Post on 31-Aug-2019
Aus der Abteilung für klinische Chemie
(ehem. Leiter: PD. Dr. F. W. Tischendorf)
des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin Hamburg
Institutsdirektor: Prof. Dr. B. Fleischer
Untersuchungen zur biologischen Wirkung von
Onchocerca-volvulus-Proteinen auf
Monozyten / Makrophagen in vitro
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg
vorgelegt von
Florestan Gerald Höckh
geboren in Wiesbaden
Hamburg 2005
Inhaltsverzeichnis
Fragestellung 1
Einleitung 2
1. Ätiologie und Epidemiologie der Onchozerkose 2
2. Parasitologie des Erregers der Onchozerkose 3
3. Parasit-Wirt-Interaktion bei der Onchozerkose 6
4. Klinisches Erscheinungsbild der Onchozerkose 7
4.1 Hautveränderungen 8
4.2 Onchozerkombildung 9
4.3 Augenläsionen 10
5. Diagnostik der Onchozerkose 11
6. Bekämpfungs- und Therapiemaßnahmen bei der Onchozerkose 11
7. Immunantwort gegenüber Onchocerca volvulus 13
7. 1 Zelluläre Abwehrmechanismen 13
7. 2 Humorale Abwehrmechanismen 14
7. 3 Klassische und alternativ aktivierte Makrophagen 16
Material und Methodik 19
1. Reagenzien 19
2. Gewinnung von Onchocera-volvulus-Extrakt 23
2. 1 Materialgewinnung 23
2. 2 Nodulektomie und Isolierung von adulten O. volvulus 23
2. 3 Extraktherstellung 23
Inhaltsverzeichnis
3. Gewinnung humaner mononukleärer Zellen 24
3.1 Probanden 24
3.2 Blutabnahme 24
3.3 Erythrozytensediment und Gewinnung mononukleärer Zellen 24
4. Monozytenreinkultur 26
5. Zellkultur 26
6. Vollblutkultur 27
7. Durchflußzytometrie 28
8. ELISA 30
9. Auswertung und kommerzielle Computersoftware 33
Ergebnisse 34
1. Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 auf stimulierten Monozyten 34
1.1 Optimierung der Bedingungen der Expression von CD163
im Durchflußzytometer 34
1.2 Expression des Scavenger-Rezeptors CD163
nach Stimulation mit Lipopolysaccharid 37
1.3 CD163-Expression nach Stimulation mit dem Steroid Ecdyson 38
1.4 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 40
1.4.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt
von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren 44
1.5 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 45
1.6 CD163-Expression nach Stimulation mit den
Onchocerca-volvulus-Antigenen Ov17, Ovv17 und Ov33 48
1.7 CD163-Expression nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein
des Parasiten Dirofilaria immitis 49
Inhaltsverzeichnis
1.7.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Fragmenten des
Wolbachienproteins des Parasiten Brugia malayi 50
2. Interleukin-10-Freisetzung stimulierter Monozyten 51
2.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 51
2.1.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt
von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren 52
2.2 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 53
2.3 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein
des Parasiten Dirofilaria immitis 55
3. Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf Monozyten 55
3.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors
nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 55
3.1.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation
von gereinigten Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt
von mit Doxycyclin behandelten Patienten 57
3.2 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors
nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 59
3.3 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation
mit Wolbachienoberflächenprotein des Parasiten Dirofilaria immitis 60
4. Zentrale Ergebnisse 61
Diskussion 63
Zusammenfassung 73
Literaturverzeichnis 75
Anhang 95
1. Lebenslauf 95
2. Danksagung 96
3. Erklärung 97
Abkürzungen
AaM Alternativ aktivierte Makrophagen
AMAC-1 Asoziiertes CC-Chemokin alterantiv aktivierter Makrophagen
Bm V1 V1-Peptid des Wolbachienoberflächenantigens von Brugia malayi
Bm V3 V3-Peptid des Wolbachienoberflächenantigens von Brugia malayi
CD Cluster of Differentiation
DTH Immunantwort der verzögerten Überempfindlichkeit
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FCS Fetales Kälberserum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF Granulozyten-/Makrophagenkolonie stimulierender Faktor
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulphonsäure
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IL-10 Interleukin-10
IL-1 RA Interleukin-1-Rezeptorantagonist
LPS Lipopolysaccharid
MIF Makrophagen-inhibierender Faktor
MMR Makrophagen-Mannose-Rezeptor
NO Stickoxid
Ov Onchocerca volvulus
Ov17 Onchocystatin
Ovv17 Fragment des Onchocystatins
Ov33 Asparaginproteaseinhibitor, 33kDa-Antigen von O. volvulus
OvE Extrakt aus adulten Onchocerca volvulus unbehandelter Patienten
OvE/D Extrakt aus adulten Onchocerca volvulus von Patienten, die vor
Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren
OoE Onchocerca-ochengi-Extrakt
PAF Thrombozyten-aktivierender Faktor
PBS Phosphate Buffered Saline
PGE Prostaglandin E
PM Polymyxin B
R-PE / PE R-Phycoerythrin
RPMI Roswell Park Memorial Institute
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TGF Tumor-Wachstums-Faktor
WSP Wolbachienoberflächenprotein (Wolbachia Surface Protein)
von Dirofilaria immitis
1
Fragestellung
Alternativ aktivierte Makrophagen spielen bei der Immunantwort gegen Helminthen
eine bedeutende regulierende Rolle (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003). Trotz hoher
Mikrofilariendichte kommt es bei der generalisierten Form der Onchozerkose nicht zu
einer massiven Inflammation, wie es bei der Sowda-Form der Onchozerkose zu
beobachten ist. Bei der Immunantwort der generalisierten Form der Onchozerkose stellt
sich die Frage, ob Proteine des Parasiten O. volvulus alternativ aktivierte Makrophagen
dahingehend stimulieren, daß diese eine antiinflammatorische Reaktion herbeiführen. In
der vorliegenden Arbeit sollte experimentell geprüft werden, ob Onchocerca-volvulus-
Proteine antiinflammatorische Faktoren in und auf Monozyten/Makrophagen induzieren
können.
Es sollten mononukleäre Zellen und Monozyten gesunder Probanden in Gegenwart von
Extrakt adulter O. volvulus und einzelnen rekombinant exprimierten Proteinen in vitro
kultiviert werden. Anschließend sollte die Expression von, für alternativ aktivierte
Makrophagen charakteristischen Rezeptoren (CD163, MMR) auf den Zellen gemessen
und im Überstand dieser Zellkulturen das Produkt von aaM, IL-10, bestimmt werden.
2
Einleitung
1. Ätiologie und Epidemiologie der Onchozerkose
Die Onchozerkose ist weltweit die zweithäufigste infektiöse Erblindungsursache
(WHO, 1995). So sind in der Republik Zentralafrika 2,2% von 6086 Individuen
erblindet (Schwartz et al., 1997). Die Mehrheit der Erblindungen ist dort durch
Onchozerkose bedingt (73,1%), der übrige Teil durch Katarakt (16,4%), Trachom
(4,5%) oder Glaukom (2,2%). Ursache dieser chronisch verlaufenden Erkrankung
(Flußblindheit) ist der Fadenwurm Onchocerca volvulus (Ordnung Spirurida,
Überfamilie Filaroidea); er stellt eine der wichtigsten humanpathogenen Filarien dar.
Onchocerca volvulus als Erreger der Onchozerkose wurde erstmals von einem
deutschen Missionar in Ghana beschrieben. 1893 gab Leuckart dem Parasiten seinen
Namen. Der Parasit kommt in 34 tropischen Ländern vor (Abb. 1). Vorwiegend kann
O. volvulus auf dem afrikanischen Kontinent, an der Südspitze der arabischen Halbinsel
sowie in Zentral- und Südamerika gefunden werden. Von den insgesamt über
120 Millionen weltweit in Risikogebieten lebenden Menschen sind ca. 18 Millionen mit
O. volvulus infiziert (WHO, 1995).
Abbildung 1:
Epidemiegebiete der
Onchozerkose
(freundlicherweise
von Prof. D. W.
Büttner zur
Verfügung gestellt)
Einleitung
3
2. Parasitologie des Erregers der Onchozerkose
Je nach Region sind unterschiedliche Arten von Simulien (Kriebelmücken) für die
Übertragung verantwortlich. In Westafrika wird O. volvulus durch Simulien des
Simulium damnosum-Komplexes übertragen. Innerhalb des Komplexes kann man
25 Typen unterscheiden (WHO, 1995). Simulien leben und brüten bevorzugt an schnell
fließenden Gewässern. Sie sind tagaktiv, exophil und können auf der Suche nach
Brutplätzen Entfernungen bis zu 500 km zurücklegen (Garms, Walsh and Davies,
1979). Normalerweise ernähren sich Simulien von Pflanzensäften. Zum Heranreifen
ihrer Eier benötigen die Weibchen jedoch Blut. Um an eine Blutmahlzeit zu gelangen,
orientieren sie sich an Duftstoffen im Schweiß von Säugetieren.
Bei der Blutmahlzeit nimmt das Simulienweibchen durch ihren kurzen Saugrüssel nach
Setzen von Gewebszerstörungen Mikrofilarien mit der Gewebsflüssigkeit des Wirtes
auf. Der Saugakt dauert ungefähr vier Minuten, bei dem die Simulie eine anästhetisch
wirksame Substanz abgibt, um vom Wirt nicht gestört zu werden. Die aufgenommene
Blutmenge beträgt ca. einen Mikroliter. Simulien fliegen dicht über der Erde und
stechen Erwachsene vorwiegend in den Unterkörper, Kinder auch in den Oberkörper
und Kopf (Duke & Beesley, 1958). Die Saugaktivität in Westafrika ist in den
Morgenstunden und am späten Nachmittag am höchsten, d.h. wenn die Außen-
temperatur zwischen 18°C und 35°C liegt. In einigen Gebieten sind mehr als 90% der
Erwachsenen mit O. volvulus infiziert (McMahon & Simonsen, 1996).
Bevor die aufgenommenen Mikrofilarien die Flugmuskulatur der Simulie erreichen,
müssen sie die Pharynxleiste und die peritrophische Membran des Insektenmagens
überwinden und in das Haemocoel gelangen. Dabei sterben ca. 25-33% der
Mikrofilarien (Brinkmann, 1982). In der Flugmuskulatur beginnen die Mikrofilarien
sich intrazellulär zu ernähren. Nach zwei Häutungen wandern die dritten infektiösen
Larvenstadien (L3) in den Kopf der Simulie. Von den Larvenstadien sterben ca. 15%.
Die Infektionslarven sammeln sich in den Mundwerkzeugen und werden bei einem
erneuten Blutmahl an den Wirt abgegeben. Die Entwicklung zur infektiösen Larve
dauert je nach Umgebungstemperatur ein bis zwei Wochen. Nach Beobachtungen von
B. Philippon und B. Quillevere (Philippon & Quillevere, 1977) sterben bis zu einem
Drittel der Parasiten bei Nachttemperaturen von unter 18°C.
Einleitung
4
Die L3 wandern durch das subkutane Fettgewebe des infizierten Menschen, häuten sich
innerhalb von zwei bis sechs Tagen zum vierten Larvenstadium (Bianco et al., 1989;
Strote & Bonow 1991). An dem komplexen Häutungsprozeß sind proteolytische
Enzyme beteiligt, die die alte Kutikula von der neuen trennen (Lustigman et al., 1996).
Aus dem vierten Larvenstadium entwickelt sich innerhalb von neun Monaten ein adulter
Parasit. Es bilden sich fibröse Knoten (Onchozerkome) um weibliche Filarien, die in der
Regel oberflächlich im Unterhautbindegewebe (Nelson, 1970; Albiez, 1978; Albiez et
al., 1978), aber auch in tieferen Gewebsschichten (Kilian, 1988) liegen können. In
diesen Knoten wachsen die weiblichen Filarien bis auf eine Länge zwischen 23 - 70 cm
und einen maximalen Durchmesser von ca. fünf Millimeter heran. Sie liegen allein oder
zu mehreren in diesen Knoten, die durch die Aggregation von Satellitenknoten im Lauf
der Zeit immer größer werden.
Tabelle 1: Entwicklungsstadien und Lebensdauer (Duke, 1990).
Männchen hingegen werden nur zwischen 6 - 13 cm lang und haben einen Durch-
messer von ca. 0,15 mm (Burchard & Bierther, 1978; Burchard et al., 1979; Franz,
1979; Omar & Büttner, 1979). Sie leben ebenfalls in den Knoten und wandern nach der
Befruchtung der Weibchen aus, um andere Knoten aufzusuchen. Der Mechanismus, der
den Männchen die Wanderung durch die Bindegewebskapsel ermöglicht, ist noch nicht
geklärt. Adulte Würmer leben bis zu 15 Jahre. In einem Zeitraum von 10 bis 15 Jahren
Stadium Vorkommen Lebensdauer
Adultes Weibchen Subkutanes Bindegewebe und
Onchozerkom (Mensch) bis zu 15 Jahre
Adultes Männchen Subkutanes Bindegewebe und
Onchozerkom (Mensch) bis zu 15 Jahre
Mikrofilarien Vorwiegend in der Haut und selten im
Bindegewebe (Mensch) ca. 1 bis 1,5 Jahre
1. Larvenstadium Flugmuskulatur (Simulie) ca. 4 Tage
2. Larvenstadium Flugmuskulatur (Simulie) ca. 2 Tage
3. Larvenstadium Kopf und Thorax (Simulie) ca. 2 bis 6 Tage
4. Larvenstadium Subkutanes Bindegewebe (Mensch) Präpatenz 1 Jahr
Einleitung
5
bildet ein Weibchen Millionen von Mikrofilarien (WHO, 1995). Diese ca. 0,3 mm
langen und im Durchmesser ca. 0,007 mm breiten Filarienlarven (Franz, 1979) können
in der Haut des Menschen 6 bis 24 Monate überleben. Eine Übersicht über das
Vorkommen und die Lebensdauer der Entwicklungsstadien von O. volvulus gibt die
Tabelle 1 wieder. Der Kreislauf beginnt von neuem, sobald Mikrofilarien bei einem
erneuten Saugakt von einer Kriebelmücke aufgenommen werden. Die Abbildung 2 zeigt
den Lebenszyklus von O. volvulus.
Lebenszyklus von O. volvulus
Abbildung 2: Lebenszyklus von O. volvulus (nach A. Renz, Universität Stuttgart und
WHO)
Einleitung
6
3. Parasit-Wirt-Interaktion bei der Onchozerkose
Die Mikrofilarie ist das am häufigsten vorkommende Stadium des Parasiten im
Menschen. Pro Tag und Weibchen schlüpfen durchschnittlich 700-1500 Mikrofilarien.
Die Anzahl der adulten Weibchen ist auf 60 beschränkt. Ein infizierter Mensch kann
über 12 Millionen Mikrofilarien beherbergen (Schulz-Key, 1990). In infizierten
Menschen nimmt die Mikrofilariendichte von den Füßen zum Kopf hin ab. Die
Mikrofilarien können durch die Kornea wandern und führen dort durch enzymale
Reaktionen zu einer Sklerosierung und Entzündung der Kornea.
Mikrofilarien von O. volvulus zeigen keine ausgeprägte Periodizität, wie sie bei anderen
Filarien bekannt ist (z.B.: Wuchereria bancrofti). Die maximale Dichte wurde in Afrika
und Guatemala mittags und am frühen Nachmittag gefunden (Duke, 1973; Duke &
Moore, 1974; Anderson et al., 1975). Die Krankheitsmanifestationen werden
überwiegend durch die inflammatorischen Reaktionen gegenüber Mikrofilarien
hervorgerufen. Veränderungen der Haut, der Augen sowie der Lymphknoten können
festgestellt werden. Erstaunlicherweise ist in den meisten Fällen trotz hoher
Mikrofilariendichte die inflammatorische Reaktion eher schwach ausgeprägt
(generalisierte Form der Onchozerkose; Ottesen, 1995). Die Sowda-Form der
Onchozerkose (Sowda aus dem Arabischen „aswad“= schwarz) mit stark ausgeprägter
Immunantwort gegen Antigene von Mikrofilarien tritt wesentlich seltener auf. Im
Vergleich zu der generalisierten Form ist bei der Sowda-Form die Mikrofilariendichte
weitaus geringer.
Ottesen (1995) unterscheidet drei exponierte Personengruppen:
I. Endemisch normale (mutmaßlich immune) Personen: Menschen, die in
Endemiegebieten gewohnt haben oder noch wohnen, bei denen jedoch keine
Infektion nachweisbar ist
II. Patienten mit generalisierter Mikrofilardermie (generalisierte Form) der
Onchozerkose: Sie zeigen Mikrofilarien in der Hautbiopsie, meist ohne
klinische Hautmanifestationen
III. Patienten mit chronisch-hyperreaktiver Form der Infektion (Sowda-Form):
Die Patienten weisen eine lokalisierte Entzündung der Haut mit geringer
Mikrofilariendichte auf
Einleitung
7
Die Abtötungsrate von Mikrofilarien in einem Patienten ist abhängig von der
bestehenden Parasitenlast, der Vitalität der Mikrofilarien und der Immunkompetenz des
Wirtes. Mikrofilarien können von Entzündungszellen attackiert werden (Büttner &
Rácz, 1983; Wildenburg et al., 1996). Die humorale Immunantwort auf parasitäres
Antigen ist weitaus prominenter als die zelluläre Zellantwort (Ottesen, 1995). Sterbende
Mikrofilarien lösen im Gegensatz zu lebenden Mikrofilarien lokale Entzündungs-
reaktionen aus. Es besteht eine Interaktion zwischen den Mikrofilarien und dem
Immunsystem des Wirts auf der Basis von exkretorischen und sekretorischen
Produkten.
