basal niedrigeren Werte von 2,35 mmol∙l-1 nur auf 2,66 mmol∙l-1. Relativ
gesehen liegen die Anstiege aber in vergleichbaren Größenordnungen.
Der hypercalcämische Effekt der Behandlung ließ sich nicht allein durch erhöhte
Mobilisation aus dem Knochen erklären. Da es darüber hinaus auch keine Hinweise
auf eine vermehrte renale Resorption gab, ergibt sich als sinnvolle Erklärung, dass
die gastrointestinale Resorption von Calcium erhöht sein muss (WILKENS et al.
2010). Unterstützt wird diese Hypothese von Ergebnissen aus In-vitro-
Untersuchungen mit der Ussing-Kammer-Technik. Im Jejunum wiesen die
Diskussion
60
behandelten Tiere signifikant erhöhte Calcium-Nettofluxraten auf (MROCHEN et al.
2010).
Die Adaptationsprozesse zeigen eindeutig, dass das Tiermodell wie geplant geeignet
ist, die calcitriolstimulierte Calcium-Resorption im Darm zu untersuchen.
4.2 Beurteilung der angewandten Methoden
4.2.1 Quantitative RT-PCR
In der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Expression von TRPV6 und PMCA mit
Hilfe der Real-Time PCR quantitativ untersucht, um so die Auswirkung eines
erhöhten Calcitriolspiegels auf die Transkription dieser Gene zu ermitteln. Zur
Expression von TRPV6 und PMCA beim Schaf werden in der Literatur bisher nur
qualitative Aussagen getroffen. So konnte eine deutliche mRNA-Expression beider
Gene im Jejunum und Duodenum adulter Schafe nachgewiesen werden (WILKENS
2006, WILKENS et al. 2010).
In der vorliegenden Studie wurde nun erstmals die Expression im Jejunum quantitativ
bestimmt. Für alle 20 Tiere konnte der quantitative Nachweis beider Gene erbracht
werden. Diese wurden in Bezug auf die mRNA-Expression des Housekeeping genes
GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) bestimmt. Auch in einer
Studie an calcitriolbehandelten Ratten wurde die Expression von GAPDH als interner
Standard zur Quantifizierung der intestinalen TRPV6-Expression eingesetzt
(BROWN et al. 2005). Es wird vorausgesetzt, dass dieses Enzym der Glykolyse in
etwa gleicher Menge in den Geweben der verschiedenen Tiere vorkommt und eine
ausreichende Stabilität aufweist (REIST et al. 2003, WANG & XU 2010). Dadurch
konnten Proben verglichen werden, deren Menge an intakter cDNA nicht exakt gleich
war.
Zwar gibt es in der Literatur Hinweise auf eine Hochregulation von GAPDH durch
geringe Dosen Calcitriol (DESPREZ et al. 1992), jedoch sind dies Ergebnisse aus
Untersuchungen an Brustkrebszellen, die nicht unmittelbar auf die Regulation des
Gens in Enterozyten übertragbar ist. In der vorliegenden Arbeit konnte kein Effekt der
Calcitriolbehandlung auf die GAPDH-Expression beobachtet werden (Kap. 3.2).
Diskussion
61
Vergleicht man die Ergebnisse der auf GAPDH standardisierten mRNA-Gehalte
miteinander, so fällt auf, dass in der Kontrollgruppe für PMCA eine 10-fach höhere
Kopienanzahl als für TRPV6 nachgewiesen wurde. Ähnliche Relationen der
Kopienzahl wurden auch bei 1-α-Hydroxylase Knockout Mäusen beobachtet (VAN
ABEL et al. 2003). Wobei jene Ergebnisse sich auf Analysen stützen, die unter
Vitamin D-defizienten Versuchsbedingungen durchgeführt wurden und daher nicht
unmittelbar mit den Ergebnissen aus Studien an hormonell intakten Schafen
verglichen werden können.
4.2.2 Western Analyse
Mit der Hilfe der Western Analyse wurde der Einfluss der Calcitriolbehandlung bzw.
der Calcium-Depletion auf Ebene der Translation untersucht. Die Daten wurden
semiquantitativ erfasst. Dazu wurden immer nur Werte einer Membran miteinander
verglichen, da diese unter exakt gleichen Bedingungen erzeugt wurden. Als interner
Standard wurde nicht wie meist üblich ß-Aktin verwendet, da gezeigt werden konnte,
dass schon bei eingesetzten Proteinkonzentrationen von 15 µg der ß-Aktin-Nachweis
nicht linear verläuft und daher bei einer aufgetragenen Proteinmenge von 50 µg nicht
sensitiv genug ist, um Unterschiede in der Proteinbeladung zu detektieren (DITTMER
& DITTMER 2006). Stattdessen wurde die gleichmäßige Beladung der Gele mit
Villin, einem Strukturprotein der Mikrovilli, das hauptsächlich in epithelialen Zellen
des Darms und des proximalen Tubulus der Niere zu finden ist (FRIEDERICH et al.
1990), als internem Standard überprüft.
Bei der TRPV6-Western Analyse wurden überraschenderweise zwei Banden von 70
und 72 kDa detektiert. Belegt wurde die Existenz des Kanals auf Protein-Ebene
schon in apikalen Membranen des Jejunums bei adulten Schafen, wobei nur eine
Bande mit einer Größe von ca. 70 kDa detektiert wurde (WILKENS et al. 2009). In
apikalen und basolateralen Membranen humaner Plazenta wurde TRPV6 mit einer
dominanten Bande von 80 kDa nachgewiesen (BERNUCCI et al. 2006). Mit einer
75 kDa-Bande wurde der Kanal im Endometrium tragender Sauen detektiert (CHOI
et al. 2009). Auffällig ist, dass die mittels Western Analyse gemachten Angaben zum
Diskussion
62
relativen Molekulargewicht von TRPV6 in der Literatur stark differieren. Die
detektierten Banden waren, wie auch in unserer Untersuchung, meist deutlich kleiner
als die anhand der Sequenz erwarteten 83 kDa (PENG et al. 1999). Die Ursache für
diese Größenunterschied sowie das Auftreten der Doppelbanden ist unklar.
HOENDEROP et al. (2003) konnte zeigen, dass es sich bei den in TRPV6-
exprimierenden Xenopus laevis Oozyten detektierten spezifischen Banden mit
75 kDa und 85-100 kDa um die reine Kernstruktur sowie eine glykosylierte Form des
Proteins handelt. Nach enzymatischer Abspaltung des Zuckerrestes mit N-
Glykosidase F war nur eine einzelne Bande mit 75 kDa sichtbar. Eine N-
Glykosilierungsstelle wird in der ersten extrazellulären Schleife zwischen dem ersten
und zweiten Transmembransegement des Kanals vermutet (PENG et al. 1999). Die
posttranslationale Glykosilierung kann unterschiedliche Funktionen haben, zum
einen erhöht sie die Stabilität mancher Proteine, schützt sie vor proteolytischem
Abbau oder dient dem intrazellulären Transport zur Zellmembran. Möglicherweise
handelt es sich bei der in dieser Arbeit detektierten Doppelbande ebenfalls um eine
glykosilierte Form des Proteins. Zu diesem Zweck wurden die Proben vor der
Elektrophorese mit N-Glykosidase F (EndoF), einer Endoglykosidase, die alle Typen
von Asparagingebundenen N-Glykanen spaltet (TARENTINO et al. 1985), behandelt.
Trotz der Behandlung traten weiterhin zwei Banden auf. Wenn man davon ausgeht,
dass die Reaktionsbedingungen für das Enzym richtig gewählt wurden und somit die
Methodik nicht als Ursache für die fehlende Deglykosilierung angesehen werden
kann, muss eine glykosilierte Form des Proteins ausgeschlossen werden. Eine
andere Möglichkeit wäre, dass die heterogene Molekularmasse des Antigens durch
Unterschiede in der Phosphorylierung zustande kommt. Mehrere potenzielle
Phosphorylierungsstellen sind in den cytoplasmatischen Domänen des Kanals
lokalisiert (PENG et al. 1999).
