Zelluläre Signaltransduktion II TGF-ß, der Wachstumsfaktor, der das Wachstum hemmt?

Zelluläre Signaltransduktion II

• TGF-ß, der Wachstumsfaktor, der das Wachstum hemmt?

Transforming growth factor ß (TGF-ß)

Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serum-

freiem Medium in Weichagar

Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften.

Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation

Transforming growth factor ß (TGF-ß)

Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serum-

freiem Medium in Weichagar

Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften.

Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation

Epithel: Schicht engverbundener, polarisierter Zellen

Mesenchym: Gewebe aus locker verbundenen, nicht polarisierten Zellen

Control TGF-ß

Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation

Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001)

Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation

Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001) Link to Cadherins

TGFß ein pleiotropes Cytokin

- 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3)

- Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert

- TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen

- TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen

- TGFß3: Mesenchymale Zellen

TGF-ß-Familie BMP-Familie

TGF-ß BMP2 (bone morphogenic Protein)

Activin BMP4

Nodal BMP7

TGF-ß und verwandte Proteine

ß1-LAP (80 kDa)

TGF-ß1 (25 kDa)

LTBP (125-160 kDa)

Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex

LAP = Latency-associated proteinLTBP = Latent TGF-ß-binding protein

ß1-LAP (80 kDa)

TGF-ß1 (25 kDa)

LTBP (125-160 kDa)

Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex

LAP = Latency-associated proteinLTBP = Latent TGF-ß-binding protein

Aktivierung von TGFß durch proteolytische Prozesse

TGFß ein pleiotropes Cytokin

- 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3)

- Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert

- TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen

- TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen

- TGFß3: Mesenchymale Zellen

Signale für die proteolytische Aktivierung:

- Stimulation von Integrinrezeptoren der extrazellulären Matrix

- Gefäßschädigungen und Aktivierung von Plasmin/Thrombospondin

TGFß Funktionen

- Inhibition der Zellproliferation

- Supression der Immunantwort

- Induktion von Zelldifferenzierung

- Stimulation der Synthese von extrazellulärer Matrix

- Stimulator der Angiogenese

Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren

3 Typen von TGF-Rezeptoren wurden in Säugetierzellen indentifiziert:

TGFß-R I: 55 kDa

TGFß-R II: 75 kDa

TGFß-R III: 200 – 400 kDa Proteoglycan ohne Signaltransduktionseigenschaften

TßR-II TßR-I

Ligandbindungs-domäne

TßR-II TßR-I

Transmembran-domäne

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

Tß-R I und TßR-II sind Serin/Threonin Kinasen

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

Konstitutiv aktiveKinase

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

SGSGSG GS Domäne

TßR-II TßR-I

TGF-ßLigandbindungs-domäne

Kinase-domäne

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

Phosphorylierung der GS Domäne

Signalkaskade

TßR-II TßR-I

Kinase-domäne

TßR-II

TGF-ß

TßR-I ActR-IIActR-IIB

Activin/Nodal

ActR-IB

Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unter-schiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien

TßR-II

TGF-ß

TßR-I ActR-IIActR-IIB

Activin/Nodal

ActR-IB

BMP2BMP4BMP7

GDF5BMP4 BMP7 AMH/MIS

ActR-IIActR-IIB

BMPR-II BMPR-IABMPR-IB

BMPR-IABMPR-IB

ALK2 AMHR-II BMPR-IB

Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unter-schiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien

S igna lkaskadeS m ad-Prote ine

TßR -II TßR -I

TG F-ßL igandb indungs-dom äne

Transm em bran-dom äne

K inase-dom äne

K onstitu tiv aktiveK inase

D urch P hosphory lierungaktiv ierte K inase

Struktur der Smad-Proteine

Fusion aus

Sma: Analogon aus C. elegans

Mad: Analogon aus Drosophila

(Mad= „Mothers against decapentaplegig“)

Decapentaplegic = TGFß-Analog aus Drosophila

SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )R-Smads H2N- -COO-

SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )

MH1-Domäne MH2-DomäneLinker

R-Smads H2N- -COO-

Phosphorylierungsstelle

R-Smads

Co-Smad

R-Smads

Co-Smad

I-Smads

Co-factorinteraction

Interaktionsdomänen der Smad-Proteine

Mitglieder der Smad-Familie

SXSH2N- -COO-

SXS -COO-

TßR-I

Aktivierung der R-Smads durch TßR-I-abhängige Phosphorylierung der C-terminalen Domäne

TßR-II TßR-I

TGF-ß

Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade

R-SmadSXS -COO-

TßR-II TßR-I

TGF-ß

R-SmadSXS -COO-

SARA = Smad anchor for receptor activation

TßR-II TßR-I

TGF-ß

R-Smad

TßR-II TßR-I

TGF-ß

SXSH2N- -COO-PP

R-Smad

TßR-II TßR-I

TGF-ß

SXSH2N- -COO-PP

H2N- -COO-

SXSH2N- -COO-PP

Co-Smad

R-Smad

SMAD-4

TßR-II TßR-I

TGF-ß

SXSH2N- -COO-PP

H2N- -COO-

SXSH2N- -COO-PP

Translokation in den Zellkern

Co-Smad

R-Smad

TßR-II TßR-I

TGF-ß

SXSH2N- -COO-PP

H2N- -COO-

SXSH2N- -COO-PP

Translokation in den Zellkern

Co-Smad

R-SmadSXS -COO-

I-Smad

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Smad-abhängige Aktivierung der Transkription

S B Emad inding lement

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp)

In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor.