Der Parasit O. volvulus lebt in einer Symbiose mit Wolbachien, die zur Familie der
Rickettsien gehören (Taylor & Hoerauf, 1999). Diese intrazellulär lebenden,
gramnegativen Bakterien werden in der Hypodermis, den Oozyten, allen embryonalen
Stadien und im Uterus des adulten Wurms sowie in Mikrofilarien gefunden und führen
bei ihrem Fehlen oder ihrer Eliminierung nach Behandlung mit Doxycyclin zu einer
langanhaltenden Sterilität des weiblichen Wurms (Hoerauf et al., 2000). Fast alle
Filarienspezies beherbergen Wolbachien, die vertikal übertragen werden (Taylor et al.,
1999). Es gibt vier Wolbachiengruppen, die mit A-D benannt werden. Verschiedene
Individuen einer Untergruppe der gleichen Wirtsspezies zeigen eine identische
Gensequenz des Wolbachienoberflächenproteins (WSP). In Nematoden kommen die
Gruppen C und D vor (Bazzocchi et al., 2000).
4. Klinisches Erscheinungsbild der Onchozerkose
Die Onchozerkose zeigt klinisch ein breites, fließend ineinander übergehendes
Formenspektrum (Ottesen 1995, Brattig 2004), von der häufigen hyporeaktiven
generalisierten Form mit geringer bis hoher Mikrofilariendichte der Haut bis hin zur
seltenen hyperreaktiven Sowda-Form mit niedriger Mikrofilariendichte. Die
Onchozerkose geht mit Knotenbildung (Onchozerkomen), Hautveränderungen wie
Depigmentierung (Leopardenhaut), Atrophie (Papierhaut) und Pruritus einher. Der
Korneabefall mit Mikrofilarien kann zur Erblindung führen, weshalb die Erkrankung
auch den Namen Flußblindheit bekommen hat (Schäfer & Gümbel, 2004).
Einleitung
8
4.1 Hautveränderungen
Die Hautveränderungen stehen in direkter Beziehung zur Mikrofilariendichte der Haut
(Kreshaw et al., 1954). Das erste Zeichen ist oft starker Juckreiz und eine akute
unspezifische Dermatitis mit stecknadelkopfgroßen, gleichförmigen Papeln. Bei
längerem Bestehen der Infektion kann sich eine chronische Dermatitis ausbilden. „Craw
Craw“ ist der ursprüngliche afrikanische Name dieses Krankheitsbildes, auch „Gale
filarienne“ oder Onchodermatitis genannt. In Zentralamerika, wo die Veränderungen
bevorzugt im Gesicht auftreten, nennt man dieses Krankheitsbild „Erisipela de la costa“.
Abbildung 3: Verän-
derung der Haut bei
Onchozerkose
(www.who.int)
Bei der Papierhaut
handelt es sich im
wesentlichen um eine
Schädigung und Ver-
minderung der retikulären und elastischen Fasern in der oberflächlichen Kutisschicht.
Eine dadurch bewirkte Lockerung der Haftstellen zwischen Epidermis und Kutis
verursacht Reliefveränderungen, die makroskopisch zunächst als sogenannte „lizard
skin“ und später bei ausgeprägter Atrophie mit papierdünner Haut das Bild der „crushed
tissue paper skin“ bietet (Abb. 3). In Liberia traten diese Veränderungen ähnlich der
normalen Hautalterung ohne gleichzeitige oder vorherige Dermatitis auf (Reber &
Hoeppli, 1964; Schumacher, 1965). Wenn die Hautfaltenbildung über den ursprünglich
vergrößerten inguinalen und femoralen Lymphknoten besonders ausgeprägt ist, spricht
man von „hanging groins“ (Nelson, 1958; Büttner, 1998). Am Eindrucksvollsten ist die
unregelmäßige Depigmentierung der Haut, vorwiegend prätibial (Browne, 1960).
Differentialdiagnostisch müssen eine tuberkuloide Lepra, Depigmentierungen bei
Treponematosen, insbesondere Framboesia tropica, eine Vitiligo, ein Arzneimittel-
exanthem und andere Dermatitiden abgegrenzt werden.
Einleitung
9
4.2 Onchozerkombildung
Onchozerkome sind linsen- bis pflaumengroße Tumore, die über der Unterlage
verschieblich und als rundliche bis ovale Knoten getastet werden können (Abb. 4). Die
Sensitivität des palpatorischen Befundes von Onchozerkomen liegt bei 94-99% (Weiss,
1978; Albiez, 1978). Sie sind meist fester als Lymphknoten und Lipome, jedoch nicht
so fest wie verkäsende Lymphknoten. Onchozerkome kommen in nahezu allen
Körperregionen vor. Je nach Endemiegebiet wurden typische Verteilungsmuster
beschrieben. An den Händen und Füßen, sowie im Gesicht kommen Onchozerkome
praktisch nicht vor. Auch sind sie äußerst selten im Bereich der Unterschenkel und im
Bereich der Bauchhaut anzutreffen. Vorwiegend im Hüftbereich verschmelzen oft
mehrere Knoten zu größeren
Konglomeraten mit unregelmä-
ßiger Oberfläche. Geschwollene
Lymphknoten können inguinal,
femoral und auch axillär (Senker
et al., 1973) oder generalisiert
(Browne, 1959; Connor et al.,
1970) vorkommen und die Folge
einer lokalen Lymphadenitis sein.
Abbildung 4: Vier bis fünf cm großes Onchozerkom über den linken Rippen eines ca.
vier Jahre alten Jungen. (www.who.int)
Einleitung
10
4.3 Augenläsionen
Lebende und tote Mikrofilarien können mittels Spaltlampe in der Kornea beobachtet
werden (Boithias, 1958; Anderson & Fuglsang, 1973). Der Tod von Mikrofilarien in der
Kornea führt zu einer begrenzten entzündlichen Reaktion, die eine unscharf begrenzte
graue Trübung hinterläßt (Garner, 1976; Thylefors, 1978; Schäfer & Gümbel, 2004).
Beschrieben als „flockige“ oder „schneeflockenartige“ Trübung präsentiert sich das
Bild einer Keratitis punctata. Im frühen Stadium ist diese Augenveränderung noch
reversibel (Lagraulet, 1971). Massive Invasion führt zur irreversiblen sklerosierenden
Keratitis (Garner, 1976). Sie beginnt gewöhnlich am unteren Limbus der Kornea als
grauer ödematöser Bezirk, in dem zahlreiche Mikrofilarien enthalten sind. Erreicht die
sklerosierende Fläche die zentrale pupilläre Zone und wächst darüber hinaus, so
erblindet das Auge (Abb. 5). Meist leiden Patienten mit einer sklerosierenden Keratitis
gleichzeitig an einer Uveitis der vorderen Abschnitte (Anderson & Fuglsang, 1977).
Abbildung 5: Sklerosierende Keratitis (www.stanford.edu)
Einleitung
11
5. Diagnostik der Onchozerkose
Neben der Klinik sind die Palpation von Onchozerkomen sowie „skin snips“ (kleine
Hautbiopsien) mittels Sklerastanze nach Walser zur Diagnoseerhebung entscheidend.
Nach der Entnahme wird die Biopsie für 24 Stunden in 0,9 % NaCl-Lösung gegeben.
Die Mikrofilarien verlassen das Biopsat und können anschließend mittels Mikroskop
ausgezählt werden (Braun-Munzinger et al., 1977).
Wenn die Hautbiopsie und die Palpation von Onchozerkomen negativ ausfallen, könnte
man bei bestehendem Verdacht auf Onchozerkose den Mazzotti-Test (Mazzotti, 1948)
anwenden. Dieser Test wird mittels einer einmaligen Dosis von 50 mg
Diäthylcarbamazin (DEC) durchgeführt. Nach frühestens 15 Minuten, spätestens jedoch
nach einem Tag, tritt ein starker Juckreiz und eventuell eine Urtikaria mit
asymmetrischem Erythem auf. Die Reaktion ist an den Stellen am stärksten ausgeprägt,
an denen die Konzentration der Mikrofilarien am höchsten ist. Gelegentlich kommt es
zu leichtem Fieber, Unwohlsein und Schwellung der örtlichen Lymphknoten. Die
Hauterscheinungen und der Juckreiz lassen im Verlauf von 3 bis 5 Tagen nach. Der Test
ist negativ, sofern keine Mikrofilarien vorhanden sind. Bei hoher Filariendichte der
Haut sollte aufgrund des massiven Untergangs von Mikrofilarien und einer daraus
resultierenden Gefährdung des Patienten durch Schwindel, Atemnot und Kollaps kein
Test angewandt werden. Der Test ist nicht spezifisch für O. volvulus.
6. Bekämpfungs- und Therapiemaßnahmen bei der Onchozerkose
1974 wurde in dem von Onchozerkose am schwersten betroffenen Gebiet Westafrikas
(ca. 1 235 000 km2) ein Onchozerkose-Kontrollprogramm (OCP) gestartet. Die
Bevölkerung des OCP-Gebietes betrug zu Beginn des Programms (1974) ca.
10 Millionen Einwohner, von denen mehr als eine Million an Onchozerkose litten; über
100 000 zeigten schwere Augenmanifestationen, 35 000 weitere waren bereits an den
Parasiten erblindet. 1986 wurde das OCP-Gebiet erweitert.
Die Strategie der WHO bezweckt die Reduktion der Simulienpopulation. Durch die
Minimierung des Vektors wird die Häufigkeit der Transmission von Mikrofilarien auf
Einleitung
12
den Menschen verringert. Per Flugzeug wurden über einen Zeitraum von 14 Jahren
regelmäßig Insektizide über den Brutplätzen versprüht. Sieben Insektizide (Toxin von
Bacillus shaericus und Bacillus thuringiensis var israelensis (B.t und H-14), Temephos
(Abate), Pyraclofos, Phoxim, Permethrin, Carbosulfan und Vectron) wurden unter
ständiger Kontrolle von Flora und Fauna in dem Programm eingesetzt. 1988 wurde das
Programm auf Guinea, Sierra Leone, Südghana, Togo und Benin ausgeweitet, um die
Reinvasion der Simulien in die OCP-Gebiete zu eliminieren. In den achtziger Jahren
tauchte erstmals das Problem der zunehmenden Resistenz der Simulien gegen die
verwendeten Insektizide auf. Daraufhin wurden als Konsequenz verbesserte Insektizide
abwechselnd verwendet.
In den frühen achtziger Jahren begann das erste medizinisch kontrollierte Therapie-
programm mit Ivermectin (Mectizan® Merck). Es wurde mit der Intention verabreicht,
einer Erblindung der Erkrankten vorzubeugen. Im Jahre 1996 sind mehr als 2,6 Mil-
lionen Menschen mit Ivermectin im Gebiet des Programms behandelt worden
(www.who.int). Hierbei kommt es zu einer Eliminierung der Wolbachien im weiblichen
Wurm sowie zu einer massiven Abnahme der Mikrofilariendichte in der Haut. Nach
18 Monaten zeigten sich bei 90% der so behandelten Patienten keine Mikrofilarien mehr
in der Haut (Hoerauf et al., 2001). Bei der Verabreichung von 150 µg/kg Körpergewicht
Ivermectin werden nur Mikrofilarien, nicht aber adulte Filarien abgetötet. Da die
geschlechtsreifen Würmer erneut Mikrofilarien hervorbringen, muß meist nach
6-12 Monaten erneut mit Ivermectin behandelt werden (Eddelston & Pierini, 1999).
Nach neueren klinischen Studien führt eine Gabe von 100 mg/Tag Doxycyclin über
sechs Wochen, verbunden mit einer einmaligen Gabe von 150 µg/kg Körpergewicht
Ivermectin, zu einer weitgehenden Sterilisation des weiblichen Wurms (Hoerauf et al.,
2001).
Einleitung
13
7. Immunantwort gegenüber Onchocerca volvulus
7.1 Zelluläre Abwehrmechanismen
Die Immunmechanismen gegen O. volvulus sind komplex. Bei unbehandelten Patienten
mit variierender Mikrofilariendichte der Haut kann eine massive Infiltration von
eosinophilen Granulozyten und Makrophagen im Gewebe um sterbende oder tote
Mikrofilarien beobachten werden (Büttner & Rácz, 1983). Die ansteigende
Akkumulation von eosinophilen Granulozyten in Onchozerkomen hängt von der
Mikrofilarienpräsenz ab (Wildenburg et al., 1996). Immunreaktionen gegen lebende,
agile Mikrofilarien treten in histologischen Hautbiopsien von Patienten mit
Mikrofilardermie meist nur nach mikrofilarizider Medikation auf (Darge et al., 1991).
Neben eosinophilen Granulozyten und Makrophagen wird die Beteiligung von
neutrophilen Granulozyten an der zellulären Immunantwort auf Mikrofilarien in der
Haut beschrieben (Gutiérrez-Peña et al., 1996). Anhand der erhöhten Bluteosinophilie
und der steigenden Konzentration zirkulierender kationischer eosinophiler Proteine
(Tischendorf et al., 1996) kann die Beteiligung des Immunsystems am täglichen Umsatz
von Mikrofilarien gezeigt werden.
Bei Patienten mit gesicherter Sowda-Form zeigt sich im Gegensatz zur generalisierten
Form ein Untergang von Mikrofilarien auch ohne mikrofilarizide Medikation (Büttner
& Rácz, 1983). Sowda-Patienten haben eine verminderte Parasitenlast sowie wenige
große Onchozerkome mit einem charakteristischerweise massiven inflammatorischen
Infiltrat von Lymphozyten, Mastzellen, eosinophilen Granulozyten, neutrophilen
Granulozyten und Makrophagen (Korten et al., 1998). Ein ähnliches Muster zeigt sich
auch in den vergrößerten Lymphknoten. Eosinophile Granulozyten, neutrophile
Granulozyten und Makrophagen besitzen die Fähigkeit, Mikrofilarien abzutöten
(Büttner & Rácz, 1983; Korten et al., 1998).
Bei der Sowda-Form, im Gegensatz zur generalisierten Form, kommt es zum Untergang
von Mikrofilarien in vivo durch das Zusammenspiel von aktivierten inflammatorischen
Zellen. Bei der generalisierten Form ist die Immunantwort supprimiert. T-Zellen und
Antigen-präsentierende Zellen spielen offensichtlich eine wichtige Rolle in der
Wegweisung der Immunantwort.
Einleitung
14
Verschiedene In-vitro-Studien bestätigen das Vermögen eosinophiler und neutrophiler
Granulozyten, Mikrofilarien und L3 zu bekämpfen (Greene et al., 1981; Johnson et al.,
1994). Während eosinophile Granulozyten nach Aktivierung L3 direkt immobilisieren,
werden zur Adhärenzreaktion an Mikrofilarien spezifische Antikörper zur Opsonierung
benötigt. Nach der Häutung von L3 werden die L4-Stadien nicht mehr attackiert
(Brattig et al., 1991). Im Tiermodell führen antikörperabhängige eosinophile
Granulozyten kurz nach ihrem Eindringen in den Wirt zur Zerstörung von L3. Das
Vorhandensein von Antikörpern und Effektorzellen scheint essentiell für die
Immunantwort zu sein. Die Abhängigkeit von Interleukin-4 (IL-4) und IL-5
kennzeichnet diese Reaktion als T-Helfer2-Antwort (Th2-Antwort). Unter Berück-
sichtigung der vorherrschenden T-Helferzellen bei der Regulation der Immunantwort
gegen Mikrofilarien und L3 zeigte sich ein Unterschied bei putativ Immunen (PI),
Patienten mit Sowda und Patienten mit generalisierter Onchozerkose. Bei der
generalisierten Form dominierte eine Th2-Antwort. Einzelne Berichte beschrieben eine
Th1-Antwort für putativ Immune (PI; Elson et al., 1995). Die Mehrzahl der
Publikationen beschreibt jedoch für PI oder endemisch unauffällige Personen eine
gemischte Th1/Th2- Antwort (Soboslay et al., 1997; Brattig et al., 1997; Doetze et al.,
1997; Turaga et al., 2000). Interferon-γ (IFN-γ) und IL-5 sind die bei PI am häufigsten
gefundenen Zytokine.
Im Vergleich zu Patienten mit der Sowda-Form und putativ immunen Personen
zeichnen sich Patienten mit einer generalisierten Onchozerkose, besonders bei Patienten
mit hoher Parasitenlast, durch einen Status der Suppression des Immunsystems aus
(Cooper et al., 1998). Bei Patienten mit generalisierter Form wurde, im Gegensatz zu
Patienten mit Sowda und putativ immunen Personen, eine geringe Proliferation
peripherer mononukleärer Blutzellen als Antwort auf Onchocerca-volvulus-Extrakt
(OvE) beobachtet (Steel & Nutman, 1993; Elson et al., 1995; Soboslay et al., 1997;
Doetze et al., 2000).
7.2 Humorale Abwehrmechanismen
Die Aufgabe der humoralen Abwehr ist die Neutralisierung und Eliminierung
körperfremder Antigene und Pathogene. Bei der Aktivierung der B-Zellen zu
Einleitung
15
Plasmazellen spielen Th2-Zellen eine entscheidende Rolle. Die Antigenbindungsstellen
bestimmen die Spezifität der Antikörper. Die Isotypen der konstanten Domäne der
schweren Ketten bestimmen hingegen die Wirkungsfunktion. Zunächst werden IgM und
IgD, gefolgt von IgG und IgE exprimiert. Bereits einen Monat nach Infektion mit
O. volvulus können Immunglobuline nachgewiesen werden (Taylor, 1994). Isotypen
von IgG weisen Unterschiede in ihrer funktionellen Eigenschaft auf. IgG1 und IgG3
können die Komplementkaskade aktivieren und reagieren nach Bindung des
spezifischen Antigens mit Fc-Rezeptoren auf der Effektorzelle der antikörper-
abhängigen zellulären Zytotoxizität (Van de Winkel & Capel, 1993). Komplement-
proteine (C3b) spielen eine wichtige Rolle bei der Adhäsionsreaktion von eosinophilen
und neutrophilen Granulozyten (Medina de la Garza et al., 1990; Brattig et al., 1991).