Als weitere posttranslationale Modifikation wird die Abspaltung bestimmter
Signalsequenzen aus 15 bis 30 Aminosäuren, die am Amino-Ende mancher Proteine
lokalisiert sind und dazu beitragen, dass das Molekül in der Zelle an seinen
endgültigen Bestimmungsort gelangt, angegeben. Solche Signalsequenzen werden
letztlich von spezifischen Peptidasen entfernt und sind daher im reifen Protein nicht
Diskussion
63
mehr zu finden (NELSON & COX 2001). Die Differenz der Molekulargewichte der
Doppelbanden von 2 kDa würde in etwa einer Anzahl von 15 Aminosäuren
entsprechen. Dies würde bedeuten, dass die kleinere untere Bande ohne
Signalsequenz das in die Membran eingebaute funktionsfähige Protein repräsentiert.
Deren Größe deckt sich auch mit der in rein apikalen Membranen vom Jejunum des
Schafes detektierten Bande (WILKENS et al. 2009). Eventuell könnten bei der
Präparation der Gesamtmembranen nicht alle intrazellulären Bestandteile entfernt
worden sein, sodass dort lokalisierte Vorläuferproteine des TRPV6 bei der Detektion
mit auftauchen könnten. Jedoch gibt es in der Literatur keine Hinweise auf die
Existenz solcher Signalsequenzen im TRPV6-Protein. Daher kann die Ursache für
das Auftreten der Doppelbanden nicht abschließend geklärt werden.
Für die Auswertung wurden beide Banden densitometrisch vermessen. Statistisch
gab es für den Gruppenvergleich keinen Unterschied, ob nur die untere Bande oder
beide Banden berücksichtigt wurden. Aus diesem Grund wurde für die weitere
Auswertung nur die untere Bande, deren Größe sich außerdem mit der Bande in
apikalen Membranen des Jejunums der Ratte (Daten nicht gezeigt) deckt,
berücksichtigt.
Für den PMCA-Nachweis zeigte sich in der Western Analyse eine dominante Bande
mit einem Molekulargewicht von 140 kDa. Dies stimmt mit den für PMCA
angegebenen Molekularmassen, die bei allen Splicevarianten um die 140 kDa liegen,
überein (STAUFFER et al. 1995, GLENDENNING et al. 2000). Zusätzlich trat eine
Bande in Höhe von ca. 80 kDa auf, sowie mehrere diffuse Banden zwischen 140 und
80 kDa.
Um zu klären, welche der Banden für die Auswertung als spezifisch angesehen
werden kann, wurde durch eine Antikörperblockierung dessen Spezifität überprüft.
Nach Inkubation der Membran mit dem blockierten Antikörper konnte weder bei
140 kDa noch bei 80 kDa ein Signal detektiert werden. Für die Auswertung wurden
daher alle Signale als spezifisch für PMCA angesehen und densitometrisch
vermessen. An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass der Antikörper
nach Herstellerangaben sowohl mit PMCA1 als auch mit der Isoform PMCA4
reagiert. Da beide Isoformen in zahlreichen Geweben, wie auch im Dünndarm
Diskussion
64
coexprimiert werden (STREHLER & ZACHARIAS 2001), kann nicht von einem
spezifischen PMCA1b-Proteinnachweis gesprochen werden.
Bei der kleineren Bande (80 kDa) sowie den von den beiden dominanten
eingerahmten diffusen Banden könnte es sich möglicherweise um Produkte einer
proteolytischen Degradation des Proteins handeln. Gleiches vermuten auch BORKE
et al. (1990), der ein ähnliches Muster von mehreren Banden (135 kDa, 125 kDa und
72 kDa) bei Untersuchungen am Darm der Ratte beobachten konnte. Dafür spricht
auch, dass im Pansen, wo sich keine proteolytisch wirksamen Enzyme befinden, nur
die größere Bande detektiert wurde (Abb. 3.8).
Es bleibt jedoch unklar, ob die Fragmentierung des PMCA-Proteins durch die im
Anschluss an die Schlachtung rasch einsetzenden proteolytischen Prozesse in der
Darmschleimhaut zurückzuführen ist, oder ob dies infolge der Membranpräparation
eintritt. Auch die Möglichkeit von bereits in vivo stattfindenden Abbauprozessen kann
nicht ausgeschlossen werden.
4.2.3 Qualität der BSMV
Die Anreicherung der BSM, als Qualitätsmerkmal der BSMV-Präparation, wurde
anhand der Aktivität verschiedener membranständiger Leitenzyme im
Ausgangshomogenat und in der Vesikelsuspension, die spezifische Indikatoren für
bestimmte Membranfraktionen sind (MIRCHEFF & WRIGHT 1976), bestimmt. Als
Leitenzym der Bürstensaummembran wurde die Aktivität der alkalischen
Phosphatase gemessen, die im Mittel um das 17-fache angereichert werden konnte.
Ähnliche Anreicherungen wurden auch in anderen Untersuchungen am Schafdarm
(SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991; SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung)
und bei anderen Spezies (KAUNE et al. 1992; ZURICH 2009) ermittelt. Als
Leitenzym für die basolaterale Membran wurde die Aktivität der Na+/K+-ATPase
bestimmt. Diese waren im Mittel nur um das 1,5-fache angereichert, was sich
ebenfalls mit Werten aus anderen Untersuchungen deckt (KAUNE et al. 1992;
ZURICH 2009; SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung). Sowohl für die
spezifische, als auch für die relative Anreicherung, die im Mittel bei 12 lag, ergaben
Diskussion
65
sich keine Gruppenunterschiede und somit konnten die Gruppen hinsichtlich ihrer
Membrantransporteigenschaften verglichen werden.
Mit Hilfe der zeitabhängigen Glukose-Aufnahme in Anwesenheit eines einwärts
gerichteten Na+-Gradienten wurde die funktionelle Integrität der BSMV überprüft. Das
typische Overshoot-Phänomen bei dem, durch den Na+-Gradienten getrieben, initial
mehr Glucose in die Vesikel aufgenommen wird als bei einem
Konzentrationsausgleich zwischen extra- und intravesikulärem Medium zu erwarten
wäre, kann nur bei der Glukose-Aufnahme in ein geschlossenes Kompartiment
beobachtet werden.
Als eine weitere Möglichkeit die Vesikelintegrität zu überprüfen, wurde die Ca2+-
Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca2+-Ionophors A23187 untersucht. Durch
den Einbau des Ionophors in die BSMV werden diese permeabel für Ca2+ und füllen
sich sehr schnell bis zu einem Konzentrationsausgleich. Dieses schnelle „Volllaufen“
mit Ca2+ tritt nur beim Einbau des Ionophors in Vesikel, die zuvor ein geschlossenes
Kompartiment begrenzten, auf. Um die Integrität der Vesikel zu beurteilen, wurden
für alle Tiere die Ca2+-Aufnahmewerte nach 30 s in An- und Abwesenheit des Ca2+-
Ionophors verglichen. Bei einer mindestens 2-fach höheren Ca2+-Aufnahme in
Anwesenheit des Ionophors wurden die Vesikel als funktionell intakt angesehen
(HINTERDING 2002, BRANDENBURGR 2004). Im vorliegenden Versuch ergaben
sich Quotienten zwischen 3,7 und 4,8, weshalb davon ausgegangen wurde, dass für
alle Tiere intakte Vesikel zur Bestimmung der kinetischen Parameter des Ca2+-
Transportes durch jejunale Bürstensaummembran vorlagen.
Es zeigte sich jedoch ein signifikanter Gruppenunterschied. Der Quotient der Ca2+-
Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca2+-Ionophors der Calcium-depletiert
gefütterten Tiere war deutlich niedriger als bei der Kontrollfütterungsgruppe. Dies
könnte ein Hinweis für eine verminderte Stabilität der Vesikel bzw. einen geringeren
Anteil an geschlossenen Vesikeln sein. Bekannt ist, dass Ca2+-Ionen eine wichtige
Rolle bei der Regulation der strukturellen und funktionellen Eigenschaften
biologischer Membranen spielen (OHYASHIKI & MOHRI 1982, BRASITUS &
DUDEJA 1986). OHYASHIKI & MOHRI (1982) konnten zeigen, dass es, induziert
durch die Bindung von Ca2+ an BSMV vom Schwein, zu einer Stabilisierung des
Diskussion
66
Lipid-Verbandes kommt. Außerdem vermindert Ca2+ die Fluidität sowohl der
Bürstensaum- als auch der basolateralen Membran (BRASITUS & DUDEJA 1986).