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp)

In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor.

Genspezifität kann nur durch Kombination mit anderen Faktoren erreicht werden

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM )

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNAalleine nicht aus.

-COO-SXS -C

C A G A C5' 3'

Transaktivierung?

Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNAalleine nicht aus.

Eine effektive DNA-Bindung kann nur durch multiple SBEs und/oder andereFaktoren erreicht werden

-SXS -COO

C A G A C5'

DNA-Bindungs-Kofaktoren

-SXS -COO

C A G A C5'

A T C A C A

A R Ectivin esponse lement

-SXS -COO

C A G A C5'

Transaktivierung

A T C A C A

-SXS -COO

C A G A C5'

Transaktivierung

A T C A C A

FAST verstärkt die Bindung des Smad-Komplexes an die DNAhat aber selbst keine transaktivierende Wirkung.

Smad-abhängige Aktivierung der TranskriptionD N A-B indungs-K ofaktoren

Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind FAST für Smad2 und Smad3

OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8

Smad-abhängige Aktivierung der TranskriptionD N A-B indungs-K ofaktoren

Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind - FAST für Smad2 und Smad3

- OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8

DNA-Bindungspartner erhöhen die Signalspezifität - da nur Gene aktiviert werden, die SRE und Erkennungssequenzen für die Kofaktoren haben

- da sie für eine bestimmte Gruppe von Smads und damit für eine Gruppe von Rezeptoren spezifisch sind

- da sie zellspezifisch exprimiert werden

Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Histon-Acetyl-Transferase

Coaktivator

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

Chromatinauflockerung

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

erhöhte Transkription

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

-COO-SXS-COO-PP

C A GA C5' 3'

Repressor

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

-COO-SXS-COO-PP

C A GA C5' 3'

Histon-Deacetylase

Repressor

-COO-SXS-COO

C A GA C5' 3'

Coaktivator

Histon

Histon-Ac

-COO-SXS-COO-PP

C A GA C5' 3'

Histon-Deacetylase

Repressor

Histon-Ac

Histon

Chromatinkondensierung

erniedrigte Transkription

Aktivierung der TGFß-R/SMAD Signalkaskade führt bei epithelialen Zellen zu einem Zellzyklusarrest

Wodurch ?

Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus

CDKs: Motoren des Zellzyklus

Welche "Motorwirkung" haben CDKs im Zellzyklus ?

Durch die Phosphorylierung welcher Substratewerden Zellzyklusphasen eingeleitet ?

CDK Substrate: Initiation der S-Phase

Bedeutung von CDKs bei der Initiation der S-Phase

NH2- -COOHA B

Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -

nucleäres Protein, 110 kDa

NH2- -COOHA B

Bindung des Transkriptionsfaktors E2F

NH2- -COOHA B

E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen

NH2- -COOHA B

P P P P P P P P PP

E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen

Repression E2F-kontrollierter Gene

InduktionE2F-kontrollierter Gene

Cyclin E

Repression E2F-kontrollierter Gene

E2F: Initiator der S-Phase

E2F-kontrollierter Gene

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

Cyclin E

Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren

inaktiv

inaktivCDK

CyclinCyclin

T160 PCDK

Cyclin

T160 PCDK

CDKinaktiv

Cyclin

Cyclinkonzentration

PhosphorylierungDephosphorylierung

CDK-Inhibitoren

CyclinT14

Pinaktiv

T160 P

Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren

Beispiel: CKI p21

isosterische Hemmung durch Bindung im aktiven Zentrum

Cyclin E

CKI p21

G1 S-Phase

Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß

TGF-ß

p15, p21

TGF-ß

p15, p21 p27

Cyclin/CdK

TGF-ß

p15, p21 p27

Cyclin/CdKRb/E2F

TGF-ß

p15, p21 p27

Cyclin/CdKRb/E2F E2F

S-Phase Gene

TGF-ß

p15, p21 p27

Cyclin/CdKRb/E2F E2F

S-Phase Gene

Zielgene des Transkriptionsfaktors c-myc

(+) Cyclin D Vermehrte Bildung des CyclinD/Cdk4 Komplexes(+) Cyclin E Vermehrte Bildung des CyclinE/Cdk2 Komplexes

(+) cdc25a-Phosphatase Enthemmung des CyclinD/Cdk4 Komplexes(+) p27-Sequestrierungsfaktor Enthemmung des CyclinE/Cdk2 Komplexes

Myc C ell cycleprogression

Beeinflussung des Zellzyklus durch Myc

Mögliche Angriffspunkte in der TGF-ß-Signalkette bei Tumorerkrankungen

• Aufhebung der TGF-ß-vermittelten Hemmung der Zellproliferation

z. B. Defekte in TßR oder Smad • Ausschaltung der proapoptotischen Signalkaskaden

z. B. Defekte in proapoptotischen Proteinen

In späteren Stadien TGF-ß Sekretion und dadurch :• Immunsuppression• Epitheliale zu mesenchymaler Transdifferenzierung erhöhte

Metastasierungsneigung• Vermehrte Neovaskularisation

Zelluläre Signaltransduktion II TGF-ß, der Wachstumsfaktor, der das Wachstum hemmt?

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