IgG4 kann weder Komplement aktivieren noch vermag es Fc-Rezeptoren von
Effektorzellen nach Bindung von Antigendeterminanten zu aktivieren.
Die Konzentration der Fc-Rezeptor- und Komplement-bindenden IgG3 sind bei putativ
immunen Personen in einer höheren Konzentration nachweisbar als bei Patienten mit
der generalisierten Form der Onchozerkose (Boyer et al., 1991). Patienten mit
generalisierter Onchozerkose bilden hingegen charakteristischerweise in hoher
Konzentration IgG4, die mit Hilfe von Extrakt der Onchocerca-volvulus-Würmer (OvE)
nachgewiesen wurden (Bradley & Unnasch, 1996). Patienten mit hoher Mikrofilarien-
dichte zeigen hohe IgG4-Titer, die mit einer supprimierten T-Zellantwort korrelieren
(Maizels et al., 1995). Die Bildung von IgG4 wird durch IL-4 induziert, das von
Th2-Zellen sezerniert wird (Wierenga et al. 1990). Im Gegensatz zu putativ immunen
Patienten mit einer gemischten Th1/Th2-Antwort wurde eine stark ausgeprägte
Th2-Antwort gegen OvE in Sowda-Patienten beobachtet (Brattig et al., 1997; Turaga et
al., 2000). Sowda-Patienten produzieren hohe Konzentrationen von IgG1, IgG3 (Brattig
et al, 1994) und IgE (Mpagi et al., 2000) gegen Onchocerca-volvulus-Antigene. Die
IgG3-Antwort gegen OvE korrelierte negativ mit der Mikrofilariendichte (Dafa’alla et
al., 1992). Es wird angenommen, daß eine Th2-vermittelte, Antikörper- und
Granulozyten-abhängige Immunantwort zur Zerstörung von Mikrofilarien, aber auch
zur Inflammation der Haut wie bei der Sowda-Form führt.
Einleitung
16
7.3 Klassische und alternativ aktivierte Makrophagen
Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DZ) haben den ersten Kontakt mit
Parasiten und reagieren daraufhin mit generischen Reaktionen, wie z.B. Zytokin-
freisetzung und Antigenpräsentation, mit denen eine T-Zellantwort eingeleitet wird
(Reis e Sousa, 2001). Die klassische Aktivierung von Makrophagen wird durch
Interferon-γ (IFN-γ) induziert, welches getriggert durch mikrobiologische Substanzen
wie Lipopolysaccharid zu einer Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie
Interleukin-6, Tumor-Nekrose-Faktor und IL-1 sowie Stickoxid (NO) führt. Neben
klassisch aktivierten, Immunantwort-stimulierenden DZ ist auch seit einigen Jahren
bekannt, daß die Immunantwort supprimierende Zellen bei chronisch infizierten
Menschen (Piessens et al., 1980) und Tieren (Lammie & Katz, 1983) aufweist. Spätere
Studien zeigten die Rolle von IL-10, das bei der Suppression der Immunreaktion von
Makrophagen freigesetzt wird (Allen & Loke, 2001). Akzessorische Zellen, wie
Makrophagen, die keine Antigen-spezifischen Rezeptoren exprimieren, üben eine
immunmodulierende Wirkung auf die Antigen-spezifische Immunantwort von
Lymphozyten aus. Durch Nematoden aktivierte Makrophagen sind größer, haben mehr
Vakuolen und ein anderes Profil exprimierter Gene als klassische Makrophagen
(Maizles & Yazdanbakhsh, 2003). An Stelle der Produktion von inflammatorischem
NO wird in diesen Zellen die Expression von Arginase (die mit dem Substrat der
Stickstoffoxidsynthase konkurriert) hochreguliert.
Eine alternative Aktivierung von Monozyten/Makrophagen (aaM) wird im Gegensatz
zur klassischen Aktivierung durch antiinflammatorische Substanzen wie IL-4 (Stein et
al., 1992; Schebesch et al., 1997), Glukokortikoide, wie Dexamethason (Kodelja et al.,
1994; Djemadji-Oudjiel et al., 1996; Sorg et al., 2000), IL-10 (Zlotnik & Moore, 1992;
Kodelja et al., 1998; Williams et al., 2002), IL-13 (Gordon, 2003) und TGF-ß (Takeuchi
et al., 1997) ausgelöst. AaM sezernieren funktionell relevante Moleküle und
exprimieren Rezeptoren mit Spezifität für Pathogen-assoziierte molekulare Muster
(PAMP). Diese Muster werden dem angeborenen Immunsystem zugerechnet (Gordon
2003).
Der cysteinreiche Scavenger-Rezeptor Typ1 CD163 (Djemadji-Oudjiel et al., 1996;
Kodelja et al., 1997; Högger et al., 1998; Droste et al., 1999), der ß-Glukan-Rezeptor
Einleitung
17
(Mosser & Handman, 1992) sowie der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (Stein et al.,
1992; Kodelja et al., 1997) werden bei diesen Makrophagen vermehrt exprimiert und
sind Marker für aaM.
CD163 ist ein membranständiger Rezeptor von aaM, der auch in löslicher Form
vorkommen kann (Droste et al., 1999). IL-6, Glukokortikoide wie Dexamethason und
antiinflammatorisches IL-10 induzieren die Expression von CD163 auf Monozyten/
Makrophagen. Herunterreguliert wird der Rezeptor von proinflammatorischen
Mediatoren wie LPS, IFN-γ und TNF-α (Högger et al., 1998; Büchler et al., 2000). Der
cysteinreiche Scavenger-Rezeptor CD163 besteht aus einem aminoterminalen
Signalelement, einer transmembranen Domäne von 24 Aminosäuren und neun kurzen,
zytoplasmatischen Domänen (Van den Heuvel et al., 1999; Møller et al., 2002). CD163
ist beteiligt bei der Adhäsion des Monozyten an Endothelzellen (Wenzel & Sorg, 1996;
Van den Heuvel et al., 1999) sowie bei der Kalzium-Mobilisation, der Inositol-
triphosphatproduktion und Sekretion von IL-6 und GM-CSF (Van den Heuvel et al.,
1999). CD163 wirkt als Schlüsselmolekül, wie das Plasmaprotein Haptoglobin bei der
Clearance und Wiederverwertung von Hämoglobin zerstörter Erythrozyten. An CD163
gebundenes Haptoglobin und Hämoglobin wird vom Makrophagen endozytiert (Madsen
et al., 2001). Die Rezeptor-Ligand-Interaktion ist kalziumabhängig und weist eine hohe
Affinität auf (Kristiansen et al., 2001). CD163 ist am stärksten auf Makrophagen und
nur zu 50% auf den peripheren Blutmonozyten exprimiert (Sulahian et al., 2000).
Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) gehört zu der Gruppe der c-Typ-Lectine
und dient der Erkennung, Bindung und Phagozytose von einfachen exprimierten
Zuckern von Pathogenen (Lipoglykane und Glykoproteine) (Stein et al., 1992). MMR
bestehen aus fünf Domänen. Eine lektinreiche Domäne, die aus 8-10 Kohlenhydrat-
bindenden Regionen besteht, ist für die Erkennung von Mannose und Fruktose
verantwortlich (Stahl et al., 1998; Napper et al., 2001). MHC Klasse II-Moleküle
werden zusammen mit dem MMR durch Stimulation des Makrophagen mit IL-4
heraufreguliert (Stein et al., 1992; Kodelja et al., 1997). Die Erhöhung der Expression
beider Rezeptoren führt zu einer Verbesserung der Antigenpräsentation. Weitere
Mediatoren und Induktoren von aaM sind in der Diskussion dargestellt (Tabelle 2).
Einleitung
18
Zur Identifizierung von aaM in vitro können monoklonale Antikörper, z.B. gegen
CD163 oder MMR eingesetzt werden. Es zeigte sich ein gehäuftes Vorkommen von
aaM in der Plazenta (Mues et al., 1989) und Lunge (Fireman et al., 1988), während der
Heilphase akuter Entzündungen, bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie
Psoriasis und rheumatischem Fieber, in Wundheilungsgewebe (Schebesch et al., 1997)
und in Fremdkörpergranulomen (Goerdt & Kodelja, 1994). Es wird angenommen, daß
aaM eine systemische Gegenregulation zu inflammatorischen Prozessen darstellt. So
scheint bei einer Sepsis die massive Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine
(IL-1 und TNF-α) durch Freisetzung von Glukokortikoiden, welche zu einer
alternativen Aktivierung von Makrophagen führt, unter Kontrolle gebracht zu werden
(Wilckens & de Rijk, 1997).
19
Material und Methodik
1. Reagenzien
Medien und Zusätze:
HEPES Sigma-Aldrich Company, Deisenhofen
RPMI 1640 Sigma
Ficoll-Hypaque ICN Biomedicals Inc. Ohio, USA
Percoll Pharmacia Biotech, Amsterdam,
Niederlande
Penicillin 100 IU/ml
und Streptomycin 100µg/ml GIBCO/BRL, Karlsruhe
Fetales Kälberserum Biochrom KG, Berlin
Plasmasteril Fresenius Kabi Deutschland GmbH
PBS Sigma
Humanes Serum AB-Serum, Universitätsklinikum Eppendorf,
Hamburg
Polymyxin Sigma
Stimulanzien:
Interleukin-4 Biomol, Hamburg,
Interleukin-10 R&D Systems, Wiesbaden
GM-CSF Borstel, Hamburg
LPS von E. coli Sigma
PGE2 Cayman, Ann Arbor, USA
Dexamethason und Ekdyson Sigma
Material und Methodik
20
Parasitenextrakte und -proteine:
Onchocerca volvulus-Extrakt (OvE) BNI, Hamburg
Onchocerca ochengi-Extrakt (OoE) BNI, Hamburg
Aspartylproteaseinhibitor (Ov33) Dr. R. Lucius, Humboldt Universität, Berlin
Onchocystatin (Ov17) Dr. R. Lucius
Ov17-Fragment (Ovv17) Dr. R. Lucius
O. volvulus-Extrakt von Patienten mit
Doxycyclinbehandlung vor Nodulektomie Drs. A. Hoerauf & D. W. Büttner, BNI
OvE-Lipid Dr. D. Steinhart, BNI
Wolbachienoberflächenproteine (WSP) Dr. C. Bandi, Istituto di Patologia
aus Dirofilaria immitis Generale Veterinaria, Mailand, Italien
Fragment V1 und V3 des Wolbachien- Dr. G. Tzertzinis, New England Bioleps,
oberflächenproteins aus Brugia malayi Beverly, USA
Monoklonale Antikörper:
Anti-CD163-Antikörper und RM 3/1 BMA Biomedicals AG, Augst, Schweiz
Anti-Makrophagen-Mannose-Rezeptor Becton Dickinson PharMingen, USA
Anti-Human-IL-10-Antikörper Becton Dickinson PharMingen,
Anti-CD14-Antikörper Cymbus Biotechnology, Hants, UK
Antikörper-Enzym-Konjungate:
Biotinylierter Ratten-Antikörper gegen humanes IL-10, konjungiert mit Avidin-
Meerrettichperoxidase (Becton Dickinson PharMingen)
Material und Methodik
21
Weitere Reagenzien:
Essigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland
Salzsäure Merck
Tween20 Sigma
Substrat für ELISA, Reagenz A und B Becton Dickinson PharMingen
0,1 M Carbonat, pH 9,5 Merck
Plastik- und Glaswaren:
Koagulationsröhrchen Monovette, Sarstedt, Nümbrecht, D
Serumröhrchen Monovette, Sarstedt
Heparinröhrchen Monovette, Sarstedt
Einwegpipetten Monovette, Sarstedt
FACS-Röhrchen Becton Dickinson, Mountain View, USA
Mikrotiterplatten Nunclon, Dänemark
96-Napf Polystyrol-Flachboden-
Mikrotiterplatte Maxi-Sorp, NUNC, Wiesbaden
Einwegpipetten Greiner Labortechnik, Frickenhausen
Kanülen Becton Dickinson, Dublin, Irland
Kryotube NUNC, Wiesbaden
Pipettenspitzen Sarstedt
Spritzen Sarstedt
Sterilfilter 0,2µm Schleicher & Schuell, Dassel
50ml, 14ml, 1ml Reagenzröhrchen Falcon, N.J., USA
Material und Methodik
22
Laborgeräte und Software:
Brutschrank Inkubator IG 150, Jouan
FACscan Flow Cytometer (Durchflußzytometer) Becton Dickson, Mountain View
CellQuest (V3.3) FACS-Software Becton Dickson
Glashomogenisator Ten Broek-Homogenisator
Mikroskop HBO 50 Zeiss
ph-Meter CG 840 Schott
Plattenphotometer Dynatech MR 5000, Denkendorf
Pipette Eppendorf, Hamburg
Schüttler MTS 2 Janke & Kunkel
StatView SAS Institute Inc.,
www.statview.com
Sterile Arbeitsbank NUNC, Wiesbaden
Zentrifugen Hettich, Rotanta/RP & Eppendorf
Material und Methodik
23
2. Gewinnung von Onchocerca-volvulus-Extrakt
2.1 Materialgewinnung
Die Onchozerkomata wurden in Benin in der Feldforschungsstation Covè des Bernhard-
Nocht-Instituts für Tropenmedizin operativ entfernt. Die Patienten wurden vor Nodul-
ektomie in ihrer Sprache über den Verbleib der Knoten informiert.
2.2 Nodulektomie und Isolierung von adulten Onchocerca volvulus
Onchozerkomata wurden chirurgisch entfernt und die Würmer durch Kollagenaselösung
nach der Methode von Schulz-Key et al. 1977 bei 35°C auf dem Schüttler zur
Verdauung der Bindegewebskapsel inkubiert. Je nach Knotendurchmesser wurde bei
<1,5 cm großen Knoten 0,5%-ige, bei Knoten mit einem Durchmesser von >1,5 cm
1%-ige Kollagenaselösung verwendet. Aus kleineren Knoten wurden Würmer nach
achtstündiger Inkubation, bei größeren erst nach 12-20 h vorsichtig durch Wegspülen
der Knotenreste unter dem Stereomikroskop isoliert.
Die Würmer wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und in Stickstoffcontainern direkt
nach Hamburg in das Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin transportiert.
2.3 Extraktherstellung
40 Weibchen wurden einzeln unter der Sterilbank jeweils vier Stunden in sterilem PBS
gewaschen, um die noch übriggebliebene Kollagenase zu entfernen. Nach dem
Waschen wurden die Weibchen auf ein steriles Filterpapier gelegt, um abtropfende PBS
zu minimieren. Danach wurden die Weibchen in einem mit Stickstoff gekühlten Mörser
unter wiederholter Zugabe von flüssigem Stickstoff zerrieben und anschließend als
Pulver in 2 ml PBS gelöst.
Material und Methodik
24
Nach 30 Minuten Kühlung und Überführung in ein gekühltes, 4,5 ml fassendes
Kryotube wurde das Tube 10-mal mit Ultraschall jeweils mit einer Minute Pause
behandelt. Die Suspension wurde 3-mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder
aufgetaut.
Schließlich wurde die Wurmsuspension für eine Stunde bei 4°C mit 100 000 x g in der
Ultrazentrifuge zentrifugiert und der Überstand entnommen, die Proteinkonzentration
nach Bradford bestimmt und der Extrakt bei einer Konzentration von 1 mg/ml bei minus
30°C in Portionen eingelagert. Der Extrakt wurde auf einer Blutagarplatte auf Sterilität
geprüft.
3. Gewinnung humaner mononukleärer Zellen
3.1 Probanden
Das Blut von gesunden Probanden zwischen 23 und 40 Jahren wurde zur Blutkultur
verwendet.
3.2 Blutabnahme
Dem Probanden wurden 30 bis 40 ml Blut in „Coagulation-9NC-Röhrchen“ sowie
10 ml Blut in Serumröhrchen abgenommen. Das nicht koagulierte Blut wurde unter der
Sterilbank in zwei 50 ml fassende Tubes unter sterilen Bedingungen überführt und
1:2 mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt.
3.3 Erythrozytensediment und Gewinnung mononukleärer Zellen
Das verdünnte Blut wurde unter der Sterilbank vorsichtig auf 15 ml einer 58%-igen
sterilen Percoll-Suspension in PBS geschichtet und in einer Zentrifuge (Rotanta/RP,
Material und Methodik
25
Hettich) bei 600 x g und bei 4°C für 20 bis 30 Minuten ohne Bremse auslaufend in drei
Phasen aufgetrennt. Die obere Phase enthält das Plasma, oberhalb der mittleren Phase
(Percoll) liegen die mononukleären Zellen. Diese wurden mittels einer Einwegpipette
aus Plastik in ein 50 ml fassendes Tube gegeben. Die untere Phase stellt die Fraktion
der Erythrozyten dar und konnte verworfen werden.
RPMI 1640 wurde unter sterilen Bedingungen mit Penicillin 100 IU/ml und
Streptomycin 100 µg/ml sowie 5%-igem autologen humanen Serum versehen. Das Tube
mit den vom Percollgradienten abpipettierten Zellen wurde mit diesem Kulturmedium
bei 400 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur in der Laborzentrifuge gewaschen,
das Sediment in ein 12 ml fassendes Tube unter der Sterilbank überführt und mit
Kulturmedium auf 10 ml aufgefüllt. Die Zellen wurden ein weiteres Mal bei 400 x g für
zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, das Sediment steril mit zwei Milliliter
Kulturmedium resuspendiert und auf Eis gelagert.
In den ersten Versuchen wurden die Zellen mit Hilfe eines Ficollgradienten aufgetrennt.
Unter diesen Bedingungen setzten die isolierten, unstimulierten Zellen verstärkt
Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1-RA) frei. Ficoll wurde auf Grund dessen
nicht weiter zum Auftrennen der Zellen verwendet.