Zwar waren die Veränderungen der Plasmamembranfluidität relativ gering, doch
waren Enzymaktivitäten und Transportprozesse, wie beispielsweise der Ca2+-
ATPase, in diesen Membranen bei ähnlichen quantitative Veränderungen deutlich
beeinflusst (BRASITUS et al. 1979). Während sich die meisten Arbeiten mit dem
Einfluss einer Ca2+-Zugabe befassen, untersuchte TOLOSA DE TALAMONI (1996)
den Effekt einer alimentären Calcium-Depletion auf die Fluidität und die
Lipidzusammensetzung intestinaler basolateler Membranen. Infolge des Calcium-
Mangels kam es zu einer deutlichen Erhöhung der Membranfluidität, wobei die
verantwortlichen Mechanismen nicht klar sind. Als mögliche Erklärung führt er die bei
den Tieren erhöhten Calcitriol-Konzentrationen im Plasma an, die ursächlich für die
Veränderung der Membraneigenschaften sein sollen. Während diese Ca2+-
induzierten Effekte nicht eindeutig auf eine verminderte Stabilität intestinaler BSMV
hinweisen, kommt es durch Calcitriol zu einer Destabilisierung der Vesikel (PUTKEY
et al. 1986). So zeigten 80% der BSMV von mit Calcitriol behandelten Hühnern nach
24-stündiger Lagerung bei 4°C charakteristische Zeichen einer Destabilisierung. Mit
diesen Vesikeln konnte kein Glukose-Overshoot gezeigt werden. Ein solches
Phänomen der Destabilisierung konnte aber in der vorliegenden Arbeit nicht
beobachtet werden.
Der niedrigere A23187-Quotient könnte auch ein Hinweis auf einen Fütterungseffekt
auf die Ca2+-Aufnahmerate sein, deshalb wird in Kap. 4.3.3 vertiefend auf diese
Beobachtung eingegangen.
4.2.4 Bestimmung der Ca2+
-Aufnahme in jejunale BSMV
Aufnahmestudien an isolierten BSMV ermöglichen eine selektive Betrachtung der
Ca2+-Aufnahme über die apikale Membran unter kontrollierten Bedingungen.
Aufgrund der Annahme, dass die Aufnahme von Ca2+ über die apikale Membran der
geschwindigkeitslimitierende Schritt für den transzellulären Transport im Darm ist
Diskussion
67
(NIJENHUIS et al. 2005), erscheinen BSMV geeignet, um den regulierbaren Ca2+-
Transport im Detail zu untersuchen.
Die Herangehensweise sollte jedoch vorsichtig beurteilt werden. Auf der einen Seite
können so die Transportprozesse an der apikalen Membran, unabhängig von
zellulären Stoffwechselprozessen und anderen intrazellulären Einflüssen, sowie von
basolateralen Transportprozessen isoliert beurteilt werden. Durch die Trennung
zwischen intra- und extravesikulärem Kompartiment können durch unterschiedliche
intra- und extravesikuläre Pufferzusammensetzungen die Transportbedingungen
variiert und die Wirkung verschiedener Substanzen auf den betrachteten
Transportvorgang untersucht werden. Auf der anderen Seite stellen die Ergebnisse
Daten dar, die unter vollkommen artifiziellen Bedingungen gewonnen wurden. Da
jeglicher Einfluss von intrazellulären Strukturen oder cytosolischen Proteinen
unterbunden wird, kann eine mögliche komplexe Interaktion mit anderen
Komponenten, die für die einwandfreie Funktion des Transporters nötig sind, nicht
ausreichend berücksichtigt werden (MURER & KINNE 1980).
Die durch die Schnellfiltrationsmethode ermittelten Ca2+-Aufnahmeraten stellen
zunächst einmal den Gesamttransport dar, der sich aus einer sättigbaren und einer
nicht sättigbaren Komponente zusammensetzt (SCHEDL & WILSON 1985,
GHISHAN et al. 1989, KAUNE et al. 1992). Die sättigbare Komponente kann im
Gegensatz zu der nicht sättigbaren Komponente mit dem aktiven Ca2+-Transport
korreliert werden (SCHEDL & WILSON 1985). Nicht genau definiert werden kann der
Anteil der Bindung von Ca2+ an Proteine sowohl der Außen- als auch der Innenseite
der isolierten Bürstensaummembran am Gesamttransport. Durch den Vergleich der
aus Glukose- und Ca2+-Aufnahmestudien berechneten Vesikelvolumina wurden
unterschiedliche Werte für die unspezifische Proteinbindung geschätzt. MILLER &
BRONNER (1981) konnten 50% der Aufnahme auf Bindung zurückführen,
KASSIANOFF (1989) gibt 75-90% an und MERRIL et al. (1986) gehen von 100%
Bindung aus, wobei sie präzisieren, dass es sich hauptsächlich um Bindung an die
Innenseite der Membran handelt. Eine andere Herangehensweise zwischen Bindung
und Ca2+-Aufnahme zu unterscheiden, wurde von GHISHAN et al. (1989)
angewendet. Untersuchungen zur Ca2+-Aufnahme in BSMV bei steigender
Diskussion
68
Osmolarität des Inkubationsmediums zeigten eine lineare Beziehung, weshalb sie
darauf schlossen, dass es sich bei der Ca2+-Aufnahme in die Vesikel hauptsächlich
um die Aufnahme in ein intravesikuläres Lumen handelte und der gebundene Anteil
nur unwesentlich war.
Um eine Verfälschung der Ca2+-Aufnahmeraten durch unspezifische Proteinbindung
möglichst gering zu halten, wurde der Stopplösung zusätzlich EGTA (1 mmol∙l-1)
zugesetzt. Durch Waschen der Vesikel mit einer Stopplösung, die als Chelator EGTA
(5 mmol∙l-1) bzw. EDTA (5 mmol∙l-1) enthielt, konnten, verglichen mit der Stopplösung
ohne Zusatz, 30-35% des gebundenen Ca2+ entfernt werden (MERRILL et al. 1986).
Durch Untersuchung der zeitabhängigen Ca2+-Aufnahme in die BSMV wurde der
Zeitraum der linearen Aufnahme bestimmt, damit konnte ein definierter Zeitpunkt für
die konzentrationsabhängigen Aufnahmestudien festgelegt werden. Anfänglich zeigt
sich ein sehr steiler Kurvenverlauf der Aufnahme bis ca. 5 min, zu späteren
Zeitpunkten flacht die Kurve deutlich ab, wobei sich der lineare Verlauf der Aufnahme
auf den Zeitraum zwischen 10 und 50 s beschränkt. Die Ca2+-Aufnahmeraten als
Funktion der freien Ca2+-Konzentration wurde deshalb bei 30 s durchgeführt. Anhand
dieser Werte lassen sich nach der Theorie von Michaelis-Menten die kinetischen
Parameter Vmax und Km, also die maximale Transportkapazität und die Affinität des
Transporters, kalkulieren.
Für die Km-Werte, welche die Ca2+-Konzentration im Inkubationsmedium angibt, bei
der die halbmaximale Transportrate erreicht ist, ergaben sich sehr unterschiedliche
Werte. Diese lagen zwischen 1,0 und 5,9 mmol∙l-1, ohne dass sigifikante
Gruppenunterschiede nachgewiesen werden konnten.
Beim Wiederkäuer wurden bislang nur wenige vergleichbare Untersuchungen zur
Ca2+-Aufnahme in BSMV durchgeführt. Bei Aufnahmestudien am Jejunum des
Schafes konnte ein mittlerer Km-Wert von 4,0 mmol∙l-1 errechnet werden
(SCHRÖDER & WILKENS, mündliche Mitteilung). Vorliegende Vergleichswerte
stammen meist aus Studien an monogastrischen Tieren. Dort ermittelte Km-Werte
liegen durchweg im unteren Bereich der in dieser Studie berechneten Werte. Die
Affinität des Kanals zum Calcium scheint also bei Vesikeln monogastrischer Tiere
höher zu sein. So konnte für die Ca2+-Aufnahme in BSMV von Saugferkeln eine Km
Diskussion
69
von 2,3 mmol∙l-1, bei Absetzferkeln von 1,0 mmol∙l-1 festgestellt werden
(BRANDENBURGER 2004). Bei den Untersuchungen von HINTERDING (2002)
ergaben sich Km-Werte bei Schweinen unterschiedlicher Altersgruppen, die ebenfalls
zwischen 1,1 und 1,4 mmol∙l-1 lagen. Ganz ähnliche Km-Werte wurden auch für
BSMV aus Hühnerenterozyten beschrieben (RASMUSSEN et al. 1979). Im
Gegensatz dazu ermittelte KAUNE et al. (1992) eine Km von nur 0,03 mmol∙l-1. Es
muss aber darauf hingewiesen werden, dass die kalkulierten Km-Werte je nach
Vorhandensein von TRPV5 und TRPV6 in der Bürstensaummembran die Ca2+-
Affinität als Mittelwert beider Ca2+_Kanäle darstellen können. Jedoch sind die an
Oozyten von Xenopus laevis ermittelten Km-Werte für TRPV5 und TRPV6 sehr
ähnlich. Sie variieren bei TRPV5 exprimierenden Oozyten von 0,2 mmol∙l-1
(HOENDEROP et al. 1999) bis 0,66 mmol∙l-1 (PENG et al. 2000) und bei TRPV6 von
0,25 mmol∙l-1 (PENG et al. 2000) bis 0,44 mmol∙l-1 (PENG et al. 1999). Für die
großen Unterschiede der Km-Werte beim Schaf verglichen mit anderen Spezies gibt
es bislang keine Erklärung. Die niedrige Calcium-Affinität weist auf eine geringe
Spezifität des Transportsystems in der apikalen Membran bzw. einen niedrigen Anteil
spezifischen Transports an der Gesamtaufnahme hin.
Die ermittelten Vmax-Werte lagen zwischen 1,4 und 8,8 nmol∙mg-1 Protein∙30 s-1, ohne
dass sigifikante Gruppenunterschiede nachgewiesen werden konnten. Die
ungerichteten Unterschiede der Vmax-Werte könnten durch die technische Umsetzung
zu erklären sein, da Vmax von mehreren Faktoren wie der Reinheit der
Membranpräparation oder dem Grad der Inaktivierung des Transporters während der
Präparation abhängt.
Diskussion
70
4.3 Effekt der Calcium-Depletion bzw. der Calcitriolbehandlung
auf die Ca2+
-Transportkomponenten im Jejunum
4.3.1 Expressionsstudien
Um mögliche fütterungs- und behandlungsabhängige Veränderungen über die
Teilschritte des transzellulären Ca2+-Transports im Jejunum auf genomischer Ebene
nachweisen zu können, wurden Untersuchungen zur mRNA-Expression des apikalen
TRPV6-Kanals und der basolateralen Ca2+-Pumpe PMCA1b mit Hilfe der
quantitativen RT-PCR durchgeführt.
Durch die Calcitriolbehandlung kam es wie erwartet zu einer signifikant höheren
Expression der mRNA für TRPV6 (~20-fach) sowie für PMCA (~3-fach). VDREs,
über die diese Calcitriolwirkung vermittels wird, wurden in den Promotorregionen
beider Gene nachgewiesen (GLENDENNING et al. 2000, MEYER et al. 2006).
Während für Schafe noch keine Ergebnisse zum Einfluss einer Behandlung mit
Calcitriol auf Transkriptionsebene vorliegen, weisen mehrere Studien an
Zellmodellen und Ratten ebenfalls auf eine Erhöhung der TRPV6-Expression durch
Calcitriol hin. WOOD et al. (2001) konnte zeigen, dass sich die mRNA-Expression an
TRPV6 in CaCo-2 Zellen nach Zugabe von 1,25(OH)2D3 innerhalb von 24 h um das
10-fache erhöht. Ein erhöhter mRNA-Level für TRPV6 und PMCA konnte auch schon
8 h nach einer 1,25(OH)2D3-Behandlung in CaCo-2-Zelllinien registriert werden.
Gleichzeitig war diese Beobachtung mit einem 40 h verzögert auftretenden erhöhten
Calcium-Nettotransport in die Zellen verbunden (FLEET et al. 2002).
Bei 1-α-Hydroxylase-Knockout-Mäusen führt eine Behandlung mit 1,25(OH)2D3 über
mehrere Wochen zu einer erhöhten mRNA-Expression für TRPV6 (~ 20-fach), für
Calbindin D9K (~100-fach) und für PMCA (~3-fache) (VAN ABEL et al. 2003). Das
Verhältnis der durch die Behandlung erzielten Steigerungen der Expression deckt
sich sehr gut mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Jedoch stützen sich die
beschriebenen Daten auf Analysen, die unter Vitamin D-defizienten
Versuchsbedingungen durchgeführt wurden. Betrachtungen an Versuchsgruppen mit
physiologischem Calcitriol-Haushalt bieten weniger eindeutige Ergebnisse. Während
beispielsweise VAN CROMPHAUT et al. (2001) von einer vermehrten mRNA-
Diskussion
71
Expression von TRPV6 (~ 6,5-fach), Calbindin D9K (~ 2,2-fach) und PMCA (~ 1,8-
fach) bei WT-Mäusen nach einmaliger Behandlung mit Calcitriol berichten, konnten
weder bei Ratten noch bei Menschen mit unterschiedlichem Calcitriol-Status ein
Zusammenhang zum mRNA-Gehalt von TRPV6 im vorderen Dünndarm hergestellt
werden (PENG et al. 1999, BARLEY et al. 2001). Auch konnten in Studien von
ARMBRECHT et al. (2002) bei Mäusen mit basal physiologischen Calcitriolspiegeln
keine erhöhten mRNA-Gehalte für Calbindin D9K und PMCA nach Calcitriol-Injektion
festgestellt werden. Die Autoren vermuten, dass die Tiere bereits eine ausreichend
hohe mRNA-Ausstattung für die betreffenden Gene aufweisen, wodurch keine
darüber hinausgehende signifikante Erhöhung durch die Behandlung zu induzieren
ist.
Betrachtet man die untersuchten mRNA-Gehalte in Relation zueinander, so wird
deutlich, dass die Expression beider Gene positiv miteinander korreliert (Abb. 4.1).
Dies zeigt deutlich, dass die Calcitriolwirkung auf identischem Wege über VDREs
vermittelt wird. Auffällig bleibt jedoch, dass die mRNA-Gehalte von PMCA durch
Calcitriol weitaus weniger stark hochreguliert wurden.
Abb. 4.1: Korrelation von PMCA mRNA mit TRPV6 mRNA.
Diskussion
72
Auch KUTUZOVA & DELUCA (2004) beschreiben, dass die Expression von
PMCA1b nicht so streng durch Calcitriol reguliert wird, wie für TRPV5, TRPV6 und
Calbindin-D9K beschrieben. Möglicherweise handelt es sich bei der Regulation der
PMCA-Expression nicht um einen rein transkriptionellen Effekt. Die Erhöhung der
mRNA-Gehalte an PMCA könnte auch durch posttranskriptionelle Prozesse, wie eine
erhöhte mRNA-Stabilisierung bedingt sein. PANNABECKER et al. (1995) konnten
zwar an Hühnern anhand von isolierten nukleären RNA-Gehalten zeigen, dass
Calcitriol eindeutig die Transkriptionsrate erhöhte. Die Zugabe von 10-8 mol∙l-1
Calcitriol führte bei einer distalen Nierentubuluszelllinie aber neben einer Erhöhung
der Expression auch zu einer erhöhten PMCA1b-mRNA Stabilität (GLENDENNING
et al. 2000).
SONG et al. (2003) beschreiben zeitliche Unterschiede der durch Calcitriol-Injektion
induzierten Steigerung der Expression von TRPV6 und Calbindin-D9K. So ging die
Erhöhung der TRPV6-Expression, die ihr Maximum nach 6 Stunden erreichte und 24
Stunden nach der Behandlung wieder auf Basalniveau zurückkehrte, der Steigerung
der Calbindin-D9K-Expression, deren Maximum erst nach 24 Stunden erreicht war,
voraus. Eventuell wird das Maximum der PMCA-Expression ebenfalls erst nach mehr
als 12 Stunden nach der Calcitriol-Applikation erreicht. Die in der vorliegenden Studie
ermittelten Expressionszunahmen könnten möglicherweise noch in der
Anstiegsphase liegen und daher die maximale Zunahme nicht abgeschätzt werden.
Da der Einstrom von Calcium durch die TRPV-Kanäle in der apikalen Membran als
geschwindigkeitslimitierender Schritt des transzellulären Calciumtransports
angesehen wird (NIJENHUIS et al. 2005), erscheint das unterschiedliche Ausmaß
der Expressionssteigerung jedoch physiologisch begründet zu sein.