Beim Ficollgradienten wurde das Blut 1:2 in zwei 50 ml fassenden Tubes unter der
Sterilbank mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt. Es wurden 15 ml Ficoll in ein
50 ml fassendes Tube gefüllt und das verdünnte Blut unter der Sterilbank vorsichtig auf
das Ficoll pipettiert. Der Gradient wurde bei 600 x g und 20°C für 20 bis 30 Minuten in
der Laborzentrifuge (Rotanda/RP, Hettich) ungebremst auslaufend zentrifugiert. Die
mononukleären Zellen oberhalb der Ficollphase wurden mit einer Einwegpipette unter
sterilen Bedingungen abgesaugt, mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt, bei 400 x g
für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und auf Eis gelagert. 20 µl der Zell-
suspension wurden mit 3%-iger Essigsäure in einer Neubauer-Zählkammer (Boxer)
gezählt.
Material und Methodik
26
4. Monozytenreinkultur
Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) wurden im Forschungszentrum Borstel (AG
Dr. M. Ernst) aus heparinisiertem Vollblut gesunder Blutspender mittels Ficoll
(1,077 g/ml, Pharmacia, Freiburg) und Dichtegradientenzentrifugation (465 x g,
45 Min., 22°C) isoliert (Grage-Griebenow et al., 1993). Die mononukleären Zellen
wurden über der Ficollphase abgenommen, in HBSS (Biochrom) (465 x g, 15 Min.,
4°C) gewaschen und ein zweites Mal in HBSS mit fetalen Kälberserum (FCS, 298 x g,
15 Min., 4°C) zentrifugiert, um die Zellfragmente von intakten Zellen zu trennen.
PBMC wurden in Monozyten und Lymphozyten unter Verwendung des LE-6B-
Elutriationssystems (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA) durch
Gegenstromzentrifugation getrennt. Maximal 2 Millionen Zellen/ml wurden in HBSS
mit 0,1% BSA verdünnt und in einer standardisierten Kammer bei initialer
Durchflußrate von 25 ml/Min., 1720 x g und 12°C zentrifugiert. Im Anschluß daran
wurde die Durchflußrate schrittweise gesenkt, um elutriierte Lymphozyten- und
Monozytenfraktionen zu erhalten.
Die isolierten Monozyten wurden innerhalb von drei Stunden kultiviert. Als
Kulturmedium wurde FCS oder humanes AB-Serum verwendet.
5. Zellkultur
Die Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte im Kulturmedium mit Antibiotika und 5%
FCS (reine Monozyten) oder mit autologem Serum (mononukleäre Zellen) kultiviert. Zu
den Zellen wurde GM-CSF in einer finalen Konzentration von 1000 U/ml (Van den
Heuvel et al., 1999) hinzugefügt. Pro Kavität wurden anfangs 0,6 Millionen
mononukleäre Zellen, später die gleiche Anzahl gereinigter Monozyten in 100 µl
verwandt.
Zu Optimierung der Kultivierungsbedingungen wurden Petrischalen mit hydrophober
Bodenfolie „PetriPerm“ (Vivascience, Göttingen) getestet (Buechler et al., 2000). Sie
ergaben in den Versuchen jedoch keine Verbesserung. Es wurden der jeweilige
Material und Methodik
27
Stimulus unter der Sterilbank und anschließend 0,6 Millionen Zellen pro Ansatz steril in
das Mikrotiterloch pipettiert. Diese Zellen wurden bei 37°C und einem Luftanteil im
Brutschrank von 5% Kohlendioxyd für einen Zeitraum von ein bis sechs Tagen
inkubiert (Van den Heuvel et al., 1999).
In den meisten Fällen wurden die Kulturen nach drei oder sechs Tagen beendet, die
Mikrotiterplatte mit den Zellen auf Eis gelagert und durch Zentrifugation bei 400 x g für
10 Minuten der Überstand von den zellulären Bestandteilen getrennt. Der Überstand
wurde bei minus 28°C eingefroren, um später für den ELISA zur Verfügung zu stehen.
Sofern die Zellen nicht anschließend im Durchflußzytometer zur Rezeptorbestimmung
verwendet wurden, erfolgte eine Fixierung mit 8% Paraformaldehyd.
Anfangs wurde mit mononuklearen Zellen gesunder Spender gearbeitet, mit denen
Testdurchläufe der verschiedenen Stimuli durchgeführt wurden. Im Anschluß an die
Testdurchläufe und bei Stimuli, wie z. B. Wolbachienproteine, wurden gereinigte
Monozyten aus dem Forschungszentrum Borstel verwendet.
6. Vollblutkultur
Zu 10 ml Heparinblut wurden 90 ml Iscove Medium mit 50 IU/ml Na-Heparin und
0,1% Humanserum unter der Sterilbank hinzugegeben. Anschließend wurden je 200 µl
in eine Mikrotiterplatte pipettiert und mit den jeweiligen Stimulanzien versehen. Die
Kultur wurde drei und sechs Tage im Brutschrank bei 37°C mit 5% Kohlendioxydanteil
der Luft und gesättigter Raumfeuchtigkeit inkubiert. Um grobe bakterielle Verunrei-
nigungen auszuschließen, wurde die Titerplatte mikroskopiert. Nach dem Zentrifugieren
der Zellen wurde der Überstand abgenommen und bei minus 28°C eingefroren. Die
Zellen wurden 15 Minuten im Dunkeln und bei 4°C mit 10 µl des Antikörpers inkubiert,
danach wurde 0,5 ml FACS Lyselösung (1:10) zugegeben, die Erythrozyten im Dunkeln
15 Minuten lysiert und anschließend im Durchflußzytometer gemessen.
Material und Methodik
28
7. Durchflußzytometrie
Das Durchflußzytometer mißt die Intensität der Fluoreszenz, die von einer Zelle mit
Fluorescein-markierten Antikörpern ausgeht. Die Intensität reflektiert die Expression
des getesteten Rezeptors.
Nach dem Waschen in PBS mit anschließendem Abzentrifugieren wurden die Zellen in
ein 5 ml fassendes Reagenzröhrchen überführt und mit dem jeweiligen Antikörper
inkubiert. Pro Ansatz wurden folgende mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und
R-Phycoerythrin (R-PE) markierte Antikörper (10 µl pro Ansatz) verwendet:
(1) FITC-markierte Antikörper gegen CD14 und CD163 sowie Kontroll-FITC-
Reagenz
(2) R-PE-markierte Antikörper gegen CD163, RM3/1 und Makrophagen-Mannose-
Rezeptor sowie Kontroll-PE-Reagenz.
Inkubiert wurde auf dem Schüttler über 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank. Die
ungebundenen Antikörper wurden danach ausgewaschen und der Überstand nach
Zentrifugieren (400 x g / 10 Minuten) verworfen. Das Pellet wurde aufgeschüttelt und
die Intensität der Fluoreszenz je Zelle mit dem Durchflußzytometer (FACS:
Fluorescence Activated Cell Sorter) gemessen. Die Zellen wurden zuvor auf eine
Konzentration von ca. 0,1 Millionen Zellen pro ml gebracht.
Bei der Messung im FACS werden die Zellen über ein Schlauchsystem durch einen
Meßkopf (Abb. 6) gedrückt, der eine enge Kapillare (zwischen 50 und 100 µm) besitzt.
Der laminare Flüssigkeitsstrom ermöglicht nur jeweils einer einzelnen Zelle die Passage
der Öffnung. Etwa in die Mitte dieses Flußkanals wird ein Laserstrahl fokussiert, der
auf die vorbeifließenden Zellen trifft. Er wird durch die Zellen kleinwinklig oder
großwinklig abgelenkt. Dabei werden durch den Laserstrahl Fluoreszenz- oder
Lumineszenzerscheinungen aktiviert.
Material und Methodik
29
Abbildung 6: Durchflußzytometer (FACS)
Material und Methodik
30
Verarbeitet werden die Ablenkungen des Laserstrahls durch einen nachgeschalteten
Digital-Analogwandler zusammen mit einem Computer, der mit der dafür notwendigen
Software (ZellQuest) ausgestattet ist. So können die Größe, das Volumen und die
Struktur der Zellen sowie Oberflächenbindungen wie Rezeptorbindungen mit
fluoreszierenden Antikörpern gemessen werden. Die Daten werden im Computer
aufgearbeitet und können auf dem Bildschirm in unterschiedlicher Darstellung,
beispielsweise als Histogramm oder als „Dot Blot“ dargestellt und gespeichert werden.
Hierbei wird der quantitative Anteil eines Parameters in Relation zur Stärke des Signals
dargestellt. Weiter können diese Histogramme untereinander zu sogenannten
Zytogrammen kombiniert werden, wobei die unterschiedlichsten Parameter miteinander
kombiniert werden können.
Durch das Ausblenden mittels „Gaten“, d.h. isoliertes Betrachten der Monozyten/
Makrophagen- und Granulozytenpopulation im Zytogramm wurden Zelltrümmer
weitgehend bei der Messung ausgegrenzt. Somit konnte die Rezeptorexpression auf
unzerstörten Zellen genauer ermittelt und Störeffekte beseitigt werden. Die Granularität
der Zellen wird durch den Sideward-Scatter und die Größe der Zellen mit dem Forward-
Scatter dargestellt, die in einem „Dot Blot“ zur Beurteilung der Zellen dienen. Das
Ergebnis wurde jeweils mit dem unstimulierten Wert, einer Positivkontrolle und einer
Negativkontrolle, betrachtet.
8. ELISA
Immunchemisch wurde IL-10 in Zellkulturüberständen mit Hilfe der semiquantitativen
ELISA-Technik („enzyme linked immunosorbent assay“, Abb. 7) nachgewiesen. Bei
diesem Verfahren wird in der Probe vorhandenes Interleukin durch spezifische
Antikörper („coating antibody“) an die Wand einer 96-Well-Flachboden-Mikrotiter-
platte gebunden (1). Über einen biotinylierten Ratten-Antikörper gegen andere Epitope
des humanen IL-10 wird die IL-10-Konzentration semiquantitativ durch die Absorption
im Plattenphotometer (Dynatech MR 5000, Denkendorf) gemessen. Der biotinylierte
Ratten-Antikörper wird mit Avidin-Meerrettichperoxidase kombiniert (2), um nach
Material und Methodik
31
Abbildung 7: ELISA-Technik („enzyme linked immunosorbent assay“)
Inkubation und Waschen das Substrat hinzuzugeben (3). Das Enzym des Konjungates
führt mit dem Substrat zu einer meßbaren Farbstoffreaktion (4).
Material und Methodik
32
Zur Konzentrationsbestimmung der Probe wurden IL-10-Eichkurven verwendet. Als
Positivkontrolle wurde eine Probe einer über drei Tage stimulierten Kultur mit 1 ng/ml
LPS verwendet. Es wurden 10 µl, 50 µl und 75 µl der Probe pro 100 µl Kavität
eingesetzt und Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Beschichtung der Mikrotiter-
platten erfolgte jeweils am Vortag des Testes. Der monoklonale Anti-Human-IL-10-
Antikörper der Ratte wurde in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 verdünnt. Je Kavität
wurden 100 µl in die Mikrotiterplatte pipettiert und über Nacht inkubiert. Nach
anschließendem dreimaligen Waschen mit PBS/Tween (0,05% Tween-20 in PBS)
wurden mit 200 µl 10% FCS in PBS pro Kavität freie Bindungsstellen geblockt und
über eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Proben- bzw. Antigenzugabe (1) erfolgt nach weiterem dreimaligen Waschen mit
200 µl PBS/Tween pro Kavität. Anschließend wurde die absteigende Verdünnungsreihe
des Standards pipettiert. Zwei Kavitäten dienten als Leerkontrolle für das Substrat. Von
den Proben wurden jeweils 50 µl und 10 µl verwendet. Die Proben inkubierten zwei
Stunden bei Raumtemperatur, bevor die Platte wieder mit 200 µl PBS/Tween pro
Kavität dreimal gewaschen wurde.
Als Konjugat wurden pro Kavität 100 µl Lösung verwendet. Das Konjugat setzt sich
zusammen aus biotinyliertem Ratten-Antikörper gegen humanes IL-10 gebunden an
Avidin-Meerrettichperoxidase als Enzym in 10% FCS in PBS im Verhältnis von 1:250.
Nach einer weiteren Stunde Inkubation wurde die Mikrotiterplatte siebenmal mit je
200 µl PBS/Tween gewaschen. Nach dem Waschen wurden pro Kavität 100 µl Substrat
eingesetzt. Die nach ca. 10 Minuten einsetzende Enzymreaktion, erkennbar an der
Blaufärbung, wurde mit je 50 µl 1M Salzsäure gestoppt. Es trat eine sichtbare
Farbreaktion von blau zu gelb ein. Innerhalb von 10 Minuten nach der Säurezugabe
wurde die Extinktion des Produkts bei 450 nm und der Referenzwellenlänge von
570 nm gemessen. Mit Hilfe der Referenzansätze von Interleukin-10 wurde aus den
Extinktionswerten die jeweilige Konzentration bestimmt. Je Probe und Konzentration
wurden Doppelbestimmungen durchgeführt, deren Mittelwert verwendet wurde.
Mittelwerte verschiedener Versuchsreihen mit gleichen Ansätzen wurden berechnet und
als Durchschnittswert angegeben.
Material und Methodik
33
9. Auswertung und kommerzielle Computersoftware
Die Mittelwerte der verschiedenen Versuchsreihen wurden tabellarisch nach
Kulturdauer und Zellart aufgelistet. Zur Auswertung und Berechnung der Daten wurde
das Programm STAT View (Abacus Concepts, USA) und als Werte die Mittelwerte des
jeweiligen Stimulus verwendet. Die Darstellung erfolgte über Box Plot mit
Standardabweichung sowie deskriptiver Statistik. Die Validität wurde mittels gepaarten
t-Tests überprüft. Ausgedruckte FACS-Histogramme die im FACS-Computer durch das
Programm CellQuest (USA) erstellt wurden, wurden wie Bilder mittels Scanner (Epson
Perfection 1260) als Dateien im Computer mit Photoshop 6.0 (USA) verarbeitet.
34
0
50
100
150
200
0 100 200 300 400
Dexamethason (ng/ml)
Rez
epto
rexp
ress
ion
(U)
Ergebnisse
1. Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 auf stimulierten Monozyten
1.1 Optimierung der Bedingungen der Expression von CD163 im
Durchflußzytometer
Eine Exposition von mononukleären Zellen mit Dexamethason führt zur signifikanten
Expression von CD163 auf der Zellmembran von Monozyten und diente in den
folgenden Versuchen als Positivkontrolle. Die optimale Dexamethasonkonzentration
wurde mit Hilfe von Verdünnungsreihen mit den Konzentrationen 10, 20, 40, 100, 200,
300 und 400 ng/ml ermittelt. Nach drei und sechs Tagen Kultur mit Dexamethason
wurde die Intensität der Rezeptorexpression auf Monozyten bestimmt (Van den Heuvel
et al., 1999). Die optimale Konzentration von Dexamethason liegt zwischen 40 und
200 ng/ml (Abb. 8; Van den Heuvel et al., 1999; Büchler et al., 2000). Für die
Konzentration 40 ng/ml war die Expression nach drei Tagen am stärksten (Abb. 9).
Abbildung 8: Dargestellt ist
die Dosiswirkungskurve der
Expression von CD163 nach
zwei Tagen Kultur von
mononukleären Zellen mit
dem Stimulus Dexametha-
son. Es wurde der Median
der CD163-Expression in
Abwesenheit von Dexa-
methason vom jeweiligen
Median nach Stimulation mit Dexamethason subtrahiert, so daß die induzierte
Expression abzüglich der konstitutiven Expression dargestellt wird.
Ergebnisse
35
Abbildung 9: Die Abbildungen präsentieren Boxplots mit Perzentilen (10, 25, 50, 75
und 90%) und Ausreißerwerten (o) der Medianwerte der FACS-Analyse der CD163-
Rezeptorexpression. Mononukleäre Zellkulturen wurden mit 40 ng/ml und 200 ng/ml
Dexamethason (Dex) über drei (linke Abbildung) und sechs Tage (rechte Abbildung)
stimuliert und im Vergleich zu unstimulierten Zellkulturen dargestellt. Links: t-Test: Dexamethason 40 P: 0,059; Dexamethason 200 P: 0,043; rechts: t-Test: Dexamethason 40
P: 0,232; Dexamethason 200 P: 0,025
In den Histogrammen der Abbildungen 10 und 11 sieht man eine Rechtsverlagerung des
Fluoreszenz-Peaks, d.h. die Zunahme der Fluoreszenz und somit der Rezeptorex-
pression nach Stimulation mit Dexamethason. Nach Stimulation mit 40 ng/ml und
200 ng/ml Dexamethason über drei Tage ist die Rezeptorexpression von CD163
annähernd gleich (Abb. 10).
Abbildung 10: Die mittels FACS bestimmte Rezeptorexpression von CD163 auf
Monozyten mononukleärer Zellkulturen nach drei Tagen Stimulation mit 40 ng/ml
Dexamethason (rote Fläche), 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) im Verhältnis zu
unstimulierten Zellen (schwarze Linie) ist in dieser Abbildung dargestellt. Versuchsnummern: Links 140400 404+405+403; Mitte 170400 504+505+503; rechts 140700
006+008+001
1
10
100
1000
0 40 200 Dexamethason (ng/ml)
Expression (U)
1
10
100
1000
0 40 200 Dexamethason (ng/ml)
Expression (U)
Ergebnisse
36
200 ng/ml Dexamethason über sechs Tage Kultur ergab die größte Rechtsverschiebung
der CD163-Expression auf Monozyten mononukleärer Zellkulturen (Abb. 11).