Durch die alimentäre Calcium-Depletion kam es zu einer scheinbaren Verdopplung
der mRNA-Expression beider Gene, statistisch ließ sich aber kein direkter
Zusammenhang nachweisen. Daten zum Einfluss einer Calcium-restriktiven Diät auf
genomischer Ebene beim Wiederkäuer liegen bislang nicht vor. Untersuchungen an
Ratten ergaben allerdings eine Erhöhung der TRPV6-mRNA um das 2,5-fache nach
vierwöchiger Fütterung einer calciumarmen Ration (0,02% gegenüber 1,2%
Diskussion
73
Calcium), in Abhängigkeit des Alters der Tiere. Die durch die restriktive Fütterung
erreichten mRNA-Level fielen bei den adulten (12 Monate) wesentlich geringer aus
als bei den jungen Tieren (2 Monate) (BROWN et al. 2005). Gleichzeitig konnte
gezeigt werden, dass die mRNA-Level positiv mit dem Calcium-Transport korrelieren.
Gleiche Beobachtungen machten auch SONG et al. (2003) an Mäusen, bei denen es
durch die calciumarme Fütterung im Duodenum zu einer sehr viel stärkeren,
30-fachen Erhöhung der mRNA-Gehalte an TRPV6 und einer 8-fachen Erhöhung an
Calbindin-D9K kam. Dies war von einer 4-fach erhöhten Serum-Calcitriol-
Konzentration begleitet.
Eine gesteigerte mRNA-Expression an PMCA konnte bei Hühnern nach 10-tägiger
alimentärer Calcium-Depletion beobachtet werden (CAI et al. 1993).
Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der genomischen Effekte der Calcium-
Depletion bei Studien an monogastrischen Tieren und den Ergebnissen der
Untersuchung am Schaf kann in der unterschiedlichen Calcitriolantwort begründet
sein. Im Gegensatz zu der 4-fach erhöhten Calcitriolkonzentration bei Mäusen
(SONG et al. 2003) waren die Calcitriolspiegel durch eine Calcium-Depletion bei den
Schafen nur um 50% gesteigert. Ähnlich geringe Steigerungen (2-fache) wurden
auch schon in früheren Studien an Schaf und Ziege beobachtet (ABDEL-HAFEEZ et
al. 1982, SCHRÖDER et al. 1997, SCHRÖDER et al. 1999). Infolge der verringerten
alimentären Calciumverfügbarkeit, nur 25% des normalen Bedarfs, kommt es zwar
zu einem signifikanten Absinken der Plasma-Calcium-Konzentration, jedoch liegen
die Werte noch im physiologischen Bereich, der für das Schaf mit 2,1 bis 2,7 mmol∙l-1
angegeben wird (KRAFT und DÜRR 2005). Möglicherweise kommt es erst beim
Absinken in pathophysiologische Konzentrationsbereiche zum Erreichen von
Calcitriolspiegeln, die für eine Beeinflussung der Genexpression nötig sind. Um dies
zu erreichen, wäre eine weitere Verringerung der Calciumaufnahme notwendig.
Allerdings ist eine calciumarme Fütterung mit nur ca. 2% des Calciumgehaltes der
Kontrollfütterung (BROWN et al. 2005), wie sie in den Studien an monogastrischen
Tieren eingesetzt wird, beim Wiederkäuer nicht realisierbar. Aufgrund des benötigten
mindestens 18%igen Rohfaseranteils in der Ration (MEYER 2004) ist die Calcium-
Depletion mit nur 25% des normalen Bedarfs weitgehend ausgeschöpft.
Diskussion
74
Möglicherweise können die Tiere die Calcium-Depletion aber auch besser
kompensieren und deshalb ihre Plasma-Calcium-Konzentration im physiologischen
Bereich halten. Bei den Tieren der Calcium-Depletionsgruppe waren die Werte des
Knochenresorptionsmarkers Cross Laps signifikant erhöht (WILKENS et al. 2010).
Dies legt die Vermutung nahe, dass die Tiere das fehlende Calcium bei
vermindertem Angebot in der Nahrung auch durch Mobilisation aus dem Knochen
bereitstellen.
Da sich aus den Ergebnissen der Real-Time PCR auf Grundlage der mRNA-Gehalte
keine verbindlichen Aussagen über die tatsächlich exprimierte Proteinmengen treffen
lassen, wurden ergänzend dazu Western Analysen durchgeführt.
In den Ergebnissen der Proteinexpression spiegelt sich deutlich der Effekt von
Behandlung und Fütterung auf RNA-Ebene wieder.
Für den apikalen Calcium-Kanal TRPV6 zeigte sich eine signifikant Proteinzunahme
durch die Calcitriolbehandlung. Die alimentäre Calcium-Depletion beeinflusste die
Proteinkonzentration nicht. Für die auf RNA-Ebene sichtbare, jedoch statistisch nicht
signifikante Expressionserhöhung konnte aufgrund der geringeren Sensitivität der
Methode auf Proteinebene kein Hinweis gefunden werden.
Für die PMCA-Protein-Expression konnte ebenfalls eine Proteinzunahme nach
Calcitriolbehandlung detektiert werden, die jedoch deutlich geringer als bei TRPV6
ausfiel. Vergleichbare Ergebnisse auf Proteinebene liegen von Wiederkäuern bislang
nicht vor. MDBK-Zelllinien (distale Nierentubuluszellen), die mit steigenden
Konzentrationen an Calcitriol behandelt wurden, wiesen bei einer Konzentration von
10-8 mol∙l-1 Calcitriol im Medium eine Steigerung des PMCA-Proteins um 80% auf.
Übereinstimmend mit dem Effekt auf die Proteinexpression konnte auf funktioneller
Ebene eine 100%ige Steigerung des ATP-abhängigen Transports beobachtet
werden (GLENDENNING et al. 2000). Studien an Vitamin D-defizienten Hühnern
weisen ebenfalls auf eine Erhöhung der PMCA-Potein-Expression durch Calcitriol hin
(WASSERMAN et al. 1992). Die Autoren fanden auch Hinweise auf eine erhöhte
Proteinexpression nach Fütterung einer calciumarmen Diät. Bei den Schafen war die
Proteinexpression durch die Fütterung allein in keiner Weise beeinflusst, obwohl die
Diskussion
75
PMCA-Expression auf RNA-Ebene im Mittel immer über der Kontrolle lag. Ein Grund,
weshalb dies auf Proteinebene nicht sichtbar wird, ist vermutlich technisch
begründet. Da es sich bei der RNA um einen spezifischen Nachweis der PMCA1b-
Isoform handelt, wogegen mit dem Antikörper in der Western Analyse neben PMCA1
auch PMCA4 nachgewiesen wird, kommt es möglicherweise zu einer Überlagerung
existierender Effekte. Während PMCA1b nachweislich über Calcitriol reguliert wird
(GLENDENNING et al. 2000), ist über die Regulation von PMCA4 nicht viel bekannt.
Die Tiere, die der Kombination aus Fütterung und Behandlung unterzogen wurden,
lagen mit der PMCA-Proteinmenge signifikant unterhalb der behandelten Tiere der
Kontrollfütterung. Diese Beobachtung wiederholt sich auch in den Ergebnissen der
RNA-Expression. Eine Erklärung für dieses Phänomen kann zum jetzigen Zeitpunkt
leider nicht gegeben werden.
4.3.2 Funktionelle Untersuchungen
Für die Resorption von Calcium im Organismus ist selbstverständlich nicht nur die
Menge an exprimierten Transportern, sondern vor allem auch deren
Funktionsfähigkeit von entscheidender Bedeutung. Durch Untersuchung der Ca2+-
Aufnahme in Bürstensaummembranvesikel wurde überprüft, ob die erhöhte TRPV6-
Proteinmenge auch mit einem gesteigerten Einstrom über die apikale Membran
verbunden ist.