Abbildung 11: Die CD163-Expression von gereinigten Monozyten nach sechs Tagen
Stimulation mit 40 ng/ml (rote Fläche) und 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) sind
hier dargestellt. Das rechte Histogramm zeigt die Expression nach Stimulation mit
10 ng/ml LPS (rote Fläche) und 5 ng/ml IL-4 (grüne Linie) im Vergleich zu
unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: links 170400 204+205+203; Mitte
270400 106+107+103; rechts 190201 014+013+008
Dexamethason 200 ng/ml mit zusätzlich 5 ng/ml IL-10 oder IL-4 bzw. 5 ng/ml IL-4
zusammen mit IL-10 wurden in den Versuchen ebenso wie 5 ng/ml IL-4 (Abb. 11
rechts) getestet. Die mit den genannten Stimulanzien kultivierten Monozyten
exprimierten deutlich mehr CD163, als unstimuliert kultivierte Monozyten. Des
weiteren wurden 400 ng/ml Cortison mit 2,5 pg/ml IL-4 als Positivkontrolle erfolgreich
verwendet. Cortison mit IL-4 hatte jedoch keinen so starken Effekt auf die Rezeptor-
expression wie Dexamethason 40 oder 200 ng/ml (Abb. 12). Dexamethason ergab in
den Konzentrationen 40-200 ng/ml die besten Ergebnisse (Abb. 9) und wurde in diesen
Konzentrationen als Positivkontrolle verwendet.
Abbildung 12: Gereinigte
Monozyten wurden über
drei (linkes Histogramm)
bzw. sechs Tage (rechtes
Histogramm) mit 10 ng/ml
Lipopolysaccharid (LPS,
rote Fläche) oder 400 ng/ml Cortison mit 2,5 pg/ml IL-4 (grüne Linie) stimuliert und im
Vergleich mit unstimulierten Zellen (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: links 230201 008+007+001; rechts 190201 014+013+008
Ergebnisse
37
1.2 Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 nach Stimulation mit
Lipopolysaccharid
Als Negativkontrolle wurde Lipopolysaccharid (LPS) in der Konzentration 1 und
10 ng/ml verwendet (Djemadji Ondjiel et al., 1996; Van den Heuvel, 1999; Büchler et
al., 2000). Lipopolysaccharid ergab in der Konzentration von 1 ng/ml nach drei Tagen
eine leichte und nach sechs Tagen keine signifikante CD163-Rezeptorexpressions-
erhöhung mehr (Abb. 13 und 14).
Abbildung 13: Dargestellt sind die Boxplots der CD163-Expression auf Monozyten der
mononukleären Zellfraktion nach dreitägiger (linke Abbildung) und sechstägiger
Stimulation (rechte Abbildung) mit LPS 1 ng/ml (LPS), Dexamethason 200 ng/ml
(Dex) und ohne Stimulus (Leerwert). Rechts: t-Test: LPS P: 0,875; Dex P: 0,043; links: t-Test: LPS P: 0,319; Dex P: 0,025
1
10
100
1000
Leerwert LPS Dex
Expression (U)
1
10
100
1000
Leerwert LPS Dex
Expression (U)
Ergebnisse
38
Abbildung 14: Keine erhöhte CD163-Expression auf Monozyten der mononukleäre
Zellfraktion zeigte sich nach dreitägiger (obere drei Histogramme) bzw. sechstägiger
(untere drei Histogramme) Stimulation mit 1 ng/ml LPS (rote Fläche) im Vergleich zu
unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 070400 213+203; oben Mitte 170400 511+503; oben rechts 140400
111+103; unten links 160300 062+058; unten Mitte 170400 211+203; unten rechts 050500 111+103
1.3 CD163-Expression nach Stimulation mit dem Steroid Ecdyson
Neben Dexamethason wurde geprüft, ob das Steroid Ecdyson zu einer vermehrten
CD163-Expression führt. Verwendet wurden die Konzentrationen 20 bis 400 ng/ml in
bis zu sieben Tage dauernden Kulturen. Nach Stimulation ergab sich jedoch nur eine
geringe CD163-Rezeptorexpressionserhöhung auf Monozyten der mononukleären
Zellfraktion. Die Stimulation mit 40 ng/ml bzw. 200 ng/ml Ecdyson in sechstägiger
Kultur zeigte im Durchschnitt die höchste Expression des CD163-Rezeptors auf den
Monozyten der mononukleären Zellkulturen (Abb. 15).
Ergebnisse
39
Abbildung 15: Medianwerte und Boxplots nach dreitägiger (links) und sechstägiger
Kultur (rechts) mononukleärer Zellen stimuliert mit Ecdyson (Ecd) Links: t-Test: Ecd 20 P: 0,719; Ecd 40 P: 0,338; Ecd 200 P: 0,374; rechts: t-Test: Ecd 20 P: 0,759;
Ecd 40 P: 0,285; Ecd 200 P: 0,206
Die Histogramme zeigen nach sechs Tagen Stimulation mit 200 ng/ml Ecdyson in
Einzelfällen eine geringfügige Expressionszunahme für CD163 auf Monozyten der
mononukleären Zellfraktion. Nach dreitägiger Kultur war keine signifikante Zunahme
erkennbar (Abb. 16). Dexamethason, das ein potenteres Glukokortikoid als Ecdyson ist,
ergab nach Stimulation mononukleärer Zellen eine erhöhte Expression des Rezeptors
CD163 auf Monozyten. Aufgrund der geringfügigen Erhöhung der CD163-Expression
(Abb. 16) nach drei und sechs Tagen Stimulation mononukleärer Zellen mit
verschiedenen Ecdysonkonzentrationen wurde Ecdyson nicht bei Versuchen mit
gereinigten Monozyten verwendet.
1
10
100
Expression (U)
Leer 20 40 200Ecdyson (ng/ml)
1
10
100
1000
0 20 40 200 Ecdyson (ng/ml)
Expression (U)
Ergebnisse
40
Abbildung 16: CD163-Rezeptorexpression auf Monozyten der mononukleären
Zellfraktion nach dreitägiger Stimulation (obere drei Histogramme) mit 200 ng/ml
Ecdyson (rote Fläche) im Vergleich zu 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) und
unstimulierten Zellen (schwarze Linie)
Versuchsnummern: oben links 140400 109+105+103; oben Mitte 140400 409+405+403; oben rechts
240400 305+307+303; unten links 160300 035+027+025; unten Mitte 170400 209+205+203; unten
rechts 270400 105+107+103
1.4 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt
Onchocerca-volvulus-Extrakt stimulierte dosisabhängig die Expression von CD163 auf
Monozyten. Sie war am deutlichsten ausgeprägt bei den Konzentrationen 20 bis
50 µg/ml. Nach einer Kultivierungsdauer von drei und sechs Tagen ergab sich eine
erhöhte Expression des Rezeptors CD163 auf Monozyten der mononukleären
Zellfraktion sowie auf gereinigten Monozyten, die deutlich über dem Kontrollwert,
jedoch unter der Positivkontrolle (Dexamethason 40 ng/ml) lag (Abb. 17). Der
Mittelwert der Rezeptorexpression von CD163 auf Monozyten der mononukleären
Zellfraktion nach drei und sechs Tagen Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-volvulus-
Extrakt war rund viermal höher als der Mittelwert der Leerwerte (Abb. 17). Ebenso
Ergebnisse
41
1
10
100
1000
Leerwert OvE Dex
Expression (U)
1
10
100
1000
Leerwert OvE Dex
Expression (U)
1
10
100
Leerwert OvE
Expression (U)
zeigte sich nach Stimulation von reinen Monozyten mit 20-30 µg/ml Onchocerca-
volvulus-Extrakt über drei Tage eine statistisch signifikante Erhöhung der CD163-
Expression um das Vierfache des Leerwertes, wobei sich nach sechstägiger Kultur nur
das Dreifache des Leerwertes darstellte (Abb. 17).
Abbildung 17: CD163-Expression auf Monozyten der mononukleären Zellfraktion
(obere Abbildung) nach Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE)
und auf gereinigter Monozyten nach Stimulation mit 20-30 µg/ml OvE (untere
Abbildung) über drei Tage (links) bzw. sechs Tage (rechts) im Vergleich zu
Medianwerten unstimulierter (Leerwert) und Medianwerten mit Dexamethason
40 ng/ml (Dex) stimulierter Zellen
Oben links: t-Test: OvE P: 0,569; Dex P: 0,087; oben rechts: t-Test: OvE P: 0,369; Dex P: 0,544; unten
links: t-Test: OvE P: 0,059; unten rechts: t-Test: OvE P: 0,193
1
10
100
Leerwert OvE
Expression (U)
Ergebnisse
42
In den Histogrammen erkennt man eine Rechtsverschiebung der Fluoreszenz, d. h. eine
Zunahme der Expression des CD163-Rezeptors auf den kultivierten Monozyten. Sie
war nach sechstägiger Kultur stärker ausgeprägt als nach drei Tagen Kultur (Abb. 18).
Des Weiteren kann man häufig eine Zweigipfligkeit nach Stimulation von Monozyten
mit OvE erkennen, die auf zwei Monozytenpopulationen, eine mit hoher und eine mit
geringer CD163-Expression hindeutet.
Abbildung 18: Die Histogramme zeigen die monozytäre CD163-Rezeptorexpression
jeweils dreier Versuche nach dreitägiger (obere Histogramme) bzw. sechstägiger
Stimulation (untere Histogramme) von reinen Monozytenkulturen mit 30 µg/ml (links
und Mitte, rote Fläche) und 20 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (rechts, rote Fläche)
im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 230201 004+001; oben Mitte 081200 002+001; oben rechts 240800
031+029; unten links 050301 013+009; unten Mitte 260201 006+001; unten rechts 111200 002+001
In der Zellverteilung reiner Monozyten verlagert sich nach Stimulation mit Onchocerca-
volvulus-Extrakt im Verlauf von sechs Tagen die Hauptzellpopulation in einen Bereich
höherer Granularität. Es fällt auf, daß sich nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-
Extrakt eine CD163-exprimierende Population abgespalten hat (Abb. 19 und 20), die im
Vergleich zu den anderen zwei Populationen eine größere Granularität (FSC-H)
aufweist.
Ergebnisse
43
Abbildung 19: Die drei Bilder
links zeigen jeweils die Zell-
verteilung von unstimulierten
Monozyten. Auf der rechten
Seite ist die Verteilung der
Zellen nach Stimulation mit OvE
(oben und Mitte 30 µg/ml, unten
100 µg/ml) nach dreitägiger
Kultur dargestellt.
FSC-H: Zellgröße; SSC-H:
Zellgranularität
Abbildung 20: Gereinigte
Monozyten wurden mit Oncho-
cerca-volvulus-Extrakt (jeweils
rechtes Bild) über sechstägig
kultiviert, wobei das jeweilig
linke Histogramm unstimuliert
kultivierte Zellen repräsentiert.
FSC-H: Zellgröße; SSC-H:
Zellgranularität
Ergebnisse
44
1.4.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von
Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren
Für gereinigte Monozyten, die mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von Doxycyclin
behandelten Patienten über drei und sechs Tage stimuliert worden waren, ergab sich
keine vermehrte Expression des CD163-Rezeptors auf Monozyten (Abb. 21).
Abbildung 21: Abgebildet sind die Medianwerte der CD163-Rezeptorexpression nach
Stimulation von gereinigten Monozyten über drei Tage mit 20-30 µg/ml Extrakt aus
Würmern unbehandelter Patienten mit Onchozerkose (OvE) und Extrakt von mit
Doxycyclin behandelten Patienten (OvE/D) im Vergleich zu unstimulierten Zellen
(Leerwert)
Links: t-Test: OvE P: 0,059; OvE/D P: 0,357; rechts: t-Test: OvE P: 0,193; OvE/D P: 0,109
Die unterschiedliche Expression des CD163-Rezeptors nach Stimulation mit
Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE) und Extrakt von Patienten, die mit Doxycyclin
behandelt wurden (OvE/D), wird in den Histogrammen der Abbildung 22 verdeutlicht.
Es zeigt sich keine deutliche Rechtsverschiebung des Fluoreszenzmaximums und somit
keine Erhöhung der Expression von CD163 auf Monozyten nach Stimulation mit
OvE/D, während sie nach Stimulation mit OvE vorhanden ist.
1
10
100
Leerwert OvE OvE/D
Expression (U)
1
10
100
Leerwert OvE OvE/D
Expression (U)
Ergebnisse
45
Abbildung 22: Gereinigte Monozyten wurden über drei Tage mit Onchocerca-
volvulus-Extrakt von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt wurden (OvE/D, rote
Fläche) bzw. mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von unbehandelten Patienten (OvE,
grüne Linie) in einer Konzentration von 30 µg/ml (oben links und unten Mitte),
20 µg/ml (oben Mitte und unten rechts) bzw. 50 µg/ml (oben rechts) stimuliert und mit
den unstimulierten Zellen (schwarze Linie) verglichen. Versuchsnummern: oben links 081200 003+002+001; oben Mitte 240800 034+031+029; oben rechts
240800 033+030+029; unten links 111200 003+002+001; unten Mitte 260201 005+006+001; unten
rechts 120301 015+014+010
1.5 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt
Nach Stimulation mit Extrakt aus O. ochengi (OoE) zeigte sich eine geringe Expression
von CD163 auf den stimulierten Monozyten. Die CD163-Rezeptorexpression war nach
drei Tagen Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt ca. Zweieinhalbmahl höher als
die unstimulierter Monozyten. Nach sechs Tagen hatten die Expression von CD163
wieder abgenommen und belief sich auf das Zweifache des Leerwertes (Abb. 23, 24 und
25).
Ergebnisse
46
Abbildung 23: Dargestellt sind die Medianwerte der CD163-Expression von
gereinigten Monozyten nach drei Tagen (linke Abbildung) und sechs Tagen Kultur
(rechte Abbildung) mit 30-50 µg/ml (linke Abbildung) bzw. 30 µg/ml (rechte
Abbildung) OoE im Vergleich zu unstimulierten Kulturen (Leerwert). Links: t-Test: OoE P: 0,083; rechts: t-Test: OoE P: 0,280
Abbildung 24: Expression von CD163 auf gereinigten Monozyten, die über drei (obere
Histogramme) und sechs Tage (untere Histogramme) mit 30 µg/ml (rechtes oberes
Histogramm mit 50 µg/ml) mit OoE stimuliert worden waren (rote Fläche). Die
Expression von CD163 auf unstimulierten Zellen, ebenfalls über sechs Tage kultiviert,
ist durch die schwarze Linie dargestellt. Versuchsnummern: oben links 240800 037+029; oben rechts 230201 006+001; unten links 260201
007+001; unten Mitte 190201 012+008; unten rechts 050301 014+009
1
10
100
Leerwert OoE
Expression (U)
1
10
100
Leerwert OoE
Expression (U)
Ergebnisse
47
Abbildung 25: Die linke Abbildung zeigt die Expression von CD163 auf Monozyten
der mononukleären Zellfraktion nach sechstägiger Stimulation mit 50 µg/ml OoE, die
rechte Abbildung, die gereinigte Monozyten mit 30-50 µl/ml OoE. Die Medianwerte
werden mit denen unstimulierter Zellen (Leerwert) und denen der Positivkontrolle
Dexamethason 40 ng/ml (Dex), verglichen. Links: t-Test: OoE P: 0,369; Dex P: 0,544; rechts: t-Test: OoE P: 0,095
Monozyten mononukleärer Zellfraktionen zeigten gegenüber dem Leerwert nach drei
und sechs Tagen Kulturdauer keine signifikante Erhöhung der Rezeptorexpression von
CD163 nach Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-ochengi-Extrakt (Abb. 26).
Abbildung 26: Es wurden mononukleäre Zellen über drei Tage (oben) bzw. sechs Tage
(unten) mit OoE (oben links 10 µg/ml; unten links 20 µg/ml; oben rechts, unten Mitte
und unten rechts 50 µg/ml, rote Fläche) und 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie)
stimuliert und im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: oben links 140400 414+405+403; oben rechts 140400 415+405+403; unten links
040900 004+001; unten Mitte 210200 004+002; unten rechts 210200 008+006
1
10
100
Leerwert OoE Dex
Expression (U)
1
10
100
Leerwert OoE
Expression (U)
Ergebnisse
48
1.6 CD163-Expression nach Stimulation mit den Onchocerca-volvulus-Antigenen
Ov17, Ovv17 und Ov33
Die als Stimuli eingesetzten Onchocerca-volvulus-Antigene Onchocystatin bzw.
Onchocystatinfragment (Ov17 bzw. Ovv17) und Asparaginproteaseinhibitor (Ov33)
ergaben keine signifikante Erhöhung der Expression von CD163 auf gereinigten
Monozyten nach zwei, drei und sechs Tagen Stimulation (Abb. 27) in den
Konzentrationen 5, 50, 100, 150 und 200 nM pro Kulturansatz. Aufgrund dessen
wurden diese Onchocerca-volvulus-Antigene aus den Versuchen herausgenommen.
Abbildung 27: Dargestellt ist die CD163-Expression nach drei Tagen Kultur von
gereinigten Monozyten mit Ov17 (oben) bzw. Ovv17 (Mitte) und Ov33 (unten, rote
Fläche) zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Als Stimuli wurden jeweils 5 nM
(linkes Histogramm) und 150 nM (rechtes Histogramm) der Antigene verwendet. Versuchsnummern: oben links 161299 069+067; oben rechts 161299 068+067; Mitte links 161299
074+067; Mitte rechts 161299 075+067; unten links 161299 071+067; unten rechts 161299 072+067
Ergebnisse
49
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25
WSP (µg/ml)
Expr
essi
on (U
)
1.7 CD163-Expression nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein des
Parasiten Dirofilaria immitis
Die CD163-Rezeptorexpression wurde auch auf mit Oberflächenprotein von
Wolbachien (WSP) stimulierten Monozyten untersucht. Wolbachien sind in Symbiose
mit der Filarie O. volvulus lebende Endobakterien. WSP von Dirofilaria immitis zeigt
eine mit Onchocerca identische Gensequenz (Bazzocchi et al., 2000). Gereinigte
Monozyten wurden mit WSP in den Konzentrationen 3, 10, 20 µg/ml über drei Tage
stimuliert. Bei der Konzentration 10 µg/ml ergab sich nach drei Tagen die höchste
CD163-Expression (Abb. 28). Nach sechs Tagen Stimulation mit einer Konzentration
von 20-25 µg/ml WSP waren die Mediane der CD163-Rezeptorexpression bedeutend
höher, bei der Konzentration von 10 µg/ml WSP nur leicht höher als die des Leerwertes
(Abb. 29).