Im Gegensatz zur Proteinexpression war für die kinetischen Parameter der
Calciumaufnahme in BSMV eine Abhängigkeit von der Behandlung mit Calcitriol
nicht nachweisbar. Dieses Ergebnis ist konträr zu den Daten anderer Studien, in
denen eine Erhöhung der Vmax durch Calcitriol beobachtet wurde. Bei Vitamin D-
defizienten Ratten führte eine einmalige intraperitoneale Applikation von Calcitriol
16 Stunden vor der Schlachtung zu einer Steigerung der Ca2+-Aufnahmerate
(MILLER & BRONNER 1981). Bei BSMV vom Huhn war die Vmax durch
Calcitriolbehandlung nach 12 Stunden 2,5 bis 3-fach erhöht, ohne dass der Km-Wert
verändert war (FONTAINE et al. 1981). GHISHAN et al. (1988) konnten zeigen, dass
schon acht Stunden nach Calcitriolgabe die Vmax sowohl für die Ca2+
-Aufnahme in
Diskussion
76
BSMV als auch für die ATP-abhängige Aufnahme in basolaterale Membranvesikel
erhöht war. Allerdings stützen sich die Ergebnisse alle auf Untersuchungen an
Vitamin D-defizienten Tieren und sind somit nicht direkt mit den Daten dieser Studie
vergleichbar. Aber auch bei adäquat mit Vitamin D versorgten sechs Monate alten
Ratten konnte eine Steigerung der Ca2+-Aufnahmerate von 3,95 auf 5,10 nmol∙mg-1
Protein∙20s-1 nach Calcitriol-Applikation registriert werden (LIANG et al. 1991). Bei 24
Monate alten Tieren war die basal niedrigere Aufnahmerate von 2,61 auf 4,05
nmol∙mg-1 Protein∙20s-1 durch Calcitriol ebenfalls erhöht. Demgegenüber konnten
BRAUN et al. (1984) keinen Effekt einer zweimaligen Calcitriolbehandlung, 36 und
12 Stunden vor der Schlachtung, auf die maximale Ca2+-Aufnahmerate bei adulten
Ratten feststellen.
Warum in der vorliegenden Studie trotz der erhöhten Proteinmenge bei den
behandelten Tieren keine gesteigerte Aufnahme in die BSMV messbar war, bleibt
unklar. Für das TRPV6-Protein wird in diesem Zusammenhang ein intrazellulärer
Pool präformierter intakter Kanalproteine diskutiert. Ihr Einbau in die Zellmembran
kann eine weitere Regulationsmöglichkeit für den Organismus darstellen
(HOENDEROP et al. 2002b). Möglicherweise handelt es sich bei dem in der Western
Analyse detektierten Protein um eine noch nicht vollkommen funktionsfähige Form
des Kanals. Auch bei BRANDENBURGER (2004) konnte bei Ferkeln trotz einer
durch Vitamin D-Behandlung erhöhten TRPV6-mRNA-Menge kein funktioneller
Effekt in Ca2+-Uptake-Studien festgestellt werden. Die Proteinexpression wurde in
dieser Arbeit nicht quantifiziert, jedoch ergaben sich bei den Untersuchungen am
intakten Epithel in der Ussing-Kammer deutliche Effekte der Behandlung. Diese
Beobachtungen führen zu der Überlegung, dass die Diskrepanz möglicherweise
durch die isolierte Betrachtung der apikalen Membran bedingt wird. Wie schon
vorangehend beschrieben (4.1.4) wird durch die selektive Betrachtung der Vorgänge
an der apikalen Membran jeglicher Einfluss intrazellulärer Strukturen auf die
Transportrate unterbunden. Aus diesem Grund darf von dem Unvermögen, eine
bestimmte Eigenschaft in Vesikelstudien nachweisen zu können, nicht automatisch
auf ihre Abwesenheit im Gesamtsystem geschlossen werden (MURER & KINNE
1980). Das Fehlen einer Potenzialdifferenz über der Vesikelmembran könnte ein
Diskussion
77
möglicher Hinweis auf eine Schwachstelle der Methode sein, da bekannt ist, dass
der Öffnungszustand des TRPV6-Kanal wesentlich vom Membranpotenzial der Zelle
abhängt (HOENDEROP et al. 2005), wobei eine Hyperpolarisation einen erhöhten
Ca2+-Einstrom induziert (HOENDEROP et al. 1999). Der Nachweis möglicher
Veränderungen der Aufnahmerate könnte dadurch bei diesem Versuchsaufbau
behindert worden sein. Durch Anlegen eines intravesikulär negativen elektrischen
Potenzials durch ein K+-Diffusionspotenzial konnten KAUNE et al. (1992) die Ca2+-
Aufnahme in BSMV stimulieren.
Ein weiterer Unterschied zur intakten Zelle besteht in der fehlenden Pufferung der
einströmenden Ca2+-Ionen. Dies könnte ein Problem darstellen aufgrund der
Tatsache, dass sich der TRPV6-Kanal bei ansteigender intrazellulärer Ca2+-
Konzentration über einen negativen Feedback-Mechanismus selbst inaktiviert. Wobei
die IC50, die Konzentration bei der die Hälfte der Kanäle inaktiviert sind, in der
Zellkultur bei ~ 70 nmol∙l-1 lag (NILIUS et al. 2001). Durch den während der Ca2+-
Aufnahme starken Anstieg der intravesikulären Ca2+-Konzentration könnte es zu
einer vorzeitigen Schließung der Kanäle kommen, so dass die maximale
Transportkapazität nicht ausgeschöpft wurde und deshalb, wie bei einigen Tieren
deutlich auffiel, der sättigbare Anteil des Gesamttransportes stark von der nicht
sättigbaren Komponente überlagert wurde. Dies könnte eine mögliche Erklärung für
die fehlenden Gruppenunterschiede in den Vmax-Werten sein. Das Beladen der
Vesikel mit EGTA-haltigem Puffer sollte ein frühes Schließen der Kanäle verhindern.
In TRPV-exprimierenden HEK-Zellen, die mit 10 mmol∙l-1 BAPTA, einem Calcium-
spezifischen Chelator, beladen waren, trat die Ca2+-induzierte Inaktivierung ebenfalls
auf. Daher wird vermutet, dass eine lokale Erhöhung der Ca2+-Konzentration in
unmittelbarer Nähe der Kanalpore ursächlich für die Inaktivierung ist (NILIUS et al.
2001).
Die alimentäre Calcium-Depletion hatte ebenfalls keinen signifikanten Effekt auf die
Vmax-Werte, was die Beobachtungen auf Ebene der Proteinexpression bestätigt.
Jedoch scheint die Fütterung tendenziell einen Effekt auf die Affinität des
Transportsystems für Calcium zu haben. Die niedrigeren Km-Werte sind als Hinweis
auf eine Anpassung des Transportsystems an die langfristig erniedrigte luminale
Diskussion
78
Ca2+-Konzentration zu werten. Durch eine erhöhte Calcium-Affinität kann auch bei
niedrigerer Substratverfügbarkeit die gleiche Transportrate erreicht werden. Dies
deckt sich auch mit dem in Kap. 4.1.3 beschriebenen Phänomen des durch die
Fütterung erniedrigten A23187-Quotienten. Bei einzelner Betrachtung der Ca2+-
Aufnahme in BSMV ohne Ionophorzusatz fällt auf, dass die unbehandelten
Kontrolltiere bei einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1 in 30 s deutlich
weniger Aufnahme zeigten (Abb. 4.2). Bei dem einzelnen Ausreißer in der Gruppe
handelt es sich um dasselbe Tier, dass auch bei der Auswertung der TRPV6-
Proteinexpression aus zuvor genannten Gründen nicht berücksichtigt wurde. Ohne
dieses Tier war die Aufnahme bei einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1
in der Kontrollgruppe signifikant niedriger. Die größere bzw. schnellere Ca2+-
Aufnahme in Abwesenheit des Ionophors bedingt die statistisch nachweisliche
Erniedrigung des A23187-Quotienten. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass der
spezifische, wahrscheinlich kanalvermittelte Anteil der Ca2+-Aufnahme in die Vesikel
durch die Fütterung erhöht ist. Dieser Effekt lässt sich aber offenbar im klassischen
Ansatz nur schwer nachweisen, da er nur bei niedrigen freien Ca2+-Konzentrationen,
bei denen der sättigbare Transport nicht so stark durch den unspezifischen Anteil der
Aufnahme überlagert wird, auftritt.
Diskussion
79
Abb. 4.2: Ca2+-Gesamtaufnahme nach 30 s bei freier Ca2+-Konzentration von
0,09 mmol∙l-1 in jejunale BSMV von adäquat bzw. restriktiv mit Calcium
versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-
Behandlung
Durch die Zugabe von Ruthenium Rot sollte versucht werden, den apikalen Calcium-
Kanal in seiner Funktion zu hemmen. Von dieser Substanz, einem Calcium-
Kanalblocker ist eine IC50 von etwa 10 µmol∙l-1 bekannt (HOENDEROP et al. 2001).
In den Uptake-Studien konnte durch Ruthenium Rot, in einer Konzentration von
100 µmol∙l-1, in keiner der Versuchsgruppen ein Effekt auf die Ca2+-Aufnahme
beobachtet werden. Dies ist konträr zu Ergebnissen anderer Studien. Bei
Untersuchungen an BSMV vom Duodenum unbehandelter Ratten verringerte sich
durch Zugabe des Inhibitors in gleicher Konzentration die Aufnahme von Calcium um
44% (MILLER & BRONNER 1981). In einer Untersuchung zur Calcium-Resorption
aus dem Dünndarm von Ferkeln konnten mittels Ussing-Kammer-Technik durch
Ruthenium Rot in einer Konzentration von 10 µmol∙l-1 die Calcium-Nettofluxraten nur
um 15,8% gesenkt werden (BRANDENBURGER 2004). Allerdings trat dieser Effekt
auch nur bei Vitamin D-behandelten Tieren auf und wurde in der Kontrollgruppe nicht
beobachtet. In der vorliegenden Arbeit war es vermutlich aufgrund der starken
Diskussion
80
Überlagerung des sättigbaren Transportes durch den unspezifischen Anteil der
Aufnahme bei höheren freien Ca2+-Konzentrationen nicht möglich eine Inhibition des
Kanals nachzuweisen.
Diskussion
81
4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit konnte im Jejunum anhand von Expressionstudien eine
erhöhte Expression des apikalen Calcium-Kanals TRPV6 und der basolateralen
Calcium-Pumpe PMCA auf RNA und Proteinebene durch Behandlung mit Calcitriol in
pharmakologischer Dosierung gezeigt werden. Dies steht in Übereinstimmung mit
In-vitro-Untersuchungen in der Ussing-Kammer, bei denen im selben Tiermodell
durch Calcitriol stimulierte Calcium-Nettofluxraten nachgewiesen wurden
(MROCHEN et al. 2010). Aufgrund des deutlichen Behandlungseffektes kann darauf
geschlossen werden, dass der aktive, intestinale Calcium-Transport beim Schaf, wie
bei den meisten monogastrischen Säugetieren auch, prinzipiell durch Calcitriol
reguliert wird. Inwieweit dies unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt,
muss vorsichtig beurteilt werden.
Die durch die alimentäre Calcium-Depletion erniedrigte Calcium-Konzentration im
Plasma sowie die erhöhten Phosphat- und Calcitriol-Konzentrationen zeigen deutlich,
dass es zu einer Aktivierung adaptiver Mechanismen der Calcium-Homöostase
kommt. Obwohl eine Adaptation des aktiven Ca2+-Transports wahrscheinlich
stattfindet, gelang es nicht, eine erhöhte Expression entsprechender Strukturen
nachzuweisen. Die Veränderungen auf RNA-Ebene waren zu gering und aufgrund
der relativ geringen Tierzahl statistisch nicht abzusichern. Auch die augenscheinliche
Erhöhung der Calcium-Nettofluxraten war nicht signifikant (MROCHEN et al. 2010).
In zukünftigen Untersuchungen sollte versucht werden, durch eine länger
andauernde alimentäre Calcium-Depletion und außerdem größere Tierzahlen, die
Annahme zur Möglichkeit der Adaptation des aktiven Calcium-Transports im Jejunum
beim Schaf auch statistisch besser abzusichern. Darüber hinaus sollte der Einfluss
des Alters und des Reproduktionsstatus auf die Anpassung an einen Calciummangel
im Futter untersucht werden.
Der niedrige Anpassungslevel der intestinalen Resorption könnte darin begründet
sein, dass das Schaf unter physiologischen Bedingungen aufgrund seiner
Ernährungsweise immer ausreichend mit Calcium versorgt ist und außerdem bereits
im Pansen eine gewisse Calcium-Aufnahme erfolgt (MROCHEN et al. 2009). Somit
ist das Tier möglicherweise nicht auf eine engere Regulierung im Darm angewiesen.
Diskussion
82
Womöglich findet eine Anpassung auch dadurch statt, dass die sonst nur im
vordersten Abschnitt des Jejunums stattfindende Calcium-Aufnahme auf die distalen
Abschnitte ausgedehnt und so das mangelnde Calcium-Angebot ausgeglichen wird.
Die längere Verweildauer der Ingesta in diesen Darmsegmenten könnte hierfür
hilfreich sein.
Die Ca2+-Aufnahmestudien an Bürstensaummebranvesikeln erwiesen sich bei der
hier angewendeten Methodik nicht als geeignet, die maximale Transportkapazität als
Maß für die Anzahl der Calcium-Kanäle beim Schaf funktionell differenziert zu
untersuchen. Auf der Basis der in der Ussing-Kammer gezeigten Ca2+-Fluxraten
(MROCHEN et al. 2010), ist davon auszugehen, dass die Expression epithelialer
Calcium-Kanäle und somit auch die Höhe der spezifischen Ca2+-Aufnahme in BSMV
relativ niedrig sind. Dadurch wird aber der unspezifische Anteil an der Ca2+-
Gesamtaufnahme in die Vesikel relativ hoch, was eine sinnvolle Auswertung des
spezifischen Anteils erschwert. Darüber hinaus kann nicht ausgeschlossen werden,
dass es unter den gewählten Bedingungen zu einem vorzeitigen Schließen der
Kanäle kam, so dass sich Fütterungs- und Behandlungseffekte auf den spezifischen
Anteil an der Gesamtaufnahme nicht darstellen ließen. Es ist daher notwendig, die
Methode weiter zu modifizieren, entsprechende Ansätze zur Verbesserung wurden
weiter oben diskutiert. Dass Ca2+-Aufnahmestudien mit BSMV unter angepassten
Versuchsbedingungen eine adäquate Methode zur Demonstration stimulierter
Transportmechanismen sein können, deutet sich aber zumindest in den
Veränderungen der spezifischen Aufnahme bei sehr niedriger extravesikulärer Ca2+-
Konzentrationen und den tendenziell erniedrigten Km-Werten in den Calcium restriktiv
gefütterten Tieren an.
Zusammenfassung
83
5 Zusammenfassung
Nina Mrochen
Untersuchungen zur Regulation der jejunalen Calcium-Resorption beim Schaf
In funktionellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass im Unterschied zum
monogastrischen Tier die intestinale, aktive Calcium-Resorption beim Schaf nicht im
Duodenum sondern im Jejunum lokalisiert ist. Qualitativ konnten die strukturellen
Grundlagen für einen calcitriolregulierten, transzellulären Calcium-Transport in
diesem Darmabschnitt bereits in früheren Untersuchungen nachgewiesen werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die Regulation dieser strukturellen
Komponenten genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde die Wirkung einer
alimentären Calcium-Depletion, einer Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer
Dosierung und der Kombination aus Depletion und Behandlung auf die Expression
und die Aktivität der am transzellulären Calcium-Transport beteiligten Strukturen
untersucht.
Dazu wurde die Expression wichtiger Gene des transzellulären Calcium-Transportes,
des apikalen Calcium-Kanal TRPV6 und der basolateralen Calcium-Pumpe PMCA1b
mit Hilfe der quantitativen RT-PCR und der Western Analyse auf Transkriptions- und
Translationsebene quantifiziert. Darüber hinaus wurden Aufnahmestudien in isolierte
Bürstensaummembranvesikel (BSMV) durchgeführt und die kinetischen Kenngrößen
Vmax und Km der Ca2+-Aufnahme bestimmt.
Durch die Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer Dosierung kam es zu einer
eindeutigen Expressionssteigerung auf RNA- und Proteinebene, was die prinzipielle
Regulierbarkeit des transzellulären Calcium-Transportes im Jejunum beim Schaf
bestätigt. Es gelang nicht, diese Regulation durch Aufnahmestudien in BSMV auch
funktionell darzustellen. Letzteres könnte darin begründet sein, dass die Methode
weiter technisch optimiert werden müsste, um Bestimmungen der Calcium-Aufnahme
in jejunale BSMV vom Schaf in geeigneter Weise durchführen zu können.
Durch die alimentäre Calcium-Depletion allein waren die RNA- und Protein-
Expressionen nur in geringem Maße beeinflusst. Statistisch ließen sich die Effekte
Zusammenfassung
84
nicht absichern. Die funktionellen Untersuchungen brachten Hinweise auf eine
gesteigerte Ca2+-Affinität der apikalen Ca2+-Transportsysteme.
Damit konnte erstmals auf struktureller Ebene gezeigt werden, dass der jejunale
Calcium-Transport beim Schaf durch Calcitriol regulierbar ist. Eine alimentäre
Calcium-Depletion reichte als Stimulus aber nicht aus, um den Transport deutlich zu
steigern. Es kann daher diskutiert werden, dass das Schaf aufgrund seiner
Ernährungsweise und der Möglichkeit, ausreichend Calcium aus dem Pansen
aufzunehmen, unter physiologischen Bedingungen nicht auf aktive Ca2+-Resorption
im Dünndarm angewiesen ist.