Abbildung 28: Dosiswirkungs-
kurve von WSP. Es wurden
Monozyten über drei Tage mit
3, 10 und 20 µg/ml WSP
stimuliert und anschließend die
Rezeptorexpression von CD163
bestimmt.
Abbildung 29: In dieser Abbildung
sind die Medianwerte der CD163-
Expression von Monozyten nach
sechs Tage Kultur mit WSP in den
Konzentrationen von 10 µg/ml und
20-25 µg/ml und von unstimulierten
Zellen dargestellt. t-Test: WSP 10 P: 0,39; WSP 20-25 P: 0,194
Nach Stimulation mit 10 µg/ml WSP über sechs Tage zeigt sich eine
Rechtsverschiebung der Fluoreszenz und somit eine vermehrte Expression des CD163-
1
10
100
0
10
20-25 WSP (µg/ml)
Expression (U)
Ergebnisse
50
Rezeptorens auf Monozyten (Abb. 30). Eine zweigipflige Expression deutet auf das
Vorliegen zweier Monozytenpopulationen hin, wie sie auch nach Stimulation mit OvE
auftreten. Eine dieser Populationen zeigt eine hohe CD163-Expression.
Abbildung 30: Abgebildet sind die Ergebnisse von drei Versuchen mit reinen
Monozyten, die über sechs Tage mit WSP (rote Fläche) in einer Konzentration von
10 µg/ml stimuliert wurden. Zum Vergleich sind unstimulierte Zellen eingesetzt
(schwarze Linie). Versuchsnummern: links 260201 003+001; Mitte 190201 010+008; rechts 120301
015+014+010
1.7.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Fragmenten des Wolbachien-
proteins des Parasiten Brugia malayi
Die Fragmente V1 und V3 des Wolbachienoberflächenproteins von Brugia malayi (Bm
V1 und Bm V3) ergaben nach Stimulation von mononukleären Zellen sowie gereinigten
Monozyten in der Konzentration 4, 5, 20 und 50 µg/ml über drei und sechs Tage Kultur
(Abb. 31) keine vermehrte Expression des Scavenger-
Rezeptors CD163 auf Monozyten. Der Versuch wurde
deshalb nicht weiter verfolgt.
Abbildung 31: Gereinigte Monozyten wurden über
sechs Tage mit Bm V1 (oberes Histogramm) und
Bm V3 (unteres Histogramm) in einer Konzentration
von 50 µg/ml (rote Fläche) stimuliert. Die CD163-
Rezeptorexpression unstimulierter Zellen ist zum Ver-
gleich (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: oben 11120 005+001; unten 11120 006+001
Ergebnisse
51
2. Interleukin-10-Freisetzung stimulierter Monozyten
2.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt
Mononukleäre Zellen wurden
über fünf Tage mit Onchocerca-
volvulus-Extrakt (OvE) stimu-
liert. Nach einem bzw. drei Tagen
war die Konzentration des
Interleukins im Überstand am
stärksten ausgebildet. Im Verlauf
nahm die Konzentration von
IL-10 im Überstand wieder ab
(Abb. 32). Monozyten der mono-
nukleären Zellfraktion sowie
gereinigte Monozyten bilden nach Stimulation mit OvE vermehrt IL-10. Nach einem
Tag Stimulation von gereinigten Monozyten gesunder Spender ist die Expression am
höchsten und lag im Mittel bei 450 pg/ml. Die Konzentration von IL-10 im
Kulturüberstand von gereinigten Monozyten, die mit OvE stimuliert wurden, lag unter
dem Mittelwert der IL-10-Konzentration nach Stimulation mit 10 ng/ml
Lipopolysaccharid (Abb. 33).
Abbildung 33: Es wurden die IL-10-
Konzentrationen im Kulturüberstand
von über einen Tag mit 20-30 µg/ml
Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE)
bzw. 10 ng/ml Lipopolysaccharid
(LPS) stimulierten Monozyten ge-
messen. t-Test: LPS P: 0,008; OvE P: 0,103
0,1
1
10
100
1000
10000
Leerwert LPS OvE
IL-10 (pg/ml)
4h 1d 3d 5d 0
100
200
300
400
500
IL-10 (pg/ml)
OvE
Std./Tage
Abbildung 32: IL-10-Produktion
von Monozyten nach Stimulation
mit 20 µg/ml OvE
Ergebnisse
52
Die mittlere Konzentration von IL-10 nahm nach drei bzw. sechs Tagen Kultur reiner
Monozyten ab (Abb. 34).
Abbildung 34: Dargestellt ist die IL-10-Expression von Monozyten, die über drei
(linke Abbildung) und sechs Tage (rechte Abbildung) mit 20-30 µg/ml Onchocerca-
volvulus-Extrakt (OvE) bzw. 10 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden, im
Verhältnis zur Expression unstimulierter Zellen (Leerwert). Links: t-Test: OvE P: 0,059; LPS P: 0,405; rechts: t-Test: OvE P: 0,120; LPS P: 0,047
2.1.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von
Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren
Monozyten wurden mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von unbehandelten Patienten
(OvE) sowie von Patienten, die vor der Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt
worden waren (OvE/D), stimuliert. Der Mittelwert der IL-10-Konzentration im
Überstand war nach Stimulation mit OvE über einen Tag um etwa 900 pg/ml höher als
bei Verwendung von OvE/D. Eindrucksvolle Ergebnisse ergaben Kulturen von
gereinigte Monozyten, die über einen Tag kultiviert wurden (Abb. 35). Der Mittelwert
der IL-10-Konzentration im Überstand nach Stimulation der Monozyten mit OvE/D lag
nach einem und drei Tagen Kultur unter der IL-10-Konzentration nach Stimulation mit
OvE (Abb. 35).
0,1
1
10
100
1000
Leerwert OvE LPS
IL-10 (pg/ml)
1
10
100
1000
Leerwert OvE LPS
IL-10 (pg/ml)
Ergebnisse
53
Abbildung 35: Gereinigte Monozyten wurden mit jeweils 20-30 µg/ml OvE und mit
OvE/D über einen (linke Abbildung) bzw. drei Tage (rechte Abbildung) kultiviert und
zum Vergleich mit unstimulierten Zellen (Leerwert, LW) dargestellt. Links: t-Test: LW-OvE P: 0,103; LW-OvE/D P: 0,244; OvE-OvE/D P: 0,114; rechts: t-Test: OvE
P: 0,176; OvE/D P: 0,384
Mononukleäre Zellen zeigen nach drei Tagen Stimulation mit OvE eine höhere IL-10-
Konzentration im Überstand als nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von
Patienten, die vor Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren (Abb. 36).
Abbildung 36: Dargestellt
sind die IL-10-Konzentratio-
nen der Überstände mono-
nukleärer Zellen nach drei-
tägiger Stimulation mit
20 µg/ml OvE bzw. OvE/D. t-Test: OvE P: 0,234; OvE/D
P: 0,368
0,1
1
10
100
1000
Leerwert OvE OvE/D
IL-10 (pg/ml)
0,01
0,1
1
10
100
1000
Leerwert OvE OvE/D
IL-10 (pg/ml)
0,1
1
10
100
1000
Leerwert OvE OvE/D
IL-10 (pg/ml)
Ergebnisse
54
2.2 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt
Die Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt (OoE) führte zu stark erhöhten IL-10-
Konzentrationen im Überstand gereinigter Monozyten nach einem Tag Kultur. Der
Mittelwert lag bei 392 pg/ml (Abb. 37). Analoge Konzentrationen wurden nach drei
Tagen Kultur gemessen. Die IL-10-Konzentrationen im Überstand stimulierter Mono-
zyten lag nach sechs Tagen niedriger als nach ein bis drei Tagen Kultur (Abb. 37).
Abbildung 37: IL-10-Konzentrationen der Überstände von Monozyten nach einem Tag
(linke Abbildung) und sechs Tagen Kultur (rechte Abbildung), stimuliert mit
20-30 µg/ml OoE, 10 ng/ml LPS bzw. unstimuliert (Leerwert). Links: t-Test: OoE P: 0,011; LPS P: 0,008; rechts: t-Test: OoE P: 0,024; LPS P: 0,047
Mononukleäre Zellen gesunder Spender zeigten nach einem Tag Kultur mit OvE bzw.
LPS, im Vergleich zu unstimulierten Zellen, ebenfalls einen erhöhten IL-10-Spiegel.
Die Mediane der IL-10-Konzentrationen mit 10 ng/ml LPS stimulierter mononukleärer
Zellen lag höher als nach Stimulation mit OoE (Abb. 38), anders als bei reinen
Monozyten, die gleich hohe Medianwerte für beide Stimuli zeigten (vgl. Abb. 37).
Abbildung 38: IL-10-Konzentrationen
mononukleärer Zellen nach eintägiger
Stimulation mit 20-30 µg/ml OoE bzw.
10 ng/ml LPS. t-Test: OoE P: 0,189; LPS P: 0,023
0,1
1
10
100
1000
10000
Leerwert OoE
IL-10 (pg/ml)
LPS
1
10
100
1000
10000
Leerwert OoE LPS
IL-10 (pg/ml)
1
10
100
1000
Leerwert OoE LPS
IL-10 (pg/ml)
Ergebnisse
55
2.3 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein des
Parasiten Dirofilaria immitis
Wolbachienoberflächenprotein (WSP) stimuliert dosisabhängig nach einem Tag Kultur
die IL-10-Expression in Monozyten (Abb. 39). Nach sechs Tagen Kultur nahm die
IL-10-Konzentration im Überstand der Monozyten bei Stimulation mit 20 µg/ml WSP
auf etwa 300 pg/ml zu (Abb. 39).
Abbildung 39: Darstellung der IL-10-Konzentrationen im Zellüberstand. Gereinigte
Monozyten wurden mit 3, 10 und 20-25 µg/ml WSP (linke Abbildung) bzw. 20 µg/ml
WSP (rechte Abbildung) und ohne Stimulus (Leerwert) über einen Tag kultiviert. Links: t-Test: WSP 3 P: 0,237; WSP 10 P: 0,065; WSP 20-25 P: 0,360; rechts: t-Test: WSP P:0,273
3. Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf Monozyten
3.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation mit
Onchocerca-volvulus-Extrakt
Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) gehört wie der CD163-Rezeptor zu den
Markern von alternativ aktivierten Makrophagen (Stein et al., 1992; Kodelja et al.,
1997). Die Stimulation von Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt über drei
Tage führte zu einer nachweisbaren Expression von MMR. Die Expression des MMR
auf den Zellen war am dritten Tag stärker ausgeprägt als nach sechstägiger Kultur
(Abb. 40). Die erhöhte Expression zeigt sich im Histogramm (Abb. 41) als Rechts-
1
10
100
1000
10000
Leerwert WSP
IL-10 (pg/ml)
0.1
1
10
100
1000
0 3 10
20-25 WSP (ng/ml)
IL-10 (pg/ml)
Ergebnisse
56
verschiebung entsprechend einer Zunahme der Fluoreszenz und damit der
Rezeptorexpression auf Monozyten.
Abbildung 40: Dargestellt sind Medianwerte der MMR-Expression auf Monozyten,
über drei (linke Abbildung) bzw. sechs Tage (rechte Abbildung) stimuliert mit
30 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE) bzw. 10 ng/ml LPS (LPS) oder ohne
Stimulus (Leerwert). Links: t-Test: OvE P: 0,165; LPS P: 0,136; rechts: t-Test: OvE P: 0,221
Abbildung 41: Abgebildet ist die MMR-Expression auf Monozyten, die über drei
(oben) bzw. sechs Tage (unten) mit 30 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (rote
Fläche) stimuliert worden waren. Die schwarze Linie gibt das Expressionsverhalten
unstimulierter Zellen wieder. Versuchsnummern: oben links 230201 012+009; oben rechts 081200 010+009; unten links 111200
010+009; unten Mitte 260201 015+010; unten rechts 170701 018+017
1
10
100
Leerwert OvE LPS
Expression (U)
1
10
100
Leerwert OvE
Expression (U)
Ergebnisse
57
3.1.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation von
gereinigten Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von mit
Doxycyclin behandelten Patienten
Bei den Versuchen mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von Patienten, die vor
Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren (OvE/D), konnte keine
Expressionserhöhung des MMR auf Monozyten nachgewiesen werden (Abb. 42). Nach
Stimulation von Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt unbehandelter Patienten
(OvE) war die Differenz der Expression des MMR nach drei Tagen deutlich größer als
nach sechs Tagen Kultur (Abb. 40).
Abbildung 42: Die Abbildung zeigt die Medianwerte der Expression für den
Makrophagen-Mannose-Rezeptor auf drei (linke Abbildung) bzw. sechs Tage (rechte
Abbildung) mit 30 µg/ml OvE/D stimulierten reinen Monozyten im Vergleich zu OvE
und zu unstimulierten Zellen (Leerwert). Aufgrund der Begrenztheit des Materials
konnten nur drei Bestimmungen durchgeführt werden. Links: t-Test: OvE P: 0,240; OvEoB P: 0,204; rechts: t-Test: OvE P: 0,221; OvE/D P: 0,416
1
10
100
Leerwert OvE OvE/D1
10
100
Leerwert OvE OvE/D
Expression (U)Expression (U)
Ergebnisse
58
Die folgenden Histogramme zeigen die Fluoreszenzwerte kultivierter Monozyten, die
mit OvE über drei, sechs und sieben Tage stimuliert wurden (Abb. 43 und 44). Mit
OvE/D stimulierte und unstimulierte Monozyten zeigten eine äquivalente MMR-
Expression. Auch nach sieben Tagen Stimulation mit OvE/D von gereinigten
Monozyten zeigt sich keine erhöhte MMR-Expression (Abb. 44).
Abbildung 43: Dargestellt ist die MMR-Expression nach drei (obere Histogramme)
und sechs Tagen Stimulation (untere Histogramme) von gereinigten Monozyten mit
30 µg/ml OvE/D (rote Fläche) bzw. Onchocerca-volvulus-Extrakt unbehandelter
Patienten (grüne Linie) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 081200 011+010+009; oben rechts 230201 013+012+009; unten links
111200 011+010+009; unten rechts 260201 014+015+010
Abbildung 44: Dargestellt ist die MMR-Expression
nach Stimulation von gereinigten Monozyten über
sieben Tage mit 30 µg/ml OvE (rote Fläche) bzw.
OvE/D (grüne Linie) im Vergleich zu unstimulierten
Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummer: 271200 015+014+013
Ergebnisse
59
3.2 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation mit
Onchocerca-ochengi-Extrakt
Gereinigte Monozyten zeigten in Relation zu unstimulierten Monozyten nach sechs
Tagen Kultur mit Onchocerca-ochengi-Extrakt (OoE) keine signifikante Erhöhung der
Expression des MMR (Abb. 45 und 46).
Abbildung 45: Dargestellt
sind die Medianwerte der
MMR-Expression auf gerei-
nigten Monozyten, die über
sechs Tage mit 30 µg/ml
OoE stimulierten worden
waren, verglichen mit unsti-
mulierten Monozyten (Leer-
wert). t-Test: OoE P: 0,159
Histogramm 46: Stimulation von gereinigten Monozyten mit 30 µg/ml OoE über sechs
Tage (rote Fläche) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie) Versuchsnummern: links 260201 016+010; Mitte 170701 019+017; rechts 260302 057+051
1
2
3
4
5
6
7
8
Leerwert OoE
Expression (U)
Ergebnisse
60
3.3 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation mit
Wolbachienoberflächenprotein des Parasiten Dirofilaria immitis
Der Makrophagen-Mannose-
Rezeptor (MMR) wurde auf
mit Wolbachienoberflächen-
protein (WSP) stimulierten
gereinigten Monozyten ver-
mehrt exprimiert. Mononukle-
äre Zellen sowie gereinigte
Monozyten wurden über sechs
Tage mit Konzentrationen zwischen 3 und 30 µg/ml stimuliert (Abb. 48); hierbei ergab
sich die stärkste Expression bei 10 µg/ml (Abb. 47).
Abbildung 48: MMR-Expression auf gereinigten Monozyten nach sechstägiger
Stimulation mit 3 µg/ml (links), 10 µg/ml (Mitte) und 20 µg/ml WSP (rechts; rote
Fläche) sowie MMR-Expression unstimulierter gereinigter Monozyten nach sechs
Tagen Stimulation (schwarze Linie) Versuchsnummer: links 260201 013+010; Mitte 260201 012+010; rechts 260201 011+010
Abbildung 47: Dosiswirkungskurve von WSP
0
2
4
6
8
Expression (U)
0 10 20 WSP (µg/ml)
Ergebnisse
61
4. Zentrale Ergebnisse
Monozyten zeigen nach drei-
tägiger Stimulation mit Oncho-
cerca-volvulus-Extrakt (OvE)
eine erhöhte Expression des
Scavenger-Rezeptors CD163 und
des Makrophagen-Mannose-Re-
zeptors (MMR, Abb. 49). Im
Gegensatz zu OvE führt Oncho-
cerca-volvulus-Extrakt aus Wür-
mern von Patienten, die vor
Nodulektomie mit Doxycyclin
behandelt worden waren, zu
keiner bzw. nur geringer
Erhöhung der Rezeptoren. Im
Überstand stimulierter Mono-
zyten läßt sich eine erhöhte IL-10-Konzentration nach Stimulation mit OvE nachweisen.
OvE/D führt nicht zu einer erhöhten Expression von CD163, MMR und IL-10.