Summary
85
6 Summary
Nina Mrochen
Studies on the regulation of the jejunal calcium resorption in sheep
In former functional studies it could be demonstrated that compared to most
monogastric animals, the ovine intestinal calcium resorption is mainly located in the
jejunum. Qualitative studies showed the existence of structural prerequisites for a
calcitriol-regulated transcellular calcium transport.
The aim of the present study was to evaluate the regulation of those structural
elements in the ovine jejunum. Therefore, we investigated the effect of alimentary
calcium restriction, treatment with calcitriol in pharmacological dosage or combination
of calcium depletion with treatment on expression and activity of structures involved
in transcellular calcium transport.
For this purpose, the expression of apical calcium-channel TRPV6 and basolateral
calcium-pump PMCA1b were determined by means of quantitative RT-PCR and
Western Analysis. These data were compared with kinetic parameters of calcium
uptake studies into isolated jejunal brush border membrane vesicles (BBMV).
Calcitriol treatment resulted in an increase of TRPV6 and PMCA RNA as well as
protein expression, indicating an up-regulation of calcium transport in ovine jejunum
by calcitriol in principle. However, we were not able to demonstrate this regulation in
functional studies with BBMV. This may be due to technical reasons. In further
investigations, this method has to be further improved and adapted.
A slight increase in RNA and protein expression of both genes seemed to be induced
by the calcium restricted feeding regime. However, this effect could not be verified
statistically. The calcium uptake study with BBMV suggests an increased calcium
affinity of the transport system.
It could be demonstrated for the first time on a structural level, that there is a
regulation of calcium transport in the ovine jejunum. Though, a nutritional calcium
deficiency was not sufficient to significantly increase the amount of intestinal calcium
transport. Hence, it may be discussed that the sheep are, due to their nutrition and
Summary
86
their ability to resorb calcium in the rumen, not necessarily dependent on active
intestinal calcium transport under physiological conditions.
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Anhang
102
Anhang
A. Puffer und Lösungen für die Präparation von
Gesamtmembranen und BSMV
Name der Lösung Bestandteile
Homogenisierungspuffer
20 mmol∙l-1 Tris
250 mmol∙l-1 Saccharose
5 mmol∙l-1 EGTA
5 mmol∙l-1 MgSO4
pH 7,5
MgCl2 (1 mol ∙ l-1) 1 mol ∙ l-1 MgCl2
Präparationspuffer 1
300 mmol ∙ l-1 Mannit
12 mmol ∙ l-1 Tris, basisch
5 mmol ∙ l-1 EGTA
1 mmol ∙ l-1 HCl, pH 7,1
Präparationspuffer 2
60 mmol ∙ l-1 Mannit
5 mmol ∙ l-1 EGTA
1 mmol ∙ l-1 Tris, basisch, pH 7,1
Präparationspuffer 3
100 mmol ∙ l-1 Mannit
100 mmol ∙ l-1 KCl
10 mmol ∙ l-1 HEPES
1 mmol ∙ l-1 Tris, basisch, pH 7,4
Resuspensionspuffer
10 mmol∙l-1 Tris
150 mmol∙l-1 NaCl
pH 7,4
Anhang
103
B. Puffer und Lösungen für die Western Analyse
Name der Lösung Bestandteile
Blottingpuffer
25 mmol ∙ l-1 Tris, basisch
192 mmol ∙ l-1 Glycin
20% v/v Methanol
Denaturierungspuffer
1 ml Glycerin
3 ml SDS [ 10% w/v]
1,25 ml Sammelgelpuffer
0,5 ml ges. Bromphenolblau-Lsg.
ad 10 ml A. bidest (steril)
PBS
137 mmol ∙ l-1 NaCl
3 mmol ∙ l-1 KCl
2 mmol ∙ l-1 KH2PO4
9 mmol ∙ l-1 Na2HPO4
PBST 1 ml Tween 20
Ad 1000 ml PBS
Ponceau Rot-Lösung 20 mg Ponceau 2R
10 ml Essigsäure (3%)
Sammelgel (4,75%)
1,25 ml Roti-Gel 40
1,25 ml Sammelgelpuffer
7,3 ml A. bidest (steril)
100 µl SDS (10%)
100 µl APS (10%)
5 µl TEMED
Sammelgelpuffer
pH 6,8
1 mol ∙ l-1 Trs/HCl
ad 100 ml A. bidest
Elektrodenpuffer
25 mmol ∙ l-1 Tris, basisch
192 mmol ∙ l-1 Glycin
0,1% w/v SDS
Anhang
104
Trenngel (8,5%)
2,5 ml Roti-Gel 40
4,32 ml Trenngelpuffer
4,44 ml A. bidest (steril)
114 µl SDS (10%)
92 µl APS (10%)
9,2 µl TEMED
Trenngelpuffer
pH 8,8
1 mol ∙ l-1 Trs/HCl
ad 100 ml A. bidest
C. Puffer für die funktionellen Untersuchungen
Name der Lösung Bestandteile
KCl-Transportpuffer, 2-fach
200 mmol ∙ l-1 Mannit
200 mmol ∙ l-1 KCl
20 mmol ∙ l-1 Hepes
NaCl-Transportpuffer, 2-fach
200 mmol ∙ l-1 Mannit
200 mmol ∙ l-1 NaCl
20 mmol ∙ l-1 Hepes
Stopplösung
150 mmol ∙ l-1 KCl
50 mmol ∙ l-1 Mannit
10 mmol ∙ l-1 Hepes
1 mmol ∙ l-1 EGTA
Danksagung
105
Danksagung
Zu guter Letzt möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mir in diesem
entscheidenden Lebensabschnitt mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben.
Mein herzlicher Dank gilt:
….Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die freundliche Aufnahme in seine
Arbeitsgruppe.
….Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder für die Überlassung des interessanten
Themas, die engagierte Betreuung, die unglaublich raschen Korrekturen und seine
hilfsbereite Art nicht nur in Belangen der Arbeit.
….meinen Mitstreiterinnen Steffi, Nina, Nina, Katha, Maria, Lisa, Imke, Birgit, die mir
sehr ans Herz gewachsen sind. Danke für die vielen gemütlichen Stunden im
Doktorandenzimmer. Danke auch an Alexandra, Anja und Jens für die vielen
wertvollen Hinweise bei so manchem Laborproblemchen.
….Susi, der liebsten Zimmerkollegin der Welt.
….Inga, die sich für mich manche Nächte um die Ohren geschlagen hat. Danke für
die moralische Unterstützung, deine Diskussionsbereitschaft und die notwendige
Ablenkung auch beim Sport.
….Marion, Kerstin, Marion, Kathrin für die viele Hilfe im Labor und so manchen Keks,
Bärbel für das bekleben hunderter von Eppis und Karin für die aufmunternden Worte.
….Yvonne, Michael und Jelena für die Hilfe bei der Betreuung der Tiere.
Mein größter Dank gilt Mirja von der ich so viel gelernt habe, die alle meine
Gemütszustände mit Engelsgeduld ertragen hat, mich auf dem Weg durch meine
persönliche „Vortragshölle“ begleitet hat, die es nicht leid war auch noch ein zehntes
Danksagung
106
Mal über Vesikel zu diskutieren und die es mit „wohldosiertem“ Druck ermöglicht hat,
dass diese Arbeit zu einem termingerechten Abschluss gelangt ist. Dafür und noch
für so einiges mehr möchte ich dir von Herzen danken und wenn mal wieder eine
Nachtschicht ansteht, sag bescheid, dann bring ich dir was zu Essen.
Auf diesem Weg möchte ich mich auch bei meinen Eltern und meinen Schwestern
Nora und Laura bedanken, die mir ein Zuhause geben, in dem man sich geborgen
fühlt und alle Sorgen nur noch halb so groß sind. Danke für alles was ihr in den
letzten Jahren für uns getan habt. Es ist schön, dass es jemanden gibt auf den man
sich immer verlassen kann.
Den zwei wichtigsten Menschen in meinem Leben möchte ich dafür danken, dass sie
immer an mich geglaubt habe und für ihre Geduld, wenn ich es mal nicht tat.
Aber das Wichtigste: Danke, dass es euch gibt.
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