Nach Stimulation reiner Mono-
zyten mit Wolbachienober-
flächenprotein (WSP) des
Parasiten Dirofilaria immitis
zeigte sich eine Expressions-
erhöhung der Rezeptoren
CD163 und MMR sowie eine
Erhöhung der Konzentration
von IL-10 im Kulturüberstand
(Abb. 50). Der MMR zeigt
nach Stimulation mit WSP eine
geringere Expression als der
Scavenger-Rezeptor CD163.
Abbildung 49: Stimulation gereinigter Monozyten mit OvE führt zu einer erhöhten
Expression von CD163 und MMR auf diesen Zellen (nach drei Tagen) und zu einer
erhöhten IL-10-Freisetzung im Monozytenüberstand (nach einem Tag).
1
10
100
CD163 MMR IL-10
unstimulierte Zellenstimuliert mit 20-30 µg/ml OvE/Dstimuliert mit 20-30 µg/ml OvE
Abbildung 50: Erhöhung der Rezeptorexpression für CD 163 und
MMR bw. IL-10-Freisetzung nach Kultur gereinigter Monozyten mit WSP über sechs Tage (CD163, MMR) und einen
Tag (IL-10)
1
10
100
CD163 MMR IL-10
unstimulierte Zellenstimulierte Zellen mit 20-25 µg/ml WSP
Ergebnisse
62
Die Gensequenz des WSP von Dirofilaria immitis ist identische mit der des WSP aus
Onchocerca (Bazzocchi et al., 2000).
Onchocerca-ochengi-Extrakt
(OoE) führte nach dreitägiger
Stimulation von Monozyten zu
einer vermehrten Expression
des CD163-Rezeptors. Nach
einem Tag Stimulation mit
OoE zeigt sich im Überstand
eine signifikate IL-10-Erhö-
hung (Abb. 51).
Abbildung 51: Darstellung der Ergebisse der Rezeptorexpression und IL-10-
Freisetzung auf bzw. durch gereinigte Monozyten nach drei (CD163), sechs Tagen (MMR) bzw. einem Tag (IL-10)
Stimulation mit OvE
1
10
100
1000
CD163 MMR IL-10
unstimulierte Zellen
stimuliert mit 30-50 µg/ml OoE
63
Diskussion
Die klinischen Manifestationen der Infektion mit Onchocerca volvulus variieren stark.
Unterschiede umfassen die generalisierte und die seltenere Sowda-Form, die fließend
ineinander übergehen können (Spektrum). Es zeigen sich bei der generalisierten Form
keine oder nur geringe Entzündungsreaktionen, obwohl z. T. eine große Anzahl von
Mikrofilarien in der Haut vorhanden sein kann. Die Sowda-Form präsentiert sich
hingegen als hyperreaktive, klinisch ausgeprägte Form der Erkrankung, meist mit einer
an den Gliedmaßen lokalisierten, juckenden, papulösen, hyperpigmentierten
chronischen Dermatitis mit regionaler Lymphadenopathie. Sowda-Patienten zeigen im
Unterschied zur generalisierten Form in vitro stark ausgeprägte zelluläre Reaktionen. Es
stellt sich die Frage, weshalb das Immunsystem von Patienten mit der generalisierten
Form vitale Filarien von O. volvulus toleriert und nicht bekämpft, wie es bei der Sowda-
Form zu beobachten ist.
Patienten mit der generalisierten Form der Onchozerkose zeigen eine nur geringe
Lymphozytenproliferation und geringe Konzentrationen inflammatorischer Zytokine
wie IL-2, Tumor-Nekrose-Faktor und IL-6 bei Stimulation mit Onchocerca-volvulus-
Extrakt (Ottesen, 1995). Immunreaktionen gegenüber adulten Filarien und Mikro-
filarien sind kaum nachweisbar. Degenerierte Mikrofilarien führen jedoch auch bei der
generalisierten Form vor allem bei hoher Mikrofilariendichte zu massiven Entzün-
dungsreaktionen (Ottesen, 1995). Eine Abtötung der Mikrofilarien erfolgt insbesondere
nach Gabe des mikrofilariziden Therapeutikums Diethylcarbamazin. Dies bedeutet, daß
die eingeschränkte Immunreaktivität unter bestimmten Bedingungen durchbrochen
werden kann. Die Entzündungsreaktion scheint von endobakteriellen Molekülen sowie
von prädominanten Th2-aktivierenden Molekülen von Filarien hervorgerufen zu
werden, die auf das native Immunsystem aktivierend einwirken. Die stetige Exposition
des Wirts mit Onchocerca-assoziierten Molekülen sowohl von Filarien als auch
filariellen Endobakterien provoziert mit steigender Filarienanzahl inflammatorische
Mechanismen. Immunpathologische Schäden werden durch T-Zellen und alternativ
aktivierten Makrophagen (aaM) minimiert (Hoerauf & Brattig, 2002; Brattig, 2004).
Von den lebenden Parasiten scheint eine immunmodulierende Aktivität auszugehen. So
kommt es zum Beispiel bei den Infektionen mit Brugia malayi, Nippostrongylus und
Diskussion
64
Toxocara canis zu einer Hemmung der T-Zellproliferation und Th2-Zellantwort. Die
Hemmung dieser Antworten wirkt einer Entzündungsreaktion durch die Freigabe von
IL-4, IL-10, Prostaglandinen und Proteinen wie Fizz1 und Ym1 entgegen (Maisels et
al., 2003).
Ein großer Fortschritt war die Entdeckung einer neuen Form von Makrophagen bzw.
dendritischen Zellen, die bei Infektionen mit Nematoden beobachtet wurde. Diese
Makrophagen schlagen einen IL-10 unabhängigen Weg ein (MacDonald et al., 1998;
Allen & Loke, 2001). Mit B. malayi infizierte Mäuse präsentierten diese Makrophagen
im Peritoneum. Im Mausmodell verhindern Makrophagen die Proliferation von
T-Zellen und wirken durch einen kontaktabhängigen Mechanismus. Der Mechanismus
ist unabhängig von den bekannten Inhibitoren wie NO, Prostaglandinen oder Zytokinen
wie IL-10 und TGF-ß (Loke et al., 2000). Diese Makrophagen induzieren die
Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th2-Zellen (Allen et al., 1996) und können
möglicherweise als Typ-2-Makrophagen klassifiziert oder als ein wichtiges In-vivo-
Beispiel von alternativ aktivierten Makrophagen (aaM) dargestellt werden (Gordon,
2003). Durch Helminthen stimulierte dendritische Zellen aus dem Knochenmark von
Mäusen zeigten eine vermehrte Expression von CD80, CD86 und MHC Klasse II
(Jankovic et al. 2001; MacDonald et al., 2001). Für die Th2-Antwort spricht auch die
vermehrte Expression des OX40-Liganden auf humanen dendritischen Zellen, welche
ausschlaggebend für die OX40-vermittelte Th2-Differenzierung ist (Flynn et al., 1998).
Später wurden auch ähnliche Zellen bei anderen Tieren, welche verschiedenen
Nematoden und deren sekretorischen Produkten ausgesetzt wurden, gefunden (Allen &
MacDonald, 1998).
Ym1, ein Protein, das zur Familie der Chitinase-Proteine gehört und von Makrophagen
zur Bindung von Glykosaminoglykanen wie Heparin im Rahmen einer Inflammation
poduziert wird, wurde als chemotaktischer Faktor für eosinophile Granulozyten
identifiziert (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003). Die begleitende lokale Infiltration
eosinophiler Granulozyten bei Onchozerkose kann somit durch die chemotaktische
Wirkung von Ym1 entstehen. Immunmodulierende Moleküle wie z. B. Filarien-
Cystatin, Migrations-inhibierender-Faktor und ein dem TGF-ß-ähnliches Molekül,
führen mit zu einer Suppression des Immunsystems. Nach Injektion von OvE zeigte
sich eine Einschränkung der Immunantwort der verzögerten Überempfindlichkeit
Diskussion
65
(DTH) (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003); diese war jedoch nicht bei Patienten mit einer
Sowda-Form sowie putativ Immunen zu beobachten (Burchard et al., 1999). Die
Antigen-induzierte DTH gilt als Th1-vermittelte Immunreaktion (Burchard et al., 1999).
Neueste Studien zeigen, daß bei Th2-abhängigen Reaktionen eine DTH des Typs II mit
einem klinischen Bild ähnlich dem der klassischen DTH auftreten kann. Frühere
Versuche, die verminderte Immunantwort bei der generalisierten Form der
Onchozerkose als eine Th2-Antwort zu beschreiben, werden heute als eine zu große
Vereinfachung angesehen. Gegen eine ausschließliche Th2-Antwort spricht das
Auftreten verschiedener Zellreaktionen bei putativ Immunen sowie die Zunahme der
zellulären Proliferation nach mikrofilarizider Behandlung mit Ivermectin bei Patienten
mit der Sowda-Form (Soboslay et al., 1997, Henry et al., 2001).
Neben Th1- und Th2-Antworten wurde kürzlich die Antwort einer dritten Th-
Zellpopulation, der Th3- oder regulatorischen T-Zelle Typ 1 (Tr1) beschrieben. Bei
Onchozerkose war die Th3-Antwort mit der OvE-spezifischen Verminderung der
Zellproliferation assoziiert. Th3-Reaktionen können die Th1- und Th2-Antwort
unterdrücken (Doetze et al., 2000). Th3-Zellen produzieren IL-10 und TGF-ß und sind
möglicherweise für eine Toleranzinduktion verantwortlich (Kapselberg et al., 1999).
Die Produktion von IL-10 ist assoziiert mit der verminderten zellulären
Antwortfähigkeit (Elson et al., 1995; Brattig et al., 1997; Soboslay et al., 1997; Cooper
et al., 1998; Doetze et al., 2000; Henry et al., 2001). Sie ist bei Patienten mit
generalisierter Form nach mikrofilarizider Behandlung mit Ivermectin vermindert, und
es läßt sich als Konsequenz eine verstärkte Zellproliferation nachweisen (Henry et al.,
2001). Die Neutralisation von IL-10 durch spezifische Antikörper ergab in vitro noch
keine Zunahme der Lymphozytenproliferation bei Patienten mit generalisierter
Onchozerkose (Soboslay et al, 1999; Doetze et al., 2000). Erst bei gleichzeitiger Zugabe
von Antikörpern gegen TGF-ß zeigte sich eine Zunahme der Zellproliferation (Doetze
et al., 2000). Onchozerkose-spezifische T-Zellklone bilden bei Patienten mit
generalisierter Onchozerkose Zytokine, die für den Th3-Suppressorzelltyp
charakteristisch sind (Doetze et al., 2000). Bei lymphatischen Filariosen und bei
Schistosomiasis ist die T-Zellantwort durch gemischte Th1- und Th2-Zellreaktionen
(Sartono et al., 1997; Grogan et al., 1998) sowie durch eine durch IL-10 und TGF-ß
vermittelte verminderte Zellproliferation gekennzeichnet (King et al., 1993; Mahanty et
al., 1996). Die Abbildung 52 zeigt ein Modell, wie man sich aufgrund der neueren
Diskussion
66
Forschungsergebnisse die Balance zwischen den Effektor- und Suppressormechanismen
bei der generalisierten Form der Onchozerkose im Vergleich zur Sowda-Form und zu
putativ Immunen vorstellt.
Abbildung 52: Balancemodell
zwischen den Effektor- und
Suppressormechanismen bei
Onchozerkose. (nach Hoerauf
& Brattig 2002)
1. Bei generalisierter Onchozerkose werden die Th1- und Th2-abhängigen
Effektorreaktionen durch IL-10 und TGF-ß supprimiert, und antigenspezifische
supprimierende Zellen (Th3/Tr1) treten auf.
2. Bei putativ immunen Individuen und Patienten mit der hyperreaktiven Form der
Onchozerkose (Sowda) zeigt sich eine ausgeprägte Th1/2-Effektorantwort, die zu einer
Immunantwort gegen infektiöse Larven bei putativ Immunen oder gegen Mikrofilarien
bei Sowda führt.
Somit kann durch freigesetztes IL-10 (z. B. aus aaM) eine Th3/Tr-1-Antwort ausgelöst
werden (Gomez-Escobar et al. 1998; Pastrana et al. 1998; Schönemeyer et al. 2001;
Hoerauf & Brattig, 2002). Th1- und Th2-Immunantworten können durch Fragmente
untergehender Mikrofilarien oder in Symbiose mit O. volvulus lebender Wolbachien
verursacht werden. Noch nicht identifizierte Wolbachienprodukte führen zunächst zu
proinflammatorischen Reaktionen (Brattig et al 2000; Taylor et al. 2000). Oligo-
saccharide (Fucosyl) und Phosphorylcholin hingegen lösen eher eine zelluläre Th2-
Antwort aus (Velupillai et al. 1996; Al-Qaoud et al. 1998; Whelan et al. 2000). Eine
Diskussion
67
Modulation der Immunantwort scheint auch durch In-utero-Exposition mit dem
parasitären Antigen bedingt zu sein, wobei entweder eine Toleranzbildung oder eine
verstärkte humorale Immunreaktion stattfindet. Im Rahmen von inflammatorischen
Reaktionen werden sequentiell auch antiinflammatorische Mechanismen hochreguliert,
um einer unkontrollierten sich verstärkenden Entzündungsreaktion entgegenzuwirken
(Kodelja & Goerdt, 1994; Kodelja et al., 1997; Goerdt & Orfanos 1999; Gratchev et al.,
2001). Hierbei spielen alternativ aktivierte Monozyten/Makrophagen (aaM) eine Rolle
(Kodelja et al., 1997; Gordon 2003), die bei chronischen Entzündungsreaktionen
vermehrt nachgewiesen wurden (Kodelja & Goerdt, 1994; Djemadji-Ondjiel et al.,
1996; Schebesch et al., 1997).
Da es für die Onchozerkose kein Tiermodell gibt, habe ich In-vitro-Untersuchungen mit
menschlichen Zellen durchgeführt. Vollblut zu kultivieren war wegen des geringen
Anteils an Monozyten ungeeignet (nur 2-6% der peripheren Leukozyten im Blut). Aus
diesem Grund wurden mononukleäre Zellen isoliert oder gereinigte Monozyten
eingesetzt. Untersucht wurden zwei wichtige Rezeptoren von aaM (CD163 und MMR)
sowie das Zytokin IL-10, das von aaM vermehrt gebildet wird. Die Rezeptorexpression
von CD163 und MMR wurde im Durchflußzytometer (FACS), die IL-10-Konzentration
im Kulturüberstand mittels ELISA analysiert. Der MMR wurde erst zu einem späteren
Zeitpunkt der Versuche als charakteristischer Marker hinzugenommen. Um das In-vivo-
Vorkommen von aaM zu überprüfen wären auch immunhistologische Untersuchungen
von Hautbiopsien für den Nachweis der Expression von CD163 und MMR interessant
gewesen.
Immunchemische Untersuchungen der kultivierten Zellen unter Anwendung der
Zytospinmethodik waren aufgrund des hohen Zellverbrauchs nicht ökonomisch.
Außerdem erwiesen sich die Ergebnisse der Rezeptorbestimmung durch die
Durchflußzytometrie als objektiver im Vergleich zur Zytospinmethodik. Die Selektion
der zu untersuchenden Zellpopulation durch das sogenannte „gaten“ stellt eine mögliche
Fehlerquelle beim FACS dar. Hierdurch werden Zelltrümmer und andere
Zellpopulationen aus der Analyse mit möglichem Informationsverlust ausgegrenzt. Bei
den Versuchen wurden Negativ- und Positivkontrollen eingeschlossen. Bei jedem
Versuch wurde stets ein Leerwert ohne Einsatz der monoklonalen Antikörper gegen die
Rezeptoren mitgeführt. Die MMR-Ergebnisse stellen aufgrund der Materialknappheit
Diskussion
68
der Reagenzien zum Teil nur einen Trend dar. Alternativ aktivierte Makrophagen
werden im Gegensatz zu klassisch aktivierten Makrophagen durch antiinflammatorische
Substanzen wie IL-4, Glukokortikoide, IL-10, IL-13 und TGF-ß aktiviert und
präsentieren ein bestimmtes Muster an Zytokinen wie IL-10 und TGF-ß sowie
Rezeptoren wie MMR und CD163. Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der bis jetzt
bekannten biologischen Eigenschaften alternativ aktivierter Makrophagen. Diese gehen
aus mit IL-4 und Glukokortikoiden stimulierten Monozyten hervor. Bestimmte weitere
Stimuli induzieren in diesen Monozyten eine präferentielle Freisetzung oder Expression
von z. B. Zytokinen, Chemokinen, Rezeptoren, Enzymen und anderen Produkten.
Auslösender Stimulus Rezeptorexpression
Glukokortikoide, IL-4 (Kodelja & Goerdt, 1994; Djemadji-
Ondjiel et al., 1996; Kodelja et al., 1997; Van den Heuvel et
al., 1999)
Scavenger-Rezeptor CD163
IL-4, Dexamethason (Cowan et al., 1992; Stein et al., 1992 ;
Kodelja et al., 1997)
IgG2a (Stein et al., 1992)
Bacille-Calmette-Guerin, Endotoxin/Phorbolester (Cowan
et al., 1992)
Glukokortikoide (Cowan et al., 1992; Stein et al., 1992)
Makrophagen-Mannose-Rezeptor
Glukokortikoide (Woiciechowsky et al., 1999)
IL-10 (Steinbrink et al., 1997)
Erniedrigte Expression von HLA-
DR,CD83,CD86,CD58
Auslösender Stimulus Produktexpression
IL-4 (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003) Fizz1
IL-4 (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003) Eosinophiles Dermotoxin Ym1/2
IL-4 (Chizzolini et al. 2000) Matrix-Metalloproteinase MMP-1
Auslösender Stimulus Enzymexpression
IL-4, IL-13 (Gordon, 2002) L-Arginase 1
Glukokortikoide, IL-4 (Kodelja et al. 1997) 15-Lipoxigenase
Auslösender Stimulius Chemokinfreisetzung
IL-13, IL-10 u. IL-4 (Kodelja et al., 1998) AMAC-1 (CCL18)
Karzinome, Allergien und inflammatorische
Erkrankungen (Psoriasis u. Asthma), HIV
(Guan et al., 1999)
MIP-4/DC-CK1
Tabelle 2: Charakteristika von alternativ aktivierten Makrophagen
Diskussion
69
Auslösender Stimulus Zytokinfreisetzung
TNF-α (Asadullah et al., 1999 ; Ito et al., 1999)
cAMP (Asadullah et al., 1999)
Glukokortikoide (Franchimont et al., 1999)
UV-Stahlen (Asadullah et al., 1999; Ullrich, 1994)
Katecholamine (Woiciechowsky et al., 1998 & 1999)
Leishmania major, Toxoplasma gondii, Listeria
monocytogenes, Mykobacterium tuberculosis
(Carrera et al., 1996)
Neuropeptide : α-Melanocten-stimulierendes Hormon
β-Endorphin (Carrera et al., 1996)
IL-10
IFN-β (Lin et al., 1998)
IL-4 /LPS (Lin et al., 1998; Fenton et al., 1992)
IL-10 (Jenkins et al., 1994)
TNF-α (Giri et al., 1994 ; Franchimont et al., 1999)
IL-1-Rezeptorantagonist
Phagozytose von apoptotischen Zellen (Fadok et al., 1998) TGF-β
ACTH, geringe Konzentration von Glukokortikoiden
(Calandra et al., 1995)
Brugia-malayi-Larve, Wucheria bancrofti, Onchocerca
volvulus (Pastrana et al., 1998)
MIF (Bm-MIF)
IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β (Sutterwale et al., 1997)
Leishmania major, Toxoplasma gondii, Listeria
monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis
(Carrera et al., 1996)
Schistosoma-mansoni-Eier (Kalinski et al., 1999)
Fcγ-Bindung, HIV (Sutterwale et al., 1997)
PGE, Cholecalciferol (Kapsenberg et al., 1999)
Erniedrigte Freisetzung von IL-12
Phagozytose apoptotischer Zellen (Fadok et al., 1998) PAF
Tabelle 2: Charakteristika von alternativ aktivierten Makrophagen
AaM besitzen keine Fähigkeit, Mikroorganismen abzutöten. Das von aaM verstärkt
exprimierte Enzym Arginase ist ein Gegenspieler der NO-Synthase; beide konkurrieren
um das limitierte Substrat L-Arginin (Modolell et al., 1995). Die Arginase bildet
L-Ornithin aus L-Arginin und führt über die Erhöhung von Prolin mittels der
Ornithinaminotransferase zur Kollagenproduktion (Gordon, 2003). Eine erhöhte
Kollagenproduktion findet sich auch als Antwort auf O. volvulus in Onchozerkomen.
Die Sauerstoff- und NO-Synthaseproduktion ist erniedrigt. Von besonderer Bedeutung
Diskussion
70
ist die zunehmende Hemmung der Proliferation CD4-positiver T-Zellen im peripheren
Blut durch aaM, die zur Immunsuppression führt (Schebesch et al., 1997).
Alle drei in dieser Studie untersuchten Marker (MMR, CD163 und IL-10) kennzeichnen
eine alternative Aktivierung von Makrophagen bei Onchozerkose. Nach Stimulation
isolierter peripherer Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt zeigte sich nach
eintägiger Kultur eine Erhöhung der IL-10-Konzentration im Überstand. Neben der
IL-10-Konzentration im Kulturüberstand erhöhte sich auf den stimulierten Monozyten
nach dreitägiger Stimulation die Expression des Scavenger-Rezeptors CD163
signifikant. Die Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt hatte ebenfalls eine
geringfügige Erhöhung des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf den Zellen zur Folge.
Die gesteigerte Expression dieser Rezeptoren sowie die geringe IL-6- und TNF-α-
Konzentration nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt in vitro unterstützen
die Annahme der alternativen Aktivierung von Monozyten/Makrophagen bei der
generalisierten Form der Onchozerkose. Exposition der Monozyten mit Extrakt von
O. ochengi führte nach drei Tagen zu einer vermehrten Expression von CD163 und
einer deutlich stärkeren Sekretion von IL-10 im Vergleich zu mit Onchocerca-volvulus-
Extrakt stimulierten Zellen. Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR), der nach
sechs Tagen gemessen wurde, ergab nach Exposition mit Extrakt von O. ochengi keine
signifikante Erhöhung. Es ist nicht auszuschließen, daß nach drei Tagen Stimulation
eine erhöhte Expression eintritt, wie es bei der Expression des CD163-Rezeptors nach
Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt der Fall war.
In weiteren Untersuchungen wurden Monozyten mit rekombinanten Antigenen von
O. volvulus getestet. Dazu gehörten Onchocystatin (Ov17) (Schönemeyer et al., 2001;
Schierack et al., 2003), ein verkürztes Ov17-Fragment (Ovv17) sowie der Aspartyl-
proteaseinhibitor Ov33 (Lucius et al., 1992). Onchocystatin führte zu einer Hemmung
der T-Zellproliferation und zu einer verstärkten Freisetzung von IL-10 (Hartmann et al.,
1997). Es ließ sich in den Versuchen mit Onchocystatin nur der Trend zu verstärkter
CD163-Expression nachweisen. Weiterhin wurden einige Versuche mit Ecdyson,
welches unter anderem bei O. volvulus gefunden wurde (Mereer et al., 1989; Yates et
al., 1995), durchgeführt. Ecdyson ist ein weniger potentes Steroid als Dexamethason
und kommt vor allem bei Insekten und Würmern vor. Es löste eine geringe Erhöhung
Diskussion
71
der CD163-Expression aus, die sich am stärksten bei einer Konzentration zwischen
40-200 ng/ml nach einem Zeitraum von sechs Tage Stimulation zeigte.
Beim Zerfall von Mikrofilarien, der eine ausgeprägte inflammatorische Immunreaktion
auslösen kann, werden Moleküle aus den Filarien und Wolbachien freigesetzt
(Bryceson et al., 1977; Francis et al., 1985; Ali et al., 2003). Kürzlich wurde wiederholt
gezeigt, daß Oberflächenantigene der Wolbachien eine inflammatorische Immun-
antwort auslösen, deren Ausprägung mit der Menge der zirkulierenden bakteriellen
DNA und von TNF-α korreliert (Keiser et al., 2002; Brattig, 2004). Die Stimulation von
Monozyten mit dem Wolbachienoberflächenprotein WSP aus Dirofilaria immitis, das
eine identische Gensequenz wie WSP aus Onchocerca aufweist (Bazzocchi et al.,
2000), ergab eine ausgeprägte Erhöhung der Expression aller drei Marker, was auf eine
alternative Aktivierung von Makrophagen hindeutet. Die stärkste Expression fand sich
für eine Konzentration von 10 µg/ml WSP. Interessanterweise zeigte sich im Gegensatz
zum Extrakt von unbehandelten Patienten bei Stimulation mit Onchocerca-volvulus-
Extrakt von Patienten, die zur Eliminierung der Wolbachien mit Doxycyclin behandelt
worden waren, keine erhöhte Expression der untersuchten Marker. Wolbachien-
moleküle scheinen daher neben proinflammatorischen Eigenschaften auch an der
Differenzierung von Monozyten zu aaM beteiligt zu sein.
Die Onchozerkose ist eine chronische Erkrankung der Haut und führt zu Granulom-
bildung in der Subkutis. AaM wurden in Fremdkörpergranulomen und bei chronischen
Erkrankungen wie der Psoriasis vermehrt beobachtet (Djemadji-Oudjiel et al., 1996).
Sie regulieren unter anderem die Fibroblastenaktivität durch Induktion von Zytokinen
und Wachstumsfaktoren, die die Proliferation und Kollagensynthese von Fibroblasten
modulieren (Sang et al., 2000). AaM können daher auch an der starken Fibrosierung bei
der Onchozerkose beteiligt sein. Scavenger-Rezeptoren sind charakteristisch für
sogenannte Schaumzellen, welche sich auch bei Arteriosklerose in der Gefäßwand aus
einwandernden Monozyten entwickeln. Diese Makrophagen nehmen oxydierte Lipide
auf und speichern sie. Schaumzellen sind ebenfalls bei der Onchozerkose beobachtet
worden (Burchard et al., 1979; de Villiers & Smart, 1999; Madsen et al., 2001).
IL-10 weist nicht nur immunsuppressive, sondern auch B-Lymphozyten-fördernde
Effekte auf. IL-10 führt nicht zu einer Hemmung der IL-4-induzierten IgE-Sekretion,
Diskussion
72
sondern zu einer verstärkten B-Zellproliferation. Die Expression von CD40, IL-4 und
IL-10 bewirkt neben der verstärkten B-Zellproliferation eine Immunglobulinsekretion
und einen Isotypenwechsel zur IgE-Synthese (Rousset et al., 1992). Hohe
Konzentrationen von IgE stellen ein Hauptcharakteristikum der Filarieninfektion wie
Onchozerkose dar (Ottesen, 1995; Tischendorf et al., 1999).
Gordon (2003) unterscheidet fünf Aktivierungsformen von Makrophagen, wobei neben
Glukokortikoiden nur IL-4 und IL-13 Makrophagen alternativ aktivieren. IL-10, TGF-ß,
IL-1-Rezeptor-Antagonist führen danach zu einer Deaktivierung von Makrophagen, die
ihrerseits IL-10 und TGF-ß bilden. CD163 wird von Gordon als Charakteristikum
alternativ aktivierter Makrophagen aufgeführt. In anderen Veröffentlichungen führen
IL-10, Glukokortikoide und IL-4 in Verbindung mit Glukokortikoiden zu einer
Induktion von CD163 (Kodelja & Goerdt, 1994; Kodelja et al., 1997; Högger et al.,
1998). Über die Rolle von IL-4 und IL-13 als Stimuli gibt es sich widersprechende
Berichte. Die Veröffentlichung von Djemadji-Ondjiel et al. (1996) beschreibt eine
vermehrte Expression des Rezeptors, die unter IL-4 nicht so stark ausfällt wie nach
Stimulation mit IL-10. In anderen Artikeln (van den Heuvel et al., 1999; Sulahian et al.,
2000) wird IL-4 und IL-13 hingegen kein Einfluß auf die Induktion des CD163-
Rezeptors eingeräumt. IL-10 führt laut Gordon zur Deaktivierung von Makrophagen,
was im Gegensatz zur vermehrten CD163- und MMR-Expression steht (Djemadji-
Ondjiel et al., 1996; Büchler et al., 2000; Sulahian et al., 2000).
Insgesamt sprechen die Ergebnisse meiner In-vitro-Studie erstmalig für die Ausbildung
von alternativ aktivierten Makrophagen unter Stimulation mit Onchocerca-volvulus-
und Onchocerca-ochengi-Extrakt. Die Frage, ob und inwieweit WSP in vivo an der
Immunreaktion beteiligt ist, ist noch zu klären. In vitro bewirkt die Exposition von
Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt und Wolbachienoberflächenprotein eine
erhöhte Expression von CD163, MMR und IL-10. Immunhistologische Studien haben
gezeigt, daß Mikrofilarien das WSP enthalten und daß Gewebsmakrophagen
Mikrofilarien bzw. Fragmente der Mikrofilarien und mit diesen WSP aufnehmen
können und dieses auch tatsächlich enthalten (Brattig et al., 2004). Eine mögliche
intensive Interaktion zwischen Makrophagen, Mikrofilarien und Wolbachien ist daher
bei der Auseinandersetzung des Wirts mit der Filarie O. volvulus auch in vivo
anzunehmen.
73
Zusammenfassung
Die Onchozerkose ist eine chronische Infektionskrankheit, bei der die Stadien der
Filarie O. volvulus im immunkompetenten Wirt für lange Zeit überleben. Entzündliche
Reaktionen werden durch ein System von antiinflammatorischen Mechanismen
kontrolliert. Ein Mechanismus repräsentiert dabei die Differenzierung von Monozyten
in alternativ aktivierte Makrophagen. Die durch Suppressormechanismen alternativ
aktivierter Makrophagen bedingte eingeschränkte Immunantwort ist charakteristisch für
die Chronizität der Parasitose.
In der vorliegenden Studie wurden periphere mononukleäre Zellen und gereinigte
Monozyten gesunder Spender mit Onchocerca-volvulus- und Onchocerca-ochengi-
Extrakt stimuliert und die Expression bestimmter Rezeptoren auf Monozyten/
Makrophagen sowie das immunmodulierende Zytokin IL-10 bestimmt. Untersucht
werden sollte, ob es durch Onchocerca-volvulus-Antigene zu einer erhöhten Expression
des Scavenger-Rezeptors CD163, des Makrophagen-Mannose-Rezeptors sowie von
IL-10 kommt. Diese Merkmale sind Indikatoren von alternativ aktivierten
Makrophagen. Die Membranrezeptoren CD163 und MMR wurden auf den stimulierten
Monozyten mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern im Durchflußzytometer (FACS)
untersucht. IL-10 wurde im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt.
Die Expression von CD163 auf Monozyten/Makrophagen und die Konzentration von
IL-10 im Zellkulturüberstand waren nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus- und
Onchocerca-ochengi-Extrakt signifikant erhöht. Eine höhere Expression des MMR war
unter den Testbedingungen nur als Trend nachweisbar.
Diese Ergebnisse sprechen für eine Onchocerca-assoziierte Stimulation von Monozyten
zu alternativ aktivierten Makrophagen. Weiterhin konnte nach Stimulation der
gereinigten Monozyten mit dem endobakteriellen Wolbachienoberflächenprotein WSP
nach drei Tagen auf den Zellen eine stark erhöhte CD163-Rezeptorexpression und eine
nur leicht erhöhte Expression des MMR sowie eine erhöhte IL-10-Konzentration im
Kulturüberstand festgestellt werden. Die Stimulation von gereinigten Monozyten mit
Onchocerca-volvulus-Extrakt, der von mit Doxycyclin behandelten Patienten stammte
(Eliminierung der Endobakterien), zeigte dagegen eine signifikant niedrigere
Zusammenfassung
74
Rezeptorexpression und IL-10-Freisetzung als die Stimulation mit Extrakt von
unbehandelten Patienten.
Die Ergebnisse weisen daraufhin, daß WSP eine wesentliche Rolle bei der Induktion
einer alternativen Aktivierung von Monozyten/Makrophagen durch Onchocerca-
volvulus-Extrakt spielt. Alternativ aktivierte Makrophagen können nach diesen neuen
Ergebnissen neben regulatorischen T-Zellen (Th3/Tr1) eine Rolle bei der verminderten
Immunreaktivität der generalisierten Form der Onchozerkose spielen.
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Anhang
95
Curriculum vitae
Name: Florestan Gerald Höckh
Geburtsdatum: 19. März 1976
Geburtsort: Wiesbaden / Sonnenberg
Schulen und Studium
1982 bis 1986 Grundschule Musberg, Leinfelden-Echterdingen
1986 bis 1992 Albert-Schweitzer-Realschule, Tübingen,
Abschluß: Mittlere Reife
1992 bis 1995 Wirtschaftsgymnasium Tübingen,
Abschluß: Allgemeine Hochschulreife
1997 bis 2003 Studium der Humanmedizin, Universität Hamburg
März 1999 Physikum
März 2001 Erstes Staatsexamen
März 2003 Zweites Staatsexamen
2003 bis 2004 Studium der Humanmedizin, Universität Freiburg
Praktisches Jahr:
Innere Medizin, Universitätsklinikum Freiburg
Chirurgie, Universitätsklinikum Sevilla/Spanien
Wahlfach: Pädiatrie, Universitätsklinikum Freiburg
Nov. 2004 Drittes Staatsexamen
1999 Beginn der Medizinischen Doktorarbeit am Bernhard-Nocht-
Institut für Tropenmedizin, Abteilung für Klinische Chemie
Auslandsaufenthalte
Feb. bis Mai 2004 Chirurgie, Hospital Virgen de Macarena, Univ. Sevilla / Spanien
Sept. 2003 Praktikum, Hospital for Tropical Diseases, London / England
Sept. 1999 Famulatur Pädiatrie, Hospital Heodra, León / Nicaragua
Sprachen
Englisch und Spanisch fließend, Französisch: Anfängerniveau
Anhang
96
Danksagung:
Herrn Priv.-Doz. Dr. med. F. W. Tischendorf danke ich für seine Unterstützung meiner
Arbeit und für die hilfreiche und kritische Beratung bei der Anfertigung der
Dissertation.
Herrn Priv.-Doz. Dr. N. W. Brattig danke ich für die durchgehende Betreuung dieser
Arbeit sowie für die anregenden Gespräche und Diskussionen.
Herrn Prof. Dr. H. Schmitz, Leiter der Abteilung Virologie, danke ich für die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes am Durchflußzytometer.
Herrn Dr. M. Ernst, des Forschungszentrums Borstel in Hamburg, danke ich für die
Versorgung mit gereinigten Monozyten.
Besonderer Dank geht an meine Mitdoktoranden Arline Schwohl und Antje Wagner
sowie an Maren Lintzel, Wilfried Grönwoldt und Frank Geisinger für ihre technische
Hilfe und das freundliche Arbeitsklima sowie den Kaffee zwischendurch.
Mein spezieller Dank gilt meiner Familie, die mir nicht nur das Studium der Medizin
ermöglichte. Ein weiterer Dank gilt meinem Freundeskreis für die anregenden
Gespräche und den Zusammenhalt im Studium.
Anhang
97
Eidesstattliche Versicherung
Ich versichere ausdrücklich, daß ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe
verfaßt, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und
die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln
nach Ausgabe, Auflage und Jahr des Erscheinens des benutzten Werkes kenntlich
gemacht habe.
Ferner versichere ich, daß ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer
anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung
zur Promotion beworben habe.
Tübingen, den 12. Februar 2005